特許 7019590 核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-04

(45)【発行日】2022-02-15

(54)【発明の名称】核酸安定化試薬、キット、及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20220207BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20220207BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220207BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20220207BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12Q1/04

C12Q1/6869 Z

C12N15/10 100Z

【請求項の数】 45

(21)【出願番号】P 2018550743

(86)(22)【出願日】2017-03-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-05-30

(86)【国際出願番号】 US2017025065

(87)【国際公開番号】W WO2017173105

(87)【国際公開日】2017-10-05

【審査請求日】2020-03-26

(31)【優先権主張番号】62/316,514

(32)【優先日】2016-03-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514304762

【氏名又は名称】バークレー ライツ，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】マキューエン，ジェイソン エム．

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１６／０１１７９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５０６４０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／００２７２９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１６６３２６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０６１４９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１５－１８０６５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５０００９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１１－５１２８７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５１０１２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１５／１５５２３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１２２６２９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表２００２－５４１７６７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００３－５１３７３３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ

Ｃ１２Ｑ

Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体細胞内の核酸集団を安定化させるためのキットであって、
少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤であって、リボソームストーリングを引き起こす薬剤である不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、
少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、
電子伝達鎖阻害剤又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、
を含む、生体細胞キット。

【請求項2】

生体細胞内の核酸集団を安定化させるためのキットであって、
少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、
少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、
電子伝達鎖阻害剤又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、
を含み、
前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が、アミノグリコシド抗生物質、Ｄ－ガラクトサミン、又はエメチンである、
生体細胞キット。

【請求項3】

前記キットが第２のタンパク質翻訳阻害剤を更に含む、請求項１又は２に記載のキット。

【請求項4】

前記第２のタンパク質翻訳阻害剤が、
（ｉ）可逆タンパク質翻訳阻害剤である、
（ｉｉ）前記不可逆タンパク質翻訳阻害剤と比較して速効性である、及び／又は
（ｉｉｉ）細胞膜透過性である、
請求項３に記載のキット。

【請求項5】

前記第２のタンパク質翻訳阻害剤が、前記可逆タンパク質翻訳阻害剤であり、前記可逆タンパク質翻訳阻害剤が、リボソーム上でのアクセプター部位からドナー部位へのペプチジルＲＮＡの移動をブロックする薬剤である、請求項４に記載のキット。

【請求項6】

前記第２のタンパク質翻訳阻害剤が、ジアゾオキシド、グルタルイミド抗生物質、シクロヘキシミド、及び／又はトコンアルカロイドである、請求項３又は４に記載のキット。

【請求項7】

（ｉ）前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が細胞膜透過性である、
（ｉｉ）前記少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が細胞膜透過性である、及び／又は
（ｉｉｉ）前記少なくとも１種の電子伝達鎖剤が細胞膜透過性である、
請求項１から６のいずれか１項に記載のキット。

【請求項8】

前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤がエメチンである、請求項１から７のいずれか１項に記載のキット。

【請求項9】

前記少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤がＣＤＫ９阻害剤、オーレスライシン、チオルチン、アマニチン、又はトリプトリドである、請求項１から８のいずれか１項に記載のキット。

【請求項10】

前記少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が不可逆阻害剤である、請求項１から９のいずれか１項に記載のキット。

【請求項11】

前記少なくとも１種の電子伝達鎖剤が可逆活性を有する、請求項１から１０のいずれか１項に記載のキット。

【請求項12】

前記電子伝達鎖剤が電子伝達鎖阻害剤である、請求項１から１１のいずれか１項に記載のキット。

【請求項13】

前記電子伝達鎖剤がアジ化ナトリウムである、請求項１から１２のいずれか１項に記載のキット。

【請求項14】

前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、前記少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び前記少なくとも１種の電子伝達鎖剤の少なくとも１つが溶液中に提供される、請求項１から１３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項15】

前記キットがRNase阻害剤を含まない、請求項１から１４のいずれか１項に記載のキット。

【請求項16】

前記キットがプロテアーゼ阻害剤、及び／又は溶解緩衝液を更に含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項17】

前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、前記少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び前記少なくとも１種の電子伝達鎖剤の２つ以上がマスターミックス中に提供される、請求項１から１６のいずれか１項に記載のキット。

【請求項18】

生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法であって、
前記生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップ
を含み、
前記接触が、前記核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、前記生体細胞が安定化生体細胞に変換され、
前記不可逆タンパク質翻訳阻害剤が、リボソームストーリングを引き起こす薬剤である、
方法。

【請求項19】

生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法であって、
前記生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップ
を含み、
前記接触が、前記核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、前記生体細胞が安定化生体細胞に変換され、
前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が、アミノグリコシド抗生物質、Ｄ－ガラクトサミン、又はエメチンである、
方法。

【請求項20】

前記生体細胞が、前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のそれぞれに同時に接触される、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のそれぞれの存在下で前記安定化生体細胞を貯蔵することを更に含む、請求項１８から２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記貯蔵ステップが、少なくとも８時間行われ、及び／又は約０℃～約４℃の温度で行われる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより前記安定化生体細胞を溶解させることを更に含む、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記溶解された安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記安定化溶解生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分からデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)の少なくとも１つを分析することを更に含む、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

分析することが、前記デオキシリボ核酸(DNA)又は前記リボ核酸(RNA)の少なくとも１つをシーケンスすることを含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記デオキシリボ核酸(DNA)又は前記リボ核酸(RNA)の少なくとも１つがリボ核酸である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

エンクロージャを含むマイクロ流体デバイス内の生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法であって、
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャ内に前記生体細胞を配置することであって、前記エンクロージャが、フロー領域と、前記フロー領域に流体接続された少なくとも１つのチャンバとを含み、前記フロー領域及び少なくとも１つのチャンバが流体培地を閉じ込めるように構成される、配置することと、
前記生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させることと、
を含み、
前記接触が、前記生体細胞の前記核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、前記生体細胞が安定化生体細胞に変換される、
方法。

【請求項29】

エンクロージャを含むマイクロ流体デバイス内の生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法であって、
前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャ内に前記生体細胞を配置することであって、前記エンクロージャが、フロー領域と、前記フロー領域に流体接続された少なくとも１つのチャンバとを含み、前記フロー領域及び少なくとも１つのチャンバが流体培地を閉じ込めるように構成される、配置することと、
前記生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させることと、
を含み、
前記接触が、前記生体細胞の前記核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、前記生体細胞が安定化生体細胞に変換され、
前記少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が、アミノグリコシド抗生物質、Ｄ－ガラクトサミン、又はエメチンである、
方法。

【請求項30】

前記マイクロ流体デバイス内に前記生体細胞を配置することが、前記少なくとも１つのチャンバ内に前記生体細胞を配置することを含む、請求項２８又は２９に記載の方法。

【請求項31】

前記少なくとも１つのチャンバが、分離領域と前記分離領域を前記フロー領域に流体接続する接続領域とを有する隔離ペンを含み、前記分離領域及び前記接続領域が、前記流体培地の成分が前記フロー領域と前記隔離ペンの前記分離領域との間で実質的に拡散のみにより交換されるように構成される、請求項２８から３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記マイクロ流体デバイスの前記エンクロージャ内に前記生体細胞の配置することが、前記隔離ペンの前記分離領域内に前記生体細胞を配置することを含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記マイクロ流体デバイス内に前記安定化生体細胞を貯蔵することを更に含む、請求項２８から３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記貯蔵ステップが、少なくとも８時間行われ、及び／又は約０℃～約４℃の温度で行われる、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記マイクロ流体デバイスから前記安定化生体細胞を搬出することを更に含む、請求項２８から３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより前記安定化生体細胞を溶解させることを更に含む、請求項２８から３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記溶解された安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記溶解された安定化生体細胞から放出された前記安定化核酸集団の前記少なくとも一部分からデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)の少なくとも１つを分析することを更に含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記生体細胞が哺乳動物細胞である、請求項１８から３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記生体細胞が免疫細胞である、請求項１８から３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が、ＣＤＫ９阻害剤、オーレスライシン、チオルチン、アマニチン、又はトリプトリドである、請求項１８から４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記電子伝達鎖剤がアジ化ナトリウムである、請求項１８から４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記生体細胞と、第２のタンパク質翻訳阻害剤と、を接触させるステップをさらに含み、
前記第２のタンパク質翻訳阻害剤が、可逆タンパク質翻訳阻害剤であり、前記可逆タンパク質翻訳阻害剤が、リボソーム上でのアクセプター部位からドナー部位へのペプチジルＲＮＡの移動をブロックする薬剤である、
請求項１８から４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記生体細胞と、第２のタンパク質翻訳阻害剤と、を接触させるステップをさらに含み、
前記第２のタンパク質翻訳阻害剤が、ジアゾオキシド、グルタルイミド抗生物質、シクロヘキシミド、及び／又はトコンアルカロイドである、
請求項１８から４３のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の規定により２０１６年３月３１日出願の米国仮特許出願第６２／３１６，５１４号（その開示はその全体が参照により本明細書に援用される）に基づく利益を主張する非仮出願である。

【背景技術】

【0002】

背景
バイオサイエンス及び関連分野では、分析のために生体細胞から核酸集団を分離する前に、数時間から一晩更には数日間に及ぶ期間にわたり生体細胞を貯蔵することが有用なことがある。分析される核酸集団又は少なくともその一部分は、貯蔵前の細胞状態を代表するものであることが望ましい。貯蔵に起因する核酸発現の変化は、最小限に抑えることが好ましい。本開示の幾つかの実施形態は、後で分離すべく生体細胞内の核酸を安定化させるための、有利には、貯蔵の介在が原因で核酸発現が変化する頻度を低減するための、試薬及びプロセスを含む。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

概要
生体細胞内の核酸を安定化させるためのキットが本明細書に記載されており、キットは、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び電子伝達鎖デカップリング剤から選択される少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含む。

【0004】

他の態様では、生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップを含む、生体細胞の核酸を安定化させるための方法が記載されている。ただし、接触は、核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、生体細胞は、安定化生体細胞に変換される。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、本明細書に記載の任意の核酸安定化試薬であり得る核酸安定化試薬の成分であり得る。種々の実施形態では、本方法は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のそれぞれの存在下で本明細書に記載の任意の期間にわたり安定化生体細胞を貯蔵することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、貯蔵ステップは２０℃未満の温度で行い得る。種々の実施形態では、貯蔵ステップは０℃～約４℃の温度で行い得る。

【0005】

他の態様では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に生体細胞を配置するステップであって、エンクロージャがフロー領域と少なくとも１つのチャンバとを含み、少なくとも１つのチャンバがフロー領域に流体接続され、フロー領域及び少なくとも１つのチャンバが流体培地を閉じ込めるように構成される、ステップと、生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップであって、接触が、生体細胞の核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、生体細胞が安定化生体細胞に変換される、ステップと、を含む、エンクロージャを有するマイクロ流体デバイス内に位置する生体細胞の核酸を安定化させるための方法が記載されている。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、本明細書に記載の任意の核酸安定化試薬であり得る核酸安定化試薬の成分であり得る。少なくとも１つのチャンバは隔離ペンであり得る。フロー領域はマイクロ流体チャネルであり得る。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1A】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの例を例示する。

【図1B】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。

【図1C】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。

【図2A】本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。

【図2B】本開示の幾つかの実施形態による分離ペンを例示する。

【図2C】本開示の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを例示する。

【図2D】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。

【図2E】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。

【図2F】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを例示する。

【図2G】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスを例示する。

【図2H】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスの被覆表面を例示する。

【図3A】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器で用いられるシステムの具体例を例示する。

【図3B】本開示の幾つかの実施形態による撮像デバイスを例示する。

【図4】実施例１の５つの貯蔵準備方法の各レプリケートから回収されたＲＮＡ及びＤＮＡの量のグラフ図である。

【図5A】実施例１で溶解対照として処理された細胞（ＬＣ）から回収されたｃＤＮＡのサイズ分布のグラフ図である。

【図5B】実施例１で本開示の安定化試薬の実施形態を用いて処理された細胞（Ｉｎ）から回収されたｃＤＮＡのサイズ分布のグラフ図である。

【図5C】実施例１で本開示の安定化試薬の実施形態を用いて処理されなかった細胞（ＮＡ）から回収されたｃＤＮＡのサイズ分布のグラフ図である。

【図6】実施例１で溶解対照サンプルの細胞（ＬＣ）と比較した安定化試薬を用いて処理された細胞（Ｉｎ）の差次的発現（ＤＥ）の表図である。

【図7】実施例１で安定化試薬を用いずに４℃で貯蔵された細胞（ＮＡ）と比較した－８０℃で貯蔵された溶解対照細胞（ＬＣ）の差次的発現（ＤＥ）の表図である。

【図8】－８０℃で貯蔵された溶解対照細胞（ＬＣ）と比較した実施例１の安定化試薬の後続添加によるＰＢＳ洗浄及び４℃貯蔵の細胞（ＷＩｎ）の差次的発現（ＤＥ）の表図である。

【図9】実施例１の－８０℃で貯蔵された溶解対照サンプルの細胞（ＬＣ）と比較した４℃で貯蔵された無添加ＰＢＳ洗浄の細胞（Ｗ）の差次的発現（ＤＥ）の表図である。

【発明を実施するための形態】

【0007】

例示的な実施形態の詳細な説明
本明細書には、本開示の例示的な実施形態及び適用が記載されている。しかし、本開示は、これらの例示的な実施形態及び適用にも、例示的な実施形態及び適用を行う方式やそれについての本明細書に記載の方式にも、限定されるものではない。更に、図は、簡略図又は部分図を示し得ると共に、図中の要素の寸法は、誇張されたりさもなければ比例していなかったりし得る。そのほか、「～上」、「～に付着される」、「～に接続される」、「～に結合される」という用語又は類似語が本明細書で使用される場合、一方の要素が直接他方の要素上にあるか、それに付着されるか、それに接続されるか、若しくはそれに結合されるか、又は一方の要素と他方の要素との間に１つ以上の介在要素があるかにかかわらず、一方の要素（例えば、材料、層、基板等）は、他方の要素「上」にあるか、それ「に付着される」か、それ「に接続される」か、又はそれ「に結合される」。そのほか、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が参照された場合、かかる参照は、列挙された要素のいずれか１つだけ、列挙された要素の全てに満たない任意の組合せ、及び／又は列挙された要素の全ての組合せを含むことが意図される。

【0008】

本明細書でのセクション分割は、概説を容易にすることのみを目的としたものであり、考察される要素のいずれの組合せにも限定されるものではない。

【0009】

本明細書で使用される場合、「実質的に」とは、意図された目的で機能するのに十分であることを意味する。そのため、「実質的に」という用語は、当業者により予想されるような、ただし、全体性能にそれほど影響を及ぼさない、絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からのわずかな有意でない変動を許容する。数値又は数値として表現可能なパラメータ若しくは特性に対して用いられる場合、「実質的に」とは１０パーセント以内を意味する。

【0010】

本明細書で使用される場合、「ones（もの）」という用語は２つ以上を意味する。本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上であり得る。

【0011】

本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置決めされる」を包含する。

【0012】

本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」とは、流体を保持するように構成された１つ以上の離散マイクロ流体回路（各マイクロ流体回路は、限定されるものではないが、領域、流路、チャネル、チャンバ、及び／又はペンをはじめとする相互接続回路要素を含む）と、マイクロ流体デバイスに対して流体（及び任意選択的に流体中に懸濁された微小物体）の流入及び／又は流出を可能にするように構成された少なくとも２つのポートとを含むデバイスのことである。典型的には、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルと少なくとも１つのチャンバとを含み、約１ｍＬ未満、例えば、約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満、又は約２μＬ未満の体積の流体を保持するであろう。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１～２μＬ、約１～３μＬ、約１～４μＬ、約１～５μＬ、約２～５μＬ、約２～８μＬ、約２～１０μＬ、約２～１２μＬ、約２～１５μＬ、約２～２０μＬ、約５～２０μＬ、約５～３０μＬ、約５～４０μＬ、約５～５０μＬ、約１０～５０μＬ、約１０～７５μＬ、約１０～１００μＬ、約２０～１００μＬ、約２０～１５０μＬ、約２０～２００μＬ、約５０～２００μＬ、約５０～２５０μＬ、又は約５０～３００μＬを保持する。

【0013】

本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」とは、約１μＬ未満、例えば、約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ以下の体積の流体を保持するように構成された少なくとも１つの回路要素を含有するマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスのことである。典型的には、ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００個、又はそれ以上）を含むであろう。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００ｐＬ～１ｎＬ、約１００ｐＬ～２ｎＬ、約１００ｐＬ～５ｎＬ、約２５０ｐＬ～２ｎＬ、約２５０ｐＬ～５ｎＬ、約２５０ｐＬ～１０ｎＬ、約５００ｐＬ～５ｎＬ、約５００ｐＬ～１０ｎＬ、約５００ｐＬ～１５ｎＬ、約７５０ｐＬ～１０ｎＬ、約７５０ｐＬ～１５ｎＬ、約７５０ｐＬ～２０ｎＬ、約１～１０ｎＬ、約１～１５ｎＬ、約１～２０ｎＬ、約１～２５ｎＬ、又は約１～５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成され得る。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ以上（例えば、全て）は、約１００～２００ｎＬ、約１００～３００ｎＬ、約１００～４００ｎＬ、約１００～５００ｎＬ、約２００～３００ｎＬ、約２００～４００ｎＬ、約２００～５００ｎＬ、約２００～６００ｎＬ、約２００～７００ｎＬ、約２５０～４００ｎＬ、約２５０～５００ｎＬ、約２５０～６００ｎＬ、又は約２５０～７５０ｎＬの体積の流体を保持するように構成され得る。

【0014】

マイクロ流体デバイス又はナノ流体デバイスは、本明細書では、「マイクロ流体チップ」若しくは「チップ」又は「ナノ流体チップ」若しくは「チップ」として参照され得る。

【0015】

本明細書で使用される「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」とは、水平寸法及び垂直寸法の両寸法よりも有意に長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれかの長さの少なくとも５倍、例えば、その長さの少なくとも１０倍、その長さの少なくとも２５倍、その長さの少なくとも１００倍、その長さの少なくとも２００倍、その長さの少なくとも５００倍、その長さの少なくとも１，０００倍、その長さの少なくとも５，０００倍、又はそれ以上であり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、介在する任意の範囲を含めて約１００，０００ミクロン～約５００，０００ミクロンの範囲内である。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００ミクロン～約１０００ミクロン（例えば、約１５０～約５００ミクロン）の範囲内であり、且つ垂直寸法は、約２５ミクロン～約２００ミクロン、例えば、約４０～約１５０ミクロンの範囲内である。フローチャネルは、マイクロ流体デバイス内で多種多様な空間構成を有し得るので、完全に線状の要素に制限されないことに留意されたい。例えば、フローチャネルは、次の構成、すなわち、カーブ、ベンド、スパイラル、傾斜、下降、フォーク（例えば、複数の異なる流路）、及びそれらの任意の組合せを有する１つ以上のセクションであるか、又はそれらを含み得る。そのほか、フローチャネルは、その中に所望の流体フローを提供するように、その通路に沿って異なる断面積、拡幅、及び狭窄を有し得る。

【0016】

本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの２つの異なる領域間又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分な大きさのバンプ又は類似のタイプの構造物を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペン及びマイクロ流体チャネル、又はマイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。

【0017】

本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスの回路要素（又は２つの回路要素間のインターフェース）の幅の狭小化を指す。狭窄は、例えば、マイクロ流体隔離ペンとマイクロ流体チャネルとの間のインターフェース又はマイクロ流体隔離ペンの分離領域と接続領域との間のインターフェースに位置決めし得る。

【0018】

本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、透過の際に光を実質的に変化させることなく可視光を透過させる材料を指す。

【0019】

本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本開示に従って分離及び／又は操作し得る任意の微視的物体を意味する。限定されるものではないが微小物体の例としては、無生物微小物体、例えば、マイクロ粒子、マイクロビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）、磁気ビーズ、マイクロロッド、マイクロワイヤ、量子ドット等、生物学的微小物体、例えば、細胞、生物オルガネラ、ベシクル又は複合体、合成ベシクル、リポソーム（例えば、合成又は膜調製物由来）、脂質ナノラフト等、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞付着マイクロビーズ、リポソーム被覆マイクロビーズ、リポソーム被覆磁気ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、共有結合又は非共有結合された部分／分子、例えば、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、低分子シグナリング部分、又はアッセイで使用可能な他の化学的／生物学的種を含み得る。脂質ナノラフトは、例えば、Ritchie et al. (2009) “Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs,” Methods Enzymol., 464:211-231に記載されている。

【0020】

本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、「生体細胞」という用語と同義的に用いられる。限定されるものではないが生体細胞の例としては、真核細胞、植物細胞、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、爬虫動物細胞、トリ細胞、サカナ細胞等、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生動物細胞等、組織、例えば、筋肉、軟骨、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経の組織等から解離させた細胞、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等、胚（例えば、接合体）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞系細胞、癌細胞、感染細胞、トランスフェクト及び／又はトランスフォーム細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長動物等に由来し得る。

【0021】

コロニー中の複製可能な生細胞の全てが単一の親細胞に由来する娘細胞である場合、生体細胞のコロニーは「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニーの娘細胞は全て、１０回以下の分裂により単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの娘細胞は全て、１４回以下の分裂により単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの娘細胞は全て、１７回以下の分裂により単一の親細胞から派生される。他の実施形態では、クローンコロニーの娘細胞は全て、２０回以下の分裂により単一の親細胞から派生される。「クローン細胞」という用語は、同一のクローンコロニーの細胞を意味する。

【0022】

本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」とは、２細胞以上（例えば、約２～約２０、約４～約４０、約６～約６０、約８～約８０、約１０～約１００、約２０～約２００、約４０～約４００、約６０～約６００、約８０～約８００、約１００～約１０００細胞、又は１０００細胞超）を意味する。

【0023】

本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞の生存及び／又は増殖を続けるのに必要な条件を提供する、流体及び気体の両成分と任意選択的に表面とを含む環境を提供することを意味する。

【0024】

本明細書で使用される場合、細胞を参照するときの「増殖させる」という用語は、細胞数が増加することを意味する。

【0025】

流体培地の「成分」は、溶媒分子、イオン、低分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝物等をはじめとする培地中に存在する任意の化学分子又は生化学分子である。

【0026】

本明細書で使用される場合、「捕捉部分」とは、微小物体に対する認識部位を提供する化学的若しくは生物学的種、官能基、又はモチーフである。所定のクラスの微小物体は、ｉｎ ｓｉｔｕで生成された捕捉部分を認識し得ると共に、ｉｎ ｓｉｔｕで生成された捕捉部分に結合し得るか又はそれに対して親和性を有し得る。限定されるものではないが例としては、抗原、抗体、及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。

【0027】

本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」とは、流体培地（例えば、プレポリマー溶液）に溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーのことである。流動性ポリマーは、マイクロ流体フロー領域に進入し得ると共に、その中の流体培地の他の成分と共に流動し得る。

【0028】

本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」とは、光に暴露されると、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化、又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能であり、それによりポリマーネットワークを形成するポリマー（又はポリマーを生成するために使用可能なモノマー分子）を意味する。幾つかの場合には、光開始ポリマーは、共有結合による架橋、特異的共有結合の形成、剛性化化学モチーフの周りの位置化学の変化、又は物理的状態の変化を引き起こすイオン対の形成が可能な１つ以上の化学部分に結合されたポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合には、光開始ポリマーは、ポリマーネットワークの形成を開始（例えば、ポリマーの重合により）するために光活性ラジカル開始剤を必要とし得る。

【0029】

本明細書で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン（Ｉｇ）を意味し、これは、霊長動物化（例えば、ヒト化）、ネズミ、マウス－ヒト、マウス－霊長動物、及びキメラのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含み、且つインタクト分子、そのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、ファブ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ）’２フラグメント）、又はインタクト分子及び／若しくはフラグメントのマルチマー若しくはアグリゲートであり得ると共に、天然に存在し得るか、又は免疫化、合成、遺伝子工学等により生成し得る。「抗体フラグメント」とは、本明細書で使用される場合、抗原に結合する、且つ幾つかの実施形態では、ガラクトース残基の導入等により、クリアランス及び取込みを促進する構造特徴部を呈するように誘導体化し得る、抗体に由来する又は関連するフラグメントを意味する。これは、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）、及びそれらの組合せを含む。

【0030】

流体培地を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」又は「拡散」とは、流体培地の成分が濃度勾配の下方に熱力学的に移動することを指す。

【0031】

「培地のフロー」という語句は、拡散以外の任意の機構に主に起因する流体培地のバルク移動を意味する。例えば、培地のフローは、点間の圧力差に起因する一方の点から他方の点への流体培地の移動を含み得る。かかるフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期フロー、ランダムフロー、間欠フロー、若しくは往復フロー、又はそれらの任意の組合せを含み得る。一方の流体培地が他方の流体培地に流入する場合、培地の乱流及び混合を生じ得る。

【0032】

「実質的にノーフロー」という語句は、時間平均で流体培地中への又は流体培地中での材料の成分（例えば、対象のアナライト）の拡散速度未満の流体培地の流速を指す。かかる材料の成分の拡散速度は、例えば、温度、成分のサイズ、及び成分と流体培地との間の相互作用の強度に依存し得る。

【0033】

マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体接続される」という語句は、異なる領域が流体培地等の流体で実質的に充填されたときに各領域内の流体が単一体の流体を形成するように接続されることを意味する。このことは、異なる領域内の流体（又は流体培地）が必ずしも同一の組成であることを意味するものではない。より正確には、マイクロ流体デバイスの異なる流体接続領域内の流体は、溶質がそのそれぞれの濃度勾配の下方に移動するときに及び／又は流体がデバイスを貫流するときに流束内で異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン、他の分子等の溶質の濃度が異なる）を有し得る。

【0034】

本明細書で使用される場合、「流路」とは、培地のフローの軌道を規定する且つその対象となる１つ以上の流体接続回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を意味する。そのため、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路の培地のフローの対象とならない流路を含む回路要素に流体接続し得る。

【0035】

本明細書で使用される場合、「微小物体を分離する」とは、マイクロ流体デバイス内の規定領域に微小物体を閉じ込めることである。

【0036】

マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域と「非掃引」領域とを含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに培地のフローにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル、及びチャンバの全部又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を貫流するときに実質的に流体のノーフラックスにそれぞれ遭遇するマイクロ流体回路の１つ以上の流体相互接続回路要素を含む。拡散を可能とするが掃引領域と非掃引領域との間で培地が実質的にノーフローとなるように流体接続が構造化される限り、非掃引領域は掃引領域に流体接続可能である。そのため、マイクロ流体デバイスは、掃引領域と非掃引領域との間で実質的に拡散流体連通のみを可能にしつつ掃引領域内の培地のフローから非掃引領域を実質的に分離するように構造化可能である。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは掃引領域の例であり、一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下に更に詳細に記載される）は非掃引領域の例である。

【0037】

特定の生体物質（例えば、抗体等のタンパク質）を産生する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力は、かかるマイクロ流体デバイスでアッセイ可能である。アッセイの具体的な実施形態では、対象のアナライトを産生するためにアッセイされる生物学的微小物体（例えば、細胞）を含むサンプル材料は、マイクロ流体デバイスの掃引領域に装填可能である。生物学的微小物体（例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞）のうち特定の特徴のものを選択して非掃引領域に配置することが可能である。次いで、残留サンプル材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることが可能である。選択された生物学的微小物体は非掃引領域内にあるので、選択された生物学的微小物体は、残留サンプル材料の流出やアッセイ材料の流入の影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象のアナライトの産生を可能にし得る。この場合、対象のアナライトは、非掃引領域から掃引領域内に拡散可能であり、掃引領域では、対象のアナライトは、アッセイ材料と反応して局在化された検出可能な反応を引き起こすことが可能であり、各反応は、特定の非掃引領域に関連付け可能である。検出された反応に関連付けられる任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域内のどの生物学的微小物体（もしあれば）が対象のアナライトの十分なプロデューサーであるかを決定することが可能である。

【0038】

本明細書で参照される場合、「安定化生体細胞」とは、典型的な培養条件又はｉｎ－ｖｉｖｏ条件とは異なる条件下で維持された生体細胞のことである。ただし、かかる条件（すなわち「維持条件」）は、核酸集団又はトランスクリプトームが典型的な培養条件下又はｉｎ－ｖｉｖｏ条件下の細胞の核酸集団又はトランスクリプトームと実質的に同一になるように細胞の核酸又はトランスクリプトームを安定化させる。維持条件は、低下温度での貯蔵を含めて安定化生体細胞の貯蔵の助けとなる条件を含み得る。特定の実施形態では、安定化生体細胞の安定化トランスクリプトームは、典型的な培養条件下又はｉｎ－ｖｉｖｏ条件下で成長する対応する細胞（すなわち、同一のタイプ及び／又は起源のもの）のトランスクリプトームと実質的に同一である。

【0039】

本明細書で使用される場合、「可逆」阻害剤は、バイオ分子に非共有結合で結合してバイオ分子（例えば、タンパク質、核酸、リボザイム、複合体等）の活性を阻害することにより、結合状態でバイオ分子の活性を低減又は排除する。可逆阻害剤は、阻害されるバイオ分子に対して一群の特徴的な速度論的パラメータ（例えば、結合親和性、会合速度又は「オン速度」、及び解離速度又は「オフ速度」）を有する。したがって、特定のバイオ分子の異なる可逆阻害剤は、異なる結合親和性（会合速度及び／又は解離速度）を有し得る。かかる速度論的パラメータの差は、可逆阻害剤と標的バイオ分子との間の化学的相互作用の差、例えば、標的バイオ分子の異なる部分への結合との差を反映する。

【0040】

本明細書で参照される場合、「不可逆」阻害剤は、バイオ分子への共有結合を形成するか、又は任意の適正な実験期間内にわたり阻害剤がバイオ分子から解離しないようにつまり本質的に不可逆的にバイオ分子への高い結合親和性を有するか、のいずれかにより、バイオ分子の活性を阻害する。

【0041】

本明細書で参照される場合、「細胞膜透過性」とは、効果的に細胞内活性にするに十分な量で細胞膜を通って受動拡散する分子の能力を意味する。これは、分子のイオン性（荷電）、極性、及びサイズ（モル質量）の関数である。より小さなより脂溶性の分子は、より大きな荷電分子よりも透過性であり得る。

【0042】

本明細書で参照される場合、「マスターミックス」とは、プレ混合された即使用可能な試薬の組合せのことである。安定化試薬のマスターミックスは、試薬（例えば、タンパク質翻訳阻害剤、核酸転写阻害剤、及び任意選択的プロテアーゼ阻害剤）の全ての成分を有し得る。マスターミックスは、安定化反応内で実際に使用される濃度の約１倍～約１０００倍（例えば、２倍、５倍、１０倍、２０倍、１００倍又は１０００倍）の任意の濃度の成分を有し得る。幾つかの他の実施形態では、マスターミックスは、完全試薬に必要とされる成分の幾つか（例えば、２、３等）を有し得る。この場合、残りの成分は、使用直前に添加し得る。

【0043】

核酸安定化試薬及びその使用方法。
数時間から数日間に及ぶ期間にわたり細胞を貯蔵した後に生体細胞から核酸集団を分離することが望ましいことがある。貯蔵時、典型的には低下温度での貯蔵時、生体細胞の核酸のサブセットは、細胞が貯蔵条件又は貯蔵用細胞の準備に使用した作用剤との接触に晒された結果として損傷、過少産生（例えば、比率の低減）、又は過剰産生を生じるおそれがある。幾つかの実施形態では、シーケンシング又はハイブリダイゼーションの実験による核酸の検出は、回収された核酸が貯蔵前に細胞に存在していた核酸のタイプ及び集団内頻度を代表する場合にのみ生体細胞の状態に関する有意な情報をもたらし得る。貯蔵用細胞を調製するために現在利用可能な処理は、通常、タンパク質、核酸等を架橋することを含むが、「固定」細胞の架橋された材料塊（例えば、架橋試薬で処理されたもの）内からの所望の核酸の回収が損なわれて材料の量の低減を招く可能性があるので、架橋を用いることなく貯蔵用細胞を安定化できることが改善点である。このことは単一細胞から核酸を回収するときに特に問題となる。

【0044】

本明細書には、生体細胞を貯蔵に付す前に生体細胞に存在する核酸を安定化させるための組成物、方法、及びキットが記載されている。安定化させることは、生体細胞がその規範的条件下で産生していたものと比べて異なる核酸又は変化した量の同一の核酸の産生をもたらす可能性のある細胞プロセスを停止させることを含む。温度変化又は保存剤への暴露は、物理的変化（例えば、水性成分の結晶化）、化学的変化、又は生物学的変化の誘導、例えば、ストレス経路又は細胞死経路の誘導を招くおそれがある。そのため、生体細胞から回収されたこうした外因的誘導核酸を検出しても、貯蔵前の細胞状態の真の理解ができないおそれがある。

【0045】

驚くべきことに、細胞内の核酸の産生及び／又は機能を停止させるように設計された作用剤の混合物を含有する安定化試薬は、その産生のパターン及びレベルを貯蔵条件／安定化試薬への暴露前に観測されたレベルに実質的に類似したレベルに維持することにより、貯蔵時に（及び貯蔵後の分離のために）核酸を安定化させ得ることを、出願人は発見した。

【0046】

幾つかの実施形態では、安定化試薬は、貯蔵及びその後のＤＮＡ分離のためにデオキシ核酸を安定化させるべく使用し得る。他の実施形態では、安定化試薬は、貯蔵及びその後の分離のためにリボ核酸（ＲＮＡ）を安定化させ得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬は、貯蔵及びその後の分離のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を安定化させ得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬は、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の両方を安定化させ得る。

【0047】

安定化試薬。
幾つかの実施形態では、安定化試薬は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含む。電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖阻害剤であり得るか又は電子伝達デカップリング剤であり得るかのいずれかである。幾つかの実施形態では、安定化試薬は、第１の不可逆タンパク質翻訳阻害剤とは異なる第２のタンパク質翻訳阻害剤を含み得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、可逆阻害剤であり得る及び／又は不可逆タンパク質翻訳阻害剤と比較して速効性であり得る。

【0048】

不可逆タンパク質翻訳阻害剤。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、安定化試薬の成分であり得る。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、新しいタンパク質の合成を実質的に防止し得る。不可逆性は、試薬導入の時点で、及びいずれも暴露に反応してタンパク質合成の変化を引き起こすおそれのいかなる他の貯蔵条件又は試薬への暴露前にも、タンパク質合成を停止させることが望ましい。不可逆阻害剤は、速効性（例えば、約１０分～約３０分の時間内で効力を示す）又は遅効性（１時間以上経って効力を示す）のいずれかであり得る。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は細胞膜透過性であり得る。例えば、より容易に細胞内に拡散してタンパク質翻訳を阻害するのに十分な量で細胞内に進入するように、脂質相への溶解性を有する。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、アミノグリコシド抗生物質（限定されるものではないがアミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、及びトブラマイシンを含む）、Ｄ－ガラクトサミン、及び／又はエメチン（CAS No. 483-18-1）から選択し得る。幾つかの実施形態では、不可逆タンパク質翻訳阻害剤はエメチンであり得る。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、リボソームに結合すると共にリボソームストーリングを引き起こしてタンパク質合成を停止させることにより、タンパク質翻訳を阻害し得る。限定されるものではないが一例では、エメチンは、真核生物（限定されるものではないが哺乳動物又はヒトを含む）リボソームの４０Ｓサブユニットに不可逆的に結合してリボソームストーリングを開始させる。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、不可逆タンパク質翻訳阻害剤が約１．０マイクロモル～約１００ミリモル、約１．０マイクロモル～約５０ミリモル、約１．０マイクロモル～約５ミリモル、約５マイクロモル～約１５ミリモル、約５マイクロモル～約１０ミリモル、約０．１ミリモル～約５ミリモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在する溶液を添加することにより生体細胞に接触させ得る。

【0049】

第２のタンパク質翻訳阻害剤。
第２のタンパク質翻訳阻害剤は、安定化試薬の成分であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、安定化試薬の第１のタンパク質翻訳阻害剤とは異なる。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、不可逆タンパク質翻訳阻害剤又は可逆タンパク質翻訳阻害剤であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は細胞膜透過性であり得る。例えば、細胞膜を通ってタンパク質翻訳を阻害するのに十分な量で細胞に進入できるように十分な脂溶性であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、安定化試薬の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と同一の機構又は異なる機構により新たなタンパク質合成を停止させるように作用し得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は速効性であり得る。速効性とは、その適用により生体細胞への添加の３０分以内に阻害剤がタンパク質合成を実質的に停止させることを意味する（タンパク質合成を実質的に停止させるとは、タンパク質合成の少なくとも９０％を停止させることを意味する）。そのため、幾つかの実施形態では、速効性タンパク質翻訳阻害剤は、約１分、２分、３分、５分、又は約１０分～約３０分の時間内でタンパク質合成を実質的に停止させ得る。幾つかの実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤は、ジアゾオキシド、グルタルイミド抗生物質、及び／又はトコンアルカロイドから選択し得る。グルタルイミド抗生物質は、限定されるものではないがシクロヘキシミド、アセトキシシクロヘキシミド、ストレプチミドン、ストレプトビタシン、イナクトン、エピデルスタチン、アセチケタール、及びドリゴシンを含み得る。幾つかの実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤はシクロヘキシミド（CAS No. 66-81-9）であり得る。シクロヘキシミドは可逆阻害剤であり、６０Ｓリボソームユニットに結合してリボソーム上でのアクセプター（アミノアシル）部位からドナー（ペプチジル）部位へのペプチジルＲＮＡの移動をブロックすることにより、翻訳伸長を阻害することが可能である。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、第２のタンパク質翻訳阻害剤が約１．０マイクロモル～約１００ミリモル、約１．０マイクロモル～約５０ミリモル、約１．０マイクロモル～約５ミリモル、約５マイクロモル～約１５ミリモル、約５マイクロモル～約１０ミリモル、約０．１ミリモル～約５ミリモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在する溶液を添加することにより生体細胞に接触させ得る。

【0050】

リボ核酸転写阻害剤。
少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤は、安定化試薬の成分であり得る。リボ核酸転写阻害剤は、不可逆リボ核酸転写阻害剤又は可逆リボ核酸転写阻害剤であり得る。可逆リボ核酸転写阻害剤は、限定されるものではないがＣＤＫ９阻害剤（例えば、５，６－ジクロロ－１－β－Ｄ－リボフラノシルベンゾイミダゾール（ＤＲＢ））及びフラボルピリドールを含み得る。不可逆リボ核酸転写阻害剤は、限定されるものではないがオーレオスライシン、チオルチン、アミニチン、又はトリプトリドを含み得る。他の実施形態では、不可逆リボ核酸転写阻害剤はアクチノマイシンであり得る。種々の実施形態では、リボ核酸転写阻害剤はトリプトリド（CAS no. 38748-32-2）であり得る。リボ核酸転写阻害剤は細胞膜透過性であり得ると共に、リボ核酸転写を阻害するのに十分な量で細胞に進入し得る。リボ核酸転写阻害剤は、速効性であり得るか（例えば、約１分、２分、３分、５分、１０分～約３０分の時間内で効力を示す）又は遅効性であり得るか（１時間以上経って効力を示す）のいずれかである。幾つかの実施形態では、リボ核酸転写阻害剤は速効性であり得る。リボ核酸転写阻害剤は、リボ核酸転写阻害剤が約１０ナノモル～約５０ミリモル、約０．０１マイクロモル～約５０ミリモル、約０．１マイクロモル～約５００マイクロモル、約０．１マイクロモル～約５０マイクロモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在する溶液を添加することにより生体細胞に接触させ得る。

【0051】

電子伝達鎖剤。
少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、安定化試薬の成分であり得る。電子伝達鎖剤は、細胞膜透過性であり得ると共に、電子伝達鎖を撹乱するのに十分な量で細胞に進入し得る。電子伝達鎖剤は、速効性であり得るか（例えば、約１分、２分、３分、５分、１０分～約３０分の時間内で効力を示す）又は遅効性であり得るか（１時間以上経って効力を示す）のいずれかである。幾つかの実施形態では、電子伝達鎖剤は速効性であり得る。電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖に対して可逆活性又は不可逆活性を有し得る。電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖阻害剤であり得ると共に、その例としては、限定されるものではないがロテノン、アンチマイシンＡ１、２－テノイルトリフルオロアセトン、カルボキシン、シアニド、アジ化ナトリウム、及びオリゴマイシンが挙げられる。代替的に、電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖デカップリング剤であり得ると共に、その例としては、限定されるものではないが２，４ジニトロフェノール、ジクマロール、及びカルボニルシアニド４－（トリフルオロメトキシ）－フェニルヒドラゾンが挙げられる。電子伝達デカップリング剤は、脂質溶解性がその一般的特徴であるので電子伝達鎖剤として選択し得る。幾つかの実施形態では、電子伝達鎖剤はアジ化ナトリウムであり得る。電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖剤が約０．１マイクロモル～約１００ミリモル、約１０マイクロモル～約５０ミリモル、約０．３ミリモル～約２５ミリモル、約０．３ミリモル～約１５ミリモル、約０．５ミリモル～約１０ミリモル、約１ミリモル～約５ミリモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在する溶液を添加することにより生体細胞に接触させ得る。

【0052】

安定化試薬は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を単一溶液内に提供し得るか、又は少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、の全部に満たない部分を単一溶液内に有し得る。安定化試薬の個別成分は、それぞれ、個別溶液として提供し得る。安定化試薬の個別成分は、生体細胞に逐次的に又は同時に接触させ得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬の成分は、生体細胞に同時に接触される。例えば、同一溶液中に存在させて同時に添加される。他の実施形態では、成分は、最初にリボ核酸転写阻害剤、続いて安定化試薬の他方の成分を添加することにより、逐次的に添加し得る。

【0053】

安定化試薬の他の成分。
幾つかの実施形態では、安定化試薬は、RNase阻害剤を含まないものであり得る。タンパク質翻訳阻害剤と、リボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖剤との組合せは、細胞内プロセスを十分に停止させることにより、RNase阻害剤の添加を必要とすることなく核酸を安定化させ得る。

【0054】

RNase阻害剤。
他の実施形態では、安定化試薬は、１種以上のRNase阻害剤を含み得る。任意の好適なRNase阻害剤を含み得ると共に、限定されるものではないが、リボヌクレアーゼ阻害剤タンパク質（例えば、４９ｋＤＡロイシン・システインリッチタンパク質、そのオルソログ若しくはホモログ）、又は次の市販の試薬、すなわち、Rnasin（登録商標）リボヌクレアーゼ阻害剤（Promega）、Rnasin（登録商標）Plusリボヌクレアーゼ阻害剤（Promega）、SUPERase（商標）RNase阻害剤（ThermoFisher Scientific）、RNaseOUT（商標）組換えリボヌクレアーゼ阻害剤（ThermoFisher Scientific）、ＡNTI-RNase（ThermoFisher Scientific）、RNAsecure（商標）試薬（ThermoFisher Scientific）のうちのいずれかの試薬の活性な成分若しくは作用剤を含み得る。

【0055】

プロテアーゼ阻害剤。
種々の実施形態では、生体細胞の核酸を安定化させるための安定化試薬は、プロテアーゼ阻害剤を更に含み得る。プロテアーゼ阻害剤は、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、又はメタロプロテアーゼ阻害剤であり得る。他の実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、トレオニンプロテアーゼ阻害剤又はグルタミン酸プロテアーゼ阻害剤であり得る。

【0056】

セリンプロテアーゼ阻害剤。
セリンプロテアーゼ阻害剤は、可逆阻害剤又は不可逆阻害剤であり得る。セリンプロテアーゼ阻害剤は細胞膜透過性であり得る（例えば、細胞膜を通って拡散してセリンプロテアーゼを阻害するのに十分な量で細胞に進入し得る）。セリンプロテアーゼ阻害剤は、限定されるものではないがフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、３，４，ジクロロイソクマリン、ジイソプロピルフルオロホスフェート、Ｎ－ｐ－トシル－Ｌ－リシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）、及びＮ－ｐ－トシル－Ｌ－フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）を含む。

【0057】

システインプロテアーゼ阻害剤。
システインプロテアーゼ阻害剤は、可逆阻害剤又は不可逆阻害剤であり得ると共に更に細胞膜透過性であり得る（例えば、細胞膜を通って拡散してシステインプロテアーゼを阻害するのに十分な量で細胞に進入し得る）。システインプロテアーゼ阻害剤は、カスパーゼプロテアーゼの阻害剤又はカテプシンシステインプロテアーゼ阻害剤であり得る。システインプロテアーゼ阻害剤は、限定されるものではないがＥ－６４（Ｎ－（ｔｒａｎｓ－エポキシスクシニル）－Ｌ－ロイシン－４－グアニジノブチルアミド、Selleck Chem）、Ｎ－ベンゾイルフェニルアラニンフルオロメチルケトン（Ｚ－ＦＡ－ＦＭＫ）、及びＮ－ベンゾイルバリニルアラニニルアスパラギン酸フルオロメチルケトン（Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ）のいずれかであり得る。

【0058】

メタロプロテアーゼ阻害剤。
メタロプロテアーゼ阻害剤は、可逆阻害剤又は不可逆阻害剤であり得る。メタロプロテアーゼ阻害剤は細胞膜透過性であり得る（例えば、細胞膜を通って拡散してメタロプロテアーゼを阻害するのに十分な量で細胞に進入し得る）。好適なメタロプロテアーゼ阻害剤の例は、限定されるものではないがホスホラミドン、ベスタチン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、マリミスタット、バチマスタット、亜鉛メタクリレート、及びＭＭＰ阻害剤ＩＩＩ（CAS No. 927827-98-3、Ｎ’－ヒドロキシ－Ｎ－（１－メチルカルバモイル）－３－フェニル－プロピル）－２－（２－メチルプロピル）ブタンジアミドを含み得る。

【0059】

安定化試薬用の緩衝液及び培地。
安定化試薬は、安定化試薬の成分を可溶化するために水性溶媒及び／又は非水性溶媒を含み得る。これらの溶媒は、阻害剤とエネルギー伝達鎖剤との組合せの長期貯蔵を可能にするように選択し得る。有用な溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、水、エチルアルコール等を含み得る。非水性溶媒を使用する場合、緩衝液は必要でないこともある。水性溶液の緩衝化は、安定化試薬の成分の劣化の防止及び安定化反応自体に好適なｐＨ範囲の提供の両方を行うように構成されるであろう。－２０℃等の低下温度での貯蔵が望ましい場合、凍結防止添加剤又は溶媒、例えば、限定されるものではないがグリセロール若しくはＤＭＳＯが安定化試薬に含まれ得る。

【0060】

核酸を安定化させる方法。
組織サンプル、細針吸引物サンプル、洗浄液サンプル等の生物学的サンプルから細胞を分離する場合、更なる分析のために核酸を抽出するステップを行う前に、便宜上又は他の理由で、サンプルからの細胞を部分的に処理してから細胞を貯蔵することが望ましいことがある。貯蔵前（及び貯蔵時）に生体細胞内の核酸を安定化させる方法が提供される。貯蔵後に生体細胞の核酸又はその集団を細胞から分離し得る。種々の実施形態では、貯蔵後の分離のために安定化される核酸はデオキシ核酸（ＤＮＡ）であり得る。他の実施形態では、貯蔵後の分離のために安定化される核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。幾つかの実施形態では、貯蔵後の分離のために安定化されるＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。ｍＲＮＡは、生体細胞のトランスクリプトームを分析するために安定化細胞の安定化核酸から分離し得る。生体細胞のトランスクリプトームの分析は、生体細胞により示差的に発現される遺伝子を同定するために使用し得る。差次的発現は、比較可能な「健常」細胞の発現レベル又は異なる細胞型の発現レベルとの比較によるものであり得る。生体細胞のトランスクリプトームは、好ましくは、安定化及び貯蔵のプロセス時に実質的に撹乱されることはないので、生体細胞内のＲＮＡオペラントの量及び同一性の検査を可能にする。

【0061】

したがって、生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップを含む、生体細胞内の核酸集団を安定化させる方法が提供される。ただし、接触は、核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、生体細胞は、安定化生体細胞に変換される。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、生体細胞の核酸の産生及び分解の細胞内機構の異なる部分を標的とする２種以上の阻害剤又はデカップリング剤を含む核酸安定化試薬として提供される。安定化生体細胞の核酸は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を少なくとも含む安定化試薬で処理することにより安定化される。電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖阻害剤であり得る及び／又は電子伝達デカップリング剤であり得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬は、第１の不可逆タンパク質翻訳阻害剤とは異なる第２のタンパク質翻訳阻害剤を更に含み得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は可逆阻害剤であり得る。不可逆タンパク質翻訳阻害剤、リボ核酸転写阻害剤、電子伝達鎖剤、及び任意選択的に第２のタンパク質翻訳阻害剤は、本明細書に記載の任意の好適な阻害剤又は電子伝達鎖剤であり得ると共に、独立して任意の組合せで選択し得る。安定化試薬は、独立して及び任意の組合せで選択される本明細書に記載の追加の成分（例えば、プロテアーゼ阻害剤、RNase阻害剤、緩衝液等）のいずれかを含有し得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬はRNase阻害剤を含有しない。

【0062】

生体細胞は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を少なくとも含む安定化試薬に接触される。接触は、生体細胞の入った容器（例えば、チューブ、ウェル、チャンバ、インキュベーションチャンバ）に安定化試薬（例えばマスターミックス）の成分の一部又は全部の作製済み溶液を添加することにより行い得る。他の実施形態では、生体細胞との接触は、安定化反応の開始時にそれぞれ全てに満たない成分を含む複数の溶液（例えば、幾つかの成分は、個別にピペッティングされて異なる溶液で存在する）を添加することにより行い得る。したがって、幾つかの実施形態では、生体細胞と安定化試薬の各成分との接触は同時に行い得る。他の実施形態では、生体細胞の接触は、安定化試薬の成分のサブセットを用いて逐次的に行い得る。作製済み溶液の成分の濃度は、安定化反応自体に必要とされる最終濃度の約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又は約１０００倍であり得る。

【0063】

本明細書に記載の方法のいずれでも、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、約１．０マイクロモル～約１００ミリモル、約１．０マイクロモル～約５０ミリモル、約１．０マイクロモル～約５ミリモル、約５マイクロモル～約１５ミリモル、約５マイクロモル～約１０ミリモル、約０．１ミリモル～約５ミリモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在し得る。

【0064】

本明細書に記載の方法のいずれでも、リボ核酸転写阻害剤は、約１０ナノモル～約５０ミリモル、約０．０１マイクロモル～約５０ミリモル、約０．１マイクロモル～約５００マイクロモル、約０．１マイクロモル～約５０マイクロモルの範囲、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在し得る。

【0065】

本明細書に記載の方法のいずれでも、電子伝達鎖剤は、約０．１マイクロモル～約１００ミリモル、約１０マイクロモル～約５０ミリモル、約０．３ミリモル～約２５ミリモル、約０．３ミリモル～約１５ミリモル、約０．５ミリモル～約１０ミリモル、約１ミリモル～約５ミリモルの範囲、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在し得る。

【0066】

本明細書に記載の方法のいずれでも、第２のタンパク質翻訳阻害剤は、約１．０マイクロモル～約１００ミリモル、約１．０マイクロモル～約５０ミリモル、約１．０マイクロモル～約５ミリモル、約５マイクロモル～約１５ミリモル、約５マイクロモル～約１０ミリモル、約０．１ミリモル～約５ミリモルの範囲、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在し得る。

【0067】

生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤を少なくとも含む安定化試薬と、を接触させるステップは、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、又はそれ以上の時間にわたり行い得る。幾つかの実施形態では、接触時間は、５分間～約１時間、約５分間～４５分間、約５分間～３０分間、又は約５分間～約１５分間の範囲内であり得る。接触ステップは、約３８℃、３７℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、５℃、又は約０℃で行い得る。

【0068】

生体細胞と安定化試薬とを接触させた後、この時点で核酸集団は安定化され、生体細胞は安定化生体細胞に変換される。例えば、転写及び翻訳の細胞内プロセスが撹乱され得る。次いで、細胞は、任意の所望の期間にわたり、例えば、数時間から何日間かにわたり又は更により長期間にわたり貯蔵し得る。安定化細胞は、約２時間、５時間、８時間、１４時間、２０時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、何ヵ月間、又はそれらの間の任意の期間にわたり貯蔵し得る。幾つかの実施形態では、安定化細胞は、約２時間超且つ約１週間未満、約８時間超且つ約２週間未満、約８時間超且つ約１週間未満、又は約１４時間超且つ約５日間未満にわたり貯蔵し得る。幾つかの実施形態では、安定化細胞は、約１時間～約２４時間、約６時間～約１８時間、約１２時間～約２４時間、約１８時間～約３０時間、約２４時間～約３６時間、約３０時間～約４２時間、約３６時間～約４８時間、約４２時間～約５４時間、約４８～約６０時間、又はこれらの範囲のいずれかに含まれる任意の時間にわたり貯蔵し得る。安定化細胞は、典型的な室温例えば２０℃よりも低い温度で貯蔵することが望ましいことがある。幾つかの実施形態では、細胞は、約０℃～約１０℃（例えば、約０℃～約５℃又は約２℃～約５℃）の範囲内の温度で貯蔵し得る。他の実施形態では、細胞は、約－３０℃～約－２５℃、約－３０℃～約０℃、約－２５℃～約０℃、約－２５℃～約４℃の範囲内の温度、又はこれらの範囲内で選択された任意の温度で貯蔵し得る。

【0069】

核酸を安定化させる方法は、安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより安定化生体細胞を溶解させるステップを更に含み得る。溶解試薬は、ＤＮＡ集団又はＲＮＡ集団を分離するように構成し得る。ＤＮＡを分離するための溶解試薬は、全てのＤＮＡを分離したりゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を選択的に分離したりするように更に構成し得る。ＲＮＡを分離するための溶解試薬は、全てのＲＮＡを分離したり又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、若しくはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であり得るただ１つのタイプのＲＮＡを優先的には分離したりするように構成し得る。幾つかの実施形態では、安定化生体細胞は、安定化生体細胞を溶解試薬で処理する前に、生体細胞を取り囲む培地中の過剰の安定化試薬及び他の可溶性材料を除去するために培地又は水性洗浄溶液で洗浄し得る。幾つかの実施形態では、安定化生体細胞を溶解させるステップは、溶解生体細胞から所望の核酸を回収すべく溶解生体細胞を調製する追加の操作を更に含み得る。

【0070】

核酸を安定化させる方法は、溶解安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含み得る。分離は、沈殿、溶媒抽出、オリゴヌクレオチド捕捉リガンドを有するマトリックス若しくはビーズへの特異的捕捉、又は電荷捕捉マトリックスへのアフィニティー捕捉により行い得る。

【0071】

本方法は、溶解安定化生体細胞から分離された核酸集団の少なくとも一部分を分析すること更に含み得る。分離された核酸集団の全てのクラスを分析し得るか、又は核酸の所定のクラスのみを分析し得る。ｇＤＮＡ、ｍＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び／又はｔＲＮＡのいずれかを分析し得る。分析は、シーケンシング（例えば、電気泳動シーケンシング、合成シーケンシングを含み得る次世代シーケンシング、単分子シーケンシング、イオン半導体シーケンシング、パイロシーケンシング、ナノポアシーケンシング等）、ハイブリダイゼーション実験（限定されるものではないがｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ、ｑＰＣＲ、ｄＰＣＲ、TaqMan（登録商標）（ThermoFisher Scientific）、分子ビーコン、及び他の蛍光プローブ分析を含む）、フットプリンティング、アレイ捕捉、及びゲル電気泳動を含み得る。特定の一実施形態では、ｍＲＮＡは、シーケンシングでトランスクリプトーム分析を行うことにより分析される。トランスクリプトーム分析は、病的細胞状態の同定及び／又は病変に対処する選択肢の探究に有用であり得る生体細胞のグローバル遺伝子発現の変化を調べるのに有用であり得る。

【0072】

幾つかの実施形態では、これらの方法は、マイクロ流体環境内の生体細胞を操作することを含み得る。したがって、マイクロ流体デバイス内の生体細胞の核酸集団を安定化させるための方法が本明細書に提供される。マイクロ流体デバイスは、光学的に作動させ得る本明細書に記載のマイクロ流体デバイスのいずれか（例えば、いずれも以下に記載のＤＥＰ構成及び／又はエレクトロウェッティング構成を含み得るデバイス１００、２００、２４０、２９０）のような構成し得る。マイクロ流体デバイスは、エンクロージャ（ただし、エンクロージャは、流体培地を閉じ込めるように構成されたフロー領域を含む）と、流体培地を閉じ込めるように構成された少なくとも１つのチャンバ（ただし、チャンバは、前記フロー領域に流体接続される）と、を有し得る。生体細胞は、マイクロ流体デバイス内に配置し得ると共に、エンクロージャ内の少なくとも１つのチャンバ内に更に配置し得る。生体細胞は、誘電泳動力（ＤＥＰ）を用いてマイクロ流体デバイスに導入し得る。更に、生体細胞をマイクロ流体デバイスのエンクロージャ内の少なくとも１つのチャンバに導入する場合、チャンバ内に配置するステップは、ＤＥＰ力を用いて行い得る。細胞は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、に接触させ得る。ただし、接触は、核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われる。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含む安定化試薬は、生体細胞に接触させるステップで使用し得ると共に、本明細書に記載の安定化試薬の任意の実施形態であり得る。本方法は、マイクロ流体デバイス以外で生体細胞を安定化させる方法に関連して以上に記載したステップのいずれかを更に含み得る。

【0073】

幾つかの実施形態では、エンクロージャ内のチャンバは、分離領域と、分離領域とフロー領域（例えばマイクロ流体チャネル）とを流体接続する接続領域と、を有する隔離ペンであり得ると共に、分離領域及び接続領域は、隔離ペンのフロー領域と分離領域との間で実質的に拡散のみにより培地の成分が交換されるように構成される。幾つかの実施形態では、生体細胞は、マイクロ流体デバイスの隔離ペンの分離領域内に配置し得る。安定化試薬は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（チャネルであり得る）に流入し得ると共に、続いて、チャンバ内への拡散により（又はチャンバが隔離ペンである場合、隔離ペンの分離領域内への拡散により）生体細胞に接触し得る。

【0074】

生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る少なくとも１種の電子伝達鎖剤を少なくとも含む安定化試薬と、を接触させるステップは、約５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、又はそれ以上の時間にわたり行い得る。幾つかの実施形態では、接触時間は、５分間～約１時間、約５分間～４５分間、約５分間～３０分間、又は約５分間～約１５分間の範囲内であり得る。接触ステップは、約３８℃、３７℃、３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、１５℃、１０℃、５℃、又は約０℃で行い得る。

【0075】

本方法は、ある期間にわたり安定化生体細胞を貯蔵することを含み得る。細胞は、マイクロ流体デバイス内に貯蔵し得る。例えば、安定化細胞は、貯蔵時にチャンバ（又は隔離ペンの分離領域）から移動させない。そのため、マイクロ流体デバイス全体を貯蔵し得る。細胞は、約２時間、５時間、８時間、１４時間、２０時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、２週間、３週間、４週間、何ヵ月間、又はそれらの間の任意の期間にわたりマイクロ流体デバイス内に貯蔵し得る。幾つかの実施形態では、安定化細胞は、約１時間～約２４時間、約６時間～約１８時間、約１２時間～約２４時間、約１８時間～約３０時間、約２４時間～約３６時間、約３０時間～約４２時間、約３６時間～約４８時間、約４２時間～約５４時間、約４８～約６０時間、又はこれらの範囲のいずれかに含まれる任意の時間にわたり貯蔵し得る。安定化細胞は、典型的な室温例えば２０℃よりも低い温度でマイクロ流体デバイスに搭載して貯蔵することが望ましいことがある。幾つかの実施形態では、細胞は、約０℃～約４℃、０℃～約１０℃（例えば、約０℃～約５℃又は約２℃～約５℃）の範囲内の温度でマイクロ流体デバイス内に貯蔵し得る。他の実施形態では、細胞は、約－３０℃～約－２５℃、約－３０℃～約０℃、約－２５℃～約０℃、約－２５℃～約４℃の範囲内の温度、又はこれらの範囲内で選択された任意の温度で貯蔵し得る。

【0076】

マイクロ流体デバイス内の生体細胞の核酸を安定化させる方法は、安定化生体細胞を溶解させることを更に含み得る。例えば、安定化生体細胞は、生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより溶解させ得る。安定化生体細胞は、マイクロ流体デバイス内又はマイクロ流体デバイス以外（例えば、マイクロ流体デバイスから安定化生体細胞を搬出した後）で溶解試薬に接触させ得る。ＤＮＡを分離するための溶解試薬は、全てのＤＮＡを分離したりゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）又はミトコンドリアＤＮＡ（ｍＤＮＡ）を選択的に分離したりするように更に構成し得る。ＲＮＡを分離するための溶解試薬は、全てのＲＮＡを分離したり又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、若しくはトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であり得るただ１つのタイプのＲＮＡを優先的には分離したりするように構成し得る。溶解試薬と安定化生体細胞との接触は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（チャネルであり得る）に溶解試薬を流入させることを含み得る。そのため、溶解試薬は、フロー領域からチャンバ内への拡散により（又はチャンバが隔離ペンである場合、隔離ペンの分離領域内への拡散により）生体細胞に接触させ得る。安定化生体細胞は、マイクロ流体デバイスのフロー領域に溶解試薬を流入させる前に、過剰の安定化試薬又はチャンバ（若しくは隔離ペンの分離領域）内の安定化細胞を取り囲む培地の他の成分を除去するために洗浄し得る。洗浄は、マイクロ流体デバイスのフロー領域（チャネル）への洗浄溶液又は緩衝液の流入及び／又は貫流により達成し得ると共に、その際、過剰の安定化試薬及び／又は細胞を取り囲む培地の他の成分は、フロー領域（チャネル）内の培地中への拡散により交換し得るので、安定化細胞を取り囲む環境から除去される。幾つかの実施形態では、安定化生体細胞を溶解させるステップは、溶解生体細胞から所望の安定化核酸集団を回収すべく溶解生体細胞を調製する追加の操作を更に含み得る。代替的に、安定化生体細胞は、マイクロ流体デバイスから洗浄溶液中又は緩衝液中に搬出し得る。安定化生体細胞の搬出は、誘電泳動力を用いて行い得る。誘電泳動力は光学的に作動させ得る。

【0077】

マイクロ流体デバイス内の生体細胞の核酸を安定化させる方法は、溶解生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含み得る。安定化核酸の分離は、放出された安定化核酸集団を捕捉マトリックス（限定されるものではないがビーズ上の捕捉オリゴヌクレオチド又はマイクロ流体デバイスの表面にプリントされたプライマーであり得る捕捉オリゴヌクレオチドを含む）に捕捉することにより達成し得る。安定化生体細胞がマイクロ流体デバイス内で溶解される実施形態では、放出された安定化核酸は、マイクロ流体デバイス内に捕捉し得る。例えば、マイクロ流体デバイスがＤＥＰ構成を含む実施形態では、捕捉マトリックス（例えばビーズ）は、細胞溶解中の安定化生体細胞と同一のチャンバ／隔離ペン内に位置し得るか、又は代替的に、捕捉マトリックスは、安定化生体細胞の溶解後にチャンバ／隔離ペン内に移動させ得る。捕捉マトリックスは、幾つかの実施形態では光学的に作動させ得る誘電泳動力により安定化／溶解生体細胞の入ったチャンバ／隔離ペン内に配置し得る。マイクロ流体デバイスがエレクトロウェッティング構成（例えば、オプトエレクトロウェッティング構成）を含む実施形態では、溶解細胞の核酸の分離は、核酸を包含する水性培地のドロップレットに捕捉マトリックスを導入することにより（例えば、捕捉マトリックスを含有するドロップレットと放出された核酸を包含するドロップレットとを合体させることにより）、放出された核酸を包含する水性培地のドロップレットを捕捉マトリックスが位置するマイクロ流体デバイスの他の領域に移動させることにより、又は更なる処理のためにドロップレットをマイクロ流体デバイスから搬出することにより達成し得る。放出された核酸を包含する水性培地のドロップレットを捕捉のためにマイクロ流体デバイスの他の領域に移動させる場合、放出された核酸は、捕捉ビーズ等の捕捉マトリックスにより捕捉し得るか、又は放出された核酸は、マイクロ流体デバイスの表面に固定（例えばプリント）し得るプライマーであり得る捕捉オリゴヌクレオチドにより捕捉し得る。プリントされたプライマーは、溶解が行われた領域内又はマイクロ流体デバイスの他の領域内に位置し得る）。代替的に、核酸は、放出された核酸を捕捉するビーズを包含する水性培地のドロップレットをマイクロ流体デバイスの他の領域に移動させることにより、又は放出された核酸を捕捉するビーズを含有するドロップレットをマイクロ流体デバイスから搬出することにより分離し得る。

【0078】

本方法は、溶解生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分から少なくとも１クラスの核酸を分析することを更に含み得る。分析は、核酸又は記載のように核酸が結合された捕捉マトリックスを搬出することによりオフチップで行い得るか、又はマイクロ流体デバイスの他の領域でオンチップで行い得る。オンチップ分析は、ハイブリダイゼーションアッセイ又は他の蛍光検出法（例えば、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ、ｑＰＣＲ、ｄＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン等）を含み得る。

【0079】

マイクロ流体デバイス以外で行われる分析は、限定されるものではないがシーケンシング、ハイブリダイゼーション実験（限定されるものではないがｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＦＩＳＨ、ｑＰＣＲ、ｄＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（ThermoFisher Scientific）、分子ビーコン、及び他の蛍光プローブ分析を含む）、フットプリンティング、アレイ捕捉、及びゲル電気泳動を含み得る。幾つかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シーケンシングでトランスクリプトーム分析を行うことにより分析される。

【0080】

細胞。
生体細胞は、任意の種類の生体細胞、すなわち、原核細胞又は真核細胞であり得る。幾つかの実施形態では、生体細胞は哺乳動物細胞であり得る。哺乳動物の生体細胞は、ヒト、霊長動物、ブタ、ネズミ科動物、ラット、イヌ科動物の細胞等であり得る。生体細胞は、増殖障害、感染障害、自己免疫障害、及び／又は内分泌障害をはじめとする細胞障害を有する被験者に由来し得る。生体細胞は、正常被験者又は遺伝子工学操作被験者に由来し得る。生体細胞は、ハイブリドーマ、培養細胞サンプル、又は細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系に由来し得る。代替的に、生体細胞は、被験者、特にヒト被験者の血液、尿、涙液、汗、又は糞便に由来し得る。更に他の実施形態では、生体細胞は、被験者から摘出された組織サンプル、例えば、限定されるものではないが切除腫瘍サンプル及び生検サンプル、細針吸引物及びホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルに由来し得る。生体細胞は、免疫細胞（例えば、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞等）、乳房細胞、膵細胞、前立腺細胞、肺細胞、又は腫瘍細胞、例えば、限定されるものではないが黒色腫、乳癌等をはじめとする任意のタイプの循環腫瘍細胞であり得る。

【0081】

組成物。
幾つかの実施形態では、組成物が提供される。組成物は、本明細書に記載されるように生体細胞と安定化試薬とを含み得る。安定化試薬は、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含み得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬は、第２のタンパク質翻訳阻害剤を更に含み得る。少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、少なくとも１種の電子伝達鎖剤、及び任意選択的に第２のタンパク質翻訳阻害剤は、以上に記載の各クラスの任意の好適な種であり得る。組成物は、安定化試薬の追加記載の成分（例えば、プロテアーゼ阻害剤、RNase阻害剤、緩衝液等のいずれかを更に含み得る。

【0082】

キット。
幾つかの実施形態では、細胞内の核酸集団を安定化させるためのキットが提供され得る。キットは、少なくとも１種のタンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び電子伝達鎖デカップリング剤から選択される少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含む安定化試薬を含み得る。少なくとも第１のタンパク質翻訳阻害剤は不可逆阻害剤であり得る。

【0083】

幾つかの実施形態では、キットは、貯蔵及びその後のＤＮＡ分離のためにデオキシ核酸を安定化させるべく安定化試薬を提供し得る。他の実施形態では、キットは、貯蔵及びその後の分離のためにリボ核酸（ＲＮＡ）を安定化させる安定化試薬を提供し得る。幾つかの実施形態では、キットは、貯蔵及びその後の分離のためにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を安定化させるべく安定化試薬を提供し得る。安定化試薬は、本明細書に記載の任意の安定化試薬であり得る。

【0084】

キットの種々の実施形態では、少なくとも１種のタンパク質翻訳阻害剤（例えば、不可逆なもの）は細胞膜透過性であり得る。不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、アミノグリコシド抗生物質、Ｄ－ガラクトサミン、及びエメチンから選択し得る。幾つかの実施形態では、不可逆タンパク質翻訳阻害剤はエメチンであり得る。

【0085】

キットの少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤は細胞膜透過性であり得る。リボ核酸転写阻害剤は、ＣＤＫ９阻害剤、オーレスライシン、チオルチン、アマニチン、及び／又はトリプトリドから選択し得る。種々の実施形態では、リボ核酸転写阻害剤は不可逆阻害剤であり得る。幾つかの実施形態では、リボ核酸転写阻害剤はトリプトリドであり得る。

【0086】

キットの少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、電子伝達鎖阻害剤又は電子伝達鎖デカップリング剤であり得る。電子伝達鎖剤は、その標的に対して可逆活性を有し得る。幾つかの他の実施形態では、電子伝達鎖剤は、その標的に対して不可逆活性を有し得る。電子伝達鎖剤は細胞膜可溶性であり得る。電子伝達鎖剤は、以上に記載の電子伝達鎖剤のいずれにも限定されるものではなく、任意の好適な電子伝達鎖剤であり得る。幾つかの実施形態では、電子伝達鎖剤は電子伝達鎖阻害剤であり得る。幾つかの実施形態では、電子伝達鎖剤はアジ化ナトリウムであり得る。幾つかの実施形態では、２種以上の電子伝達鎖剤がキットに含まれ得る。

【0087】

キットは、第２のタンパク質翻訳阻害剤を更に含み得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、第１のタンパク質翻訳阻害剤とは異なる。幾つかの実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤は、任意の好適なタンパク質翻訳阻害剤であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、不可逆阻害剤であり得る。幾つかの実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤は、可逆タンパク質翻訳阻害剤であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は速効性であり得る。例えば、約１、２、３、５、１０分～約３０分の時間内で阻害効果が見られる。第２のタンパク質翻訳阻害剤は透過性細胞膜であり得る。第２のタンパク質翻訳阻害剤は、ジアゾオキシド、グルタルイミド抗生物質、及びトコンアルカロイドから選択し得る。種々の実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤はシクロヘキシミドであり得る。

【0088】

キットの種々の実施形態では、安定化試薬の少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のうち２つ以上を含む作製済み溶液（例えばマスターミックス）として安定化試薬の成分の一部又は全部が提供され得る。幾つかの実施形態では、マスターミックスは、安定化試薬の少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤を含み得る。マスターミックスは、本明細書に記載されるように任意の安定化試薬の任意の他の成分を更に含み得る。マスターミックス中の安定化試薬の成分の濃度は、安定化反応自体に必要とされる最終濃度の約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、又は約１０００倍であり得る。

【0089】

キットの他の成分。
種々の実施形態では、キットは、RNase阻害剤を含まない。キットは、プロテアーゼ阻害剤を更に含み得る。プロテアーゼ阻害剤は、安定化試薬内に組み込み得るか、又はキットのスタンドアロン成分として提供し得る。プロテアーゼ阻害剤は、システインプロテアーゼ阻害剤、セリンプロテアーゼ阻害剤、又はメタロプロテアーゼ阻害剤であり得る。プロテアーゼ阻害剤は、以上に記載のプロテアーゼ阻害剤のいずれにも限定されるものではなく、任意の好適なプロテアーゼ阻害剤であり得る。

【0090】

溶解緩衝液。
キットは更に、溶解緩衝液を更に含み得る。溶解緩衝液は、安定化試薬に含まれず、安定化試薬を含む溶液のいずれにも含まれない。溶解緩衝液は、キットの他の成分との別の容器に提供し得る。溶解緩衝液は、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡを分離するように構成し得る。他の実施形態では、溶解緩衝液は、全ＲＮＡ又はＲＮＡのサブセットを分離するように設計し得る。溶解緩衝液は変性であり得る。溶解緩衝液は、非イオン性又は双性イオン性であり得る界面活性剤を含み得る。幾つかの実施形態では、例えば、ＤＮＡを分離する場合、イオン性界面活性剤を使用し得る。好適な溶解緩衝液界面活性剤は、限定されるものではないがナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）、ナトリウムデオキシコレート、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ＰＥＧ（２０）ソルビタンモノラウレート（Tween 20）、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（NP40）、オクチルフェノキシポリエトキシルエタノール（Nonidet P-40）又はポリエチレングリコールｔｅｒｔオクチルフェニルエーテル（Triton（商標）X-100）を含み得る。幾つかの実施形態では、溶解緩衝液界面活性剤はＳＤＳを含み得る。

【0091】

溶解緩衝液は、ＥＤＴＡ等のキレート化剤を更に含み得る。溶解緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤を含み得ると共に、プロテアーゼ阻害剤の混合物を更に含み得る。幾つかの実施形態では、溶解緩衝液は、１種以上のホスファターゼ阻害剤を含み得る。

【0092】

ＲＮＡ単離。
ＲＮＡを単離する場合、溶解緩衝液はｐＨ７～８に緩衝化し得る。ＲＮＡ用溶解緩衝液は、フェノール（ＲＮＡ分解の防止）とグアニジニウムイソチオシアネート（RNase酵素及びDNase酵素も変性するカオトロープ）とを含み得る。溶解緩衝液は、１種以上のRNase阻害剤を含み得る。

【0093】

キットの幾つかの実施形態では、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、リボ核酸転写阻害剤、及び電子伝達鎖剤は、溶液中に提供し得る。少なくとも第１の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、リボ核酸転写阻害剤、及び電子伝達鎖剤のそれぞれは、個別容器内の個別溶液として提供し得るか、又は任意の組合せでキットの１つ以上の成分の混合物として提供し得るか、のいずれかである。キットは、任意の好適なプロテアーゼ阻害剤（限定されるものではないが本明細書に記載のプロテアーゼ阻害剤を含む）であり得る１種以上のプロテアーゼ阻害剤を更に含み得る。キットは、任意の好適なRNase阻害剤（限定されるものではないが本明細書に記載のRNase阻害剤を含む）であり得る１種以上のRNase阻害剤を更に含み得る。幾つかの実施形態では、安定化試薬の成分は全て、単一溶液としてキットに提供される。安定化試薬の成分のいずれか又は全てを溶液として提供する場合、成分の濃度は、細胞の核酸を安定化させるために使用される最終濃度の１倍、２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、又は１０００倍であり得るので、生体細胞への添加前にキットの溶液の希釈が可能である。

【0094】

キットの種々の実施形態では、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤は、約１．０マイクロモル～約２Ｍ、約１．０マイクロモル～約０．５Ｍ、約１．０マイクロモル～約５００ミリモル、約１．０マイクロモル～約２５０ミリモル、約０．１ミリモル～約１５０ミリモル、約０．１ミリモル～約５０ミリモル、約１ミリモル～約１００ミリモル、約１ミリモル～約５０ミリモル、約１０ミリモル～約１モル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で溶液内に存在し得る。

【0095】

キットの種々の実施形態では、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤は、約１０ナノモル～約５００ミリモル、約０．０１マイクロモル～約５００ミリモル、約０．１マイクロモル～約５０ミリモル、約０．１マイクロモル～約５ミリモル、約０．１マイクロモル～約５００マイクロモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で溶液内に存在する。

【0096】

キットの種々の実施形態では、少なくとも１種の電子伝達鎖剤は、約０．１マイクロモル～約５Ｍ、約０．１マイクロモル～約１Ｍ、約０．１マイクロモル～約５００ミリモル、約０．３ミリモル～約２５０ミリモル、約０．３ミリモル～約１５０ミリモル、約０．５ミリモル～約１００ミリモル、約１．０マイクロモル～約５００ミリモル、約１．０ミリモル～約１００ミリモル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で存在する。

【0097】

キットの種々の実施形態では、第２のタンパク質翻訳阻害剤は、約１．０マイクロモル～約２Ｍ、約１．０マイクロモル～約０．５Ｍ、約１．０マイクロモル～約５００ミリモル、約１．０マイクロモル～約２５０ミリモル、約０．１ミリモル～約１５０ミリモル、約０．１ミリモル～約５０ミリモル、約１ミリモル～約１００ミリモル、約１ミリモル～約５０ミリモル、約１０ミリモル～約１モル、又はこれら範囲間の任意の値の濃度で溶液内に存在し得る。

【0098】

マイクロ流体デバイス並びにかかるデバイスの操作及び観測のためのシステム。
図１Ａは、本開示の実施形態に従って微小物体の保持、増殖、及びアッセイに使用可能なマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を例示する。マイクロ流体デバイス１００の斜視図は、マイクロ流体デバイス１００に部分図を提供するためにそのカバー１１０の部分破断図を伴って示されている。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流体培地１８０が貫流可能で任意選択的に１つ以上の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０に搬入及び／又は搬送する流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含む。図１Ａには単一のマイクロ流体回路１２０が例示されているが、好適なマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２つ又は３つ）のかかるマイクロ流体回路を含み得る。それにもかかわらず、マイクロ流体デバイス１００は、ナノ流体デバイスになるように構成可能である。図１Ａに例示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得ると共に、各隔離ペンは、流路１０６に流体連通した状態で１つ以上の開口を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６に流体連通した状態で単一の開口部のみを有し得る。以下で更に考察されるように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を貫流する場合でさえも、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイス内に微小物体を保持するように最適化された各種の特徴及び構造を含む。しかし、上記のことに目を向ける前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の簡単な説明を提供する。

【0099】

図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。

【0100】

図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。

【0101】

支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。

【0102】

マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。

【0103】

マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料 － したがって、マイクロ流体回路材料１１６ － は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。

【0104】

カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。

【0105】

幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム－錫－酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。

【0106】

図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。

【0107】

電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。

【0108】

システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。

【0109】

幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。

【0110】

幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。

【0111】

システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。

【0112】

図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。

【0113】

マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。

【0114】

培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。

【0115】

原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。

【0116】

撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。

【0117】

傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。

【0118】

図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。

【0119】

マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少ない又はより多くの隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、それぞれ、生物学的微小物体の保持、分離、アッセイ、又は培養に役立つ１つ以上の利益を提供し得る様々な特徴及び形状を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。

【0120】

図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。

【0121】

幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。

【0122】

幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。

【0123】

トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。

【0124】

幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。

【0125】

他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。

【0126】

幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。

【0127】

図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ～図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。

【0128】

生物学的微小物体を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。

【0129】

原動マイクロ流体デバイス構成。
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。

【0130】

ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。

【0131】

図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。

【0132】

特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。

【0133】

電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。

【0134】

図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。

【0135】

幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0136】

他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。

【0137】

フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0138】

ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。

【0139】

ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。

【0140】

他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0141】

更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成（ＯＥＷ）又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。

【0142】

誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ～約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ～約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム～約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。

【0143】

幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３－ジフルオロメチレニル－ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ～約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５～３．０ｎｍ）を有する。

【0144】

幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。

【0145】

幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ－Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ－Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ－Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％～４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ－Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ～約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ－Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。

【0146】

したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。

【0147】

他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。

【0148】

マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。

【0149】

隔離ペン。
一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ～図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。

【0150】

図２Ａ～図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、４５０、５００、７００にも当てはまる。

【0151】

したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ～図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。

【0152】

図２Ｃは、本開示による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。

【0153】

既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬ_ｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤ_ｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤ_ｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤ_ｐが接続領域２３６の長さＬ_ｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。

【0154】

更に、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬ_ｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤ_ｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。

【0155】

マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。

【0156】

マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤ_ｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗ_ｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。

【0157】

幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗ_ｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬ_ｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。

【0158】

図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内にあり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎよりも大きい値であり得る。

【0159】

図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎについて本明細書において識別された任意の範囲内であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。

【0160】

図２Ｄ～図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ～図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。

【0161】

図２Ｄ～図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ～図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。

【0162】

各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。

【0163】

図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬ_ｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤ_ｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤ_ｐよりも小さい長さＬ_ｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬ_ｃ１及びＬ_ｃ２との和は最大侵入深さＤ_ｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬ_ｃｏｎが侵入深さＤ_ｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬ_ｃ１及びＬ_ｃ２の和が侵入深さＤ_ｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖ_ｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤ_ｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。

【0164】

図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗ_ｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗ_ｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗ_ｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅_ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗ_ｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗ_ｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗ_ｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、以下の任意の範囲内の角度を含む：約３０°～約９０°、約４５°～約９０°、約６０°～約９０°等。

【0165】

隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０^６立方μｍ、少なくとも２×１０^６立方μｍ、少なくとも４×１０^６立方μｍ、少なくとも６×１０^６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。

【0166】

隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）でのマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗ_ｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：約５０～１０００μｍ、約５０～５００μｍ、約５０～４００μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２５０μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１５０μｍ、約５０～１００μｍ、約７０～５００μｍ、約７０～４００μｍ、約７０～３００μｍ、約７０～２５０μｍ、約７０～２００μｍ、約７０～１５０μｍ、約９０～４００μｍ、９０～３００μｍ、約９０～２５０μｍ、約９０～２００μｍ、約９０～１５０μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２５０μｍ、約１００～２００μｍ、約１００～１５０μｍ、及び約１００～１２０μｍ。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗ_ｃｈは、約２００～８００μｍ、約２００～７００μｍ、又は約２００～６００μｍであり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗ_ｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。更に、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗ_ｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。

【0167】

幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０～約２００μｍ又は約５０～約１５０μｍの高さを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０^４～約３×１０^６平方μｍ、約２×１０^４～約２×１０^６平方μｍ、約４×１０^４～約１×１０^６平方μｍ、約２×１０^４～約５×１０^５平方μｍ、約２×１０^４～約１×１０^５平方μｍ、又は約２×１０^５～約２×１０^６平方μｍの断面積を有する。

【0168】

隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨ_ｃｈは、以下の任意の範囲内であり得る：２０～１００μｍ、２０～９０μｍ、２０～８０μｍ、２０～７０μｍ、２０～６０μｍ、２０～５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～９０μｍ、３０～８０μｍ、３０～７０μｍ、３０～６０μｍ、３０～５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～９０μｍ、４０～８０μｍ、４０～７０μｍ、４０～６０μｍ、又は４０～５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨ_ｃｈは、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨ_ｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域において、これらの任意の範囲であるように選択することができる。

【0169】

隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、以下の任意の範囲内であり得る：５００～５０，０００平方μｍ、５００～４０，０００平方μｍ、５００～３０，０００平方μｍ、５００～２５，０００平方μｍ、５００～２０，０００平方μｍ、５００～１５，０００平方μｍ、５００～１０，０００平方μｍ、５００～７，５００平方μｍ、５００～５，０００平方μｍ、１，０００～２５，０００平方μｍ、１，０００～２０，０００平方μｍ、１，０００～１５，０００平方μｍ、１，０００～１０，０００平方μｍ、１，０００～７，５００平方μｍ、１，０００～５，０００平方μｍ、２，０００～２０，０００平方μｍ、２，０００～１５，０００平方μｍ、２，０００～１０，０００平方μｍ、２，０００～７，５００平方μｍ、２，０００～６，０００平方μｍ、３，０００～２０，０００平方μｍ、３，０００～１５，０００平方μｍ、３，０００～１０，０００平方μｍ、３，０００～７，５００平方μｍ、又は３，０００～６，０００平方μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、他の範囲（例えば、上記列挙された任意の端点により定義される範囲）であってもよい。

【0170】

隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬ_ｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：約１～６００μｍ、５～５５０μｍ、１０～５００μｍ、１５～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～５００μｍ、４０～４００μｍ、６０～３００μｍ、８０～２００μｍ、又は約１００～１５０μｍ。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬ_ｃｏｎは、上記例と異なる範囲（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）内であることもできる。

【0171】

隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）での接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、以下の任意の範囲内であり得る：２０～５００μｍ、２０～４００μｍ、２０～３００μｍ、２０～２００μｍ、２０～１５０μｍ、２０～１００μｍ、２０～８０μｍ、２０～６０μｍ、３０～４００μｍ、３０～３００μｍ、３０～２００μｍ、３０～１５０μｍ、３０～１００μｍ、３０～８０μｍ、３０～６０μｍ、４０～３００μｍ、４０～２００μｍ、４０～１５０μｍ、４０～１００μｍ、４０～８０μｍ、４０～６０μｍ、５０～２５０μｍ、５０～２００μｍ、５０～１５０μｍ、５０～１００μｍ、５０～８０μｍ、６０～２００μｍ、６０～１５０μｍ、６０～１００μｍ、６０～８０μｍ、７０～１５０μｍ、７０～１００μｍ、及び８０～１００μｍ。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）の接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、上記例と異なることができる（例えば、上記列挙される任意の終点により定義される範囲）。

【0172】

隔離ペンの様々な実施形態において、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、又は卵子であり得る生体細胞）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗ_ｃｏｎは、上記例と異なってもよい（例えば、上記列挙される任意の端点により定義される範囲）。

【0173】

隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域の基端開口部の幅Ｗ_ｐｒは、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と少なくとも同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗ_ｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、又は約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約７５～１５０μｍ、約７５～１００μｍ、又は約２００～３００μｍであり得る。

【0174】

隔離ペンの様々な実施形態において、接続領域（例えば、２３６）の長さＬ_ｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗ_ｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、又はこれを超える比率。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬ_ｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗ_ｃｏｎとの比率は、上記例と異なってもよい。

【0175】

マイクロ流体デバイスの様々な実施形態１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３００において、Ｖ_ｍａｘは、約０．２マイクロリッター／秒、約０．５マイクロリッター／秒、約０．７マイクロリッター／秒、約１．０マイクロリッター／秒、約１．３マイクロリッター／秒、約１．５マイクロリッター／秒、約２．０マイクロリッター／秒、約２．５マイクロリッター／秒、約３．０マイクロリッター／秒、約３．５マイクロリッター／秒、約４．０マイクロリッター／秒、約４．５マイクロリッター／秒、約５．０マイクロリッター／秒、約５．５マイクロリッター／秒、約６．０マイクロリッター／秒、約６．７マイクロリッター／秒、約７．０マイクロリッター／秒、約７．５マイクロリッター／秒、約８．０マイクロリッター／秒、約８．５マイクロリッター／秒、約９．０マイクロリッター／秒、約１０マイクロリッター／秒、約１１マイクロリッター／秒、約１２マイクロリッター／秒、約１３マイクロリッター／秒、約１４マイクロリッター／秒、又は約１５マイクロリッター／秒に設定することができる。

【0176】

隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０^５立方μｍ、少なくとも８×１０^５立方μｍ、少なくとも１×１０^６立方μｍ、少なくとも２×１０^６立方μｍ、少なくとも４×１０^６立方μｍ、少なくとも６×１０^６立方μｍ、少なくとも８×１０^６立方μｍ、少なくとも１×１０^７立方μｍ、少なくとも５×１０^７立方μｍ、少なくとも１×１０^８立方μｍ、少なくとも５×１０^８立方μｍ、少なくとも８×１０^８立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態において、隔離ペンの容積は、約５×１０^５立方μｍ、約６×１０^５立方μｍ、約８×１０^５立方μｍ、約１×１０^６立方μｍ、約２×１０^６立方μｍ、約４×１０^６立方μｍ、約８×１０^６立方μｍ、約１×１０^７立方μｍ、約３×１０^７立方μｍ、約５×１０^７立方μｍ、又は約８×１０^７立方μｍ、又はそれを超える容積であり得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約１ナノリットル～約５０ナノリットル、２ナノリットル～約２５ナノリットル、２ナノリットル～約２０ナノリットル、約２ナノリットル～約１５ナノリットル、又は約２ナノリットル～約１０ナノリットルであり得る。

【0177】

様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の実施形態でのように構成された隔離ペンを有し、その場合、マイクロ流体デバイスは、約５～約１０個の隔離ペン、約１０～約５０個の隔離ペン、約１００～約５００個の隔離ペン、約２００～約１０００個の隔離ペン、約５００～約１５００個の隔離ペン、約１０００～約２０００個の隔離ペン、約１０００～約３５００個の隔離ペン、約２５００～約５０００個の隔離ペン、約３０００～約７０００個の隔離ペン、約５０００～約１０，０００個の隔離ペン、又は約８０００～約１２，０００個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴）を含み得る。

【0178】

図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。図２Ｇに示されたマイクロ流体デバイス２８０は、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤ_ｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤ_ｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。

【0179】

図３Ａ～図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。

【0180】

図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。

【0181】

通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。

【0182】

特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロ
プロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。

【0183】

幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ－ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ～－６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。

【0184】

図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。

【0185】

幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／－０．１％、温度係数＋／－０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／－０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。

【0186】

ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。

【0187】

上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。

【0188】

特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。

【0189】

特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。

【0190】

特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は、構造化光（例えば、光変調サブシステム３３０を介する）を出力するために使用可能であり、第２の光源３３４は、非構造化光を提供するために使用可能である。第１の光源３３２は、光学作動動電性及び／又は蛍光励起のために構造化光を生成可能であり、第２の光源３３４は、明視野照明を提供するために使用可能である。これらの実施形態では、原動モジュール１６４は、第１の光源３３２を制御するために使用可能であり、撮像モジュール１６４は、第２の光源３３４を制御するために使用可能である。顕微鏡３５０の光学縦列は、（１）デバイスがネスト３００により保持されたとき、光変調サブシステム３３０から構造化光を受け取ってマイクロ流体デバイスの少なくとも第１の領域、例えば、光学作動動電デバイスに構造化光を集束させるように、且つ（２）マイクロ流体デバイスから反射光及び／又は発光光を受け取ってかかる反射光及び／又は発光光の少なくとも一部を検出器３４８集束させるように、構成可能である。光学縦列は、デバイスがネスト３００により保持されたとき、第２の光源から非構造化光を受け取って、マイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域に非構造化光を集束させるように、更に構成可能である。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域はオーバーラップ領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、追加的又は代替的に、任意の好適な波長の光を有し得るレーザーを含み得る。図３Ｂに示される光学システムの図は模式図にすぎず、光学システムは、追加のフィルター、ノッチフィルター、レンズ等を含み得る。第２の光源３３４が明視野及び／又は蛍光励起更にはレーザー照明のための１つ以上の光源を含む場合、光源の物理的構成は、図３Ｂに示されるものと異なり得ると共に、レーザー照明は、光学システム内の任意の好適な物理的位置に導入し得る。光源４３２及び光源４０２／光変調サブシステム４０４の模式的位置は、同様に交換し得る。

【0191】

図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。

【0192】

幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。

【0193】

被覆溶液及び被覆剤。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。

【0194】

被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。

【0195】

幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。

【0196】

被覆剤／溶液。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。

【0197】

ポリマーベースの被覆材料。
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。

【0198】

ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量Ｍ_Ｗで、約２０００Ｄａ～約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ－ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２～１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍ_Ｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍ_Ｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭ_Ｗを有し得る。

【0199】

他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。

【0200】

他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。

【0201】

他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７－デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。

【0202】

更に他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬで存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）～約５０％ｖ／ｖで存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。

【0203】

幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。

【0204】

共有結合される被覆材料。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。

【0205】

共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。

【0206】

幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。

【0207】

様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。

【0208】

幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。

【0209】

他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。

【0210】

他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ Ｍ_ｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍ_ｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭ_ｗを有し得る。

【0211】

共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。

【0212】

共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。

【0213】

調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子を更に含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。

【0214】

調整された表面の性質。
調整された表面の組成以外に、疎水性材料の物理的厚さ等の他の因子は、ＤＥＰ力に影響を及ぼし得る。基板に調整された表面を形成する方法（例えば、気相堆積、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、静電コーティング）等の各種因子は、調整された表面の物理的厚さを変化させ得る。幾つかの実施形態では、調整された表面は、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１ｎｍ～約７ｎｍ、約１ｎｍ～約５ｎｍの範囲内又はそれらの間の任意の個別値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合された部分により形成された調整された表面は、約１０ｎｍ～約５０ｎｍの厚さを有し得る。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように作製された調整された表面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整された表面の共有結合された部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成の基板表面）に共有結合された場合、単層を形成し得ると共に、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５～３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、典型的には約３０ｎｍ程度の厚さを有し得るスピンコーティングにより作製された表面のものと対照的である。幾つかの実施形態では、調整された表面は、ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイス内の操作で好適には機能するために完全に形成された単層を必要とするものではない。

【0215】

様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。

【0216】

調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。

【0217】

単一又は複数パートの調整面。
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。

【0218】

共有結合された被覆材料を準備する方法。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。

【化1】

【0219】

被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。

【0220】

被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及びリン原子の任意の組合せから選択される１～２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基から選択される１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０～２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子～約２００原子、約１０原子～約８０原子、約１０原子～約５０原子、又は約１０原子～約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。

【0221】

幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。

【0222】

幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒ_ｘとペアとなる反応部分Ｒ_ｐｘ（すなわち、反応部分Ｒ_ｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、更に置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。

【0223】

幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１～約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。

【0224】

幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。

【0225】

図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得る基板２８６の内面２９４と、マイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。

【0226】

図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。

【0227】

他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。

【0228】

更に他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。

【0229】

適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。

【0230】

マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素。
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。

【実施例】

【0231】

実験
実施例１．核酸安定化試薬を用いた又は用いない核酸分離プロトコルの比較

【0232】

材料。
エメチン（Sigma、カタログ番号E2375）、シクロヘキシミド（Sigma、カタログ番号C7698）、トリプトリド（Sigma、カタログ番号T3652）、及びアジ化ナトリウム（Sigma、カタログ番号S2002）は全て、市販品であった。溶解試薬は、ＴＣＬ溶解緩衝液（Qiagen、カタログ番号070498）であった。ＲＮＡ分離は、Agencourt（登録商標）RNAClean（登録商標）XPビーズ（Beckman Coulter、カタログ番号A63987）を用いて行った。ＲＮＡシーケンシングは、Nextera（登録商標）XTキット（Illumina（登録商標）、カタログ番号ＦC-131-1024）及びNextera（登録商標）XTインデックスキット（Illumina（登録商標）、カタログ番号FC-131-1001）を用いて行った。

【0233】

生体細胞。
ＯＫＴ３細胞（ネズミ骨髄腫ハイブリドーマ細胞系）は、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ－８００１（商標））から得た。培養下で細胞は懸濁液細胞系の挙動を示す。約２×１０^４～約５×１０^５生存細胞／ｍＬを播種し、５％二酸化炭素ガス環境を用いて２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有する２０ｍｌイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で３７℃でインキュベートすることにより、培養を維持した。２～３日ごとに細胞を分割した。マイクロ流体デバイスに細胞を装填するために、ＯＫＴ３細胞数及び生存能を計測し、細胞密度を５×１０^５／ｍｌに調整した。

【0234】

ストック溶液は、表１に示されるように作製した。

【0235】

【表1】

【0236】

表２に示されるように安定化試薬の１００×マスターミックスを作製した。３０マイクロリットルアリコートとして－８０℃でマスターミックスを貯蔵した。

【0237】

【表2】

【0238】

約０．５×１０^５濃度でＯＫＴ３細胞の単一アリコートを得た。５つの試験条件のそれぞれに対して５０マイクロリットルの細胞培養物（２０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシンを有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中）をトリプリケートでアリコートした。

【0239】

【表3】

【0240】

上下にピペッティングすることにより各レプリケートの各チューブを混合した。氷上にサンプルを１５分間配置し、次いで、４℃の実験室冷蔵庫に移した。溶解対照サンプルは４℃ではなく－８０℃で貯蔵した。

【0241】

貯蔵サンプルの貯蔵後処理。
３日間貯蔵した後、サンプルを処理した。４℃で貯蔵した各細胞サンプルに対して、３．２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳでサンプルを２回洗浄した。簡潔に述べると、０．３ｇで２分間遠心分離することにより細胞をペレット化し、上清を除去し、そして３．２ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５００マイクロリットルのＰＢＳに細胞ペレットを再懸濁させた。これを繰り返した。３回目の遠心分離の後、３．２ｍＭアジ化ナトリウムを含有する５０マイクロリットルのＰＢＳに各サンプル中の細胞を再懸濁させた。

【0242】

ＲＮＡ分離及びその後のシーケンシング分析。
全ての貯蔵サンプル（Ｉｎ、ＮＡ、ＷＩｎ、及びＷサンプルのそれぞれ）の２マイクロリットルの細胞懸濁液を個別に８マイクロリットルの１．２５×ＴＣＬ溶解緩衝液に添加し、上下にピペッティングした。溶解対照（ＬＣ）サンプルのそれぞれに対して、４マイクロリットルの細胞／ＴＣＬ溶解緩衝液ミックスを６マイクロリットルの１×ＴＣＬ溶解緩衝液に添加し、上下にピペッティングした。

【0243】

各サンプルに対して、Agencourt（登録商標）RNAClean（登録商標）XPビーズを用いてＲＮＡを精製した。分離されたＲＮＡは、Picelli et al., Nature Methods, 10, 1096-1098 (2013)に記載のSMART-Seq2プロトコルを用いて１２サイクルで増幅させた。Nextera（登録商標）XTキット及びバーコード（Nextera XT Indexキット）を用いてＲＮＡｓｅｑ ｃＤＮＡシーケンシングライブラリーを作製した。Illumina（登録商標）MiSeqでシーケンシングを行って３～５００万の２×７５ｂｐリード／サンプルを得た。

【0244】

図４には増幅後に回収されたｃＤＮＡの量の比較が示されている。ｃＤＮＡの定量は、蛍光測定（Qubit（商標）蛍光計、ThermoFisher Scientific）を用いて行った。示された量は、回収されたｃＤＮＡの合計ナノグラム数である。Ｃｔ１と記された最初の２つカラムは、溶解対照（ＬＣ）サンプル１（Ｃｔ１）を用いたｃＤＮＡ増幅反応の技術的デュプリケートを表した。カラムの残りの部分は、左から右にペアワイズに、２つの追加の溶解対照（ＬＣ）サンプル（Ｃｔ２及びＣｔ３）、安定化試薬で処理した３つの阻害（Ｉｎ）サンプル（Ｉｎ１、Ｉｎ２、Ｉｎ３）、３つの陰性対照（ＮＡ）サンプル（ＮＡ１、ＮＡ２、ＮＡ３）、安定化試薬で処理した３つのＰＢＳ洗浄サンプル（ＷＩｎ）（ＷＩｎ１、ＷＩｎ２、ＷＩｎ３）、及び更なる添加なしの３つのＰＢＳ洗浄サンプル（Ｗ）（Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３）を表す。カラムの各ペア（技術的デュプリケート）は、そのレプリケートの各特定条件下で回収されたｃＤＮＡの量を表す。細胞を洗浄して安定化試薬の添加有り（ＷＩｎカラムペア）又は添加無し（Ｗカラムペア）でＰＢＳ緩衝液に導入すると、ＬＣ、Ｉｎ、及びＮＡサンプルでのｃＤＮＡ回収と比較して、全核酸収率が非常に低くなることが分かる。Ｃｔ及びＮＡサンプルから回収されたｃＤＮＡ量の収率は類似していたが、安定化試薬で処理したサンプルから分離されたＲＮＡの品質は、以下で考察されるようにライブラリー調製にはより好適であった。

【0245】

１日目に安定化試薬を存在させずに溶解させて－８０℃で貯蔵した溶解対照サンプル（ＬＣ）（図５Ａ）及び安定化試薬で処理して４℃で７２時間貯蔵してから溶解させた阻害サンプル（Ｉｎ）（図５Ｂ）から回収されたｃＤＮＡのサイズ分布が図５に示されている。曲線は非常に類似しているように見え、阻害サンプル（Ｉｎ）のｃＤＮＡのサイズ分布は溶解対照サンプル（ＬＣ）のものと比較して有意差を示さない。各サンプルセットのバイオアナライザートレースは、シーケンシングに入るうえで良好な相関及び相対分布を示す。図５Ｃは、ＮＡサンプルから回収されたｃＤＮＡのサイズ分布を示す。図５Ａ及び５Ｂに示されるトレースと比較して、トレースの主分布ピークのより低分子量側に沿って低分子量材料が追加されることは明らかであった。より低分子量のｃＤＮＡがバイオアナライザートレースに示されることから、ＮＡサンプルで回収されたＲＮＡは、ＬＣ及びＩｎサンプルと比べて分解の増加の問題を抱えていることが示唆された。そのため、多量のｃＤＮＡが観測されたにもかかわらず（図４）、ＮＡサンプルは、シーケンシングに最適化されたｃＤＮＡライブラリーを提供しなかった。

【0246】

シーケンシングデータの分析は、Illumina BaseSpaceで利用可能になったTopHatアライメント及びCufflinks DE発現モジュールを用いて行った。参照として溶解対照サンプル（Ｃｔ１、Ｃｔ２、Ｃｔ３）を用いて、安定化試薬で処理した阻害サンプル（Ｉｎ１、Ｉｎ２、Ｉｎ３）の差次的発現（ＤＥ）分析が図６に示されている。Ｉｎサンプル中の１４０遺伝子は３．４×～１．２×の範囲内で変化する発現レベルを呈することが、ＤＥ分析により示された。３８遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が減少した（データは示されていない）。最も大きな減少は、２．０９×減少であった。遺伝子オントロジー分析では、発現が減少した遺伝子の特異的経路富化は予測されなかった。１８遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が増加した。最も大きな増加は、ヒストンタンパク質で３．４×であった。遺伝子オントロジー分析では、アミン分泌経路が１つの特異的富化として予測された（２遺伝子）。全体として、変化はランダム且つ副次的であるように思われた。したがって、４℃で貯蔵する前に安定化させた細胞（Ｉｎ）のプロファイリング実験では、直接溶解且つ－８０℃貯蔵（ＬＣ）と比較して影響はほとんど予測されない。

【0247】

参照として溶解対照細胞（Ｃｔ１、Ｃｔ２、Ｃｔ３）を用いて安定化無しで４℃で貯蔵した陰性対照細胞（ＮＡ１、ＮＡ２、ＮＡ３）のＤＥ分析が図７に示されている。３０３遺伝子は、８．２×～１．２×の範囲内で示差的に発現された。１３９遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が減少した（データは示されていない）。最も大きな減少は８．２×であり、遺伝子オントロジー分析では、細胞タンパク質修飾（ＧＯ：０００６４６４）（２８遺伝子）及び代謝プロセス（ＧＯ：０００８１５２）（６６遺伝子）で経路富化が予測された。１８遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が増加した（データは示されていない）。最も大きな増加は５．４×であった。遺伝子オントロジー分析では、いかなる特異的経路富化も予測されなかった。安定化剤で処理したＩｎサンプルでアップレギュレートされた遺伝子は、安定化試薬の添加無しのＮＡ細胞でアップレギュレートされた遺伝子にオーバーラップすることから、安定化法自体は、何ら発現の増加をトリガーしないことが示唆されるが、環境暴露及び／又は取扱いが原因になるように思われた。

【0248】

参照として溶解対照細胞を用いて安定化試薬を後添加し且つ４℃で貯蔵したＰＢＳ洗浄ＷＩｎ細胞（ＷＩｎ１、ＷＩｎ２、ＷＩｎ３）のＤＥ分析が図８に示されている。多数の１１６０遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が減少した（データは示されていない）。最も大きな減少は８．２×であった。遺伝子オントロジー分析では、１０を超える特異的経路の富化が予測された。同様に、多数の１１０８遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が増加し、最も大きな増加は８．４×であった（データは示されていない）。遺伝子オントロジー分析では、１０を超える特異的経路の富化が予測された。特異的な２遺伝子Ｓａｍｄ１１及びＳａｍｄ１は、それぞれ、８．４×及び７．９×で最も高度に活性化された。これらの２つの推定転写因子は、観測された多数の遺伝子発現変化を駆動した可能性がある。

【0249】

参照として溶解対照サンプル（Ｃｔ１、Ｃｔ２、Ｃｔ３）を用いてＰＢＳで洗浄し且つ安定化試薬を添加しないＷ細胞（Ｗ１、Ｗ２、Ｗ３）のＤＥ分析が図９に示される。多数の７４４遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が減少した（データは示されていない）。最も大きな減少は１３×であった。遺伝子オントロジー分析では、１０を超える特異的経路の富化が予測された。同様に、多数の７７４遺伝子は、１．５×カットオフを用いて評価したとき発現が増加し、最も大きな増加は５．１×であった（データは示されていない）。遺伝子オントロジー分析では、１０を超える特異的経路の富化が予測された。Ｓａｍｄ１１は、この場合も、最も高度に活性化された遺伝子の１つであり、４．６×富化を有していた。この転写因子は、特徴付けが不十分であるが、見られた多数の遺伝子発現変化を駆動した可能性がある。

【0250】

４℃の培地で細胞を貯蔵すると、代謝遺伝子発現は有意な減少を示すが、大きな変化のトリガーには影響しないことが、結果から示される。しかし、代謝遺伝子発現の変化は、安定化試薬の使用によりブロックされる（６０遺伝子超が影響を受ける）。安定化試薬は、ＰＢＳ等の培地で洗浄する前に細胞に添加すべきである。

【0251】

実施例２．貯蔵後のマイクロ流体デバイス内での安定化核酸の分離

【0252】

システム及びデバイス：Berkeley Lights, Inc.により製造された、且つ同様にBerkeley Lights, Inc.により製造された光学機器により制御された、ナノ流体デバイスOptoSelect（商標）チップを利用した。この機器は、温度コントローラに結合されたチップ用の取付けステージと、ポンプ・流体培地調整コンポーネントと、カメラとチップ内のフォトトランジスターをアクティブにするのに好適な構造化光源とを含む光学縦列と、を含む。OptoSelectチップは、フォトトランジスター誘起ＯＥＴ力を提供するOptoElectroPositioning（ＯＥＰ（商標））技術を用いて構成された基板を含む。チップはまた、複数のNanoPen（商標）チャンバ（又は隔離ペン）がそれぞれ流体接続された複数のマイクロ流体チャネルを含んでいた。各隔離ペンの容積は約１×１０^６立方ミクロンである。

【0253】

細胞及び培養培地：以上の実施例１の通り。

【0254】

マイクロ流体デバイスのプライミング。２５０マイクロリットルの１００％二酸化炭素を１２マイクロリットル／秒の速度で流動させ、続いて、０．１％Pluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含有する２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流動させ、最後に、２５０マイクロリットルのＰＢＳを１２マイクロリットル／秒で流動させた。続いて、培養培地の導入を行う。

【0255】

培地かん流。培地は、以下の２つの方法のいずれかによりマイクロ流体デバイスを介してかん流させる。
１． ０．０１マイクロリットル／秒で２時間かん流させ、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、そして繰り返す。
２． ０．０２マイクロリットル／秒で１００秒間かん流させ、フローを５００秒間停止し、２マイクロリットル／秒で６４秒間かん流させ、そして繰り返す。

【0256】

実施例１に記載の濃度で２つのOptoSelectデバイスに細胞を導入し、個別にNanoPenチャンバに入れ、そして３７℃で２４時間培養する。

【0257】

OEP技術により生成された光学作動誘電泳動力を用いて培養細胞の半分をデバイス１及び２のそれぞれから搬出する。ＯＫＴ３細胞のこれらの対照サンプルをＴＣＬ溶解緩衝液（２×）に搬出導入し、混合し、そして８０℃で凍結させる。

【0258】

５０マイクロリットルの安定化試薬（表２の１００×マスターミックスから２×に希釈したもの、０．７２ｍＭシクロヘキシミド、０．３６ｍＭエメチン、６マイクロモルトリプトリド、６．２０ｍＭアジ化ナトリウム）を１マイクロリットル／秒の速度でマイクロ流体チャネルに流入させて培養培地を置き換えることにより、OptoSelectデバイス１内に残留する細胞を貯蔵のために安定化させる。５分間にわたり安定化試薬をNanoPenチャンバ内に拡散させ、更に１５分間にわたりＯＫＴ３細胞を安定化試薬に接触させ、その後、OptoSelectデバイス１を機器から取り出す。安定化細胞（安定化）の入ったOptoSelectデバイス１をシールして蒸発を防止し、そして４℃で一晩貯蔵する。

【0259】

安定化試薬を添加せずに貯蔵すべくOptoSelectデバイス２内に残留する細胞を４℃にする。非安定化細胞（非安定化）の入ったOptoSelectデバイス２をシールして蒸発を防止し、そして４℃で一晩貯蔵する。

【0260】

翌日、OptoSelectデバイス１を機器に戻し、安定化カクテルを含有する培地をデバイスに通してフラッシュし、貯蔵培地を置き換える。次いで、安定化細胞のグループをOptoSelectデバイスからＴＣＬ溶解緩衝液（２×）に搬出導入し、以上の実験１に記載されるようにライブラリー生成、核酸シーケンシング、及びシーケンス解析のための処理を行う。OptoSelectデバイス２もOptoSelectデバイス１と同一の一晩の貯蔵期間の後に機器上に再配置し、そして新鮮培地（安定化試薬を含有しない）を用いてデバイスをフラッシュし再調整する。次いで、非安定化細胞（非安定化）のグループをOptoSelectデバイスからＴＣＬ溶解緩衝液（２回）に搬出導入し、以上の実験１に記載されるようにライブラリー生成、核酸シーケンシング、及びシーケンス解析のための処理を行う。

【0261】

安定化サンプル及び対照サンプルからのシーケンシング結果は、非安定化細胞と対照細胞との間の遺伝子発現の変動と比較して、安定化細胞と対照細胞との間の遺伝子発現の変動の低減を示すと予想される。

【0262】

実施形態のレシテーション
１．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤と、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤と、電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を含む、生体細胞内の核酸集団を安定化させるためのキット。

【0263】

２．キットが第２のタンパク質翻訳阻害剤を更に含む、実施形態１に記載のキット。

【0264】

３．第２のタンパク質翻訳阻害剤は可逆タンパク質翻訳阻害剤である、実施形態２に記載のキット。

【0265】

４．第２のタンパク質翻訳阻害剤が不可逆タンパク質翻訳阻害剤と比較して速効性である、実施形態２～３のいずれか１つに記載のキット。

【0266】

５．第２のタンパク質翻訳阻害剤が細胞膜透過性である、実施形態２～４のいずれか１つに記載のキット。

【0267】

６．第２のタンパク質翻訳阻害剤がジアゾオキシド、グルタルイミド抗生物質、及び／又はトコンアルカロイドである、実施形態２～５のいずれか１つに記載のキット。

【0268】

７．第２のタンパク質翻訳阻害剤がシクロヘキシミドである、実施形態２～６のいずれか１つに記載のキット。

【0269】

８．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が細胞膜透過性である、実施形態１～７のいずれか１つに記載のキット。

【0270】

９．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤がアミノグリコシド抗生物質、Ｄ－ガラクトサミン、及び／又はエメチンである、実施形態１～８のいずれか１つに記載のキット。

【0271】

１０．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤がエメチンである、実施形態１～９のいずれか１つに記載のキット。

【0272】

１１．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が細胞膜透過性である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のキット。

【0273】

１２．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤がＣＤＫ９阻害剤、オーレスライシン、チオルチン、アマニチン、及び／又はトリプトリドである、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のキット。

【0274】

１３．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が不可逆阻害剤である、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキット。

【0275】

１４．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤がトリプトリドである、実施形態１～１３のいずれか１つに記載のキット。

【0276】

１５．少なくとも１種の電子伝達鎖剤が可逆活性を有する、実施形態１～１４のいずれか１つに記載のキット。

【0277】

１６．少なくとも１種の電子伝達鎖剤が細胞膜透過性である、実施形態１～１５のいずれか１つに記載のキット。

【0278】

１７．電子伝達鎖剤が電子伝達鎖阻害剤である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載のキット。

【0279】

１８．電子伝達鎖剤がアジ化ナトリウムである、実施形態１～１７のいずれか１つに記載のキット。

【0280】

１９．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤の少なくとも１つが溶液中に提供される、実施形態１～１８のいずれか１つに記載のキット。

【0281】

２０．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が溶液中に提供される、実施形態１９に記載のキット。

【0282】

２１．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤が１．０マイクロモル～２Ｍの濃度で溶液内に存在する、実施形態２０に記載のキット。

【0283】

２２．第２のタンパク質翻訳阻害剤が溶液中に提供される、実施形態１～２１のいずれか１つに記載のキット。

【0284】

２３．第２のタンパク質翻訳阻害剤が１．０マイクロモル～２Ｍの濃度で溶液内に存在する、実施形態２２に記載のキット。

【0285】

２４．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が溶液中に提供される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載のキット。

【0286】

２５．少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤が１０ナノモル～５００ミリモルの濃度で溶液内に存在する、実施形態２４に記載のキット。

【0287】

２６．少なくとも１種の電子伝達鎖剤が溶液中に提供される、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のキット。

【0288】

２７．少なくとも１種の電子伝達鎖剤が０．１マイクロモル～１Ｍの濃度で存在する、実施形態２６に記載のキット。

【0289】

２８．キットがRNase阻害剤を含まない、実施形態１～２７のいずれか１つに記載のキット。

【0290】

２９．キットがプロテアーゼ阻害剤を更に含む、実施形態１～２８のいずれか１つに記載のキット。

【0291】

３０．プロテアーゼ阻害剤がシステインプロテアーゼ阻害剤又はセリンプロテアーゼ阻害剤である、実施形態２９に記載のキット。

【0292】

３１．安定化核酸集団がリボ核酸集団を含む、実施形態１～３０のいずれか１つに記載のキット。

【0293】

３２．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤の２種以上がマスターミックス中に提供される、実施形態１～３１のいずれか１つに記載のキット。

【0294】

３３．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤の３種全てがマスターミックス中に提供される、実施形態３２に記載のキット。

【0295】

３４．キットが溶解緩衝液を更に含む、実施形態１～３３のいずれか１つに記載のキット。

【0296】

３５．キットの１つ以上の成分が個別容器中に提供される、実施形態１～３４のいずれか１つに記載のキット。

【0297】

３６．生体細胞が哺乳動物細胞である、実施形態１～３５のいずれか１つに記載のキット。

【0298】

３７．生体細胞がヒト細胞である、実施形態１～３６のいずれか１つに記載のキット。

【0299】

３８．生体細胞が癌細胞である、実施形態１～３７のいずれか１つに記載のキット。

【0300】

３９．生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップを含む、生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法であって、接触が、核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、生体細胞が安定化生体細胞に変換される、方法。

【0301】

４０．生体細胞が、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のそれぞれに同時に接触される、実施形態３９に記載の方法。

【0302】

４１．少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、及び少なくとも１種の電子伝達鎖剤のそれぞれの存在下で安定化生体細胞を貯蔵することを更に含む、実施形態３９又は４０に記載の方法。

【0303】

４２．少なくとも８時間貯蔵するステップの、実施形態４１に記載の方法。

【0304】

４３．貯蔵ステップが０℃～４℃の温度で行われる、実施形態４１又は４２に記載の方法。

【0305】

４４．安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより安定化生体細胞を溶解させることを更に含む、実施形態３９～４３のいずれか１つに記載の方法。

【0306】

４５．溶解された安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含む、実施形態４４に記載の方法。

【0307】

４６．溶解ステップが、安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させる前に安定化生体細胞を洗浄することを更に含む、実施形態４４又は４５に記載の方法。

【0308】

４７．安定化溶解生体細胞から放出された核酸集団の少なくとも一部分から少なくとも１クラスの核酸を分析することを更に含む、実施形態４４～４６のいずれか１つに記載の方法。

【0309】

４８．分析が、少なくとも１クラスの核酸をシーケンスすることを含む、実施形態４７に記載の方法。

【0310】

４９．少なくとも１クラスの核酸がリボ核酸である、実施形態４８に記載の方法。

【0311】

５０．マイクロ流体デバイスのエンクロージャ内に生体細胞を配置するステップであって、エンクロージャがフロー領域と少なくとも１つのチャンバとを含み、少なくとも１つのチャンバがフロー領域に流体接続され、フロー領域及び少なくとも１つのチャンバが流体培地を閉じ込めるように構成される、ステップと、生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップであって、接触が、生体細胞の核酸集団を安定化させるのに十分な期間にわたり行われ、それにより、生体細胞が安定化生体細胞に変換される、ステップと、を含む、エンクロージャを含むマイクロ流体デバイス内の生体細胞中の核酸集団を安定化させる方法。

【0312】

５１．マイクロ流体デバイス内に生体細胞を配置することが、少なくとも１つのチャンバ内に生体細胞を配置することを含む、実施形態５０に記載の方法。

【0313】

５２．少なくとも１つのチャンバが、分離領域と分離領域をフロー領域に流体接続する接続領域とを有する隔離ペンを含み、分離領域及び接続領域が、培地の成分がフロー領域と隔離ペンの分離領域との間で実質的に拡散のみにより交換されるように構成される、実施形態５０又は５１に記載の方法。

【0314】

５３．少なくとも１つのチャンバ内に生体細胞を配置することが、隔離ペンの分離領域内に生体細胞を配置することを含む、実施形態５２に記載の方法。

【0315】

５４．少なくとも１つのチャンバ内に生体細胞を配置することが、誘電泳動力を用いて生体細胞を移動させることを更に含む、実施形態５３に記載の方法。

【0316】

５５．誘電泳動力が光学的に作動される、実施形態５４に記載の方法。

【0317】

５６．ある期間にわたり安定化生体細胞を貯蔵することを更に含む、実施形態５０～５５のいずれか１つに記載の方法。

【0318】

５７．貯蔵ステップが少なくとも８時間行われる、実施形態５６に記載の方法。

【0319】

５８．貯蔵ステップが０℃～４℃の温度で行われる、実施形態５６又は５７に記載の方法。

【0320】

５９．マイクロ流体デバイスから安定化生体細胞を搬出するステップを更に含む、実施形態５０～５８のいずれか１つに記載の方法。

【0321】

６０．安定化生体細胞を搬出するステップが、誘電泳動力を用いて生体細胞を移動させることを含む、実施形態５９に記載の方法。

【0322】

６１．誘電泳動力が光学的に作動される、実施形態６０に記載の方法。

【0323】

６２．安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させることにより安定化生体細胞を溶解させることを更に含む、実施形態５０～６１のいずれか１つに記載の方法。

【0324】

６３．溶解された安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分を分離することを更に含む、実施形態６２に記載の方法。

【0325】

６４．溶解ステップが、安定化生体細胞と溶解試薬とを接触させる前に安定化生体細胞を洗浄することを更に含む、実施形態６２又は６３に記載の方法。

【0326】

６５．溶解された安定化生体細胞から放出された安定化核酸集団の少なくとも一部分から少なくとも１クラスの核酸を分析することを更に含む、実施形態６３又は６４のいずれか１つに記載の方法。

【0327】

６６．分析が、少なくとも１クラスの核酸をシーケンスすることを含む、実施形態６５に記載の方法。

【0328】

６７．少なくとも１クラスの核酸がリボ核酸である、実施形態６５又は６６に記載の方法。

【0329】

６８．生体細胞が哺乳動物細胞である、実施形態３９～６７のいずれか１つに記載の方法。

【0330】

６９．生体細胞がヒト細胞である、実施形態３９～６８のいずれか１つに記載の方法。

【0331】

７０．生体細胞が癌細胞である、実施形態３９～６９のいずれか１つに記載の方法。

【0332】

７１．生体細胞が免疫細胞である、実施形態３９～７０のいずれか１つに記載の方法。

【0333】

７２．免疫細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、又はマクロファージである、実施形態７１に記載の方法。

【0334】

７３．エンクロージャ内に生体細胞を配置するステップが、誘電泳動力を用いて生体細胞を移動させることを含む、実施形態５０～７２のいずれか１つに記載の方法。

【0335】

７４．誘電泳動力が光学的に作動される、実施形態７３に記載の方法。

【0336】

７５．生体細胞と、少なくとも１種の不可逆タンパク質翻訳阻害剤、少なくとも１種のリボ核酸転写阻害剤、並びに電子伝達鎖阻害剤及び／又は電子伝達鎖デカップリング剤を含む少なくとも１種の電子伝達鎖剤と、を接触させるステップが、生体細胞と、実施形態１～３３のいずれか１つに記載のキットの１つ以上の成分と、を接触させることを含む、実施形態３９～７４のいずれか１つに記載の方法。

【0337】

上記の書面の明細書は、当業者による実施形態の実施を可能とするのに十分であると考えられる。以上の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、企図される最良形態を記載するが、例示にすぎない。しかし、以上の内容が本文でいかに詳細に見えても、実施形態は多くの方法で実施し得るので、添付の特許請求の範囲及び任意の均等物に従って解釈すべきであることは分かるであろう。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】