ホーム > 特許ランキング > ＳＢＩファーマ株式会社
特許7026108ＡＬＡ－ＰＤＴ又はＡＬＡ－ＰＤＤにおける光線力学的効果の増強剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-16
(45)【発行日】2022-02-25
(54)【発明の名称】ＡＬＡ－ＰＤＴ又はＡＬＡ－ＰＤＤにおける光線力学的効果の増強剤
(51)【国際特許分類】
A61K 41/00 20200101AFI20220217BHJP
A61K 31/197 20060101ALI20220217BHJP
A61K 31/14 20060101ALI20220217BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220217BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220217BHJP
【ＦＩ】
A61K41/00
A61K31/197
A61K31/14
A61P43/00 121
A61P35/00
【請求項の数】
4
(21)【出願番号】P 2019513593
(86)(22)【出願日】2018-04-12
(86)【国際出願番号】 JP2018015363
(87)【国際公開番号】W WO2018193958
(87)【国際公開日】2018-10-25
【審査請求日】2020-12-11
(31)【優先権主張番号】P 2017082167
(32)【優先日】2017-04-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】508123858
【氏名又は名称】ＳＢＩファーマ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】石塚 昌宏
(72)【発明者】
【氏名】石井 琢也
(72)【発明者】
【氏名】中島 元夫
(72)【発明者】
【氏名】北嶋 勇也
【審査官】鳥居 敬司
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５３６３２７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１３／１８７０６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】JOSHI, S. et al.，Dynamin inhibitors induce caspase-mediated apoptosis following cytokinesis failure in human cancer c，Mol. Cancer, 2011, Vol. 10, No. 78, pp. 1-12
【文献】DEFEO-JONES, D. et al.，Tumor cell sensitization to apoptotic stimuli by selective inhibition of specific Akt/PKB family mem，Mol. Cancer Ther., 2005, Vol. 4, No. 2, pp. 271-279
【文献】RODRIGUEZ, L. et al.，Mechanisms of 5-aminolevulic acid ester uptake in mammalian cells，Br. J. Pharmacol., 2006, Vol. 147, pp. 825-833
【文献】TRAN, T. T. et al.，Neurotransmitter Transporter Family Including SLC6A6 and SLC6A13 Contributes to the 5-Aminolevulinic，Photochem. Photobiol., 2014, Vol. 90, pp. 1136-1143
【文献】Oncology Reports, 2013, Vol.29, pp.911-916
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４１／００－４１／１７
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｐ ４３／００
Ａ６１Ｐ ３５／００－３５／０４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、（Ａ）５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、ＡＬＡヘキシルエステル、ＡＬＡヘプチルエステル、または、ＡＬＡオクチルエステルと、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
を含み、
前記ダイナミン阻害剤は、以下の式（II）で示される化合物、または、以下の式（III）で示される化合物である
【化1】
【化2】
医薬。
【請求項2】
光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための、同時又は異時に投与される、組み合わせ医薬であって、（Ａ）５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、ＡＬＡヘキシルエステル、ＡＬＡヘプチルエステル、または、ＡＬＡオクチルエステルと、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
の組み合わせ医薬であり、
前記ダイナミン阻害剤は、以下の式（II）で示される化合物、または、以下の式（III）で示される化合物である
【化3】
【化4】
医薬。
【請求項3】
光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、前記医薬は、５－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）またはその塩、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル、ＡＬＡヘキシルエステル、ＡＬＡヘプチルエステル、または、ＡＬＡオクチルエステル、
を含み、
前記医薬は、ダイナミン阻害剤と併用されることを特徴とし、
前記ダイナミン阻害剤は、以下の式（II）で示される化合物、または、以下の式（III）で示される化合物である
【化5】
【化6】
【請求項4】
請求項２に記載の組み合わせ医薬であって、前記（Ａ）と前記（Ｂ）とが、キットとして準備されることを特徴とする、
医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、光線力学的治療（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）または光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ＰＤＤと略す）における光線力学的効果の増強剤に関する。
【背景技術】
【0002】
抗がん剤治療や放射線療法とは異なるがん治療の選択肢の１つとして、光線力学的治療（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ；ＰＤＴ）が挙げられる。ＰＤＴによるがん治療は、がん細胞に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、がん組織に特定の波長の光を照射することによりがんの治療を行う治療方法であり、低侵襲かつ治療跡が残りにくい治療法であるため、近年注目を集めている。
【0003】
また、近年、がん、イボ、ニキビのような疾患組織の診断方法として、光線力学的診断（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ＰＤＤ）が注目されている。ＰＤＤは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、特定の波長の光を照射することにより標的箇所の特定を行う診断方法であり、これまでの診断法と比較して、低侵襲で副作用が少ないため、患者に対する負担が少ないという利点がある。
【0004】
上述のとおり、ＰＤＴやＰＤＤにおいては、治療または検出の対象となる組織に集積する性質をもつ、光に反応する化合物（光増感剤）を利用する。ＰＤＴやＰＤＤにおいて好適に用いられる光増感剤については、様々なものが検討されているが、近年、ポルフィリンの前駆物質であり、生体物質である５－アミノレブリン酸類（本明細書において、「ＡＬＡ類」ともいう）を対象に投与し、ＰＤＴまたはＰＤＤと組み合わせる、「ＡＬＡ－ＰＤＴ」または「ＡＬＡ－ＰＤＤ」が注目されている（例えば、特許文献１）。
【0005】
ＡＬＡ類それ自体には光感受性はないものの、ＡＬＡ類は、細胞内で、ヘム生合成経路の一連の酵素群により代謝活性化されてポルフィリン（主としてプロトポルフィリンＩＸ（ＰｐＩＸ））となる。ポルフィリン類は腫瘍細胞に取り込まれて蓄積される性質を有し、また、ＰｐＩＸは、４１０ｎｍ、５１０ｎｍ、５４５ｎｍ、５８０ｎｍ、６３０ｎｍ等にピークを有する光増感剤であるため、ＰＤＴまたはＰＤＤに利用することができる。ＡＬＡは生体内で代謝され、４８時間以内に排泄されるため、全身の光感受性にはほとんど影響しないという特徴がある。
【0006】
しかし、がんの細胞種や悪性度によっては、ＰｐＩＸ等のポルフィリンを基質とするＡＢＣトランスポーターファミリーの一つであるＡＢＣＧ２が高発現することによりＰｐＩＸが細胞質へ排出され、ＰｐＩＸが十分に蓄積しない細胞があることが確認されている（例えば、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特開平１１－１２１９７号公報
【非特許文献】
【0008】
【文献】Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２２（６）：４２８‐４４０（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
これまで、ＡＬＡ－ＰＤＴやＡＬＡ－ＰＤＤにおける光線力学的効果を増強させるために、ＡＢＣＧ２阻害剤を併用する方法や、ＡＢＣＧ２トランスポーターの基質である抗がん剤を併用する方法が検討されている。しかし、すべてがん細胞において、必ずしもＡＢＣＧ２の高発現が認められるというわけではなく、がん細胞の中には、逆にＡＢＣＧ２の発現が低いものも存在し、ＡＢＣＧ２の阻害のみによる細胞内ＰｐＩＸの蓄積増強には限界あると考えられている。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、細胞のＰｐＩＸ蓄積量を増加させる物質を鋭意検討した結果、ダイナミン阻害剤とＡＬＡ類とを併用することにより、ほとんどのがん細胞において、ＡＬＡ類を単独で適用した場合と比較して、ＰｐＩＸの蓄積量が増加することを見出した。さらに本発明者らは、特に、ダイナミンのプレクストリン相同ドメインを標的とする阻害剤が、ＡＬＡ類適用時の細胞内ＰｐＩＸ蓄積量の増加に有用であることを見出した。
【0011】
すなわち本発明は、一実施形態において、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩と、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
を含むことを特徴とする、
医薬に関する。
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化1】
又はその塩と、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
を含むことを特徴とする、
医薬に関する。
【0012】
また、本発明は、一実施形態において、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための、同時又は異時に投与される、組み合わせ医薬であって、
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩と、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
の組み合わせ医薬に関する。
（Ａ）下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化2】
又はその塩と、
（Ｂ）ダイナミン阻害剤と
の組み合わせ医薬に関する。
【0013】
また、本発明は、一実施形態において、光線力学的治療又は光線力学的診断における、光線力学的反応を増強させるための医薬であって、
前記医薬は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩、
を含み、
前記医薬は、ダイナミン阻害剤と併用されることを特徴とする、
医薬に関する。
前記医薬は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
【化3】
又はその塩、
を含み、
前記医薬は、ダイナミン阻害剤と併用されることを特徴とする、
医薬に関する。
【0014】
また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、Ｒ１が、水素原子、炭素数１～８のアルカノイル基、及び、炭素数７～１４のアロイル基からなる群から選択され、Ｒ２が、水素原子、直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基、炭素数３～８のシクロアルキル基、炭素数６～１４のアリール基、及び、炭素数７～１５のアラルキル基からなる群から選択されることを特徴とする。
【0015】
また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、Ｒ１及びＲ２が、水素原子であることを特徴とする。
【0016】
また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、前記ダイナミン阻害剤が、ダイナミンのプレクストリン相同ドメインを標的とするダイナミン阻害剤であることを特徴とする。
【0017】
また、本発明の一実施形態においては、上記の医薬において、前記ダイナミンのプレクストリン相同ドメインを標的とするダイナミン阻害剤が、以下の式（ＩＩ）～式（ＶＩ）：
からなる群から選択される１または複数の化合物であることを特徴とする。
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
からなる群から選択される１または複数の化合物であることを特徴とする。
【0018】
また、本発明の一実施形態においては、上記の組み合わせ医薬において、前記（Ａ）と前記（Ｂ）とが、キットとして準備されることを特徴とする。
【0019】
本発明の他の実施形態は、下記式（Ｉ）で示される化合物：
（式中、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す）
又はその塩、を用いる光線力学的治療又は光線力学的診断において、光線力学的反応を増強させる方法であって、
対象へ治療上有効量のダイナミン阻害剤を投与するステップ、
を含むことを特徴とする、
方法に関する。
【化9】
又はその塩、を用いる光線力学的治療又は光線力学的診断において、光線力学的反応を増強させる方法であって、
対象へ治療上有効量のダイナミン阻害剤を投与するステップ、
を含むことを特徴とする、
方法に関する。
【0020】
なお、上記に述べた本発明の一又は複数の特徴を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
本明細書において、ＡＬＡ類とは、ＡＬＡ若しくはその誘導体又はそれらの塩をいう。
【0023】
本明細書において、ＡＬＡは、５－アミノレブリン酸を意味する。ＡＬＡは、δ－アミノレブリン酸ともいい、アミノ酸の１種である。
【0024】
ＡＬＡの誘導体としては、下記式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。式（Ｉ）において、Ｒ１は、水素原子又はアシル基を表し、Ｒ２は、水素原子、直鎖若しくは分岐状アルキル基、シクロアルキル基、アリール基又はアラルキル基を表す。なお、式（Ｉ）において、ＡＬＡは、Ｒ１及びＲ２が水素原子の場合に相当する。
【化10】
【0025】
ＡＬＡ類は、生体内で式（Ｉ）のＡＬＡ又はその誘導体の状態で有効成分として作用すればよく、生体内の酵素で分解されるプロドラッグ（前駆体）として投与することもできる。
【0026】
式（Ｉ）のＲ１におけるアシル基としては、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ベンジルカルボニル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルカノイル基や、ベンゾイル、１－ナフトイル、２－ナフトイル基等の炭素数７～１４のアロイル基を挙げることができる。
【0027】
式（Ｉ）のＲ２におけるアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル基等の直鎖又は分岐状の炭素数１～８のアルキル基を挙げることができる。
【0028】
式（Ｉ）のＲ２におけるシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロドデシル、１－シクロヘキセニル基等の飽和、又は一部不飽和結合が存在してもよい、炭素数３～８のシクロアルキル基を挙げることができる。
【0029】
式（Ｉ）のＲ２におけるアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントリル、フェナントリル基等の炭素数６～１４のアリール基を挙げることができる。
【0030】
式（Ｉ）のＲ２におけるアラルキル基としては、アリール部分は上記アリール基と同じ例示ができ、アルキル部分は上記アルキル基と同じ例示ができ、具体的には、ベンジル、フェネチル、フェニルプロピル、フェニルブチル、ベンズヒドリル、トリチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル基等の炭素数７～１５のアラルキル基を挙げることができる。
【0031】
好ましいＡＬＡ誘導体としては、Ｒ１が、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ２が、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル基等である化合物が挙げられる。また、好ましいＡＬＡ誘導体としては、上記Ｒ１とＲ２の組合せが、（ホルミルとメチル）、（アセチルとメチル）、（プロピオニルとメチル）、（ブチリルとメチル）、（ホルミルとエチル）、（アセチルとエチル）、（プロピオニルとエチル）、（ブチリルとエチル）の各組合せである化合物が挙げられる。
【0032】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、薬理学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩等を挙げることができる。酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩等の各無機酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の各有機酸付加塩を例示することができる。金属塩としては、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の各アルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム塩等の各アルカリ土類金属塩、アルミニウム、亜鉛等の各金属塩を例示することができる。アンモニウム塩としては、アンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等のアルキルアンモニウム塩等を例示することができる。有機アミン塩としては、トリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩、トルイジン塩等の各塩を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液としても用いることができる。
【0033】
以上のＡＬＡ類のうち、もっとも望ましいものは、ＡＬＡ、及び、ＡＬＡメチルエステル、ＡＬＡエチルエステル、ＡＬＡプロピルエステル、ＡＬＡブチルエステル、ＡＬＡペンチルエステル等の各種エステル類、並びに、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩である。とりわけ、ＡＬＡ塩酸塩、ＡＬＡリン酸塩を特に好適なものとして例示することができる。
【0034】
上記ＡＬＡ類は、例えば、化学合成、微生物による生産、酵素による生産など公知の方法によって製造することができる。また、上記ＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またＡＬＡ類を単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることもできる。
【0035】
上記ＡＬＡ類を水溶液として調製する場合には、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように留意する必要がある。アルカリ性となってしまう場合は、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
【0036】
本明細書において、ＡＬＡ－ＰＤＴとはＡＬＡ類を用いる光線力学的治療（ＰＤＴ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＴを意味する。また、ＡＬＡ－ＰＤＤとはＡＬＡ類を用いる光線力学的診断（ＰＤＤ）を意味し、最も典型的には、ＡＬＡを用いるＰＤＤを意味する。
【0037】
上記ＡＬＡ－ＰＤＴは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、特定の波長の光線を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＴを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を対象へ投与する。対象の体内において、色素生合成経路を経てＡＬＡ類から誘導されたポルフィリン（主にＰｐＩＸ）を標的箇所に集積させ、集積したＰｐＩＸを励起させることで、周囲の酸素分子を光励起させる。その結果生成する一重項酸素が、その強い酸化力による殺細胞効果を有する。ＡＬＡ－ＰＤＴには、例えば、４００ｎｍ～４２０ｎｍにピークを持つ光線、又は、６００ｎｍ～６５０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。
【0038】
一方、上記ＡＬＡ－ＰＤＤは、標的組織に集積する性質を有する光感受性物質（光増感剤）を対象に投与し、光線を照射することにより標的箇所を治療するＰＤＤを行う際に、それ自身は光増感作用を有さないＡＬＡ類を対象へ投与する。対象の体内において、色素生合成経路を経てＡＬＡ類から誘導されたポルフィリン（主にＰｐＩＸ）を標的箇所に集積させ、集積したＰｐＩＸを励起させて蛍光を検出することで、標的組織の存在の有無を検出もしくは診断する。ＡＬＡ－ＰＤＤには、例えば、４００ｎｍ～４２０ｎｍにピークを持つ光線を用いるのが好ましい。
【0039】
ダイナミンは高分子量のＧＴＰアーゼであり、さまざまな細胞小器官で膜の形成や形状変更に関わっていることが知られている。また、ダイナミンは、ＧＴＰａｓｅドメイン（ＧＴＰａｓｅ Ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ Ｓｉｔｅ ｄｏｍａｉｎ：ＧＡＳドメイン）、ＢＳＥ（ｂｕｎｄｌｅ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）、柄状の構造（ストーク）、プレクストリン相同ドメイン（Ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎ：ＰＨドメイン）を含むタンパク質であることが知られている。
【0040】
プレクストリン相同ドメインは約１２０アミノ酸残基からなるモジュールであり、ダイナミンだけでなく、細胞内動態、細胞情報伝達、および細胞骨格再構築に関与する多様なシグナル伝達情報タンパク質において見出されることが知られている。
【0041】
本発明において用いられるダイナミン阻害剤は、ダイナミンの機能を阻害する物質であれば、特に限定されない。本発明においては、ダイナミン阻害剤のうち、特に、ダイナミンのプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）をターゲットとした阻害剤が好適に用いられる。
【0042】
本発明における「ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤」は、一般的にダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤として知られている薬剤（例えば、ＯｃＴＭＡＢ（商標）（ａｂｃａｍ社製）、ＭｉＴＭＡＢ（商標）（ａｂｃａｍ社製）、ＲＴＩＬ１３（商標）（ａｂｃａｍ社製）、Ｐｒｏ－ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄ（ａｂｃａｍ社製）、等）であってよいが、これらに限定されず、ＰＨドメインに結合することが知られている物質であれば、本発明の「ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤」として用い得る。例えば、分子内にＰＨドメインを有するＡｋｔの阻害剤（例えば、Ａｋｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））も、本発明の「ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤」に含まれる。
【0043】
本発明に用いられ得るＯｃＴＭＡＢ（商標）は、以下の式（II）で示される化合物である。
【化11】
【0044】
本発明に用いられ得るＭｉＴＭＡＢ（商標）は、以下の式（III）で示される化合物である。
【化12】
【0045】
本発明に用いられ得るＲＴＩＬ１３（商標）は、以下の式（ＩＶ）で示される化合物である。
【化13】
【0046】
本発明に用いられ得るＰｒｏ－ｍｙｒｉｓｔｉｃ ａｃｉｄは、以下の式（Ｖ）で示される化合物である。
【化14】
【0047】
本発明に用いられ得るＡｋｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩは、以下の式（ＶＩ）で示される化合物である。
【化15】
【0048】
本発明はＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤との組み合わせに関するが、その組み合わせの態様は限定されず、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、当業者が様々な方法でＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを組み合わせることができる。
【0049】
本発明において、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とは、同時又は異時に対象に投与されてよい。また、本発明において、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とは、それぞれを含む配合剤として準備され、対象へ投与されてよい。また、本発明において、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とは、それぞれを別々に備えるキットとして準備されてもよい。
【0050】
本発明において、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを同時に投与する態様としては、例えば、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを含む配合剤を対象へ投与する態様であってよい。
【0051】
本発明において、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを異時に投与する態様としては、例えば、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを、時間をずらしてそれぞれ投与する態様であってよく、また、例えば、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを異なる投与経路から投与する態様であってよい。
【0052】
本発明におけるＡＬＡ類の投与経路、及び、ダイナミン阻害剤の投与経路は、いずれも限定されず、全身投与であっても、局所投与であってもよい。投与経路としては、例えば、舌下投与も含む経口投与、あるいは吸入投与、カテーテルによる、標的組織又は臓器に対する直接投与、点滴を含む静脈内投与、貼付剤等による経皮投与、座薬、又は、経鼻胃管、経鼻腸管、胃ろうチューブ若しくは腸ろうチューブを用いる強制的経腸栄養法による投与等の非経口投与などを挙げることができる。また、上述のとおり、ＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤とを、別々の経路から投与してもよい。
【0053】
本発明において用いられる、ＡＬＡ類、ダイナミン阻害剤、または、これらを組み合わせた配合剤、の剤型は、前記投与経路に応じて適宜決定してよく、限定はされないが、注射剤、点滴剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、液剤、シロップ等に溶解した水剤、貼付剤、座薬剤等を挙げることができる。
【0054】
本発明はＡＬＡ類と、ダイナミン阻害剤との組み合わせに関するが、さらに、ダイナミン阻害剤とは異なる機序で細胞内のＰｐＩＸ蓄積量を増加させる物質を併用することができる。ダイナミン阻害剤とは異なる機序で細胞内のＰｐＩＸ蓄積量を増加させ得る物質としては、例えば、Ｆｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎ ＣのようなＡＢＣＧ２阻害剤、キレート剤、ビタミンＤの活性化体が挙げられる。本発明において任意選択的に用い得るＡＢＣＧ２阻害剤は、例えば、Ｍｏ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１２：３（１）：１－２７のＴａｂｌｅ ３およびＴａｂｌｅ ４に記載された化合物、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ； ２０１２； Ｖｏｌ． ３１ Ｉｓｓｕｅ ２， ｐ７５－９９のＴａｂｌｅ ２に記載された化合物等が挙げられる。キレート剤が細胞内のＰｐＩＸの蓄積量の増加に用い得ることは、例えば、ＷＯ２０１４／２０２３８３３や、Ｖａｌｄｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ２０１０ Ｍａｒ－Ａｐｒ；８６（２）：４７１－５に記載されている。また、ビタミンＤの活性化体が細胞内のＰｐＩＸの蓄積量の増加に用い得ることは、例えば、Ａｎａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ； ７１（１８） Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５， ２０１１， ６０４０－６０５０に記載されている。
【0055】
本発明に係る医薬は、必要に応じて他の薬効成分、栄養剤、担体等の他の任意成分を加えることができるのは言うまでもない。任意成分として、例えば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコール等の、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することができる。
【0056】
本発明における、ＡＬＡ類の対象への投与量は、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。限定はされないが、ＡＬＡ換算で対象の体重１ｋｇあたり、１ｍｇ～１，０００ｍｇ、好ましくは５ｍｇ～１００ｍｇ、より好ましくは１０ｍｇ～３０ｍｇ、さらに好ましくは１５ｍｇ～２５ｍｇ投与することができる。
【0057】
ＡＬＡ類の投与頻度としては、一日一回～複数回の投与又は点滴等による連続的投与を例示することができる。
【0058】
ＡＬＡ類の投与期間は、例えば、対象の、予防又は治療しようとする症状又は状態等に鑑みて、種々の臨床学的指標等に基づいて、当該技術分野の薬理学者や臨床医が既知の方法により決定することができる。
【0059】
本発明において、ダイナミン阻害剤は、ＡＬＡ類が代謝されて精製されるＰｐＩＸの対象組織への蓄積を増強させる目的で投与されることから、ＡＬＡ類を投与する際にあわせて投与することが好ましいが、必ずしも完全に同時に投与する必要はない。
【0060】
本発明における、ダイナミン阻害剤は、ＰＤＴまたはＰＤＤの実施態様に応じて、また、使用する薬剤の種類に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。
【0061】
本発明を用いたＡＬＡ－ＰＤＴまたはＡＬＡ－ＰＤＤは、例えば、腫瘍の治療又は診断、感染症の治療又は診断に好適に用いることができる。本発明を腫瘍の治療又は診断に用いる場合、腫瘍の種類は特に限定されないが、例えば、ＰＤＴの対象としては、疣、子宮頸部がん、皮膚がん、甲状腺がん、悪性脳腫瘍などの表在性のがんや皮下性のがん、中でも皮下数ｍｍのがんを好適に例示することができ、ＰＤＤの対象としては、センチネルリンパ節を好適に例示することができる。また、ＰＤＤにより摘出前リンパ節転移診断を行うことが可能になる。本発明を感染症の治療または診断に用いる場合、例えば、感染症は、細菌感染症、真菌感染症、ウイルス感染症または寄生虫感染症であってよく、好ましくは、細菌感染症に対して用いることができ、さらに好ましくは、黄色ブドウ球菌感染症または緑膿菌感染症に用いることができる。
【0062】
本明細書において用いられる用語は、特に定義されたものを除き、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
【0063】
また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
【0064】
異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【0065】
以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
【実施例】
【0066】
実施例１：ダイナミン阻害剤によるがん細胞のＰｐＩＸ蓄積増強
【0067】
材料と方法
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社製）に非働化済みウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｗｅｓｔ社）を５％添加したものを用いた（以下ＲＰＭＩ培地と記載する）。ダイナミンの阻害剤は２種類知られており、一方はＧＡＳドメインを標的とする阻害剤で、もう一方はＰＨドメインを標的にする阻害剤が存在する。ＧＡＳドメインを標的とする阻害剤はＩｍｉｎｏｄｙｎ２２（ａｂｃａｍ社）を使用した。また、ＰＨドメインを標的とする阻害剤はＯｃＴＭＡＢ（ａｂｃａｍ社）を使用した。
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ１６４０（Ｗａｋｏ社製）に非働化済みウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｂｉｏｗｅｓｔ社）を５％添加したものを用いた（以下ＲＰＭＩ培地と記載する）。ダイナミンの阻害剤は２種類知られており、一方はＧＡＳドメインを標的とする阻害剤で、もう一方はＰＨドメインを標的にする阻害剤が存在する。ＧＡＳドメインを標的とする阻害剤はＩｍｉｎｏｄｙｎ２２（ａｂｃａｍ社）を使用した。また、ＰＨドメインを標的とする阻害剤はＯｃＴＭＡＢ（ａｂｃａｍ社）を使用した。
【0068】
ＯｃＴＭＡＢ １ｍｇに対してジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ、Ｗａｋｏ社製）を２５５μＬ加え、混合後、ＯｃＴＭＡＢ １０ｍＭストック溶液とした。また、Ｉｍｉｎｏｄｙｎ２２ １ｍｇに対してＤＭＳＯを２０８μＬ加え、混合後、Ｉｍｉｎｏｄｙｎ２２ １０ｍＭストック溶液とした。ＯｃＴＭＡＢ １０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で希釈し、１６μＭに調製した。Ｉｍｉｎｏｄｙｎ２２ １０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で希釈し、４０μＭに調製した。調製したＯｃＴＭＡＢ及びＩｍｉｎｏｄｙｎ２２をそれぞれＲＰＭＩ培地で段階希釈し、希釈系列を６点作製した。これらの各ダイナミン阻害剤含有培地を、２ｍＭアミノレブリン酸塩酸塩（ＡＬＡ）を含む等量のＲＰＭＩ培地と混合し、ＡＬＡ／ＯｃＴＭＡＢ及びＡＬＡ／Ｉｍｉｎｏｄｙｎ２２含有培地を調製した。
【0069】
各がん細胞株を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（黒色・底透明；Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）に１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のみ２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種）し、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、培養上清を取り除き、各ｗｅｌｌに上述の各ＡＬＡ／ＯｃＴＭＡＢ含有培地またはＡＬＡ／Ｉｍｉｎｏｄｙｎ２２含有培地を、２００μＬずつ添加し、３７℃の条件で４時間培養した。４時間後、各培養上清を１００μＬずつ別の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、これを細胞外ＰｐＩＸ測定用ｐｌａｔｅとした。残りの培養上清を除去し、各細胞株をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｗａｋｏ社製）で１回洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、Ｗａｋｏ社製）水溶液を加えて細胞を可溶化し、細胞内ＰｐＩＸ測定用ｐｌａｔｅとした。プロトポルフィリンＩＸの標品（ＰｐＩＸ、フナコシ社製）をＤＭＳＯ溶液に溶解し、１ｍＭ ＰｐＩＸストック溶液を作製した。１ｍＭ ＰｐＩＸストック溶液を１％ＳＤＳ溶液とＲＰＭＩ培地でそれぞれ希釈し、最終濃度０－１０００ｎＭのＰｐＩＸ標準液を調製した。１％ＳＤＳで調製したＰｐＩＸ標準液は細胞内蓄積ＰｐＩＸ測定用プレート内の未使用ｗｅｌｌに、ＲＰＭＩ培地で調製した標準液は細胞外排出ＰｐＩＸ測定用プレートの未使用部分にそれぞれ１００μＬずつ添加した。マイクロプレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ＰＲＯ； ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、細胞内ＰｐＩＸ測定用ｐｌａｔｅと細胞外ＰｐＩＸ測定用ｐｌａｔｅの蛍光強度を、励起光４０５ｎｍ、測定波長６３５ｎｍの条件で測定した。測定後、ＰｐＩＸ標準液の蛍光強度から検量線を作製し、各ｗｅｌｌのＰｐＩＸ量を検量線から算出した。
【0070】
上記の方法で測定したＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正する為、細胞内ＰｐＩＸ測定用ｐｌａｔｅの各サンプル中に含まれるタンパク質量を測定した。タンパク質量測定にはＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した。ＢＣＡ ｒｅｇｅｎｔ ＡとＢＣＡ ｒｅｇｅｎｔ Ｂを５０：１の割合で混合し、ＢＣＡ反応液を作製した。タンパク質量定量用標準液は、Ｋｉｔ付属のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液を希釈し、０－２ｍｇ／ｍｌに調製した。９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに細胞内ＰｐＩＸ測定用プレート内のサンプル２５μＬずつ分注し、ＢＣＡ反応液を２００μＬずつ添加した。３７℃で３０分間反応後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、５６２ｎｍの吸光度を測定した。測定後、ＢＳＡ標準液の吸光度から検量線を作製し、各ｗｅｌｌのタンパク質量を検量線から算出した。細胞内外のＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正した結果を図１に示す。
【0071】
結果
図１から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＯｃＴＭＡＢとを併用することで、ＯｃＴＭＡＢの濃度依存的に細胞内ＰｐＩＸ量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＯｃＴＭＡＢ併用時においてＯｃＴＭＡＢの濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。これに対してＡＬＡとｉｍｉｎｏｄｙｎ２２とを併用した場合には、細胞内外のＰｐＩＸ量の変化は確認されなかった。以上の結果から、ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤をＡＬＡと併用することで、ＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
図１から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＯｃＴＭＡＢとを併用することで、ＯｃＴＭＡＢの濃度依存的に細胞内ＰｐＩＸ量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＯｃＴＭＡＢ併用時においてＯｃＴＭＡＢの濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。これに対してＡＬＡとｉｍｉｎｏｄｙｎ２２とを併用した場合には、細胞内外のＰｐＩＸ量の変化は確認されなかった。以上の結果から、ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤をＡＬＡと併用することで、ＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
【0072】
実施例２：ＯｃＴＭＡＢとＦＴＣの併用によるＰｐＩＸ蓄積増強
【0073】
材料と方法
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。Ｆｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎ Ｃ（ＦＴＣ、ｓｉｇｍａ社製）は、ＤＭＳＯに溶解し、２ｍＭのストック溶液を作製後、ＲＰＭＩ培地で４０μＭに調製した。ＯｃＴＭＡＢは、１０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で３２μＭに調整した。４０μＭ ＦＴＣ含有ＲＰＭＩ培地を等量の３２μＭ ＯｃＴＭＡＢ含有培地に添加して１６μＭ ＯｃＴＭＡＢ／２０μＭＦＴＣ含有培地を調製した。尚、ＦＴＣはＡＢＣＧ２（ＰｐＩＸを細胞外に排出するトランスポーター）の阻害剤であり、ＰｐＩＸの細胞外排出を阻害する効果を有する化合物と知られている。
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。Ｆｕｍｉｔｒｅｍｏｒｇｉｎ Ｃ（ＦＴＣ、ｓｉｇｍａ社製）は、ＤＭＳＯに溶解し、２ｍＭのストック溶液を作製後、ＲＰＭＩ培地で４０μＭに調製した。ＯｃＴＭＡＢは、１０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で３２μＭに調整した。４０μＭ ＦＴＣ含有ＲＰＭＩ培地を等量の３２μＭ ＯｃＴＭＡＢ含有培地に添加して１６μＭ ＯｃＴＭＡＢ／２０μＭＦＴＣ含有培地を調製した。尚、ＦＴＣはＡＢＣＧ２（ＰｐＩＸを細胞外に排出するトランスポーター）の阻害剤であり、ＰｐＩＸの細胞外排出を阻害する効果を有する化合物と知られている。
【0074】
各がん細胞株を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（黒色・底透明）に１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のみ２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種）し、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、培養上清を取り除き、各ｗｅｌｌに２ｍＭ ＡＬＡ含有ＲＰＭＩ培地を１００μＬずつ添加した。その後上述の１６μＭ ＯｃＴＭＡＢ／２０μＭ ＦＴＣ含有培地を１００μＬずつ添加し、４時間、３７℃で培養した（終濃度ＡＬＡ １ｍＭ、ＯｃＴＭＡＢ ８μＭ、ＦＴＣ １０μＭ）。なお、比較対象としてＡＬＡ単独作用群、ＡＬＡ／ＦＴＣ併用群、ＡＬＡ／ＯｃＴＭＡＢ併用群も同時に作製した。４時間後、各ｗｅｌｌの培養上清を１００μＬずつ別の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（黒色・底透明）に移し、これを細胞外ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。残りの培養上清を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ＳＤＳ水溶液を加えて細胞を可溶化し、細胞内ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。ＰｐＩＸの標準溶液の調製および細胞内外のＰｐＩＸ量測定の方法は、実施例１と同様に実施した。
【0075】
上記のＰｐＩＸ量測定結果をタンパク質量で補正する為、細胞内ＰｐＩＸ量測定用の各サンプルのタンパク質量を測定した。タンパク質量測定はＰｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用し実施例１と同様の方法で実施した。細胞内外のＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正した結果を図２に示す。
【0076】
結果
図２から明らかなように、多くの細胞株でＡＬＡとＯｃＴＭＡＢ併用群はＡＬＡとＦＴＣ併用群と同等、またはそれ以上に細胞内ＰｐＩＸを増加させた。さらにＯｃＴＭＡＢとＦＴＣを併用する事で各阻害剤単独投与時よりも細胞内ＰｐＩＸ量が増加する傾向を示した。
図２から明らかなように、多くの細胞株でＡＬＡとＯｃＴＭＡＢ併用群はＡＬＡとＦＴＣ併用群と同等、またはそれ以上に細胞内ＰｐＩＸを増加させた。さらにＯｃＴＭＡＢとＦＴＣを併用する事で各阻害剤単独投与時よりも細胞内ＰｐＩＸ量が増加する傾向を示した。
【0077】
細胞外ＰｐＩＸ量の測定結果より、ＯｃＴＭＡＢは、ＦＴＣと同程度のＰｐＩＸの細胞外排出を抑制する効果を示した。また、ＯｃＴＭＡＢとＦＴＣを併用する事で、ＯｃＴＭＡＢまたはＦＴＣ単独投与時よりも細胞外ＰｐＩＸ量が減少することが分かった。これらの結果から、ＯｃＴＭＡＢはＡＢＣＧ２とは別の排出機構に作用している可能性が示唆された。
【0078】
実施例３：ＭｉＴＭＡＢによるがん細胞のＰｐＩＸ蓄積増強
【0079】
材料と方法
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。また、ダイナミン阻害剤としては、ＭｉＴＭＡＢ（ａｂｃａｍ社製）を用いた。
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。また、ダイナミン阻害剤としては、ＭｉＴＭＡＢ（ａｂｃａｍ社製）を用いた。
【0080】
ＭｉＴＭＡＢ １ｍｇに対してＤＭＳＯを２９７μＬ加え、混合後、１０ｍＭストック溶液とした。１０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で希釈し、３２μＭに調製した。調製したＭｉＴＭＡＢ含有培地をＲＰＭＩ培地で段階希釈し、希釈系列を６点作製した。各濃度のＭｉＴＭＡＢ含有培地を、２ｍＭ ＡＬＡを含む等量のＲＰＭＩ培地と混合し、ＡＬＡ／ＭｉＴＭＡＢ含有培地を調製した。
【0081】
各がん細胞株を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のみ２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種）し、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、培養上清を取り除き、各ｗｅｌｌに上述の各ＡＬＡ／ＭｉＴＭＡＢ含有培地を、２００μＬ添加し、３７℃の条件で４時間培養した。４時間後、各培養上清を１００μＬずつ別の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、これを細胞外ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。残りの培養上清を除去し各細胞をＰＢＳで１回洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ＳＤＳ水溶液を加えて可溶化し、細胞内ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。ＰｐＩＸの標準溶液の調製および細胞内外のＰｐＩＸ量測定の方法は、実施例１と同様に実施した。
【0082】
上記結果をタンパク質量で補正する為、細胞内ＰｐＩＸ測定用のｐｌａｔｅ内の各サンプルを使用して、タンパク質量を測定した。タンパク質量測定にはＰｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した。タンパク質量測定方法は、実施例１と同様に実施した。細胞内外のＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正した結果を図３に示す。
【0083】
結果
図３から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＭｉＴＭＡＢを併用したとき、ＭｉＴＭＡＢの濃度依存的に細胞内ＰｐＩＸ量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＭｉＴＭＡＢを併用したとき、ＭｉＴＭＡＢの濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。以上の結果から、ＭｉＴＭＡＢを併用することで、実施例１のＯｃＴＭＡＢと同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
図３から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＭｉＴＭＡＢを併用したとき、ＭｉＴＭＡＢの濃度依存的に細胞内ＰｐＩＸ量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＭｉＴＭＡＢを併用したとき、ＭｉＴＭＡＢの濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。以上の結果から、ＭｉＴＭＡＢを併用することで、実施例１のＯｃＴＭＡＢと同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
【0084】
実施例４：ＲＴＩＬ１３によるがん細胞のＰｐＩＸ蓄積増強
【0085】
方法
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。また、ダイナミン阻害剤としては、ＲＴＩＬ１３（ａｂｃａｍ社製）を用いた。
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。また、ダイナミン阻害剤としては、ＲＴＩＬ１３（ａｂｃａｍ社製）を用いた。
【0086】
ＲＴＩＬ１３ ５ｍｇに対してＤＭＳＯを８７５μＬ加え、混合後、１０ｍＭストック溶液とした。１０ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で希釈し、４０μＭに調製した。調製したＲＴＩＬ１３含有培地をＲＰＭＩ培地で段階希釈し、希釈系列を６点作製した。各濃度のＲＴＩＬ１３含有培地を、２ｍＭ ＡＬＡを含む等量のＲＰＭＩ培地と混合し、ＡＬＡ／ＲＴＩＬ１３含有培地を調製した。
【0087】
各がん細胞株を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のみ２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種）し、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、培養上清を取り除き、各ｗｅｌｌに上述の各ＡＬＡ／ＲＴＩＬ１３含有培地を、２００μＬ添加し、３７℃の条件で４時間培養した。４時間後、各培養上清を１００μＬずつ別の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、これを細胞外ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。残りの培養上清を除去し各細胞をＰＢＳで１回洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ＳＤＳ水溶液を加えて可溶化し、細胞内ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。ＰｐＩＸの標準溶液の調製および細胞内外のＰｐＩＸ量測定の方法は、実施例１に同様に実施した。
【0088】
上記結果をタンパク質量で補正する為、細胞内ＰｐＩＸ測定用のｐｌａｔｅ内の各サンプルを使用して、タンパク質量を測定した。タンパク質量測定にはＰｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した。タンパク質量測定方法は、実施例１と同様に実施した。細胞内外のＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正した結果を図４に示す。
【0089】
結果
図４から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＲＴＩＬ１３を併用したとき、ＲＴＩＬ１３の濃度１０μＭ前後をピークに、ＰｐＩＸ蓄積量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＲＴＩＬ１３を併用したとき、ＲＴＩＬ１３の濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。この結果から、ＲＴＩＬ１３を併用することで、実施例１、３の結果と同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
図４から明らかなように、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＲＴＩＬ１３を併用したとき、ＲＴＩＬ１３の濃度１０μＭ前後をピークに、ＰｐＩＸ蓄積量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＲＴＩＬ１３を併用したとき、ＲＴＩＬ１３の濃度依存的に細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。この結果から、ＲＴＩＬ１３を併用することで、実施例１、３の結果と同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
【0090】
ＯｃＴＭＡＢ、ＭｉＴＭＡＢ、ＲＴＩＬ１３は、いずれもダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤である。実施例１～４の結果から、ダイナミンのＰＨドメインをターゲットとした阻害剤とＡＬＡとを併用することにより、細胞内のＰｐＩＸ蓄積量を造作させることができることが示唆された。
【0091】
実施例５ ＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩによるがん細胞のＰｐＩＸ蓄積増強
【0092】
次に、一般的にダイナミン阻害剤としては知られていないが、ＰＨドメイン構造に結合し、タンパク質の活性を阻害する薬剤による、細胞内のＰｐＩＸ蓄積量の増加を試みた。
【0093】
方法
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。試験薬剤として、ＡｋｔのＰＨドメインに結合し、Ａｋｔの活性を阻害することが知られているＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。
がん細胞株として膀胱がん細胞株（ＤＵ１４５）、大腸がん細胞株（ＨＴ２９、ＨＣＣ２９９８）、胃がん細胞株（ＭＫＮ７）、乳腺がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＣＦ－７）の６種類の細胞株を用いた。培地はＲＰＭＩ培地を用いた。試験薬剤として、ＡｋｔのＰＨドメインに結合し、Ａｋｔの活性を阻害することが知られているＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた。
【0094】
Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ １ｍｇに対してＤＭＳＯを３６３μＬ加え、混合後、５ｍＭストック溶液とした。５ｍＭストック溶液をＲＰＭＩ培地で希釈し、４０μＭに調製した。調製した４０μＭのＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ含有培地をＲＰＭＩ培地で段階希釈し、希釈系列を６点作製した。各濃度のＡＫＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ含有培地を、２ｍＭ ＡＬＡを含む等量のＲＰＭＩ培地と混合し、ＡＬＡ／Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ含有培地を調製した。
【0095】
各がん細胞株を９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１．２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のみ２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種）し、３７℃で一晩培養した。一晩培養後、培養上清を取り除き、各ｗｅｌｌに上述の各ＡＬＡ／Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＶＩＩＩ含有培地を、２００μＬ添加し、３７℃の条件で４時間培養した。４時間後、各培養上清を１００μＬずつ別の９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、これを細胞外ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。残りの培養上清を除去し各細胞をＰＢＳで１回洗浄後、ｗｅｌｌあたり１００μＬの１％ＳＤＳ水溶液を加えて可溶化し、細胞内ＰｐＩＸ量測定用ｐｌａｔｅとした。ＰｐＩＸの標準溶液の調製および細胞内外のＰｐＩＸ量測定の方法は、実施例１に同様に実施した。
【0096】
上記結果をタンパク質量で補正する為、細胞内ＰｐＩＸ測定用のｐｌａｔｅ内の各サンプルを使用して、タンパク質量を測定した。タンパク質量測定にはＰｉｅｒｃｅ（商標） ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を使用した。タンパク質量測定方法は、実施例１と同様に実施した。細胞内外のＰｐＩＸ量をタンパク質量で補正した結果を図５に示す。
【0097】
結果
図５から明らかな様に、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用したとき、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩの濃度５μＭ前後をピークに、ＰｐＩＸ蓄積量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用した場合、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩの濃度５μＭをピークに、細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。この結果から、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用することで、実施例１、３、４の結果と同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
図５から明らかな様に、ＡＬＡ単独投与と比較して、ＡＬＡとＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用したとき、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩの濃度５μＭ前後をピークに、ＰｐＩＸ蓄積量が増加する結果が得られた。また、細胞外ＰｐＩＸ量は、ＡＬＡ単独投与と比較してＡＬＡとＡｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用した場合、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩの濃度５μＭをピークに、細胞外ＰｐＩＸ量が減少する結果が得られた。この結果から、Ａｋｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＶＩＩＩを併用することで、実施例１、３、４の結果と同様にＰｐＩＸの細胞外への排出阻害が起こり、ＰｐＩＸの細胞内蓄積量が増えることが示唆された。
【0098】
以上の結果から、一般的にダイナミン阻害剤として知られていない薬剤であっても、ＰＨドメイン構造に結合してタンパク質の活性を阻害する薬剤であれば、本発明における「ダイナミン阻害剤」として使用し得ることが示唆された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
