特許 7018631 骨再生用組成物、骨再生用組成物キット、骨再生用部材および骨再生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-03

(45)【発行日】2022-02-14

(54)【発明の名称】骨再生用組成物、骨再生用組成物キット、骨再生用部材および骨再生方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/20 20060101AFI20220204BHJP

   A61K 36/31 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 38/44 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/04 20060101ALI20220204BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20220204BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20220204BHJP

   A61L 27/44 20060101ALI20220204BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20220204BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20220204BHJP

【ＦＩ】

A61L27/20

A61K36/31

A61K38/18

A61K38/44

A61K47/04

A61K47/36

A61L27/22

A61L27/44

A61L27/52

A61L27/54

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2018100652

(22)【出願日】2018-05-25

(65)【公開番号】P2019202054

(43)【公開日】2019-11-28

【審査請求日】2021-02-22

(73)【特許権者】

【識別番号】000004178

【氏名又は名称】ＪＳＲ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】598041566

【氏名又は名称】学校法人北里研究所

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ

(72)【発明者】

【氏名】林 英治

(72)【発明者】

【氏名】諫山 純

(72)【発明者】

【氏名】舟▲崎▼ 愛

(72)【発明者】

【氏名】内田 健太郎

(72)【発明者】

【氏名】関口 裕之

(72)【発明者】

【氏名】庄司 真太郎

(72)【発明者】

【氏名】高相 晶士

【審査官】藤代 亮

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／０７３９４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許第０９１３２２０１（ＵＳ，Ｂ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

・ＩＰＣ

Ａ６１Ｌ ２７／２０

Ａ６１Ｋ ３６／３１

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ａ６１Ｋ ３８／４４

Ａ６１Ｋ ４７／０４

Ａ６１Ｋ ４７／３６

Ａ６１Ｌ ２７／２２

Ａ６１Ｌ ２７／４４

Ａ６１Ｌ ２７／５２

Ａ６１Ｌ ２７／５４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）、
前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、
過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、
塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）、ならびに
水（Ｅ）
を含有する骨再生用組成物。

【請求項2】

前記塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）が遺伝子操作技術により作製された組換え型のｂＦＧＦである、請求項１に記載の骨再生用組成物。

【請求項3】

前記塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）の含有量が前記変性デキストラン（Ａ）１００質量部に対して、０．０１～１０質量部である、請求項１または２に記載の骨再生用組成物。

【請求項4】

前記塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）以外の成長因子を実質的に含有しない請求項１～３のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【請求項5】

前記ヒドロキシアリール基が、チラミン由来の基である請求項１～４のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【請求項6】

前記変性デキストラン（Ａ）における前記ヒドロキシアリール基による置換度が０．１～５０である請求項１～５のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【請求項7】

前記酸化カップリング酵素（Ｂ）が、西洋わさびペルオキシダーゼである請求項１～６のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【請求項8】

前記成分（Ｃ）が、前記過酸化物（ｃ１）である請求項１～７のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【請求項9】

第１の溶液と、第２の溶液と、第３の溶液とを有する骨再生用組成物キットであり、
前記第１の溶液が、デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）および水（Ｅ）を含有し、前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、ならびに過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、のいずれかを含有するが両方は含有せず、
前記第２の溶液が、前記酸化カップリング酵素（Ｂ）および前記成分（Ｃ）のうち第１の溶液中で含有されない方を含有し、
前記第３の溶液が、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）を含有する、
骨再生用組成物キット。

【請求項10】

請求項１～８のいずれか１項に記載の骨再生用組成物、または請求項９に記載の骨再生用組成物キットを用いて形成した骨再生用部材。

【請求項11】

請求項１～８のいずれか１項に記載の骨再生用組成物、請求項９に記載の骨再生用組成物キット、または請求項１０に記載の骨再生用部材を用いて、対象（ヒトを除く）の骨を再生させる骨再生方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、骨再生用組成物、骨再生用組成物キット、骨再生用部材および骨再生方法に関する。

【背景技術】

【0002】

骨の一部が損なわれた場合、前記骨が損なわれた箇所において、ハイドロゲルを細胞外マトリックスとして用い、細胞を増殖や分化する治療が行われている。一方、塩基性線維芽細胞増殖因子等の成長因子は、骨再生に寄与することが知られていることから、成長因子を内包するハイドロゲルの研究が進められている（特許文献１～２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際公開第２０１２／１５７３３９号

【文献】国際公開第２０１１／０２７８５０号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

骨再生治療において、成長因子は体液によって循環しやすいため、成長因子の投与部位に移植効果を長期間維持することは困難である。例えば、ハイドロゲルに成長因子を内包させることは容易であるが、内包しただけでは移植効果は充分ではなく、ハイドロゲルと成長因子との組み合わせが非常に重要である。

【0005】

本発明は、上述の問題点に対して、骨再生に有用な、骨再生用組成物、骨再生用組成物キット、および骨再生用部材を提供すること、ならびに骨再生方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは上記課題を解決すべく検討した。その結果、以下の骨再生用組成物などにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の［１］～［８］に関する。

【0007】

［１］デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）、前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）および骨を形成するタンパク質（Ｄ２）から選ばれる少なくとも１種の成長因子（Ｄ）、ならびに水（Ｅ）を含有する骨再生用組成物。

【0008】

［２］前記ヒドロキシアリール基が、チラミン由来の基である前記［１］に記載の骨再生用組成物。
［３］前記変性デキストラン（Ａ）における前記ヒドロキシアリール基による置換度が０．１～５０である前記［１］または［２］に記載の骨再生用組成物。

【0009】

［４］前記酸化カップリング酵素（Ｂ）が、西洋わさびペルオキシダーゼである前記［１］～［３］のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。
［５］前記成分（Ｃ）が、前記過酸化物（ｃ１）である前記［１］～［４］のいずれか１項に記載の骨再生用組成物。

【0010】

［６］第１の溶液と、第２の溶液と、第３の溶液とを有する骨再生用組成物キットであり、前記第１の溶液が、デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）および水（Ｅ）を含有し、前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、ならびに過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、のいずれかを含有するが両方は含有せず、前記第２の溶液が、前記酸化カップリング酵素（Ｂ）および前記成分（Ｃ）のうち第１の溶液中で含有されない方を含有し、前記第３の溶液が、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）および骨を形成するタンパク質（Ｄ２）から選ばれる少なくとも１種の成長因子（Ｄ）を含有する、骨再生用組成物キット。

【0011】

［７］前記［１］～［５］のいずれか１項に記載の骨再生用組成物、または前記［６］に記載の骨再生用組成物キットを用いて形成した骨再生用部材。
［８］前記［１］～［５］のいずれか１項に記載の骨再生用組成物、前記［６］に記載の骨再生用組成物キット、または前記［７］に記載の骨再生用部材を用いて、骨を再生させる骨再生方法。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、骨再生に有用な、骨再生用組成物、骨再生用組成物キット、および骨再生用部材を提供すること、ならびに骨再生方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、本発明の骨再生用組成物を使用した骨再生過程のスキームである。

【図2】図２は、実施例１、比較例１～２およびｃｏｎｔｏｒｏｌ群における骨折部位の新生骨量の測定結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、本発明を実施するための形態について説明する。
本明細書で例示する各物質、例えば、組成物中に含まれるまたは各工程で用いられる物質は、特に言及しない限り、それぞれ１種単独で用いることができ、または２種以上を併用して用いることができる。

【0015】

［骨再生用組成物］
本発明の骨再生用組成物（以下、単に「本発明の組成物」ともいう）は、
デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）、
前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、
過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、
塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）および骨を形成するタンパク質（Ｄ２）から選ばれる少なくとも１種の成長因子（Ｄ）、ならびに
水（Ｅ）
を含有する。

【0016】

＜変性デキストラン（Ａ）＞
変性デキストラン（Ａ）は、デキストランにヒドロキシアリール基が導入された化合物である。デキストランは、グルコースを構成単糖とし、α－１，６結合を主鎖とする多糖である。

【0017】

変性デキストラン（Ａ）は、成長因子（Ｄ）の受容体として機能することができる。このため、本発明の組成物の投与部位において成長因子（Ｄ）が安定的に存在でき、成長因子（Ｄ）の有効濃度を長期間維持できると考えられることから、骨の再生効果が高い。すなわち本発明では、変性デキストラン（Ａ）とともに特定の成長因子（Ｄ）を用いることにより、仮骨形成を促進し、骨の再生速度を向上させることができる。

【0018】

変性デキストラン（Ａ）は、ヒドロキシアリール基を有する。ヒドロキシアリール基の炭素数は、通常、６～５０、好ましくは６～３０である。前記ヒドロキシアリール基において、ベンゼン核に結合する水酸基数は通常、１以上、好ましくは１～３、より好ましくは１～２である。このように、ヒドロキシアリール基は、モノヒドロキシアリール基に限定されるわけではない。

【0019】

ヒドロキシアリール基としては、例えば、ヒドロキシフェニル基、ヒドロキシナフチル基、ヒドロキシアントラセニル基が挙げられる。ヒドロキシアリール基は、アルキル基等の置換基を有することができる。ヒドロキシアリール基において、水酸基に対して少なくとも１つのオルト位置の炭素原子には水素原子が結合していることが好ましい。ヒドロキシアリール基は、本発明の組成物の投与部位において、成長因子が、安定的に存在でき、且つその有効濃度を保持できると考えられることから、チラミン由来の基であることが好ましい。

【0020】

変性デキストラン（Ａ）は、好ましくは、ヒドロキシアリール基が、直接または有機基を介して、エステル結合、ウレタン結合またはエーテル結合によりデキストランに結合した化合物である。エステル結合、ウレタン結合およびエーテル結合は、デキストランに含まれる水酸基が結合していた炭素原子と結合していることが好ましい。

【0021】

前記有機基としては、例えば、炭素数１～２０のアルカンジイル基、前記アルカンジイル基にエーテル結合および２価のアミノ基（－ＮＨ－等）から選ばれる少なくとも１種が付加又は挿入された置換アルカンジイル基、ペプチド結合を有する有機基（具体的には、ジペプチド等のオリゴペプチドまたはそのエステル体に由来する基）が挙げられる。

【0022】

以下、変性デキストラン（Ａ）の製造例の一実施態様について説明する。
例えば、デキストランが有するアルコール性水酸基を、カルボニル化試薬を用いて、炭酸エステル誘導体基に変換した後（以下「変換反応」ともいう）、得られたデキストランの炭酸エステル誘導体と、ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物とを反応させる（以下「ヒドロキシアリール基導入反応」ともいう）。

【0023】

前記カルボニル化試薬としては、例えば、クロロギ酸ニトロフェニル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸トリクロロメチル、炭酸ビス（トリクロロメチル）が挙げられる。カルボニル化試薬の量は、通常、デキストラン１００質量部に対して１～１００質量部である。中間体である炭酸エステル誘導体が安定である場合は、一旦単離した後に次の反応を行うことができる。

【0024】

前記ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物としては、例えば、チラミンが挙げられる。前記ヒドロキシアリール基を有するアミン化合物の量は、通常、デキストランの炭酸エステル誘導体１００質量部に対して１～１００質量部である。

【0025】

前記変換反応は、塩基性化合物の存在下で行うことが好ましい。塩基性化合物としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、ピペリジンが挙げられる。

【0026】

前記変換反応およびヒドロキシアリール基導入反応は、溶媒中で行うことが好ましい。溶媒としては、例えば、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド系溶媒；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；ジクロロメタン、１，２－ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテルが挙げられる。デキストランの溶媒中への溶解性を向上させるため、塩化リチウム等のアルカリ金属塩を用いることができる。

【0027】

変性デキストラン（Ａ）の製造例の他の実施態様としては、例えば、デキストランと、アルコール性水酸基と反応可能な官能基（例：カルボキシ基、その酸ハロゲン化物、エポキシ基、オキセタニル基）およびヒドロキシアリール基を有する化合物とを、反応させる方法が挙げられる。

【0028】

デキストラン中のアルコール性水酸基と反応可能なカルボキシ基またはその酸ハロゲン化物と、ヒドロキシアリール基とを有する化合物としては、例えば、４－ヒドロキシフェニル酢酸、４－ヒドロキシフェニルプロピオン酸、４－ヒドロキシフェニルブタン酸、２－（２，５－ジヒドロキシフェニル）酢酸、これらの酸ハロゲン化物が挙げられる。

【0029】

変性デキストラン（Ａ）におけるヒドロキシアリール基による置換度（ＤＳ）は、通常、０．１～５０であり、好ましくは１～４０、より好ましくは２～３０である。置換度は、¹Ｈ ＮＭＲにより求めることができる。変性デキストラン（Ａ）の置換度とは、変性デキストラン（Ａ）の構成単糖１００単位あたりに導入されたヒドロキシアリール基の平均数を示す。変性デキストラン（Ａ）はこのような置換度を有することにより、そのゲル化速度が向上する。

【0030】

変性デキストラン（Ａ）の多角度光散乱検出器を用いた絶対分子量測定による数平均分子量は、通常、１，０００～１０，０００，０００、好ましくは３，０００～１，０００，０００、より好ましくは５，０００～５００，０００である。また、変性デキストラン（Ａ）の分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量；いずれも前記絶対分子量測定による）は、通常、１～２０、好ましくは１～１０、より好ましくは１～５である。

【0031】

変性デキストラン（Ａ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物中の変性デキストラン（Ａ）の含有割合は、通常、０．０５～４９質量％、好ましくは０．５～３０質量％、より好ましくは３～１５質量％である。このような態様であると、ゲルの機械的強度および取扱い性の観点から好ましい。

【0032】

＜ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）＞
本発明の組成物は、ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）（以下「酵素（Ｂ）」ともいう）を含有する。酵素（Ｂ）は、ヒドロキシアリール基の酸化カップリング反応を直接的または間接的に触媒しうる酵素である。

【0033】

酵素（Ｂ）としては、例えば、ラッカーゼ、チロシナーゼ等のフェノールオキシダーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼが挙げられる。ペルオキシダーゼは、過酸化水素等の過酸化物（ｃ１）と併用することで本発明の組成物をゲル化させることができる。ラッカーゼ、チロシナーゼ等の銅酵素類の起源は、例えばウルシ、キノコ（ツチカブリ、マッシュルーム）、カビ（Polyporus vericolor）が挙げられる。カタラーゼ、ペルオキシダーゼの起源は、例えば、ウシ肝臓、ウマ血球、ヒト血球、M. lysodeikticus、西洋わさび（ホースラディッシュ）、大豆、ダイコン、カブ、甲状腺、牛乳、腸、白血球、赤血球、酵母、Caldariomyces fumago、Steptococcus faecalisが挙げられる。これらの中でも、チロシナーゼとしてはマッシュルーム由来、ペルオキシダーゼとしては西洋わさび由来のもの、すなわち西洋わさびペルオキシダーゼが好ましい。

【0034】

本発明では、変性デキストラン（Ａ）が有するヒドロキシアリール基の架橋反応を効率的に進める観点から、成分（Ｃ）を用い、酵素（Ｂ）としてペルオキシダーゼおよびカタラーゼから選ばれる１種以上を少なくとも用いることが好ましく、成分（Ｃ）を用い、酵素（Ｂ）として西洋わさびペルオキシダーゼを少なくとも用いることがより好ましい。

【0035】

酵素（Ｂ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物において、酵素（Ｂ）の量は、０．０１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、０．１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましく；１，０００Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、５００Ｕ／ｍＬ以下がより好ましい。なお、Ｕとは酵素活性の単位を示し、至適条件下で、温度３０℃で毎分１マイクロモルの基質を変化させることができる酵素量である。

【0036】

＜成分（Ｃ）＞
本発明の組成物は、過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）を含有する。

【0037】

過酸化物（ｃ１）としては、例えば、過酸化水素が挙げられる。
成分（Ｃ）として過酸化物（ｃ１）を用いる場合、本発明の組成物において、過酸化物（ｃ１）の量は、変性デキストラン（Ａ）中のヒドロキシアリール基１モルに対して、通常、０．０１～１０００モル、好ましくは０．１～５００モル、より好ましくは０．５～２００モルである。また、一実施態様において、本発明の組成物中の過酸化物（ｃ１）の含有量は、反応性の点から、好ましくは１０～１，０００ｍＭ、より好ましくは１００～８００ｍＭである。

【0038】

過酸化物を生成する物質（ｃ２）は、通常、酸化酵素（ｃ３）とともに用いられる。酸化酵素（ｃ３）は、物質（ｃ２）を消費して過酸化水素等の過酸化物を生成する反応を触媒する酵素である。酸化酵素（ｃ３）としては、例えば、グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼが挙げられる。これらの酵素は、用途に応じて適宜選択できるが、ゲル化速度が大幅に向上することから、グルコースオキシダーゼが好ましい。

【0039】

物質（ｃ２）は、例えば、酸化酵素（ｃ３）により消費されて過酸化水素等の過酸化物を生成し、酸化酵素（ｃ３）に対応して選択される。例えば、酸化酵素（ｃ３）が物質（ｃ２）を、酸素の存在下（例：空気中の酸素）に酵素処理することによって、過酸化水素を生成させることができる。例えば、酸化酵素（ｃ３）が、グルコースオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼまたはコレステロールオキシダーゼである場合、物質（ｃ２）は、それぞれ、グルコース、コリン、アミノ酸、アルコール、ピルビン酸またはコレステロールである。

【0040】

成分（Ｃ）として物質（ｃ２）を用いる場合、本発明の組成物中の酸化酵素（ｃ３）の含有量は、反応性の点から、０．０１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、１Ｕ／ｍＬ以上がより好ましく；１，０００Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、５００Ｕ／ｍＬ以下がより好ましい。また、物質（ｃ２）の含有量は、過酸化物を適度に生成するような量が適宜選択される。
成分（Ｃ）は１種または２種以上用いることができる。

【0041】

＜成長因子（Ｄ）＞
本発明の組成物は、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）および骨を形成するタンパク質（Ｄ２）から選ばれる少なくとも１種の成長因子（Ｄ）を含有する。

【0042】

塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）（以下「ｂＦＧＦ」ともいう）は、細胞の増殖を制御、促進する因子の一種である。ｂＦＧＦは骨形成能に優れており、線維芽細胞の増殖を促進するのみならず、骨膜や骨髄に存在する間葉系細胞の増殖を促進する。

【0043】

ｂＦＧＦとしては、例えば、ヒト、ウシ等の哺乳動物の脳または下垂体等の臓器から抽出された、天然型のｂＦＧＦまたは遺伝子操作技術により作製された組換え型のｂＦＧＦを用いることができる。また、ｂＦＧＦには、アミノ酸配列の一部が欠失し、もしくは他のアミノ酸に置換された、または他のアミノ酸配列が挿入された塩基性線維芽細胞増殖因子の変異体も包含される。

【0044】

骨を形成するタンパク質（Ｄ２）としては、骨の形成および骨折の修復を促進するＴＧＦ－βスーパーファミリーに属するタンパク質が挙げられる。具体的には、骨芽細胞の活性を増進する因子、および間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する因子である。骨を形成するタンパク質（Ｄ２）の好適例としては、ＴＧＦ－βスーパーファミリーに属するタンパク質であるＢＭＰ（Bone Morphogenic Protein）、例えば、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８、ＢＭＰ９が挙げられる。

【0045】

成長因子（Ｄ）は１種または２種以上用いることができる。
本発明の組成物において、成長因子（Ｄ）の含有量は、変性デキストラン（Ａ）１００質量部に対して、通常、０．０１～１０質量部、好ましくは０．０５～５質量部である。このような態様であると、本発明の組成物から形成されるハイドロゲル中に成長因子（Ｄ）が良好に保持される。

【0046】

＜水（Ｅ）＞
本発明の組成物は、水（Ｅ）を含有することが好ましい。
本発明の組成物中の水（Ｅ）の含有割合は、通常、５０～９９．９質量％、好ましくは６５～９９質量％、より好ましくは７０～９７質量％である。このような態様であると、生体に対して低浸襲性な条件でゲル化が可能な組成物となり、さらに得られるゲルの機械的強度が優れる傾向にある。

【0047】

＜他の成分＞
本発明の組成物は、変性デキストラン（Ａ）以外の多糖をさらに含有することができる。前記多糖としては、例えば、ヒアルロン酸、プルラン、キサンタンガム、セルロース、グアーガム、フルクタン、マンナン、カラギーナン、キチン、キトサン、ペクチン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、ヒドロキシアリール基が導入されていない未変性のデキストラン、デキストリン、ゲランガム、アルギン酸が挙げられる。

【0048】

本発明の組成物は、その他、リン酸、ポリリン酸、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、増粘剤、着色剤およびフィラーから選ばれる１種または２種以上を含有することができ、また、薬剤、細胞等の機能発現物質を含有することができる。
また、本発明の組成物は、さらに塩化ナトリウムを含有することができる。例えば本発明の組成物は、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液を含有することができる。

【0049】

［骨再生用組成物キット］
本発明の骨再生用組成物キット（以下、単に「本発明のキット」ともいう）は、以下に説明する、第１の溶液と、第２の溶液と、第３の溶液とを有する。

【0050】

第１の溶液は、デキストランにヒドロキシアリール基が導入された変性デキストラン（Ａ）および水（Ｅ）を含有し、前記ヒドロキシアリール基の酸化カップリング酵素（Ｂ）、ならびに過酸化物（ｃ１）および過酸化物を生成する物質（ｃ２）から選ばれる少なくとも１種の成分（Ｃ）、のいずれかを含有するが両方は含有しない。

【0051】

第２の溶液は、前記酸化カップリング酵素（Ｂ）および前記成分（Ｃ）のうち第１の溶液中で含有されない方を含有する。
第３の溶液は、塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｄ１）および骨を形成するタンパク質（Ｄ２）から選ばれる少なくとも１種の成長因子（Ｄ）を含有する。

【0052】

第１～第３の溶液は、いずれも水溶液であることが好ましい。
第１～第３の溶液中の各成分（Ａ）～（Ｅ）の詳細は上述したとおりである。また、第１～第３の溶液の量比、および第１～第３の各溶液中に含まれる各成分の含有量は、第１～第３の溶液を混合して得られる組成物中の各成分（Ａ）～（Ｅ）の量比や含有量が［骨再生用組成物］欄に記載した範囲となるよう適宜設定される。第１～第３の溶液を混合することにより、本発明の組成物を調製することができる。この際、各溶液の混合順序は特に限定されないが、第１の溶液と第３の溶液とを混合した後に得られた混合物に第２の溶液を混合する、あるいは第２の溶液と第３の溶液とを混合した後に得られた混合物に第１の溶液を混合する態様が挙げられる。

【0053】

［骨再生用部材］
本発明の骨再生用部材は、本発明の骨再生用組成物または骨再生用組成物キットを用いて形成され、具体的には、前記骨再生用組成物または骨再生用組成物キットから形成されるゲルからなる。

【0054】

前記ゲルは、変性デキストラン（Ａ）が有するヒドロキシアリール基の酸化カップリングによる架橋構造を有し、すなわち変性デキストラン（Ａ）由来の架橋体を含有する。例えば、変性デキストラン（Ａ）中のヒドロキシアリール基が酸化され、前記基同士の酸化カップリング（架橋）が起こり、ゲル化が進行すると推測される。

【0055】

一実施態様において、前記ゲルは、ハイドロゲルであり、具体的には水を通常、５０～９９．９質量％、好ましくは７０～９７質量％含有するハイドロゲルである。前記ハイドロゲルは、変性デキストラン（Ａ）由来の架橋体を通常、５０～０．１質量％、好ましくは３０～３質量％含有する。前記ハイドロゲルは、機械的強度および柔軟性に優れる。

【0056】

前記ハイドロゲルを適宜乾燥するなどして水分を除去することにより、キセロゲルを得ることができる。あるいは、前記ゲルは、例えば、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０１５）２６２４－２６３０に記載のように、変性デキストラン（Ａ）とともにエオシンＹ、メチレンブルー、ローズベンガル等の光増感剤を用い、光照射を行うことでゲル化させて得ることもできる。

【0057】

骨再生用部材の製造方法の一例は、以下のとおりである。
本発明の組成物における各成分（Ａ）～（Ｅ）、または本発明のキットにおける第１～３の溶液を混合し、水溶液温度（架橋温度）が、通常、４～５０℃、好ましくは１０～４５℃、より好ましくは２０～４０℃、反応時間が、通常、１分～４８時間、好ましくは５分～３０時間の条件で、ゲル化させることができる。前記各成分（Ａ）～（Ｄ）は、各成分の水溶液として用いることができる。ハイドロゲル形成は、加圧下、常圧（大気圧）下および減圧下のいずれかで行うことができるが、常圧下が好ましい。

【0058】

なお、所望の形状のキャビティーを有する金型を用意し、本発明の組成物の各成分（Ａ）～（Ｅ）、または本発明のキットにおける第１～３の溶液を前記キャビティー中で混合して反応させることにより、前記形状を有するハイドロゲルを形成することができ、また所定の基材上に本発明の組成物、または本発明のキットにおける第１～３の溶液の混合液をキャストすることにより、フィルム状のハイドロゲルを得ることができ、および前記フィルム状のハイドロゲルを例えば円柱形状、多角柱状等に打ち抜くこともできる。

【0059】

骨再生用部材の形状は特に限定されないが、例えば、フィルム状、円柱形状、多角柱状、不織布状、ファイバー状、チューブ状、粒子状、メッシュ状が挙げられる。
本発明の骨再生用部材中には成長因子（Ｄ）が担持しており、したがって前記骨再生用部材の適用部位（例：骨の欠損部位、骨折部位）に成長因子（Ｄ）を長期間維持することが可能である。また、前記ハイドロゲルは患部において細胞外マトリックスとして機能し、この細胞外マトリックスは骨再生する細胞の足場となり、骨再生する細胞が定着して、良好に増殖および分化することができる。したがって、本発明の骨再生用部材は、骨再生効果が高い。

【0060】

［骨再生方法］
本発明の骨再生用組成物、骨再生用組成物キットおよび骨再生用部材は、骨再生用途に用いられる。例えば、骨再生を必要とする対象（例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳動物）の骨の欠損部位、骨折部位等の患部に、骨再生用組成物を投与する、もしくは骨再生用組成物キットの第１～３の溶液を混合してなる混合物を投与することにより、骨再生用部材を患部に形成する、または前記患部に骨再生用部材を適用することにより、骨再生を誘導し、骨の再生速度を向上させることができる。

【0061】

図１に、一例として本発明の骨再生用組成物を用いた場合における骨再生の推定スキームを記載する。患部３０に投与された骨再生用組成物はハイドロゲル４０を形成し、ハイドロゲル４０中には成長因子５０が良好に保持される。成長因子５０は、骨細胞の前駆細胞である骨膜細胞２０の増殖を促進する。その結果、大きな新生骨（仮骨）７０が形成される。なお、図１中では骨細胞は省略している。

【0062】

本発明の再生対象である骨は、網目状に形成されたコラーゲン線維にヒドロキシアパタイトが沈着したものであり、骨の有機質の大部分はコラーゲンである。
本発明の骨再生用組成物、骨再生用組成物キットまたは骨再生用部材は、その使用目的に合わせて、用法、用量、形状を適宜決定することができる。例えば、骨再生用組成物、または骨再生用組成物キットの第１～３の溶液の混合物は、生体内の骨の欠損部位、骨折部位等の患部に、直接、例えば注射、塗布等により投与することができる。また、前記組成物または混合物を適当な賦形剤と混合し、軟膏状、ゲル状またはクリーム状にしてから、前記患部に塗布することもできる。

【0063】

本発明の骨再生用組成物、骨再生用組成物キットおよび骨再生用部材の対象疾患としては、例えば、骨折等の外傷などにより骨の一部が損なわれた場合における骨の欠損、口腔外科疾患、骨粗鬆症が挙げられる。

【実施例】

【0064】

以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
＜変性多糖の製造＞
［合成例１］ヒドロキシフェニル基変性デキストラン（Ａ１）の合成
窒素雰囲気下、フラスコに、デキストラン（品名「デキストラン４０」、名糖工業株式会社製）４０ｇ、ジメチルホルムアミド１６００ｍｌ、および塩化リチウム３０．９ｇを加え、９０℃で９０分間攪拌した。得られた溶液を０℃に冷却し、ピリジン９．２ｍｌとクロロギ酸ニトロフェニル２３．８ｇとを加え、０℃で１時間撹拌した。次いで、前記フラスコに、冷やしたエタノール２０００ｍｌを加え、析出物を濾別し、濾物を冷やしたエタノールで洗浄し、乾燥した。

【0065】

窒素雰囲気下、フラスコに、乾燥後の前記濾物をジメチルホルムアミド７４０ｍｌで溶解した溶液を入れ、次いでチラミン９．１ｇを入れ、室温で３時間撹拌した。次いで、前記フラスコに、冷やしたエタノール８００ｍｌを加え、析出物を濾別し、濾物を純水に溶解させ透析した。

【0066】

このようにして、ヒドロキシフェニル基変性デキストラン（Ａ１）を得た。得られたヒドロキシフェニル基変性デキストラン（Ａ１）を¹Ｈ ＮＭＲにて分析したところ、ヒドロキシフェニル基による置換度（ＤＳ）は１２であった。

【0067】

［比較合成例１］ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（ＡＲ１）の合成
合成例１において、デキストランの代わりにヒアルロン酸を用いたこと以外は同様の手法にて、ヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（ＡＲ１）を得た。得られたヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（ＡＲ１）を¹Ｈ ＮＭＲにて分析したところ、そのＤＳは３．２であった。

【0068】

＜骨再生用組成物キットの第１～第３の溶液の製造＞
［製造例１］第１の溶液（１）の製造
合成例１で得られたヒドロキシフェニル基変性デキストラン（Ａ１）０．２ｇを、リン酸緩衝生理食塩水（品名「ＰＢＳ（－）」、和光純薬工業株式会社（製））０．８ｇに溶解しポリマー溶液を準備した。前記ポリマー溶液１．０ｇと、西洋わさびペルオキシダーゼ（和光純薬製、商品コード「１６９－１０７９１」、「ＨＲＰ」と略す）水溶液（濃度：０．８Ｕ／ｍｌ）１．０ｇとを均一に混合し、第１の溶液（１）を製造した。

【0069】

［比較製造例１］第１の溶液（２）の製造
比較合成例１で得られたヒドロキシフェニル基変性ヒアルロン酸（ＡＲ１）０．２ｇを、前記ＰＢＳ（－）０．８ｇに溶解しポリマー溶液を準備した。前記ポリマー溶液１．０ｇと、前記ＨＲＰ水溶液（濃度：３０Ｕ／ｍｌ）１．０ｇとを均一に混合し、第１の溶液（２）を製造した。

【0070】

［調製例１］第２の溶液（１）の準備
過酸化水素水（濃度：８８２ｍＭ）を、第２の溶液（１）とした。
［調製例２］第３の溶液（１）の製造
塩基性線維芽細胞増殖因子（製品名「フィブラストスプレー」、科研製薬社製）を前記ＰＢＳ（－）で濃度が１μｇ／μｌとなるように調整し、第３の溶液（１）を準備した。

【0071】

＜患部への骨再生用部材の適用および評価＞
［実施例１］
第３の溶液（１）１４．４μｌと、第１の溶液（１）１６５．６μｌとを均一に混合し、混合液を得た。前記混合液１５μｌに第２の溶液（１）１５μｌを混合し、骨再生用組成物を準備した。

【0072】

大腿骨を骨折させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、生後９週齢）の骨折部位に、前記骨再生用組成物２５μｌを投与し（図１参照）、４週間後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを屠殺した。骨折部位の新生骨量をｍｉｃｒｏＣＴにて測定した。新生骨量は約１３．１ｍｍ³であった。

【0073】

［比較例１］
実施例１において、第１の溶液（１）の代わりに第１の溶液（２）を用いたこと以外は実施例１と同様にして、骨再生用組成物を準備した。

【0074】

大腿骨を骨折させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、生後９週齢）の骨折部位に、前記骨再生用組成物２５μｌを投与し、実施例１と同様に試験を行った。骨折部位の新生骨量をｍｉｃｒｏＣＴにて測定した。新生骨量は約６．１ｍｍ³であった。

【0075】

［比較例２］
実施例１において、第３の溶液（１）の代わりに前記ＰＢＳ（－）を用いたこと以外は実施例１と同様に試験を行った。骨折部位の新生骨量をｍｉｃｒｏＣＴにて測定した。新生骨量は約５．０ｍｍ³であった。

【0076】

［実験例１］ｃｏｎｔｒｏｌ
ｃｏｎｔｒｏｌ群として、大腿骨を骨折させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（オス、生後９週齢）の４週間後の骨折部位の新生骨量をｍｉｃｒｏＣＴにて測定した。新生骨量は約５．６ｍｍ³であった。
以上、新生骨量の結果を図２にまとめて示す。

【0077】

＜考察＞
実施例１は、比較例１～２および実験例１（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、有意に新生骨が生成しており、骨再生に優位であることが明らかになった。

【符号の説明】

【0078】

１０：骨
１５：骨髄
２０：骨膜細胞（骨膜）
３０：患部（骨の欠損部位、骨折部位）
４０：ハイドロゲル
５０：成長因子
６０：増殖した骨膜細胞
７０：新生骨
８０：新生骨膜

【図1】

【図2】