(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-17
(45)【発行日】2022-02-28
(54)【発明の名称】高い表面湿潤性を有する生体適合性表面コーティング
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20220218BHJP
C12M 3/00 20060101ALI20220218BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20220218BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20220218BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 C
C12M3/00 A
C12N1/00 A
C12N5/07
【請求項の数】
19
(21)【出願番号】P 2018553355
(86)(22)【出願日】2017-04-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-25
(86)【国際出願番号】 US2017026883
(87)【国際公開番号】W WO2017180544
(87)【国際公開日】2017-10-19
【審査請求日】2020-04-13
(31)【優先権主張番号】62/322,015
(32)【優先日】2016-04-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/395,575
(32)【優先日】2016-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】397068274
【氏名又は名称】コーニング インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100073184
【弁理士】
【氏名又は名称】柳田 征史
(72)【発明者】
【氏名】ゴラール，ヴァシリー ニコラエヴィチ
【審査官】小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５２１２９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５０５６２３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１４／１７９１９６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２００７－２１５５１９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０
Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞培養器具であって、細胞培養表面を有する高分子基板、および
前記高分子基板の細胞培養表面上に配置された溶ける炭水化物コーティング、
を備え、
被覆された前記細胞培養表面に水性細胞培養培地を加えた際に、前記溶ける炭水化物コーティングが該水性細胞培養培地中に溶け、
前記溶ける炭水化物コーティングを有する高分子基板が、該溶ける炭水化物コーティングの不在下での前記高分子基板の接触角より小さい接触角を有し、
前記高分子基板が親水性特徴を有する低タンパク質結合コーティングを備え、
前記高分子基板の投影表面積に対する実際の表面積の比ｒが１より大きい、器具。
【請求項2】
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、請求項１記載の器具。
【請求項3】
前記溶ける炭水化物コーティングが安定剤をさらに含む、請求項１または２記載の器具。
【請求項4】
前記安定剤がポリエチレンオキシドを含む、請求項３記載の器具。
【請求項5】
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、請求項１から４いずれか１項記載の器具。
【請求項6】
前記高分子基板が、ガス透過性であり、液体不透過性である、請求項１から５いずれか１項記載の器具。
【請求項7】
前記低タンパク質結合コーティングが、前記高分子基板の細胞培養表面に共有結合したヒドロゲル層を含む、請求項１から６いずれか１項記載の器具。
【請求項8】
前記高分子基板の細胞培養表面が滑らかな表面を含む、請求項１から７いずれか１項記載の器具。
【請求項9】
前記高分子基板の細胞培養表面が粗面を含む、請求項１から８いずれか１項記載の器具。
【請求項10】
前記高分子基板の細胞培養表面が超親水性である、請求項１から９いずれか１項記載の器具。
【請求項11】
前記器具が、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、およびマイクロ流体器具からなる群より選択される、請求項１から１０いずれか１項記載の器具。
【請求項12】
前記器具が、マイクロキャビティのアレイを含む３Ｄ細胞培養器具である、請求項１から１０いずれか１項記載の器具。
【請求項13】
細胞培養器具を製造する方法であって、高分子基板を提供する工程、および
前記高分子基板の細胞培養表面上に溶ける炭水化物コーティングを施す工程、
を有し、
前記高分子基板が、前記炭水化物コーティングを施す前に、親水性特徴を有する低タンパク質結合コーティングを備え、
前記高分子基板の投影表面積に対する実際の表面積の比ｒが１より大きい、方法。
【請求項14】
前記高分子基板の細胞培養表面上に溶ける炭水化物コーティングを施す工程が、炭水化物と溶媒の溶液を前記高分子基板の細胞培養表面と直接接触させる工程、および
前記溶液から前記溶媒を蒸発させて、前記高分子基板に化学結合していない溶ける炭水化物コーティングを備えた高分子基板の細胞培養表面を得る工程、
を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項15】
前記施す工程が、吹き付け塗り工程、溶媒被覆工程、および回転塗布工程からなる群より選択される工程を含む、請求項１３記載の方法。
【請求項16】
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項17】
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項18】
前記溶ける炭水化物コーティングがポリエチレンオキシドをさらに含有する、請求項１７記載の方法。
【請求項19】
細胞培養のための方法であって、請求項１から１２いずれか１項記載の細胞培養器具を提供する工程、
請求項１から１２いずれか１項記載の細胞培養器具に、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養培地を加える工程、
前記溶ける炭水化物コーティングを前記細胞培養培地中に溶かす工程、および
前記細胞を培養する工程、
を有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権】
【0001】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て含まれる、２０１６年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／３２２０１５号および２０１６年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／３９５５７５号の米国法典第３５編第１１９条の下での優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【0002】
本開示は、高い表面湿潤性を持つ溶ける表面コーティングを有する器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）に関する。本開示は、高い表面湿潤性を持つ溶ける表面コーティングを有する器具を使用する方法および製造する方法にも関する。
【背景技術】
【0003】
例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、およびマイクロ流体器具などの器具が、いくつか例を挙げると、分子、細胞、および生物の分野での研究を可能にするために重要であることがよく知られている。例えば、３Ｄ細胞凝集体（例えば、多細胞スフェロイド）を生成する３Ｄ細胞培養器具が、基礎研究並びに細胞療法の重要な部分であると過去１０年で認識されてきた。現在、動物実験を行わなければならなくなる前の治療法の開発および基礎研究の両方に３Ｄ細胞培養器具を使用する利点は、３Ｄ細胞凝集体（例えば、多細胞スフェロイド）を生成し、支持できる新たな３Ｄ細胞培養製品の継続的な開発と商業化にとっての推進力である。
【0004】
３Ｄ細胞培養器具は、典型的に、細胞がその表面に付着するのを妨げる表面を有し、このことは、転じて、３Ｄ細胞凝集体（例えば、多細胞スフェロイド）の形成を誘発する。３Ｄ細胞凝集体を生成する最もうまくいった方法の内の１つは、非接着性細胞培養表面を有するウェル内に細胞を播種することである。超低付着性（ＵＬＡ）表面と称される非接着性細胞培養表面を持つウェルを有する製品系列の一例が、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより販売されている。これらの製品は、概して、非常にうまく機能するが、均一なサイズの３Ｄ細胞凝集体をよりよく生成することができるようにまだ改善することができる。
【0005】
３Ｄ細胞凝集体を生成するために今日使用されている別の方法は、３Ｄ細胞凝集体またはスフェロイドを収容するためのマイクロキャビティを有するウェル内または表面上に細胞を播種することである。３Ｄ細胞凝集体を生成するために使用できるマイクロキャビティ表面を持つウェルを有する３Ｄ細胞培養器具の一例に、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社により販売されているＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）Ｐｌａｔｅがある。この「ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ」系列の製品は、６ウェルプレートが最大であるマルチウェル形式で提示されている。しかしながら、マイクロウェルまたはマイクロキャビティ配列が鋭角であるために、これらのフットプリントが大きい製品は、最初の細胞播種工程中に気泡を閉じ込め易い。この気泡閉じ込め問題に対処するためにＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社が推奨する方法の１つは、細胞を加える前に、プレートを遠心分離機にかけられるようにマイクロウェルに培地を完全に満たすことである。しかしながら、この提案された解決策は、ユーザが多数のプレートを同時に取り扱う能力を著しく制限するために、細胞培養プロトコルにおいては望ましくない。基本的に、最初の細胞播種工程中のマイクロウェルのキャビティまたはマイクロキャビティ内の気泡の閉じ込めは、大量の３Ｄ細胞凝集体を生成するために使用できる、フットプリントの大きい３Ｄ細胞培養器具の採用および設計にとって重大な問題を引き起こす。それゆえ、マイクロキャビティを持つウェルを有する製品は、３Ｄ細胞凝集体をよりよく生成できるために、気泡閉じ込め問題に対処するように、改良することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
少なくとも先に述べたことに鑑みて、３Ｄ細胞培養器具にとって改良が望ましいことが認識できる。実際に、３Ｄ細胞培養器具に加え、例えば、２Ｄ細胞培養器具およびマイクロ流体器具を含む幅広い器具にとって、改良が望ましい。本開示は、これらの必要性と他の必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本出願の請求項に、上述した必要性に対処する器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）、並びにその器具を製造する方法および使用する方法が記載されている。その器具、並びにその器具を製造する方法および使用する方法の有利な実施の形態も、請求項に記載されている。
【0008】
１つの態様において、本開示は、その上に溶ける炭水化物コーティング（すなわち、高い表面湿潤性を有する生体適合性表面コーティング）を持つ高分子表面を有する器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を提供する。その高分子表面は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、プラズマ処理されたポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。その水に溶ける炭水化物コーティングは、以下（例えば）の内の１つから製造できる：単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類。実施の形態において、溶ける炭水化物コーティングは、周囲条件での長期貯蔵のために、得られた水に溶ける炭水化物コーティングを安定化させるために、ポリエチレンオキシドまたは同様の化合物を含有することができる。所望であれば、その高分子表面は、低タンパク質結合コーティング（例えば、ＵＬＡコーティング）で被覆してもよく、これは、次に、水に溶ける炭水化物コーティングで被覆される。この器具は、最新の器具を上回る際立った改良である。何故ならば、この器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、炭水化物の薄いコーティングは水性の細胞培養培地の添加の際に溶けるので、高分子表面の物理化学的性質に影響を与えない溶ける炭水化物コーティングを有するからである。
【0009】
別の態様において、本開示は、器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を製造する方法であって、（ａ）高分子表面を提供する工程、および（ｂ）その高分子表面上に水に溶ける炭水化物コーティング（すなわち、高い表面湿潤性を持つ生体適合性表面コーティング）を施す工程を有してなる方法を提供する。この施す工程は、吹付け塗り工程、溶媒被覆工程、または回転塗布工程を伴い得る。例えば、施す工程は、炭水化物と溶媒の溶液を高分子表面と直接接触させる工程、および溶液から溶媒を蒸発させて、高分子表面に化学結合していない水に溶ける炭水化物コーティングで被覆された高分子表面を得る工程を含み得る。１つの実施の形態において、その高分子表面は、その上に水に溶ける炭水化物コーティングが施される低タンパク質結合コーティング（例えば、共有結合したヒドロゲル層）を有することがある。その高分子表面は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン（例えば、プラズマ処理されたポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。その水に溶ける炭水化物コーティングは、以下（例えば）の内の１つから製造できる：単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類。溶ける炭水化物コーティングは、周囲条件での長期貯蔵のために、得られた水に溶ける炭水化物コーティングを安定化させるために、ポリエチレンオキシドまたは同様の化合物を含有することができる。この器具は、最新の器具を上回る際立った改良である。何故ならば、この器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、炭水化物の薄いコーティングは水性の細胞培養培地の添加の際に溶けるので、高分子表面の物理化学的性質に影響を与えない水に溶ける炭水化物コーティングを有するからである。
【0010】
さらに別の態様において、本開示は、器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を使用する方法であって、（ａ）その上に溶ける炭水化物コーティング（すなわち、高い表面湿潤性を持つ生体適合性表面コーティング）が配置された高分子表面を有する器具を提供する工程、および（ｂ）高分子表面上に配置された溶ける炭水化物コーティング上に、少なくとも水、炭水化物、および細胞を含有する細胞培養培地溶液を添加する工程を有してなる方法を提供する。１つの実施の形態において、その高分子表面は、その上に水に溶ける炭水化物コーティングが配置される低タンパク質結合コーティング（例えば、共有結合したヒドロゲル層）を有することがある。その高分子表面は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン（例えば、プラズマ処理されたポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。その溶ける炭水化物コーティングは、以下（例えば）の内の１つから製造できる：単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類。溶ける炭水化物コーティングは、周囲条件での長期貯蔵のために、得られた溶ける炭水化物コーティングを安定化させるために、ポリエチレンオキシドまたは同様の化合物を含有することができる。この器具は、最新の器具を上回る際立った改良である。何故ならば、この器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、炭水化物の薄いコーティングは水性の細胞培養培地の添加の際に溶けるので、高分子表面の物理化学的性質に影響を与えない溶ける炭水化物コーティングを有するからである。
【0011】
本開示の追加の態様は、一部は、以下の詳細な説明、図面、および任意の請求項に述べられており、一部は、その詳細な説明から想起されるか、または本開示の実施により分かる。先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、例示かつ説明に過ぎず、本開示を開示されたように制限するものではないことを理解すべきである。
【0012】
本開示のより完全な理解は、添付図面と共に解釈したときに、以下の詳細な説明を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】平面の湿潤過程（接触角ヒステリシス）を示す説明図
【図1B】固体表面の親水性と疎水性の尺度および本開示により対処されるマイクロキャビティを含む表面に関連する問題の空気の閉じ込めを説明するために使用されるマイクロキャビティのアレイを有する表面を示す説明図
【図2A】従来のＵＬＡ被覆ポリスチレン表面上の水滴の写真（従来技術）
【図2B】ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面上の溶ける炭水化物コーティングの実施の形態上の水滴の写真
【図3】材料の透明度を示す黒と白のポスターの前に位置するのが示されている、従来のＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の写真（従来技術）
【図4】材料の透明度を示す黒と白のポスターの前に位置するのが示されている、本開示の実施の形態にしたがって構成された溶ける炭水化物が被覆されたＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の写真
【図5】本開示の実施の形態による、その上に水に溶ける炭水化物コーティングが配置された高分子表面を有する例示の器具の部分側面図
【図6】低タンパク質結合コーティングで被覆され、次に、本開示の実施の形態による水に溶ける炭水化物コーティングで被覆された高分子表面を有する例示の器具の部分側面図
【図10A】溶ける炭水化物コーティングを組み込んだ例示の細胞培養器具の実施の形態を示す図
【図11A】本開示の実施の形態による、滑らかな内面を持つ溶ける炭水化物／ＵＬＡ被覆ポリスチレン・マイクロキャビティ（培養形式：２４ウェルプレート）内で３日間培養した後のＨＣＴ １１６ヒト結腸直腸癌細胞（ＡＣＴＴ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））の３Ｄ細胞凝集体のある見方を示す写真
【図11B】本開示の実施の形態による、滑らかな内面を持つ溶ける炭水化物／ＵＬＡ被覆ポリスチレン・マイクロキャビティ（培養形式：２４ウェルプレート）内で３日間培養した後のＨＣＴ １１６ヒト結腸直腸癌細胞（ＡＣＴＴ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））の３Ｄ細胞凝集体の異なる見方を示す写真
【発明を実施するための形態】
【0014】
定義
本開示の目的のために、「コーティング」という用語は、別の材料の表面に施された材料を意味する。例えば、コーティングは、プラスチック表面に施された多糖類であることがある。そのコーティングは、層または膜であってよく、連続または不連続であってよい。コーティングは、例えば、吹き付け塗り、溶媒被覆または回転塗布技術、もしくは当該技術分野で公知の任意の他の技術によって施されてよい。
本開示の目的のために、「コーティング」という用語は、別の材料の表面に施された材料を意味する。例えば、コーティングは、プラスチック表面に施された多糖類であることがある。そのコーティングは、層または膜であってよく、連続または不連続であってよい。コーティングは、例えば、吹き付け塗り、溶媒被覆または回転塗布技術、もしくは当該技術分野で公知の任意の他の技術によって施されてよい。
【0015】
本開示の目的のために、「マイクロキャビティ」という用語は、３Ｄで、またはスフェロイドとして培養された細胞を収容するような適切なサイズの、表面内の凹面、凹み、小さな窪み、または陥凹を意味する。「マイクロキャビティ」を有する細胞培養器具は、３Ｄ細胞培養器具である。すなわち、それらは、三次元配置内の培養で、またはスフェロイドとして培養下の増殖する細胞を支持するような構造である。「マイクロキャビティ」および「マイクロウェル」は同義語である。
【0016】
本開示の目的のために、「マイクロキャビティ・アレイ」という用語は、培養において１つ以上のスフェロイドを収容するのに適したマイクロキャビティのアレイを意味する。マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養器具は、３Ｄ細胞培養器具である。すなわち、それらは、三次元の培養で、またはスフェロイドとして培養下の増殖する細胞を支持するような構造である。
【0017】
本開示の目的のために、「３Ｄ細胞培養器具」という用語は、スフェロイドなどの三次元構造を形成する上で培養細胞を支持するような構造の器具を意味する。「３Ｄ細胞培養器具」は、マイクロキャビティまたはマイクロキャビティのアレイを有する細胞培養器具（図１０Ａに示されたものなど）を含む。「３Ｄ細胞培養器具」は、スフェロイドなどの三次元構造を形成するために培養細胞を支持するように他のように作られた器具も含む。例えば、丸底マルチウェル細胞培養プレートは、マイクロキャビティまたはマイクロキャビティのアレイを持たずに、３Ｄ細胞培養を促進するであろう。
【0018】
本開示の目的のために、「２Ｄ細胞培養器具」という用語は、細胞を培養するための平面を有する器具を意味し、よって、細胞は、細胞の二次元シートとしてその細胞培養器具内で増殖する。
【0019】
本開示の目的のために、「マイクロ流体器具」という用語は、複数の細胞培養チャンバ（マルチウェルプレートのウェルまたは多層器具の層など）およびチャンバ間で流体を共有するための機構を有する、細胞培養のための器具を意味する。
【0020】
本開示の目的のために、「スフェロイド」という用語は、培養において三次元配列で増殖する細胞の群または凝集体を意味する。スフェロイド配置で増殖する細胞は、平らな細胞増殖表面上に配置された細胞の単層として、二次元配列で培養において増殖する細胞とは区別される。
【0021】
本開示の目的のために、「ウェル」という用語は、細胞培養のための容器を意味し、これは、ペトリ皿、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、フラスコ、多層フラスコなどのウェルであってよい。
【0022】
本開示の目的のために、「粗い」という用語は、滑らかではない表面を意味する。例えば、平らな細胞増殖表面は、滑らかであっても、滑らかから外れていてもよい。表面粗さは、その理想形態からの、実際の表面の法線ベクトルの方向の逸脱により数量化される（https://en.wikipedia.org/wiki/Surface_roughness）。例えば、粗い表面は、１μｍ以下だけ表面の法線ベクトルの方向に逸脱することがある。ある表面は、粗くても、滑らかであってもよい。マイクロキャビティは、粗くても、滑らかであってもよい内面を１つ以上有することがある。
【0023】
本開示の目的のために、「低タンパク質結合表面」または「低結合表面」または「低タンパク質結合コーティング」または「低結合コーティング」（全てが互いに交換可能に使用される）という用語は、低タンパク質結合特性または低細胞結合特性を有する材料のコーティングを有する材料を意味する。すなわち、タンパク質および細胞は、低タンパク質結合表面に結合しない、または低タンパク質結合表面に対して減少した結合を示す。実施の形態において、低タンパク質結合材料は、表面に共有結合して、低タンパク質結合表面を形成することがある。実施の形態において、低タンパク質結合表面は、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手できるＵＬＡ（超低付着性）処理された細胞培養容器または他の類似の製品などの市販の製品内に存在することができる。低タンパク質結合コーティングは、その低いタンパク質結合特徴に加え、親水性特徴を有することがある。
【0024】
本開示の目的のために、「安定剤」という用語は、ポリエチレンエポキシド群またはポリエチレンオキシド／プロピレンオキシド・ブロック・コポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの生体適合性コポリマー誘導体からの水溶性高分子を意味する。実施の形態において、この安定剤は、長期貯蔵中に溶ける炭水化物コーティングの安定化を助けるように、炭水化物コーティング中にブレンドされることがある。いくつかの実施の形態において、その安定剤はポリエチレンオキシドである。
【0025】
詳細な説明
本開示には、器具の表面親水性を一時的に上昇させるための、機器（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）に実施できる様々な表面改質技術が記載されている。本開示は、主に３Ｄ細胞培養器具に向けられているが、ここに記載された独特の表面改質は例えば、２Ｄ細胞培養器具やマイクロ流体器具などの他のタイプの器具に使用できることを認識すべきである。ここに記載されたように、ここに記載された溶ける親水性コーティングにより改質された、様々な表面形状（例えば、平面または２Ｄ表面、もしくは少なくとも１つのマイクロキャビティまたはマイクロキャビティのアレイを有する表面、または３Ｄ表面）を有する細胞培養器具は、生体適合性である。追加の実施の形態において、前記表面は非接着性をさらに有する。非接着性およびマイクロキャビティを有するこれらの表面は、３Ｄ細胞凝集体またはスフェロイドを生成するために使用されることがある。さらに、開示された表面改質は、３Ｄ細胞凝集体の生成に関連する細胞播種工程および水性培地の添加工程中のマイクロキャビティ表面内の空気の閉じ込めをなくすこともある。
本開示には、器具の表面親水性を一時的に上昇させるための、機器（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）に実施できる様々な表面改質技術が記載されている。本開示は、主に３Ｄ細胞培養器具に向けられているが、ここに記載された独特の表面改質は例えば、２Ｄ細胞培養器具やマイクロ流体器具などの他のタイプの器具に使用できることを認識すべきである。ここに記載されたように、ここに記載された溶ける親水性コーティングにより改質された、様々な表面形状（例えば、平面または２Ｄ表面、もしくは少なくとも１つのマイクロキャビティまたはマイクロキャビティのアレイを有する表面、または３Ｄ表面）を有する細胞培養器具は、生体適合性である。追加の実施の形態において、前記表面は非接着性をさらに有する。非接着性およびマイクロキャビティを有するこれらの表面は、３Ｄ細胞凝集体またはスフェロイドを生成するために使用されることがある。さらに、開示された表面改質は、３Ｄ細胞凝集体の生成に関連する細胞播種工程および水性培地の添加工程中のマイクロキャビティ表面内の空気の閉じ込めをなくすこともある。
【0026】
実施の形態において、その２Ｄまたは３Ｄ細胞培養表面は炭水化物コーティングを有する。この炭水化物コーティングの存在により、その表面がより湿潤性になる。すなわち、その炭水化物コーティングは親水性である。そのコーティングは水分子を引き付ける。炭水化物コーティングが存在する場合、細胞培養表面上または中に水性液体を導入する際の気泡の形成が減少する。言い換えると、炭水化物コーティングは表面の親水性を改善して、水性培地が器具に添加されるときに、その器具の表面上の空気の閉じ込めを防ぐ。その炭水化物コーティングは細胞に対して生体適合性でもある。細胞培養培地は、培養中の細胞のためのエネルギー源として、例えば、グルコースやガラクトースなどの炭水化物を含有する。これらの材料が培地に溶け込んだときに、それらの存在は、水性培地中にすでに存在する炭水化物の濃度を増加させる働きをする。
【0027】
実施の形態において、前記溶ける炭水化物コーティングは、連続または不連続であり得る。実施の形態において、その溶ける炭水化物コーティングの厚さは、そのコーティングの機能性にしか制限されない。例えば、そのコーティングは、非常に薄くても、厚くても、もしくは薄いと厚いの間であってもよい。コーティングの厚さの範囲は、その機能によって薄い側で制限される－すなわち、コーティングは、表面を湿潤にできるほど十分に厚くなければならないが、水性培地に、細胞培養条件のための範囲から外れるほど多くのグルコースを与えるほど厚くてはならない。例えば、その材料は、薄い（すなわち、０．０１マイクロメートル）から厚い（すなわち、５マイクロメートル）までの厚さに及ぶことがある。
【0028】
（例えば）単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含む、幅広い範囲の生体適合性炭水化物を使用して、前記器具を被覆することができる。例えば、その器具は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、またはマンニトールのコーティングで被覆することができる。実施の形態において、その炭水化物は、炭水化物材料が培地に溶け込むようにしているようにコーティングが表面の化学結合しないような様式で、細胞培養表面に与えられる。
【0029】
例えば、セルロースは、水または液体培地中に可溶性ではないので、コーティングにとって適切な炭水化物ではない（例えば、Journal of Adhesion Science and Technology 22 (2008) 545－567頁、表１ｃを参照のこと。この文献に、セルロース膜の水分付着張力の値（表１の第３列）は５０程度であることが示されている。このことは、気泡が、セルロースコーティングで被覆されたマイクロキャビティ内に閉じ込められそうであろうことを示す）。
【0030】
その上に表面コーティングを有する器具についてのより詳しい議論が下記に、例えば、親水性表面、超親水性表面、および疎水性表面の湿潤性を説明するために与えられた手短な議論の後に記載されている。
【0031】
実施の形態において、前記炭水化物コーティングは、低いタンパク質結合表面処理を有する細胞培養表面に施されることがある。例えば、その炭水化物コーティングは、細胞培養表面を細胞に対して非接着性にする材料で処理された（炭水化物コーティングの施用の前に）細胞培養表面に施されることがある。超低付着性（ＵＬＡ）表面と称される非接着性細胞培養表面を持つウェルを有する製品系列の一例が、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより販売されている。その炭水化物コーティングは、市販のＵＬＡ処理表面に施してよい。
【0032】
前記炭水化物コーティングは、例えば、吹き付け塗り、溶媒被覆、または回転塗布技術により施すことができる。一例において、その炭水化物コーティングは、特定の高分子表面材料と相溶性である溶媒中にあり、その溶媒が蒸発して炭水化物の薄いコーティングを残すように表面に施される。実施の形態において、水分子に対する炭水化物コーティングの高い親和性により、細胞培養培地などの水溶液と接触した際に、表面が瞬間的に濡れる。
【0033】
実験において、炭水化物コーティングを有する表面の実施の形態上の水滴の接触角は、平らなＵＬＡ被覆ポリスチレン表面上に炭水化物コーティングを加えると、接触角が４０°から１０°に減少し、表面が超親水性となることを示した（表３参照）。
【0034】
追加の実施の形態において、前記炭水化物コーティングに、ポリエチレンオキシド群またはポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシド・ブロック・コポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）などの生体適合性コポリマー誘導体からの水溶性高分子を加えることは、周囲条件での長期貯蔵に適するように、２４時間程度から３０～４５日に亘り、得られた炭水化物コーティングの均一な被覆を安定化させるのに役立つ。
【0035】
親水性表面は、一般に、水を引き付ける表面として記載することができ、水接触角は９０°未満であるべきである（例えば、接触角についての詳細、および親水性表面に加えて他の種類の表面にその表面がどのように関連しているかについて、下記の議論および図１Ａ～１Ｂ、図２Ａと２Ｂ、並びに表１～３を参照のこと）。ヤングの式により表される親水性表面のエネルギーバランスは、
γｓ－γｓｌ＝γｌｃｏｓθ （式１）
と記載することができ、式中、γｓは固体の表面自由エネルギーであり、γｌは液体の表面自由エネルギーであり、γｓｌは固体／液体の界面自由エネルギーであり、θは平衡接触角である。超親水性表面について、接触角は、ヤングの式の適用限界であるゼロである。一般に、超親水性表面は、親水性であり、表面粗さも有する。
γｓ－γｓｌ＝γｌｃｏｓθ （式１）
と記載することができ、式中、γｓは固体の表面自由エネルギーであり、γｌは液体の表面自由エネルギーであり、γｓｌは固体／液体の界面自由エネルギーであり、θは平衡接触角である。超親水性表面について、接触角は、ヤングの式の適用限界であるゼロである。一般に、超親水性表面は、親水性であり、表面粗さも有する。
【0036】
このように、親水性系は、以下のように、清浄で非反応性の固体の単位表面積に液体を広げるために行われた仕事－液体広がりＷｓ仕事によりよりうまく特徴付けられる：
Ｗｓ＝γｓ－（γｌ＋γｓｌ） （式２）
Ｗｓ＝γｓ－（γｌ＋γｓｌ） （式２）
【0037】
液体が完全には広がらないが、明確な接触角を形成する場合、ひいては、広がりの仕事は、以下のように、θ＞０である限り、測定された接触角および液体の表面張力から計算できる：
Ｗｓ＝γｌ（ｃｏｓθ－１） （式３）
Ｗｓ＝γｌ（ｃｏｓθ－１） （式３）
【0038】
したがって、広がりの仕事は、固体表面の親水性の尺度として使用できるであろう。広がりの式のこの仕事に関する詳細について、C.J. Van Oss “Interfacial Forces in Aqueous Media”, Marcel Dekke Inc, New York, 1994（この文献の内容が、全ての目的について、ここに引用される）を参照のこと。
【0039】
湿潤過程中の液体の固体表面との相互作用を考慮すると、親水性の絶対尺度として、水和／溶媒和の自由エネルギー（ΔＧｓｌ）を使用できる。水中で互いに引き付ける疎水性分子はΔＧｓｌ＞－１３３ｍＪｍ－２を有するのに対し、親水性分子は、ΔＧｓｌ＜－１３３ｍＪｍ－２を有する（上述したC.J. Van Oss, Interfacial Forces in Aqueous Media, Marcel Dekke Inc, New York, 1994を参照のこと）。これを考慮すると、ひいては、式３は、以下のように読めるように変更できる：
ΔＧｓｌ＝－γｌ（ｃｏｓθ＋１） （式４）
ΔＧｓｌ＝－γｌ（ｃｏｓθ＋１） （式４）
【0040】
親水性表面と疎水性表面との間の移行を記載する平衡接触角は、ΔＧｓｌ＝－１１３ｍＪｍ－２について、θ＝５６°である。それゆえ、固体表面の親水性の様々な尺度は、固体表面の親水性および疎水性の一般に是認された尺度を示す表１に下記に示されるように纏めることができる：
【0041】
【表1】
【0042】
注記１：この表は、Soft Matter, 2011, 7, 9804-9828から引用した。
【0043】
注記２：この表において、超親水性表面と称されている表面は、その上で水（液体）が完全に広がる、１より大きい（すなわち、ｒ＞１）粗さ係数（ｒ＝投影表面積に対する実際の表面積の比）を有するザラザラしたおよび／または構造化表面（粗いおよび／または多孔質の）である。言い換えると、超親水性（超湿潤性）表面は、親水性材料に粗さを導入することによって達成される。
【0044】
注記３：図１Ａおよび１Ｂは、滑らかな平面１００（図１Ａ）および３Ｄ細胞培養表面の一形態である、マイクロキャビティ７１０のアレイを有する表面（図１Ｂ）に関する湿潤過程を示す図である。図１Ａおよび図１Ｂに示された表面は、超低付着性（ＵＬＡ）コーティングなどの表面コーティングで処理されていても、いなくてもよい。図１Ａは、高分子材料１０２の滑らかな平面１００に施された水性液体２０２の液滴を示す。図１Ｂは、マイクロキャビティ７１０を有する高分子材料１０４の表面に施された水性液体２０２の液滴を示す。炭水化物コーティングがないと、その表面のマイクロキャビティ７１０特徴内に空気１０１が閉じ込められることがある。マイクロキャビティ７１０中の細胞培養に干渉する、気泡１０１の形成を減少させるために、表面を、その親水性を向上させるように処理することができる。
【0045】
表面の親水性の向上は、その表面よりも親水性である材料の分子または微視的コーティングの堆積により、または基板自体の化学的性質の変更によって、取り組むことができる。分子修飾および表面の化学的性質の改質の両方が、生命科学用途における高分子材料の場合に、過去に使用されてきた。
【0046】
溶液相または気相のいずれかからの多数の有機分子が、選択された固体上に吸収され、それら自体を、基板の湿潤特徴を変える自己組織化単分子層に組織化し得ることが公知である。これらの自己組織化単分子層に関する詳細について、A. Ulman, “An Introduction to Ultrathin Organic Films: From Langmuir-Blodgett to Self-Assembly”, Academic Press Inc, Boston, 1991（この文献の内容が、全ての目的について、ここに引用される）を参照のこと。
【0047】
固体表面上に化学結合した短い機能性分子の自己組織化単分子層を配置すること以外に、生命科学用途に使用される高分子の改質のために、巨大分子を有する材料のコーティングに多数の研究が焦点を当ててきた。しかしながら、典型的な生物工学または細胞培養用途において、グラフト化コーティングまたは物理的に吸着された合成巨大分子コーティングの親水性は、前記器具の細胞培地との生体適合性がより重要であるので、通常は、それほど重要ではない。代わりに、典型的な保護コーティングは、表面が生体液と接触したときに、タンパク質の吸着を防ぐことを目的としている。このタイプの研究に関する研究について、D.G. Castner et al. “Biomedical Surface Science: Foundations to Frontiers”, Surf. Sci., 2002, 500 (1-3), 28-60（その内容が、全ての目的に関して、ここに引用される）を参照のこと。
【0048】
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより開発された、業界で今日使用されているそのような保護または低タンパク質結合コーティングの一例に、細胞培養表面に施される超低付着性（ＵＬＡ）コーティングがある。ポリスチレン表面に施されたＵＬＡを有する製品が、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販されている。その超低付着表面は、親水性であり、中性的に帯電した、共有結合したヒドロゲル層である。ＵＬＡコーティングの主な目的は、細胞培養培地からの生体分子のその表面への吸着を最小にし、それゆえ、その細胞が表面に付着するのを防ぎ、その表面を低タンパク質結合表面にすることである。
【0049】
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄは最近、マルチウェルプレートのウェル内に位置する個々のマイクロキャビティを有する新たな細胞培養容器も開発した。例えば、９６ウェルプレートは９６個のウェルを有し、これらのウェルの各々の中に、１つのスフェロイドが成長することができる（Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｐｌａｔｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）。これらの製品は、３Ｄ細胞凝集体の生成と培養のために設計されている。これらの細胞培養容器も、細胞接着を防ぐためにＵＬＡコーティングを使用しており、本開示に記載された新たな炭水化物の薄いコーティング（例えば、グルコース薄膜コーティング）を使用できるであろう。これらの新たな細胞培養容器に関する詳細について、２０１５年１０月２９日に出願され、「３Ｄ細胞凝集体の生成および培養のための器具および方法(Devices and Methods for Generation and Culture of 3D Cell Aggregates)」と題する同一出願人による特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／５８０４８号（その内容が、全ての目的について、ここに引用される）を参照のこと。重ねて、このＵＬＡコーティングの主な目的は、３Ｄ凝集体の形成を促進するために、細胞の細胞培養表面への付着を防ぐことにある。
【0050】
従来の平らなＵＬＡ被覆ポリスチレン表面は、３０°から５０°まで様々である接触角（図１Ａおよび表２に示されるような）による弱い親水性を示す。しかしながら、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面にマイクロキャビティを導入すると、見掛け接触角（図１Ｂに概略的に示され、表２において測定されたような）が増加する。図１Ａおよび１Ｂは、マイクロキャビティ７１０のアレイを含む表面（図１Ｂ）と比べた平面１００（図１Ａ）の湿潤性の概略図を示している。図１Ａおよび１Ｂは、同じ高分子材料から製造された表面を示す。図１Ａおよび１Ｂにおいて、θｐ＞θｆであるのが分かり、θｐ≧１２０°の場合、エアロックが生じる（表面のマイクロキャビティ特徴７１０中の空気１０１の閉じ込め）ことを認識すべきである（注記：θｆは平面１００に関連する接触角であり、θｐはマイクロキャビティを含む表面１０４に関連する接触角である。実際には、接触角は、概して、表面のタイプにかかわらずに、θにより表される）。マイクロキャビティ・アレイ表面（マイクロキャビティ７１０のアレイを有する表面、例えば、図１０Ｂの６００を参照のこと）の場合。粗さ係数ｒ＞１では、マイクロキャビティ７１０内に気泡が閉じ込められ得る。この系は、以下のように、カッシー・バクスター・モデルにより記載できる：
ｃｏｓθＣ－Ｂ＝ψｓｃｏｓ下（１－ψｓ） 式（５）
式中、ψｓは、固体表面と接触した液体ベースの割合であり、ψｓ＜１、（１－ψｓ）はエアポケットと接触した液体ベースの割合である。カッシー・バクスター・モデル（ｃｏｓθＣ－Ｂ）に関する詳細について、A. B. Cassie et al. “Wettablity of Porous Surfaces” Trans. Faraday Soc., 1944, 40, 546-551（この文献の内容が、全ての目的について、ここに引用される）を参照のこと。
ｃｏｓθＣ－Ｂ＝ψｓｃｏｓ下（１－ψｓ） 式（５）
式中、ψｓは、固体表面と接触した液体ベースの割合であり、ψｓ＜１、（１－ψｓ）はエアポケットと接触した液体ベースの割合である。カッシー・バクスター・モデル（ｃｏｓθＣ－Ｂ）に関する詳細について、A. B. Cassie et al. “Wettablity of Porous Surfaces” Trans. Faraday Soc., 1944, 40, 546-551（この文献の内容が、全ての目的について、ここに引用される）を参照のこと。
【0051】
カッシー・バクスター・モデルが、マイクロキャビティのアレイを有する表面の湿潤性をどのように表現しているかを示すために、ＵＬＡで被覆された平らなポリスチレン表面とマイクロキャビティを含むポリスチレン表面の測定された接触角（実施例３にしたがって測定された）およびその上に閉じ込められた気泡の量の分析が、以下のように表２に与えられている。
【0052】
【表2】
【0053】
水性細胞培養培地の添加中にマイクロウェルまたはマイクロキャビティ７１０の増加した（１００％まで）湿潤性を得るために、ＵＬＡ処理済みまたは未処理のポリスチレン表面の接触角をさらに減少させることが望ましいであろう。そして、同時に、表面への細胞付着を阻害するために、細胞培養溶液が施されるときに、ＵＬＡコーティングの化学官能基が依然として存在することを確実にすることが望ましいであろう。
【0054】
実施の形態において、溶ける炭水化物コーティングは、水性液体を細胞培養表面に導入した際の泡の形成を減少させるために、一時的により親水性である細胞培養表面を提供する。追加の実施の形態において、溶ける炭水化物コーティングと、ＵＬＡで処理された高分子表面などの低タンパク質結合表面との組合せにより、（１）気泡の形成を防ぐために表面の湿潤性を増加させる表面を与え、また（２）細胞接着を防ぎ、スフェロイドの形成において細胞の成長を促進させる表面も与える。新たな器具が溶ける炭水化物材料のコーティングを有する本開示の特定の実施の形態を記載するために、これらの実施の形態についての詳しい議論が与えられる。
【0055】
実施の形態において、前記コーティングは薄い。そのコーティングの厚さの範囲は、その機能によって薄い側で制限される－すなわち、コーティングは、表面を湿潤にできるほど十分に厚くなければならないが、水性培地に、細胞培養条件のための範囲から外れるほど多くのグルコースを与えるほど厚くてはならない。例えば、その材料は、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の頂部で、薄い（すなわち、０．０１マイクロメートル）から厚い（すなわち、１～２マイクロメートルまたは５マイクロメートルまで）までの厚さに及ぶことがある。生体適合性であり、かつ高い表面湿潤性を有する（例えば、０°～４０°の範囲の接触角）、その上に配置された水に溶ける炭水化物コーティングを有する高分子表面を有するように、本開示にしたがって構成された器具のいくつかの一般的な実施の形態を記載するために、詳しい議論が与えられる。
【0056】
実施の形態において、前記コーティングは一時的である。すなわち、そのコーティングは溶ける。実施の形態において、水性培地を添加した際に、そのコーティングは培地に溶け、コーティングの下の表面が暴露される。そのコーティングの下の表面は、高分子表面であってもよく、低結合処理またはコーティングで処理された高分子表面であってもよく、滑らかであっても粗くてもよく、マイクロキャビティを含んでもよく、そのマイクロキャビティ自体が滑らかなまたは粗い表面を有してもよい。実施の形態において、その溶けるコーティングが水性培地中に溶けるときに、その培地内で培養される細胞に悪影響がない。すなわち、その溶けるコーティングは、培養中の細胞にとって非毒性である。
【0057】
本開示の実施の形態において、前記細胞培養表面は、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の頂部に堆積されたグルコースのコーティングまたは層を有する（例えば、図６参照）。ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の頂部のグルコースの堆積は、表面の接触角を４０°から１０°（平面について）に、そして４８°から３０°（マイクロキャビティのアレイを有する表面について）に減少させることが分かった（表２に示された、ＵＬＡで被覆された平らなポリスチレンおよびマイクロキャビティのアレイを有するＵＬＡ被覆ポリスチレンについての接触角測定値を、下記の表３に示された、グルコース／ＵＬＡが被覆された平らなポリスチレン表面およびマイクロキャビティを含むポリスチレン表面についての接触角測定値と比較する）。培養中の細胞に栄養分を与えるために、グルコース、および他の炭水化物が、細胞培養培地中の一般的な成分である。
【0058】
図２Ａ（従来技術）は、弱い親水性（表１により、（５６°～６５°）≧θ≧０°の範囲の接触角）を示している、従来技術のＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０４上の水滴２０２を示す写真である。図２Ｂは、親水性（表１により、接触角０°）を示している溶ける炭水化物が被覆された（グルコース被覆された）－ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０８上の水滴２０２を示す写真である。この溶ける炭水化物が被覆された細胞培養物品（グルコース－ＵＬＡ被覆）は、より強力な親水性を示した。
【0059】
溶ける炭水化物コーティングが高分子表面の透明度に干渉しないことを示すために、図３および４が与えられている。図３は、黒と白のポスター３０２の前に位置する従来のＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０４（図３－従来技術）の写真である。図４は、黒と白のポスター３０４の前に位置する溶ける炭水化物材料２０８（この実施の形態において、グルコース）で被覆されたＵＬＡ被覆ポリスチレン表面を示す。図４は、グルコースＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０８が、溶ける炭水化物コーティングの追加後に完全に透明なままであったことを示す。具体的に、図３および４は、従来のＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０４および溶ける炭水化物で被覆されたＵＬＡ被覆ポリスチレン表面２０８の光透過性の比較を示しており、それらの写真は、グルコースコーティングがポリスチレンの光透過性に影響しないことを示す。
【0060】
生体適合性であり、かつ高い表面湿潤性（例えば、０°～４０°の範囲の接触角）を有する、その上に配置された溶ける炭水化物コーティングを持つ高分子表面を有する、本開示による、器具５００、６００、７００および８００（例えば、マイクロキャビティのアレイを有する３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具（平面を有する）、およびマイクロ流体器具）の７つの一般的な実施の形態が、下記に説明される。
【0061】
図５を参照すると、本開示の実施の形態による、上面５０２を持つ高分子基板５０１、および上面５０６を持つ溶ける炭水化物コーティング５０４を有する例示の器具５００の部分側面図が示されている。高分子基板５０２は、細胞培養に適したどの表面であっても差し支えなく、以下（例えば）の内の１つであってよい：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン（例えば、プラズマ処理されたポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。実施の形態において、その高分子基板は、多孔質または非多孔質、小分子透過性、ガス透過性、またはガス透過性で液体不透過性であってよい。溶ける炭水化物コーティング５０４は、（例えば）単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含む幅広い生体適合性炭水化物から製造することができる。例えば、溶ける炭水化物コーティング５０４は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、またはマンニトールであって差し支えない。
【0062】
器具５００は、親水性である表面を提供して、細胞培養物品の表面上またはその近くの気泡の形成を低下させるので、最新の器具を上回る改良である。溶ける炭水化物コーティング５０４は、表面の湿潤性を増加させるだけでなく、炭水化物コーティング５０４は、水性細胞培養培地の添加の際に培地中に溶けるので、高分子表面５０２の物理化学的性質に影響を与えない。
【0063】
溶ける炭水化物コーティング５０４は、周囲条件での長期貯蔵（例えば、３０～４５日間）のために、溶ける炭水化物コーティング５０４を安定化させるために、水溶性安定剤高分子、例えば、ポリエチレンオキシド群からの高分子も含有し得る。グルコース被覆ＵＬＡ表面（平らなものとマイクロキャビティを含むものの両方）は、乾燥条件下で貯蔵された（乾燥剤パッケージを収容するプラスチック袋内に密封された）場合、安定である。２４時間超に亘り周囲条件（室温、４０％超の相対湿度）で貯蔵された場合、グルコースコーティングは、小さいグルコース液滴になり、それゆえ、その被覆されていない湿潤性により、下にある表面が現れるであろう。表３は、２４時間から３０日間までに亘り、マイクロキャビティの存在下と不在下において、安定剤高分子（ポリエチレンオキシド）を添加したものとしないもので、表面の形成直後と様々な貯蔵時間と条件後の両方で、グルコース／ＵＬＡ被覆材料から測定した接触角を示している。表３は、安定性に関して、溶ける炭水化物コーティングで被覆された表面は、乾燥環境において長期間に亘り貯蔵されるであろうことを示している。あるいは、別の方法で、溶ける炭水化物コーティングは、ポリエチレンオキシドなどの安定剤高分子を含有することがあり、これにより、その長所を維持しながら、周囲条件において長期間（すなわち、３０日より長く）貯蔵されるであろう溶ける、炭水化物コーティングを有する基板が提供される。
【0064】
【表3】
【0065】
表３は、平面およびマイクロキャビティを含む表面を有するグルコース被覆ＵＬＡポリスチレンの改善された湿潤性を示している。以後、詳しく述べられる平らな高分子と炭水化物の他の組合せについて、接触角は０°から７０°の範囲になるであろうと考えられる。さらに、以後、詳しく述べられる、マイクロキャビティのアレイを有する高分子および溶ける炭水化物コーティングの他の組合せについて、接触角は０°から６０°の範囲に入るであろうと考えられる。
【0066】
表２および表３を参照すれば分かるように、マイクロキャビティのアレイを有するグルコースＵＬＡ被覆ポリスチレン表面の場合、接触角は、溶ける炭水化物コーティングがないときの４８°から、溶ける炭水化物コーティングがあるときの３０°に減少した。接触角のこの減少により、器具に細胞培養培地の最初の添加中に、マイクロキャビティまたはマイクロウェル内のエアポケットの形成が完全になくなった。
【0067】
図６を参照すると、本開示の実施の形態による上面６０６を形成する溶ける炭水化物コーティング６０４で被覆された上面６０５を有する低タンパク質結合コーティング６０３で被覆された上面６０２を有する高分子基板６０１を有する例示の器具の部分側面図が示されている。高分子基板６０１は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレンまたはプラズマ処理されたポリスチレン、プラズマ処理されたポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。低タンパク質結合コーティング６０３は、ここではＵＬＡ表面６０３とも称される、共有結合ヒドロゲル層６０３（例えば、単分子層または０．０１から５μｍ厚）であり得る。この低タンパク質結合コーティングは、低タンパク質結合コーティングの上面６０５を有する。上面６０６を有する溶ける炭水化物コーティング６０４は、（例えば）単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類を含む幅広い生体適合性炭水化物から製造できる。例えば、溶ける炭水化物コーティング６０４は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ソルビトール、マンニトールであって差し支えない。溶ける炭水化物コーティング６０４は、周囲条件で長期間の貯蔵（例えば、３０～４５日間）のために、得られた水に溶ける炭水化物コーティング６０４を安定化させるために、ポリエチレンオキシド族からの水溶性高分子も含有し得る。器具６００は、最新の器具を上回る改良である。何故ならば、その器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、炭水化物の薄いコーティング６０４は、水性細胞培養培地の添加の際に溶けるので、低タンパク質結合高分子表面６０５の物理化学的性質に影響を与えない溶ける炭水化物コーティング６０４を有するからである。
【0068】
前記溶ける炭水化物コーティングは、細胞培養器具に水性細胞培養培地を導入した際の表面上の気泡の形成を減少させる。その上、その溶ける炭水化物コーティングは、細胞培養器具に水性細胞培養培地を添加した際に溶ける。このようにして、溶ける炭水化物コーティングの存在により導入される表面特徴は、その表面からすぐに除かれる。溶ける炭水化物コーティングの一時的存在は、それは培地中に迅速に溶け、基板の表面特性が残されるので、高分子表面の物理化学的性質に影響しない。実施の形態において、その基板は、低結合コーティング、例えば、ＵＬＡコーティングにより被覆され、そのコーティングは、水に溶ける炭水化物材料が培地中に溶け去った後に、高分子表面上に残る。
【0069】
図７Ａ～７Ｄを参照すると、本開示の実施の形態による、器具７００の４つの異なる例示の形状を示す３つの部分側面図の概略図がある。上面７０２を有する高分子基板７０１を有する細胞培養器具７００が、図７Ａに示されている。高分子基板７０１の上面７０２上に一旦施されたら、低タンパク質結合上面７０５を形成する、随意的な低タンパク質結合コーティング７０３が、高分子基板７０１の上面７０２上に配置されている。上面７０６を有する溶ける炭水化物コーティング７０４が、随意的な低タンパク質結合コーティング７０３の上に配置されている。図７Ａに示された実施の形態において、高分子基板７０１は、コーティング７０３（存在する場合）および７０４が、滑らかまたは実質的に滑らかでもある上面７０５および７０６を与えるように、滑らかまたは実質的に滑らかな高分子表面７０２を有するように構成されている。追加の実施の形態（図示せず）において、上面７０２（７０５、７０６）は粗くてもよい。
【0070】
図７Ｂにおいて、高分子基板７０１の上面７０２は、マイクロキャビティ７１０のアレイを有するように構成されている。高分子基板７０１はその上面７０２にマイクロキャビティ７１０のアレイを有するので、随意的な低タンパク質結合コーティング７０３および溶ける炭水化物コーティング７０４も、その上面（７０５および７０６）上にマイクロキャビティのアレイを有する。
【0071】
図７Ｃおよび７Ｄは、図７Ｂの７５０で示された区域の引き伸ばし図である。図７Ｃおよび７Ｄは、高分子基板７０１の上面７０２がマイクロキャビティ７１０のアレイを有するように構成されていることを示している。高分子基板７０１はその上面７０２にマイクロキャビティ７１０のアレイを有するので、随意的な低タンパク質結合コーティング７０３および溶ける炭水化物コーティング７０４も、その上面（７０５および７０６）上にマイクロキャビティのアレイを有する。その上、図７Ｄに示されるように、マイクロキャビティ７１０自体は、図７Ｄに示された突起７１５により示されるような、粗面を有することがある。これらの突起７１５は、かなり標準化されている、または規則的であるものとして図７Ｄに示されているが、「粗」面は突起または窪みを有してもよいこと、および「滑らか」からのこれらの逸脱が規則的または不規則であってもよいことが当業者には理解されるであろう。先の「粗い」という用語の定義を参照のこと。また、平面（２Ｄ細胞培養に適している）は、「粗い」または「滑らか」であるが、それでも、例えば、図７Ａおよび７Ｂに示されるように平らであろう。同様に、マイクロキャビティの表面は、図７Ｄに示されるように「粗い」、または図７Ｃに示されるように「滑らか」であることがある。
【0072】
それゆえ、図７Ａおよび図７Ｂに示されるように、細胞培養物品の上面は、滑らか（図７Ａに示されるように）または粗くてもよく、滑らかな表面を有するマイクロキャビティのアレイを含んでもよく（図７Ｂおよび７Ｃに示されるように）、または粗面を有するマイクロキャビティのアレイを含んでもよい（図７Ｄに示されるように）。
【0073】
これらの構造は例示であり、器具５００、６００および７００は、分子、細胞、生物学、および他の分野における研究を可能にするために使用できるどの所望の形状を有しても差し支えないことが認識されよう。例えば、その器具は、内部通路が溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４で被覆されたマイクロ流体器具の形状を有してもよい。さらに、図５～７および１０に示された器具５００、６００および７００は、原寸に比例しておらず、代わりに、特定の実施の形態において、炭水化物コーティング５０４、６０４および７０４は０．０１～５μｍ厚の範囲にあることがあり、親水性コーティング６０３、７０３は単分子層または０．０１から１００μｍであることがあり、高分子表面５０２、６０２または７０２は、０．０１～１０ｍｍ（ミリメートル）の範囲にあることがあることを認識すべきである。
【0074】
図８を参照すると、本開示の実施の形態による器具５００、６００および７００（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を製造するための例示の方法８００を示す流れ図が与えられている。方法８００は、（ａ）その表面が必要に応じて低タンパク質結合コーティング６０３、７０３（各々が上面６０５、７０５を有する）を有する上面５０２、６０２または７０２を有する高分子基板５０１、６０１または７０１を提供する工程（工程８０２）、および（ｂ）高分子表面５０２、６０２または７０２上に水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を施す工程（工程８０４）を有してなる。この施す工程８０４は、吹き付け塗り工程、溶媒被覆工程、または回転塗布工程を含み得る。例えば、施す工程８０４は、炭水化物と溶媒の溶液を高分子表面５０２、６０２または７０２と直接接触させる工程（工程８０４ａ）、およびその溶液から溶媒を蒸発させて、水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４で被覆されている高分子表面５０２および６０２をもたらす工程（工程８０４ｂ）を含み得る（必要に応じて、表面５０２、６０２または７０２に共有結合していてもよく、または高分子表面５０２、６０２または７０２に化学結合していなくてもよい低タンパク質結合コーティングの存在下で）。高分子表面５０２、６０２および７０２に化学結合していない水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４および７０４が、その溶ける炭水化物コーティングが水性培地の存在下で溶け去り、高分子表面５０２、６０２および７０２の本来の物理化学的性質、または必要に応じて、低タンパク質結合コーティング６０５または７０５の物理化学的性質が残されるために望ましい。
【0075】
実施の形態において、高分子基板６０１、７０１の上面６０２、７０２は、その上に水に溶ける炭水化物コーティング６０４、７０４が施される低タンパク質結合コーティング６０３、７０３（例えば、共有結合したヒドロゲル層６０３、７０３）を有することがある。高分子基板５０１、６０１または７０１は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、プラズマ処理されたポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、以下（例えば）の内の１つから製造できる：単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類。水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、周囲条件における長期貯蔵のために、得られた水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を安定化させるためにポリエチレンオキシドも含有し得る。器具５００、６００または７００は、最新の器具を上回る著しい改良である。何故ならば、その器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、水性細胞培養培地の添加の際に溶けるので、高分子表面５０２、６０２および７０２の物理化学的性質に影響を与えない水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を有するからである。
【0076】
図９を参照すると、本開示の実施の形態による、細胞増殖に適した形態にある器具５００、６００および７００（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を使用するための例示の方法９００を示す流れ図がある。方法９００は、（ａ）必要に応じて、低タンパク質結合コーティング（６０３、７０３）の存在下で、高分子表面５０２、６０２または７０２を有する器具５００、６００または７００に、その上に位置する水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を与える工程（工程９０２）、および（ｂ）少なくとも、水、炭水化物、および細胞を含有する水性細胞培養培地溶液を、高分子表面５０２、６０２または７０２上または必要に応じて、低タンパク質結合コーティング６０３または７０３上に位置する水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４の上面５０６、６０６または７０６上に加える工程（工程９０４）を有してなる。実施の形態において、高分子表面６０２または７０２は、その上に水に溶ける炭水化物コーティング６０４または７０４がある低タンパク質結合コーティング６０３または７０３（例えば、共有結合したヒドロゲル層６０３または７０３）を有することがある。高分子表面５０２、６０２または７０２は、以下（例えば）の内の１つであり得る：エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン（例えば、プラズマ処理されたポリスチレン）、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマー。水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、以下（例えば）の内の１つから製造できる：単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類。水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、周囲条件における長期貯蔵のために、得られた水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を安定化させるためにポリエチレンオキシドも含有し得る。器具５００、６００または７００は、最新の器具を上回る著しい改良である。何故ならば、その器具は、表面湿潤性を増加させるだけでなく、溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４は、水性細胞培養培地の添加の際に溶けるので、高分子表面５０２、６０２または７０２、もしくは必要に応じて、親水性層６０３または７０３の物理化学的性質に影響を与えない水に溶ける炭水化物コーティング５０４、６０４または７０４を有するからである。実施の形態において、溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養表面に細胞培地が一旦添加されたら、その炭水化物コーティングは培地中に溶け、高分子表面（随意的な低タンパク質結合コーティングの有無にかかわらずに）が残される。
【0077】
図１０Ａおよび１０Ｂを参照すると、細胞培養器具、この場合には、細胞培養表面上にマイクロキャビティ７１０のアレイを有する細胞培養フラスコ８００の実施の形態が示されている。フラスコ８００は、上壁８１５、マイクロキャビティ７１０のアレイを含む底壁８５０、側壁８２０、およびこのフラスコの首部８６０に取り付けられた取り外せるキャップ８６１を有する。図１０Ｂは、図１０Ａの四角形に示された区域の引き伸ばされた図であり、マイクロキャビティ７１０のアレイ６００を示している。実施の形態において、マイクロキャビティは、丸くても（図１０Ａおよび１０Ｂに示されるように）、例えば、図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように六角形であっても、もしくはどの他の形状であってもよい。細胞培養フラスコが示されているが、細胞培養器具は、細胞培養に適したどの器具であっても差し支えなく、皿、プレート、ウェル、マルチウェルプレート（２、３、４、６、１２、２４、９６または１５３６ウェル、もしくはどの他の数のウェルを有しても差し支えない）、フラスコ、多層フラスコ、またはどの他の適切な細胞培養器具も含むことが理解されよう。マイクロキャビティのアレイを含むこれらの器具は、実施の形態において、３Ｄ細胞培養器具である。丸底（マイクロキャビティを含まない）を有する９６ウェルプレートを含む、培養において３Ｄ細胞形成を促進するように構造化された器具も、３Ｄ細胞培養器具である。
【0078】
態様（１）において、本開示は、上面を有する高分子基板を備えた細胞培養のための器具であって、その高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングが配置された器具を提供する。態様（２）において、本開示は、その溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、態様１の器具を提供する。態様（３）において、その溶ける炭水化物コーティングは安定剤をさらに含む。態様（４）において、その安定剤はポリエチレンオキシドを含む。態様（５）において、本開示は、高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、態様１～４のいずれか１つの器具を提供する。態様（６）において、その高分子基板は、ガス透過性であり、液体不透過性である。態様（７）において、本開示は、高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、態様１～６のいずれか１つの器具を提供する。態様（８）において、本開示は、その低タンパク質結合コーティングが、高分子基板の上面に共有結合したヒドロゲル層を含む、態様７の器具を提供する。態様（９）において、本開示は、その高分子基板の上面が滑らかな表面を含む、態様１～８のいずれか１つの器具を提供する。態様（１０）において、本開示は、その高分子基板の上面が粗面を含む、態様１～９のいずれか１つの器具を提供する。態様（１１）において、本開示は、その高分子基板の上面が超親水性である、態様１～１０のいずれか１つの器具を提供する。態様（１２）において、本開示は、その器具が、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、およびマイクロ流体器具からなる群より選択される、態様１～１１のいずれか１つの器具を提供する。態様（１３）において、本開示は、その器具が、マイクロキャビティのアレイを含む３Ｄ細胞培養器具である、態様１～１１のいずれか１つの器具を提供する。
【0079】
態様（１４）において、本開示は、器具を製造する方法であって、高分子基板を提供する工程、およびその高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程を有してなる方法を提供する。態様（１５）において、本開示は、その高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程が、炭水化物と溶媒の溶液をその高分子基板の上面と直接接触させる工程、およびその溶液から溶媒を蒸発させて、高分子基板に化学結合していない溶ける炭水化物コーティングを備えた高分子基板の上面を得る工程を含む、態様１４の方法を提供する。態様（１６）において、本開示は、その施す工程が、吹き付け塗り工程、溶媒被覆工程、および回転塗布工程からなる群より選択される工程を含む、態様１４の方法を提供する。態様（１７）において、本開示は、その高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、態様１４または１５の方法を提供する。態様（１８）において、本開示は、親水性コーティングが、共有結合したヒドロゲル層である、態様１７の方法を提供する。態様（１９）において、本開示は、その高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、態様１４の方法を提供する。態様（２０）において、本開示は、その溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、態様１４の方法を提供する。態様（２１）において、本開示は、その溶ける炭水化物コーティングがポリエチレンオキシドをさらに含有する、態様２０の方法を提供する。
【0080】
別の態様（２２）において、本開示は、細胞培養のための方法であって、態様１～１３のいずれか１つの細胞培養器具を提供する工程、およびその器具に、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養培地を加える工程を有してなる方法を提供する。
【0081】
以下は、２４マルチウェルプレートの上部のグルコースの被覆、および３Ｄ細胞凝集体の播種と培養を含む実験工程のより詳しい議論である。その２４マルチウェルプレートは、以下のように行ったグルコースコーティングの塗布の前に、マイクロウェルパターンを備えたＵＬＡが被覆された滑らかなポリスチレン表面を有した：
【実施例】
【0082】
実施例１：コーティング
マイクロウェルを被覆するために、メタノール中の１％ｗ／ｖのグルコース溶液を２４ウェルプレートの各マイクロウェルまはマイクロキャビティに２０μｌ／ｃｍ２で加えた。各場合で、２４ウェルプレートは、ポリスチレンなどの被覆されていない高分子材料から製造しても、低タンパク質結合溶液、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからのＵＬＡコーティングが設けられてもよい。この２４ウェルプレートの細胞培養表面は、マイクロウェルまたはマイクロキャビティを含んだが、そのマイクロウェルまたはマイクロキャビティ自体は、粗い内面を持たなかった。すなわち、その細胞培養表面はマイクロキャビティを含んでいたが、そのマイクロキャビティは滑らかな表面を有した。メタノールを１５分間に亘り４５℃で蒸発させた。そのグルコースコーティングは、０．２ｍｇ／ｃｍ２の量のグルコースの添加に相当する。
マイクロウェルを被覆するために、メタノール中の１％ｗ／ｖのグルコース溶液を２４ウェルプレートの各マイクロウェルまはマイクロキャビティに２０μｌ／ｃｍ２で加えた。各場合で、２４ウェルプレートは、ポリスチレンなどの被覆されていない高分子材料から製造しても、低タンパク質結合溶液、例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからのＵＬＡコーティングが設けられてもよい。この２４ウェルプレートの細胞培養表面は、マイクロウェルまたはマイクロキャビティを含んだが、そのマイクロウェルまたはマイクロキャビティ自体は、粗い内面を持たなかった。すなわち、その細胞培養表面はマイクロキャビティを含んでいたが、そのマイクロキャビティは滑らかな表面を有した。メタノールを１５分間に亘り４５℃で蒸発させた。そのグルコースコーティングは、０．２ｍｇ／ｃｍ２の量のグルコースの添加に相当する。
【0083】
実施例２：ポリエチレンオキシドを使用したコーティング
グルコースの含水性質のために、このタイプのコーティングは周囲湿度に対して中程度の感度を示す、例えば、周囲条件における２４時間の貯蔵後に、グルコースコーティングは、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面上で微細な液滴に分かれ始めることに留意すべきである。この問題に対処するために、その溶ける炭水化物コーティング（この実施例では、グルコース）は、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面にグルコースコーティングを施すために使用される吹き付け塗り溶液中にポリエチレンオキシド（ＰｏｌｙＯｘ ＷＳＲＮ１２Ｋ、ＤＯＷ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加することによって、安定化させることができる。例えば、ＵＬＡ処理済みポリスチレン表面に、メタノール溶液中の０．２５％ｗ／ｖのグルコース、０．１％ｗ／ｖのＰｏｌｙＯｘを吹き付け塗りすることによつて、安定なグルコースコーティングを得た。次に、残留するメタノール溶媒を１５分間に亘り４５℃で乾燥させた。ＵＬＡ処理済みポリスチレン上のグルコース・ポリエチレンオキシド・コーティングは、少なくとも４日間に亘り（表３参照）、周囲条件（５０％の相対湿度、２５℃の室温）で安定していた。
グルコースの含水性質のために、このタイプのコーティングは周囲湿度に対して中程度の感度を示す、例えば、周囲条件における２４時間の貯蔵後に、グルコースコーティングは、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面上で微細な液滴に分かれ始めることに留意すべきである。この問題に対処するために、その溶ける炭水化物コーティング（この実施例では、グルコース）は、ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面にグルコースコーティングを施すために使用される吹き付け塗り溶液中にポリエチレンオキシド（ＰｏｌｙＯｘ ＷＳＲＮ１２Ｋ、ＤＯＷ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加することによって、安定化させることができる。例えば、ＵＬＡ処理済みポリスチレン表面に、メタノール溶液中の０．２５％ｗ／ｖのグルコース、０．１％ｗ／ｖのＰｏｌｙＯｘを吹き付け塗りすることによつて、安定なグルコースコーティングを得た。次に、残留するメタノール溶媒を１５分間に亘り４５℃で乾燥させた。ＵＬＡ処理済みポリスチレン上のグルコース・ポリエチレンオキシド・コーティングは、少なくとも４日間に亘り（表３参照）、周囲条件（５０％の相対湿度、２５℃の室温）で安定していた。
【0084】
実施例３：接触角の測定
全ての材料の試料の接触角を、Ｋｒｕｓｓ ＤＳＡ３０ Ｄｒｏｐ形状分析システム（Ｋｒｕｓｓ ＧｍｂＨ、独国）で測定した。５μｍの蒸留水を表面に１００μｌ／分の速度で堆積させし、液滴形状のデフォルト曲線当てはめにより、接触角を測定した。
全ての材料の試料の接触角を、Ｋｒｕｓｓ ＤＳＡ３０ Ｄｒｏｐ形状分析システム（Ｋｒｕｓｓ ＧｍｂＨ、独国）で測定した。５μｍの蒸留水を表面に１００μｌ／分の速度で堆積させし、液滴形状のデフォルト曲線当てはめにより、接触角を測定した。
【0085】
実施例４：細胞培養
実施例１および実施例２によるマルチウェルプレートの各ウェルに、５０μｌ／ｃｍ２のＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １６６００－０８２）を加えて、マイクロウェルを満たした。この工程の後に、１百万細胞／ｍｌの濃度でＭｃＣｏｙの培地中に懸濁された結腸癌ＨＣＴ １１６細胞を１５０μｌ／ｃｍ２で加えた。細胞をマイクロウェル中に沈降させ、２４ウェルプレートを、３７℃、５％のＣＯ２、９５％の相対湿度で細胞培養器内で培養した。
実施例１および実施例２によるマルチウェルプレートの各ウェルに、５０μｌ／ｃｍ２のＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔ＃ １６６００－０８２）を加えて、マイクロウェルを満たした。この工程の後に、１百万細胞／ｍｌの濃度でＭｃＣｏｙの培地中に懸濁された結腸癌ＨＣＴ １１６細胞を１５０μｌ／ｃｍ２で加えた。細胞をマイクロウェル中に沈降させ、２４ウェルプレートを、３７℃、５％のＣＯ２、９５％の相対湿度で細胞培養器内で培養した。
【0086】
培養３日後のグルコースＵＬＡ被覆ポリスチレンマイクロウェル４０４内に形成された細胞スフェロイド４０２の画像が、図１１Ａおよび１１Ｂに示されている。表面のグルコースコーティングは、細胞播種手順の最中に細胞培養培地内の全体のグルコース濃度を２０％増加させた。しかしながら、そのグルコース濃度は、その後の毎日の細胞培地の交換後に、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地に通常見られる規定濃度に戻った。一般に、哺乳類細胞は、１ｇ／Ｌから１０ｇ／Ｌに及ぶグルコースレベルの非常に広い許容範囲を有する。先の実施例において、グルコース濃度は、最初の細胞播種中に２．９５ｇ／Ｌから３．５ｇ／Ｌに上昇し、これは十分に許容範囲内である。
【0087】
試験したグルコース・ポリエチレンオキシド被覆ＵＬＡポリスチレン表面は、細胞培養培地が１～１０ｇ／Ｌの濃度で主栄養物としてグルコースを含有していたので、細胞研究に使用した場合、完全に生体適合性であった。すなわち、グルコース・ポリエチレンオキシド被覆ＵＬＡポリスチレン表面の存在下で、細胞は増殖した。例えば、図１１Ａおよび１１Ｂは、グルコースコーティングが、被覆された滑らかなポリスチレンマイクロウェル４０４内の気泡の閉じ込めをなくした（培養形式：２４ウェルプレート）、滑らかな内面を有するグルコース被覆ＵＬＡ被覆マイクロウェル４０４の内部で３日間培養した後のＨＣＴ １１６ヒト結腸直腸癌細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））（ＨＣＴ）１１６細胞４０２の３Ｄ細胞凝集体を示す写真である。３Ｄスフェロイド４０２が、細胞播種の前にグルコースが被覆されたＵＬＡの被覆された滑らかなマイクロウェル４０４内に形成した。細胞培養培地の添加中に、グルコースが被覆されたＵＬＡの被覆された滑らかなマイクロウェル４０４内に、気泡の閉じ込めは見られなかった。
【0088】
先のことに鑑みて、当業者には、本開示は、高い表面湿潤性を持つ生体適合性の溶ける炭水化物表面コーティングを有する器具（例えば、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、マイクロ流体器具）を開示していることが容易に認識されるであろう。この生体適合性の溶ける炭水化物表面コーティングは、疎水性または弱く親水性の表面をより親水性の表面に効果的に転換させ、表面の元の接触角を０～１０°まで著しく減少させる水に溶ける炭水化物コーティング（例えば、グルコース薄膜）である。水溶液中の炭水化物コーティング（例えば、グルコース薄膜）のその後の溶解のために、このタイプのコーティングは、元の表面の物理化学的性質を永久的には変えない。そのような溶ける炭水化物コーティング（例えば、グルコースコーティング）は、細胞培養用途における表面湿潤性の改質にとって有益であろう。そのような炭水化物コーティング（例えば、グルコースコーティング）は、マイクロキャビティを有する表面に水性培地を導入する最中にマイクロキャビティ内の空気の閉じ込めをなくすために、培養における平らな二次元の細胞とは対照的に、非接着性スフェロイドの増殖を促進する環境を提供するのに適した、マイクロキャビティのアレイを含む表面の表面改質において特に有用であろう。このタイプの表面コーティングは、その炭水化物（例えば、グルコース）は、細胞培養培地中に与えられる栄養物であるので、完全に生体適合性である。
【0089】
さらに、ここに述べられたマイクロキャビティは、スフェロイドの培養に適したどのサイズまたは形状であっても差し支えないことを認識すべきである。例えば、ある実施の形態において、各マイクロキャビティは、閉じた半球形丸底、直径Ｄｔｏｐを有する開いた円形頂部、並びに底と頂部との間で直径が増加し、底と頂部との間の直径Ｄｈａｌｆ－ｗａｙおよび底の上の高さＨを持つ側壁を有することがあり、ここで、Ｄｔｏｐ＝１．５から２．５Ｄｈａｌｆ－ｗａｙ、Ｈ＝０．７から１．３Ｄｈａｌｆ－ｗａｙ、Ｄｈａｌｆ－ｗａｙは２００から１０００μｍである。そして、ここに述べられたマイクロキャビティのアレイを含む表面は、例えば、平面の１１の公知の均一なタイル張り（例えば、三角形、正方形、六角形充填）の内の１つの均一に充填されたマイクロキャビティまたはマイクロウェル構造を持つ平面として定義できる［例えば、Williams, Robert (1979). The Geometrical Foundation of Natural Structure: A Source Book of Design. Dover Publications, Inc. p. 35-39. ISBN
0-486-23729-Xを参照のこと。この文献の内容が、全ての目的のために、ここに引用される］。
【0090】
様々な開示された実施の形態は、その特定の実施の形態に関して記載された特定の特徴、要素または工程を含むことができることが認識されよう。特定の特徴、要素または工程は、１つの特定の実施の形態に関して記載されているが、様々な説明されていない組合せまたは順序で代わりの実施の形態と交換されても、または組み合わされてもよいことも認識されよう。
【0091】
また、ここに用いたように、名詞は、「少なくとも１つの」対象を指し、特に明記のない限り、「ただ１つ」の対象に限定されるべきではないことも理解すべきである。それゆえ、例えば、「開口」に対する言及は、そうではないと文脈が明白に示していない限り、そのような「開口」を２つ以上有する例を含む。
【0092】
範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値まで、とここに表現できる。そのような範囲が表現された場合、例は、その１つの特定の値から、および／または他方の特定の値までを含む。同様に、値が、「約」という先行詞を使用して近似として表されている場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらに、範囲の各々の端点は、他方の端点に関連としてと、他方の端点と関係なくの両方で有意であることが理解されよう。
【0093】
ここに表現された全ての数値は、特に明記のない限り、そのように述べられていてもいなくても、「約」を含むと解釈すべきである。しかしながら、列挙された各数値は、それが「約」その値として表されているか否かにかかわらず、同様に正確に考えられることがさらに理解されよう。それゆえ、「１０ｍｍ未満の寸法」および「約１０ｍｍ未満の寸法」の両方とも、「約１０ｍｍ未満の寸法」並びに「１０ｍｍ未満の寸法」の実施の形態を含む。
【0094】
特に明記のない限り、ここに述べられたどの方法も、その工程が特定の順序で行われることを要求すると解釈されることは決して意図されていない。したがって、方法の請求項がその工程が従うべき順序を実際に列挙していない場合、またはその工程が特定の順序に制限されるべきであることが、請求項または説明に他に具体的に述べられていない場合、どの特定の順序も暗示されるとは決して意図されていない。
【0095】
特定の実施の形態の様々な特徴、要素または工程が、「含む」という移行句を使用して開示されることがあるが、「からなる」または「から実質的になる」という移行句を使用して記載されることがあるものを含む、代わりの実施の形態が暗示されると理解すべきである。それゆえ、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む方法に対して暗示される代わりの実施の形態は、方法がＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施の形態、および方法がＡ＋Ｂ＋Ｃから実質的になる実施の形態を含む。
【0096】
本開示の多数の実施の形態が、添付図面に示され、先の詳細な説明に記載されてきたが、本開示は、開示された実施の形態に限定されず、以下の請求項により述べられ定義されたように、本開示から逸脱せずに、様々な再配列、改変および置換が可能であることを理解すべきである。
【0097】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【0098】
実施形態１
細胞培養器具であって、
上面を有する高分子基板、
を備え、
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングが配置された器具。
細胞培養器具であって、
上面を有する高分子基板、
を備え、
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングが配置された器具。
【0099】
実施形態２
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
【0100】
実施形態３
前記溶ける炭水化物コーティングが安定剤をさらに含む、実施形態１に記載の器具。
前記溶ける炭水化物コーティングが安定剤をさらに含む、実施形態１に記載の器具。
【0101】
実施形態４
前記安定剤がポリエチレンオキシドを含む、実施形態３に記載の器具。
前記安定剤がポリエチレンオキシドを含む、実施形態３に記載の器具。
【0102】
実施形態５
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
【0103】
実施形態６
前記高分子基板が、ガス透過性であり、液体不透過性である、実施形態５に記載の器具。
前記高分子基板が、ガス透過性であり、液体不透過性である、実施形態５に記載の器具。
【0104】
実施形態７
前記高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、実施形態１に記載の器具。
前記高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、実施形態１に記載の器具。
【0105】
実施形態８
前記低タンパク質結合コーティングが、前記高分子基板の上面に共有結合したヒドロゲル層を含む、実施形態７に記載の器具。
前記低タンパク質結合コーティングが、前記高分子基板の上面に共有結合したヒドロゲル層を含む、実施形態７に記載の器具。
【0106】
実施形態９
前記溶ける炭水化物コーティングが安定剤を含む、実施形態１に記載の器具。
前記溶ける炭水化物コーティングが安定剤を含む、実施形態１に記載の器具。
【0107】
実施形態１０
前記安定剤がポリエチレンオキシドを含む、実施形態９に記載の器具。
前記安定剤がポリエチレンオキシドを含む、実施形態９に記載の器具。
【0108】
実施形態１１
前記高分子基板の上面が滑らかな表面を含む、実施形態１に記載の器具。
前記高分子基板の上面が滑らかな表面を含む、実施形態１に記載の器具。
【0109】
実施形態１２
前記高分子基板の上面が粗面を含む、実施形態１に記載の器具。
前記高分子基板の上面が粗面を含む、実施形態１に記載の器具。
【0110】
実施形態１３
前記高分子基板の上面が超親水性である、実施形態１２に記載の器具。
前記高分子基板の上面が超親水性である、実施形態１２に記載の器具。
【0111】
実施形態１４
前記器具が、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、およびマイクロ流体器具からなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
前記器具が、３Ｄ細胞培養器具、２Ｄ細胞培養器具、およびマイクロ流体器具からなる群より選択される、実施形態１に記載の器具。
【0112】
実施形態１５
器具を製造する方法であって、
高分子基板を提供する工程、および
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程、
を有してなる方法。
器具を製造する方法であって、
高分子基板を提供する工程、および
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程、
を有してなる方法。
【0113】
実施形態１６
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程が、
炭水化物と溶媒の溶液を前記高分子基板の上面と直接接触させる工程、および
前記溶液から前記溶媒を蒸発させて、前記高分子基板に化学結合していない溶ける炭水化物コーティングを備えた高分子基板の上面を得る工程、
を含む、実施形態１５に記載の方法。
前記高分子基板の上面に溶ける炭水化物コーティングを施す工程が、
炭水化物と溶媒の溶液を前記高分子基板の上面と直接接触させる工程、および
前記溶液から前記溶媒を蒸発させて、前記高分子基板に化学結合していない溶ける炭水化物コーティングを備えた高分子基板の上面を得る工程、
を含む、実施形態１５に記載の方法。
【0114】
実施形態１７
前記施す工程が、吹き付け塗り工程、溶媒被覆工程、および回転塗布工程からなる群より選択される工程を含む、実施形態１５に記載の方法。
前記施す工程が、吹き付け塗り工程、溶媒被覆工程、および回転塗布工程からなる群より選択される工程を含む、実施形態１５に記載の方法。
【0115】
実施形態１８
前記高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、実施形態１５に記載の方法。
前記高分子基板が低タンパク質結合コーティングを備える、実施形態１５に記載の方法。
【0116】
実施形態１９
親水性コーティングが、共有結合したヒドロゲル層である、実施形態１８に記載の方法。
親水性コーティングが、共有結合したヒドロゲル層である、実施形態１８に記載の方法。
【0117】
実施形態２０
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
前記高分子基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
【0118】
実施形態２１
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類、およびその混合物からなる群より選択される、実施形態１５に記載の方法。
【0119】
実施形態２２
前記溶ける炭水化物コーティングがポリエチレンオキシドをさらに含有する、実施形態１５に記載の方法。
前記溶ける炭水化物コーティングがポリエチレンオキシドをさらに含有する、実施形態１５に記載の方法。
【0120】
実施形態２３
細胞培養のための方法であって、
上面およびその上に配置された溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板を提供する工程、および
前記溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板上に、少なくとも、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養溶液を加える工程、
を有してなる方法。
細胞培養のための方法であって、
上面およびその上に配置された溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板を提供する工程、および
前記溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板上に、少なくとも、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養溶液を加える工程、
を有してなる方法。
【0121】
実施形態２４
細胞培養のための方法であって、
低タンパク質結合コーティングを備えた上面および該低タンパク質結合コーティングの上に配置された水に溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板を提供する工程、および
被覆された前記細胞培養基板上に、少なくとも、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養溶液を加える工程、
を有してなる方法。
細胞培養のための方法であって、
低タンパク質結合コーティングを備えた上面および該低タンパク質結合コーティングの上に配置された水に溶ける炭水化物コーティングを有する細胞培養基板を提供する工程、および
被覆された前記細胞培養基板上に、少なくとも、水、炭水化物、および細胞を含む細胞培養溶液を加える工程、
を有してなる方法。
【0122】
実施形態２５
前記細胞培養基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択され、
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類、またはその混合物からなる群より選択される、実施形態２４に記載の方法。
前記細胞培養基板が、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエステルのコポリマー、およびフルオロポリマーからなる群より選択され、
前記溶ける炭水化物コーティングが、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類、またはその混合物からなる群より選択される、実施形態２４に記載の方法。
【符号の説明】
【0123】
１００ 平面
１０１ 空気
１０２、１０４ 高分子材料
２０２ 水性液体
２０４ ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面
２０８ 溶ける炭水化物が被覆されたＵＬＡ被覆ポリスチレン表面
３０２、３０４ 白と黒のポスター
４０２ 細胞スフェロイド
４０４ マイクロウェル
５００、６００、７００ 細胞培養器具
５０１、６０１、７０１ 高分子基板
５０４、６０４、７０４ 炭水化物コーティング
６０３、７０３ 低タンパク質結合コーティング
７１０ マイクロキャビティ
７１５ 突起
８００ フラスコ
８１５ 上壁
８２０ 側壁
８５０ 底壁
８６０ 首部
８６１ キャップ
１０１ 空気
１０２、１０４ 高分子材料
２０２ 水性液体
２０４ ＵＬＡ被覆ポリスチレン表面
２０８ 溶ける炭水化物が被覆されたＵＬＡ被覆ポリスチレン表面
３０２、３０４ 白と黒のポスター
４０２ 細胞スフェロイド
４０４ マイクロウェル
５００、６００、７００ 細胞培養器具
５０１、６０１、７０１ 高分子基板
５０４、６０４、７０４ 炭水化物コーティング
６０３、７０３ 低タンパク質結合コーティング
７１０ マイクロキャビティ
７１５ 突起
８００ フラスコ
８１５ 上壁
８２０ 側壁
８５０ 底壁
８６０ 首部
８６１ キャップ
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】