特許 7026145 微粒子分類装置と遅延時間決定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-16

(45)【発行日】2022-02-25

(54)【発明の名称】微粒子分類装置と遅延時間決定方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 15/14 20060101AFI20220217BHJP

【ＦＩ】

G01N15/14 K

【請求項の数】 12

(21)【出願番号】P 2019567517

(86)(22)【出願日】2018-04-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-04-02

(86)【国際出願番号】 US2018025919

(87)【国際公開番号】W WO2018191069

(87)【国際公開日】2018-10-18

【審査請求日】2019-08-28

(31)【優先権主張番号】62/484,153

(32)【優先日】2017-04-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000002185

【氏名又は名称】ソニーグループ株式会社

(73)【特許権者】

【識別番号】504257564

【氏名又は名称】ソニー コーポレイション オブ アメリカ

(74)【代理人】

【識別番号】100092093

【弁理士】

【氏名又は名称】辻居 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100067013

【弁理士】

【氏名又は名称】大塚 文昭

(74)【代理人】

【識別番号】100109335

【弁理士】

【氏名又は名称】上杉 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120525

【弁理士】

【氏名又は名称】近藤 直樹

(72)【発明者】

【氏名】オオツカ フミタカ

(72)【発明者】

【氏名】ゾルダン マイケル

(72)【発明者】

【氏名】ツジ アキコ

(72)【発明者】

【氏名】スズキ ユウヤ

(72)【発明者】

【氏名】キモト マサシ

【審査官】福田 裕司

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－１９０６８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１９１７１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開昭４８－０７４２９２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－２１０２６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１６－１４５８３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１５－１５２４３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００５－３１５７９９（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１３／０３３７５７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／１２２０７１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ １５／１４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

微粒子分類装置であって、
流路を流れる微粒子を検出するように構成された検出器と、
前記微粒子を少なくとも１つ含む液滴の画像を取得し、前記液滴は、液滴流れを生成する流路に設けたオリフィスから排出されるように構成された撮像装置と、
制御装置と、を備え、前記制御装置は、
第１の複数のサブエリアを有する第１の画像領域、第２の複数のサブエリアを有する第２の画像領域、および第３の複数のサブエリアを有する第３の画像領域を含む前記画像を取得するために前記撮像装置を制御し、ここで、前記第１の画像領域は、最後に付着した液滴の下縁と最初に付着した液滴の下縁との間の第１の距離によって、又は、２つの連続する液滴の間の上縁の間の第２の距離によって決定され、前記第２及び第３の画像領域は、前記第１の画像領域の上で前記第１の距離又は第２の距離と同じ距離によって順に決定され、
複数の異なる時間において前記画像を取得し、
滴下クロックサイクルに基づく時間間隔の前記複数の異なる時間の各々について、前記第１の複数のサブエリアの各々、前記第２の複数のサブエリアの各々および前記第３の複数のサブエリアの各々について、輝度の強度を決定し、
第１の画像領域の強度合計を取得するための前記第１の複数のサブエリアの各々の輝度の強度、前記第２の画像領域の強度合計を取得するための前記第２の複数のサブエリアの各々に関する輝度の強度、および前記第３の画像領域強度を取得するための前記第３の複数のサブエリアの各々の輝度の強度を加算し、それによって複数の異なる時間の各々における第１の画像領域の強度合計、第２の画像領域の強度合計および第３の画像領域の強度合計を取得し、
前記検出器が前記流路を流れる微粒子を検出してから、強度特性の最大合計を決定することによって前記第１の画像領域の強度合計が最大になるまでの遅延時間を決定し、ここで、前記滴下クロックサイクルは３６０度からなり、前記複数の異なる時間は、３つの滴下クロックサイクルにわたる２０度間隔又は４０度の間隔で生じ、前記強度特性の最大合計は、前記第１の画像領域の強度合計、前記第２の画像領域の強度合計、前記第３の画像領域の強度合計を含む、強度比の第１の画像領域合計を使用して決定され、

前記遅延時間に基づいて、前記液滴に電荷を付与するタイミングを設定するように構成されている微粒子分類装置。

【請求項2】

前記第１の画像領域は、前記液滴流れの最後に付着した液滴に関連付ける、請求項１に記載の微粒子分類装置。

【請求項3】

前記第１の画像領域は、前記液滴流れの最後に付着した液滴に続く液滴に関連付ける、請求項１に記載の微粒子分類装置。

【請求項4】

前記遅延時間は滴下クロックサイクルに基づき、
前記電荷は最後に付着した液滴に付与され
前記最後に付着した液滴の遅延時間を取得するために、前記遅延時間に＋１滴下クロックサイクルが加えられる、請求項３に記載の微粒子分類装置。

【請求項5】

微粒子分類装置であって、
流路を流れる微粒子を検出するように構成された検出器と、
前記微粒子の少なくとも１つを含み、前記流路に設けたオリフィスから排出される、液滴の画像を取得するように構成された撮像装置と、
コンピュータ読み取り可能な命令を記憶する非一時的な記憶媒体とを含み、
前記命令は、処理回路によって実行されたときに、
前記画像を、第１の画像領域、第２の画像領域、第３の画像領域からなる３つの画像領域に分割し、ここで前記第１の画像領域は、最後に付着した液滴の下縁と最初に付着した液滴の下縁との間の第１の距離によって、又は、２つの連続する液滴の間の上縁の間の第２の距離によって決定され、前記第２及び第３の画像領域は、前記第１の画像領域の上で前記第１の距離又は第２の距離と同じ距離によって順に決定され、
前記第１の画像領域の強度合計、前記第２の画像領域の強度合計、前記第３の画像領域の強度合計に少なくとも一部は基づくものである強度特性の最大合計に基づいて、遅延時間を決定し、
前記強度特性の最大合計は、前記第１の画像領域の強度合計、前記第２の画像領域の強度合計、前記第３の画像領域の強度合計を含む、強度比の第１の画像領域合計を使用して決定される、

微粒子分類装置。

【請求項6】

各画像領域は、少なくとも１つの微粒子を含む、請求項５に記載の微粒子分類装置。

【請求項7】

前記画像は、複数の異なる時間において取得された複数の画像を含んでいる請求項５に記載の微粒子分類装置。

【請求項8】

前記複数の異なる時間は、滴下クロックサイクルに基づき、３つの滴下クロックサイクルにわたる、請求項７に記載の微粒子分類装置。

【請求項9】

各滴下クロックサイクルは３６０度から成り、複数の異なる時間は２０度間隔で生じる、請求項８に記載の微粒子分類装置。

【請求項10】

各滴下クロックサイクルは３６０度から成り、複数の異なる時間は４０度間隔で生じる、請求項８に記載の微粒子分類装置。

【請求項11】

各滴下クロックサイクルは３６０度から成り、複数の異なる時間は６０度間隔で生じる、請求項８に記載の微粒子分類装置。

【請求項12】

前記遅延時間は、第２画像領域の強度合計又は第３の画像領域の強度合計の少なくとも一方を最小化することによって決定される、請求項５に記載の微粒子分類装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

〔関連発明への相互参照〕
[0001] 本出願は、２０１７年４月１１日に出願された米国仮出願第６２／４８４，１５３号の優先権を主張する非仮特許出願であり、この出願の本文および図面は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

【0002】

[0002] 本技術は、微粒子分類装置および微粒子分類装置における遅延時間決定方法に関する。より具体的には、本技術は、遅延時間を自動的に決定する微粒子分類装置などに関する。

【背景技術】

【0003】

[0003] 関連技術には、細胞などの微粒子の特性を光学的、電気的または磁気的に検出し、次に所定の特性を有する微粒子のみを分離して回収する微粒子分類装置（例えば、フローサイトメーター）がある。

【0004】

[0004] フローサイトメーターにおける細胞分離では、まず、フローセルに形成されたオリフィスから液滴流れ（細胞およびシース液を含むサンプル液の層流）を生成され、流体流れはオリフィスに振動を加えることによって液滴にされ、液滴に電荷が付与される。さらに、オリフィスから排出された細胞を含む液滴の移動方向が電気的に制御され、所望の特性を有する目標細胞および他の非目標細胞が別々の回収容器に回収される。

【0005】

[0005] 例えば、日本国特開２０１０－１９０６８０号公報には、マイクロチップ型のフローサイトメーターとして微粒子分類装置が開示され、それは、微粒子を含む流体が流れる流路、および流路を流れる流体をチップ外の空間に排出するオリフィスが配置されたマイクロチップと、オリフィスにおいて流体を液滴化して排出するための振動素子と、排出される液滴に電荷を付与するための帯電手段と、流路を流れる微粒子の光学特性を検出する光学検出手段と、排出された液滴の移動方向に沿って移動する液滴を挟んで対向して設置された対電極と、対電極間を通過した液滴を回収する２つ以上の容器と、を備えている。

【0006】

[0006] また、日本国特開２００７－５３２８７４号公報には、液滴が目的の流路に分類さられたか否かを確認できるフローサイトメーターの動作を制御する方法が開示され、分類の確認は、補助照明および検出ユニットを、液滴が流体から分離する位置（以下、ブレークオフ点と呼ぶ）に配置することによって行う。このようにブレークオフ点を確認することによって、細胞などである微粒子が検出されてから細胞などを含む液滴がブレークオフ点に到達するまでの遅延時間を確認することができ、検出される微粒子を含む液滴に遅延時間に基づいて電荷を付与することが可能である。

【発明の概要】

【0007】

[0007] しかしながら、ブレークオフ点は、液滴の排出条件などに応じて変動するため、遅延時間も変動する。さらに、ブレークオフ点を確認するだけでは、微粒子を含む液滴に電荷を付与する正確なタイミングを十分に確認することは困難である。したがって、微粒子を含む液滴に正しい電荷が付与されるが、最終的に主に採用されている方法は、準備時に電荷が付与される液滴が所望の回収容器に割り当てられているかどうかを、ユーザーが液滴を観察することによって視覚的に識別する方法である。このような方法では、ユーザーが技術を習得する必要があり、信頼性および安定性に問題がある。

【0008】

[0008] したがって、液滴に電荷を自動的に、簡単に、正確に付与することができる微粒子分類装置を提供することが望ましい。

【0009】

[0009] 一実施形態では、微粒子分類装置が開示されている。微粒子分類装置は、流路を流れる微粒子を検出するように構成された検出器と、微粒子の少なくとも１つを含み、流路に設けたオリフィスから排出される、液滴の画像を取得するように構成された撮像装置と、を含む。微粒子分類装置は制御装置をさらに含む。制御装置は、画像を取得するために撮像装置を制御するように構成され、画像は第１および第２の画像領域を有し、第１および第２の画像領域は各々複数のサブエリアを有する。制御装置はさらに、サブエリアの各々に関する画像輝度の強度を決定し、第１の画像領域および第２の画像領域の各々に関する強度の合計を得るために、第１および第２の画像領域の各々内にあるサブエリアの各々に関する画像輝度の強度を加算するように構成されている。制御装置は、第１および第２の画像領域の強度の合計を調べ強度特性の最大合計を特定することによって遅延時間を決定し、そして遅延時間に基づいて液滴に電荷を付与するタイミングを設定するようにさらに構成されている。

【0010】

[0010] 別の実施形態では、第１および第２の画像領域の各々の強度の合計は、複数の異なる時間で決定される。さらに別の実施形態では、複数の異なる時間は、液滴クロックサイクルに基づき、３つの液滴クロックサイクルにわたっている。さらに別の実施形態では、各液滴クロックサイクルは３６０度から成り、複数の異なる時間は２０度間隔で生じる。さらに別の実施形態では、複数の異なる時間は４０度間隔で生じる。さらに別の実施形態では、複数の異なる時間は６０度間隔で生じる。

【0011】

[0011] 別の実施形態では、画像は複数のサブエリアを有する第３の画像領域をさらに含み、制御装置はさらに、第３の画像領域内のサブエリアの各々に関する画像輝度の強度を決定するように構成されている。制御装置はまた、第３の画像領域の強度の合計を取得するために、第３の画像領域内にあるサブエリアの各々に関する画像輝度の強度を加算するように構成され、遅延時間は、第３の画像領域の強度の合計を調べることによって決定される。

【0012】

[0012] 別の実施形態では、強度特性の最大合計は、第１の画像領域比を計算することによって決定される。

【0013】

【数1】

【0014】

[0014] 別の実施形態では、第１の画像領域は、最後に付着した液滴に関連付けている。さらに別の実施形態では、第１の画像領域は、液滴流れ内の最後に付着した液滴に続く液滴に関連付けている。さらに別の実施形態では、第２の画像領域は第１の画像領域に隣接し、第３の画像領域は第２の画像領域または第１の画像領域の何れかに隣接している。

【0015】

[0015] 別の実施形態では、強度特性の最大合計は、第２の画像領域の強度の合計、第３の画像領域の強度の合計またはその両方の何れかを最小化することによって決定される。さらに別の実施形態では、強度特性の最大合計は、第１の画像領域の強度の合計を最大化することによって決定される。

【0016】

[0016] 一実施形態では、微粒子分類装置が開示され、それは、流路を流れる微粒子を検出するように構成された検出器と、微粒子を少なくとも１つ含む液滴の画像を取得し、液滴は液滴流れを生成する流路に設けたオリフィスから排出されるように構成された撮像装置と、制御装置と、を備えている。制御装置は、第１の複数のサブエリアを有する第１の画像領域、第２の複数のサブエリアを有する第２の画像領域、および第３の複数のサブエリアを有する第３の画像領域を含む画像を取得するために撮像装置を制御するように構成されている。制御装置はまた、複数の異なる時間において複数の異なる時間の各々について画像を取得し、第１の複数のサブエリアの各々、第２の複数のサブエリアの各々および第３の複数のサブエリアの各々について輝度の強度を決定するように構成されている。制御装置は、第１の画像領域の強度合計を取得するための第１の複数のサブエリアの各々の輝度の強度、第２の画像領域の強度合計を取得するための第２の複数のサブエリアの各々の輝度の強度、および第３の画像領域強度を取得するための第３の複数のサブエリアの各々の輝度の強度を加算し、それによって複数の異なる時間の各々における第１の画像領域の強度合計、第２の画像領域の強度合計、および第３の画像領域の強度合計を取得するように構成されている。制御装置は、検出器が流路を流れる微粒子を検出してから、強度特性の最大合計を決定することによって第１の画像領域の強度合計が最大に達するまでの時間である遅延時間を決定し、そして遅延時間に基づいて液滴に電荷を付与するタイミングを設定するようにさらに構成されている。

【0017】

[0017] 別の実施形態において、遅延時間は液滴クロックサイクルに基づき、このサイクルにおいて電荷は最後に付着した液滴に付与され、最後に付着した液滴の遅延時間を得るために遅延時間に＋１液滴クロックサイクルが加えられる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】マイクロチップ型フローサイトメーターとして構成された、本技術の一実施形態による微粒子分類装置（フローサイトメーター）を成す分類システムの構成を説明する模式図である。

【図2A】フローサイトメーターに設置可能なマイクロチップの例を示す模式図である。

【図2B】フローサイトメーターに設置可能なマイクロチップの例を示す模式図である。

【図3A】マイクロチップのオリフィスの構成を説明する模式図である。

【図3B】マイクロチップのオリフィスの構成を説明する模式図である。

【図3C】マイクロチップのオリフィスの構成を説明する模式図である。

【図4】フローサイトメーターにおける遅延時間を決定する方法を説明するフロー図である。

【図5A】フローサイトメーターの液滴カメラによって撮像された液滴の画像の例であり、粗い遅延時間決定ステップを例示する説明図である。

【図5B】フローサイトメーターの液滴カメラによって撮像された液滴の画像の例であり、粗い遅延時間決定ステップを例示する説明図である。

【図5C】フローサイトメーターの液滴カメラによって撮像された液滴の画像の例であり、粗い遅延時間決定ステップを例示する説明図である。

【図5D】フローサイトメーターの液滴カメラによって撮像された液滴の画像の例であり、粗い遅延時間決定ステップを例示する説明図である。

【図6A】説明図であり、例示的な液滴画像である。

【図6B】説明図であり、例示的な較正画像である。

【図6C】説明図であり、液滴クロックに関するＬＥＤストロボおよび較正ストロボの例示的な表現である。

【図7A】複数の画像領域を決定する第１の方法を説明する例示的な画像であり、液滴の画像を表わす。

【図7B】複数の画像領域を決定する第１の方法を説明する例示的な画像であり、液滴の画像を表わす。

【図7C】複数の画像領域を決定する第１の方法を説明する例示的な画像であり、較正画像を表わす。

【図7D】複数の画像領域を決定する第１の方法を説明する例示的な画像であり、液滴クロックに関するＬＥＤストロボおよび較正ストロボを表わす。

【図8A】複数の画像領域を決定する第２の方法を説明する例示的な画像であり、液滴画像を表わす。

【図8B】複数の画像領域を決定する第２の方法を説明する例示的な画像であり、液滴画像を表わす。

【図8C】複数の画像領域を決定する第２の方法を説明する例示的な画像であり、較正画像を表わす。

【図8D】複数の画像領域を決定する第２の方法を説明する例示的な画像であり、液滴クロックに関するＬＥＤストロボおよび較正ストロボを表わす。

【図9】説明図であり、横軸に遅延時間をとり、左側の縦軸にフローサイトメーターの液滴カメラで撮像した液滴の画像の強度の合計をとり、右側の縦軸に遅延時間決定ステップ（第１の遅延時間決定方法）の例を説明するＳ１比をとったグラフである。

【図10】説明図であり、例を説明するために横軸に遅延時間をとり、縦軸にフローサイトメーターの液滴カメラで撮像した液滴の画像の強度の合計をとった、遅延時間決定ステップ（第２の遅延時間決定方法）の例を説明するためのグラフである説明図である。

【図11】説明図であり、例を説明するために横軸に遅延時間をとり、縦軸にフローサイトメーターの液滴カメラによって撮像された液滴の画像の強度の合計をとった、遅延時間決定ステップ（第３の遅延時間決定方法）の例を説明するためのグラフである。

【図12】フローサイトメーターで微粒子を分類する方法（微粒子分類ステップ）を説明するフロー図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

[0030] 以下、本技術を実現するための好適な実施形態について図面を参照して説明する。さらに、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示すものであり、本技術の範囲は、この例に従って狭く解釈されるべきではない。説明は次の順序で行う。

【0020】

[0031] １．本技術による微粒子分類装置の装置構成
１－１ 帯電ユニット
１－２ マイクロチップ
１－３ 検出ユニット
１－４ 液滴カメラ
１－５ そらせ板
１－６ 回収容器
１－７ 制御ユニットまたは類似物
２．本技術による微粒子分類装置における遅延時間決定方法
２－１ 微粒子検出ステップＳ１
２－２ 液滴排出ステップＳ２
２－３ 液滴撮像ステップＳ３
２－４ 排出周波数決定ステップＳ４
２－５ 粗い遅延時間決定ステップＳ５
２－６ 画像領域決定ステップＳ６
２－７ 細かい遅延時間決定ステップＳ７
２－７－１ 第１の細かい遅延時間決定方法
２－７－２ 第２の細かい遅延時間決定方法
２－７－３ 第３の細かい遅延時間決定方法
２－８ 微粒子分類ステップＳ８
２－８－１ 微粒子検出ステップ
２－８－２ 液滴排出および電荷付与のステップ

【0021】

[0053] １．本技術による微粒子分類装置の装置構成

【0022】

[0054] 図１は、マイクロチップ型フローサイトメーターとして構成された、本技術の一実施形態による微粒子分類装置１（以下、「フローサイトメーター１」とも呼ぶ）を成す分類システムの構成を説明する模式図である。

【0023】

[0055] １－１ 帯電ユニット

【0024】

[0056] フローサイトメーター１には、マイクロチップ２上に形成されたオリフィス２１から排出された液滴に電荷を付与する帯電ユニット１１が設けられている。液滴の帯電は、帯電ユニット１１に電気的に接続された電極または励起レーザー（図示しない）などの帯電装置１２によって行なわれる。帯電装置１２は、マイクロチップ２に設けた入口（図示しない）を介して液滴にアクセスすることができる。さらに、電極は、マイクロチップ２上の位置に挿入されて、流路を下流に送液するサンプル流体またはシース流体と電気的に接触するようにすれば十分である。同様に、励起レーザーをマイクロチップ２上に位置させて、レーザーが、流路を下流に送液するサンプル流体またはシース流体にアクセスできるようにすれば十分である。

【0025】

[0057] フローサイトメーター１では、サンプル液に含まれる微粒子が後述する検出ユニット３によって検出されてから遅延時間が経過すると、帯電ユニット１１は、微粒子を含む液滴を帯電させることが可能である。ここで、「遅延時間」は、微粒子が検出ユニット３によって検出されてから、微粒子を含む流体から液滴が形成されるまでの遅延時間を指す。すなわち、「遅延時間」は、微粒子が検出ユニット３によって検出されてから、微粒子を含む液滴が帯電ユニット１１によって電荷を付与されるまでの所要時間を指す。本技術において、「遅延時間」という用語は、微粒子が検出ユニット３によって検出された時点から、以下に説明する液滴カメラ４によって撮像される画像情報において自動的に設定される、画像領域内の強度が最大に達する時点までの持続時間を指す。

【0026】

[0058] １－２ マイクロチップ

【0027】

[0059] 図２Ａおよび図２Ｂならびに図３Ａから図３Ｃは、フローサイトメーター１に設置可能なマイクロチップ２の例を示す。

【0028】

[0060] 図２Ａは上面の模式図を示し、図２Ｂは、図２Ａの線IIＢ－IIＢに対応する断面模式図を示す。また、図３Ａから図３Ｃは、マイクロチップ２のオリフィス２１の構成を概略的に示し、図３Ａは上面の模式図を示し、図３Ｂは断面の模式図を示し、図３Ｃは前面の模式図を示す。図３Ｂは、図２Ａの線IIIＢ－IIIＢに沿った断面に対応する。

【0029】

[0061] マイクロチップ２は、互いに接着されてサンプル流路２２を形成する基板層２ａおよび２ｂから形成されている。金型を用いて熱可塑性樹脂を射出成形することにより、基板層２ａ、２ｂからサンプル流路２２が形成できる。熱可塑性樹脂として、関連技術においてマイクロチップ材料として一般的に使用されているプラスチックが採用でき、それらは、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリメチルジシラザン（ＰＤＭＳ）などである。

【0030】

[0062] サンプル流体は、流体送出し接続部からサンプル入口２３に導入され、流体送出し接続部からシース入口２４に導入されるシース流体と合流し、サンプル流路２２を通って送り出される。シース入口２４から導入されたシース流体は、二方向に分割されて送り出された後、シース液がサンプル入口２３から導入されたサンプル液と合流する合流部において、シース液は、サンプル液と合流し、２つの方向からのサンプル流体を仲介する。したがって、合流部では、シース液層流の中心に、サンプル層流が内部に位置決めされた三次元層流が形成される。

【0031】

[0063] サンプル流路２２に詰まりまたは気泡が発生したとき、サンプル流路２２に負圧を付与する吸引流路２５は、一時的に流れを逆流させて詰まりまたは気泡を解消する。吸引流路２５の一端には、送液接続部を介して真空ポンプなどの負圧源に接続された吸引出口２５１が形成され、他端は、連通穴２５２においてサンプル流路２２に接続されている。

【0032】

[0064] 三次元層流において、層流幅は、制限部２６１（図２Ａおよび図２Ｂ）ならびに制限部２６２（図３Ａから図３Ｃ）で制限されており、制限部は、流体送出し方向に対するその垂直断面の表面積が、流体送出し方向の上流から下流に向かって段階的にまたは徐々に小さくなるように形成されている。その後、三次元層流は、流路の片側に設けたオリフィス２１から流体流れ（図１参照）となり、排出される。図１では、オリフィス２１からの流体流れの排出方向は、Ｙ軸正方向で表されている。

【0033】

[0065] オリフィス２１に対するサンプル流路２２の接続部は、直線状に形成された直線部２７である。直線部２７は、オリフィス２１からの流体流れがＹ軸正方向に直線状に排出されるように機能する。

【0034】

[0066] オリフィス２１から排出された流体流れは、チップ励起ユニットによってオリフィス２１に付与される振動により液滴に変換される。オリフィス２１は、基板層２ａ、２ｂの端面方向に開口しており、その開口位置と基板層端面との間にノッチ部２１１が設けられている。ノッチ部２１１は、オリフィス２１の開口部と基板端面との間で基板層２ａ、２ｂを、ノッチ部２１１の直径Ｌがオリフィス部２１の開口径ｌよりも大きくなるように切り欠いて形成されている（図３Ｃ参照）。ノッチ部２１１の直径Ｌは、オリフィス２１から排出された液滴の移動を妨げないように、オリフィス２１の開口径ｌの２倍以上に形成することが望ましい。

【0035】

[0067] １－３ 検出ユニット

【0036】

[0068] 図１には検出ユニット３が設けられ、これは、細胞などの微粒子から放出される測定対象光を光源３１から放出されるレーザーＬ１の照射によって検出する。検出ユニット３は、サンプル流路２２の制限部２６１（図２Ａおよび図２Ｂ参照）と制限部２６２（図３Ａから図３Ｃ参照）との間で細胞の特徴的な検出を行う。特性検出は特に限定されないが、例えば、光学的検出を用いる場合、３次元層流の中心にあるサンプル流路２２内の単一の列に流体が送り出されるように配置された細胞に関するレーザーＬ１の照射により（図１参照）、細胞から放出される散乱光および蛍光は、検出ユニット３によって検出される。

【0037】

[0069] 光の照射および検出のために、レーザー光源に加えて、集光レンズ、ダイクロイックミラーまたはバンドパスフィルターなどの、レーザーを細胞に集光して照射する照射システムも構成することができる。検出システムは、例えば、ＰＭＴ（光電子増倍管）、あるいはＣＣＤまたはＣＭＯＳデバイスなどのエリア撮像素子によって構成されている。

【0038】

[0070] 検出ユニット３の検出系によって検出される測定対象光は、測定光の照射によって細胞から放射される光であり、例えば、前方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱またはミー散乱のような散乱光、蛍光などにすることができる。これらの測定対象光は、電気信号に変換されて制御ユニット７に出力され、細胞の光学特性判別に利用される。

【0039】

[0071] さらに、検出ユニット３は、細胞の特徴を磁気的または電気的に検出することができる。この場合、マイクロチップ２のサンプル流路２２に、微小電極が互いに対向して配置され、抵抗値、容量値、インダクタンス値、インピーダンス、電極間の電界の変化値、または磁化、磁場の変化などが測定される。

【0040】

[0072] １－４ 液滴カメラ

【0041】

[0073] 図１には本技術の撮像装置４の一例が設けられ、撮像装置４は、マイクロチップ２のオリフィス２１から排出される液滴Ｄを撮像する、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳセンサーなどの液滴カメラである。液滴カメラ４は、撮像される液滴Ｄの画像の焦点を調整することができるように設計されている。フローサイトメーター１では、ブレークオフ点付近の液滴は、光源４１から放射されるストロボＬ２によって撮像される。ストロボＬ２は、複数の光源４１から出る複数の異なるタイプのストロボを含むことができる。例えば、１つのストロボＬ２はＬＥＤストロボを含み、それは、ブレークオフ点およびその近くで液滴の液滴画像を得るのに十分な光を提供することができる。加えて、別のストロボＬ２は、液滴内の微粒子を励起する較正ストロボを含むことができる。較正ストロボによって提供される微粒子の励起により、液滴カメラは較正画像を取得でき、較正画像は、以下に説明するように、微粒子の位置を示し、微粒子の強度の合計を決定するために使用される。一般に、ＬＥＤストロボは較正ストロボよりもはるかに短く、その理由は、較正ストロボによる微粒子からの放射が弱いためであり、したがって、高品質の較正画像を得るには、より長い較正ストロボが必要である。例えば、ＬＥＤストロボの長さは、液滴クロックサイクルの約２％にできる一方、較正ストロボは、液滴クロックサイクルの約５０％にできる。

【0042】

[0074] また、フローサイトメーター１では、マイクロチップが新しいマイクロチップに交換され、または外部環境（温度など）が変化するせいで、場合によっては、液滴形成パラメーター（シース圧力、液滴周波数、ピエゾ駆動圧力など）を変更することが必要となる。この場合、微粒子が検出ユニット３によって検出された後、微粒子を含む液滴に電荷が付与されるまでの時間（以下、この時間は遅延時間とも呼ばれる）を調整する必要がある。液滴カメラ４は、液滴Ｄを撮像するために、また後述する制御ユニット７が遅延時間を決定可能にするために機能する。

【0043】

[0075] より具体的には、液滴カメラ４は、液滴Ｄの複数の画像を複数の異なる時間に撮像でき、結果として後述する制御ユニット７が遅延時間を決定できるように設計されている。さらに、「遅延時間」という用語は、微粒子が検出ユニット３によって検出される時点から、画像領域内の強度が最大に達する時点までの期間を指し、強度は、液滴カメラ４によって撮像された液滴の画像情報の複数の項目を比較することによって計算される。さらに、「複数の異なる時間」という用語は、例えば各時間を指し、その間の間隔は、振動素子１３がオリフィス２１に加える振動の周波数の逆数の時間（言い換えれば、液滴Ｄの各々の排出間隔時間）である。

【0044】

[0076] また、制御ユニット７が遅延時間を決定できるようにするため、液滴カメラ４は、微粒子が検出ユニット３によって検出される時間から遅延時間が過ぎた後所定時間内に、液滴Ｄの複数の画像を撮像できるようになっている。さらに、「所定時間」という用語は、液滴Ｄの各々の排出間隔時間よりも短い時間を指す。

【0045】

[0077] また、液滴カメラ４は、制御ユニット７が後述する液滴Ｄの最適な排出周波数を決定できるように、Ｙ軸に沿って正方向または負方向に移動可能に設計されている。

【0046】

[0078] また、液滴カメラ４で撮像された画像は、ディスプレイなどの表示部に表示されるとともに、ユーザーがオリフィス２１内にある液滴Ｄの形成状態（サイズ、形状、間隔など）を確認するために使用される。

【0047】

[0079] １－５そらせ板

【0048】

[0080] 図１には一対のそらせ板５１および５２が設けられ、両そらせ板は、オリフィス２１から排出され液滴カメラ４によって撮像される液滴Ｄを挟むように、互いに対向して配置されている。

【0049】

[0081] そらせ板５１および５２は電極を含み、電極は、オリフィス２１から排出される液滴の移動方向を、液滴に付与される電荷に加わる電気力を用いて制御するように構成されている。さらに、そらせ板５１および５２はまた、オリフィス２１から排出される液滴Ｄの軌道を、液滴Ｄに付与される電荷に加わる電気力を用いて制御する。図１では、そらせ板５１および５２の対向方向はＸ軸方向で表される。

【0050】

[0082] １－６ 回収容器

【0051】

[0083] フローサイトメーター１では、液滴Ｄは、そらせ板５１、５２の対向方向（Ｘ軸方向）に一列に配置された、複数の回収容器６１１、６１２、６２または６３のいずれかに収容される。回収容器６１１、６１２、６２または６３は、通常、実験に使用されるプラスチック管またはガラス管にすることができる。回収容器６１１、６１２、６２または６３の数は特に限定されないが、ここでは４つ配置された場合を示す。オリフィス２１から排出された液滴Ｄは、そらせ板５１とそらせ板５２との間の電気力の有無または大きさに応じて、４つの回収容器６１１、６１２、６２または６３の１つに案内されて回収される。

【0052】

[0084] 回収容器６１１、６１２、６２および６３は、回収容器として用いる容器（図示しない）に交換可能なやり方で配置される。回収容器として用いる容器（図示しない）は、オリフィス２１からの液滴の排出方向（Ｙ軸方向）と直交しかつそらせ板５１および５２の対向方向（Ｘ軸方向）と直交する方向（Ｚ軸方向）に移動可能に構成されたＺ軸ステージ（図示しない）上に配置されている。

【0053】

[0085] １－７ 制御ユニットまたは類似物

【0054】

[0086] フローサイトメーター１は、上述した構成に加えて、検出ユニット３によって検出された細胞などの特徴的な判別のためのデータ分析部、サンプル液およびシース液を保持するためのタンク部、通常のフローサイトメーターに備わって上記構成の各々を制御するための制御ユニット７などを備えている。

【0055】

[0087] 制御ユニット７は、ＣＰＵ、メモリ、ハードディスクなどを備えた通常のコンピュータにより構成され、ハードディスク上には、ＯＳ、次に説明する遅延時間決定方法に関する各ステップを実行するプログラムなどが記憶されている。

【0056】

[0088] ２．本技術による微粒子分類装置における遅延時間決定方法

【0057】

[0089] ２－１ 微粒子検出ステップＳ１

【0058】

[0090] 図４は、フローサイトメーター１における遅延時間決定ステップを説明するフローチャートである。遅延時間決定ステップは、「微粒子検出ステップＳ１」、「液滴排出ステップＳ２」、「液滴撮像ステップＳ３」、「排出周波数決定ステップＳ４」、「画像領域決定ステップＳ５」、および「遅延時間決定ステップＳ６」のプロセスを含む。また、上記の遅延時間決定ステップの後に、「微粒子分類ステップＳ７」のプロセスを実行することができる。以下、各プロセスについて説明する。

【0059】

[0091] まず、微粒子検出ステップＳ１では、制御ユニット７は、流体送出し接続部に信号を出力し、サンプル流体およびシース流体の流体送出しを開始する。さらに、検出ユニット３は、例えば、レーザーＬＩの照射によって、サンプル流路２２にあるサンプルに含まれる微粒子を検出する。また、本ステップＳ１および後述するステップＳ２からステップＳ６は、検出ユニット３が目標細胞などを検出してから帯電ユニット１１が細胞などを含む液滴に電荷を付与するまでの、遅延時間を決定するための較正処理である。そのため、微粒子としては、形状などが予め明らかな工業用微粒子などの較正用ビーズを使用することが好ましい。

【0060】

[0092] ２－２ 液滴排出ステップＳ２

【0061】

[0093] 液滴排出ステップＳ２では、振動素子１３がオリフィス２１に振動を付与し、液滴Ｄがオリフィス２１から排出され、液滴Ｄは廃液入口に集められ、流体を処理することができる（図４参照）。

【0062】

[0094] ２－３ 液滴撮像ステップＳ３

【0063】

[0095] 液滴撮像Ｓ３において、制御ユニット７は液滴カメラ４に信号を出力し、信号を受信した液滴カメラ４は、排出されストロボＬ２（図４参照）によってストロボされた液滴Ｄを撮像する。液滴カメラ４は、後述する液滴クロックの間隔と同じまたはそれよりも短い間隔で画像を撮像することができる。

【0064】

[0096] 図５Ａ～図５Ｃを参照して、液滴カメラ４は、液滴画像５０１および較正画像５１１を撮像することができる。図５Ａに示す液滴画像５０１を取得するために、ＬＥＤストロボ５０３がストロボＬ２として放射される。図５Ｂに示す較正画像５１１を取得するために、微粒子を励起する較正ストロボ５１３がストロボＬ２から放射される。上述したように、ＬＥＤストロボ５０３は、一般に較正ストロボ５１３よりも短い。図５Ｃは、液滴クロック５００に関して、ＬＥＤストロボ５０３と較正ストロボ５１３との間のタイミング差の例示的な実施形態を示す。

【0065】

[0097] このとき、例えば、制御ユニット７は、液滴カメラ４に信号を出力し、信号を受信した液滴カメラ４をＸ軸方向またはＹ軸方向に移動させることができる。さらに、制御ユニットは、液滴カメラ４による液滴Ｄの画像の撮像において、Ｚ軸方向の焦点調整を行うことができる。例えば、制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された画像のコントラスト比が所定の範囲内に入るまで、焦点を調整することができる。

【0066】

[0098] ２－４ 排出周波数決定ステップＳ４

【0067】

[0099] 排出周波数決定ステップＳ４では、制御ユニット７は、液滴カメラ４を所定位置に移動させ、液滴Ｄの排出周波数を、液滴カメラ４によって撮像された画像情報に基づいて調整する（図４参照）。上述した所定位置は、特に限定されないが、オリフィス径および駆動圧力などの排出条件に応じて予め設定された位置にすることができる。

【0068】

[0100] さらに、制御ユニット７は、液滴Ｄの最適な排出周波数を、液滴ＤがＹ軸方向において形成され始める位置（以下、ブレークオフ点と呼ぶ）がオリフィス２１に最も近い、所定位置における排出周波数に決定する。さらに、本ステップＳ４は、後述するステップＳ５の後に行うこともできる。

【0069】

[0101] このように、フローサイトメーター１では、最適な排出周波数は、ブレークオフポイントに基づいて制御ユニット７によって決定されるため、ユーザーが手動で液滴周波数を設定する煩わしさを解消することができる。

【0070】

[0102] ２－５ 粗い遅延時間決定ステップ

【0071】

[0103] 粗い遅延時間決定ステップＳ５において、制御ユニット７は、微粒子が検出ユニット３（図４参照）によって検出された時点から液滴カメラ４によって撮像された、画像情報の液滴Ｄの複数の項目を比較することによって液滴Ｄの粗い遅延時間を決定する。

【0072】

[0104] 本明細書において、「粗い遅延時間」は、本ステップＳ５によって暫定的に遅延時間として扱われる時間を指し、これは、後述する遅延時間ステップＳ７によって細かい遅延時間が決定されるまでの時間である。より具体的には、「粗い遅延時間」という用語は、微粒子が検出ユニット３によって検出された時間から、液滴Ｄの複数の時間に取得された較正画像の強度の合計が所定領域（以下に説明する）において最大に達する時間までの持続期間を指す。代わりに、これは、所定領域内における輝点の数が最大に達したときに決定することができ、輝度の数は、複数の異なる時間に液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの複数の較正画像を比較することによって算出される。さらに、「複数の異なる時間」という用語は、特に限定されないが、例えば各時間を指し、その間の間隔は、振動素子１３がオリフィスに付与する振動の周波数の逆数の時間である（言い換えれば、液滴Ｄの各々の排出間隔時間を指し、以下「液滴クロック」と呼ばれる）。

【0073】

[0105] 図５Ａから図５Ｄは、フローサイトメーター１の液滴カメラ４によって撮像された液滴の画像の一例を示す写真であり、異なる時間に撮像された画像を表わす（図５Ａから図５Ｄ参照）。より具体的には、図５Ａから図５Ｄは、微粒子が検出ユニット３によって検出された撮像された時間（ＴＯ）において、液滴カメラ４によって撮影された液滴Ｄが第１の液滴として設定されたとき、検出された微粒子がどの液滴に含まれるかを示す写真図である。さらに、各写真表示はまた、複数の撮像化された画像が一緒に統合された表示にすることができる。

【0074】

[0106] 図５Ａから図５Ｄにおいて、「区間１」という用語は、画像Ｐに予め設定された所定領域を指す。

【0075】

[0107] 制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの複数の画像を、液滴クロックの間隔で比較し、ＴＯから「セクション１」内の強度の合計数（または輝点の数）が粗い遅延時間として最大に達するまでの時間を事前に決定する。さらに、「強度の合計」という用語については、以下でさらに詳しく説明する。加えて、「輝点」は、液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの画像において、輝度が所定の閾値よりも高い画素を指し、レーザーＬ２によって照射される励起された液滴Ｄに含まれる微粒子の画像情報の項目である。

【0076】

[0108] 図５Ａから図５Ｄにおいて、本技術の一例として、「輝点」という用語は、ＴＯにてオリフィス２１から排出されて液滴カメラ４によって撮像される液滴Ｄを第１の液滴として設定するとき、第３０番目から第３３番目の液滴の排出時に、液滴カメラ４によって撮像される画像を指す。例えば、第３０番目の液滴は、Ｎ＝３０で表される写真表示である（図５Ａを参照）。

【0077】

[0109] 図５Ａから図５Ｄに示す例では、制御ユニット７は、Ｎ＝３２の画像情報（図５Ｃ参照）に基づいて、「セクション１」内の輝点Ｂの数が最大に達する微粒子は、第３２番目の液滴に含まれていると判別できる。すなわち、制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの複数の画像を液滴クロックの間隔で比較し、微粒子が検出されてから第３２番目の液滴が排出される時間までの粗い遅延時間を、粗い遅延時間として事前に決定することができる。

【0078】

[0110] このように、フローサイトメーター１では、「区分１」内の画像情報における強度の合計（または輝点の数）を複数の異なる時間に関して比較することによって、粗い遅延時間を遅延時間として事前に決定することができる。

【0079】

[0111] ２－６ 画像領域決定ステップＳ６

【0080】

[0112] 画像領域決定ステップＳ６では、制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの画像情報を分析することによって、複数の画像領域を決定する。一実施形態では、制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された液滴画像６０１を分析することによって、複数の画像領域を決定する。

【0081】

[0113] ここで、「複数の画像領域」という用語は液滴画像６０１の領域を指し、その強度が測定されしかも滴下遅延が決定され、滴下遅延は、後述するように複数の画像項目を比較することによって計算され、計算では液滴カメラ４によって複数の異なる時間に撮像された液滴Ｄの強度情報は最大に達する。さらに、「複数の異なる時間」という用語は、特に限定されないが、例えば各時間を指し、その間の間隔は、振動素子１３がオリフィスに加える振動の周波数の逆数の時間である（言い換えれば、各液滴Ｄの排出間隔時間を指し、以下「液滴クロック」と呼ばれる）。

【0082】

[0114] 複数の画像領域を決定するには２つの方法がある。第１の方法は液滴Ｄの下縁を検出することを含み、第２の方法は液滴Ｄの上縁を検出することを含む。特に、第１の方法では、最後に付着した液滴の下縁および最初に分離した液滴の下縁が検出される。図７Ａから図７Ｃは、所定時間における液滴画像７０１、７０２（図７Ａおよび図７Ｂ）ならびに較正画像７１１（図７Ｃ）の例を示す写真であり、第１の方法に従って複数の画像領域を決定するプロセスを表わす。より具体的には、図７Ａに、最後に付着した液滴７２０の下縁、および最初に付着した液滴７２２の下縁が示される。最後に付着した液滴７２０の下縁と最初に分離した液滴７２２の下縁との間の距離によって定まる領域は、複数の画像領域の１つである最下画像領域Ｓ２である。最後に付着した液滴７２０の下縁と最初に分離した液滴７２２の下縁との間のこの距離は、一般に画像領域高さと呼ばれ、または特定の場合にはＳ２画像領域高さ７４０と呼ばれることがある。一実施形態では、他の画像領域は以下のように決定される。Ｓ２画像領域高さ７４０が測定され、同じ距離が適用されて、最下の画像領域Ｓ２の上にさらに２つの画像領域Ｓ１およびＳ０が生成される。好ましくは、中央の画像領域はＳ１（Ｓ１画像領域高さ７４２である）と名付け、最上の画像領域はＳ０（Ｓ０画像領域高さ７４４である）と名付けている。したがって、各画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２は、画像領域高さ７４０、７４２、７４４が同じである。図７Ｂは、３つの画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２が描かれた液滴画像７０２を示し、図７Ｃは、図７Ｂの較正画像６１１を示し、この場合も３つの画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２を有する。別の実施形態では、Ｓ２画像領域高さを決定した後（上述したように）、Ｓ１画像領域高さおよびＳ２画像領域高さは、最後に付着した液滴７２０上の２つの付着液滴の各々の下縁を決定することによって各々個別に決定される。したがって、この実施形態では、Ｓ２、Ｓ１およびＳ０画像領域高さ７４０、７４２および７４４は、必ずしも同じ距離を占めるわけではない。画像領域高さを決定するための２つ実施形態が別個に説明されているが、それらは結合して使用することができる。例えば、Ｓ２およびＳ１画像領域高さ７４０、７４２は、各々、第２の実施形態で説明した方法によって個別に決定することができ、一方Ｓ０画像領域は、Ｓ２およびＳ１画像領域高さ７４０、７４２の何れかの画像領域高さを複製することによって決定される。複数の画像領域を決定するこの第１の方法は、液滴流れが速いサテライトを含むとき優先的に使用する。速いサテライトは、サテライト７３０がその前の液滴（すなわち、図７Ａおよび図７Ｂのサテライトの下の液滴）と最終的に結合するとき含まれる。この方法を用いて複数の画像領域を決定することは、サテライトが最終的に結合する液滴を有する画像領域内のサテライト７３０を含む。また、図７Ｄは、第１の方法用の液滴クロック６００に関するＬＥＤストロボ６０３および較正ストロボ６１３の一実施形態を示す。図７Ｄに示すように、この例示的な実施形態における較正ストロボ６１３およびＬＥＤストロボ６０３は、同時に終了し、ＬＥＤ６０３ストロボは較正ストロボ６１３よりも短い。

【0083】

[0115] 図８Ａから図８Ｃは、複数の画像領域を決定する第２の方法を示す。特に、複数の画像領域を決定する第２の方法では、第１の分離液滴８２０および第２の分離液滴８２２の上縁が検出される。図８Ａでは、第１および第２の分離された液滴８２０、８２２の上縁が示される。第２の分離液滴８２２の上縁と第１の分離液滴８２２の上縁との間の距離によって定まる領域は、複数の画像領域のうちの１つである最下画像領域Ｓ２である。第２の分離された液滴８２２の上縁と第１の分離された液滴８２０の上縁との間のこの距離は、一般に画像領域高さと呼ばれ、または特定の場合には、Ｓ２画像領域高さ８４０と呼ばれる。一実施形態では、他の画像領域は以下のように決定される。Ｓ２画像領域高さ８４０を測定し、同じ距離が適用されて、最下の画像領域Ｓ２の真上にさらに２つの画像領域Ｓ１およびＳ０が生成される。好ましくは、中央の画像領域はＳ１（Ｓ１画像領域高さ８４２である）と名付け、最上の画像領域はＳ０（Ｓ０画像領域高さ８４４である）と名付けている。したがって、各画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２は、画像領域高さ８４０、８４２、８４４が同じである。図８Ｂは、３つの画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２が描かれた液滴画像８０２を示し、図８Ｃは、図８Ｂの較正画像８１１を示し、この場合も３つの画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２を有する。別の実施形態では、Ｓ２画像領域高さ８４０を決定した後（上述したように）、Ｓ１画像領域高さ８４２およびＳ２画像領域高さ８４４は、最後に付着した液滴の上縁および最後に付着した液滴の上にある液滴の上縁によって各々それぞれ決定される。したがって、この実施形態では、Ｓ２、Ｓ１およびＳ０画像領域高さ８４０、８４２および８４４は、必ずしも同じ距離であるとは限らない。画像領域高さを決定するための２つの実施形態が別個に説明されているが、それらは結合して使用することができる。例えば、Ｓ２およびＳ１画像領域高さ８４０、８４２は、各々第２の実施形態で説明した方法によって個別に決定することができ、一方Ｓ０画像領域は、Ｓ２およびＳ１画像領域高さ８４０、８４２の何れかの画像領域高さを第１の実施形態で説明した方法によって複製することにより決定される。複数の画像領域を決定する第２の方法は、液滴流れが遅いサテライトを含むとき優先的に使用する。遅いサテライトは、サテライトがその後の液滴（すなわち、図８Ａおよび図８においてサテライトの上の液滴）と最終的に結合するとき含まれる。この方法を使用して複数の画像領域を決定することは、サテライトが最終的に結合する液滴を有する画像領域内のサテライト８３０を含む。また、図８Ｄは、第２の方法用の液滴クロック６００に関するＬＥＤストロボ６０３および較正ストロボ６１３の一実施形態を示す。図８Ｄに示すように、この例示的な実施形態における較正ストロボ６１３およびＬＥＤストロボ６０３は同時に始まり、ＬＥＤストロボ６０３は較正ストロボ６１３よりも短い。

【0084】

[0116] ２－７ 細かい遅延時間決定ステップ

【0085】

[0117] 図４に示す遅延時間決定ステップＳ７では、まず、制御ユニット７は、液滴カメラ４によって撮像された液滴Ｄの複数の画像領域に基づいて、上述した隣接情報を参照する。この方法は、図８から図１０を参照して以下に説明する。さらに、隣接情報は、複数の画像領域の強度の合計に関する情報である。

【0086】

[0118] ２－７－０ 一般的な細かい遅延時間決定ステップ

【0087】

[0119] 最初に、ＬＥＤストロボも較正レーザーも励起されていない画像を取得することによって較正画像の背景強度が決定される。本質的に、背景強度は、光源がないが背景光が存在し得る画像である。

【0088】

[0120] 次に、液滴の較正画像が撮られ、予め設定された遅延時間内に蓄積される。複数の較正画像をカメラによって撮る。液滴内の蛍光のビーズが弱いとき、複数の液滴画像を集約して最終的な較正画像を取得することができる。最終的な較正画像を取得するために、任意の数の較正画像が集約できる。較正画像の集約により、測定すべくより明るいスポットを持つ較正画像を取得するのが支援される。

【0089】

[0121] 第３に、背景強度が較正画像（それが単一の較正画像であっても、複数の較正画像の集約であっても）から差し引かれる。単一の背景強度の合計を差し引き、または背景強度の合計に集約された較正画像の数を掛けたものを差し引くことができる。

【0090】

[0122] 第４に、較正画像（それが単一の較正であっても、複数の較正画像の集合であっても）を取得した後、画像領域の各々の強度の合計が決定される。このプロセスでは、各画像領域が複数の画像領域サブエリアに分割される。たとえば、画像領域は、較正画像の各ピクセルによって定まるサブエリアを含むことができる。好ましくは、サブエリアは、長方形状（例えば、正方形）であるが、３つ以上の辺を有する他の幾何学的形状が適切である。同様に、サブエリアは全ての面積が同じでもよいが、本方法は、サブエリアの全ての面積が同じである方法に限定されない。各サブエリアが設定されると、各個々のサブエリアの強度が決定される。たとえば、ピクセルあたり８ビットのデータを備えるカメラが使用されているとき、サブエリアは、強度範囲が０から２５５であることができる。代わりに、ピクセルあたり１０ビットのデータを備えるカメラの強度範囲は０から１０２４である。強度は較正画像に基づいて測定する。各個々のサブエリアの強度が決定されると、画像領域内の全てのサブエリアの強度の合計は、個々のサブエリアの強度を合計することによって決定される。このプロセスは、各画像領域について、各画像領域が強度値の独自の合計を持つように繰り返される。各画像領域（Ｓ０、Ｓ１、およびＳ２）に関するこの強度値の合計がグラフにプロットされる。

【0091】

[0123] 第５に、新しい遅延時間が選択され、以前の段落の第２番目から第４番目のステップが繰り返される。このステップ自体は、次いで２つ以上の遅延時間について画像領域の各々の強度値に関する合計が決まるまで繰り返される。一実施形態では、強度の合計が決定される２つ以上の遅延時間は、複数の遅延時間値にわたる。たとえば、２つ以上の遅延時間は、合計３つまたは５つの完全な遅延期間にわたる。別の実施形態では、強度の合計が決定される２つ以上の遅延時間は同等な間隔にある。たとえば、遅延時間が３６０度であるとき、強度の合計が決定される各遅延時間は２０度だけ離れている。この場合、強度の合計が決定される５５個の合計遅延時間は、３つの完全な遅延時間（たとえば、遅延時間：３０、３０＋２０°、３０＋４０°、・・・、３３）の期間について、そのようになされたとき、生じる。代わりの実施形態では、強度の合計が決定される遅延時間は、４０度、６０度、または９０度だけ離れている。強度の合計が決定される各遅延時間において、Ｓ０、Ｓ１、およびＳ２に関する強度の合計がグラフにプロットされる。そのようなグラフの例は、図８から図１０に描かれている（以下で詳しく説明する）。３つの完全な遅延時間をプロットする方法の場合、強度の合計が決定される最初の遅延時間は、以上で決定された粗い遅延時間よりも短い１つの完全な遅延時間にすることができる。たとえば、粗い遅延時間が３０の場合、この反復プロセスは遅延時間２９から始まり、連続する各間隔で画像領域の強度の合計を測定し続ける（すなわち、２０度間隔が選択されているとき：遅延時間２９、２９＋２０°、２９＋４０°、・・・、３２）。しかしながら、粗い遅延時間よりも短い２つの遅延時間から開始して、３つの遅延期間の間（すなわち、粗い遅延時間よりも長い１つの遅延時間に）進むこともできる。粗い遅延時間の周りの任意の範囲が、粗い遅延時間がその範囲内に含まれている限り、許容される。

【0092】

[0124] 最後に、各画像領域に関する強度の合計の各々が決定され、グラフ上にプロットされ（上述した通り）、以下の方法の何れか使用して、細かい遅延時間が決定される。

【0093】

[0125] ２－７－１ 最初の細かい遅延時間決定方法

【0094】

[0126] まず、図９を参照して、３つの画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２全ての強度の合計を参照して遅延時間を決定する、第１の遅延時間決定方法について説明する。

【0095】

[0127] 図９は、各画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２についての、３つの滴下遅延時間のスパンにわたる、強度測定値の合計のグラフ表示である。ｘ軸は滴下遅延時間９１０を表わし、左側のｙ軸は強度の合計９１１を表わし、右側のｙ軸はＳ１比９１２（後述する）を表わす。図９において、線９００は、領域Ｓ０について様々な滴下遅延時間における強度の合計を表わし、線９０１は、領域Ｓ１について様々な滴下遅延時間における強度の合計を表わし、線９０２は、領域Ｓ２について様々な滴下遅延時間における強度の合計を表わし、線９０５はＳ１比（後述する）を表わす。

【0096】

[0128] 次いでＳ１比を決定する。Ｓ１比は次の式を用いて決定される。

【0097】

【数2】

【0098】

[0130] Ｓ１比の式では、Ｓ１は、所定の滴下遅延時間における画像領域Ｓ１の強度の合計を表わし、Ｓ２は、所定の滴下遅延時間における画像領域Ｓ２の強度の合計を表わし、Ｓ０は、所定の滴下遅延時間における画像領域Ｓ０の強度の合計を表わす。上記のステップで強度の合計が測定される各滴下遅延時間についてＳ１比が測定され、結果が図９のグラフに線９０５としてプロットされている。

【0099】

[0131] これから、Ｓ１比が最大になる滴下遅延時間を決定することによって、最適な滴下遅延時間の概算値を決定することができる。これは、図９のグラフを表示することによって実現できる。代わりに、線９０５によって表されるＳ１比の値のプロットは、多項式近似を用いて近似することができる。一実施形態では、６次多項式近似を用いて、線９０５によって示されるＳ１比値のセットに最も適合する方程式が決定される。近似から、Ｓ１比に関する最大値を数学的に決定することができ、その場合Ｓ１比の最大値は最適な遅延時間を表わす。

【0100】

[0132] 以上により、フローサイトメーター１では、制御ユニット７は、液滴の各画像領域Ｓ０、Ｓ１、Ｓ２の強度の合計に関する隣接情報を参照することによって遅延時間を算出する。このように、フローサイトメーター１において、最適な滴下遅延時間は、最後に付着した液滴が最大数のビーズを含むととともに、前および後の液滴が最小数のビーズを含むポイントにおける滴下遅延を表わす。したがって、液滴に電荷を正確かつ自動的に付与することが可能である。

【0101】

[0133] さらに、本ステップＳ７の一例である第１の遅延時間決定方法は、サンプルに含まれる微粒子の検出をマイクロチップ２で行い、液滴Ｄに対する電荷の付与を空中で行う場合に、好適に用いられる。言い換えれば、サンプルの速度はマイクロチップ２の内部と空中との間で変化するため、サンプルに電荷を付与するタイミングを調整する必要がある場合、最初の遅延時間決定方法を用いて決めるのが特に有効である。

【0102】

[0134] ２－７－２ 細かい遅延時間の決定方法

【0103】

[0135] 次に、画像領域Ｓ０およびＳ２の強度の合計の最小値を求めることによって遅延時間を決定する、第２の遅延時間決定方法について図１０を参照して説明する。この方法では、全てのステップは最初の方法（ステップ２－７－１）と同じように実行されるが、ここでは、最適な滴下遅延値は、画像領域Ｓ０とＳ２との結合時、強度値の合計の最小値を見つけることによって決定される。図１０において、線１０００は、領域Ｓ０の強度の測定された合計を表わし、線１００２は、領域Ｓ２の強度の測定された合計を表わす。

【0104】

[0136] ２－７－３ 第３の細かい遅延時間決定方法

【0105】

[0137] 次に、画像領域Ｓ１の強度の合計の最大値を見つけることによって遅延時間を決定する、第３の遅延時間決定方法について図１１を参照して説明する。この方法では、全てのステップを最初の方法（ステップ２－７－１）と同じように行うが、ここでは、最適な滴下遅延値は、画像領域Ｓ１の強度値の合計の最大値を見つけることによって決定される。図１１において、線１１０１は、領域Ｓ１の強度の測定された合計を表わす。

【0106】

[0138] ２－７－４ 代替機能

【0107】

[0139] 上記ステップは、検出された微粒子の最大数が最後に付着した液滴（すなわち、画像領域Ｓ１）にある時期を判断する方法について説明している。これらの実施形態では、微粒子分類ステップ（以下にＳ８で詳細に説明する）は、微粒子が最後に付着した液滴に位置し、次いで帯電微粒子がこの電荷に基づいて分類されるとき、液滴中の微粒子に電荷を付与する。しかしながら、背景ノイズまたはその他の問題に起因して、より鮮明でより高品質の較正画像が液滴流れ内の別の場所で得られる場合がある。そのような場合、最後の付着液滴にない微粒子のセットによって決定される場合、最後に付着した液滴に微粒子がある時期を決定するのに必要な細かい遅延時間は、取得した細かい遅延時間に対して遅延時間を単に追加しまたはこれを単に減算することによって決定される。たとえば、最後に付着した液滴よりも２滴だけ上流にある液滴内の微粒子の数を最大化することによって細かい遅延時間が決定される場合、細かい遅延時間を算出するには、微粒子が最後に付着した液滴にあるときの代わりに、単にそれに２つの遅延時間を追加して細かい遅延時間を決定するだけでよい。一実施形態では、最高品質の較正画像が得られ、最後に付着した液滴は画像領域Ｓ２として定まり、上の液滴は画像領域Ｓ１であり、その上の液滴は画像領域Ｓ０であり、この場合細かい遅延時間は、画像領域Ｓ１の強度の合計を最大化することによって決定される。この実施形態では、画像領域Ｓ１における強度の合計（液滴内の所望の微粒子の数に対応する）を最大化する細かい遅延時間が決定されると、単にそれに１つの遅延時間を追加して、最後に付着した液滴中の所望の微粒子の数を最大化するための遅延時間が得られる。

【0108】

[0140] ２－８ 微粒子分類ステップＳ８

【0109】

[0141] 図１２は、フローサイトメーター１で細胞などの微粒子を分類するステップＳ８を説明するフローチャートである。微粒子分類ステップＳ８では、フローサイトメーター１は、上記ステップＳ１からＳ７で決定された遅延時間に基づいて、細胞などの微粒子を含む液滴の分類を行う。軌道方向判別ステップは、「微粒子検出ステップＳ－８－１」および「液滴排出および電荷付与ステップＳ－８－２」のプロセスを含む。以下、各プロセスについて説明する。

【0110】

[0142] ２－８－１ 微粒子検出ステップ

【0111】

[0143] まず、本ステップＳ－８－１では、検出ユニット３が微粒子を検出する。検出方法は、上述したステップＳ１における処理と同様に行うことができる。

【0112】

[0144] ２－８－２ 液滴排出および電荷付与ステップＳ－８－２

【0113】

[0145] 次に、本ステップＳ－８－２において、細胞などの微粒子が検出ユニット３によって検出された後から所定の遅延時間が経過すると、制御ユニット７は、帯電ユニット１１に信号を出力し、微粒子を含む液滴に電荷を付与する（図１１を参照）。さらに、帯電ユニット１１は液滴に電荷を付与する。

【0114】

[0146] 当業者であれば、さまざまな修正、結合、副結合および変更が、それらが添付の特許請求の範囲またはその均等物の範囲内である限り、デザイン要件および他の要因に応じて生じ得ることを理解する。

【符号の説明】

【0115】

１ フローサイトメーター
４ 撮像装置
３ 検出ユニット
７ 制御ユニット
１１ 帯電ユニット

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A-5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A-7C】

【図7D】

【図8A-8C】

【図8D】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】