特許 7027459 ヒドロゲルビーズを用いるＤＮＡ配列決定

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-18

(45)【発行日】2022-03-01

(54)【発明の名称】ヒドロゲルビーズを用いるＤＮＡ配列決定

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/34 20060101AFI20220221BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20220221BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20220221BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20220221BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20220221BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20220221BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20220221BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20220221BHJP

【ＦＩ】

C12M1/34 Z

C07K14/00 ZNA

C12N15/11 Z

C40B40/06

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

C12M1/00 A

C12N15/09 Z

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2019568595

(86)(22)【出願日】2019-02-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-11-19

(86)【国際出願番号】 US2019017521

(87)【国際公開番号】W WO2019160820

(87)【国際公開日】2019-08-22

【審査請求日】2020-02-12

(31)【優先権主張番号】62/630,175

(32)【優先日】2018-02-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(74)【代理人】

【識別番号】100165892

【弁理士】

【氏名又は名称】坂田 啓司

(72)【発明者】

【氏名】イア－シュアン・ウー

(72)【発明者】

【氏名】フィリズ・ゴルペ－ヤサル

(72)【発明者】

【氏名】タルン・クマール・クラナ

(72)【発明者】

【氏名】ビクトリア・ポピック

(72)【発明者】

【氏名】エリック・ビー・イェガー

(72)【発明者】

【氏名】モスタファ・ロナギ

【審査官】山内 達人

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５１７２８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０１３６５４４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】NATURE BIOTECHNOLOGY，2017年，VOLUME 35 NUMBER 7，p. 640-646, ONLINE METHODS

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０／ＪＳＴＣｈｉｎａ（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒドロゲルポリマー、
還元剤の存在下で切断される可逆性ポリマー架橋剤、および
ヒドロゲルビーズ内に配置されたＤＮＡ
を含むヒドロゲルビーズを得る工程であって、ここで、該ビーズは、ＤＮＡを保持しながらビーズを通しての反応剤の拡散を可能にする細孔を含む、工程；
ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡを増幅させる工程；
ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡに対してタグメンテーションを実施して、ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡライブラリーを作製する工程；および
該ＤＮＡの配列を決定する工程；
を含む、ＤＮＡ配列決定法。

【請求項2】

ビーズが５０μｍから１５０μｍの直径を有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項3】

ヒドロゲルポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ,Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン（ＢＡＣｙ）、ＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ポリリシン、寒天、アガロース、アルギン酸塩、ヘパリン、硫酸アルギン酸塩、硫酸デキストラン、ヒアルロン酸、ペクチン、カラギーナン、ゼラチン、キトサン、セルロース、またはコラーゲンを含む、請求項１または２に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項4】

ＤＮＡが、５０，０００塩基対以上の長いＤＮＡ分子である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項5】

反応剤が、酵素、化合物および５０塩基対未満のサイズを有するプライマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項6】

反応剤が、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ、トランスポザーゼ、５０塩基対未満のサイズを有するプライマー、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、または二価陽イオンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項7】

還元剤が、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノールまたはβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエタノール、グルタチオン、チオグリコール酸、２，３－ジメルカプトプロパノール、トリス（２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、またはＰ－［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン］プロピオン酸（ＴＨＰＰ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項8】

ＤＮＡを増幅させる工程が多重置換増幅（ＭＤＡ）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項9】

タグメンテーションが、ＤＮＡを、トランスポザーゼおよびアダプターを含むトランスポソーム複合体と接触させる工程を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項10】

固体支持体上にＤＮＡライブラリーをシーディングすることをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項11】

シーディングが、ヒドロゲルを切断して、該ヒドロゲルからＤＮＡライブラリーを放出させることを含む、請求項１０に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項12】

切断が、ヒドロゲルと開裂酵素ミックスを接触させることを含む、請求項１１に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項13】

開裂酵素ミックスが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、またはトリス（３－ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰ）を含む、請求項１２に記載のＤＮＡ配列決定法。

【請求項14】

固体支持体がフローセル装置である、請求項１０から１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列決定法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本明細書に記載のシステム、方法および組成物は、ポリヌクレオチドの配列の決定および関連するライブラリー作製に用いるための、ヒドロゲルビーズ、およびヒドロゲルビーズ内に長いＤＮＡを封入する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

背景
次世代シークエンサーは、１回のシークエンシングランで大量のゲノムデータを産生する強力なツールである。この大量のデータを解釈および分析することは、困難な場合がある。１塩基合成（Sequencing by synthesis：ＳＢＳ）技術は、高品質のシークエンシング（配列決定）データを提供する。しかしながら、ショートリード（最大リード長が２×３００ｂｐである）が、現在のＳＢＳケミストリーの１つの限界である。最近では、一塩基多型（single nucleotide variants：ＳＮＰ）、挿入／欠失、および構造変異をより良好に捕捉するため、および改善されたゲノム識別のために、より長いＤＮＡ分子をシークエンシングすることの重要性が増している。

【発明の概要】

【0003】

概要
本明細書に記載されるいくつかの態様は、ＤＮＡ反応を実施するためのヒドロゲルビーズに関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ヒドロゲルポリマー前駆体、架橋剤、およびヒドロゲルビーズ内に配置されたＤＮＡを含む。ある態様において、該ビーズは、ＤＮＡを保持しつつ、ビーズからの反応剤の拡散を可能にする細孔を含む。ある態様において、ＤＮＡは５０，０００塩基対以上の長いＤＮＡ分子である。

【0004】

本明細書に記載のある態様は、ＤＮＡ配列決定を実施するためのフローセル装置に関する。ある態様において、フローセル装置は、固体支持体を含む。ある態様において、固体支持体は、そこに配置されたＤＮＡを封入する分解性ヒドロゲルを有する表面を含む。ある態様において、該分解性ヒドロゲルは、ヒドロゲルからの反応剤の拡散を可能にするが、ＤＮＡが通過するにはサイズが小さい細孔を含む。

【0005】

本明細書に記載されるいくつかの態様は、ＤＮＡ配列決定のためのシステムに関する。ある態様において、該システムは、フローセル装置を保持するように構成されたステージ、フローセル装置、およびシークエンシングデータを取得するための検出器を含む。

【0006】

本明細書に記載されるいくつかの態様は、ＤＮＡ配列決定法に関する。ある態様において、該方法は、本明細書に記載のＤＮＡを封入しているビーズを得ることを含む。ある態様において、該方法は、本明細書に記載のフローセル装置を提供することを含む。ある態様において、該方法は、ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡを増幅させること、ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡにタグメンテーションを実施すること、またはＤＮＡを配列決定することをさらに含む。ある態様において、該方法は、ヒドロゲル内に封入されたＤＮＡライブラリーを生成することをさらに含む。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1A】図１Ａは、フローセル上のライブラリー作製およびシーディングによる、長いＤＮＡの空間インデックス付けの１態様を示す概略図である。

【図1B】図１Ｂは、長いＤＮＡ分子を封入しているヒドロゲルビーズを用いた空間インデックス付けを示す概略図である。反応剤をヒドロゲルビーズに用いて、フローセル表面上にライブラリーを空間的に産生することができる。

【図2】図２は、ヒドロゲルビーズ内に長いＤＮＡを封入し、該ヒドロゲルビーズ内でライブラリーを作製し、それをフローセル装置上でクラスター化および配列決定することができる方法を示すフローチャートである。

【図3】図３は、約１００ｋｂのＤＮＡ断片（多重置換増幅（ＭＤＡ）工程を含まない（パネル（ａ））か、またはタグメンテーションの前にＭＤＡ工程を含む（パネル（ｂ）））および約１０－２０ｋｂのＤＮＡ断片（パネル（ｃ））を含む、ヒドロゲルビーズ内に封入された長いＤＮＡのＤＮＡ配列決定のワークフローを示す概略図である。

【図4】図４は、ＭＤＡを含まない１００ｋｂのＤＮＡ断片からの長いＤＮＡヒドロゲル空間インデックス付け配列決定データのストローブリード（strobed read）を示すグラフである。

【図5】図５は、ＭＤＡを含む１００ｋｂのＤＮＡ断片の長いＤＮＡヒドロゲル空間インデックス付けのロングリード（linked read）の線グラフを示す。

【図6】図６は、ＭＤＡを含む１０ｋｂのＤＮＡ断片の長いＤＮＡヒドロゲル空間インデックス付けのロングリードの線グラフを示す。

【0008】

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、ヒドロゲルビーズ内に封入された長いＤＮＡの空間的リード（spatial read）の線グラフを示す。図７Ａは、ヒドロゲルビーズ内に封入された細胞の空間的リードを示し、挿入図は、ヒドロゲルビーズ内の細胞を示す顕微鏡写真である。図７Ｂは、ヒドロゲルビーズ内に封入された長いＤＮＡ断片の空間的リードを示し、挿入図は、該ビーズ内に封入された該断片を示す顕微鏡写真である。

【図8】図８は、ヒドロゲルビーズ内に封入された微生物種の同定を示す顕微鏡写真を示す。ヒドロゲルビーズは種々の微生物種を封入し、空間的シークエンシングリードを実施して、該微生物種を同定した。

【図9】図９は、ヒドロゲルビーズ内に封入されている長いＤＮＡのバーコードリードの分布を示すグラフを示す。

【図10】図１０Ａは、ヒドロゲルビーズ内に封入された大腸菌細胞の単回ランからのショートリードおよびロングリードを示すグラフを示す。図に示すように、ロングリードはリピート領域に跨っており、新しい（de novo）配列アセンブリを改善できる。図１０Ｂは、空間的なロングリードおよび間質性ショートリードを示す顕微鏡写真を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

詳細な説明
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面中、同様の記号は、一般的に、これと異なる記載がない限り、同様の成分を示している。詳細な説明、図面および特許請求の範囲に記載される例示的態様は、限定することを意図していない。本明細書に記載される主題の精神または範囲を逸脱することなく、他の態様を利用すること、および他の変更を加えることが可能である。本明細書に一般的に記載され、図面に示される本開示の側面は、多種多様な異なる構成での配置、置き換え、組み合わせ、分離、および設計が可能であることは容易に理解され、それらの全てが本明細書で明示的に企図されている。

【0010】

複数の態様は、ビーズ中に長いＤＮＡ断片を封入させて、ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を決定するための、組成物、システムおよび方法に関する。これにより、以下に記載するように、比較的長いＤＮＡ断片を配列決定する信頼できるハイスループットな方法を創出できる。本明細書に記載の方法およびシステムは、改良された配列決定およびゲノムＤＮＡの識別定を可能にする単一ビーズ内に封入された長いＤＮＡ断片の配列決定に関する。ある態様において、この方法は、ヒドロゲルビーズ内にＤＮＡ断片のサンプルを封入すること、ＤＮＡ断片のサンプルを封入しているヒドロゲルビーズをフローセル装置上にローディングすること、ライブラリーを作製すること、作製したライブラリーをフローセル装置の表面上にリリースすること、およびリリースされたライブラリーをクラスター化および配列決定することを含む。

【0011】

ある態様において、ライブラリー作製は、封入されたＤＮＡのタグメンテーションを含む。封入されたＤＮＡのタグメンテーションは、長いＤＮＡ配列を短いタグメンテーションフラグメントに切断して、それを用いてフローセルの表面上にＤＮＡクラスターを作製する。クラスターは、長いＤＮＡのタグメンテーションフラグメントの産物であり、各々が、例えば、ＳＢＳシークエンシングを用いて配列決定され得る。単一の長いＤＮＡ分子からのクラスター群は、本明細書中、長いＤＮＡアイランド（island）と呼ばれる。ある態様において、単一のヒドロゲルビーズは、単一の長いＤＮＡ分子または複数の長いＤＮＡ分子を封入し得る。各長いＤＮＡ分子は、単一の長いＤＮＡアイランドを産生する。単一のヒドロゲルビーズ内の全ての長いＤＮＡアイランドのクラスターは、本明細書中、クラスタークラウドと呼ばれる。従って、クラスタークラウドは、単一のヒドロゲルビーズ内の全てのクラスターを表し、多くの長いＤＮＡアイランド（長いＤＮＡアイランドのそれぞれが単一の長いＤＮＡ分子を表す）を含んでいてよく、各長いＤＮＡアイランドは、複数のクラスターを含む。

【0012】

ビーズは、長いＤＮＡ分子または長いＤＮＡ分子を含む供給源の存在下で混合されて、該ＤＮＡ分子を封入しているヒドロゲルビーズを形成する、ヒドロゲルポリマーおよび架橋剤を含み得る。ある態様において、長いＤＮＡ供給源は細胞である。ヒドロゲルビーズは、ビーズ内に長いＤＮＡを保持しつつ、ヒドロゲルビーズからの反応剤の拡散を可能にし、それにより各ビーズ内で反応が起こるのを可能にする細孔を含み得る。

【0013】

ある態様は、長いＤＮＡを封入しているビーズを用いて核酸反応を起こす方法、例えば、長いＤＮＡ分子のハイスループット空間インデックス付けを含む方法を含む。図１Ａに示すように、長いＤＮＡ分子からのライブラリー作製は、表面上の“クラスターパッチ（cluster patch）”としての単一の長いＤＮＡ分子からの複数のクラスターをクラスタリングおよびシーディングすることにより容易に調製することができ、次いで読み出し、空間的にマッピングすることができる。本明細書で用いる用語“長いＤＮＡ”は、３００塩基対より長いＤＮＡ断片を含んでいてよい。本明細書で用いる、長いＤＮＡ断片は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００ｋｂ以上などの１ｋｂ、２．５ｋｂ、５ｋｂ以上の長さのＤＮＡを意味し、上記の数値のいずれか２つで定義される範囲内の長さが含まれる。

【0014】

理論は別にして、本明細書に記載の方法、システムおよび組成物は、現在のライブラリー作製技術と比べて幾つかの利点が挙げられる。例えば、ある態様において、この方法は、単一ビーズを用いてサンプル調製を可能とし、ゲノムサンプルを一連の長いＤＮＡフラグメントに断片化することが可能である。次に、その単一ビーズを、長いＤＮＡ断片が各々、フローセル表面上で互いに隣接して配置されるように該長いＤＮＡ断片を配するフローセル上の１つの特定の位置に付着させることができる。次いで、システムは、各長いＤＮＡ断片からヌクレオチド配列を決定する。それらはフローセル表面で互いに隣接しているため、システムは、この空間位置データを用いて、元のゲノムＤＮＡの最終配列をより効率的に再構築することができる。システムは、単一細胞、長いＤＮＡ断片または染色体から直接空間的に同じ位置に配置されたリードを沈積（deposit）させることができる。ある態様において、この方法は、ライブラリー作製のための入力を減らし、ＰＣＲなしの手順を可能にする。ある態様において、この方法は、分子バーコード化の必要なく実施され得る。ある態様において、この方法は、簡素化された手順の自動化を可能にする。ある態様において、この方法は、種々の核酸アッセイおよび手順に適合する。

【0015】

ある態様は、長いＤＮＡを封入するヒドロゲルビーズを調製する方法に関する。ある態様において、長いＤＮＡを封入しているヒドロゲルビーズを用いて、細胞ゲノムを処理して、ビーズ内でＤＮＡライブラリー作製を実施するのを可能し得る。ある態様において、長いＤＮＡ断片を封入しているヒドロゲルビーズは、単一の細胞を包含し、それを用いて、細胞ゲノムＤＮＡを処理し、ビーズ内での全長ＤＮＡライブラリー作製を行うことを可能にする。

【0016】

ある態様において、ヒドロゲルビーズの細孔サイズは、長いＤＮＡ断片および作製されたＤＮＡライブラリーが処理中にヒドロゲルビーズ内に保持され得るように、長い核酸（＞３００ｂｐｓ）を保持しつつ、酵素、化合物および小さいサイズのプライマー（＜５０ｂｐ）の拡散を可能にするように、操作され得る。ある態様において、特定のプライマーをヒドロゲルビーズマトリックス内で化学的に連結して、特定のゲノムＤＮＡをハイブリダイズおよび処理することができる。次いで、単一細胞からのＤＮＡライブラリーは、特定の領域に、例えば、ライブラリーシーディングのためにフローセル表面上に放出され得る。その後、これにより、封入された長いＤＮＡ断片に由来するフローセル上の“ＤＮＡクラスター”の空間分布が得られ、後処理中のリードアライメントが簡素化される。

【0017】

本明細書で用いる用語“反応剤”は、反応、相互作用、希釈、またはサンプルへの添加に有用な１つの反応材または２以上の反応材の混合物を記載し、例えば緩衝液、化合物、酵素、ポリメラーゼ、５０塩基対未満のサイズを有するプライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、またはヌクレアーゼを含む、核酸反応に用いられる反応材を含み得る。ある態様において、反応剤としては、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液または二価カチオンが挙げられる。

【0018】

遺伝物質を封入しているヒドロゲルビーズ
一態様は、ヒドロゲルポリマーおよび遺伝物質を含むビーズを含む。本明細書で用いる用語“ヒドロゲル”は、有機ポリマー(天然または合成）が共有結合、イオン結合、または水素結合により架橋されて、水分子を閉じ込めてゲルを形成する、３次元の開放格子構造を形成するときに形成される物質を意味する。ある態様において、ヒドロゲルは、生体適合性ヒドロゲルであり得る。本明細書で用いる用語“生体適合性ヒドロゲル”は、生細胞に毒性がなく、閉じ込められた細胞への酸素および栄養素の十分な拡散を可能にして生存率を維持するゲルを形成するポリマーを意味する。ある態様において、ヒドロゲルポリマーは、６０－９０％の液体、例えば水、および１０－３０％のポリマーを含む。ある態様において、ヒドロゲルの含水量は約７０－８０％である。

【0019】

ヒドロゲルは、親水性バイオポリマーまたは合成ポリマーを架橋することにより調製され得る。従って、ある態様において、ヒドロゲルは、架橋剤を含んでいてよい。本明細書で用いる用語“架橋剤”は、適切なベースモノマーと反応したときに３次元ネットワークを形成できる分子を意味する。１以上の架橋剤を含んでよいヒドロゲルポリマーの例としては、ヒアルロン酸、キトサン、寒天、ヘパリン、硫酸、セルロース、アルギネート（硫酸化アルギン酸（alginate sulfate）を含む)、コラーゲン、デキストラン（デキストラン硫酸塩を含む）、ペクチン、カラギーナン、ポリリシン、ゼラチン（ゼラチンタイプＡを含む）、アガロース、（メタ）アクリレート－オリゴラクチド－ＰＥＯ－オリゴラクチド－（メタ）アクリレート、ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯコポリマー（Pluronics）、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（メタアクリレート）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ＰＬ（Ｇ）Ａ－ＰＥＯ－ＰＬ（Ｇ）Ａコポリマー、ポリ（エチレンイミン）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール、ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル）シスタミン、ＰＥＧ、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリアクリル酸、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（メタクリル酸メチル）（ＰＭＭＡ）、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルスルホン酸）（ＰＶＳＡ）、ポリ（Ｌ－アスパラギン酸）、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、ジアリルアミン、トリアリルアミン、ジビニルスルホン、ジエチレングリコール ジアリルエーテル、エチレングリコールジアクリレート、ポリメチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート、エトキシ化トリメチロールトリアクリレート、またはエトキシ化ペンタエリトリトールテトラアクリレート、あるいはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。従って、例えば、組合せは、ポリマーおよび架橋剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－チオール／ＰＥＧ－アクリレート、アクリルアミド／Ｎ,Ｎ’－ビス（アクリロイル)シスタミン（ＢＡＣｙ）、またはＰＥＧ／ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）を含み得る。

【0020】

ある態様において、架橋剤は、ヒドロゲルポリマー中でジスルフィド結合を形成し、それによってヒドロゲルポリマーを連結する。ある態様において、ヒドロゲルポリマーは、細孔を有するヒドロゲルマトリックス（例えば、多孔性ヒドロゲルマトリックス）を形成する。これらの細孔は、ヒドロゲルビーズ内に十分大きな遺伝物質、例えば長いＤＮＡ断片を保持することができるが、反応剤などの小さな物質が該細孔を通過し、それによりヒドロゲルビーズへの出入りを可能にする。ある態様において、ポリマーの濃度と架橋剤の濃度の比を変えることにより、細孔を微調整する。ある態様において、ポリマーと架橋剤の比は、３０：１、２５：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、または１：３０であるか、あるいは上記の比率のいずれか２つによって定義される範囲内の比率である。ある態様において、ＤＮＡプライマーまたは荷電化学材のような更なる官能材をポリマーマトリックスに移植して、多様な適用の要請を満たすことができる。

【0021】

本明細書で用いる用語“多孔率”は、開口スペース、例えば開口孔または他の開口部で構成されているヒドロゲルの体積率（fractional volume (dimension-less)）を意味する。従って、多孔率は、材料内の空隙を測定し、０から１００％の間の割合として、全体積に対する空隙の体積の割合である（または０から１の間）。ヒドロゲルの多孔率は、０．５から０．９９の範囲、約０．７５から約０．９９の範囲、または約０．８から約０．９５の範囲であり得る。

【0022】

ヒドロゲルは、任意の細孔径を有し得る。本明細書で用いる用語“細孔サイズ”は、孔の断面の直径または有効径を意味する。用語“細孔サイズ”はまた、複数の孔の測定値に基づく、細孔の断面の平均直径または平均有効直径を意味し得る。円形ではない断面の有効直径は、非円形断面と同じ断面積を有する円形断面の直径に等しい。ある態様において、ヒドロゲルが水和されると、ヒドロゲルが膨潤され得る。次いで、細孔のサイズは、ヒドロゲルの含水量に応じて変化し得る。ある態様において、ヒドロゲルの孔は、ヒドロゲル内に遺伝物質を保持するが反応剤は通過させるのに十分なサイズの細孔を有し得る。

【0023】

ある態様において、架橋剤は可逆性架橋剤である。ある態様において、可逆性架橋剤は、ヒドロゲルポリマーを可逆的に架橋することができ、切断剤（cleaver）の存在下で架橋を切断することができる。ある態様において、架橋剤は、還元剤の存在により、高温により、または電場により切断され得る。ある態様において、可逆性架橋剤は、Ｎ，Ｎ’－ビス（アクリロイル)シスタミン、ポリアクリルアミドゲルの可逆性架橋剤であり得、適切な還元剤の存在下でジスルフィド結合が破壊され得る。ある態様において、架橋剤と還元剤の接触は、架橋剤のジスルフィド結合を切断し、ヒドロゲルビーズを分解する。ヒドロゲルビーズは分解し、その中に保持された核酸などの内容物を放出する。ある態様において、架橋剤は、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００℃を超えるまで温度を上昇させることにより切断される。ある態様において、架橋剤は、ヒドロゲルビーズを還元剤と接触させることにより切断される。ある態様において、還元剤としては、ホスフィン化合物、水溶性ホスフィン、窒素含有ホフィンならびにその塩および誘導体、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（２，３－ジヒドロキシ－１，４－ジチオールブタンのそれぞれシスおよびトランス異性体)、２－メルカプトエタノールまたはβ－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２－メルカプトエタノールまたはアミノエタンチオール、グルタチオン、チオグリコール酸またはチオグリコール酸、２，３－ジメルカプトプロパノール、トリス（２－カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、またはＰ－［トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン］プロピオン酸（ＴＨＰＰ）が挙げられる。

【0024】

ある態様において、温度を上げて拡散を増やすかまたは架橋剤を分解する還元剤と接触させることにより、ヒドロゲルビーズから封入された遺伝物質を放出させる。

【0025】

ある態様において、架橋剤の架橋形成は、ヒドロゲルビーズ内に複数の細孔を確立する。ある態様において、ヒドロゲルビーズにおける該細孔のサイズは調節可能であり、遺伝物質、例えば約５０００塩基対以上のＤＮＡ断片を封入するが、より小さな粒子、例えば反応剤、または約５０塩基対未満の小さいサイズの核酸、例えばプライマーが細孔を通過するのを可能にするように整形される（図１Ｂに示す）。ある態様において、反応剤には、遺伝物質を処理するための反応剤、例えば、核酸を細胞から単離するための反応剤、核酸を増幅、バーコード化または配列決定するための反応剤、あるいは核酸ライブラリーを製造するための反応剤が含まれる。ある態様において、反応剤は、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝剤、または二価のカチオンを含む。

【0026】

ある態様において、長いＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ウイルス核酸、細菌核酸、または哺乳動物核酸を含む。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、長いＤＮＡの供給源、例えば細胞を含む。ある態様において、細胞は、原核細胞または真核細胞を含む単一細胞である。ある態様において、細胞は哺乳動物細胞である。ある態様において、細胞はヒト細胞である。ある態様において、細胞は細菌細胞である。従って、図７Ａおよび７Ｂに示すように、この方法は、いずれかまたは両方がヒドロゲルビーズで封入されている、長いＤＮＡ断片または細胞上で行われてもよい。

【0027】

ビーズの作製方法
本明細書で提供されるいくつかの態様は、長いＤＮＡ断片を封入するビーズを作製する方法に関する。ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ボルテックス（vortex）攪拌処理によるエマルジョンにより調製される。本明細書で用いる、ボルテックス攪拌処理によるエマルジョンとは、チューブ、バイアルまたは反応容器などの容器内でヒドロゲルポリマーを長いＤＮＡ断片または長いＤＮＡ断片の供給源と共にボルテックスすることを意味する。複数の成分が、たとえば手動または機械的なボルテックスまたは振とうによって混合され得る。ある態様において、手動混合により、直径２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｍのサイズ、あるいは該値のいずれか２つで定義される範囲内のサイズを有する遺伝物質を封入するヒドロゲルビーズが得られる。ある態様において、ビーズのサイズは不均一であり、それ故に、ビーズのサイズには種々の直径のビーズが含まれる。

【0028】

ある態様において、ビーズは、マイクロ流体による液滴形成により調製される。図１Ｂに示すように、マイクロ流体による液滴生成には、ゲルエマルジョン生成を補助するためのマイクロ流体デバイスの使用が含まれる。ある態様において、マイクロ流体デバイスは、所望のサイズのヒドロゲルビーズを形成するように構成され、ビーズごとに選択された量の遺伝物質を封入するように構成されたマイクロチャネルを含む。ある態様において、マイクロ流体デバイスは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μｍの高さ、あるいは該値のいずれか２つによって定義される範囲内の高さを有する。ある態様において、マイクロ流体デバイスは、１以上のチャネルを含む。ある態様において、マイクロ流体デバイスは、水溶液流用のチャネルおよび非混和流体用のチャネルを含む。ある態様において、１以上のチャネルの幅は同一である。ある態様において、１以上のチャネルの幅は異なる。ある態様において、１以上のチャネルの幅は、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０μｍであるか、または該値のいずれか２つによって定義される範囲内の幅である。ある態様において、水溶液チャネルの幅は７５μｍである。ある態様において、不混和流体チャネルの幅は７８μｍである。当業者は、ビーズのサイズを微調整するために幅を変えることができることを認識し得る。マイクロ流体デバイスのサイズおよびチャネルの幅に加えて、水溶液チャネルおよび不混和流体チャネルの流速もヒドロゲルビーズのサイズに影響を与える可能性がある。

【0029】

ある態様において、水溶液チャネルにおける溶液の流速は、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μＬ／分であるか、あるいは前記値のいずれか２つにより定義される範囲内の流速である。ある態様において、不混和流体チャネルにおける不混和流体の流速は、２０、３０、５０、８０、１００、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５または４００μＬ／分であるか、あるいは前記値のいずれか２つにより定義される範囲内の流速である。ある態様において、水相中の溶液はヒドロゲルポリマー、架橋剤および遺伝物質を含み、水溶液チャネルを通過して不混和流体、例えば担体オイルに、不混和流体の流速よりも遅い流速で流れ込み、それにより液滴を形成する。ある態様において、不混和流体は、鉱油、炭化水素油、シリコン油またはポリジメチルシロキサン油、あるいはそれらの混合物などのオイルである。ある態様において、遺伝物質を含むヒドロゲル液滴は、均一なサイズ分布で製剤される。ある態様において、ヒドロゲルビーズのサイズは、マイクロ流体デバイスのサイズ、１以上のチャネルのサイズ、あるいは水溶液または不混和流体のいずれかまたは両方の流速を調整することにより微調整される。ある態様において、得られるヒドロゲルビーズは、２から１５０μｍの範囲、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０または１５０μｍ、あるいは前記値のいずれか２つにより定義される範囲内の直径を有する。

【0030】

ある態様において、遺伝物質を封入しているヒドロゲルビーズのサイズおよび均一性は、ビーズ形成前にヒドロゲルポリマーを、イソプロピルアルコールを含むアルコールなどの流体改質剤と接触させることにより、さらに制御することができる。

【0031】

ある態様において、ビーズ内に封入された長いＤＮＡ断片の量は、投入（inputted）サンプル内の長いＤＮＡ断片を希釈または濃縮することにより制御できる。長いＤＮＡ断片を含むサンプルは、ヒドロゲルポリマーと共に混合され、該長いＤＮＡ断片を含むヒドロゲルポリマーは、本明細書に記載の、ボルテックス攪拌エマルジョンまたはマイクロ流体滴生成に付される。

【0032】

ある態様において、ヒドロゲルビーズは、ヌクレオチドで官能化(functionalize)されている。ある態様において、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリＴヌクレオチドである。ある態様において、ヌクレオチドは、ヒドロゲルビーズに結合され、官能化されたビーズは、目的のヌクレオチドの標的化された捕捉に用いられ得る。

【0033】

ヒドロゲルビーズ内の長いＤＮＡ断片の処理方法
いくつかの態様は、ヒドロゲルビーズにおいて長いＤＮＡ分子を調製および処理するためのフロー図を示す図２に示されるように、ビーズ内で長いＤＮＡ断片を処理する方法を含む。第一工程において、例えばゲノムデータまたは細胞由来のＤＮＡサンプルを、ヒドロゲルビーズ内に封入する。ある態様において、長いＤＮＡ断片は、ヒドロゲルビーズ内に保持され、反応剤はヒドロゲルビーズの細孔を通過できる。ある態様において、反応剤としては、溶解剤、核酸精製剤、タグメンテーション剤、ＰＣＲ反応剤、または遺伝物質の処理に用いられる他の反応剤が挙げられ得る。従って、ヒドロゲルビーズは、反応剤に対するバリアをヒドロゲルビーズの内外に通過可能にする一方で、長いＤＮＡ断片をビーズ内に保持する、ヒドロゲルビーズ内の長いＤＮＡ断片の制御された反応のための微小環境を提供する。ＤＮＡがビーズ内に封入されると、該プロセスは、サンプルをフローセルにロードして、ライブラリー作製プロセスで長いＤＮＡ断片を作製できる次の段階に進む。

【0034】

本明細書で用いる用語“タグメンテーション”は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと結合されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソームによるＤＮＡの修飾を意味する。タグメンテーションの結果、ＤＮＡの断片化および二本鎖フラグメントの両鎖の５’末端へのアダプターのライゲーションが同時に起こる。トランスポザーゼ酵素を除去するための精製工程の後、さらなる配列が、例えば、ＰＣＲ、ライゲーション、または当業者に知られている何らかの他の好適な方法により、適合断片の末端に付加され得る

【0035】

ある態様において、全体のＤＮＡライブラリー作製は、ヒドロゲルマトリックス内にｇＤＮＡおよびそのライブラリー産物を保持しながら、多孔質を通してヒドロゲルを通過させることにより、複数の反応剤交換と共に、フローセルに結合されたヒドロゲルビーズの内部でシームレスに行うことができる。ヒドロゲルは、様々な生化学反応をサポートするために９５℃までの高温に数時間耐えることができる。

【0036】

プロセスの次のステップでは、前記ライブラリー作製からの長いＤＮＡ断片を封入したヒドロゲルビーズを処理して、該ビーズから長いＤＮＡ断片を放出、精製および分離する。したがって、例えば、ヒドロゲルビーズを溶解緩衝液と接触させる。本明細書で用いる“溶解”とは、細胞ＲＮＡまたはＤＮＡへのアクセスまたは放出を促進する細胞壁またはウイルス粒子の崩壊（perturbation）または変化を意味する。細胞壁の完全な破壊も分解も、溶解に不可欠な要件ではない。用語“溶解緩衝液”とは、少なくとも１つの溶解剤を含む緩衝液を意味する。一般的な酵素溶解剤には、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼＫ、プロテイナーゼＥ、ならびにウイルスエンドリシンおよびエキソリシンが含まれるが、これらに限定されない。従って、例えば、ビーズ中の細胞の溶解は、リゾチームおよびプロテイナーゼＫなどの溶解剤をヒドロゲルビーズ内に導入することにより、行うことができる。ここで、細胞からのｇＤＮＡは、ビーズ内に含まれる。ある態様において、溶解処理後、単離された核酸は、ヒドロゲルビーズ内に保持され、さらなる処理に用いられ得る。

【0037】

本明細書で用いる用語“単離された（isolated）”、“単離する（to isolate）”、“単離（isolation）”、“精製された（purified）”、“精製する（to purify）”、“精製（purification）”ならびに文法的に等価な用語は、本明細書で用いられるとき、他にこれと異なる記載がされない限り、そこから物質が単離される、サンプルまたは供給源（例えば、細胞）からの少なくとも１つの汚染物質（例えばタンパク質および／または核酸配列）の量の減少を意味する。従って、精製の結果、“富化”、例えば、サンプル中の所望のタンパク質および／または核酸配列の量の増加がもたらされる。

【0038】

ある態様において、封入された核酸は、ヒドロゲルビーズ内で完全にまたは一部分配列決定される。封入された核酸は、何らかの好適な配列決定法、例えば、合成による配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポアシークエンシングなどを含む直接的配列決定により配列決定され得る。

【0039】

本明細書で提供されるいくつかの態様は、長いＤＮＡ断片に対して有効な１塩基合成（sequencing-by-synthesis (SBS)）法に関する。ＳＢＳにおいて、核酸鋳型（例えば、ターゲット核酸またはそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長が、鋳型内のヌクレオチドの配列を決定するためにモニターされる。基礎となる化学プロセスは、ポリマー化であり得る（例えば、ポリメラーゼ酵素により触媒される）。特定のポリメラーゼベースのＳＢＳ態様において、蛍光標識されたヌクレオチドが、プライマーに追加されたヌクレオチドの順序とタイプの検出を用いて、該鋳型の配列を決定できるように、鋳型に依存する方法でプライマーに付加される（それにより、プライマーを延長する）。

【0040】

１以上の増幅され封入された核酸を、サイクルでの反応剤の反復送達を伴う、ＳＢＳまたは他の検出技術に供することができる。例えば、最初のＳＢＳサイクルを開始するために、１以上の標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１以上の増幅された核酸分子を含むヒドロゲルビーズに／を通して流すことができる。プライマーの伸長により標識ヌクレオチドが取り込まれる部位を検出することができる。要すれば、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに添加されると、さらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含み得る。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類縁体を、その部分を除去するために脱ブロッキング剤が送達されるまで後続の伸長が生じないように、プライマーに付加することができる。従って、可逆的終結を用いる態様では、脱ブロッキング剤がフローセルに送達され得る（検出を行う前後に）。種々の送達工程間で洗浄が行われ得る。次いで、サイクルをｎ回繰り返して、プライマーをｎヌクレオチド伸長し、それにより長さｎの配列を検出することができる。本発明の方法により生成されるアンプリコンでの使用に容易に適合させることができる例示的なＳＢＳ法、流体システムおよび検出プラットフォームは、例えば、Bentleyらの、Nature 456:53-59 (2008)、ＷＯ０４/０１８４９７；米国特許第７，０５７，０２６号；ＷＯ９１/０６６７８；ＷＯ０７/１２３７４４；米国特許第７，３２９，４９２号；米国特許第７，２１１，４１４号；米国特許第７，３１５，０１９号；米国特許第７，４０５，２８１号、およびＵＳ２００８/０１０８０８２（各文献は引用により本明細書中に包含される）に記載されている。

【0041】

パイロシークエンス法などの循環式反応を用いる他の配列決定法を用いることができる。パイロシークエンス法は、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に組み込まれているため、無機ピロホスフェート（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998);米国特許第６，２１０，８９１号;米国特許第６，２５８，５６８号および米国特許第６，２７４，３２０号、各文献は引用により本明細書中に包含される）。パイロシークエンス法において、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に直ちに変換されることにより検出され得て、精製されたＡＴＰのレベルは、ルシフェラーゼにより生成されたフォトン（光子）により検出され得る。従って、配列決定反応は、発光検出システムによりモニターできる。蛍光ベースの検出システムに用いられる励起放射線源は、パイロシークエンス法には必要ない。本明細書の記載に従って生成されたアンプリコンへのパイロシークエンスの適用に適合させることができる有用な流体システム、検出器および手順は、例えば、ＷＩＰＯ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１、ＵＳ ２００５／０１９１６９８ Ａ１、米国特許第７，５９５，８８３号、および米国特許第７，２４４，５５９号(各文献は引用により本明細書中に包含される）に記載されている。

【0042】

いくつかの態様は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法に有用であり得る。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォアを担持するポリメラーゼとγ－リン酸標識ヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用により、またはゼロモード導波路（zero mode waveguides (ZMW)）を用いて検出できる。ＦＲＥＴベースの配列決定のための技術および反応剤は、例えば、Leveneらの、Science 299, 682-686 (2003); Lundquistらの、Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlachらの、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)（これらの文献の開示内容は引用により本明細書中に包含される）に記載されている。

【0043】

いくつかのＳＢＳの態様には、伸長産物へのヌクレオチドの取り込みの際に放出される陽子（プロトン）の検出が含まれる。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定では、市販の電気検出器（electrical detector）および関連技術を用いることができる。そのような配列決定システムの例は、パイロシークエンシング（例えば、Rocheの子会社である454 Life Sciencesから市販のプラットフォーム）、γ-リン酸標識ヌクレオチドを用いるシークエンシング（例えば、Pacific Biosciencesから市販のプラットフォーム）およびプロトン検出を用いるシークエンシング（例えば、Life Technologiesの子会社であるIon Torrentから市販のプラットフォーム）、あるいはＵＳ ２００９／００２６０８２ Ａ１；ＵＳ ２００９／０１２７５８９ Ａ１；ＵＳ ２０１０／０１３７１４３ Ａ１；またはＵＳ ２０１０／０２８２６１７ Ａ１（各文献は、引用により本明細書中に包含される）に記載されているシークエンス法およびシステムである。動的排除(kinetic exclusion)を用いて標的核酸を増幅するための本明細書に記載の方法は、プロトンの検出に用いられる基質に容易に適用することができる。より具体的には、本明細書に記載の方法を用いて、プロトンを検出するために用いられるアンプリコンのクローン集団を生成することができる。

【0044】

別の配列決定技術は、ナノポアシークエンシングである（例えば、Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003)を参照のこと。それらの開示内容は引用により本明細書中に包含される）。いくつかのナノポアの態様において、標的核酸または標的核酸から除去された個々のヌクレオチドは、ナノポアを通過する。核酸またはヌクレオチドがナノポアを通過すると、孔の電気伝導度の変動を測定することにより、各ヌクレオチドタイプを特定できる（米国特許第７，００１，７９２号；Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)(それらの開示内容は引用により本明細書中に包含される）。

【0045】

本明細書に記載の検出に適用することができるアレイベースの発現および遺伝子型分析の例示的な方法は、米国特許第７，５８２，４２０号；同第６，８９０，７４１号；同第６，９１３，８８４号または同第６，３５５，４３１号あるいは米国特許出願２００５/００５３９８０ Ａ１； ２００９/０１８６３４９ Ａ１またはＵＳ ２００５/０１８１４４０ Ａ１（それぞれ引用により本明細書中に包含される）に記載されている。

【0046】

本明細書に記載の、核酸を単離、増幅および配列決定する方法において、種々の反応剤が核酸の単離および生成のために用いられる。かかる反応剤としては、例えば、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液または二価のカチオン類が挙げられ得る。これらの反応剤はヒドロゲルビーズの細孔を通過するが、一方で、遺伝物質はヒドロゲルビーズ内に保持される。本明細書に記載の方法の利点は、ヒドロゲルビーズ内の核酸の処理のために封入された微小環境を提供することである。これは、標的核酸の迅速かつ効率的な単一細胞処理を可能にする。

【0047】

アダプターには、シークエンシングプライマー部位、増幅プライマー部位、および複数のインデックス配列（indexes）が含まれ得る。本明細書で用いる“インデックス配列（index）”は、分子識別子および／またはバーコードとして核酸をタグ付けするために、および／または核酸の供給源を同定するために用いられ得る、ヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、インデックス配列を用いて単一の核酸、または核酸の亜集団を特定することができる。ある態様において、核酸ライブラリーは、ヒドロゲルビーズ内で調製され得る。ある態様において、ヒドロゲルビーズ内に封入された単一細胞は、例えば、連続性保存転位（CPTSeq）法を用いて、単一細胞のコンビナトリアルインデックス付けに用いられてもよい。ある態様において、単一細胞由来のＤＮＡは、ＷＧＡ増幅後に複数の単一細胞を、バーコード化されたトランスポゾンを担持し、それを還元剤と接触させることによりゲルマトリックスが溶解される、例えばバーコード化するためのゲノムＤＮＡを放出する別のビーズと共に封入することによりバーコード化され得る。

【0048】

本明細書に記載の“空間インデックス付け”法および技術の態様は、データ分析を短縮化し、複数の単一細胞および長いＤＮＡ分子からのライブラリー作製のプロセスを簡易化する。単一細胞シークエンシングのための既存のプロトコルは、細胞を効率的に物理的に分離し、単離された各細胞を一意的にバーコード化し、すべてをプールしつつ配列決定を行う必要がある。合成された長い読み出しのための現在の方法もまた、複雑なバーコード化工程を要し、各バーコード化されたフラグメントをプールしつつ配列決定を行い、データ分析を各バーコード化された細胞からの遺伝子情報が区別できるようにする必要がある。これらの長いプロセスの間、遺伝物質の損失もあり、それは配列の脱落を引き起こす。本明細書に記載の態様は、プロセスを短縮するのみならず、複数の単一細胞のデータ解像度の向上をもたらす。さらに、本明細書に記載の態様は、新しい生物のゲノムのアセンブリを単純化する。本明細書に記載の態様は、まれな遺伝子変異および突然変異の共起（co-occurrence）を明らかにするために用いられ得る。ある態様において、放出までヒドロゲルビーズに閉じ込められたＤＮＡライブラリーは、放出プロセスおよびヒドロゲル製造を制御することにより、表面に放出されるフラグメントのサイズを制御する機会を提供する。

【0049】

ある態様において、表面はフローセル装置である。ある態様において、フローセルは、ウェル、溝、またはパターンを有するカスタムフローセル装置である。ある態様において、フローセルは、パターン化表面を含む。ある態様において、パターン化表面は、ウェルを含む。ある態様において、ウェルは、約１０μｍから約５０μｍの直径、例えば１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、または５０μｍの直径、あるいは上記値のいずれか２つにより定義される範囲内の直径であり、かつ、約０．５μｍから約１μｍの深さ、例えば０．５μｍ、０．６μｍ、０．７μｍ、０．８μｍ、０．９μｍ、または１μｍの深さ、あるいは上記値のいずれか２つにより定義される範囲内の深さであるある態様において、該ウェルは、疎水性材料で構成される。ある態様において、疎水性材料としては、非晶質フルオロポリマー、例えばＣＹＴＯＰ、Ｆｌｕｏｒｏｐｅｌ（登録商標）、またはＴｅｆｌｏｎ（登録商標）が挙げられる。

【0050】

ある態様において、ライブラリーは、アダプター配列におけるプライマー部位を用いて増幅することができ、また、アダプター配列における配列決定プライマー部位を用いて配列決定することができる。ある態様において、アダプター配列は、核酸の供給源を識別するための指標を含み得る。後続の増幅工程の効率は、プライマーダイマーの形成により低下する可能性がある。後続の増幅工程の効率を高めるために、ライゲーション産物から非連結一本鎖アダプターを除去してよい。

【0051】

ヒドロゲルビーズを用いた核酸ライブラリーの作製
本明細書に記載のシステム、方法および組成物のいくつかの態様は、アダプターが標的核酸に連結されている方法を含む。アダプターには、配列決定プライマー結合部位、増幅プライマー結合部位、およびインデックスを含めることができる。例えば、アダプターは、Ｐ５配列、Ｐ７配列、またはそれらの相補体を含み得る。本明細書で用いる、Ｐ５配列は、配列番号１（ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ）で定義される配列を含み、Ｐ７配列は、配列番号２（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ）で定義される配列を含む。ある態様において、Ｐ５またはＰ７配列はさらに、スペーサーポリヌクレオチドを含んでいてよく、これは約１から２０ヌクレオチド長、例えば１から１５、または１から１０ヌクレオチド長、例えば２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド長である。ある態様において、スペーサーは、１０個のヌクレオチドを含む。ある態様において、スペーサーは、ポリＴスペーサー、例えば１０Ｔスペーサーである。スペーサーヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの５’末端に含まれていてよく、それは、ポリヌクレオチドの５’末端との結合により適当な支持体に結合され得る。結合は、ポリヌクレオチドの５’末端に存在するホスホロチオエートなどの硫黄含有求核反応剤により達成され得る。ある態様において、ポリヌクレオチドは、ポリＴスペーサーおよび５’ ホスホロチオエート基を含み得る。従って、ある態様において、Ｐ５配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡ－３’であり、ある態様において、Ｐ７配列は、５’ホスホロチオエート－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ－３’である。

【0052】

インデックスは、核酸分子の供給源を特定するのに有用であり得る。ある態様において、アダプターを改変して、例えば一方または両方の末端でアダプターの伸長を防ぐブロッキング基を付加することにより、コンカテマーの形成を防ぐことができる。３’ブロッキング基の例としては、３’－スペーサーＣ３、ジデオキシヌクレオチド、および基質への付着基が挙げられる。５’ブロッキング基の例としては、脱リン酸化５’ヌクレオチド、および基質への付着基が挙げられる。

【0053】

アダプターとしては、核酸、例えば一本鎖核酸が挙げられる。アダプターは、約５ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長未満、以上またはそれと等しい長さを有するか、あるいは上記サイズのいずれか２つに定義される範囲の長さの短い核酸を含み得る。ある態様において、アダプターは、ヒドロゲルビーズの孔を通過するのに十分小さいサイズである。標的核酸としてはＤＮＡ、例えばゲノムまたはｃＤＮＡ；ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、ｓＲＮＡまたはｒＲＮＡ；あるいは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドが挙げられる。核酸は、ヒドロゲルビーズ内に封入された単一細胞から単離され得る。核酸は、ホスホジエステル結合を含んでいてよく、例えばホスホラミド、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミダイトおよびペプチド核酸主鎖および結合を含む、他のタイプの主鎖を含んでいてよい。核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの任意の組合せ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニン、およびニトロピロール（３－ニトロピロールを含む）およびニトロインドール（５－ニトロインドールを含む）などの塩基類縁体を含む塩基の任意の組合せを含んでいてよい。ある態様において、核酸は、少なくとも１つの非特異的塩基（promiscuous base）を含み得る。非特異的塩基は、２以上の異なるタイプの塩基と塩基対形成することができ、例えば、ゲノムＤＮＡサンプルなどの複雑な核酸サンプルにおけるランダムハイブリダイゼーションに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーまたはインサートに含まれるとき、有用であり得る。非特異的塩基の例としては、アデニン、チミンまたはシトシンと対になり得るイノシンが挙げられる。他の例としては、ヒポキサンチン、５－ニトロインドール、アシル ５－ニトロインドール、４－ニトロピラゾール、４－ニトロイミダゾールおよび３－ニトロピロールが挙げられる。少なくとも２、３、４またはそれ以上の種類の塩基と塩基対を形成できる非特異的塩基を用いることができる。

【0054】

方法の一例としては、後続のライゲーション工程においてコンカテマーの形成を阻止するために標的核酸の５’末端を脱リン酸化すること；リガーゼを用いて、脱リン酸化された標的の３’末端に第１のアダプターを連結すること、ここで、第１のアダプターの３’末端はブロックされている；連結された標的の５’末端を再リン酸化すること；一本鎖リガーゼを用いて、脱リン酸化された標的の５’末端に第２のアダプターを連結させること、ここで、第２のアダプターの５’末端はリン酸化されていない、を含む。

【0055】

別の例としては、核酸を５’エキソヌクレアーゼで部分的に消化して、一本鎖３’オーバーハングと二本鎖核酸を形成することが挙げられる。３’ブロッキング基を含むアダプターは、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸の３’末端に連結され得る。連結されたアダプターを含む３’オーバーハングを有する二本鎖核酸を脱ハイブリダイゼーション（dehybridized）して、一本鎖核酸を形成することができる。リン酸化されていない ５’末端を含むアダプターは、一本鎖核酸の５’末端に連結され得る。

【0056】

核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸を脱リン酸化する方法としては、核酸をホスファターゼと接触させることが挙げられる。ホスファターゼの例としては、仔ウシ腸ホスファターゼ、エビアルカリホスファターゼ、アンタークティック・ホスファターゼ（antarctic phosphatase）、およびＡＰＥＸアルカリホスファターゼ（Epicentre）が挙げられる。

【0057】

核酸を連結する方法としては、核酸とリガーゼを接触させることが挙げられる。リガーゼの例としては、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＲｔｃＢリガーゼ、メタノバクテリウム属ＲＮＡリガーゼ、およびＴＳ２１２６ ＲＮＡリガーゼ（CIRCLIGASE）が挙げられる。

【0058】

核酸の５’ヌクレオチドなどの核酸をリン酸化する方法としては、核酸をキナーゼと接触させることが挙げられる。キナーゼの例としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼが挙げられる。

【0059】

本明細書に記載の態様は、核酸ライブラリーが単一の反応体積で調製されるように、ヒドロゲルビーズにおける該核酸ライブラリーの作製に関する。

【0060】

本明細書に記載のシステムおよび方法の態様には、遺伝物質を封入するヒドロゲルビーズを製造するための、ヒドロゲルポリマー、架橋剤または微小流体デバイスのいずれか１以上を含み、かつ細胞溶解ならびに核酸増幅および配列決定のための反応剤、あるいは本明細書に記載され、遺伝子物質のそれぞれの処理に用いられる、リゾチーム、プロテイナーゼＫ、ランダムヘキサマー、ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｕポリメラーゼ）、トランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５）、プライマー（例えば、Ｐ５およびＰ７アダプター配列）、リガーゼ、触媒酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、または二価カチオンを含む、核酸ライブラリー作製のための反応剤、を含む、遺伝物質を処理するのに有用な成分をさらに含む、キットが含まれる。

【実施例】

【0061】

実施例
実施例１－ヒドロゲルビーズの調製
この実施例は、マイクロ流体液滴発生器を用いて長いＤＮＡ断片を封入しているヒドロゲルビーズを調製する１つの態様を示す。

【0062】

液滴発生器を用いてヒドロゲルビーズを製造した。長いＤＮＡ断片を含むサンプルをポリマー前駆体と共に混合し、該混合物を、カートリッジ上のサンプルリザーバーに負荷した。２分以内に、長いＤＮＡを含む約５０，０００個のヒドロゲルビーズが各チャネルから作製された（８個の独立したサンプルに対する８チャネルを各カートリッジで処理する）。長いＤＮＡヒドロゲルビーズをフローセル上に負荷し、そこでヒドロゲルビーズをハンズフリーライブラリーの作製のために内部に固着させた（１００μｍの高さのチャネルおよび１２０μｍの直径のヒドロゲルビーズ）。Ｎｅｘｔｅｒａ酵素および反応剤をフローセルに接触させ、ヒドロゲルビーズ内に包埋された長いＤＮＡを接触させて、ライブラリーを形成した。その後、ライブラリーをフローセル上にシーディングした。ライブラリーシーディング中、ビーズ間の空隙を埋めるためにオイルを負荷し、ライブラリーの拡散を促進するためにフローセルを加熱した。オイルの存在下で、シーディングは、各ヒドロゲルビーズのフットプリントに近接して生じた（１２０μｍまでの直径のヒドロゲルビーズ、ライブラリーシーディングは、およそ１２０μｍ直径の領域に限定された）。

【0063】

長いＤＮＡ分子を負荷し、ヒドロゲルビーズ（直径約１２０μｍ）中に捕捉させ、ライブラリー作製を、ヒドロゲルビーズの内部に包埋されたこれらの長いＤＮＡ分子に直接実施した。その結果、特定の長いＤＮＡ分子からの全てのＤＮＡライブラリーは、同一のヒドロゲルビーズ内に保持された。次いで、ライブラリーをヒドロゲルビーズからフローセル表面上に放出させて、該フローセル表面上のグループとしてそれらをシーディングした。フローセル上の“クラスターパッチ”として、共にグループ化された長いＤＮＡ分子からクラスターを放出させた。単一の長いＤＮＡ分子からの単一のパッチを内部に有するクラスターは、高い精度およびより少ない足場ギャップを有するゲノムの再構築を簡易化する。

【0064】

実施例２－長いＤＮＡ空間インデックス
この実施例は、ＭＤＡを有する、または有しないヒドロゲルビーズ内に封入された１００ｋｂの長いＤＮＡ断片のストローブ・リードの１つの態様を示す。

【0065】

ヒドロゲルビーズを、約１００ｋｂのCorriell ゲノムＤＮＡの存在下でポリマーを混合し、微小液滴発生器を用いてヒドロゲルビーズを形成することにより調製した。ＤＮＡ断片を、封入している形成されたヒドロゲルビーズをフローセル装置上に配置して、フローセルを反応剤と接触させることにより、ＤＮＡに空間インデックス配列決定を行った。ビーズは分解され、フローセル装置上にクラスターが形成された。図５に示すように、長いＤＮＡアイランド当たりの平均クラスターは約３３であって、平均の長いＤＮＡアイランドのサイズは、６４０００塩基対であり、ビーズ当たり約４０５個の長いＤＮＡアイランドがあった。

【0066】

ヒドロゲルビーズの第２のセットを、約１００ｋｂのCorriell ゲノムＤＮＡの存在下でポリマーを混合し、微小液滴発生器を用いてヒドロゲルビーズを形成することにより調製した。ＤＮＡ断片を封入している形成されたヒドロゲルビーズをフローセル装置上に配置して、フローセルを反応剤と接触させることにより、ＤＮＡに空間インデックス配列決定を行った。ＭＤＡをタグメンテーション前に行った。ビーズは分解され、フローセル装置上にクラスターが形成された。図６に示すように、長いＤＮＡアイランド当たりの平均クラスターは約８５に増加し、平均の長いＤＮＡアイランドサイズは５８０００塩基対であって、ビーズ当たり約１６６の長いＤＮＡアイランドがあった。

【0067】

ヒドロゲルビーズの第３のセットを、約１０ｋｂのCorriell ゲノムＤＮＡの存在下でポリマーを混合し、微小液滴発生器を用いてヒドロゲルビーズを形成することにより調製した。ＤＮＡ断片を封入している形成されたヒドロゲルビーズをフローセル装置上に配置して、フローセルを反応剤と接触させることにより、空間インデックス配列決定を実施した。ＭＤＡをタグメンテーション前に行った。ビーズは分解され、フローセル装置上にクラスターが形成された。図７に示すように、長いＤＮＡアイランド当たりの平均クラスターは約５７であって、平均の長いＤＮＡアイランドサイズは１０４６１塩基対であって、ビーズ当たり約８５の長いＤＮＡアイランドがあった。

【0068】

実施例３－微生物種の複合混合物におけるメタゲノム
この実施例は、ヒドロゲル内に封入された単一細胞微生物を同定する１つの態様を示す。

【0069】

ヒドロゲルビーズを、微小液滴発生器を用いて本明細書に記載のとおりに調製した。ポリマー材を、Ｌ．ガセリ菌、黄色ブドウ球菌、セレウス菌、バクテロイデス属菌、アシネトバクター・バウマニー、Ａ群溶血性レンサ球菌、およびアクネス菌を含む多数の微生物を含むサンプルと混合した。その後、封入された細胞を溶解し、ライブラリー作製を行い、それにより、ヒドロゲルビーズが分解され、ライブラリーが表面上に沈積した。図９に示す通り、フローセル装置上でのその空間的な区画化により、各微生物を同定することが可能であった。従って、封入反応および後続の核酸反応により、ミニ－メタゲノムアッセイにおいてリード区画化を用いて複合混合物中の微生物種の菌株レベルの識別が可能となる。

【0070】

実施例４－フローセル空間インデックス付け
この実施例は、フローセル上の空間インデックスの１つの態様を実証する。

【0071】

フローセル装置を入手し、２００μｌのＰＲ２で洗浄した。プロセシングのためのビーズもＰＲ２で洗浄した。希釈したヒドロゲルをＰＲ２中で調製した。希釈度を上げると、ヒドロゲル間の間隔が増した。ヒドロゲルをフローセル上に埋め込み、該フローセルへの気泡の導入を回避した。２００μｌ ＰＲ２を該フローセルに流して、ビーズが固定されたままで該工程を実施するのを可能にした。１００μｌのＲＳＢを、フローセルを通して流した。

【0072】

タグメンテーションミックスを、２５μｌのタグメンテーション反応剤、２３μｌのＲＳＢ、および２μｌの酵素を混合することにより調製した。タグ付断片化ミックスを狭いチャネルに導入して、注入口の気泡発生の可能性を除去した。次いで、タグメンテーションミックスをゆっくりと注入口に注いだ。フローセルを密封し、５５℃にて１０分間インキュベートした。

【0073】

反応停止緩衝液ミックスを、２５μｌのタグメンテーション緩衝液、２５μｌのＲＳＢ、および１０μｌの停止緩衝液を混合することにより調製した。該停止緩衝液ミックスを、ゆっくりと気泡を発生させることなくフローセル上に流し、室温にて５分間インキュベートした。インキュベーション後、２００μｌのＰＲ２を、該装置に流した。

【0074】

ＮＰＭを、１７５μｌのＲＳＢおよび７５μｌのＮＰＭを混合することにより調製した。ＮＰＭミックスをゆっくりと気泡を生じさせることなくフローセル装置上に流し、室温にて３分間インキュベートした。２００μｌの界面活性剤含有オイルをフローセル装置に流した。顕微鏡写真から、ヒドロゲルはＮＰＭミックスおよびオイルで囲まれていることが明らかであった。フローセルを密封し、ギャップ充填反応のために７２℃にて３分間インキュベートした。

【0075】

２０－３０μｌの界面活性剤含有オイルおよびＤＴＴ含有オイル（２９／２比）をフローセル装置に流し、該装置を密封した。開始温度放出プロセスは、９０℃で３分間、６０℃で５分間、４０℃で２分間、および２０℃で２分間であった。フローセルを４００μｌのＰＲ２および２００μｌのＣＬＭで洗浄した。次いで、フローセルを４００μｌのＰＲ２で洗浄した。ここで、ｐｈｉｘシーディングが望まれ、Ｐｈｉｘは２－３ｐＭ濃度で調製され、ｐｈｉｘライブラリーを装置上に流し、室温で５分間インキュベートした。フローセルを２００μｌのＰＲ２で洗浄した。１００－２００μｌのＡＭＸを１回目の伸長のために流し、５０℃にて５分間インキュベートした。フローセルをＰＲ２で洗浄し、２４または３０サイクルの増幅を行った。

【0076】

本明細書に記載の態様、実施例および図面は、溶解からライブラリー作製までのプロセス中に遺伝物質を物理的に閉じ込められた空間に保存するための組成物、方法、およびシステムを提供する。いくつかの態様は、限られたスペース内のフローセルの表面上に放出されると、単一の長いＤＮＡ分子または単一の細胞からそれに由来するライブラリーを提供する。一旦、個々のコンパートメントにおいて単一のＤＮＡ分子または単一細胞からライブラリーがフローセルの表面上に放出されると、各コンパートメントからの該ライブラリーは、互いに近接してシーディングされる。

【0077】

本明細書で用いる用語“含む（comprising）”は、“含有する（including）”、“包含（containing）”または“によって特徴付けられる（characterized by）”と同様の意味を有し、包括的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されなかった要素または方法の工程を排除しない。

【0078】

本明細書は本発明のいくつかの方法および材料を開示している。本発明は、方法および材料の修飾、ならびに製造方法および装置の変更の影響を受けやすい。かかる修飾は、本明細書に記載の詳細な説明の考察または本発明の実施から当業者に明らかである。従って、本発明は、本明細書に記載された特定の態様に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲および精神内にあるすべての修飾および代替を網羅するものである。

【0079】

公開および未公開特許出願、特許および参考文献を含むが、これらに限定されない、本明細書に引用される全ての文献は、それらの内容全体を引用により本明細書中に包含され、それにより本明細書の一部を構成している。引用により包含させる刊行物および特許または特許出願が、本明細書に包含される開示と矛盾する場合は、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先し、および／または優先することを意図される。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

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