(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-17
(45)【発行日】2022-02-28
(54)【発明の名称】反芻家畜の免疫賦活化用飼料組成物
(51)【国際特許分類】
A23K 20/174 20160101AFI20220218BHJP
A23K 20/158 20160101ALI20220218BHJP
A23K 50/10 20160101ALI20220218BHJP
A61K 31/122 20060101ALI20220218BHJP
A61K 31/19 20060101ALI20220218BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220218BHJP
【ＦＩ】
A23K20/174
A23K20/158
A23K50/10
A61K31/122
A61K31/19
A61P37/04
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2017074717
(22)【出願日】2017-04-04
(65)【公開番号】P2018174729
(43)【公開日】2018-11-15
【審査請求日】2020-03-13
(73)【特許権者】
【識別番号】592172574
【氏名又は名称】明治飼糧株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100097825
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 久紀
(74)【代理人】
【識別番号】100137925
【弁理士】
【氏名又は名称】松本 紀一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100158698
【弁理士】
【氏名又は名称】水野 基樹
(72)【発明者】
【氏名】小原 嘉昭
(72)【発明者】
【氏名】岩下 有宏
(72)【発明者】
【氏名】折橋 毅典
(72)【発明者】
【氏名】大谷 喜永
(72)【発明者】
【氏名】新居 彦治
【審査官】赤坂 祐樹
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３５９７５７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１１－２３４６７９（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／０９９４９５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】近江那緒子 ほか，乳牛用飼料へのビタミンK3添加給与はメタン生成を低減して乳生産を向上する，日本畜産学会大会講演要旨，2017年03月28日，Vol. 122，Page 104
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ２３Ｋ １０／００－５０／９０
Ａ６１Ｋ ３１／１２２
Ａ６１Ｋ ３１／１９
Ａ６１Ｐ ３７／０４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ビタミンＫ類を有効成分とし、更に、酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分として併用することを特徴とする、反芻家畜の免疫賦活化用飼料組成物。
【請求項2】
ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を有効成分とし、更に、酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分として併用することを特徴とする、請求項１に記載の飼料組成物。
【請求項3】
ビタミンＫ類、更に、酢酸及び／又は酢酸塩を反芻家畜に経口投与又は給与することを特徴とする、反芻家畜の免疫賦活化方法。
【請求項4】
ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上、更に、酢酸及び／又は酢酸塩を経口投与又は給与することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
ビタミンＫ類を１日当たり１０～２００ｍｇ／頭経口投与又は給与することを特徴とする、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
酢酸及び／又は酢酸塩を１日当たり酢酸として３０～３００ｇ／頭経口投与又は給与することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ビタミンＫ類を有効成分とする反芻家畜のリンパ球の幼若化による免疫賦活化用飼料組成物。
【請求項8】
ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を有効成分とする、請求項７に記載の飼料組成物。
【請求項9】
反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、請求項１～２、７～８のいずれか１項に記載の飼料組成物。
【請求項10】
ビタミンＫ類を反芻家畜に経口投与又は給与することを特徴とする、反芻家畜のリンパ球の幼若化による免疫賦活化方法。
【請求項11】
ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を経口投与又は給与することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ビタミンＫ類を１日当たり１０～２００ｍｇ／頭経口投与又は給与することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、請求項３～６、１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、反芻家畜の免疫賦活化用飼料組成物等に関する。詳細には、簡便且つ効果的に、反芻家畜の免疫機能活性化などをさせる飼料組成物、飼養方法等に関する。
【背景技術】
【0002】
牛、羊、山羊などのように乳、肉等が商品となる反芻家畜においては、飼育している個体の体調不良や病気等は、酪農農家や畜産農家にとって深刻且つ直接的な経営問題となる。しかし、生産性やコストなどを重視する点から、大規模・集約型の飼育環境を採用する場合も多くあり、このような飼育環境が原因による感染症等は予防が極めて困難である。
【0003】
特に、日和見感染などは輸送ストレス、暑熱ストレス等の有害な要因によって免疫機能が低下することにより誘発されると考えられており、このような感染症に対しては、消費者の食の安全性に関する関心の高まりから抗菌剤の使用は難しく、また、物理的衛生対策では十分な効果が期待できない。したがって、反芻家畜自体の免疫機能を高める方策が着目されている。
【0004】
なお、反芻家畜の免疫系はマウスやヒトなどと同様のシステムと考えられており、これまでに核酸関連物質、乳酸菌培養濾過上清、リグニン配糖体などが牛の免疫賦活化を行うという報告もある。しかし、上述のような背景技術において、当業界では、これら以外にも有効な飼料成分、飼料組成物、飼料添加剤等の開発が引き続き望まれている。
【0005】
一方で、ビタミンＫ類は血液凝固因子や骨基質タンパク質の翻訳後修飾過程において必須の栄養成分とされており、例えば、天然にはビタミンＫ１（フィロキノン）とビタミンＫ２（メナキノン－４～１４）、合成品としてビタミンＫ３（メナジオン）、ビタミンＫ４（メナジオール二リン酸ナトリウム）、ビタミンＫ５（４－アミノ－２－メチル－１－ナフトール）等が存在する。このうち、ヒトでの使用が認められているのはビタミンＫ１、ビタミンＫ２、ビタミンＫ４である。
【0006】
なお、ビタミンＫ３はヒトでの利用は禁止されているが、家畜用としての利用は許可され、哺乳子ウシ用の飼料添加物として代用乳への添加などがされている。また、反芻家畜の乳中の高度不飽和脂肪酸含量を高めるためにメナキノン－４を有効成分として用いるという報告もある（特許文献１）。しかし、ビタミンＫ類を反芻家畜の免疫賦活化のための有効成分として用いるという報告等は、現状では見当たらない。
【0007】
逆に、マウスやヒトの免疫細胞では、ビタミンＫ３が酸化還元依存的な炎症反応及び免疫反応を抑制したこと（非特許文献１）や、ビタミンＫ３やビタミンＫ５が活性化Ｔ細胞における増殖応答を阻害し、アポトーシスを誘導することによってＴ細胞媒介性免疫を弱めること（非特許文献２）などの実験報告があり、いずれもビタミンＫ類の免疫機能抑制能が示唆されていると言える。
【0008】
また、酢酸は、反芻家畜の第一胃（ルーメン）内細菌により産生される主な揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）であり、反芻動物においてはグルコースに匹敵するくらい重要なエネルギー源である。この酢酸については、反芻家畜の唾液分泌を亢進させるとともに、ルーメン粘膜の炭酸脱水酵素を活性化してルーメンからのＶＦＡの吸収を促進することなどが報告されている。
【0009】
しかし、酢酸や酢酸塩の反芻家畜への経口投与又は給与や反芻家畜ルーメン内の酢酸濃度上昇が免疫機能に与える影響についての記載や示唆がある文献等は、ビタミンＫ類と同様に今のところ見出せない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【文献】特開２０１１－２３４６７９号公報
【非特許文献】
【0011】
【文献】Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．４５，９７５－９８５．（２０１１）
【文献】Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｖｏｌ．９９，６１－６８．（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明は、牛、羊、山羊などの反芻家畜の免疫を簡便且つ効果的に賦活化することができるような栄養生理学的技術（経口投与又は給与成分、飼料組成物、飼養方法等）の提供を目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意研究の結果、反芻家畜に有効成分としてビタミンＫ類、例えばビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）などを配合した飼料組成物等を反芻家畜に経口投与又は給与することで、簡便且つ効果的に反芻家畜の免疫賦活化ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0014】
すなわち、本発明の実施形態は次のとおりである。
（１）ビタミンＫ類を有効成分とする反芻家畜の免疫賦活化用（免疫機能活性化用）飼料組成物。
（２）ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、好ましくはメナキノン－４及び／又はメナキノン－７、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を有効成分とする、（１）に記載の飼料組成物。
（３）更に、酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分として併用すること（ビタミンＫ類と酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分とすること）を特徴とする、（１）又は（２）に記載の飼料組成物。
（４）反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、（１）～（３）のいずれか１つに記載の飼料組成物。
（５）ビタミンＫ類を反芻家畜に経口投与又は給与することを特徴とする、反芻家畜の免疫賦活化（免疫機能活性化）方法。
（６）ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、好ましくはメナキノン－４及び／又はメナキノン－７、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を経口投与又は給与することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
（７）ビタミンＫ類を１日当たり１０～２００ｍｇ／頭、好ましくは１０～１００ｍｇ、更に好ましくは１０～５０ｍｇ経口投与又は給与することを特徴とする、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）更に、酢酸及び／又は酢酸塩を（好ましくはビタミンＫ類と同時に）経口投与又は給与することを特徴とする、（５）～（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）酢酸及び／又は酢酸塩を１日当たり酢酸として３０～３００ｇ／頭、好ましくは６０～１８０ｇ経口投与又は給与することを特徴とする、（８）に記載の方法。
（１０）反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、（５）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
（１）ビタミンＫ類を有効成分とする反芻家畜の免疫賦活化用（免疫機能活性化用）飼料組成物。
（２）ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、好ましくはメナキノン－４及び／又はメナキノン－７、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を有効成分とする、（１）に記載の飼料組成物。
（３）更に、酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分として併用すること（ビタミンＫ類と酢酸及び／又は酢酸塩を有効成分とすること）を特徴とする、（１）又は（２）に記載の飼料組成物。
（４）反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、（１）～（３）のいずれか１つに記載の飼料組成物。
（５）ビタミンＫ類を反芻家畜に経口投与又は給与することを特徴とする、反芻家畜の免疫賦活化（免疫機能活性化）方法。
（６）ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、好ましくはメナキノン－４及び／又はメナキノン－７、ビタミンＫ３（メナジオン）から選ばれる少なくとも１以上を経口投与又は給与することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
（７）ビタミンＫ類を１日当たり１０～２００ｍｇ／頭、好ましくは１０～１００ｍｇ、更に好ましくは１０～５０ｍｇ経口投与又は給与することを特徴とする、（５）又は（６）に記載の方法。
（８）更に、酢酸及び／又は酢酸塩を（好ましくはビタミンＫ類と同時に）経口投与又は給与することを特徴とする、（５）～（７）のいずれか１つに記載の方法。
（９）酢酸及び／又は酢酸塩を１日当たり酢酸として３０～３００ｇ／頭、好ましくは６０～１８０ｇ経口投与又は給与することを特徴とする、（８）に記載の方法。
（１０）反芻家畜が、牛、羊、山羊から選ばれる少なくともひとつである、（５）～（９）のいずれか１つに記載の方法。
【発明の効果】
【0015】
本発明によれば、簡便且つ効果的に反芻家畜の免疫機能を活性化することができる。更に、付加的効果として、反芻家畜の乳や肉などの生産性向上、ならびに、酪農経営や畜産経営の安定化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験での、ホルスタイン種泌乳牛のリンパ球の幼若化反応に及ぼすビタミンＫ１（ＶＫ１）、メナキノン－４（ＭＫ４）、ビタミンＫ３（ＶＫ３）の添加効果を示したグラフである。なお、縦軸はリンパ球幼若化反応の指標であるＳ．Ｉ．値を、横軸はコントロール（ビタミンＫ類無添加）及びビタミンＫ類添加区の各濃度を表す。
【図2】ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験での、ホルスタイン種育成牛雌のリンパ球の幼若化反応に及ぼすビタミンＫ１（ＶＫ１）、メナキノン－４（ＭＫ４）、ビタミンＫ３（ＶＫ３）の添加効果を示したグラフである。なお、縦軸はリンパ球幼若化反応の指標であるＳ．Ｉ．値を、横軸はコントロール（ビタミンＫ類無添加）及びビタミンＫ類添加区の各濃度を表す。
【図3】ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験での、ホルスタイン種去勢雄牛のリンパ球の幼若化反応に及ぼすビタミンＫ１（ＶＫ１）、メナキノン－４（ＭＫ４）、ビタミンＫ３（ＶＫ３）の添加効果を示したグラフである。なお、縦軸はリンパ球幼若化反応の指標であるＳ．Ｉ．値を、横軸はコントロール（ビタミンＫ類無添加）及びビタミンＫ類添加区（濃度５００μＭ）を表す。
【図4】ｉｎ ｖｉｖｏ試験での、ホルスタイン種育成牛雌及び去勢雄牛へのビタミンＫ３（ＶＫ３）給与時のリンパ球幼若化反応の変動を示したグラフである。なお、縦軸はリンパ球幼若化反応の指標であるＳ．Ｉ．値を、横軸はサンプル採取期間（数字の後ろにｗが付くものは週数、数字の後ろに何も付かないものは日数、ｐｒｅは給与開始前、ｐｏｓｔは給与終了後を意味する）を表す。また、グラフ中のアルファベットは、異符号間で有意差があることを示す。
【図5】ｉｎ ｖｉｖｏ試験での、ホルスタイン種育成牛雌及び去勢雄牛へのビタミンＫ３（ＶＫ３）及び酢酸塩給与時のリンパ球幼若化反応の変動を示したグラフである。なお、縦軸はリンパ球幼若化反応の指標であるＳ．Ｉ．値を、横軸はサンプル採取期間（数字の後ろにｗが付くものは週数、数字の後ろに何も付かないものは日数、ｐｒｅは給与開始前、ｐｏｓｔは給与終了後を意味する）を表す。また、グラフ中のアルファベットは、異符号間で有意差があることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0018】
本発明においては、反芻家畜の免疫賦活化（免疫機能活性化）の有効成分として、ビタミンＫ類を使用する。ビタミンＫ類としては、天然ビタミンＫとしてビタミンＫ１（フィロキノン）及びビタミンＫ２（メナキノン－４～１４）、合成ビタミンＫとしてビタミンＫ３（メナジオン）、ビタミンＫ４（メナジオール二リン酸ナトリウム）、ビタミンＫ５（４－アミノ－２－メチル－１－ナフトール）が使用でき、また、ビタミンＫに類似した化学構造を有する１，４－ナフトキノンや１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）なども使用できるが、特に、ビタミンＫ１、ビタミンＫ２（好ましくはメナキノン－４及び／又はメナキノン－７）、ビタミンＫ３から選ばれる１以上を使用するのが好適である。
【0019】
これらビタミンＫ類については、純品乾燥物を使用するのが好適であるが、その粗精製物（ペースト化物、希釈物、乳化物、懸濁物など）も使用可能である。また、デンプンやデキストリン等の賦形剤を加えて顆粒化したり、タブレットや液剤にしたりして製剤化したものも使用可能である。さらには、ルーメンで分解されないように油脂等でコーティングしたものも使用可能である。
【0020】
更に、ビタミンＫ類と併用する場合がある酢酸及び酢酸塩については、市販されている純品乾燥物などを使用することができ、酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウムなどが例示される。本発明では、これらのうち、特に、酢酸、酢酸ナトリウム、酢酸カルシウムから選ばれる１以上を用いるのが非常に好適である。
【0021】
そして、このビタミンＫ類を有効成分として、あるいは、これに酢酸及び／又は酢酸塩を併用して、そのまま飼料添加物、飼料、飼料組成物、その他の剤として使用することができる。また、常用される飼料成分を添加、混合して、飼料添加物、飼料、飼料組成物を提供することも可能である。このような飼料組成物等とする場合には、飼料原料に加えて、他の栄養成分（タンパク質、脂質、ミネラル（カリウム、ナトリウム、マグネシウム等）、ビタミンＫ類以外のビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＥ等））などを併用できる。さらには、これらを有効成分とする動物医薬製剤を提供することもできる。この場合は、動物医薬製剤の常法にしたがって製剤化すればよく、他の生理機能を有する有効成分を併用することもできる。
【0022】
なお、酢酸や酢酸塩を併用する代わりに、あるいはこれらと共に、反芻家畜第一胃（ルーメン）内の微生物を通じて該ルーメン内の酢酸濃度を上昇させる飼料添加剤等を用いても良い。すなわち、該ルーメン内における飼料の発酵又は消化を促進するような添加物、例えばプロピオン酸菌生菌などを併用することも可能である。
【0023】
そして、動物医薬製剤の場合には、種々の形態で経口投与される。その投与形態としては例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与などをあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの動物医薬剤等の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。なお、ビタミンＫ類等の有効成分純品乾燥物をそのまま製剤として用いることも可能である。
【0024】
なお、このようにして製剤化したものは、動物医薬剤として使用できるだけでなく、この製剤自体を飼料添加物等として使用することも充分可能であって、それ自体を飼料組成物として直接家畜に給与することもできるし、これを飼料添加物として他の飼料原料等とともに添加、混合して飼料組成物とすることも可能である。
【0025】
本発明の対象となる動物は、その乳、肉などが商品となる反芻家畜である。例えば、乳牛（特にホルスタイン種、ジャージー種など）、肉牛（和牛など）、羊、山羊などがより好適な対象動物として例示される。けれども、水牛、ラクダ、ヤクなどを対象としても構わない。
【0026】
本発明の有効成分の反芻家畜への経口投与又は給与量としては、例えば乳牛であれば、ビタミンＫ類は１日・頭の経口投与又は給与で１０～２００ｍｇ、好ましくは１０～１００ｍｇ、更に好ましくは１０～５０ｍｇが好適であり、酢酸及び／又は酢酸塩は１日・頭の経口投与又は給与で０．５～５．０ｍｏｌ（酢酸量で換算すると３０～３００ｇ）、好ましくは１．０～３．０ｍｏｌ（酢酸量で換算すると６０～１８０ｇ）が好適である。そして、この量の経口投与又は給与を１日当たり２回程度に分けて行うのが好ましい。有効成分の経口投与又は給与量が当該範囲より多い場合、安全性やその効果という点において特段の問題はないが、コスト面などから上記範囲内の方が好ましい。また、当該範囲より少ない場合には、本発明の効果が十分発揮されない恐れがあるため好ましくない。
なお、他の反芻家畜においても、その体重等を勘案して経口投与又は給与量を設定すれば良いが、乳牛も含め上記以外の経口投与又は給与量を完全に除外するものではない。
なお、他の反芻家畜においても、その体重等を勘案して経口投与又は給与量を設定すれば良いが、乳牛も含め上記以外の経口投与又は給与量を完全に除外するものではない。
【0027】
本発明は、ビタミンＫ類の有効性（反芻家畜の免疫賦活化）を、実験室レベルだけでなく、実際の生産現場における反芻家畜生体を用いて直接確認し、科学的立証がなされた極めて実用的なものであると言える。
【0028】
なお、本発明において反芻家畜の「免疫賦活化」とは、反芻家畜の免疫機能を活性化あるいは活発化（例えば、反芻家畜リンパ球幼若化促進など）させることを意味する。
【0029】
以下、本発明の実施例について述べるが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではなく、本発明の技術的思想内においてこれらの様々な変形が可能である。
【実施例1】
【0030】
（リンパ球の幼若化反応に及ぼすビタミンＫ類の添加効果確認試験）
ビタミンＫ類のリンパ球幼若化反応に及ぼす影響を確認するため、ウシのリンパ球細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。
ビタミンＫ類のリンパ球幼若化反応に及ぼす影響を確認するため、ウシのリンパ球細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行った。
【0031】
ホルスタイン種泌乳牛８頭を用い、これらから血液各１０ｍｌを採血し、ここにＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製品）を入れて遠心分離後、上清を除去してリンパ球細胞層を得た。得られたリンパ球細胞層は、ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製品）にペニシリンストレプトマイシン混合液（ＧＩＢＣＯ株式会社製品）１％、非動化処理をしたウシ胎児血清５％、２－メルカプトエタノール５×１０－５ｍｏｌ／Ｌを加えた培地）で懸濁し、リンパ球浮遊液を得た。このリンパ球浮遊液中のリンパ球数を計数し、１×１０６個／ｍｌになるようＲＰＭＩ培地で希釈して、リンパ球調整液を得た。そして、得られたリンパ球調整液１００μｌに、ビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン－４）、ビタミンＫ３（メナジオン）をそれぞれ終濃度１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、５００μＭになるようＲＰＭＩ培地でそれぞれを希釈したものを各４種用意し、これらをそれぞれ１００μｌ添加して細胞を刺激した。その後、これらをＣＯ２５％インキュベーターで３７℃の条件で７２時間培養した。
【0032】
そして、培養終了後にＭＴＴアッセイ法によりそれぞれのリンパ球の幼若化を測定した。具体的には、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（株式会社同仁化学研究所製品）をＲＰＭＩ培地で２倍希釈してＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ溶液を調製し、７２時間培養した上記細胞にＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ溶液を２０μｌ添加してＣＯ２５％インキュベーターで３７℃の条件で１．５時間培養した。その後、測定波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、Ｓ．Ｉ．を（刺激細胞の吸光度／無刺激細胞の吸光度）の式で算出した。
【0033】
この結果を図１に示した。リンパ球の幼若化の指標であるＳ．Ｉ．は、ビタミンＫ１、メナキノン－４、ビタミンＫ３のいずれによっても有意に上昇した。つまり、ビタミンＫ類の免疫賦活化能が示された。特に、メナキノン－４とビタミンＫ３はほぼ同等の値を示し、これらはビタミンＫ１より高い値であった。
【0034】
また、ホルスタイン種育成牛雌及びホルスタイン種去勢雄牛のリンパ球細胞についても、ホルスタイン種泌乳牛と同様の試験を実施した。なお、ホルスタイン種育成牛雌についてはビタミンＫ１、メナキノン－４、ビタミンＫ３をそれぞれ終濃度１００μＭ及び５００μＭとしたものを用い、ホルスタイン種去勢雄牛についてはビタミンＫ１、メナキノン－４、ビタミンＫ３をそれぞれ終濃度５００μＭとしたものを用いた。
【0035】
この結果を図２（育成牛雌）、及び図３（去勢雄牛）に示した。Ｓ．Ｉ．は、ほとんどの条件で有意に上昇し、これもビタミンＫ類の免疫賦活化能が示された。特に、ビタミンＫ３の５００μＭの条件でより高い値であった。
【実施例2】
【0036】
（育成牛へのビタミンＫ３給与によるリンパ球幼若化反応確認試験）
ビタミンＫ３、又は、ビタミンＫ３及び酢酸塩を有効成分として実際に育成牛に給与した際に、リンパ球の幼若化が起こっているのかを検証するため、その給与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）を行い観察及び効果の確認を行った。
ビタミンＫ３、又は、ビタミンＫ３及び酢酸塩を有効成分として実際に育成牛に給与した際に、リンパ球の幼若化が起こっているのかを検証するため、その給与試験（ｉｎ ｖｉｖｏ試験）を行い観察及び効果の確認を行った。
【0037】
供試動物としてホルスタイン種育成牛雌２頭、ホルスタイン種去勢雄牛３頭（７ヶ月齢）を用いた。そして、１頭当たりの慣用飼料にビタミンＫ３を１％品５ｇ／日（実量５０ｍｇ／日）を添加して２週間給与する実験と、１頭当たりの慣用飼料にビタミンＫ３を実量５０ｍｇ／日と酢酸ナトリウム１３６ｇ／日を添加して２週間給与する実験をクロスオーバー法で行った。そして、給与前（Ｐｒｅ期）、給与１週間目、給与２週間目、給与終了後１日、給与終了後４日、給与終了後１週間でそれぞれ血液各１０ｍｌを採取した。
【0038】
これらの血液について、実施例１と同様の方法でリンパ球調整液を調製し、リンパ球幼若化能をＭＴＴアッセイで測定した。具体的には、コンカナバリンＡを終濃度０．０４７μｇ／ｍｌになるようＲＰＭＩ培地で希釈し、上記リンパ球調整液１００μｌに対してこれを１００μｌ添加して細胞を刺激し、ＣＯ２５％インキュベーターで３７℃の条件で７２時間培養した。そして、培養終了後に実施例１と同様の方法でＳ．Ｉ．を求めた。
【0039】
結果を図４（ビタミンＫ３給与）、及び図５（ビタミンＫ３及び酢酸給与）に示した。なお、リンパ球幼若化能は給与前後のコンカナバリンＡ刺激に対するＳ．Ｉ．を比較することにより行った。この結果、ビタミンＫ３給与１週間目までは大きな変化が見られなかったが、給与２週間目で有意にＳ．Ｉ．値が増加していた。ビタミンＫ３の給与は血液のメナキノン－４の濃度を高め、その結果、リンパ球の幼若化反応を刺激すると推定され、飼料へのビタミンＫ３の添加は、ウシの免疫賦活化に有効であることが明らかになった。
【0040】
また、ビタミンＫ３と酢酸塩を給与した場合、給与２週間目までは幼若化の指標が上昇する傾向を示し、給与終了後３日目まで幼若化の指標が高かった。酢酸塩をビタミンＫ３と同時に給与すると、ビタミンＫ３単独給与と比較して、リンパ球の幼若化現象を持続させる効果があることが明らかとなった。
【0041】
以上の結果から、有効成分としてビタミンＫ３の単独給与はウシの免疫機能を活性化し、有効成分としてビタミンＫ３及び酢酸塩の給与はウシの免疫機能活性化状態を持続させること（免疫賦活化持続能）が示された。
【0042】
なお、本発明を要約すれば次のとおりである。
【0043】
すなわち、本発明は、牛、羊、山羊などの反芻家畜の免疫を、簡便且つ効果的に賦活化（免疫機能の活性化）することができるような栄養生理学的技術（経口投与又は給与成分、飼料組成物、飼養方法等）を提供することを目的とする。
【0044】
そして、有効成分としてビタミンＫ類、例えばビタミンＫ１（フィロキノン）、ビタミンＫ２（メナキノン）、ビタミンＫ３（メナジオン）などを飼料組成物等に配合して反芻家畜に経口投与又は給与することで、反芻家畜の免疫賦活化を実現することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】