▶ チルドレンズ リサーチ インスティテュート、チルドレンズ ナショナル メディカル センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-01-31
(45)【発行日】2022-02-08
(54)【発明の名称】エキノマイシン製剤、その製造法および使用法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/12 20060101AFI20220201BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220201BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20220201BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20220201BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20220201BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220201BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220201BHJP
【ＦＩ】
A61K38/12
A61K9/127
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/69
A61P35/00
A61P43/00 105
A61P35/02
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2018543294
(86)(22)【出願日】2016-11-09
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-11-15
(86)【国際出願番号】 US2016061157
(87)【国際公開番号】W WO2017083403
(87)【国際公開日】2017-05-18
【審査請求日】2019-10-29
(31)【優先権主張番号】62/253,257
(32)【優先日】2015-11-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517158728
【氏名又は名称】チルドレンズ リサーチ インスティテュート、チルドレンズ ナショナル メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100100181
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 正博
(72)【発明者】
【氏名】リウ ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ワン イン
(72)【発明者】
【氏名】リウ ヤン
(72)【発明者】
【氏名】ベイリー クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ツェン パン
【審査官】横田 倫子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３１５７１１２（ＣＮ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５３２６９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５３５２６７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１５９７６０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００７－５１１５０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２９６３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２６４６９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Curr Med Chem., 2011, Vol.18, p.3168-3189
【文献】J Biol Chem., 2009, Vol.284 No.21, p.14001-14010
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００
Ａ６１Ｋ ９／００
Ａ６１Ｋ ４７／００
Ａ６１Ｐ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者における疾患を治療することを目的としたＰＥＧ化リポソーム医薬製剤であって：エキノマイシン、
ＰＥＧ化リン脂質、
中性ホスホグリセリド、および
ステロールを含み、
前記製剤が前記エキノマイシンを封入する複数のＰＥＧ化リポソームを含み、
前記リポソームが医薬として許容される担体に懸濁され、
前記製剤中のリポソームの少なくとも９０％が８０から１２０ｎｍの間の直径を有し、且つ
前記疾患がＨＩＦ－１αの過剰発現によって特徴付けられる、
前記製剤。
【請求項2】
請求項１に記載の前記製剤であって、前記ＰＥＧ化リン脂質がジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ）、ジパルミトイルグリセロサクシネートポリエチレングリコール（ＤＰＧＳ－ＰＥＧ）、コレステリル－ポリエチレングリコール、またはセラミドベースのペグ化脂質である前記製剤。
【請求項3】
請求項１または２に記載の前記製剤であって、前記中性ホスホグリセリドがホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルイノシトールからなる群から選択される前記製剤。
【請求項4】
請求項１から３のいずれか１つに記載の前記製剤であって、前記製剤中の総脂質に対する前記ＰＥＧ化リン脂質のモル比が３から６％であって、前記製剤中の総脂質に対する前記中性ホスホグリセリドのモル比が４５から６５％の間であって、且つ
前記製剤中の総脂質に対する前記ステロールのモル比が３０から５０％の間である前記製剤。
【請求項5】
請求項１から４のいずれか１つに記載の前記製剤であって、前記ＰＥＧ化リン脂質がジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり、前記中性ホスホグリセリドがホスファチジルコリンであり、且つ前記ステロールがコレステロールである前記製剤。
【請求項6】
請求項５に記載の前記製剤であって、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、およびコレステロールを含む前記製剤。
【請求項7】
請求項６に記載の前記製剤であって、総脂質に対するＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００、ＨＳＰＣおよびコレステロールのモル比がそれぞれ５．３％、５６．３％、および３８．４％である前記製剤。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか１つに記載の前記製剤であって、総脂質に対するエキノマイシンの質量比が２から１０％の間である前記製剤。
【請求項9】
請求項１から７のいずれか１つに記載の前記製剤であって、総脂質に対するエキノマイシンの質量比が５％である前記製剤。
【請求項10】
請求項１から９のいずれか１つに記載の前記製剤であって、前記リポソームの平均多分散性指数が＜０．１であり且つ前記リポソームおよびが４℃で少なくとも１２ヶ月間の有効期限を達成するのに十分安定である前記製剤。
【請求項11】
請求項１から１０のいずれか１つに記載の前記製剤であって、前記リポソームが凍結乾燥粉末として製剤化される前記製剤。
【請求項12】
請求項１から１１のいずれか１つに記載の前記製剤であって、前記疾患が癌である前記製剤。
【請求項13】
請求項１２に記載の前記製剤であって、前記癌が白血病である前記製剤。
【請求項14】
請求項１２に記載の前記製剤であって、前記癌が乳癌である前記製剤。
【請求項15】
請求項１に記載の前記製剤を生成するための方法であって：極性溶媒中に前記エキノマイシンと、前記ＰＥＧ化リン脂質、前記中性リン脂質および前記ステロールを含む脂質成分を含む混合物を得ること；
前記混合物を乾燥して前記極性溶媒を除去し、これにより乾燥脂質フィルムを形成すること；
前記乾燥脂質フィルムをバッファーに溶解して脂質懸濁液を形成すること；
前記脂質懸濁液をポリカーボネートフィルターから押し出して所望の粒径範囲のリポソームを達成すること；および
前記リポソームを濾過により滅菌することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０１５年１１月１０日に出願された米国特許仮出願第６２／２５３，２５７号明細書に対する優先権を主張する。前述の明細書の全文は参照文献として本願に援用される。
【0002】
本願は、全般的に、増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫応答の治療を目的とした、リポソームエキノマイシン製剤を調製および送達するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0003】
低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は転写因子であり、かつ低酸素に対する細胞反応を媒介する。ＨＩＦは多くの癌、自己免疫疾患および同種免疫応答においてアップレギュレートされることが知られている。具体的には、ＨＩＦは腫瘍の代謝、血管新生、および転移に関与する（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３；３（１０）：７２１－３２）。
【0004】
エキノマイシン（ＮＳＣ５２６４１７）はキノキサリンファミリーの１つであり、始めは１９５７年にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓから分離された。エキノマイシンは、ＨＩＦ１αのＤＮＡ結合活性を阻害する小分子である。エキノマイシンは、インビトロおよびインビボで、Ｂ１６黒色腫およびＰ３８８白血病移植マウス腫瘍およびヒト腫瘍増殖に対して抗腫瘍活性を呈することが示されている。さらにエキノマイシンは、異種モデルにおいて、白血病幹細胞を優先的に除去することにより、マウス急性リンパ球性白血病およびヒト急性骨髄性白血病を効果的に根絶することが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１１；８（４）：３９９－４１１）。
【0005】
エキノマイシンは、米国国立癌研究所によって治験に付された。しかし、これらの試験で用いられたエキノマイシンは、治療歴のある患者に対して有意な抗腫瘍活性を示さなかった。数年にわたって、固形癌に対する複数の第Ｉ相（７～１１）および第ＩＩ相（１２～１９）治験が実施されている。しかし、全ての既存の治療法に対して不応性の固形腫瘍を有する患者に対し、この薬剤は一定した効果を示さなかったので、エキノマイシンの臨床開発は停止した。当該試験は、エキノマイシンがＨＩＦ阻害剤であることが判明するはるか以前に実施されたので（Ｋｏｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５；６５（１９）：９０４７－５５）、有効性試験はＨＩＦの抑制による利益の可能性を評価するように設計されていなかった。エキノマイシンは、いくつかの第ＩＩ相試験においてヒトに対して１２００μｇ／ｍ２の用量で使用されたものの、１９８５年～１９９２年には薬物濃度を測定する方法がなかったので、薬物動態（ＰＫ）データは現れていない。しかし、最近は新たな方法が現れ、エキノマイシンはインビボ半減期が短く、そのため臨床的使用は限られることが判明した。
【0006】
エキノマイシンは水に極めて不溶性であるので、薬剤を適切な剤型に製剤化する手段を複雑にする。エキノマイシンは、水に溶かすと溶液から速やかに沈殿するので、遊離薬剤と水性溶媒の混合に依拠する製剤は、いずれも受容者に十分なバイオアベイラビリティをもたらすことができない。さらに、ＤＭＳＯなどのエキノマイシンが溶解する入手可能な溶媒は、患者に対して強い刺激性があるので臨床的に許容されない。エキノマイシンの臨床試験により、重度の悪心および嘔吐などの重大な副作用の報告も判明し、その臨床的使用をさらに制限している。
【0007】
上記の制限の観点から、無毒性であり、且つ増殖性疾患、自己免疫疾患、移植片対宿主病、またはＨＩＦ－１抑制を必要とする他の任意の疾患に対して有効である、新規の有効なエキノマイシン製剤に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本願の１つの態様は、ＨＩＦ－１αおよび／またはＨＩＦ－２αの過剰発現によって特徴付けられる、患者における疾患を治療するためのリポソーム医薬製剤に関する。リポソーム医薬製剤は、医薬として許容される担体内に複数のリポソームを含有する。リポソームはエキノマイシンを封入し、ＰＥＧ化リン脂質、中性ホスホグリセリド、およびステロールから作られる。
【0009】
１つの実施形態においては、ＰＥＧ化リン脂質はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ）、ジパルミトイルグリセロサクシネートポリエチレングリコール（ＤＰＧＳ－ＰＥＧ）、コレステリル－ポリエチレングリコール、またはセラミドベースのＰＥＧ化脂質である。
【0010】
他の実施形態においては、中性ホスホグリセリドはホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチジルイノシトールからなる群から選択される。
【0011】
他の実施形態においては、製剤中の総脂質に対するＰＥＧ化リン脂質のモル比は３から６％であり；製剤中の総脂質に対する中性ホスホグリセリドのモル比は４５から６０％％の間であり；かつ製剤中の総脂質に対するステロールのモル比は３０から５０％％の間である。
【0012】
１つの実施形態においては、ＰＥＧ化リン脂質はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）であり、中性ホスホグリセリドはホスファチジルコリンであり、かつステロールはコレステロールである。
【0013】
具体的な実施形態においては、リポソームはＤＳＰＥ－ＰＥＧ－２０００を５．３％、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）を５６．３％、およびコレステロールを３８．４％含む。
【0014】
一定の実施形態においては、総脂質に対するエキノマイシンの質量比は２から１０％の間である。具体的な実施形態においては、総脂質に対するエキノマイシンの質量比は５％である。
【0015】
一部の実施形態においては、製剤中のリポソームの少なくとも９０％が８０から１２０ｎｍの間の直径を有する。
【0016】
一部の実施形態においては、リポソームの平均多分散性指数は＜０．１であり、且つリポソームおよびは４℃で少なくとも１２ヶ月間の有効期限を達成するのに十分安定である。
【0017】
一部の実施形態においては、リポソームは凍結乾燥粉末として製剤化される。
【0018】
他の態様においては、本願によるＰＥＧ化リポソーム製剤を用いて、ＨＩＦ－１αおよび／またはＨＩＦ－２αの過剰発現によって特徴付けられる、患者における疾患を治療するための方法は、それを必要とする患者にＰＥＧ化製剤を投与することを含み、リポソーム製剤は疾患を治療するのに十分な量のエキノマイシンを含む。
【0019】
１つの実施形態においては、疾患は増殖性疾患である。具体的な実施形態においては、増殖性疾患は白血病である。他の実施形態においては、増殖性疾患は乳癌である。
【0020】
他の実施形態においては、疾患は自己免疫疾患である。
【0021】
他の実施形態においては、疾患は移植片対宿主病である。
【0022】
さらなる態様においては、本願によるＰＥＧ化リポソーム製剤を製造するための方法は、極性溶媒中にエキノマイシンと、ＰＥＧ化リン脂質、中性リン脂質およびステロールを含む脂質成分を含む混合物を形成すること；混合物を乾燥させて極性溶媒を除去し、これにより乾燥脂質フィルムを形成すること；乾燥脂質フィルムをバッファーに溶解して脂質懸濁液を形成すること；ポリカーボネートフィルターから脂質懸濁液を押し出して所望の粒径範囲のリポソームを得ること；および濾過によりリポソームを滅菌することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】リポソームエキノマイシンの物理的特性。（Ａ）マルバーンゼータサイザーソフトウェア上で動的光散乱（ＤＳＬ）により測定した典型的な製剤の粒径分布。（Ｂ）リポソームエキノマイシンの平均粒径およびゼータ電位の要約。データは、６回の独立した調製±標準偏差の要約である。測定はマルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いて実施した。
【図2】インビトロにおけるリポソームエキノマイシンからのエキノマイシンの放出。（パネルＡ）２１℃のｄｄＨ２Ｏで透析したリポソームエキノマイシンの薬剤放出曲線。データポイントはＨＰＬＣによる３回の測定の平均±標準偏差を示す。（パネルＢ）（パネルＡ）にプロットした測定時に対応するエキノマイシンピークを示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラム。
【図3】インビトロにおけるリポソームエキノマイシンの保存および安定性。（パネルＡおよびパネルＢ）リポソームエキノマイシンを４℃で保存し、１ヶ月および３ヶ月保存した後サンプリングして安定性パラメータを測定した。０ヶ月は調製直後の測定値を示す。４℃で保存中のリポソームエキノマイシンの粒径とゼータ電位測定値の平均（パネルＡ）および多分散性指数（ＰｄＩ）の平均（パネルＢ）。データはマルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いて生成し、誤差棒は３回の測定値の標準偏差を示した。（パネルＣ）初期値（０ヶ月）に対する百分率として示した、４℃での保存中のエキノマイシン含有量損失のＨＰＬＣ分析。誤差棒は３回の測定値の標準偏差を示す。
【図4】リポソームエキノマイシンと遊離エキノマイシンの毒性および有効性の比較。（パネルＡ）リポソームエキノマイシン、ＰＢＳエキノマイシン（２０％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ）、または同等の用量の空のリポソーム担体を治療サイクルで投与した雌性ＮＳＧマウスにおける体重変動。２５０μｇ／ｋｇのリポソームエキノマイシン（ｎ＝７）または遊離エキノマイシン（ｎ＝７）、または同等の担体（ｎ＝４）を、１日おきに合計３回マウスに静脈内投与した）。（パネルＢ）１ｍｇ／ｋｇのリポソームエキノマイシンまたは遊離エキノマイシン、または同等の用量の空のリポソーム担体を静脈内単回投与したＮＳＧマウスの生存率。
【図5】リポソームエキノマイシンと遊離エキノマイシンの薬物動態の比較。０．１ｍｇ／ｋｇリポソームエキノマイシンまたは遊離エキノマイシンの静脈内単回投与後、ＭＳで検出した血清血漿エキノマイシンのレベル。
【図6】エキノマイシンの腫瘍内蓄積。リポソームエキノマイシンおよびエキノマイシンの従来型製剤の静脈内投与（０．１ｍｇ／ｋｇ）後の乳腺腫瘍ＳＵＭ１５９におけるエキノマイシン濃度。ｎ＝３／測定時。
【図7】ＨＩＦ－１αのＥＴＰ－ＡＬＬ内蓄積。（パネルＡ）ＥＴＰ－ＡＬＬ異種移植モデルの脾臓におけるＨＩＦ－１αタンパク質レベルを、ウェスタンブロッティングで測定した。（パネルＢ）異種移植マウスの脾臓から採取したＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞を抗ｈＣＤ４５およびＣＤ１１７表面マーカーで染色し、さらにＡＰＣ－コンジュゲート化ＨＩＦ－１α抗体で細胞内染色した後、ＦＡＣＳ分析した。
【図8】リポソームエキノマイシンは異種移植マウスモデルにおいてヒトＥＴＰ－ＡＬＬ細胞を消失させる。（パネルＡ）パネルＢのデータを目的としたＥＴＰ－ＡＬＬヒト化マウスに対するリポソームエキノマイシンの投与レジメン。０日目はヒトＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞の移植日を示す。緑の矢印はそれぞれ１回のリポソームエキノマイシン注射（０．３５ｍｇ／ｋｇ／静脈内注射）を示す。赤い矢印は血液検査を示す。（パネルＢ）１．３Ｇｙｓで照射したＮＳＧマウスに１×１０６個のヒトＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞を静脈内注射した。レシピエントのＰＢＭＣ中のヒトＣＤ４５＋細胞を、移植後３４日目にＦＡＣＳ分析で検出した。マウスに対する投与前（３４日目）および投与後（４２、５６、６４日目）（担体およびリポソームエキノマイシン投与）のレシピエントマウスのＰＢＭＣにおけるヒトＣＤ４５＋の割合をＦＡＣＳ分析した。担体またはリポソームエキノマイシンを投与した全レシピエントマウスのＰＢＭＣにおけるヒトＣＤ４５＋の割合の要約（各群ｎ＝１０）。（パネルＣ）忍容性の良好な用量では、リポソームエキノマイシンは遊離エキノマイシンの最大効果よりも有効であった。ＮＳＧマウスを１．３Ｇｙｓで照射し、１×１０６個のヒトＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞を静脈内注射した。投与前の２１日目にＦＡＣＳ分析を実施した。２２日目は、マウスに１回目の投与を行った。レシピエントマウス群（ＰＢＳ－ＥＭ、ｎ＝５）の１つに、ＰＢＳ中のエキノマイシンを３サイクル投与した（合計１５回投与）。サイクル毎に、マウスにＰＢＳ中のエキノマイシンを０．１ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回、合計５回静脈内注射した後、５日間休薬し、その後次のサイクルを開始した。もう１つのレシピエント群（Ｌｉｐｏ－ＥＭ、ｎ＝５）は、マウスにリポソームエキノマイシン０．３５ｍｇ／ｋｇを静脈内注射した。リポソームエキノマイシンは、始めは２２日目から４日おきに２回投与し、その後７日間休薬した。その後、マウスに１日おきに４回投与し、その後７日間休薬し、さらに４回隔日投与して終了した（合計１０回投与）。もう１つのマウス群（ｎ＝５）には空のリポソーム担体を、リポソームエキノマイシンを投与したのと同じスケジュールにしたがって投与した。マウスにエキノマイシンを投与した後（３４、５０、６５日目）、レシピエントのＰＢＭＣにおけるヒトＣＤ４５＋の割合をＦＡＣＳ分析で分析した。
【図9】エキノマイシンはインビトロで生存乳癌細胞数を減少させた。ＨＩＦ－１αレベルの高い（ＳＵＭ１５９）または低い（ＭＣＦ７）乳癌細胞を、多様な濃度のエキノマイシンでインビトロ処理した。エキノマイシン濃度と、エキノマイシンと共に培養した生存細胞の相対的な割合の相関を示す。ＨＩＦ－１αの高いＳＵＭ１５９細胞は、ＨＩＦ－１αの発現が低いＭＣＦ７よりもエキノマイシンに対する感度が高い。
【図10】異種移植乳癌細胞におけるエキノマイシンの蓄積。ヒト乳癌細胞株ＳＵＭ－１５９にルシフェラーゼを形質移入し、雌性ＮＳＧマウスの乳腺脂肪体に同所異種移植した。Ｄｉｒ標識リポソームまたは遊離Ｄｉｒ水水溶液を、図の下の概要に従って異種移植マウスに投与した。生物発光撮影を用いて、異種移植細胞のルシフェラーゼ発現（上パネル）、および生物発光撮影によるリポソームエキノマイシンの有無（下パネル）を評価した。
【図11】インビボにおける乳癌細胞に対するリポソームエキノマイシンの治療効果。（パネルＡ）雌性ＮＳＧマウスにヒトＳＵＭ１５９乳癌細胞を異種移植し、遊離エキノマイシンまたは担体を投与した（各群ｎ＝１０）。遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇまたは担体を２８日目から３日おきに合計６回静脈内注射した。ＳＵＭ１５９の増殖動態を示す。（パネルＢ）雌性ＮＳＧマウスにＳＵＭ１５９乳癌細胞を異種移植し、リポソームエキノマイシンまたは担体を投与した（各群ｎ＝５）。担体およびリポソームエキノマイシンを投与したレシピエントマウスにおけるＳＵＭ１５９の増殖動態を示す。９、１１、１３、２５および２７日目に、リポソームエキノマイシン０．３５ｍｇ／ｋｇまたは担体をマウスに静脈内注射した。実験期間を通じ、平均腫瘍体積を記録した。誤差棒は±標準誤差を示す。個々の投与および用量はアスタリスクで示す。（パネルＣ）マウスを安楽死させ、腫瘍を切除して写真撮影した。（パネルＤ）担体およびリポソームエキノマイシン投与マウスから採取した乳癌の腫瘍重量の要約。重量は平均重量±標準偏差として表示し、ｐ値はｔ検定で算出した。
【発明を実施するための形態】
【0024】
別段の定義がない限り、本願で用いる全ての技術および科学用語は、本開示の方法および組成物が属する技術に精通した当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本願および付属の請求項で用いる単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈より別段の明確な指示がない限り複数の言及を含むことに留意しなければならない。したがって、たとえば、「１つのペプチド」への言及は複数のそのようなペプチドを含み、「そのペプチド」への言及は当業者に既知の１つ以上のペプチドおよびその同等物への言及である、などである。
【0025】
本願で用いる用語「細胞増殖性疾患」は、細胞の異常な増殖によって特徴付けられる障害を指す。増殖性疾患は、細胞の成長率に関するいかなる制限も意味せず、単に増殖および細胞分裂に影響する正常な制御の喪失を示す。したがって、一部の実施形態においては、増殖性疾患の細胞は正常細胞と同じ細胞分裂速度を有することがあるが、そのような成長を制限するシグナルに反応しない。「細胞増殖性疾患」の範囲内に、組織の異常な増殖である新生物または腫瘍が存在する。「癌」は、周辺の組織に浸潤および／または新たな定着部位に転移する能力を有する、細胞の増殖によって特徴付けられる多様な悪性新生物のうち任意の１つを指し、白血病、リンパ腫、癌腫、黒色腫、肉腫、胚細胞性腫瘍、および芽細胞腫を含む。本開示の方法による治療の対象となる典型的な癌は、脳、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、腎臓、肺、非小細胞肺、中皮腫、卵巣、前立腺、胃、および子宮の癌、白血病、および髄芽腫を含む。
【0026】
用語「白血病」は、血液形成器官の進行性悪性疾患を指し、一般的には血液および骨髄における白血球およびその前駆体の歪な増殖および発生によって特徴付けられる。典型的な白血病は、たとえば急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病、非白血性白血病、白血球症性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽球性白血病、血球始原細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ性白血病（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞性白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄性顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血病性白血病、および未分化細胞性白血病などを含む。
【0027】
用語「癌腫」は、周辺組織に浸潤し且つ転移を引き起こす傾向のある、上皮細胞の悪性増殖を指す。典型的な癌腫は、たとえば腺房癌、小葉癌、腺嚢癌腫、腺様嚢胞癌、腺癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｄｅｎｏｍａｔｏｓｕｍ）、副腎皮質癌、肺胞癌、肺胞上皮癌、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、類基底細胞癌、基底扁平細胞癌、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌、気管支原性癌、大脳様癌、胆管細胞癌、絨毛膜癌、膠様癌（ｃｏｌｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、面皰癌、子宮体癌、篩状癌、鎧状癌、皮膚癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｕｔａｎｅｕｍ）、円柱癌、円柱細胞癌、管癌、硬癌、胎児性癌、脳様癌（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、エピエノイド癌腫（ｅｐｉｅｎｎｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、腺様上皮癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｅ ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、外方発育癌、潰瘍癌、線維性癌、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｉｆｏｒｍ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠様癌（ｇｅｌａｔｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、巨細胞癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｇｉｇａｎｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、腺癌（ｇｌａｎｄｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、顆粒細胞癌、毛母組織癌、血様癌、肝細胞癌、ヒュルトレ細胞癌、硝子状癌、ハイペメフロイド癌腫（ｈｙｐｅｍｅｐｈｒｏｉｄ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、幼児型胎児性癌、上皮内癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌、上皮内癌（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌、クルチツキー細胞癌、大細胞癌、レンズ状癌（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌、（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌、軟性癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｏｌｌｅ）、粘液癌（ｍｕｃｉｎｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液分泌性癌、粘液細胞性癌、粘表皮癌、粘液癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌、粘液腫様癌、鼻咽頭癌、燕麦細胞癌、骨化性癌、類骨癌、乳頭状癌、門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌、軟性癌（ｐｕｌｔａｃｅｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ），腎細胞癌、予備細胞癌、肉腫癌、総排泄腔癌、硬性癌、陰嚢癌、印環細胞癌、単純癌、小細胞癌、バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌、海綿様癌、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ストリング癌腫、血管拡張性癌腫、毛細血管拡張性癌腫、移行上皮癌、結節癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、いぼ状癌、および絨毛癌などを含む。
【0028】
用語「肉腫」は、胚性結合組織様の物質から形成される腫瘍を指し、一般的に原線維物質または均一な物質に包埋された密接に圧縮された細胞から構成される。典型的な肉腫は、たとえば軟骨肉腫、線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫、粘液肉腫、骨肉腫、アベメシー（Ａｂｅｍｅｔｈｙ’ｓ）肉腫、脂肪肉腫（ａｄｉｐｏｓｅ ｓａｒｃｏｍａ）、脂肪肉腫（ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ）、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮歯牙肉腫、ブドウ状肉腫、緑色腫肉腫、絨毛膜癌（ｃｈｏｒｉｏ ｓａｒｃｏｍａ）、胎児性肉腫、ウィルンス（Ｗｉｌｎｓ’）腫瘍肉腫、子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫、筋膜肉腫、線維芽細胞性肉腫、巨細胞肉腫、顆粒球性肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、Ｂ細胞性免疫芽球性肉腫、リンパ腫（非ホジキンリンパ腫など）、Ｔ細胞免疫芽球性肉腫、イエンセン肉腫、カポジ肉腫、クッパー星細胞肉腫、血管肉腫、白血肉腫、悪性間葉腫肉腫、傍骨肉腫、細網肉腫、ラウス肉腫、漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫などを含む。
【0029】
用語「黒色腫」は、皮膚および他の器官のメラニン細胞系から発生する腫瘍を指す。黒色腫は、たとえば末端黒子型黒色腫、無色素性黒色腫、良性若年性黒色腫、クラウドマン黒色腫、Ｓ９１黒色腫、ハーディング－パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性黒色腫、結節型黒色腫舌下黒色腫、および表在性拡大型黒色腫などを含む。
【0030】
追加的な癌は、たとえばホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、小細胞肺腫瘍、原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌、悪性膵インスラノーマ（ｉｎｓｕｌａｎｏｍａ）、悪性カルチノイド、前癌性皮膚病変、精巣癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症、子宮頸癌、子宮内膜癌、および副腎皮質癌などを含む。
【0031】
本願で用いる用語「自己免疫疾患」は、個体の免疫系（活性化Ｔ細胞など）がその個体自身の組織および細胞を攻撃する状態を指す。本願で用いる用語「同種免疫応答」は、個体の免疫系が移植された組織または細胞を（移植片として）攻撃する状態を指す。
【0032】
本開示の方法による治療の対象となる典型的な自己免疫性疾患は関節炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、クローン病、皮膚筋炎、糖尿病（１型）、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギラン－バレー症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ループス腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋炎、天疱瘡／類天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、甲状腺炎（橋本甲状腺炎およびオード甲状腺炎など）、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、白斑、ヴェグナー肉芽腫症を含む。本開示の方法による治療の対象となる代表的な同種免疫応答は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）および移植片拒絶を含む。
【0033】
本願で用いる「治療」は、増殖性疾患、自己免疫疾患または同種免疫応答の任意の改善を意味する。
【0034】
用語「治療する」および「治療」は、細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫応答に随伴する１つ以上の症状の寛解；細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫応答の１つ以上の症状の発現の予防または遅延；および／または細胞増殖性疾患、自己免疫疾患、または同種免疫応答の１つまたはそれ以上の症状の重症度または頻度の低減を指す。
【0035】
本文脈で用いる用語「改善」、「上昇」または「減少」は、本願に記載の治療を開始する前の同じ個体における測定値、または本願に記載の治療の不在下での対照個体（または複数の対照個体）における測定値などのベースライン測定値と比較した、数値またはパラメータを指す。
【0036】
「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ疾患または障害に罹患した個体であり、治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である（治療される個体と対照個体の病期が比較可能であることを担保するため）。治療される個体（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は哺乳類対象、好ましくは胎児、乳児、小児、青年、または成人などのヒト対象でありうる。
【0037】
（マイクロエマルションエキノマイシン薬剤送達系）
本願は、ＨＩＦ－１αまたはＨＩＦ－２αが上昇する増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫応答の治療を目的とした、マイクロエマルションエキノマイシン薬剤送達系を提供する。エマルションは、通常は不混和性（非混合性または非配合性）である２つ以上の液状物の混合物である。マイクロエマルションエキノマイシン薬剤送達系は、リポソーム、ミセルまたはリポソームとミセルの混合物を含みうる。リポソームは、脂質二重層の形態にある疎水性膜で囲まれた水性溶液コアを有する球状ベシクルである。リポソームはリン脂質、特にホスファチジルコリンで構成されることが最も多いが、脂質二重層構造に適合する限りにおいて他の脂質も含みうる。典型的なミセルは、両親媒性分子の親水性の「頭部」領域が周囲の溶媒と接し、疎水性の単一尾部領域をミセルの中心部に隔離する両親媒性分子の単層によって形成される球状のベシクルである。
本願は、ＨＩＦ－１αまたはＨＩＦ－２αが上昇する増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫応答の治療を目的とした、マイクロエマルションエキノマイシン薬剤送達系を提供する。エマルションは、通常は不混和性（非混合性または非配合性）である２つ以上の液状物の混合物である。マイクロエマルションエキノマイシン薬剤送達系は、リポソーム、ミセルまたはリポソームとミセルの混合物を含みうる。リポソームは、脂質二重層の形態にある疎水性膜で囲まれた水性溶液コアを有する球状ベシクルである。リポソームはリン脂質、特にホスファチジルコリンで構成されることが最も多いが、脂質二重層構造に適合する限りにおいて他の脂質も含みうる。典型的なミセルは、両親媒性分子の親水性の「頭部」領域が周囲の溶媒と接し、疎水性の単一尾部領域をミセルの中心部に隔離する両親媒性分子の単層によって形成される球状のベシクルである。
【0038】
本願は、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを封入するリポソーム組成物、およびＨＩＦ－１αまたはＨＩＦ－２αが上昇する増殖性疾患、自己免疫疾患、および同種免疫応答の治療を目的としてそのような組成物を使用する方法を提供する。エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログ製剤は、好ましくはマイクロエマルション薬剤送達系を用いて患者に投与される。別段指摘されない限り、語句「エキノマイシン製剤」は、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを含有するマイクロエマルション製剤を含むと解釈すべきである。
【0039】
好ましい実施形態においては、使用されるマイクロエマルション薬剤送達系はリポソーム薬剤送達系である。他の実施形態においては、使用するマイクロエマルション薬剤送達系は、マイクロ粒子（またはマイクロスフェア）、ナノ粒子（またはナノスフェア）、ナノカプセル、ブロックコポリマーミセル、または他のポリマー薬剤送達系から構成される。さらなる実施形態においては、使用する薬剤送達系は、ハイドロゲル、フィルムまたは他の種類のポリマー薬剤送達系などのポリマーベース非マイクロエマルション薬剤送達系である。またさらなる実施形態においては、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログは脂質ベース溶媒に溶解して非経口投与される。
【0040】
本発明の方法は、全ての哺乳類対象、具体的にはヒト患者における増殖性疾患、自己免疫疾患および同種免疫応答にとって有用である。本願で用いる「患者」はヒト患者である。
【0041】
エキノマイシン（ＮＳＣ５２６４１７）はキノキサリンファミリーの１つであり、はじめはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｃｈｉｎａｔｕｓから分離された。エキノマイシンは、ＨＩＦ－１αのＤＮＡ結合活性を阻害する小分子である。エキノマイシンはエタノール、アルカリ、ケトン、酢酸およびクロロホルムに可溶性である。水に不溶性である。したがって、エキノマイシンは親油性であり、また一般に、たとえば本発明のマイクロエマルション薬剤送達系において用いられる脂質の多くなどの脂質と容易に会合する。一定の実施形態においては、エキノマイシンは金属キレートとして製剤化することもできる。
【0042】
エキノマイシンアナログは、そのエキノマイシンとの構造的および機能的類似性により、エキノマイシンのそれと同様にＨＩＦ－１αまたはＨＩＦ－２α活性の低下に対して影響を示す化合物を含む。典型的なエキノマイシンアナログはＹＫ２０００およびＹＫ２００５（Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ，２００４ Ｄｅｃ；２４（６）：６１３－６１５）；キノマイシンＧ（Ｚｈｅｎ Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒ．Ｄｒｕｇｓ，２０１５ Ｎｏｖ．１８；１３（１１）：６９４７－６１）；２ＱＮ（Ｂａｉｌｌｙ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．，１９９９ Ｊｕｎｅ；１４（３）：２９１－３０３）；およびキナゾマイシン（Ｋｈａｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９６９ Ｄｅｃ；６（４）：２２０－１）を含む。
【0043】
リポソームを含むマイクロエマルション薬剤送達系を用いて、細胞、増殖性疾患または自己免疫疾患を有する患者、またはＧＶＨＤなどにおける同種免疫応答を示す患者にエキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを送達することができる。エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログは、インビトロまたはインビボで薬剤を標的細胞に送達することの可能な、任意の適切なマイクロエマルション薬剤送達担体に封入する（または組み入れる）ことができる。
【0044】
本願で用いるところのマイクロエマルション薬剤送達担体は、医薬として許容される液状媒体に懸濁されることが可能な粒子を含むものであって、粒子の粒径範囲が直径数ナノメートルから数マイクロメートルの範囲であるものである。本願で意図されるマイクロエマルション薬剤送達系は、インビボで投与するときそのマイクロエマルション的性質を相当保持するものを含む。マイクロエマルション薬剤送達系は脂質ベースおよびポリマーベース粒子を含むが、これに限定されない。マイクロエマルション薬剤送達系の例はリポソーム、ナノ粒子（またはナノスフェア）、ナノカプセル、マイクロ粒子（またはマイクロスフェア）、およびブロックコポリマーミセルを含む。
【0045】
リポソームは細胞膜と多くの類似点を有し、かつエキノマイシンおよびエキノマイシンアナログの担体として本発明と関連付けた使用を意図している。それらは水溶性および脂溶性物質のいずれも封入することが可能である、すなわちそれぞれ水性空隙内および二重層それ自体の中に封入できるため、幅広い適合性を有する。当該リポソームのリポソーム製剤は、当業者が修飾して、その疎水性に基づきエキノマイシンまたはその任意のアナログの可溶性を最大化することができる。
【0046】
エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログの送達に適したリポソームは、主としてベシクル形成性脂質から構成されるものを含む。本発明における使用に適したベシクル形成性脂質は、リン脂質によって代表されるような、水中で自然に二重層ベシクルを形成することのできる脂質を含む。
【0047】
リポソームに適した脂質の選択は：（１）リポソームの安定性、（２）相転移温度、（３）電荷、（４）哺乳類系に対する無毒性、（５）封入効率、（６）脂質混合物特性の因子に支配される。この開示の利益を有する当業者が、これらの因子を最適化するであろう本発明にしたがって、リポソームを製剤化することが可能となることが予想される。この種のベシクル形成性脂質は、好ましくは２つの炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖、および極性または非極性の頭部を有するものである。炭化水素鎖は飽和鎖であっても、または多様な程度の不飽和度を有してもよい。リン脂質、ホスホグリセリド、セレブロシドおよびガングリオシドなどの糖脂質、スフィンゴ脂質、エーテル脂質、ステロール類、およびケージ化リン脂質を含む、多様な合成ベシクル形成性脂質および天然ベシクル形成性脂質が存在する。
【0048】
リポソームは、１つ以上の同心性脂質単分子膜または脂質二重層から構成されるリポソームシェルを含む。したがって、脂質シェルは単一の脂質二重層（すなわちシェルが単層でありうる）または数層の同心性脂質二重層（すなわちシェルが多層でありうる）から形成することができる。脂質は、リン脂質、トコフェロール、ステロイド、脂肪酸、アルブミンなどの糖タンパク質、陰イオン性脂質および陽イオン性脂質を含む、合成、半合成、または天然脂質とすることができる。脂質は陰イオン性、陽イオン性または両性イオン性親水性頭部を有してもよく、且つ生理学的ｐＨで陰イオン性、陽イオン性脂質または中性となりうる。
【0049】
リポソーム製剤は、脂質の混合物を含みうる。混合物は、（ａ）中性と／または両性イオン性脂質の混合物；（ｂ）陰イオン性脂質の混合物；（ｃ）陽イオン性脂質の混合物；（ｄ）陰イオン性脂質と陽イオン性脂質の混合物；（ｅ）中性または両性イオン性脂質と少なくとも１つの陰イオン性脂質の混合物；（ｆ）中性または両性イオン性脂質と少なくとも１つの陽イオン性脂質の混合物；または（ｇ）中性または両性イオン性脂質、陰イオン性脂質、および陽イオン性脂質の混合物を含みうる。さらに、混合物は飽和脂質、不飽和脂質、またはその組み合わせを含みうる不飽和脂質が２つの尾部を有する場合、双方の尾部が不飽和であるか、または一方が飽和尾部でありもう一方が不飽和尾部であることも可能である。一部の実施形態においては、脂質の混合物は不飽和脂質を全く含まない。
【0050】
１つの実施形態においては、脂質製剤は陰イオン性脂質をほとんど含まないか、陽イオン性脂質をほとんど含まないか、またはその双方である。他の実施形態においては、脂質製剤は陰イオン性脂質を含まないか、陽イオン性脂質を含まないか、またはその双方である。１つの実施形態においては、脂質製剤は中性脂質のみを含む。典型的には、中性脂質成分は２つのアシル基を有する脂質（すなわちジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミン）である。多様な鎖長および飽和度を有する多様なアシル鎖基を有する脂質は、市販されているか、または周知の技術によって分離または合成されうる。
【0051】
典型的な中性または両性イオン性リン脂質は、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、卵黄ホスファチジルイノシトール（ＥＰＩ）、卵黄ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、卵黄ホスファチジルグリセロール（ＥＰＧ）、卵黄ホスファチジルイノシトール（ＥＰＩ）、卵黄ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、ホスファチジン酸（ＥＰＡ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、大豆ホスファチジルグリセロール（ＳＰＧ）、大豆ホスファチジルセリン（ＳＰＳ）、大豆ホスファチジルイノシトール（ＳＰＩ）、大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＳＰＥ）、大豆ホスファチジン酸（ＳＰＡ）、水素化卵黄ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、水素化卵黄ホスファチジルグリセロール（ＨＥＰＧ）、水素化卵黄ホスファチジルイノシトール（ＨＥＰＩ）、水素化卵黄ホスファチジルセリン（ＨＥＰＳ）、水素化ホスファチジルエタノールアミン（ＨＥＰＥ）、水素化ホスファチジン酸（ＨＥＰＡ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、水素化大豆ホスファチジルグリセロール（ＨＳＰＧ）、水素化大豆ホスファチジルセリン（ＨＳＰＳ）、水素化大豆ホスファチジルイノシトール（ＨＳＰＩ）、水素化大豆ホスファチジルエタノールアミン（ＨＳＰＥ）、水素化大豆ホスファチジン酸（ＨＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコサノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、パルミトイルステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、リソホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）、コレステロールおよびエルゴステロールなどのステロール；コレステロールエステル、セラミド、セレブロシド類、ジアシルグリセロール、スフィンゴシン、脳スフィンゴミエリン、卵黄スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリンおよびジステアロイルスフィンゴミエリンジヒドロスフィンゴミエリンなどのスフィンゴミエリン類；およびモノ－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＭＯＰＥ）などの１アシル化リン脂質を含むが、これに限定されない。
【0052】
両性イオン性脂質はアシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびドデシルホスホコリンである。
【0053】
典型的な陰イオン性脂質はジヘキサデシルリン酸（ＤｈＰ）、ホスファチジルイノシトール類、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリンなどのジアシルホスファチジルセリンを含むホスファチジルセリン類；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジラウリロイルホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびリシルホスファチジルグリセロール（ＬＰＧ）などのホスファチジルグリセロール類；Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－サクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミン類；ジホスファチジルグリセロールおよびジミリストイルホスファチン酸およびジパルミトイルホスファチン酸（phosphatic acid）などのジアシルホスファチジン酸類を含むホスファチジン酸類；カルディオリピン、およびヘミ酒石酸コレステロール（ＣＨＥＭＳ）を含む。
【0054】
陽イオン性脂質は、典型的にはステロール、アシルまたはジアシル鎖などの親油性部分を有し、かつ脂質は全体的に正味の陽性電荷を有する。好ましくは、脂質の頭部は正に帯電している。典型的な陽イオン性脂質は、ＴＡＰ脂質とも呼ばれるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム塩を、たとえばメチル硫酸塩として含む。適切なＴＡＰ脂質はＤＯＴＡＰ（ジオレオイル－）、ＤＭＴＡＰ（ジミリストイル－）、ＤＰＴＡＰ（ジパルミトイル－）、およびＤＳＴＡＰ（ジステアロイル－）を含むが、これに限定されない。他の適切な陽イオン性脂質は臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジアシルオキシ－３－トリメチルアンモニウムプロパン、Ｎ－［１－（２，３－ジオロイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、塩化Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノ－エタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）－エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロ－アセテート（ＤＯＳＰＡ）、β－アラニルコレステロール、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、ジＣ１４－アミジン、Ｎ－ｔｅｒｔ－ブチル－Ｎ’－テトラデシル－３－テトラデシルアミノプロピオンアミジン、塩化Ｎ－（α－トリメチルアンモニオアセチル）ジドデシル－Ｄ－グルタミン酸（ＴＭＡＧ）、塩化ジテトラデカノイル－Ｎ－（トリメチルアンモニオ－アセチル）ジエタノールアミン、１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、およびヨウ化Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシルエチル）－２，３－ジオレオイルオキシ－１，４－ブタンジアンモニウム、塩化１－［２－（９（Ｚ）－オクタデセノイルオキシ）エチル］－２－（８（Ｚ）－ヘプタデセニル－３－（２－ヒドロキシエチル）－イミダゾリニウム（ＤＯＴＩＭ）および塩化１－［２－（ヘキサデカノイルオキシ）エチル］－２－ペンタデシル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウム（ＤＰＴＩＭ）などの塩化１－［２－（アシルオキシ）エチル］２－アルキル（アルケニル）－３－（２－ヒドロキシエチル）－イミダゾリニウム誘導体、およびたとえば臭化１，２－ジオレオイル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）、臭化１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ）、１，２－臭化ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシプロピルアンモニウム（ＤＯＲＩＣ－ＨＰ）、臭化１，２－ジオレイル－オキシ－プロピル－３－ジメチル－ヒドロキシブチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ－ＨＢ）、臭化１，２－ジオレイルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシペンチルアンモニウム（ＤＯＲＩＥ Ｈｐｅ）、臭化１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、臭化１，２－ジパルミチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＰＲＩＥ）、臭化１，２－ジステリルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチル－３－アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）などの４級アミン上にヒドロキシアルキル部分を含む２，３－ジアルキルオキシプロピル４級アンモニウム誘導体を含む。
【0055】
典型的には、本願に記載のリポソーム製剤は、ＰＥＧ化されたリポソーム内に少なくとも１つの脂質を含み、すなわち脂質はポリエチレングリコール部分を含む。ＰＥＧ化脂質を含むリポソームは、ＰＥＧが少なくともリポソームの外部に存在するようＰＥＧが配向される（しかし一部のＰＥＧはリポソームの内部、すなわち水性コアに露出しうる）。この配向はＰＥＧを脂質の適切な部分に結合させることにより達成することができる。たとえば両親媒性脂質においては、脂質二重層の水相に面する外部に配向するのは親水性頭部であるので、ＰＥＧはこの頭部に結合されるであろう。このようなＰＥＧ化は、技術上既知の技術を用いてＰＥＧと脂質の共有結合によって達成することができる。
【0056】
典型的なＰＥＧ化脂質はＤＳＰＥ ＰＥＧ（分子量１０００）、ＤＳＰＥ ＰＥＧ（分子量２０００）およびＤＳＰＥ ＰＥＧ（分子量５０００）を含むジステアロイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）；ＤＭＰＥ ＰＥＧ（分子量１０００）、ＤＭＰＥ ＰＥＧ（分子量２０００）およびＤＭＰＥ ＰＥＧ（分子量５０００）を含むジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ）；ＤＰＧＳ－ＰＥＧ（分子量１０００）、ＤＰＧＳ（分子量２０００）およびＤＰＧＳ（分子量５０００）を含むジパルミトイルグリセロサクシネートポリエチレングリコール（ＤＰＧＳ－ＰＥＧ）；ステアリル－ポリエチレングリコール、コレステリル－ポリエチレングリコールおよびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛サクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）分子量］｝、分子量が７５０、２０００または５０００である指定されたＣ８ ＰＥＧ（分子量）セラミド、またはＮ－パルミトイル－スフィンゴシン－１－｛サクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）分子量］｝または分子量が７５０、２０００または５０００である指定されたＣ１６ ＰＥＧ（分子量）セラミドなどのセラミドベースのＰＥＧ化脂質を含むが、これに限定されない。追加的なＰＥＧ化脂質はアバンティポーラリピッド社（アラバマ州アラバスター）から入手することができる。
【0057】
本発明のリポソームは、典型的には同一であることも、あるいは相異なることもある多数のＰＥＧ部分を含む。本発明の１つのリポソーム中のＰＥＧの平均分子質量は、３５０Ｄａ超であるが５ｋＤａ未満、たとえば０．３５～５ｋＤａの間、１～３ｋＤａの間、１～２～６ｋＤａの間、２～３ｋＤａの間、または４～５ｋＤａの間、または好ましくは２ｋＤａ（ＰＥＧ２０００）である。通常、ＰＥＧは直鎖ポリマー鎖を含むが、一部の実施形態においてＰＥＧは分岐ポリマー鎖を含みうる。
【0058】
一部の実施形態においては、ＰＥＧは、たとえばポリマー中の１つ以上の炭素原子が１つ以上のアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基によって置換される置換ＰＥＧでありうる。他の実施形態においては、ＰＥＧは、たとえば１つ以上のプロピレン単量体などの、ＰＥＧポリプロピレンポリマーを形成するコポリマー基を含みうる。
【0059】
一定の実施形態においては、リポソームは１つ以上のＰＥＧ化リン脂質と１つ以上の追加的中性脂質の混合物から形成される。ＰＥＧ化脂質のモル百分率は０．１～２０％の間でありうる。一部の実施形態においては、ＰＥＧ化脂質のモル百分率は組成物中の総脂質の１～９％の間、２～８％の間、また好ましくは５～６％の間である。
【0060】
本願で用いる脂質Ａ、ＢおよびＣを含有する混合物中の脂質Ａの「モル百分率」は：
[（Ａのモル量）／（Ａのモル量＋Ｂのモル量＋Ｃのモル量）] ×１００％、
と定義される。
[（Ａのモル量）／（Ａのモル量＋Ｂのモル量＋Ｃのモル量）] ×１００％、
と定義される。
【0061】
他の実施形態においては、リポソームはＰＥＧ化リン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、またはホスファチジルイノシトールなどの中性ホスホグリセリド；およびコレステロールまたはエルゴステロールなどの中性ステロールを含む脂質混合物から形成される。この実施形態においては、ＰＥＧ化リン脂質のモル百分率は総脂質の１から１０％または３から６％の範囲にあってもよく；（総脂質に対する）中性ホスホグリセリドの量は２０～６０％または３０～５０％または３３～４３％の範囲にあってもよく；かつ中性ステロールのモル比は３５～７５％または４５～６５％または５０～６０％の範囲にあってもよい。
【0062】
具体的な実施形態においては、リポソームはＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）、ＨＳＰＣおよびコレステロールの混合物から形成される。この実施形態においては、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）のモル百分率は約５．３％、ＨＳＰＣのモル百分率は約５６．３％、およびコレステロールのモル百分率は約３８．４％である。
【0063】
ＰＥＧ化の代替法として、ＰＥＧとは異なる部分との共有結合によって脂質を修飾することもある。たとえば一部の実施形態においては、脂質はポリホスファゼンを含みうる。一部の実施形態においては、脂質はポリ（ビニルピロリドン）を含みうる。一部の実施形態においては、脂質はポリ（アクリルアミド）を含みうる。一部の実施形態においては、脂質はポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）を含みうる。一部の実施形態においては、脂質はポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を含みうる。一部の実施形態においては、脂質はホスファチジルポリグリセロールを含みうる。一部の実施形態においては、脂質はポリ［Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］を含みうる。一部の実施形態においては、脂質はＰＥＧ以外のポリアルキレンエーテルポリマーを含みうる。
【0064】
静脈内注射したリポソームの運命および動態は粒径、流動性および表面電荷といったその物理的性質に依存する。その組成、および数分から数時間の範囲の血中半減期に応じて組織内に数時間または数日残存する。通常、リポソームは：多層ベシクル（ＭＬＶ）；小型単層ベシクル（ＳＵＶ）；および大型単層ベシクル（ＬＵＶ）の３群に分類される。ＭＬＶは、各ベシクル内に数個の独立した水性コンパートメントを形成する多数の二重膜を有する。ＳＵＶとＬＶＵは、１つの水性コアを封入する単一の二重層を有する。ＭＬＶは、典型的には０．５から４μｍの直径を有する。ＭＬＶを超音波処理すると、コアに水性溶液を含む、５０～５００ｎｍの範囲の直径を有する大型単層ベシクル、または５０ｎｍ未満、典型的には２００から５００Åの直径を有する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）が形成される。
【0065】
ＭＬＶおよびＬＵＶなどのより大型のリポソームは、速やかに細網内皮系の食細胞に取り込まれることができるが、大半の部位において循環系の生理学がそのような大型種の出口の障害となる。それらは、肝臓または脾臓の類洞など、毛細血管内皮に大きな開口部または小孔が存在する場所にのみ出ることができる。したがって、これらの臓器は支配的な取り込み部位である。その一方、ＳＵＶはより幅広い組織分布を示すが、それでもなお大半が肝臓および脾臓に隔離される。一般に、このインビボ挙動によって、リポソームの潜在的標的はその大きなサイズにアクセス可能な臓器および組織のみに限定される。これらは血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ系臓器を含む。
【0066】
本願のリポソームは、好ましくは６０～８０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、または９０～１２０ｎｍの範囲の直径を有するＳＵＶである。本願のリポソームは、複数のリポソーム中のリポソームが一定範囲の直径を有することができる、複数のリポソームを含むリポソーム製剤の一部であることができる。一部の実施製剤においては、リポソーム製剤は、リポソームの少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、６０～１８０ｎｍ、８０～１６０ｎｍ、９０～１２０ｎｍの範囲内にある平均直径を有するリポソームを含む。また、複数内での直径は多分散係数＜０．２、＜０．１または＜０．０５を有しうる。一部の実施形態においては、リポソームの平均直径はマルバーンゼータサイザー法を用いて測定する。
【0067】
リポソームの循環時間を延長するための１つの方法は、親水性ポリマー鎖またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリアルキルエーテルで誘導体化したリポソームを用いることによる（たとえば米国特許第５，０１３，５５６号、第５，２１３，８０４号、第５，２２５，２１２号および第５，３９５，６１９号明細書を参照）。ポリマーコーティングは、マクロファージによるリポソームの取り込み率を低下させ、またこれにより血流中のリポソームの存在を長引かせる。またこれは、リポソームが担持する薬剤の放出延長メカニズムとして用いることもできる。したがって、本願によるリポソームエキノマイシン製剤は、好ましくは１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。
【0068】
当業者は、指定された流動度または堅牢度を達成するベシクル形成性脂質を選択することができる。リポソームの流動性または堅牢性は、血清中のリポソームの安定性、またはリポソームに捕捉された物質の放出速度といった因子を制御するために用いることができる。より堅牢な脂質二重層または液晶二重層を有するリポソームは、比較的堅牢な脂質の取り込みによって得られる。脂質二重層の堅牢性は、二重層中に存在する脂質の相転移温度と相関する。相転移温度とは、脂質が物理的状態を変化させかつ整然としたゲル相から乱雑な液晶相に移行する温度である。炭化水素鎖の長さおよび不飽和度、電荷および脂質の頭部の種類を含むいくつかの因子が、脂質の相転移温度に影響する。比較的高い相転移温度を有する脂質は、より堅牢な二重層をもたらす。コレステロールといった他の脂質成分も、脂質二重層構造の膜堅牢性に寄与することが知られている。コレステロールを用いて、脂質二重層の流動性、弾性および浸透性を操作しうる。脂質二重層の間隙を満たすことによって機能すると考えられる。対照的に、脂質の流動性は比較的流動性の脂質、典型的にはより低い相転移温度を有する脂質の取り込みによって得られる。アバンティポーラリピッドのカタログおよびＭａｒｔｉｎ Ｃａｆｆｒｅｙ、ＣＲＣ ＰｒｅｓｓのＬｉｐｉｄａｔなどの多様な情報源より、多くの脂質の相転移温度が作表される。
【0069】
リン脂質は、水に分散されるとき、水に対する脂質のモル比に応じてリポソーム以外の多様な構造を形成することができる。リポソームは、低い比率では好適な構造である。リポソームの物理的特性はｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。リポソームはイオン性物質および極性物質に対して低い浸透性を示すが、高い温度では相転移を受けることによりその浸透性が著しく変化する。相転移は、ゲル状態として知られる密に充填され、整然とした構造から、流動状態として知られる粗に充填されて規則性の低い構造への変化を包含する。これは、特徴的な相転移温度で発生し、イオン、糖、および薬剤の浸透性を高める。
【0070】
本願のリポソームは、選択された粒径範囲内でほぼ均一な粒径を有するよう調製しうる。ＲＥＶおよびＭＬＶの有効なサイズ決定法の１つは、０．０３から０．２ミクロンの範囲内、典型的には０．０５、０．０８、０．１または０．２ミクロンの選択された均一な孔径を有する一連のポリカーボネート膜からの、リポソーム水性懸濁液の押出しを包含する。膜の孔径は、特に製剤を同じ膜から２回以上押し出す場合、その膜から押し出して生成す
るリポソームの最大粒径にほぼ相当する。ホモジナイゼーション法は、リポソームの粒径を１００ｎｍ以下に縮小する場合にも有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｐ．Ｔｙｌｅ，Ｅｄ．）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６７－３１６（１９９０））。ホモジナイゼーションは、大型のリポソームをより小型のリポソームに断片化する剪断エネルギーに依存する。リポソームの粒径を縮小するその他の適切な方法は、デオキシコール酸塩などの適切な可溶化界面活性剤の存在下で、リポソームを激しく振盪してリポソームの粒径を縮小することを含む。
るリポソームの最大粒径にほぼ相当する。ホモジナイゼーション法は、リポソームの粒径を１００ｎｍ以下に縮小する場合にも有用である（Ｍａｒｔｉｎ，Ｆ．Ｊ．，ｉｎ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ－Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｐ．Ｔｙｌｅ，Ｅｄ．）Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６７－３１６（１９９０））。ホモジナイゼーションは、大型のリポソームをより小型のリポソームに断片化する剪断エネルギーに依存する。リポソームの粒径を縮小するその他の適切な方法は、デオキシコール酸塩などの適切な可溶化界面活性剤の存在下で、リポソームを激しく振盪してリポソームの粒径を縮小することを含む。
【0071】
粒径範囲約０．２～０．４ミクロンとされているリポソームは、典型的には０．２２ミクロンフィルターである通常の滅菌フィルターで、リポソームを高スループットで濾過することにより滅菌しうる。他の適切な滅菌法は、当業者にとって明白である。
【0072】
脂質の無毒性も本願における重要な留意事項である。臨床用途における使用に対して承認された脂質は、当業者に周知である。一定の実施形態においては、たとえば合成脂質は、採取源生物からのウイルスまたはタンパク質汚染のリスクが低いため、生物学的採取源に由来する脂質よりも好ましいことがある。
【0073】
当初のリポソーム形成法は、始めにリン脂質を有機溶媒に懸濁し、その後乾燥脂質ケークまたはフィルムが形成されるまで蒸発乾固させることを包含した。適切な量の水性媒体を添加すると、脂質は自然に多層同心性二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。これらのＭＬＶは、その後機械的な手段により分散して粒径を小さくすることができる。
【0074】
エキノマイシンは水に不溶性であるものの、本願の発明者らは、エタノールなどの極性溶媒中でエキノマイシンと脂質を合わせ、これらの成分を乾燥してフィルムを形成し、その後リポソームを水性媒体内で分散することにより安定したリポソームを形成することができることを確認している。したがって１つの実施形態においては、エキノマイシンと脂質を有機溶媒中で完全に混合した後、たとえばロータリーエバポレーターなどを用いて溶媒を除去し、これにより乾燥脂質フィルムを得る。乾燥脂質フィルムは適切なバッファー（例：ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で水和および可溶化し、これにより脂質懸濁液を得る。次にアバンティミニエクストルーダ－を用いて、脂質懸濁液をポリカーボネートフィルターから繰り返し押出し、所望のリポソーム粒径範囲を達成する。次に、リポソームを濾過滅菌する（０．４５または０．２μｍ滅菌フィルター）。水溶性エキノマイシンアナログは、水溶性エキノマイシンアナログを含有する水溶液で脂質フィルムを水和することにより、受動的に捕捉させることができる。
【0075】
エキノマイシンは、脂質二重層の内部、２つの脂質二重層の小葉間、内部コア空隙内、二重層の片面上、リポソームのＰＥＧ部分の内部またはその表面、またはその組み合わせに局在しうる。大型単層ベシクル（ＬＵＶ）を作成するための代替的方法は、たとえば米国特許第４，２３５，８７１号明細書などに記載される、逆相蒸発工程である。この工程は、ほぼ単層であるが典型的に多少の少層ベシクルを含有する逆相蒸発ベシクル（ＲＥＶ）を生成する。この手順においては、有機溶媒中の極性脂質の混合物が適切な水性媒体と混合される。均一な油中水型エマルションが形成され、有機溶媒が蒸発してゲルを形成する。次に、ゲル状混合物を水性媒体に分散して懸濁液に変換する。
【0076】
代替的な実施形態においては、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログをリポソーム二重層の表面に結合させうる。１つの実施形態においては、エキノマイシンはアミド結合によりリポソームと共有結合する。たとえば、ヒドロキシル官能基を有するリン脂質は、エキノマイシンまたはそのアナログの１つに存在するアミン基の１つと結合することができる。
【0077】
本発明によるリポソーム製剤は十分な長期安定性を有し、室温または冷蔵温度（４℃など）で少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも２４ヶ月、または少なくとも４８ヶ月の有効期限を達成する。
【0078】
一部の代替的実施形態においては、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログは、脂質ベースではなくポリマー性の保護壁材料に封入しうる。生物活性物質の封入に用いられるポリマーは、典型的には単一のコポリマーまたはホモポリマーである。ポリマー薬剤送達系は、マイクロエマルション性であっても、または非マイクロエマルション性であってもよい。
【0079】
マイクロエマルションポリマー封入構造はマイクロ粒子、マイクロカプセル、マイクロスフェア、ナノ粒子、ナノカプセル、ナノスフェア、ブロックコポリマーミセルなどを含む。人工的に作られた合成ポリマー、およびタンパク質および多糖を含むバイオポリマーは、いずれも本発明において用いることができる。ポリマー薬剤送達系は、生体分解性または非生体分解性ポリマー材料、またはその任意の組み合わせから構成しうる。
【0080】
本願で用いる「マイクロエマルション」は、直径約１０ｎｍから５００μｍの規則的または半規則的な形状のマイクロスフェアを含むエマルションを指す。一部の実施形態においては、本願のマイクロエマルションは２０～４００ｎｍ、３０～３００ｎｍ、５０～２００ｎｍ、６０～１５０ｎｍまたは８０～１２０ｎｍの範囲内の直径を有するリポソームを含む。
【0081】
一部の実施形態においては、本願のマイクロエマルションは両親媒性分子の単層から構成されるシェルを有するミセルを含む。ミセルの内部コアは、非極性薬剤に対して疎水性微小環境を作成する一方、親水性シェルはミセルコアと水性媒体の間の安定化境界面を提供する。親水性シェルの特性を調節して、生体適合性を最大化すると共に細網内皮系の取り込みと腎臓濾過を回避することができる。ミセルの粒径は通常１０ｎｍと１００ｎｍの間である。
【0082】
フィルム、ハイドロゲル、および「デポー」型薬剤送達系を含む非マイクロエマルションポリマー薬剤送達系も、本発明によって意図される。そのような非マイクロエマルションポリマー系は、本発明において、特に非マイクロエマルション薬剤送達系が標的癌組織の近傍に配置される場合に、非経口注射と組み合わせて用いることもできる。本願で用いるところの「ハイドロゲル」は、時にゾルと呼ばれることもあり、逆に荷電する小型イオンまたはポリマーによって、または化学的架橋によってゲル状態に変換されるポリマーの溶液を意味する。「ポリマーフィルム」は、時にコーティングとして用いられる、一般に厚さ約０．５から５ｍｍのポリマーベースのフィルムを指す。
【0083】
一定の実施形態においては、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを含むリポソーム、マイクロ粒子、ナノ粒子、マイクロカプセル、ブロックコポリマーミセルまたは他のポリマー薬剤送達媒体は、細胞特異的標的化リガンドでコーティング、コンジュゲート化、または修飾することができる。送達媒体を細胞標的化リガンドと結合することにより、エキノマイシンの送達を、細胞標的化リガンドまたは標的化リガンドと結合する標的細胞集団に方向付けることができる。本願で用いる「標的化リガンド」は、非標的化組織を上回る程度にリポソームを標的細胞型と会合させる任意のリガンドを含む。
【0084】
抗体または抗体フラグメントなどの標的化リガンドを用いてリポソーム表面に結合させ、抗体およびその薬剤内容物を、特定の細胞型表面に位置する特定の抗原受容体に誘導することができる（Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９などを参照）。炭水化物決定基（細胞－細胞認識、相互作用および接着において一定の役割を果たす糖タンパク質、レクチンおよび糖脂質細胞表面成分）は、リポソームを特定の細胞型に誘導する潜在的能力を有するため、これらも標的化リガンドとして用いることができる。一定のタンパク質を、通常は標的組織の自己表面受容体として認識されるものである標的化リガンドとして用いることができる。たとえば、特定の癌細胞において過剰発現する細胞表面受容体と結合するリガンドを用いて、標的組織によるリポソームの取り込みを上昇させることも可能である。エンドサイトーシスを受ける細胞表面受容体は、一定の実施形態において好ましい。ＰＥＧ化リポソームと組み合わせる場合、標的化リガンドは水性媒体に露出する親水性ポリマーの末端と結合することが多い。またその代わりに、リポソームは膜融合タンパク質、たとえばリポソームと細胞膜の融合を誘導するウイルスに由来する膜融合タンパク質などを取り込むことができる。
【0085】
一定の実施形態においては、標的化リガンドは標的細胞によってエンドサイトーシスを受ける細胞表面受容体である。本願における使用に適した標的化リガンドは、リポソームと標的細胞の細胞表面の、非標的細胞を上回る結合または会合の増加を引き起こす任意のリガンドを含む。標的化リガンドは小型分子、ペプチド、リガンド、抗体フラグメント、アプタマーまたはシンボディとすることができる。シンボディとは、対象となる標的タンパク質との結合についてスクリーニングされた、無作為なペプチドの列からなるライブラリから生成された合成抗体であり、米国特許出願第２０１１／０１４３９５３号明細書に記載されている。アプタマーとは、多様な細胞表面分子、タンパク質、および／またはマクロ分子構造と高親和性結合を示す、特定の３次元構造を形成することのできるオリゴヌクレオチドのクラスを含む、抗体の核酸版である。典型的な細胞標的化リガンドは、たとえば以下にさらに記載するところの表皮樹状細胞などと結合する（かつこれを標的とする）小型分子（葉酸、アデノシン、プリンなど）および大型分子（ペプチドまたは抗体など）を含むが、これに限定されない。
【0086】
代表的な抗体または抗体由来フラグメントは：ＩｇＧ、抗体可変領域；分離ＣＤＲ領域；ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬドメインを含みその２つのドメイン間の会合が抗原結合部位を形成することを可能とする単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二重特異性ｓｃＦｖ二量体；ＣＨ３ドメインと結合したｓｃＦｖを含む低分子抗体；二重特異性抗体（ｄＡｂ）フラグメント；ＶＨまたはＶＬドメインからなる単鎖ｄＡｂフラグメント；ＶＬ、ＦＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む、Ｈ鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に少数の残基が付加されたことによりＦａｂフラグメントと異なるＦａｂ’フラグメント；定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持するＦａｂ’フラグメントである、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメント；連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；その誘導体；および抗原結合機能を保持した任意の他の抗体フラグメントからなる群のうち任意の構成体を含みうる。Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または二重特異性抗体分子は、ＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み入れによって安定化しうる。抗体由来フラグメントを用いる場合、その中の標的化ドメインのいずれかまたは全ておよび／またはＦｃ領域を、当業者に周知である方法論を用いて「ヒト化」しうる。一部の実施形態においては、抗体を修飾してＦｃ領域を除去しうる。
【0087】
（抗体－エキノマイシン薬剤コンジュゲート）
他の態様においては、エキノマイシンまたはそのアナログの１つを、細胞結合性物質または上記の抗癌抗体などの抗体とコンジュゲートすることができる。本願で用いる語句「抗体コンジュゲート」または「抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）」は、リンカーまたは二官能性架橋物質を介してエキノマイシンまたはそのアナログとコンジュゲート化された抗体を指す。エキノマイシン／エキノマイシンアナログ－抗体コンジュゲートの使用は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体の高い特異性を、エキノマイシンまたはそれに由来するアナログの薬理学的効力と組み合わせる。ＡＤＣの例は、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ；カリケアマイシンとコンジュゲート化した抗ＣＤ３３ ｍＡｂ；ファイザー／ワイス）；ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ－３５、アドセトリス、ＭＭＡＥ（モノメチルラウリスタチン）と共有結合したブレンツキシマブからなるＣＤ３０－標的化ＡＤＣ、シアトルジェネティクス）；およびトラスツズマブ－ＤＭ１コンジュゲート（Ｔ－ＤＭ１）を含む。
他の態様においては、エキノマイシンまたはそのアナログの１つを、細胞結合性物質または上記の抗癌抗体などの抗体とコンジュゲートすることができる。本願で用いる語句「抗体コンジュゲート」または「抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）」は、リンカーまたは二官能性架橋物質を介してエキノマイシンまたはそのアナログとコンジュゲート化された抗体を指す。エキノマイシン／エキノマイシンアナログ－抗体コンジュゲートの使用は、腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体の高い特異性を、エキノマイシンまたはそれに由来するアナログの薬理学的効力と組み合わせる。ＡＤＣの例は、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ；カリケアマイシンとコンジュゲート化した抗ＣＤ３３ ｍＡｂ；ファイザー／ワイス）；ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ－３５、アドセトリス、ＭＭＡＥ（モノメチルラウリスタチン）と共有結合したブレンツキシマブからなるＣＤ３０－標的化ＡＤＣ、シアトルジェネティクス）；およびトラスツズマブ－ＤＭ１コンジュゲート（Ｔ－ＤＭ１）を含む。
【0088】
米国特許第９，０９０，６２９号明細書に記載されるように、抗体－薬剤コンジュゲートの調製を目的として幅広い種類のリンカー技術が用いられている。本願の抗体－エキノマイシンコンジュゲートの調製において、そこに記載された方法および試薬のうち任意の１つを用いることができる。本願で用いる「二官能性架橋剤」は２つの反応性基を有する試薬を指し；その一方は細胞結合性物質または抗体と反応することが可能であり、もう一方はエキノマイシンと反応して細胞結合性物質または抗体とエキノマイシンを連結し、これによりコンジュゲートを生成することが可能である。
【0089】
リンカー試薬が、過度の毒性を伴わずに、たとえばＨＩＦ－１α阻害などの治療活性の維持および抗体の標的化特性をそれぞれ提供する限り、任意の適切な二官能性架橋試薬を本願と関連させて用いることができる。好ましくは、エキノマイシンと細胞結合性物質が互いに化学的に連結するよう（共有結合など）、リンカー分子は化学結合を介し、エキノマイシンおよび／またはエキノマイシンアナログを細胞結合性物質または抗体と（上記のように）連結する。本発明の薬剤－リンカー化合物を作成するために用いることのできる二官能性架橋剤は、サーモサイエンティフィックピアース架橋技術ハンドブックに記載されるものを含む。
【0090】
リンカーは「開裂性」リンカーであっても、または「非開裂性」リンカーであってもよい。開裂性リンカーは、たとえば標的細胞内に内部化されたときなどのように、一定の環境因子に付されるときに薬剤を放出するよう設計される。開裂性リンカーは酸不安定性リンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーを含む。非開裂性リンカーは、標的細胞によって内部化され、その内部で分解されるとき、抗体のうち少なくとも１つのアミノ酸および薬剤との共有結合を維持する傾向がある。
【0091】
１つの実施形態においては、二官能性架橋試薬は非開裂性リンカーを含む。非開裂性リンカーは、エキノマイシンを細胞結合性物質または抗体と安定した共有結合によって連結することが可能な任意の化学的部分である。したがって非開裂性リンカーは、細胞毒性物質または細胞結合性物質が活性を維持する条件において、酸誘導性開裂、光誘導性開裂、ペプチダーゼ誘導性開裂、エステラーゼ誘導性開裂およびジスルフィド結合開裂に対して相当な抵抗性を有する。
【0092】
エキノマイシンと細胞結合性物質または抗体の間で非開裂性リンカーを形成する適切な架橋剤は、技術上周知である。１つの実施形態においては、エキノマイシンおよび／またはエキノマイシンアナログは、チオエーテル結合を介して細胞結合性物質または抗体と連結する。非開裂性リンカーの例は、細胞毒性物質と反応するためのマレイミド－またはハロアセチル－ベース部分を有するリンカーを含む。そのような二官能性架橋剤は技術上周知であり（米国特許出願第２０１０／０１２９３１４号明細書を参照）、かつピアースバイオテクノロジー社（イリノイ州ロックランド）から入手できるものは４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ－サクシンイミジル（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」アナログであるＮ－サクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、κ－マレイミドウンデカン酸Ｎ－サクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ－マレイミド酪酸Ｎ－サクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、δ－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－サクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、サクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、４－（ｐ－マレイミドフェニル）－酪酸Ｎ－サクシンイミジル（ＳＭＰＢ）、およびＮ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）を含むが、これに限定されない。ハロアセチルベース部分を含む架橋試薬はＮ－サクシンイミジル－４－（イソアセチル）－アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、ヨード酢酸Ｎ－サクシンイミジル（ＳＩＡ）、ブロモ酢酸Ｎ－サクシンイミジル（ＳＢＡ）、および３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸Ｎ－サクシンイミジル（ＳＢＡＰ）、ビス－マレイミドポリエチレングリコール（ＢＭＰＥＯ）、ＢＭ（ＰＥＯ）２、ＢＭ（ＰＥＯ）３、Ｎ－（β－マレイミドプロピルオキシ）サクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、５－マレイミド吉草酸ＮＨＳ、ＨＢＶＳ、塩酸４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）－酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、サクシンイミジル－（４－ビニルスルホニル）ベンゾエート（ＳＶＳＢ）、ジチオビス－マレイミドエタン（ＤＴＭＥ）、１，４－ビス－マレイミドブタン（ＢＭＢ）、１，４－ビスマレイミジル－２，３－ジヒドロキシブタン（ＢＭＤＢ）、ビス－マレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ビス－マレイミドエタン（ＢＭＯＥ）、４－（Ｎ－マレイミド－メチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スルホサクシンイミジル（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＣＣ）、（４－ヨード－アセチル）アミノ安息香酸スルホサクシンイミジル（ｓｕｌｆｏ－ＳＩＡＢ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホサクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ－ＭＢＳ）、Ｎ－（δ－マレイミドブトリルオキシ）スルホサクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ－ＧＭＢＳ）、Ｎ－（δ－マレイミドカプロイルオキシ）スルホサクシミドエステル（ｓｕｌｆｏ－ＥＭＣＳ）、Ｎ－（κ－マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホサクシンイミドエステル（ｓｕｌｆｏ－ＫＭＵＳ）、４－（ｐ－マレイミドフェニル）酪酸スルホサクシンイミジル（ｓｕｌｆｏ－ＳＭＰＢ）、ＣＸ１－１、ｓｕｌｆｏ－ＭａｌおよびＰＥＧｎ－Ｍａｌを含む。好ましくは、二官能性架橋剤はＳＭＣＣである。
【0093】
抗体の水性バッファー溶液は、Ｎ－サクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）などの、１モル過剰な抗体修飾剤と共にインキュベートしてマレイミド基を導入、あるいはＮ－サクシンイミジル－４－（ヨードアセチル）－アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）とインキュベートしてヨードアセチル基を導入しうる。次に、チオールを含むエキノマイシン誘導体に修飾抗体を反応させて、チオエーテル結合抗体－エキノマイシンコンジュゲートを生成する。次に、抗体－細胞毒性コンジュゲートをゲル濾過または上記の他の方法または当業者に既知の方法で精製する。マレイミド基またはハロアセチル基を細胞結合性物質に導入するその他の架橋剤は技術上周知であり、上記のリンカーを含む。
【0094】
抗体コンジュゲートは、抗体1個あたり平均約１個、約２個、約３個、約４個、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、または約２０個のエキノマイシン分子（および／またはアナログ）を含みうる。
【0095】
（併用療法）
一定の実施形態においては、本願のエキノマイシン製剤によるＨＩＦ－１αの阻害は、標準的な癌治療（たとえば手術、放射線、および化学療法など）と組み合わせうる。そのような手法は、ＨＩＦが放射線療法および化学療法に対する抵抗性を媒介することが知られているという事実に基づく（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２０１２ Ａｐｒ；３３（４）：２０７-２１４）。たとえば、イマチニブによる慢性骨髄性白血病の治療などの、新規標的化療法に対する耐性の発生にＨＩＦ－１活性が寄与しうることが、エビデンスで示されている。具体的には、ＨＩＦ－１はトランスケトラーゼの発現を活性し、これによりペントースリン酸経路の非酸化アームからのグルコース流入を増加させることによる代謝リプログラミングを経て、イマチニブに対する耐性を媒介するとみられる。ＨＩＦ－１を介した酸化的代謝から還元的代謝への切り替えは、細胞ＲＯＳレベルの減少効果を有し、これは細胞障害性化学療法への耐性を高める（Ｓｅｍｅｎｚａ， ２０１２）。
一定の実施形態においては、本願のエキノマイシン製剤によるＨＩＦ－１αの阻害は、標準的な癌治療（たとえば手術、放射線、および化学療法など）と組み合わせうる。そのような手法は、ＨＩＦが放射線療法および化学療法に対する抵抗性を媒介することが知られているという事実に基づく（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．２０１２ Ａｐｒ；３３（４）：２０７-２１４）。たとえば、イマチニブによる慢性骨髄性白血病の治療などの、新規標的化療法に対する耐性の発生にＨＩＦ－１活性が寄与しうることが、エビデンスで示されている。具体的には、ＨＩＦ－１はトランスケトラーゼの発現を活性し、これによりペントースリン酸経路の非酸化アームからのグルコース流入を増加させることによる代謝リプログラミングを経て、イマチニブに対する耐性を媒介するとみられる。ＨＩＦ－１を介した酸化的代謝から還元的代謝への切り替えは、細胞ＲＯＳレベルの減少効果を有し、これは細胞障害性化学療法への耐性を高める（Ｓｅｍｅｎｚａ， ２０１２）。
【0096】
一定の実施形態においては、エキノマイシンまたはそのアナログは、１つ以上の他の化学療法剤または抗癌剤との相乗的組み合わせで投与しうる。これらの場合には、投与する化学療法剤または抗癌剤の用量を減量することも可能となりうる。そのような組み合わせの例は、白血病の治療を目的としてイマチニブと組み合わせたエキノマイシン、または乳癌の治療を目的としてハーセプチンと組み合わせたエキノマイシンである。ＨＩＦ－１α阻害と化学療法の併用は放射線療法、化学療法、および／またはアポトーシスに対する耐性、さらには血管新生、幹細胞維持、代謝リプログラミング、オートクリン成長因子シグナリング、上皮－間葉転移、浸潤および転移の好ましくない効果を解消することができるとされている。
【0097】
本願で用いるところの語句「抗癌剤」は、対象（たとえばヒトなど）において癌細胞の増殖速度を低下させるか、または癌細胞の死（たとえば壊死またはアポトーシスなど）を誘導または媒介することのできる「小分子薬剤」またはタンパク質または抗体を指す。語句「小分子薬剤」は、ポリマーでなく、薬剤活性を有し、かつ約２ｋＤａ未満、約１ｋＤａ未満、約９００Ｄａ未満、約８００Ｄａ未満、または約７００Ｄａ未満の分子量を有する有機分子または有機金属分子であることの多い分子実体を指す。当該用語は、タンパク質または核酸以外の「薬剤」と称される医薬化合物の大半を包含するが、小型ペプチドまたは核酸アナログは小分子薬剤とみなすことができる。例は化学療法抗癌剤および酵素阻害剤を含む。小分子薬剤は合成的、半合成的（すなわち天然の前駆体に由来）または生物学的に誘導することができる。
【0098】
抗癌剤はアルキル化剤；アントラサイクリン系抗生物質；代謝拮抗剤；解毒剤；インターフェロン；ポリクローナルまたはモノクローナル抗体；ＥＧＦＲ阻害剤；ＨＥＲ２阻害剤；ヒストンデアセチラーゼ阻害剤；ホルモンまたは抗ホルモン剤；有糸分裂阻害剤；ホスファチジルイノシトール－３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤；Ａｋｔ阻害剤；哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）阻害剤；プロテアソーム阻害剤；ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、Ｒａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤；セントロソームデクラスタリング剤；マルチキナーゼ阻害剤；セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤；チロシンキナーゼ阻害剤；ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤；タキサンまたはタキサン誘導体；アロマターゼ阻害剤；アントラサイクリン；微小管標的化剤；トポイソメラーゼ毒剤；分子標的また酵素阻害剤（たとえばキナーゼまた他はタンパク質メチルトランスフェラーゼなど）、シチジンアナログ、またはその組み合わせでありうる。
【0099】
典型的なアルキル化剤はシクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｎｅｏｓａｒ）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ）；メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）；カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ）；ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）；ダカルバジン（ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ）；オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）；カルムスチン（Ｇｌｉａｄｅｌ）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ）；メクロレタミン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ）；ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ）；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）；シスプラチン（ＣＤＤＰ；Ｐｌａｔｉｎｏｌ）；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ）；チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ）；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ）；またはストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ）を含むが、これに限定されない。
【0100】
典型的なアントラサイクリン系抗生物質はドキソルビシン（アドリアマイシン）、リポソームドキソルビシン（ドキシル）、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ）、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、リポソームダウノルビシン（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ）、ダクチノマイシン（コスメゲン）、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、イダルビシン（イダマイシン）、プリカマイシン（Ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、マイトマイシン（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ）、またはバルルビシン（Ｖａｌｓｔａｒ）を含むが、これに限定されない。
【0101】
典型的な代謝拮抗薬はフルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ）；カペシタビン（ゼローダ）；ヒドロキシ尿素（ハイドレア）；メルカプトプリン（プリネトール）；ペメトレキセド（アリムタ）；フルダラビン（フルダラ）；ネララビン（アラノン）；クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ Ｎｏｖａｐｌｕｓ）；クロファラビン（Ｃｌｏｌａｒ）；シタラビン（Ｃｙｔｏｓａｒ－Ｕ）；デシタビン（Ｄａｃｏｇｅｎ）；リポソームシタラビン（デポサイト）；ヒドロキシ尿素（Ｄｒｏｘｉａ）；プララトレキサート（フォロチン）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）；ゲムシタビン（ジェムザール）、クラドリビン（ロイスタチン）；フルダラビン（Ｏｆｏｒｔａ）；メトトレキセート（ＭＴＸ；リウマトレックス）；メトトレキセート（Ｔｒｅｘａｌｌ）；チオグアニン（Ｔａｂｌｏｉｄ）；ＴＳ－１またはシタラビン（Ｔａｒａｂｉｎｅ ＰＦＳ）を含むが、これに限定されない。
【0102】
典型的な解毒剤はアミホスチン（Ｅｔｈｙｏｌ）またはメスナ（Ｍｅｓｎｅｘ）を含むが、これに限定されない。
【0103】
典型的なインターフェロンはインターフェロンα－２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ）またはインターフェロンα－２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ－Ａ）を含むが、これに限定されない。
【0104】
典型的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体はトラスツズマブ（ハーセプチン）；オファツムマブ（アーゼラ）；ベバシズマブ（アバスチン）；リツキシマブ（リツキサン）；セツキシマブ（アービタックス）；パニツムマブ（ベクティビックス）；トシツモマブ／ヨード１３１トシツモマブ（ベキサール）；アレムツズマブ（キャンパス）；イブリツモマブ（ゼヴァリン；Ｉｎ－１１１；Ｙ－９０ゼヴァリン）；ゲムツズマブ（マイロターグ）；エクリズマブ（ソリリス）および/またはデノスマブを含むが、これに限定されない。
【0105】
典型的なＥＧＦＲ阻害剤はゲフィチニブ（イレッサ）；ラパチニブ（タイカーブ）；セツキシマブ（アービタックス）；エルロチニブ（タルセバ）；パニツムマブ（ベクティビックス）；ＰＫＩ－１６６；カネルチニブ（ＣＩ－１０３３）；マツズマブ（Ｅｍｄ７２００）またはＥＫＢ－５６９を含むが、これに限定されない。
【0106】
典型的なＨＥＲ２阻害剤はトラスツズマブ（ハーセプチン）；ラパチニブ（タイケルブ）またはＡＣ－４８０を含むが、これに限定されない。
【0107】
典型的なヒストンデアセチラーゼ阻害剤はボリノスタット（Ｚｏｌｉｎｚａ）、バルプロ酸、ロミデプシン、エンチノスタットアベキシノスタット、ギビノスタット、およびモセチノスタットを含むが、これに限定されない。
【0108】
典型的なホルモン剤または抗ホルモン剤はタモキシフェン（Ｓｏｌｔａｍｏｘ；ノルバデックス）；ラロキシフェン（エビスタ）；メゲストロール（Ｍｅｇａｃｅ）；ロイプロリド（リュープロン；リュープロンデポー；エリガード；Ｖｉａｄｕｒ）；フルベストラント（フェソロデックス）；レトロゾール（フェマーラ）；トリプトレリン（トレルスターＬＡ；トレルスターデポー）；エキセメスタン（アロマシン）；ゴセレリン（ゾラデックス）；ビカルタミド（カソデックス）；アナストロゾール（アリミデックス）、フルオキシメステロン（Ａｎｄｒｏｘｙ；Ｈａｌｏｔｅｓｔｉｎ）；メドロキシプロゲステロン（プロベラ；デポープロベラ）；酢酸アビラテロン（ザイティガ）；リュープロレリン（リュープロン）；エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ）；フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ）；トレミフェン（フェアストン）；デガレリクス（ファーマゴン）；ニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ）；アバレリックス（Ｐｌｅｎａｘｉｓ）；またはテストラクトン（Ｔｅｓｌａｃ）を含むが、これに限定されない。
【0109】
典型的な有糸分裂阻害剤はパクリタキセル（タキソール；Ｏｎｘｏｌ；アブラキサン）；ドセタキセル（タキソテール）；ビンクリスチン（オンコビン；Ｖｉｎｃａｓａｒ ＰＦＳ）；ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ）；エトポシド（Ｔｏｐｏｓａｒ；Ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ；ＶｅＰｅｓｉｄ）；テニポシド（Ｖｕｍｏｎ）；イクサベピロン（イグゼンプラ）；ノコダゾール；エポチロン；ビノレルビン（ナベルビン）；カンプトテシン（ＣＰＴ）；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）；トポテカン（ハイカムチン）；アムサクリン、またはラメラリンＤ（ＬＡＭ－Ｄ）を含むが、これに限定されない。
【0110】
典型的なホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤は不可逆的ＰＩ３Ｋ阻害剤ワートマニン、ワートマニン誘導体デメトキシビリジン、可逆的ＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２；ＢＫＭ１２０（ブパリシブ）；イデラリシブ（ＰＩ３Ｋδ阻害剤）；ドゥベリシブ（ＩＰＩ－１４５、ＰＩ３Ｋδおよびγ阻害剤）；α特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤アルペリシブ（ＢＹＬ７１９）；経口ＰＩ３Ｋδ阻害剤ＴＧＲ１２０２（旧名ＲＰ５２６４）；およびＰＩ３Ｋα、δアイソフォーム限定的阻害剤コパンリシブ（ＢＡＹ８０－６９４６）を含む。
【0111】
典型的なＡｋｔ阻害剤はミルテホシン、ＡＺＤ５３６３、ＧＤＣ－００６８、ＭＫ２２０６、ペリホシン、ＲＸ－０２０１、ＰＢＩ－０５２０４、ＧＳＫ２１４１７９５およびＳＲ１３６６８を含むが、これに限定されない。
【0112】
典型的なＭＴＯＲ阻害剤はエベロリムス（アフィニトール）またはテムシロリムス（トーリセル）；ラパミューン、リダフォロリムス、デフォロリムス（ＡＰ２３５７３）、ＡＺＤ８０５５（アストラゼネカ）、ＯＳＩ－０２７（ＯＳＩ）、ＩＮＫ－１２８、ＢＥＺ２３５、ＰＩ－１０３、トリン１、ＰＰ２４２、ＰＰ３０、Ｋｕ－００６３７９４、ＷＡＹ－６００、ＷＹＥ－６８７、ＷＹＥ－３５４およびＣＣ－２２３を含むが、これに限定されない。
【0113】
典型的なプロテオソーム阻害剤はボルテゾミブ（ＰＳ－３４１）、イキサゾミブ（ＭＬＮ２２３８）、ＭＬＮ９７０８、デランゾミブ（ＣＥＰ－１８７７０）、カルフィルゾミブ（ＰＲ－１７１）、ＹＵ１０１、オプロゾミブ（ＯＮＸ－０９１２）、マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）、およびジスフィラムを含むが、これに限定されない。
【0114】
典型的なＰＡＲＰ阻害剤はオラパリブ、イニパリブ、ベラパリブ、ＢＭＮ－６７３、ＢＳＩ－２０１、ＡＧ０１４６９９、ＡＢＴ－８８８、ＧＰＩ２１０１６、ＭＫ４８２７、ＩＮＯ－１００１、ＣＥＰ－９７２２、ＰＪ－３４、Ｔｉｑ－Ａ、フェン、ＰＦ－０１３６７３３８およびその組み合わせを含むが、これに限定されない。
【0115】
典型的なＲａｓ／ＭＡＰＫ経路阻害剤はトラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ＣＩ－１０４０、ＰＤ０３２５９０１、ＡＳ７０３０２６、ＲＯ４９８７６５５、ＲＯ５０６８７６０、ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２、ＴＡＫ－７３３、Ｕ０１２６、ＭＥＫ１６２およびＧＤＣ－０９７３を含むが、これに限定されない。
【0116】
典型的なセントロソームデクラスタリング剤はグリセオフルビン；ノスカピン、臭素化ノスカピン（たとえば９－ブロモノスカピン）、還元ブロモノスカピン（ＲＢＮ）、Ｎ－（３－ブロモベンジル）ノスカピン、アミノノスカピンおよびその水溶性の誘導体などのノスカピン誘導体；ＣＷ０６９；フェナントリデン誘導化ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ阻害剤、ＰＪ－３４；Ｎ２－（３－ピリジルメチル）－５－ニトロ－２－フラミド、Ｎ２－（２－チエニルメチル）－５－ニトロ－２－フラミド、およびＮ２－ベンジル－５－ニトロ－２－フラミドを含むが、これに限定されない。
【0117】
典型的なマルチキナーゼ阻害剤はレゴラフェニブ；ソラフェニブ（ネクサバール）；スニチニブ（スーテント）；ＢＩＢＷ２９９２；Ｅ７０８０；Ｚｄ６４７４；ＰＫＣ－４１２；モテサニブまたはＡＰ２４５３４を含むが、これに限定されない。
【0118】
典型的なセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤はルボキシスタウリン；エリル／塩酸イースジル；フラボピリドール；セリシクリブ（ＣＹＣ２０２、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｒｉｎｅ）；ＳＮＳ－０３２（ＢＭＳ－３８７０３２）；Ｐｋｃ４１２；ブリオスタチン；ＫＡＩ－９８０３；ＳＦ１１２６；ＶＸ－６８０；Ａｚｄ１１５２；Ａｒｒｙ－１４２８８６（ＡＺＤ－６２４４）；ＳＣＩＯ－４６９；ＧＷ６８１３２３；ＣＣ－４０１；ＣＥＰ－１３４７またはＰＤ３３２９９１を含むが、これに限定されない。
【0119】
典型的なチロシンキナーゼ阻害剤はエルロチニブ（タルセバ）；ゲフィチニブ（イレッサ）；イマチニブ（グリベック）；ソラフェニブ（ネクサバール）；スニチニブ（スーテント）；トラスツズマブ（ハーセプチン）；ベバシズマブ（アバスチン）；リツキシマブ（リツキサン）；ラパチニブ（タイケルブ）；セツキシマブ（アービタックス）；パニツムマブ（ベクティビックス）；エベロリムス（アフィニトール）、アレムツズマブ（キャンパス）；ゲムツズマブ（マイロターグ）；テムシロリムス（トーリセル）；パゾパニブ（ヴォトリエント）；ダサチニブ（スプリセル）；ニロチニブ（タシグナ）；バタラニブ（Ｐｔｋ７８７；ＺＫ２２２５８４）；ＣＥＰ－７０１；ＳＵ５６１４；ＭＬＮ５１８；ＸＬ９９９；ＶＸ－３２２；Ａｚｄ０５３０；ＢＭＳ－３５４８２５；ＳＫＩ－６０６ ＣＰ－６９０；ＡＧ－４９０；ＷＨＩ－Ｐ１５４；ＷＨＩ－Ｐ１３１；ＡＣ－２２０；またはＡＭＧ８８８を含むが、これに限定されない。
【0120】
典型的なＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ阻害剤はベバシズマブ（アバスチン）；ソラフェニブ（ネクサバール）；スニチニブ（スーテント）；ラニビズマブ；ペガプタニブ；またはバンデチニブを含むが、これに限定されない。
【0121】
典型的な微小管標的化剤はパクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン類およびナベルビンを含むが、これに限定されない。
【0122】
典型的なトポイソメラーゼ毒剤はテニポシド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エピルビシンおよびイダルビシンを含むが、これに限定されない。
【0123】
典型的なタキサンまたはタキサン誘導体はパクリタキセルおよびドセタキセルを含むが、これに限定されない。
【0124】
典型的な一般的化学療法、抗腫瘍、抗増殖剤はアルトレタミン（Ｈｅｘａｌｅｎ）；イソトレチノイン（アキュテイン；アムネスティーム；クララビス；Ｓｏｔｒｅｔ）；トレチノイン（ベサノイド）；アザシチジン（ビダーザ）；ボルテゾミブ（ベルケイド）；アスパラギナーゼ（Ｅｌｓｐａｒ）；レバミゾール（Ｅｒｇａｍｉｓｏｌ）；マイトテイン（Ｌｙｓｏｄｒｅｎ）；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）；ペグアスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）；デニロイキンジフチトクス（Ｏｎｔａｋ）；ポルフィマー（フォトフリン）；アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）；レナリドミド（レブリミド）；ベキサロテン（タルグレチン）；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）；テムシロリムス（トーリセル）；三酸化ヒ素（トリセノックス）；ベルテポルフィン（ビスダイン）；およびミモシン（ロイセノール）を含むが、これに限定されない。
【0125】
一部の実施形態においては、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログは、ＧＶＨＤの治療を目的として、１つ以上のＳＯＣ ＭＴＸ／カルシニューリン阻害剤との相乗的組み合わせで投与される。
【0126】
これらの追加的化学療法剤は、エキノマイシンまたはそのアナログを有するリポソームに装填されるか、本願のリポソーム製剤と併用投与される別個のリポソーム製剤の状態にあるか、または別段使用される他の投与形態（たとえば経口投与、静脈内注射など）によるものでありうる。
【0127】
（医薬製剤）
エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログおよびリポソームなどのマイクロエマルション薬剤送達担体を含む本発明の医薬組成物は、標準的な技術にしたがって調製される。それらは医薬として許容される担体をさらに含むことができる。本願で用いるところの用語「医薬として許容される」は、動物またはヒトに投与されるとき、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を引き起こさない分子実体または組成物を適宜示す。本願で用いる用語「医薬として許容される担体」は、医薬として許容される物質について媒体として用いうる、任意且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および／または抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延化剤、バッファー、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル、界面活性剤などを含む。
エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログおよびリポソームなどのマイクロエマルション薬剤送達担体を含む本発明の医薬組成物は、標準的な技術にしたがって調製される。それらは医薬として許容される担体をさらに含むことができる。本願で用いるところの用語「医薬として許容される」は、動物またはヒトに投与されるとき、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を引き起こさない分子実体または組成物を適宜示す。本願で用いる用語「医薬として許容される担体」は、医薬として許容される物質について媒体として用いうる、任意且つ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および／または抗真菌剤、等張化剤、および吸収遅延化剤、バッファー、賦形剤、結合剤、滑沢剤、ゲル、界面活性剤などを含む。
【0128】
代表的担体または賦形剤は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーを含むが、これに限定されない。典型的な医薬として許容される担体は、水、生理食塩水、等張水溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、０．３％グリシン水溶液、グリセロール、エタノールなどのうち１つ以上、さらにはその組み合わせを含む。多くの場合、組成物にたとえば糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、または塩化ナトリウムなどの等張化剤、または安定性を高めるためにアルブミンなどの糖タンパク質、リポタンパク質およびグロブリンを含むことが好ましい。医薬として許容される担体は、治療物質の有効期限を延長するか、または有効性を高める湿潤剤または乳化剤、保存料またはバッファーなどの少量の補助物質をさらに含みうる。
【0129】
これらの組成物は、当業者にとって周知である通常の滅菌技術によって滅菌することができる。たとえば十分に小さなリポソームは、無菌濾過技術を用いて滅菌することができる。
【0130】
修飾することのできる製剤特性はたとえばｐＨおよび浸透圧などを含む。たとえば、非経口投与するときに製剤の有効性を高めるため、ヒトの血液または組織のそれと同様のｐＨおよび浸透圧を有する製剤を得ることが望ましいことがある。またその代わりに、他の投与経路を経て投与するときに開示された組成物の有効性を高めるため、代替的な特性を修飾することもある。
【0131】
本発明においてバッファーは、他の目的の中でもとりわけ（特に非経口投与にとって望ましい）医薬組成物の総ｐＨの操作に対して有用である。有機または無機酸、塩基、またはアミノ酸などの多様な塩、さらにはクエン酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、乳酸、酢酸、重炭酸、または炭酸イオンの多様な形態などを含む、技術上既知である多様なバッファーを本発明において用いることができる。本発明において、本願に開示される組成物の非経口投与形態における使用に対して特に有利なバッファーは、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、コハク酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含むナトリウムまたはカリウムバッファーである。
【0132】
塩化ナトリウムは、０～３００ｍＭの濃度（液状剤型には１５０ｍＭが最適）で、溶液の毒性を変更するために用いることができる。凍結防止剤は凍結乾燥剤型に含めることができ、主として０～１０％スクロースである（０．５～１．０％が最適）。他の適切な凍結防止剤はトレハロースおよびラクトースを含む。充填剤は凍結乾燥剤型に含めることができ、主として１～１０％マンニトールである（２～４％が最適）。安定化剤は液状剤型および凍結乾燥剤型の双方に用いることが可能であり、主として１～５０ｍＭのＬ－メチオニンである（５～１０ｍＭが最適）。他の適切な充填剤はグリシン、アルギニンを含み、０～０．０５％ポリソルベート８０として含めることができる（０．００５～０．０１％が最適）。
【0133】
１つの実施形態においては、リン酸ナトリウムは約７．０のｐＨを達成するために約２０ｍＭの濃度において用いられる。特に効果的なリン酸ナトリウムバッファー系は、一塩基リン酸ナトリウム一水和物および二塩基リン酸ナトリウム五水和物を含む。この一塩基および二塩基リン酸ナトリウムの組み合わせを用いる場合、それぞれの有利な濃度は一塩基約０．５から約１．５ｍｇ／ｍＬおよび二塩基約２．０から約４．０ｍｇ／ｍＬであり、好ましい濃度は一塩基約０．９ｍｇ／ｍＬおよび二塩基約３．４ｍｇ／ｍＬである。製剤のｐＨは使用するバッファーの量に応じて変化する。
【0134】
剤型および意図する投与形態に応じて、異なる濃度のバッファーを用いるか、または他の添加物を用いて他の範囲を包含するよう組成物のｐＨを調節することが代替的に有利となりうる。本願の組成物にとって有用なｐＨの範囲は約２．０のｐＨから約１２．０のｐＨを含む。
【0135】
一部の実施形態においては、界面活性剤が使用する薬剤送達系を阻害しない場合、本願に開示する製剤においてそれらの界面活性剤を使用することも有利となる。有用であると立証される界面活性剤または抗吸着剤はポリオキシエチレンソルビタン、一ラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン、Ｔｗｅｅｎ－２０（登録商標）などのポリソルベート－２０、ポリソルベート－８０、ポリソルベート－２０、ヒドロキシセルロース、ゲナポールおよびＢＲＩＪ界面活性剤を含む。例として、本発明において非経口投与可能な組成物を生成するために任意の界面活性剤を用いる場合、約０．０１から約０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で用いることが有利である。
【0136】
追加的な有利な添加物は、具体的なニーズまたは組成物の意図する使用または配合者に従い、当業者によって容易に判断される。そのような特に有用な追加的物質の１つは、製剤の浸透圧を調節して所望の浸透圧を得るのに有用である塩化ナトリウムである。開示された組成物の非経口投与にとって特に好ましい浸透圧は、約２７０から約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内である。非経口投与、具体的には注射される組成物にとって最適な浸透圧は約３０００ｓｍ／ｋｇであり、約６．５から約７．５ｍｇ／ｍＬの濃度での塩化ナトリウムの使用によって達成可能であって、約７．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム濃度が特に有効である。
【0137】
エキノマイシン含有リポソームまたはエキノマイシン含有マイクロエマルション薬剤送達担体は、無菌条件下で凍結乾燥粉末として保存し、投与前に無菌水溶液と合わせることができる。リポソームを再懸濁するのに用いられる水溶液は、上記に論じられたｐＨ調節物質および緩衝化物質、浸透圧調節剤など物理的条件を近似するのに必要とされるところの、医薬として許容される補助物質を含有することができる。
【0138】
他の実施形態においては、エキノマイシン含有リポソームまたはエキノマイシン含有マイクロエマルション薬剤送達担体は、投与前に懸濁液、好ましくは水性懸濁液として保存することができる。一定の実施形態においては、リポソームの保存のために用いられる溶液またはマイクロエマルション薬剤担体懸濁液は、保存時にフリーラジカルまたは脂質過酸化による損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含む。適切な保護化合物は、α－トコフェロールなどのフリーラジカルクエンチャーおよびフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異性キレート剤を含む。
【0139】
エキノマイシン／エキノマイシンアナログの用量は、以下にさらに記載する適切な動物モデルにおいて試験することができる。一般的な提案として、エキノマイシン、エキノマイシンアナログまたは他の抗癌剤の治療上有効な量は、１回の投与であれ、それ以上の回数の投与であれ、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲内で投与される。具体的な実施形態においては、各融合タンパク質または発現ベクターは約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、１０ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１００ｎｇ／ｋｇ体重／日から約１μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１μｇ／ｋｇ体重／日から約１０μｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０μｇ／ｋｇ体重／日から約１００μｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１００μｇ／ｋｇ体重／日から約１ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日から約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与される。
【0140】
一部の実施形態においては、エキノマイシンは１０～３０，０００μｇ／ｍ２、１００～３０，０００μｇ／ｍ２、５００～３０，０００μｇ／ｍ２、１０００～３０，０００μｇ／ｍ２、１５００～３０，０００μｇ／ｍ２、２０００～３０，０００μｇ／ｍ２、２５００～３０，０００μｇ／ｍ２、３０００～３０，０００μｇ／ｍ２、３５００～３０，０００μｇ／ｍ２、４０００～３０，０００μｇ／ｍ２、１００～２０，０００μｇ／ｍ２、５００～２０，０００μｇ／ｍ２、１０００～２０，０００μｇ／ｍ２、１５００～２０，０００μｇ／ｍ２、２０００～２０，０００μｇ／ｍ２、２５００～２０，０００μｇ／ｍ２、３０００～２０，０００μｇ／ｍ２、３５００～２０，０００μｇ／ｍ２、１００～１０，０００μｇ／ｍ２、５００～１０，０００μｇ／ｍ２、１０００～１０，０００μｇ／ｍ２、１５００～１０，０００μｇ／ｍ２、２０００～１０，０００μｇ／ｍ２、または２５００～１０，０００μｇ／ｍ２の体表面積（ＢＳＡ）ベース用量で投与される。
【0141】
他の実施形態においては、エキノマイシンは各投与につき約１０ｎｇから約１００ｎｇ／回、約１０ｎｇから約１μｇ／回、約１０ｎｇから約１０μｇ／回、約１０ｎｇから約１００μｇ／回、約１０ｎｇから約１ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１０ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１００ｍｇ／回、約１０ｎｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０ｎｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１μｇ／回、約１００ｎｇから約１０μｇ／回、約１００ｎｇから約１００μｇ／回、約１００ｎｇから約１ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１０ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１００ｍｇ／回、約１００ｎｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００ｎｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１μｇから約１０μｇ／回、約１μｇから約１００μｇ／回、約１μｇから約１ｍｇ／回、約１μｇから約１０ｍｇ／回、約１μｇから約１００ｍｇ／回、約１μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１μｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１０μｇから約１００μｇ／回、約１０μｇから約１ｍｇ／回、約１０μｇから約１０ｍｇ／回、約１０μｇから約１００ｍｇ／回、約１０μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０μｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１００μｇから約１ｍｇ／回、約１００μｇから約１０ｍｇ／回、約１００μｇから約１００ｍｇ／回、約１００μｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００μｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１ｍｇから約１０ｍｇ／回、約１ｍｇから約１００ｍｇ／回、約１ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１０ｍｇから約１００ｍｇ／回、約１０ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１０ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回、約１００ｍｇから約１０００ｍｇ／注射、約１００ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回および約１０００ｍｇから約１０，０００ｍｇ／回の範囲で投与される。融合タンパク質または発現ベクターは連日、２、３、４、５、６または７日毎、または１、２、３、または４週間毎投与しうる。
【0142】
他の具体的な実施形態においては、エキノマイシンの量は約０．０００６ｍｇ／日、０．００１ｍｇ／日、０．００３ｍｇ／日、０．００６ｍｇ／日、０．０１ｍｇ／日、０．０３ｍｇ／日、０．０６ｍｇ／日、０．１ｍｇ／日、０．３ｍｇ／日、０．６ｍｇ／日、１ｍｇ／日、３ｍｇ／日、６ｍｇ／日、１０ｍｇ／日、３０ｍｇ／日、６０ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、３００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、２０００ｍｇ／日、５０００ｍｇ／日または１０，０００ｍｇ／日の用量で投与しうる。予想されるように、用量は条件、患者の体格、年齢、および病状に依存することになる。
【0143】
用量は、特定の増殖性疾患、自己免疫疾患または同種免疫応答に適したいくつかの技術上許容される動物モデルで試験することができる。
【0144】
医薬組成物中の治療物質は、「治療上有効な量」で製剤化しうる。「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するのに有効な用量で且つ必要な期間内に有効である量を指す。リポソーム製剤または他のマイクロエマルション薬剤送達担体の治療的に有効な量は、治療しようとする状態、状態の重症度および経過、投与様式、個別の薬剤のバイオアベイラビリティ、送達担体が個体において所望の反応を誘発する能力、前治療、患者の年齢、体重および性別、患者の臨床履歴および抗体への応答、使用する融合タンパク質または発現ベクターの種類、主治医の裁量などに応じて変動しうる。治療的に有効な量は、治療的に有益な効果が送達担体のあらゆる毒性または有害作用を上回る量でもある。
【0145】
（エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを投与するための方法）
１つの態様においては、本発明のマイクロエマルション薬剤送達系は、増殖性疾患、自己免疫疾患を有するか、または同種免疫応答を示す哺乳類対象を治療するための方法において用いられる。
１つの態様においては、本発明のマイクロエマルション薬剤送達系は、増殖性疾患、自己免疫疾患を有するか、または同種免疫応答を示す哺乳類対象を治療するための方法において用いられる。
【0146】
１つの実施形態においては、哺乳類対象における増殖性疾患を治療し、かつ／またはその重症度を低下させる方法は：対象における増殖性疾患を治療し、かつ／またはその重症度を低下させるために有効な量で、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを含むマイクロエマルション薬剤送達担体を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。
【0147】
他の実施形態においては、哺乳類対象における自己免疫疾患を治療し、かつ／またはその重症度を低下させる方法は：対象における自己免疫疾患を治療し、かつ／またはその重症度を低下させるために有効な量で、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを含むマイクロエマルション薬剤送達担体を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。
【0148】
さらなる実施形態においては、同種造血幹細胞（ＨＳＣ）移植を受ける哺乳類対象においてＧｖＨＤの発生を予防するかまたはＧｖＨＤの重症度を低下させる方法は：対象または移植されるＨＳＣまたはその双方に、対象におけるＧｖＨＤを予防するかまたはその重症度を低下させるために有効な量で、エキノマイシンを含むマイクロエマルション薬剤送達担体を含む医薬組成物と組み合わせて投与することを含む。
【0149】
エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログをリポソームまたは他のマイクロエマルション薬剤送達担体に封入する場合、任意の有効量のエキノマイシンまたはエキノマイシンを投与しうる。好ましくは、エキノマイシンまたはエキノマイシンアナログを含有するリポソーム製剤または他のマイクロエマルション薬剤送達担体は、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、組織内、鼻腔内、皮内、点滴、脳内、直腸内、膣内、腹腔内、腫瘍内を含む非経口的注射によって投与される。
【0150】
リポソームエキノマイシンの静脈内投与は、約１ｍｇ／ｋｇ体重の用量でマウスに忍容され、ＬＤ５０値には到達していない。対照的に、遊離エキノマイシンはＬＤ５０値０．６２９ｍｇ／ｋｇを有する。
【0151】
その他の投与経路は経口、局所（鼻腔、経皮、皮内または眼球内）、粘膜（たとえば鼻腔、舌下、バッカル、直腸、膣など）、吸入、リンパ内、脊髄内、頭蓋内、腹腔内、気管内、膀胱内、髄腔内、腸内、肺内、リンパ内、体腔内、眼窩内、嚢内および経尿道、さらにはカテーテルまたはステントによる局所送達を含む。
【0152】
一定の実施形態においては、組成物はデポー製剤として製剤化することもできる。そのような長時間作用型製剤は適切な部位への埋め込みまたは非経口注射、具体的には腫瘍内注射または癌組織に隣接した部位への注射によって投与しうる。
【0153】
リポソーム製剤またはその他のマイクロエマルション送達担体は、凍結乾燥し、好ましくは真空下で無菌粉末として保存した後、注射の前に静菌水（たとえばベンジルアルコール保存料を含有）または滅菌水に再溶解することができる。医薬組成物は、たとえばボーラス注射または持続点滴などの注射による非経口投与を目的として製剤化することもある。
【0154】
送達担体は一度に、または一連の治療にわたって患者に投与され、また診断以降の任意の時点で患者に投与しうる。送達担体は単独の治療として投与することも、あるいは対象とする状態を治療する上で有用な他の薬剤または治療法と共に投与することもある。
【0155】
本発明は、制限的であると解釈すべきでない以下の実施例によってさらに例示される。本願の全体で引用された全ての引用文献、特許明細書および公開特許明細書の内容、さらに図面と表は、参照文献として本願に援用する。当業者は、本願に鑑み、開示される具体的な実施形態に多くの変更を加えることが可能であり、かつそれでも本発明の趣旨および範囲を離れることなく、類似のまたは同様の結果を得ることができることを認識すべきである。
【実施例1】
【0156】
（リポソーム－エキノマイシン製剤の調製）
化学天秤で脂質成分とエキノマイシンを秤量し、ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）などの適切な溶媒に適切な比率で溶解し、ボルテックスミキサーで混合した。低流量の窒素気流を用いて有機溶媒を蒸発させ、ガラスバイアルの壁面に均一な脂質フィルムを生成した。ゲル化を防止するため、乾燥工程は６５℃で実施した。あらかじめ６５℃に加熱した１０％スクロース再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）溶液を添加して脂質フィルムを水和し、総脂質の最終濃度を７．１ｍｇ／ｍＬとした。水和した混合物は６５℃より高温に維持し、フィルムが全て溶解するまでボルテックスミキサーで激しく混合した。大型多層ベシクル（ＬＶＭ）の水和溶液を、アバンティミニエクストルーダ－を用い、押出し後にプールしたリポソーム混合物の平均粒径が動的光散乱（ＤＬＳ）で９４～９９ｎｍの範囲内と測定され、多分散係数（ＰｄＩ）が０．０５未満となるまで、増分を１ｍＬとして２００ｎｍ、１００ｎｍ、および５０ｎｍの重層化したポリカーボネート（ＰＣ）フィルターを通して徹底的な押出しを実施した。膜の汚れを防止するため、押出し工程は６５℃で遂行し、ＰＣ膜は１ｍＬ押し出す毎に交換した。１ｍＬ押出しの最小通過回数は２１回であったが、押出し後混合物の分析後にＤＬＳ品質基準測定値が適合しない場合は、５０ｎｍＰＣ膜を用いて追加的な通過を実施した。生成する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）懸濁液を、室温（２１℃）で一晩安定化させた。次に、生成物を直径３３ｍｍの０．２２μｍＰＥＳ膜（ミリポア）で１回無菌濾過して捕捉されなかったエキノマイシンを除去し、濾液をＨＰＬＣおよびＤＬＳ分析用にサンプリングし、無菌ガラスバイアルに入れ、使用時まで２～８℃で保存した。
化学天秤で脂質成分とエキノマイシンを秤量し、ガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）などの適切な溶媒に適切な比率で溶解し、ボルテックスミキサーで混合した。低流量の窒素気流を用いて有機溶媒を蒸発させ、ガラスバイアルの壁面に均一な脂質フィルムを生成した。ゲル化を防止するため、乾燥工程は６５℃で実施した。あらかじめ６５℃に加熱した１０％スクロース再蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）溶液を添加して脂質フィルムを水和し、総脂質の最終濃度を７．１ｍｇ／ｍＬとした。水和した混合物は６５℃より高温に維持し、フィルムが全て溶解するまでボルテックスミキサーで激しく混合した。大型多層ベシクル（ＬＶＭ）の水和溶液を、アバンティミニエクストルーダ－を用い、押出し後にプールしたリポソーム混合物の平均粒径が動的光散乱（ＤＬＳ）で９４～９９ｎｍの範囲内と測定され、多分散係数（ＰｄＩ）が０．０５未満となるまで、増分を１ｍＬとして２００ｎｍ、１００ｎｍ、および５０ｎｍの重層化したポリカーボネート（ＰＣ）フィルターを通して徹底的な押出しを実施した。膜の汚れを防止するため、押出し工程は６５℃で遂行し、ＰＣ膜は１ｍＬ押し出す毎に交換した。１ｍＬ押出しの最小通過回数は２１回であったが、押出し後混合物の分析後にＤＬＳ品質基準測定値が適合しない場合は、５０ｎｍＰＣ膜を用いて追加的な通過を実施した。生成する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）懸濁液を、室温（２１℃）で一晩安定化させた。次に、生成物を直径３３ｍｍの０．２２μｍＰＥＳ膜（ミリポア）で１回無菌濾過して捕捉されなかったエキノマイシンを除去し、濾液をＨＰＬＣおよびＤＬＳ分析用にサンプリングし、無菌ガラスバイアルに入れ、使用時まで２～８℃で保存した。
【0157】
（１．１． ＤＳＰＣ－エキノマイシン製剤の調製）
丸底フラスコ内で、０．２ｍｇ／ｍＬエキノマイシンクロロホルム溶液１．２５ｍＬに、１３．７５ｍｇ／ｍＬジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）クロロホルム溶液１．２５ｍＬを加える。次に、９．８ｍｇ／ｍＬコレステロールクロロホルム溶液１．２５ｍＬを添加し５～１０秒間手で回して穏やかに混合する。次に、ロータリーエバポレーターを最大回転速度とし、フラスコの壁面にエキノマイシン含有脂質フィルムが形成され、全ての溶媒が完全に蒸発するまで、クロロホルムを減圧下で４５分間蒸発させる。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
丸底フラスコ内で、０．２ｍｇ／ｍＬエキノマイシンクロロホルム溶液１．２５ｍＬに、１３．７５ｍｇ／ｍＬジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）クロロホルム溶液１．２５ｍＬを加える。次に、９．８ｍｇ／ｍＬコレステロールクロロホルム溶液１．２５ｍＬを添加し５～１０秒間手で回して穏やかに混合する。次に、ロータリーエバポレーターを最大回転速度とし、フラスコの壁面にエキノマイシン含有脂質フィルムが形成され、全ての溶媒が完全に蒸発するまで、クロロホルムを減圧下で４５分間蒸発させる。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
【0158】
（１．２． ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ－ＤＯＰＣ－エキノマイシン製剤の調製）
ＤＳＰＣをＤＯＰＣで置換して封入効率を高めることができる一方で、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥを加えて細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを低下させ、インビボ循環時間を延長することができる。１つの実施形態においては、丸底フラスコ内で０．２ｍｇ／ｍＬエキノマイシン１．２５ｍＬをクロロホルムに溶解し、１３．７５ｍｇ／ｍＬ１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）クロロホルム溶液１．２５ｍＬを加える。次に、９．８ｍｇ／ｍＬコレステロールクロロホルム溶液１．２５ｍＬおよび１．２５ｍｇ／ｍＬポリ（エチレングリコール）－ａ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）－２０００クロロホルム溶液１．２５ｍＬを添加し、５～１０秒間手で回して穏やかに混合する。次に、ロータリーエバポレーターを最大回転速度とし、フラスコの壁面にエキノマイシン含有脂質フィルムが形成され、全ての溶媒が完全に蒸発するまで、クロロホルムを減圧下で４５分間蒸発させる。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
ＤＳＰＣをＤＯＰＣで置換して封入効率を高めることができる一方で、ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥを加えて細網内皮系（ＲＥＳ）によるクリアランスを低下させ、インビボ循環時間を延長することができる。１つの実施形態においては、丸底フラスコ内で０．２ｍｇ／ｍＬエキノマイシン１．２５ｍＬをクロロホルムに溶解し、１３．７５ｍｇ／ｍＬ１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）クロロホルム溶液１．２５ｍＬを加える。次に、９．８ｍｇ／ｍＬコレステロールクロロホルム溶液１．２５ｍＬおよび１．２５ｍｇ／ｍＬポリ（エチレングリコール）－ａ－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）－２０００クロロホルム溶液１．２５ｍＬを添加し、５～１０秒間手で回して穏やかに混合する。次に、ロータリーエバポレーターを最大回転速度とし、フラスコの壁面にエキノマイシン含有脂質フィルムが形成され、全ての溶媒が完全に蒸発するまで、クロロホルムを減圧下で４５分間蒸発させる。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
【0159】
（１．３． ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ－ＥＰＣ－ＨＥＰＣ－エキノマイシン製剤の調製）
丸底フラスコ内でエキノマイシン０．２５ｍｇをクロロホルム１．２５ｍＬに溶解し、１２．２ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、２．２８ｍｇ／ｍＬ水素化卵黄ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、２．２８ｍｇ／ｍＬコレステロールおよび５．４ｍｇ／ｍＬメトキシポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）クロロホルム／メタノール溶液１．２５ｍＬを丸底フラスコ内のエキノマイシン溶液に加える。一旦脂質が溶媒に完全に混合したならば、減圧下で溶媒を蒸発させて除去し、丸底フラスコの壁面に脂質フィルムを形成する。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
丸底フラスコ内でエキノマイシン０．２５ｍｇをクロロホルム１．２５ｍＬに溶解し、１２．２ｍｇ／ｍＬ卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、２．２８ｍｇ／ｍＬ水素化卵黄ホスファチジルコリン（ＨＥＰＣ）、２．２８ｍｇ／ｍＬコレステロールおよび５．４ｍｇ／ｍＬメトキシポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）クロロホルム／メタノール溶液１．２５ｍＬを丸底フラスコ内のエキノマイシン溶液に加える。一旦脂質が溶媒に完全に混合したならば、減圧下で溶媒を蒸発させて除去し、丸底フラスコの壁面に脂質フィルムを形成する。脂質バッファー５ｍＬでフィルムを再水和し、ボルテックスミキサーで４５分間激しく振盪して不均一なリポソーム混合物を生成する。次に、０．２ミクロンフィルターを通して混合物を押し出し、ＨＰＬＣで生成した混合物の封入効率を分析する。
【0160】
（１．４． ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ－ＨＳＰＣ－エキノマイシン製剤の調製）
他の実施例においては、以下の方法でリポソームエキノマイシンの１４ｍＬバッチを生成した：ＨＳＰＣ６０ｍｇ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）２０ｍｇ、および羊毛コレステロール２０ｍｇを５ｍＬガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）４ｍＬに溶解した。クロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）中の１０ｍｇ／ｍＬエキノマイシン０．５ｍＬを混合物に加え、ボルテックスミキサーを用いて混合物を３０秒混合した。次に、混合物を水浴で６５℃に加熱し、バイアルの壁面にエキノマイシンと脂質を含有する均一なフィルムが形成されるまで、バイアルを手で回しながら低流量窒素気流を用いて有機溶媒を蒸発させた。有機溶媒を蒸発させる工程においては、混合物を６５℃に維持してゲル化を回避することが重要である。またその代わりに丸底フラスコを使用し、自動エバポレーターシステムで回転させながら加熱水浴中で静置してもよい；ただし小規模な実験室スケール製造ロットでは、バイアルを手で回して均一なフィルム層を形成することで十分であった。十分な体積の水和溶液を小型オーブンで６５℃に予熱した。この実施例においては、水和溶液は１０％スクロース（ｗ／ｖ）蒸留脱イオン水溶液（ｓｕｃＤＤＷ）であったが、通常のＤＤＷ、０．９％ＤＤＷ生理食塩水、または１×ＰＢＳなどの他の水和溶液も許容されることが指摘される。次に、脂質－エキノマイシンフィルムを、６５℃のｓｕｃＤＤＷ１１４ｍＬに入れ、フィルムが全て完全に溶解して（約１時間）大型多層ベシクル（ＬＭＶ）の白色懸濁液を生成するまでボルテックスミキサーで激しく振盪し、水和させた。その後、アバンティミニエクストルーダ－を用い、大型多層ベシクル（ＬＶＭ）の水和溶液を、押出し後にプールしたリポソーム混合物の水力学的直径の平均が動的光散乱（ＤＬＳ）で９４～９９ｎｍの範囲内と測定され、多分散係数（ＰｄＩ）が０．０５未満となるまで、増分を１ｍＬとして２００ｎｍ、１００ｎｍ、および５０ｎｍの重層化したポリカーボネート（ＰＣ）フィルターを通し、徹底的な押出しを実施した。膜の汚れを予防するため、押出し工程は６５℃で遂行し、ＰＣ膜は１ｍＬ押し出す毎に交換した。１ｍＬ押出し毎の最小通過回数は２１回であったが、押出し後混合物の分析後にＤＬＳ品質基準測定値が適合しない場合は、５０ｎｍＰＣ膜を用いて追加的な通過を実施した。生成する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）懸濁液を、室温（２１℃）で１２～１５時間安定化させた。次に、生成物を３３ｍｍの０．２２μｍＰＥＳメンブラン（ミリポア）で１回無菌濾過して捕捉されなかったエキノマイシンおよび他の可能な汚染物質を除去した。濾液はＨＰＬＣおよびＤＬＳ分析用にサンプリングし、使用時まで２～８℃の無菌ガラスバイアルに保存した。
他の実施例においては、以下の方法でリポソームエキノマイシンの１４ｍＬバッチを生成した：ＨＳＰＣ６０ｍｇ、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）２０ｍｇ、および羊毛コレステロール２０ｍｇを５ｍＬガラスシンチレーションバイアル内でクロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）４ｍＬに溶解した。クロロホルム／メタノール２：１（ｖ／ｖ）中の１０ｍｇ／ｍＬエキノマイシン０．５ｍＬを混合物に加え、ボルテックスミキサーを用いて混合物を３０秒混合した。次に、混合物を水浴で６５℃に加熱し、バイアルの壁面にエキノマイシンと脂質を含有する均一なフィルムが形成されるまで、バイアルを手で回しながら低流量窒素気流を用いて有機溶媒を蒸発させた。有機溶媒を蒸発させる工程においては、混合物を６５℃に維持してゲル化を回避することが重要である。またその代わりに丸底フラスコを使用し、自動エバポレーターシステムで回転させながら加熱水浴中で静置してもよい；ただし小規模な実験室スケール製造ロットでは、バイアルを手で回して均一なフィルム層を形成することで十分であった。十分な体積の水和溶液を小型オーブンで６５℃に予熱した。この実施例においては、水和溶液は１０％スクロース（ｗ／ｖ）蒸留脱イオン水溶液（ｓｕｃＤＤＷ）であったが、通常のＤＤＷ、０．９％ＤＤＷ生理食塩水、または１×ＰＢＳなどの他の水和溶液も許容されることが指摘される。次に、脂質－エキノマイシンフィルムを、６５℃のｓｕｃＤＤＷ１１４ｍＬに入れ、フィルムが全て完全に溶解して（約１時間）大型多層ベシクル（ＬＭＶ）の白色懸濁液を生成するまでボルテックスミキサーで激しく振盪し、水和させた。その後、アバンティミニエクストルーダ－を用い、大型多層ベシクル（ＬＶＭ）の水和溶液を、押出し後にプールしたリポソーム混合物の水力学的直径の平均が動的光散乱（ＤＬＳ）で９４～９９ｎｍの範囲内と測定され、多分散係数（ＰｄＩ）が０．０５未満となるまで、増分を１ｍＬとして２００ｎｍ、１００ｎｍ、および５０ｎｍの重層化したポリカーボネート（ＰＣ）フィルターを通し、徹底的な押出しを実施した。膜の汚れを予防するため、押出し工程は６５℃で遂行し、ＰＣ膜は１ｍＬ押し出す毎に交換した。１ｍＬ押出し毎の最小通過回数は２１回であったが、押出し後混合物の分析後にＤＬＳ品質基準測定値が適合しない場合は、５０ｎｍＰＣ膜を用いて追加的な通過を実施した。生成する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）懸濁液を、室温（２１℃）で１２～１５時間安定化させた。次に、生成物を３３ｍｍの０．２２μｍＰＥＳメンブラン（ミリポア）で１回無菌濾過して捕捉されなかったエキノマイシンおよび他の可能な汚染物質を除去した。濾液はＨＰＬＣおよびＤＬＳ分析用にサンプリングし、使用時まで２～８℃の無菌ガラスバイアルに保存した。
【実施例2】
【0161】
（リポソームエキノマイシンの粒径分布および物理的特性の解析）
マルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いてリポソームエキノマイシン製剤の特性解析を実施し、平均粒径およびゼータ電位を測定した。図１パネルＡの代表的な動的光散乱（ＤＳＬ）プロフィールに示されるように、粒径分布は一貫して非常に狭い範囲内にあり、多分散係数は０．１未満であることが確認された。粒径＜１００ｎｍのリポソームについて、ＰＥＧ化ステルスリポソームの浸透性および滞留性の亢進（ＥＰＲ）および細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速取り込みからの最大免疫回避性による、腫瘍組織へのリポソームの蓄積が報告されている。リポソームエキノマイシンの水力学的直径の平均は約９８ｄ．ｎｍであることが確認され；これはバッチ間で容易に再現された（図１パネルＢ）。
マルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いてリポソームエキノマイシン製剤の特性解析を実施し、平均粒径およびゼータ電位を測定した。図１パネルＡの代表的な動的光散乱（ＤＳＬ）プロフィールに示されるように、粒径分布は一貫して非常に狭い範囲内にあり、多分散係数は０．１未満であることが確認された。粒径＜１００ｎｍのリポソームについて、ＰＥＧ化ステルスリポソームの浸透性および滞留性の亢進（ＥＰＲ）および細網内皮系（ＲＥＳ）による迅速取り込みからの最大免疫回避性による、腫瘍組織へのリポソームの蓄積が報告されている。リポソームエキノマイシンの水力学的直径の平均は約９８ｄ．ｎｍであることが確認され；これはバッチ間で容易に再現された（図１パネルＢ）。
【0162】
リポソーム製剤のゼータ電位を測定することにより、粒子の安定性および凝集傾向を予測するための信頼度の高い方法を提供することができる。リポソームエキノマイシンのゼータ電位の平均は約－３０ｍＶであることが確認されており、生成物は安定でありかつ凝集する可能性が低いことを示唆した（図１パネルＢ）。リポソームエキノマイシンの異なる６製剤の、ｐＤＩ、平均および標準偏差を含む追加的な物理特性の要約を表１に示す。全てのデータはマルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いて生成した。
【0163】
【表1】
【実施例3】
【0164】
（インビトロにおけるリポソームエキノマイシンからのエキノマイシンの放出）
透析によるリポソームエキノマイシンからのインビトロ薬剤放出を、各測定時点における水中でのエキノマイシン放出速度を室温で２４０時間にわたってＨＰＬＣ測定することによって評価した。エキノマイシン標準曲線によって、各測定時点におけるエキノマイシン濃度を算出した。放出百分率の算出は、透析開始前のリポソームエキノマイシンサンプルで検出されたエキノマイシン濃度初期値の関数として導出した。リポソームのインビトロ放出特性を、図２パネルＡに示す累積放出百分率に要約した。対応する測定時におけるエキノマイシンピークを示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２パネルＢにプロットした。
透析によるリポソームエキノマイシンからのインビトロ薬剤放出を、各測定時点における水中でのエキノマイシン放出速度を室温で２４０時間にわたってＨＰＬＣ測定することによって評価した。エキノマイシン標準曲線によって、各測定時点におけるエキノマイシン濃度を算出した。放出百分率の算出は、透析開始前のリポソームエキノマイシンサンプルで検出されたエキノマイシン濃度初期値の関数として導出した。リポソームのインビトロ放出特性を、図２パネルＡに示す累積放出百分率に要約した。対応する測定時におけるエキノマイシンピークを示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを図２パネルＢにプロットした。
【実施例4】
【0165】
（インビトロにおけるリポソームエキノマイシンの保存および安定性）
保存条件下でのリポソームエキノマイシンの安定性を試験するため、４℃でのリポソームエキノマイシンの物理特性を３ヶ月間にわたってモニタリングした。マルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いて、保存１ヶ月目と３ヶ月目にリポソームエキノマイシンの粒径、ＰｄＩおよびゼータ電位を評価した。これらのパラメータのいずれにも、初期値からの相当な変化は認められなかった（図３、パネルＡおよびパネルＢ）。１および３ヶ月目の測定時に、蓄積した薬剤沈殿物を０．２２μＰＥＳ膜で濾過して除去することにより、リポソームエキノマイシンの薬剤含有量損失を試験した。濾液をＨＰＬＣ分析したところ、保存条件下でのリポソームからの薬剤漏出または沈殿のエビデンスは認められなかった。
保存条件下でのリポソームエキノマイシンの安定性を試験するため、４℃でのリポソームエキノマイシンの物理特性を３ヶ月間にわたってモニタリングした。マルバーンゼータサイザーソフトウェアを用いて、保存１ヶ月目と３ヶ月目にリポソームエキノマイシンの粒径、ＰｄＩおよびゼータ電位を評価した。これらのパラメータのいずれにも、初期値からの相当な変化は認められなかった（図３、パネルＡおよびパネルＢ）。１および３ヶ月目の測定時に、蓄積した薬剤沈殿物を０．２２μＰＥＳ膜で濾過して除去することにより、リポソームエキノマイシンの薬剤含有量損失を試験した。濾液をＨＰＬＣ分析したところ、保存条件下でのリポソームからの薬剤漏出または沈殿のエビデンスは認められなかった。
【実施例5】
【0166】
（マウスにおけるリポソームエキノマイシンの毒性）
マウスにおけるリポソームエキノマイシンの毒性を試験するために、２５０μｇ／ｋｇ用量のエキノマイシン（リポソーム製剤化、非リポソーム製剤化、または同等の用量の空のリポソーム担体）の治療サイクルを、１日おきに計３回静脈内投与した。この期間を通じてマウスの体重をモニタリングした。この分析の結果より、リポソームエキノマイシンを投与されたマウスは、同等の用量およびスケジュールで遊離エキノマイシンを投与されたマウスと比較して、体重減少が少なくかつ減少した体重の回復が早いことが示された（図４、パネルＡ）。高薬剤用量（１ｍｇ／ｋｇ）では、遊離エキノマイシン投与マウスは全て１週間以内に死亡したのに対し、エキノマイシン装填リポソーム投与マウスは３＋ヶ月間の観察期間全体を通じて７０％が生存した（図４、パネルＢ）。
マウスにおけるリポソームエキノマイシンの毒性を試験するために、２５０μｇ／ｋｇ用量のエキノマイシン（リポソーム製剤化、非リポソーム製剤化、または同等の用量の空のリポソーム担体）の治療サイクルを、１日おきに計３回静脈内投与した。この期間を通じてマウスの体重をモニタリングした。この分析の結果より、リポソームエキノマイシンを投与されたマウスは、同等の用量およびスケジュールで遊離エキノマイシンを投与されたマウスと比較して、体重減少が少なくかつ減少した体重の回復が早いことが示された（図４、パネルＡ）。高薬剤用量（１ｍｇ／ｋｇ）では、遊離エキノマイシン投与マウスは全て１週間以内に死亡したのに対し、エキノマイシン装填リポソーム投与マウスは３＋ヶ月間の観察期間全体を通じて７０％が生存した（図４、パネルＢ）。
【実施例6】
【0167】
（マウスにおけるリポソームエキノマイシンと遊離エキノマイシンの薬物動態の比較）
「ステルス」リポソームは、リポソーム表面上のＰＥＧ部分の存在により、その遊離型薬剤と比較して、血流循環時間の延長を示すことが知られている。ＰＥＧはＲＥＳによる迅速な取り込みよりリポソームを遮蔽し、且つリポソーム粒子に立体安定性を提供する。遊離エキノマイシンと比較したリポソームエキノマイシンの血流循環時間の延長を測定するため、マウスにリポソームエキノマイシンまたは遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇを単回静脈注射した後、質量分析で血漿中のエキノマイシンレベルを検出することによって、両製剤の薬物動態を評価した（図５）。この分析の結果より、リポソームエキノマイシンを投与されたマウスにおけるエキノマイシンの血液中濃度および循環時間は、同等の用量の遊離エキノマイシンと比較して有意に上昇することが示された。具体的には、遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇ投与よりわずか１５分後に血漿濃度＞１ｎｇ／ｍＬが達成されるが、これと同用量のリポソームエキノマイシンは、投与後にこの濃度を８時間にわたって維持することがデータより示される（図５）。
「ステルス」リポソームは、リポソーム表面上のＰＥＧ部分の存在により、その遊離型薬剤と比較して、血流循環時間の延長を示すことが知られている。ＰＥＧはＲＥＳによる迅速な取り込みよりリポソームを遮蔽し、且つリポソーム粒子に立体安定性を提供する。遊離エキノマイシンと比較したリポソームエキノマイシンの血流循環時間の延長を測定するため、マウスにリポソームエキノマイシンまたは遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇを単回静脈注射した後、質量分析で血漿中のエキノマイシンレベルを検出することによって、両製剤の薬物動態を評価した（図５）。この分析の結果より、リポソームエキノマイシンを投与されたマウスにおけるエキノマイシンの血液中濃度および循環時間は、同等の用量の遊離エキノマイシンと比較して有意に上昇することが示された。具体的には、遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇ投与よりわずか１５分後に血漿濃度＞１ｎｇ／ｍＬが達成されるが、これと同用量のリポソームエキノマイシンは、投与後にこの濃度を８時間にわたって維持することがデータより示される（図５）。
【0168】
さらに、ＮＳＧマウスの乳癌組織における従来型エキノマイシンとリポソーム製剤化エキノマイシンの薬物動態を評価し、有意に上昇することが確認された。図６に示すように、従来型エキノマイシンの投与後わずか２時間で腫瘍濃度＞５ｎｇ／ｇを達成することができる。対照的に、リポソームエキノマイシン（Ｌｉｐｏ－ＥＭ）を同用量の０．１ｍｇ／ｋｇで投与すると組織濃度＞５ｎｇ／ｇを達成し、投与後１０時間以上持続した（図６）。より重要なこととして、リポソームエキノマイシン投与群における薬剤レベルのピークは、遊離エキノマイシン投与群よりも６倍高かった。
【実施例7】
【0169】
（エキノマイシンによりＡＬＬを治療する根拠）
初期前駆Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ ＡＬＬ）は、予後が不良であるＴ細胞性ＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ）の一形態として最近認識されている（Ｃｏｕｓｔａｎ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．，２００９ Ｆｅｂ；１０（２）：１４７－１５６）。ＥＴＰ ＡＬＬは、造血幹細胞および骨髄前駆細胞と最も関連する、非常に初期の分化停止および特異な遺伝子的および転写的特性によって特徴付けられる。ＥＴＰ ＡＬＬについての免疫表現型、遺伝子発現プロフィール、および遺伝子突然変異スペクトルの特性は解析されているものの、ＥＴＰ ＡＬＬの病態生物学の分子的メカニズムの理解は乏しく、また有効な治療標的は特定されていない。
初期前駆Ｔ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＥＴＰ ＡＬＬ）は、予後が不良であるＴ細胞性ＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ）の一形態として最近認識されている（Ｃｏｕｓｔａｎ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．，２００９ Ｆｅｂ；１０（２）：１４７－１５６）。ＥＴＰ ＡＬＬは、造血幹細胞および骨髄前駆細胞と最も関連する、非常に初期の分化停止および特異な遺伝子的および転写的特性によって特徴付けられる。ＥＴＰ ＡＬＬについての免疫表現型、遺伝子発現プロフィール、および遺伝子突然変異スペクトルの特性は解析されているものの、ＥＴＰ ＡＬＬの病態生物学の分子的メカニズムの理解は乏しく、また有効な治療標的は特定されていない。
【0170】
これまでに、白血病幹細胞の同定に用いられるマウス天然Ｔ－ＡＬＬモデルより、マウスＴ－ＡＬＬおよびヒトＡＭＬの幹細胞において、酸素正常状態であってもＨＩＦ１αシグナリングが選択的に活性化されることが判明した（Ｗａｎｇ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２０１１；８（４）：３９９－４１１）。最近の研究より、当該経路は、慢性骨髄性白血病幹細胞の維持においても決定的であることが確認されている。重要なこととして、ＨＩＦ１α阻害剤エキノマイシンはマウス白血病を効率よく根絶し、またインビトロおよびインビボでＡＭＬ幹細胞を非常に効果的かつ選択的に消失させた（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）。これらの研究より、ＨＩＦ１αは酸素正常状態でＥＴＰ ＡＬＬ細胞に存在する細胞サブセットを活性化し、またエキノマイシン投与は異種移植ＮＳＧマウスにおいてＥＴＰ ＡＬＬ細胞を大幅に減少させることが示された（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１１のＦｉｇ．１、２および３を参照）。これらの所見より、酸素正常環境におけるＨＩＦ１αの異常な活性化は、ＥＴＰ ＡＬＬの特異な性質を表すことが証明される。ＥＴＰ ＡＬＬが幹細胞および骨髄前駆細胞と最も関係する転写特性を有し、且つＨＩＦ－１αとその標的細胞の発現を亢進させている限り、これらの特性はＥＴＰ ＡＬＬの治療を目的としたリポソームエキノマイシンによるＨＩＦ－１αの標的化を裏付ける。
【実施例8】
【0171】
（異種移植ＥＴＰ－ＡＬＬ ＮＳＧマウスにおけるリポソームエキノマイシン投与の治療効果）
実施例７の結果から予想されたように、ＨＩＦ１αタンパク質は、ＥＴＰ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣ対照サンプルと比較して、ＥＴＰ ＡＬＬ細胞において過剰に産生されることが確認された（図７、パネルＡおよびパネルＢ）。ウェスタンブロッティング分析（図７、パネルＡ）またはＨＩＦ１αの細胞内染色後のＦＡＣＳ分析（図７、パネルＢ）により、３つのＥＴＰ－ＡＬＬサンプルでＨＩＦ－１αの高度な蓄積が検出された。これらの結果より、酸素正常状態のヒト原発性ＥＴＰ ＡＬＬ細胞内にＨＩＦ１αの異常な活性化が存在することが確認される。
実施例７の結果から予想されたように、ＨＩＦ１αタンパク質は、ＥＴＰ－ＡＬＬ患者由来のＰＢＭＣ対照サンプルと比較して、ＥＴＰ ＡＬＬ細胞において過剰に産生されることが確認された（図７、パネルＡおよびパネルＢ）。ウェスタンブロッティング分析（図７、パネルＡ）またはＨＩＦ１αの細胞内染色後のＦＡＣＳ分析（図７、パネルＢ）により、３つのＥＴＰ－ＡＬＬサンプルでＨＩＦ－１αの高度な蓄積が検出された。これらの結果より、酸素正常状態のヒト原発性ＥＴＰ ＡＬＬ細胞内にＨＩＦ１αの異常な活性化が存在することが確認される。
【0172】
インビボでリポソームエキノマイシン（Ｌｉｐｏ－ＥＭ）の投与によりヒトＥＴＰ－ＡＬＬ細胞を消失させることが可能か試験するため、図８，パネルＡに概要を示す投与スケジュールに従い、異種移植ＥＴＰ－ＡＬＬ ＮＳＧマウスにＬｉｐｏ－ＥＭを投与した。簡単に述べると、１×１０６個のＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞を、１．３Ｇｙｓ照射ＮＳＧマウスに対して静脈内注射により移植した。ヒトＥＴＰ－ＡＬＬ細胞の再構成は、レシピエントマウスの末梢血ｈＣＤ４５の検出によってモニタリングした。この分析の結果より、移植より３４日目のレシピエントマウスの血液中で、約１０から２０％のヒトＣＤ４５＋細胞が検出されることが示された。４回連続した隔日投与を１サイクルとし、サイクル間に８日間の休薬を挟む２サイクルからなる２０日間Ｌｉｐｏ－ＥＭ投与レジメンを３５日目に開始した。投与後にヒトＥＴＰ ＡＬＬ－１細胞の割合をモニタリングした。この分析の結果より、Ｌｉｐｏ－ＥＭは異種移植マウスの血液中のＥＴＰ－ＡＬＬ細胞を著しく減少させることが示された（図８、パネルＢ）。具体的には、Ｌｉｐｏ－ＥＭ投与前および投与後の３測定時におけるヒトＥＴＰ ＡＬＬ細胞の割合を示すＦＡＣＳプロットより、担体マウスにおける血中ヒトＣＤ４５の割合の平均は３４日目で１０．７３％、４２日目に２２．３５％に上昇、４８日目に４５．６１％、５６日目に５７．４４％、そして最終的には６４日目に８０．１８％に到達することが判明した。しかしＬｉｐｏ－ＥＭ投与マウスにおいては、この投与レジメンによりＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞はほぼ完全に消失し、レシピエントマウスの血中ヒトＣＤ４５細胞の割合は投与前の１７．４７％から投与後６４日目の１．１９％まで低下した。これらの結果より、リポソームエキノマイシンが異種移植マウスのＥＴＰ－ＡＬＬ細胞を効果的に消失させる能力が証明される。
【0173】
このマウス異種移植モデルにおいて、ＥＴＰ－ＡＬＬに対するリポソームエキノマイシンの有効性を遊離エキノマイシンと比較するために、１×１０６個のＥＴＰ ＡＬＬ－１細胞を、１．３Ｇｙｓ照射ＮＳＧマウスに静脈内注射で移植した。２１日目のＦＡＣＳ分析で末梢血中の％ｈＣＤ４５＋がほぼ１％に達したとき、２２日目にＬｏｐｏ－ＥＭ投与を開始した。マウスを各群５匹の３群に分けた。全ての投与は静脈内注射により実施した。第１群は、ＰＢＳ中のエキノマイシンを、合計１５回の投与を３回の同一サイクルに分けて実施した。サイクル毎に、マウスにＰＢＳ中のエキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇを１日１回、合計５回静脈内注射した後、５日間休薬し、その後次のサイクルを開始した。第２群はＬｉｐｏ－ＥＭを合計１０回投与し、はじめの２回は４日に１回投与し、その後７日間休薬し、その後１日おきに４回投与し、その後さらに７日間休薬し、その後さらに１日おきに４回投与した。もう１つのマウス群（ｎ＝５）には、空のリポソーム担体を、Ｌｉｐｏ－ＥＭを投与したのと同じスケジュールにしたがって投与した。３４，５０および６５日目にＦＡＣＳ分析で末梢血を検査し、レシピエントのＥＴＰ－ＡＰＰ－１細胞の増殖を投与期間にわたって比較した（図８、パネルＣ）。この分析の結果より、ＰＢＳ中のエキノマイシンの投与はＥＴＰ－ＡＬＬ－１細胞の増殖率を阻害したが、Ｌｉｐｏ－ＥＭの投与は前者と比べて優れた効果をもたらすことが示された（図８、パネルＣ）。
【実施例9】
【0174】
（インビトロ乳癌細胞におけるエキノマイシンの効果）
乳癌細胞における高ＨＩＦ－１α発現の重要性をよりよく理解するために、２つの乳癌細胞株ＭＣＦ７およびＳＵＭ１５９においてエキノマイシンが乳癌細胞の生存を低下させる能力を試験した。より具体的には、ＭＣＦ７とＳＵＭ１５９を異なる複数の濃度のエキノマイシンで４８時間処理した後、ＭＴＴ分析により細胞の生存度を測定した。この分析の結果より、エキノマイシンが生存ＳＵＭ１５９細胞の個数を減少させることが示された（ＩＣ５０＝１ｎＭ）。対照的に、ＭＣＦ７細胞はエキノマイシンに対する感受性がより低かった（図９）。これらのデータより、ＨＩＦタンパク質を過剰発現させる癌は、エキノマイシンに対する感受性がより高いことが示唆される。
乳癌細胞における高ＨＩＦ－１α発現の重要性をよりよく理解するために、２つの乳癌細胞株ＭＣＦ７およびＳＵＭ１５９においてエキノマイシンが乳癌細胞の生存を低下させる能力を試験した。より具体的には、ＭＣＦ７とＳＵＭ１５９を異なる複数の濃度のエキノマイシンで４８時間処理した後、ＭＴＴ分析により細胞の生存度を測定した。この分析の結果より、エキノマイシンが生存ＳＵＭ１５９細胞の個数を減少させることが示された（ＩＣ５０＝１ｎＭ）。対照的に、ＭＣＦ７細胞はエキノマイシンに対する感受性がより低かった（図９）。これらのデータより、ＨＩＦタンパク質を過剰発現させる癌は、エキノマイシンに対する感受性がより高いことが示唆される。
【実施例10】
【0175】
（インビボ乳癌細胞におけるリポソームエキノマイシンの治療効果）
Ｌｉｐｏ－ＥＭが乳癌腫瘍部位へのエキノマイシンの効率的な送達を可能にするか判定するために、ルシフェラーゼ発現ＳＵＭ１５９腫瘍異種移植片を担持したマウスにＤ－ルシフェリンを投与して、生物発光により腫瘍腫瘤を可視化した。さらに、Ｌｉｐｏ－ＥＭを蛍光色素ヨウ化１，１’－ジオクタデシルテトラメチルインドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）で標識し、インビボでのリポソームの追跡および蓄積を可能とした。腫瘍増殖は内因性発現したルシフェラーゼ活性により追跡した。この分析の結果より、蛍光標識したリポソームエキノマイシンの投与より２４時間後に撮影するとき、ヒト乳癌ＳＵＭ１５９腫瘍におけるＬｉｐｏ－ＥＭの選択的蓄積が示される。対照的に、同等の用量の遊離ＤｉＲ色素水溶液は、蛍光チャネルにおいて認識可能な蓄積または蛍光シグナルを生成しなかった。重要なこととして、腫瘍を全く担持しないマウスは、他の臓器に認識可能なリポソームの蓄積が見られなかった（図１０）。これらのデータより、Ｌｉｐｏ－ＥＭはマウスにおいてヒト乳癌の異種移植片腫瘍において選択的に蓄積することができることが示される。
Ｌｉｐｏ－ＥＭが乳癌腫瘍部位へのエキノマイシンの効率的な送達を可能にするか判定するために、ルシフェラーゼ発現ＳＵＭ１５９腫瘍異種移植片を担持したマウスにＤ－ルシフェリンを投与して、生物発光により腫瘍腫瘤を可視化した。さらに、Ｌｉｐｏ－ＥＭを蛍光色素ヨウ化１，１’－ジオクタデシルテトラメチルインドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）で標識し、インビボでのリポソームの追跡および蓄積を可能とした。腫瘍増殖は内因性発現したルシフェラーゼ活性により追跡した。この分析の結果より、蛍光標識したリポソームエキノマイシンの投与より２４時間後に撮影するとき、ヒト乳癌ＳＵＭ１５９腫瘍におけるＬｉｐｏ－ＥＭの選択的蓄積が示される。対照的に、同等の用量の遊離ＤｉＲ色素水溶液は、蛍光チャネルにおいて認識可能な蓄積または蛍光シグナルを生成しなかった。重要なこととして、腫瘍を全く担持しないマウスは、他の臓器に認識可能なリポソームの蓄積が見られなかった（図１０）。これらのデータより、Ｌｉｐｏ－ＥＭはマウスにおいてヒト乳癌の異種移植片腫瘍において選択的に蓄積することができることが示される。
【0176】
インビボ乳癌細胞における遊離エキノマイシン（ＰＢＳ中）、Ｌｉｐｏ－ＥＭおよび担体の治療的有効性を試験するために、ＳＵＭ１５９細胞をＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスの乳腺脂肪体に異種移植した。遊離エキノマイシン０．１ｍｇ／ｋｇを投与するとき、エキノマイシン投与群と担体対照群の間に腫瘍サイズの有意差はみられなかった（図１１、パネルＡ）。インビボヒト乳腺腫瘍におけるＬｉｐｏ－ＥＭの有効性を試験するために、ＳＵＭ１５９乳癌細胞を１０頭のＮＳＧマウスに移植し、このうち５頭のマウスには、９、１１、１３、２５および２７日目にＬｉｐｏ－ＥＭを用量０．３５ｍｇ／ｋｇの静脈内注射で投与し、これらと同じ時点で担体対象（リポソームのみ）を５頭のマウスに投与した。さらに、移植された腫瘍の増殖動態を体積（図１１パネルＢ）および重量（図１１パネルＣおよびパネルＤ）で測定した。担体マウスの腫瘍サイズが初期切除基準に達したのち、マウス１０頭を屠殺し、腫瘍を秤量した（図１１パネルＣおよびパネルＤ）。この分析の結果より、注射を合計５回のみ受けたＬｉｐｏ－ＥＭ投与マウスにおける腫瘍の増殖は、担体投与マウスと比較して有意に減少することが示された。
【0177】
これらの分析の結果より、リポソームエキノマイシンは、遊離エキノマイシンまたは担体対象と比較して、毒性の低下、血流循環時間の延長、およびマウスにおけるヒト固形腫瘍異種移植片への蓄積能力の上昇を示す安定した製剤であることが示される。リポソームエキノマイシンは、高レベルのＨＩＦ－１αを発現する造血系および固形腫瘍悪性新生物のヒト異種移植片を担持するマウスに投与するとき、著明な抗腫瘍効果を示す。
【0178】
上記は、当業者に本発明を実践する方法を教示することを目的としており、本記載を読むとき当業者に明らかとなるその明白な変更および変法の全てを詳述することを意図していない。しかし、そのような明白な変更および変法の全てが、以下の請求項に定義される本発明の範囲内に含まれることが意図されている。請求項は、文脈が特に反対のことを示さない限り、請求された構成要素およびステップを、そこで意図された目的を満たすのに有効な任意の順で包含することを意図している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】