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特許7016886イソトレチノインとペプチドの結合体

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-01-28

(45)【発行日】2022-02-07

(54)【発明の名称】イソトレチノインとペプチドの結合体

(51)【国際特許分類】

A61K 47/64 20170101AFI20220131BHJP

C07K 7/08 20060101ALI20220131BHJP

A61P 17/10 20060101ALI20220131BHJP

A61P 31/04 20060101ALI20220131BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20220131BHJP

A61P 39/06 20060101ALI20220131BHJP

A61K 8/67 20060101ALI20220131BHJP

A61K 8/64 20060101ALI20220131BHJP

A61Q 19/00 20060101ALI20220131BHJP

A61Q 19/10 20060101ALI20220131BHJP

A61Q 5/12 20060101ALI20220131BHJP

A61Q 5/02 20060101ALI20220131BHJP

A61Q 5/06 20060101ALI20220131BHJP

A61K 31/203 20060101ALN20220131BHJP

【ＦＩ】

A61K47/64

C07K7/08 ZNA

A61P17/10

A61P31/04

A61P29/00

A61P39/06

A61K8/67

A61K8/64

A61Q19/00

A61Q19/10

A61Q5/12

A61Q5/02

A61Q5/06

A61K31/203

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019561984

(86)(22)【出願日】2018-05-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-07-02

(86)【国際出願番号】 KR2018005447

(87)【国際公開番号】W WO2018208124

(87)【国際公開日】2018-11-15

【審査請求日】2019-12-18

(31)【優先権主張番号】10-2017-0058866

(32)【優先日】2017-05-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】510271129

【氏名又は名称】ケアジェンカンパニー，リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＥＧＥＮＣＯ．，ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002620

【氏名又は名称】特許業務法人大谷特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】チョンヨンジ

(72)【発明者】

【氏名】キムウンミ

【審査官】福山則明

(56)【参考文献】

【文献】特表２００４－５３０６５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５３９２４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５－５０７９３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００８－５１５７７０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ９／００－９／７２

Ａ６１Ｋ４７／００－４７／６９

Ａ６１Ｋ３１／００－３１／８０

Ａ６１Ｋ８／００－８／９９

Ｃ０７Ｋ１／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

イソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物であって、
前記ペプチドは、配列番号１から構成されるアミノ酸配列を有するペプチドである化合物。

【請求項2】

請求項１に記載の化合物を含有する抗菌、抗炎症又は抗酸化用の薬学的組成物。

【請求項3】

請求項１に記載の化合物を含有する抗菌、抗炎症又は抗酸化用の化粧料組成物。

【請求項4】

柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス及びエアロゾルからなる群より選択される剤形を有する、請求項３に記載の化粧料組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、イソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

イソトレチノイン（ｉｓｏｔｒｅｔｉｎｏｉｎ、１３－ｃｉｓ－ｒｅｔｉｎｏｉｃａｃｉｄ）は、主にニキビを治療するために用いられる口腔医薬品であって、皮脂分泌、面皰、ニキビ菌であるプロピオニバクテリウムアクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓ）、毛孔の過多角化症を全て抑制して半永久的効果があるので、ニキビ、特に非常に深刻な結晶嚢性ニキビ結晶嚢性にきび結晶嚢性にきびに最も効果的な薬のうちの１つとして知られている。また、イソトレチノインは、まれに扁平上皮癌のような特定の皮膚癌やその他の癌の予防又は治療のために用いられることもあり、致命的な皮膚疾患の一つであるハーレークイン魚鱗癬及び層状魚鱗癬を治療するためにも用いられ得る。イソトレチノインは、ビタミンＡに関するレチノイドであって、少ない量ではあるが体内で自然に発見され、この異性質体のトレチノインもまたニキビ治療剤である。

【0003】

イソトレチノインの作用メカニズムは、小さな濾胞上皮（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）の角質化過程を正常化させ、皮脂合成を減少させながらセボサイト（ｓｅｂｏｃｙｔｅ）の数を減少させ、ニキビの炎症の原因となる微生物であるプロピオニバクテリウムアクネスを減少させることによりニキビの症状を治療すると報告されている。イソトレチノインは脂溶性であるため水に対する溶解度が低く、食べ物とともに摂取する際に吸収が増加し、空腹時の生体利用率は２０％程度である。経口投与の際に最高血中濃度に到達する時間は２～４時間程度であり、投与後６時間以後には活性代謝体である４－ヨウ素－イソトレチノインの血中濃度がイソトレチノインの血中濃度より高いと報告されている。

【0004】

しかし、このようなイソトレチノインを使用すると、皮膚に適用後に相当な不便さを与える皮膚剥脱、皮膚炎、皮膚乾燥、掻痒症、皮膚弱化などの副作用が生じ得るため、敏感性皮膚を有する使用者がこのような化合物を用いる場合にはしばしば損傷を被るようになる。また、イソトレチノインは水に対する溶解度が低いので、これを可溶化するために多様な有機溶媒を添加する必要があるが、これによりイソトレチノインを含む組成物に不便さを増すことになり得る。

【0005】

したがって、前記のようなイソトレチノインの問題点、特に水に対する低い溶解度の問題を改善し、イソトレチノインの生理学的効能もさらに強化させることができる新規の化合物の開発が要求されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【文献】韓国公開特許第１０－２００２－００３３７５１号公報

【非特許文献】

【0007】

【文献】ＳＫＹａｎｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｋｏｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．４，２５５－２６１，２００７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、前記のような従来のイソトレチノインが有している問題点を改善するためのものであって、自然型のイソトレチノインが単独で存在する場合と比べて同一であるかさらに優れた生理学的活性を示しながらも、水に対する溶解度などの特性に優れた物質を提供することを技術的課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0009】

前記課題を達成するために、本発明は、イソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。

【0010】

本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、さらに好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列からなっていてもよいが、これに限定されるものではない。

【0011】

本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖（ｓｉｄｅｃｈａｉｎ）を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いことが好ましい。本発明の他の好ましい具現例によれば、前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないことが最も好ましい。

【0012】

本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるペプチドであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0013】

また、本発明は、前記で開示されたいずれかの化合物を含む抗菌、抗炎症又は抗酸化用の薬学的組成物を提供する。

【0014】

また、本発明は、前記で開示されたいずれかの化合物を含む抗菌、抗炎症又は抗酸化用の化粧料組成物を提供する。

【0015】

本発明の一具現例によれば、前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、エアロゾルのような剤形を有してもよいが、これに限定されるものではない。

【発明の効果】

【0016】

本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、抗菌、抗炎症、又は抗酸化作用のような生理活性に優れるだけではなく、水での溶解度などの特性に優れるため、医薬品又は化粧品などの多様な分野に有用に用いられ得る。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】本発明の化合物及びイソトレチノインの水に対する溶解度を示す写真である。

【図2a】本発明の化合物及びイソトレチノインがセボサイトで発現される皮脂形成信号伝達に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を示すＲＴ－ＰＣＲの写真である。

【図2b】本発明の化合物及びイソトレチノインがセボサイトで発現される皮脂形成信号伝達に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を示すウェスタンブロット（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ）の写真である。

【図3a】本発明の化合物及びイソトレチノインが３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で脂肪形成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を示すＲＴ－ＰＣＲ写真である。

【図3b】本発明の化合物及びイソトレチノインが３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で脂肪形成（ｌｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ）に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を示すオイルレッド（ＯｉｌＲｅｄ）Ｏの染色写真である。

【図4】本発明の化合物及びイソトレチノインがＨａＣａＴ角質細胞で炎症と関連された遺伝子の発現に及ぶ影響を示すＲＴ－ＰＣＲの電気泳動写真である。

【図5】本発明の化合物及びイソトレチノインがＨａＣａＴ角質細胞でＭＭＰ（ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）の活性に及ぶ影響を示す電気泳動写真及びグラフである。

【図6】本発明の化合物及びイソトレチノインがセボサイトで細胞内の活性酸素種の含量に及ぶ影響を示すグラフである。

【図7】本発明の化合物及びイソトレチノインが３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞でガラスグリセロールの放出に及ぶ影響を示すグラフである。

【図8a】本発明の化合物及びイソトレチノインが３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で脂肪の分解と関連する遺伝子の発現に及ぶ影響を示すＲＴ－ＰＣＲ写真である。

【図8b】本発明の化合物及びイソトレチノインが３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で脂肪の分解と関連する遺伝子の発現に及ぶ影響を示すオイルレッドＯの染色写真である。

【発明を実施するための形態】

【0018】

前記課題を達成するために、本発明は、イソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。

【0019】

前記イソトレチノインは、化学式１３－シスレチノイン酸を表すものであって、下記化学式で表される化学的構造を有する。

【0020】

【化1】

【0021】

本明細書において、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によりアミノ酸が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは、本技術分野に公知の通常の生物学的又は化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）によって製造されてもよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９－５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔｅｔａｌ．，ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄｅｄ．、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍ．Ｃｏ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，１１１（１９８４））。

【0022】

前記ペプチドは、好ましくはイソトレチノインの水溶性を増加させるためのものであり、このような側面で、前記ペプチドは水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、さらに好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列からなる。本発明の好ましい具現例によれば、前記ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％と高いことが好ましい。他の一方、前記ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸の比率が５０％未満、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％と低いことが好ましい。

【0023】

本発明において、「親水性側鎖を有するアミノ酸」は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）を示し、「疎水性側鎖を有するアミノ酸」は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を示すが、これに限定されるものではなく、前記のような自然界に存在するアミノ酸以外にもこれらの変形体なども制限なく用いられてもよい。本発明の好ましい具現例によれば、前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、前記ペプチド内に５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下、より好ましくは１個以下で存在し、存在しないことが最も好ましい。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドは、配列番号１から配列番号４のアミノ酸配列から構成されるペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。

【0024】

本発明の一具現例によれば、本発明の化合物は、水に対する溶解度が優れ（図１参照）、また皮脂の形成に連関された信号伝達遺伝子及びタンパク質の発現を顕著に減少させることができる（図２ａ及び図２ｂ参照）。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、脂肪形成に連関された遺伝子の発現を顕著に減少させ、かつ、濃度依存的に細胞内の脂肪蓄積を減少させることができる（図３ａ及び図３ｂ参照）。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、炎症及び皮膚のしわの形成に関する遺伝子の発現と細胞内の活性酸素種の形成を顕著に減少させることができる（図４から図６参照）。本発明の他の具現例によれば、本発明の化合物は、従来に知られているイソトレチノインのニキビ治療効果以外にも、脂肪分解によるグリセロールの放出と脂肪分解に連関された遺伝子の発現を顕著に増加させるだけでなく、細胞内の脂肪蓄積を減少させる可能性があることを確認した（図７、図８ａ及び図８ｂ）。

【0025】

本発明の化合物は、それ自体でも安定性に優れるが、化合物に結合されたペプチドを構成する任意のアミノ酸を変形させることにより安定性がさらに向上され得る。本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮ－末端はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される保護基が結合されて安定性をさらに向上させることができる。本発明の他の具現例によれば、前記ペプチドはアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される保護基が結合されて安定性をさらに向上させることができる。

【0026】

前述したようなアミノ酸の変形は、本発明の化合物の安定性を大きく改善する作用をする。本明細書において、「安定性」という用語は、「生体内（ｉｎｖｉｖｏ）」安定性だけではなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）のような「試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）」安定性も包括する意味として用いられる。また、前述した保護基は、生体内及び試験管内でタンパク質切断酵素の攻撃から本発明の化合物を保護する作用をする。

【0027】

また、本発明は、前記化合物を有効成分として含む抗菌、抗炎症又は抗酸化用組成物を提供する。本発明の他の具現例によれば、本発明は、前記化合物を有効成分として含む皮膚状態改善用組成物を提供する。本発明において、前記組成物は、薬学的組成物又は化粧料組成物の形態であってもよいが、これに限定されるものではない。また、本発明の一具現例によれば、本発明の化合物による皮膚状態の改善は、ニキビの改善、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷の除去又は皮膚の再生であってもよいが、これに限定されるものではない。

【0028】

本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むため、この２つの間に共通された内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。

【0029】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の薬学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。

【0030】

本明細書において、「薬学的有効量」という用語は、前述した本発明の化合物の効能又は活性の達成に十分な量を意味する。

【0031】

本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、オキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤等をさらに含んでよい。好適な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈｅｄ．, １９９５）に詳しく記載されている。

【0032】

本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態に製造されるか又は多用量の容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態や、エックス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。

【0033】

本発明による薬学的組成物は、臨床投与時に経口又は非経口で投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態で用いられてよい。すなわち、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与されてよく、製剤化する場合には、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、生薬抽出物又は生薬発酵物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチン等を交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当されるところ、よく用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が用いられてよい。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等が用いられてよい。

【0034】

投薬の単位は、例えば、個別投薬量の１、２、３又は４倍で、又は１／２、１／３又は１／４倍で含有し得る。個別投薬量は、有効薬物が１回に投与される量を含有し、これは通常、１日投与量の全部、１／２、１／３又は１／４倍に該当する。

【0035】

本発明の薬学的組成物は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態に製造されるか又は多用量の容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態や、エックス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤又はゲル（例えば、ヒドロゲル）の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。

【0036】

本発明の好ましい具現例によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物であってもよい。

【0037】

本明細書において、「化粧品学的有効量」という用語は、前述した本発明の組成物の皮膚改善効能の達成に十分な量を意味する。

【0038】

本発明の化粧品組成物は、本技術分野で通常製造される任意の剤形にも製造されてよく、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレー等に剤形化されてよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゲル等のように、溶液、ゾルゲル、エマルジョン、オイル、ワックス、エアロゾル等の多様な形態に製造されてよいが、これらに限定されるものではない。

【0039】

本発明の剤形がペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク又は酸化亜鉛等が用いられてよい。

【0040】

本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート又はポリアミドパウダーが用いられてよく、特にスプレーの場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進体を含んでよいが、これらに限定されるものではない。

【0041】

本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤又は乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが用いられてよいが、これらに限定されるものではない。

【0042】

本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁液剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガー又はトラガカント等が用いられてよいが、これらに限定されるものではない。

【0043】

本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングである場合には、担体成分として、脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオン酸、イミダゾリウム誘導体、メチルタウリン、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体又はエトキシ化グリセリン脂肪酸エステル等が利用されてよいが、これらに限定されるものではない。

【0044】

本発明の剤形がヘアシャンプーである場合には、本発明の化合物に、増粘剤、界面活性剤、粘度調節剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、エッセンシャルオイル等のように、シャンプーを組成するためのベース成分を混合する。増粘剤としてはＣＤＥが用いられてよく、界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤であるＬＥＳと両性界面活性剤であるココベタイン、粘度調節剤としてはポリクオタニウム、保湿剤としてグリセリン、ｐＨ調節剤としてクエン酸、水酸化ナトリウム、防腐剤としてはグレープフルーツ抽出物が用いられてよく、それ以外にもシダーウッド、ペパーミント、ローズマリー等のエッセンシャルオイルと、シルクアミノ酸、ペンタノール、ビタミンＥが添加されてよい。本発明の一具現例によれば、前記本発明の化合物を１００重量部にするとき、ＣＤＥ５～１０重量部、ＬＥＳ３０～４０重量部、ココベタイン１０～２０重量部、ポリクオタニウム０.１～０.２重量部、グリセリン５～１０重量部、グレープフルーツ抽出物０.１～１.０１重量部、シルクアミノ酸０.５～１重量部、ペンタノール０.５～１重量部、ビタミンＥ０.５～２重量部、エッセンシャルオイルとしてシダーウッド、ペパーミント、ローズマリーのうち一つが０.０１～０.１重量部混合されてよいが、これらに限定されるものではない。

【0045】

本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としての本発明の化合物と担体成分の他に化粧品組成物に通常用いられる成分を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤を含んでよいが、これらに限定されるものではない。

【実施例】

【0046】

以下、実施例を介して本発明を詳しく説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例によって限定されるものではない。

【0047】

実施例１．本発明の化合物の合成
＜１－１＞配列番号１のペプチドの合成
７００ｍｇのクロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏｔｒｉｔｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅｒｅｓｉｎ；ＣＴＬｒｅｓｉｎ，Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ［００６４］ＣａｔＮｏ.０１－６４－００２１）を反応容器に入れ、メチレンクロリド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間の間撹拌した後、再び溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）－ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄してメタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かし、１０分間反応させて過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再び溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れ、１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて再び１０分間反応を維持した後、溶液を除去してそれぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＭｅｔ－ＣＴＬ樹脂を製造した。

【0048】

新たな反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを分画して２回にわたって入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を、脱保護された樹脂がある反応容器に入れ、１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応樹脂を少量採取してカイザーテスト（ＮｉｈｙｄｒｉｎＴｅｓｔ）を用いて反応の程度を点検した。脱保護溶液で前記と同様に２回脱保護反応させ、Ｖａｌ－Ｍｅｔ－ＣＴＬ樹脂を製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄し、再度カイザーテストを行った後、前記と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。

【0049】

選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＦｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）の順で連鎖反応をさせた。Ｆｍｏｃ－保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間の間アセチル化を行った後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ_２Ｏ_５下で真空に減圧して完全に乾燥してから、脱漏溶液［トリフルオロ酢酸９５％、蒸溜水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振りながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行って樹脂を濾過し、樹脂を少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合わせた。減圧を用いて全体の体積が半分程度残るように蒸溜し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を誘導した後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去して窒素下で十分乾燥し、精製前のＲＲＬＩＤＲＴＮＡＮＦＬＶＭペプチド（配列番号１）を１．４９ｇ合成した（収率：８６．５％）。分子量測定器を用いて測定したとき、分子量１７１９．１（理論値：１７１９．２）を得ることができた。

【0050】

【表1】

【0051】

＜１－２＞本発明の化合物の合成
ペブタイト反応器に脱保護されたペプチド（１ｍｍｏｌ）とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れ、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２７０ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）とヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢＯＰ）１．０４ｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）とイソトレチノイン２７７ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）を添加して３０分間反応させた。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３８８ｍｇ（３ｅｑｕｉｖ．）を添加し、常温で２～４時間の間反応させ、ジエチルエーテル１０ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）を用いて再結晶をして濾過後、ハイブリッドペプチドを収得した。

【0052】

実験例１．本発明の化合物の溶解度テスト
前記実施例＜１－２＞で製造されたイソトレチノイン－ペプチド化合物とイソトレチノインをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸溜水に溶解させた。
その結果、イソトレチノイン自体は水に殆ど溶解されないのと対照的に、本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物は、いずれも水に完全に溶解されることを確認した（図１）。

【0053】

実験例２．本発明の化合物の皮脂形成信号伝達の遺伝子発現抑制の効果
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物が皮脂形成に連関された信号伝達遺伝子の発現に及ぶ影響を確認するため、ＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。具体的に、セボサイトに刺激源として１００μＭのアラキドン酸を処理して刺激させた後、１又は１０μＭの本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを処理し、２４時間培養した後、培養された細胞から下記のような方法でＲＮＡを分離した後、下記表２に記載されたプライマーを用いて前記化合物が皮脂の形成に関与する信号伝達分子であるｃＥＢＰα、ＰＰＡＲγ及びＳＲＥＢＰ１ｃの発現に及ぶ影響を確認した。ＲＮＡ抽出キット（ＱｉａｇｅｎＲＮｅａｓｙｋｉｔ）を用いて細胞の全体ＲＮＡを抽出し、ＲＮＡから単一本ＤＮＡを合成するために３μｇＲＮＡ、ランダムヘキサマー２μｇとＤＥＰＣを処理した水を加え、６５℃で５分間反応させた。５×ファーストストランドバッファ５×ファーストストランドバッファー、０．１ＭＤＴＴ、１０ｍＭｄＮＴＰ、逆転写酵素を入れて総２０ｍｌとなるようにし、４２℃で１時間の間反応させた。再び９５℃で５分間加熱した後、蒸溜水２０ｍｌを加えて最終４０ｍｌのｃＤＮＡを作った。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、３μｌｃＤＮＡ、ｃＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＧＡＰＤＨの各遺伝子に特異的な、下記表２に示した１０ｐｍｏｌｅのプライマー、１０×Ｔａｇバッファ、１０ｍＭｄＮＴＰ及びｉ－ＴａｇＤＮＡ重合酵素を混合して行った。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、５５～５６℃で３０秒、７２℃で３０秒で反応させた。サイクル数の遺伝子は、ＰＣＲ結果が指数的に増幅し得る条件で分析した。５ｍｌのＰＣＲ産物を得て１％のアガローズゲルに電気泳動し、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）で染色して皮脂形成信号伝達遺伝子であるｃＥＢＰα、ＰＰＡＲγ、ＳＲＥＢＰ１ｃのｍＲＮＡレベルを確認した。

【0054】

【表2】

【0055】

また、セボサイトに対し、刺激源としてニキビ菌であるプロピオニバクテリウムアクネス（１００μｇ／ｍｌ）を４８時間の間処理して刺激させた後、１又は１０μＭの本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを処理し、皮脂の形成に連関された信号伝達タンパク質であるＣＥＢＰα及びＰＰＡＲγの発現をウェスタンブロット分析で確認した。その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べてかなり低い濃度でも皮脂の形成に連関された信号伝達遺伝子及びタンパク質の発現をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図２ａ及び図２ｂ）。

【0056】

実験例３．本発明の化合物の脂肪形成抑制の効果
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物が脂肪形成に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を確認するため、ＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。具体的に、３Ｔ３Ｌ１脂肪前駆細胞を２×１０^４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種して培養した後、０．５ｍＭＩＢＭＸ、０．２５μＭデキサメタゾン、１μｇ／ｍｌインシュリンが含まれた分化培地に交換し、１０μＭの本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノイン１０μＭとともに１０日間培養した後、前記化合物が脂肪形成に関与する遺伝子であるＰＰＡＲγ、ＡＣＣ及びａＰ２の発現に及ぶ影響を確認した。このため、ＰＰＡＲγ、ＡＣＣ及びａＰ２に特異的なプライマーとして下記表３で示したプライマーを用いたことを除いては、前記実験例２と同一の方式でＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0057】

【表3】

【0058】

また、本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物による脂肪の蓄積抑制の効果を測定するため、３Ｔ３Ｌ１細胞を２×１０^４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種して培養した後、１０μｇ／ｍｌインシュリン、０．１μＭデキサメタゾン及び０．５μＭＩＢＭＸが含まれた分化培地に交換し、本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを処理した。その後２日ごとに１０ｕｇ／ｍｌのインシュリンが含まれた培地に交換し、分化誘導９日目オイル－レッドＯ染色の分析を行った。このため、細胞をＰＢＳで洗浄した後、４％パラホルムアルデヒドを１０分間処理して固定し、蒸溜水で洗浄した後、６０％イソプロパノールで５－１０分間インキュベーションした。固定された細胞は、オイルレッド溶液［イソプロパノール内の１％オイルレッドを６：４の体積比でｄＨ２Ｏに希薄］で３０分間染色させた後、再びＰＢＳで洗浄した。染色された細胞は、光学顕微鏡で観察した後、蒸溜水で洗浄し、１００％イソプロパノールを１ｍｌずつ入れて４℃で混ぜた後、翌日５１０ｎｍ波長で定量した。その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べて脂肪形成に連関された遺伝子の発現を顕著に減少させ（図３ａ）、また化合物に依存的な細胞内脂肪蓄積の程度が減少することを確認した（図３ｂ）。

【0059】

実験例４．本発明の化合物の炎症抑制の効果
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物がニキビ菌によって誘導される炎症に及ぶ影響を確認するため、ＲＴ－ＰＣＲ分析を行った。具体的に、６ウェルプレートの各ウェルにＨａＣａＴ角質細胞を３００，０００細胞ずつ接種した後、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液（Ｇｉｂｃｏ、米国）で２４時間の間、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。新鮮な培地に交換した後、５０μｇ／ｍｌのニキビ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、５０μＭのサリチル酸及び１０μＭ又は５０μＭのＣＧ－Ｄｉｎｆｌａを処理し、処理されたニキビ菌に本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物と良性対照群として用いられたイソトレチノインを１又は１０μＭの濃度で処理した後、前記と同一の条件で２４時間の間培養した後、前記化合物が炎症形成に関与する遺伝子であるＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ及びＴＮＦ－αの発現に及ぶ影響を確認した。このため、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａ及びＴＮＦ－αに特異的なプライマーとして下記表４に示したプライマーを用いたことを除いては、前記実験例２と同一の方式でＲＴ－ＰＣＲを行った。

【0060】

【表4】

【0061】

その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べて遥かに低い濃度でも炎症の形成に連関された遺伝子の発現をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図４）。

【0062】

実験例５．本発明の化合物のＭＭＰ活性抑制の効果
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物がニキビ菌によって誘導されるＭＭＰの活性に及ぶ影響を確認した。具体的に、ＨａＣａＴ角質細胞を培養後、１又は１０μＭの本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを細胞に前処理し、３０分後に刺激剤であるニキビ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を処理した。４８時間培養した後、培養液を収去し、前記培養液とザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）バッファ（シグマアルドリッチ）を１：１で反応させた後、２０μｌの反応液を８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（１０％ｇｅｌａｔｉｎ）で電気泳動した。その後、ゲルを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００バッファ（シグマアルドリッチ）で１０分間３回洗浄し、ＴＮＣＢバッファ（シグマアルドリッチ）で活性化させ、クマシブルー染色した後、バンドの強度を測定した。

【0063】

その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べて遥かに低い濃度でも皮膚しわの形成に連関されたＭＭＰ－９遺伝子の発現をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図５）。

【0064】

実験例６．本発明の化合物の細胞内の活性酸素種抑制の効果
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物がニキビ菌によって誘導される細胞内の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）の形成に及ぶ影響を確認した。具体的に、セボサイトを１×１０^６細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し、一晩の間培養した。本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを細胞に前処理して３０分後に刺激剤であるニキビ菌（Ｐ．ａｃｎｅｓ）を１００ｕｇ／ｍｌの濃度で処理し、４８時間の間培養した。ＤＣＦ－ＤＨを処理して３０分後、ＦＡＣＳを用いて蛍光の程度に酸化活性を測定した。

【0065】

その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べてニキビ菌により誘導される細胞内ＲＯＳの形成をより顕著に減少させる可能性があることを確認した（図６）。

【0066】

実施例７．本発明の化合物の脂肪分解の効果（１）
脂肪細胞は、余分のエネルギーを脂肪滴（ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔ）中に中性脂肪の形態で貯蔵するが、エネルギーが必要となると、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ａｄｉｐｏｓｅｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｌｉｐａｓｅ）とＨＳＬ、モノグリセリドリパーゼ（ｍｏｎｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅｌｉｐａｓｅ）のような酵素により脂肪酸とグリセロールに分解され、エネルギーを生産したり細胞信号の伝達又は脂肪合成に用いる。よって、本発明者は、実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物が脂肪分解（ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ）に及ぶ影響を確認するため、ガラスグリセロールの放出及び細胞内のトリグリセロール含量分析を行った。具体的に、３Ｔ３－Ｌ１細胞を２×１０^４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに接種した後（ＤＭＥＭ、１０％ＢＣＳ）、２日間培養した。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に交換した後、２日間培養し、０．５ｍＭＩＢＭＸ、０．２５μＭデキサメタゾン及び１０μｇ／ｍｌインシュリンを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で２日間さらに培養した。以後、１μｇ／ｍｌインシュリンを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で２日間培養した後、再び１μｇ／ｍｌインシュリンを含むＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）で３日間培養した。ＦＢＳ培地に交替するとき、本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物又はイソトレチノインを細胞に処理し、分化８日目の培養液を収去してグリセロール比色分析キット（Ｃａｙｍａｎ）を用いてグリセロール分析を行った。

【0067】

その結果、本発明のイソトレチノインとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、イソトレチノインと比べて脂肪分解によるグリセロールの放出を顕著に増加させた（図７）。

【0068】

実施例８．本発明の化合物の脂肪分解の効果（２）
実施例＜１－２＞で合成された本発明のイソトレチノイン－ペプチド化合物が脂肪分解に連関された遺伝子の発現に及ぶ影響を確認するため、前記実験例３に開示されたものと同一の方法でＲＴ－ＰＣＲ分析及びオイルレッドＯ染色を行った。このとき、脂肪分解に関与する遺伝子としては、ＣＰＴ１ａ、Ａｃｏｘ、ＨＳＬ及びＡＴＧＬを用いて、前記遺伝子に特異的なプライマーとして下記表５に示したプライマーを用いた。対照群として用いられたＴＮＦ－αの場合、一般的に脂肪分解の効果が知られており、脂肪分解因子であるＨＳＬのリン酸化及びＡＴＧＬの発現増加の機能を有しており、これを対照群として用いることにより本発明の化合物の効果を比べた。

【0069】

【表5】