▶ アシムケム ライフ サイエンス （ティエンジン） カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-09
(45)【発行日】2022-02-18
(54)【発明の名称】トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20220210BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20220210BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220210BHJP
C12N 15/70 20060101ALI20220210BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220210BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220210BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220210BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220210BHJP
C12P 13/00 20060101ALI20220210BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54 ZNA
C12N9/10
C12N15/63 Z
C12N15/70 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/00
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2020515646
(86)(22)【出願日】2017-11-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-12-24
(86)【国際出願番号】 CN2017109500
(87)【国際公開番号】W WO2019084950
(87)【国際公開日】2019-05-09
【審査請求日】2020-04-15
(73)【特許権者】
【識別番号】519153028
【氏名又は名称】アシムケム ライフ サイエンス （ティエンジン） カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホン，ハオ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】ル，ジャンピン
(72)【発明者】
【氏名】ジャオ，シュエチェン
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，ナ
(72)【発明者】
【氏名】リ，ルイ
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，ケジャン
【審査官】市島 洋介
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１２／０２４１０４（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Accession: A0A1X0ITL2, Aminotransferase IV, Mycobacterium rhodesiae, [online], 2017.10.25, [2021.5.18検索], Database: UniProt, <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A1X0ITL2.txt?version=4>
【文献】Accession: A0A1Y5P4G5, Branched-chain amino acid aminotransferase/4-amino-4-deoxychorismate lyase, Mycobacterium sp., [online], 2017.10.25, [2021.5.18検索], Database: UniProt, <URL: https://www.uniprot.org/uniprot/A0A1Y5P4G5.txt?version=3>
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ ９／００－９／９９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トランスアミナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２１又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列である、
ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
【請求項2】
請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項3】
前記ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号５１又は配列番号５９に示される配列である、ことを特徴とする請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項4】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ分子を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
【請求項5】
ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である、ことを特徴とする請求項４に記載の組換えプラスミド。
【請求項6】
請求項４又は５に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
【請求項7】
前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含む、ことを特徴とする請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項8】
前記原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞であり、前記真核細胞は、酵母である、
ことを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項9】
ケトン系化合物からのキラルアミンの生産における請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
【請求項10】
トランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、前記トランスアミナーゼは、請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
【請求項11】
前記ケトン系化合物は、【化1】
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ケトン系化合物は、
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記アミノドナーは、イソプロピルアミンであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ技術分野に関し、具体的には、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
キラルアミンは、自然に幅広く存在しており、多くの重要な生体活性分子の構造単位でありながら、天然産物とキラル医薬品の合成に重要な中間体である。多くのキラルアミンは、１つ又は複数のキラル中心を含み、異なるキラル医薬品は、薬理学的活性、代謝プロセス、代謝レート及び毒性において有意差があり、一般的には、１種のエナンチオマーは有効であるが、ほかのエナンチオマーは、効果が低く又は無効であり、ひいては有毒である。従って、如何にキラル中心を含む化合物を効率的で、立体特異的に構築するかは、医薬品の研究開発において重要な意味を持っている。
【0003】
ω－トランスアミナーゼ（ω－ＴＡ）は、トランスフェラーゼ類に属し、その他のトランスアミナーゼ類と同様に、１つのアミノ基とケト基との間の交換プロセスを触媒する。ほとんどの場合に、ω－トランスアミナーゼは、１種類の酵素を意味し、ある酵素で触媒されるアミノ基転移反応においては、反応の基質又は生成物にα－アミノ酸が含まれない限り、該酵素をω－トランスアミナーゼと呼ぶことができる。ω－トランスアミナーゼは、ケトン系化合物を原料として、立体特異的なアミノ基転移作用により、キラルアミンを効率よく生産できる。その基質が相対的に安く、生成物の純度が高いという特徴により、研究者からますます注目されている（Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,２０１７,１９（２）：３３３－３６０．）。
【0004】
しかしながら、野生型のトランスアミナーゼは、基質耐性が低く、活性が低く、安定性が低いなどの欠陥が存在することが多く、産業用アプリケーションと大きな距離がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、従来技術における野生型のトランスアミナーゼが工業化生産に適用されないという技術的課題を解決するために、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を提供することを主旨とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上記目的を達成するために、本発明の一態様によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供している。該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得られたアミノ酸配列であり、突然変異は、少なくとも、第１９位、第４１位、第４３位、第７２位、第７６位、第９２位、第１０７位、第１２５位、第１３２位、第２２６位、第２９２位、第２９５位、第３０８位、第３３２位の突然変異部位の１つを含み、且つ第１９位がセリンに突然変異し、第４１位がセリンに突然変異し、第４３位がアスパラギンに突然変異し、第７２位のグリシンがロイシンに突然変異し、第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第９２位のリジンがグリシンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し、第２９２位のバリンがシステインに突然変異し、第２９５位のアラニンがグリシンに突然変異し、第３０８位がセリンに突然変異し、第３３２位がセリンに突然変異し、又はトランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
【0007】
さらに、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列であり、又は、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
【0008】
本発明の他の態様によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体をコードする。
【0009】
さらに、ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０に示される配列であり、又は、ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０と９５％以上の相同性を有する配列である。
【0010】
本発明の一態様によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記いずれか１種のＤＮＡ分子を含有する。
【0011】
さらに、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である。
【0012】
本発明の一態様によれば、宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する。
【0013】
さらに、宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含み、好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５ａ形質転換受容性細胞である。
【0014】
本発明の一態様によれば、キラルアミンの生産方法を提供している。該方法は、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体であるトランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーに対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含む。
【0015】
前記ケトン系化合物は、
であり、ここでは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又は、Ｒ１とＲ２とは、カルボニル基上の炭素と共にＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５～Ｃ１０複素環式基とＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基におけるヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１種であり、前記Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基で置換されており、好ましくは、前記ケトン系化合物は、
又は
であり、アミノ基転移反応生成物は、
又は
であり、より好ましくは、ケトン系化合物は、
であり、アミノ基転移反応生成物は、
であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミンである。
【化1】
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【0016】
本発明の上記トランスアミナーゼ突然変異体は、配列番号１に示されるトランスアミナーゼを基礎として、部位特異的な突然変異の方法によって突然変異することによって、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質の構造及び機能を変化させることを実現し、さらに標的スクリーニングの方法によって、上記突然変異部位を有するトランスアミナーゼを得る。本発明のトランスアミナーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に向上するという利点を有し、その酵素活性がトランスアミナーゼの母本に比べて数倍向上され、且つ酵素特異性もその分向上され、それによりキラルアミンの工業的生産コストを大幅に削減させた。
【発明を実施するための形態】
【0017】
なお、衝突しない限り、本願の実施例及び実施例の特徴は、互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照しながら、本発明を詳細に説明する。
【0018】
放線菌Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．に由来のアミノトランスフェラーゼ（アミノ基転移酵素とも呼ばれる）は、
を
への変換を高選択的に触媒できるが、その活性が低く、安定性が悪く、反応時に添加する酵素量が多い。本発明の発明者は、指向性進化方法によりＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．に由来のアミノトランスフェラーゼの活性及び安定性を向上し、酵素の使用量を低減させる。まず、全プラスミドＰＣＲの方式でＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．に由来のアミノトランスフェラーゼに突然変異部位を導入して、突然変異体に対して活性及び安定性の検出を行い、活性又は安定性が向上された突然変異体を選択する。
【化10】
【化11】
【0019】
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．に由来のアミノトランスフェラーゼをテンプレートとして、５３対の部位特異的な突然変異プライマー（Ｐ１９Ｓ、Ｆ７１Ｙ、Ｇ７２Ｙ、Ｇ７２Ｌ、Ｈ７３Ｔ、Ｌ７６Ａ、Ｌ７６Ｖ、Ｖ８０Ｔ、Ｋ９２Ｇ、Ｋ９２Ｄ、Ｌ１０５Ｉ、Ｌ１０５Ｍ、Ｌ１０７Ｉ、Ｆ１３３Ｍ、Ｎ１３５Ｔ、Ｎ１３５Ｓ、Ｔ１３７Ｓ、Ｇ１４７Ｆ、Ｙ１６１Ｓ、Ｉ１６３Ｃ、Ｉ１６３Ｖ、Ａ１８０Ｌ、Ｓ２１０Ｉ、Ｓ２１０Ｖ、Ｔ２２０Ｌ、Ｔ２２０Ａ、Ａ２２６Ｃ、Ａ２２６Ｇ、Ｎ２２８Ｇ、Ｐ２３４Ｓ、Ｓ２８０Ｌ、Ｙ２８４Ｌ、Ｔ２９３Ｓ、Ａ２９５Ｇ、Ｐ３０８Ｓ、Ｖ３１７Ｉ、Ｐ３３２Ｓ、Ｖ３１Ｙ、Ｅ４１Ｓ、Ｓ４３Ｎ、Ｇ１０１Ｓ、Ｋ１２１Ｖ、Ｒ１２２Ｄ、Ｃ１２３Ｍ、Ｓ１２５Ａ、Ｓ１３２Ａ、Ｓ１５６Ｎ、Ｈ１８５Ｔ、Ａ２０８Ｒ、Ｋ２４５Ｖ、Ｌ２６０Ｋ、Ｆ２７３Ｖ、Ｖ２９２Ｃ）を設計しており、部位特異的な突然変異手段を用いて、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）を発現ベクターとして、標的遺伝子を持っている突然変異プラスミドを取得する。
【0020】
ここでは、部位特異的な突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法で標的ＤＮＡ断片（ゲノムであってもよいし、プラスミドであってもよい）に、塩基の添加、削除、部位突然変異などを含む所望の変化（一般的には、有利な方向への変化を表徴する）を導入することを指す。部位特異的な突然変異は、ＤＮＡで発現された標的タンパク質の性状及び表徴を迅速で効率的に向上させることができ、遺伝子研究において非常に有用な方法である。
【0021】
全プラスミドＰＣＲで部位特異的な突然変異を導入する手段は、簡単かつ効率的であり、現在多く使われている手段である。その原理は、突然変異部位を含む一対のプライマー（フォワード、リバース）と、テンプレートプラスミドとをアニーリングした後、ポリメラーゼで「サイクル伸長」することである。いわゆるサイクル伸長とは、ポリメラーゼでテンプレートに従ってプライマーが伸長し、１回り伸長させた後、ポリメラーゼがプライマーの５’端に戻って伸長が終止し、さらに、加熱、アニール、伸長というサイクルを繰り返すことを経ることを指す。この反応は、ローリングサークル増幅とは異なり、複数のタンデムコピーを形成することがない。フォワードのプライマーの伸長生成物とリバースのプライマーの伸長生成物とがアニーリングされた後に、切れ込みを有する開環状プラスミドとなるようにペアリングする。ＤｐｎIで伸長生成物を酵素消化し、元のテンプレートプラスミドが通常の大腸菌に由来し、ｄａｍメチル化で修飾されているので、ＤｐｎIに高感受性で切断されやすく、一方、生体外で合成した突然変異配列を有するプラスミドは、メチル化されていないので、切られておらず、従って、それ以降の形質転換において形質転換に成功にし、突然変異プラスミドのクローンが得られ可能である。
【0022】
上記突然変異プラスミドを大腸菌細胞に形質転換し、大腸菌で過剰発現させる。次に、超音波細胞破砕方法で粗酵素を取得する。トランスアミナーゼ誘導発現の最適な条件は、２５℃で、０．１ｍＭのＩＰＴＧにより一晩誘導することである。
【0023】
ソフトウェアを用いてトランスアミナーゼの三次元構造に対してコンピュータシミュレート分析を行った結果、Ｇ７２Ｌが活性ポケットの近傍に位置し、且つタンパク質二量化体の界面近傍に位置し、従って、タンパク質二量体の結合能力を強化させ、タンパク質をより安定化させる。Ｖ２９２Ｃが補因子ＰＬＰの結合領域にあるため、ＰＬＰの結合能力を強化させる可能性がある。Ａ２２６Ｇ、Ａ２９５Ｇが基質結合ポケットの近傍にあるため、基質の向き方向に影響を与え、触媒効率を強化させる可能性がある。
【0024】
本発明の典型的な実施形態によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供する。該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得られたアミノ酸配列であり、突然変異は、第１９位、第４１位、第４３位、第７２位、第７６位、第９２位、第１０７位、第１２５位、第１３２位、第２２６位、第２９２位、第２９５位、第３０８位、第３３２位の突然変異部位の少なくとも１つを含み、且つ第１９位がセリンに突然変異し、第４１位がセリンに突然変異し、第４３位がアスパラギンに突然変異し、第７２位のグリシンがロイシンに突然変異し、第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第９２位のリジンがグリシンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し、第２９２位のバリンがシステインに突然変異し、第２９５位のアラニンがグリシンに突然変異し、第３０８位がセリンに突然変異し、第３３２位がセリンに突然変異し、又は、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、突然変異したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
【0025】
本明細書で用いられる用語「相同性」とは、本分野における公知の意味を有し、当業者にとっては、異なる配列間の相同性を測定する規則、標準も知られている。本発明では、異なる程度の相同性で限定される配列は、改良したトランスアミナーゼ活性を兼ねる必要がある。当業者は、本願で開示される内容の教示でトランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は上記突然変異したアミノ酸配列における突然変異部位を有し、且つ突然変異したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を取得することができる。
【0026】
好ましくは、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列であり、又はトランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
【0027】
本明細書で用いられる用語「相同性」は、本分野における公知の意味を有し、当業者にとっては、異なる配列間の相同性を測定する規則、標準も知られている。本発明では、異なる程度の相同性で限定される配列は、改良したトランスアミナーゼ活性を兼ねる必要がある。上記実施形態では、好ましくは、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又はＳＥＱＩＤ ＮＯ：３０と９５％以上の相同性を有し、また、改良したトランスアミナーゼ活性を有するアミノ酸配列を有しまたはコードする。当業者は、本願で開示される内容の教示で、このような突然変異体配列を取得できる。
【0028】
本発明の上記トランスアミナーゼ突然変異体は、配列番号１（コードするＤＮＡは、配列番号３１である）に示されるトランスアミナーゼを基礎として、部位特異的な突然変異の方法によって突然変異することによって、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造と機能を変化させることを実現し、さらに標的スクリーニングの方法によって、上記突然変異部位を有するトランスアミナーゼを得る。本発明のトランスアミナーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に向上するという利点を有し、その酵素活性がトランスアミナーゼの母本に比べて６倍向上され、且つ酵素特異性もその分向上され、それにより、キラルアミンの工業的生産のコストを大幅に削減させた。
【0029】
本発明の典型的な実施形態によれば、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．に由来のトランスアミナーゼでは、第７２位のグリシンがロイシンに突然変異し；又は第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し；又は第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し；又は第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し；又は第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し；又は第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、及び第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し；又は第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、及び第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し；又は第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、及び第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し；又は第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、及び第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異する。
【0030】
本発明の典型的な実施形態によれば、ＤＮＡ分子を提供する。該ＤＮＡ分子は、上記トランスアミナーゼ突然変異体をコードする。好ましくは、ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０に示される配列であり、又はＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０と９５％以上の相同性を有する配列である。上記ＤＮＡでコードして得られたトランスアミナーゼは、酵素活性及び酵素の安定性を向上させ、キラルアミンの工業生産中において加える酵素量を減少させ、後処理の難度を軽減させることができる。
【0031】
本発明の上記ＤＮＡ分子は、「発現カセット」の形態として存在してもよい。「発現カセット」は、線状又は環状の核酸分子を意味し、特定のヌクレオチド配列の適切な宿主細胞の中での発現を指導可能なＤＮＡ及びＲＮＡ配列を含む。一般的には、標的ヌクレオチドに効果的に連結され、非強制的には終止信号及び／又はその他の制御素子に効果的に連結されたプロモータを含む。発現カセットは、さらに、ヌクレオチド配列が正確に翻訳されるのに所要の配列を含んでもよい。コード領域は、一般的に、標的タンパク質をコードするが、センス又はアンチセンス方向において標的機能ＲＮＡ、たとえばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡもコードする。標的ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、キメラとは、少なくとも１つの成分が少なくとも１つの他の成分と異種であることを意味する。発現カセットは、天然に存在してもよいが、異種発現のための有効組換えにより得られる。
【0032】
本発明の典型的な実施形態によれば、組換えプラスミドを提供する。該組換えプラスミドは、上記いずれか１種のＤＮＡ分子を含有する。上記組換えプラスミドのＤＮＡ分子は、組換えプラスミドの適切な位置に配置されたところ、上記ＤＮＡ分子がコピー、転写又は発現を正確で順調に行うことができる。
【0033】
本発明では、上記ＤＮＡ分子を限定するときに、「含有」という単語を用いるが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関係がない他の配列を任意に加えることができるわけではない。当業者にとっては、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に適切な制限エンドヌクレアーゼの酵素切断サイトを加え、又は開始コドン、停止コドンなどを余分に増加する必要があり、従って、密閉式表現で限定すると、これらの状況を確実にカバーすることができない。
【0034】
本発明に用いられる用語「プラスミド」は、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形態の任意のプラスミド、コスミド、ファージ又は、アグロバクテリウムの二元核酸分子を含み、好ましくは、組換え発現プラスミドであり、原核発現プラスミドであってもよいし、真核発現プラスミドであってもよいが、原核発現プラスミドが好適であり、いくつかの実施態様では、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９から選択される。より好ましくは、上記組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
【0035】
本発明の典型的な実施形態によれば、上記いずれか１種の組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。本発明に適用できる宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含むが、これらに限られない。好ましくは、原核細胞は、真正細菌、たとえばグラム陰性菌又はグラム陽性菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は、大腸菌ＤＨ５ａ形質転換受容性細胞である。
【0036】
本発明の典型的な実施形態によれば、キラルアミンの生産方法を提供する。該方法は、上記いずれか１種のトランスアミナーゼ突然変異体であるトランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーに対してアミノ基転移反応を触媒するステップを含む。本発明の上記トランスアミナーゼ突然変異体がより高い酵素触媒活性を有するため、本発明のトランスアミナーゼ突然変異体で製造されるキラルアミンは、生産コストを削減できるだけではなく、得られたキラルアミンは、ｅｅ値が９９％より大きく、ｄｅ値が９８％である。
【0037】
本発明の典型的な実施形態によれば、前記ケトン系化合物は、
であり、ここでは、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又はＲ１とＲ２とは、カルボニル基上の炭素と共にＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５～Ｃ１０複素環式基とＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基におけるヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１種であり、前記Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基で置換されており、好ましくは、前記ケトン系化合物は、
又は
であり、アミノ基転移反応生成物は、
又は
であり、より好ましくは、ケトン系化合物は、
であり、アミノ基転移反応生成物は、
であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミンである。
【化12】
【化13】
【化14】
【化15】
【化16】
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【0038】
以下、実施例を参照しながら本発明の有益な効果をさらに説明する。
【0039】
当業者に知られるように、本発明の精神を逸脱しない限り、本発明に対して様々な修正を行うことができ、このような修正も本発明の範囲に落ちる。また、下記実験方法は、特に指定がない限り、いずれも従来の方法であり、用いられた実験材料は、特に指定がない限り、いずれも商業会社から簡単に入手できる。
【0040】
下記実施例で言及される主原料は、以下のとおりである。
主原料１：（Ｓ）－２－メチル－４－オキソピペリジン－１－ｔ－ブチルカルボキシレート（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ（２Ｓ）－２－ｍｅｔｈｙ１－４－ｏｘｏｐｉｐｅｒｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＣＡＳ ７９０６６７－４３－５。
【化21】
主原料１：（Ｓ）－２－メチル－４－オキソピペリジン－１－ｔ－ブチルカルボキシレート（ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ（２Ｓ）－２－ｍｅｔｈｙ１－４－ｏｘｏｐｉｐｅｒｄｉｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＣＡＳ ７９０６６７－４３－５。
【0041】
【化22】
【0042】
【化23】
【0043】
実施例１
１０ｍＬの反応フラスコにおいて、４０ｍｇのイソプロピルアミンを１ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、１２０ｍｇの配列番号１トランスアミナーゼを加え、０．４ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ０．２ｍＬに溶解した４０ｍｇの
を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で１６ｈ撹拌した。ＧＣ検出により体系の変換率を検出した。上記ステップに従って順に配列番号配列番号１３～２６の突然変異体トランスアミナーゼで反応したデータを以下の表１に示した。
１０ｍＬの反応フラスコにおいて、４０ｍｇのイソプロピルアミンを１ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、１２０ｍｇの配列番号１トランスアミナーゼを加え、０．４ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ０．２ｍＬに溶解した４０ｍｇの
【化24】
【0044】
【表1】
【0045】
ここでは、１６ｈは、１６ｈの反応を指し、パーセンテージは、変換率であり、２ｗｔは、加える酵素の重量が基質の重量の２倍であることを指す。
【0046】
単一部位突然変異体の変換効果は、母本よりも向上したが、理想的な効果が得られなかった。
【0047】
実施例２
一般的には、単一部位突然変異による突然変異体の性能は、母本と大きな差がある可能性が低く、突然変異部位の組み合わせにより、より優れた突然変異体が得られ可能である。従って、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇの方法によって突然変異部位をランダムに組換え、突然変異ライブラリーを構築し、次に、より優れた突然変異体を取得するように、スクリーニングした。
一般的には、単一部位突然変異による突然変異体の性能は、母本と大きな差がある可能性が低く、突然変異部位の組み合わせにより、より優れた突然変異体が得られ可能である。従って、ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇの方法によって突然変異部位をランダムに組換え、突然変異ライブラリーを構築し、次に、より優れた突然変異体を取得するように、スクリーニングした。
【0048】
ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇは、遺伝子の分子レベルでの有性組み換えである。１群の相同遺伝子をヌクレアーゼＩで消化してランダム断片にし、これらのランダム断片からライブラリーを構築し、互いにプライマーとテンプレートとしてＰＣＲ増幅を行った。１つ遺伝子コピー断片が他の遺伝子コピーのプライマーとなると、テンプレート交換及び遺伝子組換えが発生した。
【0049】
酵素液の調製方法：９６ウェルプレートを遠心して上清培地を除去し、各ウェルに２００μｌの酵素分解溶液（リゾチーム２ｍｇ／ｍＬ、ポリミキシン０．５ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ＝７．０）を加え、３７℃で３ｈ保温しながら破砕した。
【0050】
ハイスループットスクリーニング方法：
２５０μＬの活性測定系：
の最終濃度は０．２７ｍｇ／ｍＬ、４－ニトロフェニルエチルアミン塩酸塩の最終濃度は１２．２４ｍｇ／ｍＬ、ＰＬＰの最終濃度は０．０１ｍｇ／ｍＬ、破砕酵素液の添加量は４５μＬ、ｐＨ＝８．０、温度は３０℃である。
２５０μＬの活性測定系：
【化25】
【0051】
スクリーニングして得られた突然変異体に対して振盪フラスコ培養を行い、次に増幅反応を行った。
【0052】
トランスアミナーゼ誘導発現の最適な条件：２５℃で、０．１ｍＭのＩＰＴＧにより一晩誘導する。
【0053】
配列番号１及び製造された多部位突然変異体配列番号２～１２及び２７～３０を、以下のように反応させた。
【0054】
１０ｍＬの反応フラスコにおいて、４０ｍｇのイソプロピルアミンを１ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、４０ｍｇのトランスアミナーゼ、０．４ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合した後、ＤＭＳＯ ０．２ｍＬに溶解した４０ｍｇの主原料１を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で１６ｈ～６４ｈ撹拌した。ＧＣ検出により体系の変換率を検出し、突然変異体の反応データを以下の表２に示した。
【0055】
【表2】
【0056】
実施例３
２つのトランスアミナーゼ配列番号１をそれぞれ４０ｍｇ用意し、一つを４℃で２ｈ放置し、もう１つを５０℃で２ｈ保温し、次に以下の体系のように反応させた。
２つのトランスアミナーゼ配列番号１をそれぞれ４０ｍｇ用意し、一つを４℃で２ｈ放置し、もう１つを５０℃で２ｈ保温し、次に以下の体系のように反応させた。
【0057】
１０ｍＬの反応フラスコにおいて、４０ｍｇのイソプロピルアミンを１ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、４０ｍｇの配列番号７トランスアミナーゼ、０．４ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合した後、ＤＭＳＯ ０．２ｍＬに溶解した４０ｍｇの主原料１を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で１６ｈ撹拌した。
【0058】
ＧＣ検出により体系の変換率を検出し、突然変異体安定性は、５０℃で保温したトランスアミナーゼの変換率が、４℃で保温したトランスアミナーゼの変換率に占める百分率として示される。
【0059】
配列番号１～３０の安定性データは、以下の表３に示される。
【0060】
【表3】
【0061】
実施例４
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．４ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料１を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９８．２％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．６２ｇの製品を得て、収率は９０．２％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．４ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料１を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９８．２％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．６２ｇの製品を得て、収率は９０．２％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
【0062】
上記ステップに従って順に行われた、配列番号配列番号６、７、１０、１２の突然変異体トランスアミナーゼで反応したデータを、以下の表４に示した。
【0063】
【表4】
【0064】
実施例５
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．４ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料２を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９９．１％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．７５ｇの製品を得て、収率は９３．８％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．４ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料２を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９９．１％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．７５ｇの製品を得て、収率は９３．８％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
【0065】
実施例６
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．２ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料３を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９９．５％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．７９ｇの製品を得て、収率は９４．８％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
１０００ｍＬの反応フラスコにおいて、４ｇのイソプロピルアミンを１００ｍＬの０．２Ｍのリン酸塩緩衝液に加え、ｐＨを７．０～７．５に調整し、凍結乾燥粉質量が０．２ｇの配列番号７トランスアミナーゼ、４０ｍｇのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、ＤＭＳＯ ２０ｍＬに溶解した４ｇの主原料３を滴下し、体系のｐＨを７．０～７．５にし、３５℃±３℃の恒温で６４ｈ撹拌した。ＨＰＬＣで検出したところ、変換率は、９９．５％であり、反応終了後、１００ｍＬの酢酸エチルを加えて３回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、３．７９ｇの製品を得て、収率は９４．８％、ｅ．ｅ．値は９９％であった。
【0066】
以上の説明からわかるように、本発明の上記実施例は、以下の技術的効果を実現した。本発明の上記トランスアミナーゼ突然変異体は、配列番号１に示されるトランスアミナーゼを基礎として、部位特異的な突然変異の方法によって突然変異することによって、そのアミノ酸配列を変え、タンパク質構造及び機能を変えることを実現し、さらに標的スクリーニングの方法によって、上記突然変異部位を有するトランスアミナーゼを得る。本発明のトランスアミナーゼ突然変異体は、酵素活性が大幅に向上するという利点を有し、その酵素特異性もその分向上され、それにより、キラルアミンの工業的生産のコストを大幅に削減させた。
【0067】
以上は、本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとっては、本発明は様々な変更や変化が可能である。本発明の精神及び原則を逸脱しない限り、行われた任意の修正、等価置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］トランスアミナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得られたアミノ酸配列であり、前記突然変異は、第７２位、第７６位、第９２位、第１０７位、第１２５位、第１３２位、第２２６位、第２９２位、第２９５位、第３０８位及び第３３２位の突然変異部位の少なくとも１つを含み、且つ第１９位がセリンに突然変異し、第４１位がセリンに突然変異し、第４３位がアスパラギンに突然変異し、前記第７２位のグリシンがロイシンに突然変異し、第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第９２位のリジンがグリシンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し、第２９２位のバリンがシステインに突然変異し、第２９５位のアラニンがグリシンに突然変異し、第３０８位がセリンに突然変異し、第３３２位がセリンに突然変異し、又は、アミノ酸配列は、前記突然変異したアミノ酸配列中の前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
［実施形態２］アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列であり、又は
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とする実施形態１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
［実施形態３］実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
［実施形態４］前記ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０に示される配列であり、又は
前記ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０と９５％以上の相同性を有する配列である、
ことを特徴とする実施形態３に記載のＤＮＡ分子。
［実施形態５］実施形態３又は４に記載のＤＮＡ分子を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
［実施形態６］ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である、
ことを特徴とする実施形態５に記載の組換えプラスミド。
［実施形態７］実施形態５又は６に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
［実施形態８］前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含み、好ましくは、前記原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞である、
ことを特徴とする実施形態７に記載の宿主細胞。
［実施形態９］ケトン系化合物からのキラルアミンの生産における実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
［実施形態１０］トランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、
前記トランスアミナーゼは、実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
［実施形態１１］前記ケトン系化合物は、
であり、ここでは、Ｒ
１
とＲ
２
は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ５～Ｃ１０アリール基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基であり、又はＲ
１
とＲ
２
とは、カルボニル基上の炭素と共にＣ５～Ｃ１０複素環式基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基を形成し、前記Ｃ５～Ｃ１０複素環式基とＣ５～Ｃ１０ヘテロアリール基におけるヘテロ原子は、それぞれ独立して、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１種であり、前記Ｃ５～Ｃ１０アリール基のうちのアリール基、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロアリール基のうちのヘテロアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基のうちの炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環式基のうちの複素環式基は、それぞれ独立して置換されていないか又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つの基によって置換されており、好ましくは、前記ケトン系化合物は、
又は
であり、アミノ基転移反応生成物は、
又は
であり、より好ましくは、ケトン系化合物は、
であり、アミノ基転移反応生成物は、
であり、好ましくは、アミノドナーは、イソプロピルアミンである
ことを特徴とする実施形態１０に記載の方法。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］トランスアミナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列が突然変異して得られたアミノ酸配列であり、前記突然変異は、第７２位、第７６位、第９２位、第１０７位、第１２５位、第１３２位、第２２６位、第２９２位、第２９５位、第３０８位及び第３３２位の突然変異部位の少なくとも１つを含み、且つ第１９位がセリンに突然変異し、第４１位がセリンに突然変異し、第４３位がアスパラギンに突然変異し、前記第７２位のグリシンがロイシンに突然変異し、第７６位のロイシンがアラニンに突然変異し、第９２位のリジンがグリシンに突然変異し、第１０７位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第１２５位のセリンがアラニンに突然変異し、第１３２位のセリンがアラニンに突然変異し、第２２６位のアラニンがグリシンに突然変異し、第２９２位のバリンがシステインに突然変異し、第２９５位のアラニンがグリシンに突然変異し、第３０８位がセリンに突然変異し、第３３２位がセリンに突然変異し、又は、アミノ酸配列は、前記突然変異したアミノ酸配列中の前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異したアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
［実施形態２］アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列であり、又は
アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とする実施形態１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
［実施形態３］実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするＤＮＡ分子。
［実施形態４］前記ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０に示される配列であり、又は
前記ＤＮＡ分子の配列は、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９又は配列番号６０と９５％以上の相同性を有する配列である、
ことを特徴とする実施形態３に記載のＤＮＡ分子。
［実施形態５］実施形態３又は４に記載のＤＮＡ分子を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
［実施形態６］ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９である、
ことを特徴とする実施形態５に記載の組換えプラスミド。
［実施形態７］実施形態５又は６に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
［実施形態８］前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含み、好ましくは、前記原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５α形質転換受容性細胞である、
ことを特徴とする実施形態７に記載の宿主細胞。
［実施形態９］ケトン系化合物からのキラルアミンの生産における実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
［実施形態１０］トランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、
前記トランスアミナーゼは、実施形態１又は２に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
［実施形態１１］前記ケトン系化合物は、
【化26】
【化27】
【化28】
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【化34】
ことを特徴とする実施形態１０に記載の方法。
【配列表】