特許 7027502 チカグレロルに対する抗体および使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-18

(45)【発行日】2022-03-01

(54)【発明の名称】チカグレロルに対する抗体および使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20220221BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20220221BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20220221BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220221BHJP

   A61P 7/04 20060101ALI20220221BHJP

   C07K 16/44 20060101ALI20220221BHJP

   C07D 487/04 20060101ALN20220221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C07K16/18

C07K16/46

A61K39/395 N

A61P7/04

C07K16/44

C07D487/04 146

【請求項の数】 14

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020157239

(22)【出願日】2020-09-18

(62)【分割の表示】P 2017517307の分割

【原出願日】2015-09-30

(65)【公開番号】P2021011485

(43)【公開日】2021-02-04

【審査請求日】2020-10-19

(31)【優先権主張番号】62/114,931

(32)【優先日】2015-02-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/058,458

(32)【優先日】2014-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506042265

【氏名又は名称】メディミューン リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ブキャナン，アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】ニランダー，スヴェン

(72)【発明者】

【氏名】ペニー，マーク

(72)【発明者】

【氏名】ニュートン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】キイス，フィーナ

(72)【発明者】

【氏名】イングハート，トード

【審査官】山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】特許第６７９９５３０（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】Thomas MEYER and Helmuth HILZ，Eur. J. Biochem.，1986年，Vol.155，p.157-165

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／０９－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３２に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号３７に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するＶＬを含む、チカグレロル（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）－３－［７－｛［（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル］－５－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン－１，２－ジオール）またはその代謝産物に結合する抗体またはそのフラグメント。

【請求項2】

モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）₂から選択される、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項3】

チカグレロルまたはその代謝産物が、

【化1】

からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項4】

チカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項5】

患者への投与から６０分以内にチカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項４に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項6】

患者への投与から３０分以内にチカグレロルまたはその活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、請求項５に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項7】

チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ＡＤＰ誘導性血小板凝集を修復する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項8】

Ｐ２Ｙ₁₂受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の影響を阻害する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項9】

Ｐ２Ｙ₁₂受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の結合を阻害する、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項10】

抗体またはそのフラグメントの生体内半減期が、４～２４時間、４～１２時間、１２時間、または７時間である、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項11】

チカグレロルを投与された患者の急な出血の治療に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項12】

患者が、チカグレロルが治療可能な、および／もしくは適応とされる適応症について、治療をされているか、または治療もしくは予防の必要がある、請求項１１に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項13】

適応症が、不安定狭心症、アテローム性動脈硬化症の主要な動脈血栓性合併症；血栓性又は塞栓性脳卒中；一過性脳虚血発作；末梢血管疾患；血栓溶解を伴うかまたは伴わない心筋梗塞；アテローム性動脈硬化症への介入に起因する動脈合併症（ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）；血管形成術；冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）；動脈内膜切除術；ステント留置術；冠動脈および他の血管移植手術；手術の損傷または機械的損傷の血栓性合併症；事故による外傷または手術による外傷の後の組織サルベージ；再建手術；びまん性血栓症／血小板消費構成要素を伴う病態；播種性血管内凝固；血栓性血小板減少性紫斑病；溶血性尿毒症症候群；敗血症の血栓性合併症；成人呼吸窮迫症候群；抗リン脂質抗体症候群；ヘパリン起因性血小板減少症；子癇前症／子癇；静脈血栓症；深部静脈血栓症；静脈閉塞性疾患；血液疾患；骨髄増殖性疾患；血小板血症；鎌状赤血球病；機械的に誘発されるインビボの血小板活性化の予防；心肺バイパス；体外式膜型人工肺；微小血栓の予防；機械的に誘発されるインビトロの血小板活性化；血管損傷／炎症に続発する血栓症；脈管炎；動脈炎；糸球体腎炎；炎症性腸疾患；臓器移植拒絶；および片頭痛からなる群から選択される、請求項１２に記載の抗体またはそのフラグメント。

【請求項14】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、チカグレロルを投与された患者の急な出血の治療に使用するための、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

電子的に提出された配列表の参照
本出願は、２０１４年１０月１日に作成され、３３，９００バイトのサイズを有する「Ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ＴＸＴ」という名称のテキストファイルとしての、コンピューター可読形式（ＣＲＦ）で本出願と共に提出される配列表を援用するものとする。

【背景技術】

【0002】

チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ（商標）、ＢＲＩＬＩＱＵＥ（商標））は、選択的かつ可逆的に結合するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）受容体アンタゴニストである、経口で活性なシクロペンチルトリアゾロピリミジンである。急性冠症候群（ＡＣＳ）の患者では、低用量アスピリンと併用してチカグレロル１日２回９０ｍｇが、主要心血管（ＣＶ）イベントを減少させることが認められている。チカグレロルは、抗血小板作用（Ｐ２Ｙ₁₂）および増大されたアデノシン応答（ＥＮＴ－１）の両方を仲介する二重経路を介して作用する（Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１４．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．６３（２３）：２５０３－９）。依然として承認適用されていないが、進行中の計画された研究が、心筋梗塞の既往、定着した末梢動脈疾患、および急性脳卒中を有する患者、ならびに糖尿病および確認された冠状動脈アテローム性動脈硬化症を有する患者における主要ＣＶイベントの減少についてチカグレロルを評価している。

【0003】

チカグレロルは、２つの一次代謝産物、チカグレロル活性代謝産物（ＴＡＭ）およびチカグレロル不活性代謝産物（ＴＩＭ）を有する（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓ．３８：１５１４－１５２１）。ＡＲ－Ｃ１２４９１０ＸＸとしても知られているＴＡＭは、チカグレロルの主要な血中代謝産物であり、Ｐ２Ｙ₁₂アンタゴニスト活性に同様に有効である。ＴＡＭは、典型的に、ＢＲＩＬＩＮＴＡ／ＢＲＩＬＩＱＵＥにおいて患者における親チカグレロル濃度の約３０～４０％で存在する。チカグレロルおよびＴＡＭは、それぞれ８および１２時間の血中半減期を有する。ＡＲ－Ｃ１３３９１３ＸＸとしても知られているＴＩＭは、Ｐ２Ｙ₁₂に対して不活性であり、親チカグレロルの１０％未満を構成し、８時間後に検出できず、尿を介して排泄される主要代謝産物である。

【0004】

血小板阻害および患者の転帰（ＰＬＡＴＯ）試験は、管理戦略（医学的または侵襲的に管理される）にかかわらず、広いＡＣＳ患者集団（ＵＡ、ＮＳＴＥＭＩ、ＳＴＥＭＩ）において、クロピドグレルと比較したときに、重度の出血の合計件数（ｔｏｔａｌ ｍａｊｏｒ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）を増加させずに、チカグレロルのより高い有効性を実証した（Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ ２００９ ＮＥＪＭ ３６１（１１）：１０４５－１０５７）。しかしながら、全ての抗血小板薬と同様に、チカグレロルを用いて、患者における出血の可能性が存在する。抗血小板薬２剤併用療法（ＤＡＰＴ）において患者に重度の出血が起こる場合、治療選択肢が限られる。ＤＡＰＴにおいて患者に出血イベントが起こる場合、血小板輸血または凝固因子の投与が、止血を向上させるために使用され得る。しかしながら、チカグレロルに関する被験体の主要出血イベントの後またはその間の血小板輸血または組換え第ＶＩＩａ因子の使用の止血効果を評価する臨床データは現在存在していない（Ｄａｌｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ Ａｎｅｓｔｈ．２７（５）：ｅ５５－７）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【文献】Ｃａｔｔａｎｅｏ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１４．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ．６３（２３）：２５０３－９

【文献】Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１０ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓ．３８：１５１４－１５２１

【文献】Ｗａｌｌｅｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ ２００９ ＮＥＪＭ ３６１（１１）：１０４５－１０５７

【文献】Ｄａｌｅｎ Ｍ ｅｔ ａｌ ２０１３ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ Ｖａｓｃ Ａｎｅｓｔｈ．２７（５）：ｅ５５－７

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

したがって、チカグレロルに特異的な中和抗体などの解毒剤の利用可能性は、出血の制御に対する所望の抗血栓作用のバランスのより良好な臨床管理を可能にするであろう。チカグレロルは、唯一の市販されている可逆的に結合する抗血小板薬であるため、抗体は、新たな血小板輸血の必要なく血小板阻害の拮抗（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を提供し、それによって、血小板輸血に関連する危険を避けることができる。チカグレロルおよびＴＡＭに関連するＡＤＰ誘導性血小板凝集の阻害を克服する薬剤の利用可能性は、たとえば、重度の出血を経験し、または緊急手術を必要とする患者における、満たされていない重要な臨床的必要性を満たすであろう。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様では、本開示は、式（Ｉａ）：

【化1】

（式中、
Ｒ₁が、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシおよびＣ₁～Ｃ₆アルキルチオからなる群から選択され；
Ｒ₂が、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、置換Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキル、および置換Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキルからなる群から選択され；および
Ｒ₃が、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、およびＣ₁～Ｃ₆アルカノールからなる群から選択される）
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体に関する。

【0008】

いくつかの実施形態では、抗体は、式（ＩＩａ）

【化2】

（式中、Ｒ₁、Ｒ₂、およびＲ₃が、上記のように定義される）
として括弧で識別される化合物の部分内でエピトープに結合する。

【0009】

さらなる実施形態では、抗体は、式（ＩＩＩａ）

【化3】

（式中、Ｒ₂、およびＲ₃が、上記のように定義され、Ｒ’₁が、Ｃ₁～Ｃ₄アルキルからなる群から選択される）
として括弧で識別される化合物の部分内でエピトープに結合する。

【0010】

さらなる実施形態では、抗体は、

【化4】

からなる群から選択される化合物に結合する。

【0011】

上記の態様および実施形態のさらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列；ならびに配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２および配列番号７；配列番号１２および配列番号１７；配列番号２２および配列番号２７；配列番号３２および配列番号３７；配列番号４２および配列番号４７；配列番号５２および配列番号５７；配列番号６２および配列番号６７；ならびに配列番号７２および配列番号７７からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬ配列の組み合わせを含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号５２および配列番号５７；配列番号６２および配列番号６７；ならびに配列番号７２および配列番号７７からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬの組み合わせを含む。

【0012】

上記の態様および実施形態のさらなる実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３を含み、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）；配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）；配列番号２３（ＣＤＲ１）、配列番号２４（ＣＤＲ２）、および配列番号２５（ＣＤＲ３）；配列番号３３（ＣＤＲ１）、配列番号３４（ＣＤＲ２）、および配列番号３５（ＣＤＲ３）；配列番号４３（ＣＤＲ１）、配列番号４４（ＣＤＲ２）、および配列番号４５（ＣＤＲ３）；配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＣＤＲ２）、および配列番号５５（ＣＤＲ３）；配列番号６３（ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＣＤＲ２）、および配列番号６５（ＣＤＲ３）；または配列番号７３（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）、および配列番号７５（ＣＤＲ３）を含み；軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、配列番号８（ＣＤＲ１）、配列番号９（ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＣＤＲ３）；配列番号１８（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、および配列番号２０（ＣＤＲ３）；配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）；配列番号３８（ＣＤＲ１）、配列番号３９（ＣＤＲ２）、および配列番号４０（ＣＤＲ３）；配列番号４８（ＣＤＲ１）、配列番号４９（ＣＤＲ２）、および配列番号５０（ＣＤＲ３）；配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）；配列番号６８（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、および配列番号７０（ＣＤＲ３）；または配列番号７８（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、および配列番号８０（ＣＤＲ３）を含む。さらなる実施形態では、抗体は、配列番号５３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号５５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号５８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＶＬ ＣＤＲ３）；配列番号６３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号６５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号７０（ＶＬ ＣＤＲ３）；ならびに配列番号７３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号７５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号７８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号８０（ＶＬ ＣＤＲ３）からなる群から選択されるＣＤＲ領域の組み合わせを含む。

【0013】

上記の態様および実施形態では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、一本鎖ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、抗体模倣体、および抗体可変ドメインから選択される。いくつかの実施形態では、抗体はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗体はＦａｂを含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、上述される抗体は、チカグレロルまたはチカグレロル活性代謝産物（ＴＡＭ）に結合する。

【0015】

さらなる実施形態では、抗体は、約２００ｎＭ以下のＩＣ₅₀を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する。さらに他の実施形態では、抗体は、約１００ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ₅₀、または約１０ｎＭ～約１ｎＭのＩＣ₅₀を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する。

【0016】

さらなる実施形態では、抗体は、約５０ｎＭ以下のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する。さらに他の実施形態では、抗体は、約２５０ｐＭ～約１ｐＭの範囲の、または約１００ｐＭ～約１ｐＭの範囲のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する。

【0017】

さらなる実施形態では、抗体は、チカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合し、フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物に結合しない。実施形態では、抗体は、フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物の活性を阻害しない。さらなる実施形態では、抗体は、フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物について少なくとも約１０００μＭのＩＣ₅₀を示す。

【0018】

いくつかの実施形態では、抗体は、約４～１２時間の生体内半減期を有する。特定の実施形態では、抗体は、約１２時間の生体内半減期を有する。

【0019】

いくつかの実施形態では、抗体は、チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する。さらなる実施形態では、抗体は、投与から約６０分以内にチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する。

【0020】

いくつかの実施形態では、抗体は、チカグレロルを含む治療の開始の連続を可能にするチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）を有する。

【0021】

他の態様では、本開示は、治療を必要とする患者の急な出血を治療する方法であって、有効量の本明細書に開示される抗体を患者に投与する工程を含む方法を提供する。本方法のいくつかの実施形態では、患者は、外科手術を受けたか、または受けており、かつチカグレロルを投与された。本方法のいくつかの実施形態では、患者は、応急手当ておよび／または救急外傷管理を必要としている。

【0022】

本開示の他の態様は、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、前の態様および実施形態のいずれかの抗体を含む組成物を提供する。

【0023】

いくつかのさらなる態様は、前の請求項のいずれかに記載の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、および配列番号７６を含む。

【0024】

本開示のさらなる態様は、本明細書に開示される少なくとも１つの核酸分子を含み得る組成物、ベクター、および宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、組成物、ベクター、および宿主細胞は、本明細書に開示されるタンパク質の１つまたは複数をコードする第１の核酸分子および第２の核酸分子を含む。

【0025】

他の態様は、以下に続く説明および例示的な説明を検討すると、当業者に明らかであろう。

【0026】

本開示を例示するために、本開示のある態様が図面中に示される。しかしながら、本開示は、図面中に示される態様の正確な配置および手段に限定されない。

【図面の簡単な説明】

【0027】

【図1】第ＩＩＩ相ＰＬＡＴＯデータに基づくチカグレロルが中和するＦａｂのＰＫ／ＰＤモデリングを示す。チカグレロル１８０ｍｇの初期投与および１日２回９０ｍｇの後、中和Ｆａｂが時間ゼロの時点で加えられる。患者は、１日目にチカグレロルを再開される。Ｆａｂは、チカグレロルおよびＴＡＭを迅速に中和し、したがって、９９％の患者において血小板凝集を修復することが予測される。０～１日目の「ヒル」は、チカグレロルがよりゆっくりと除去される１％の患者における他の組織からのチカグレロルの再分配を表す。

【図2A】ハプタン（ｈａｐｔａｎ）およびＦａｂ特異性。（Ａ）チカグレロル、チカグレロル活性代謝産物（ＴＡＭ）、チカグレロル不活性代謝産物（ＴＩＭ）およびアデノシンの化学構造を提供する。固有のＲ基、ジ－フルオロフェニル－シクロプロピルおよびチオプロピル置換基が、点線で強調される。

【図2B】ハプタン（ｈａｐｔａｎ）およびＦａｂ特異性。（Ｂ）ＴＩＣＡ００７２の特異性プロファイル。特異性プロファイルは、チカグレロル、ＴＡＭ、ＴＩＭ、アデノシン、ＡＤＰ、ＡＴＰおよび図４の１２の関連化合物のうちの３つを含む（明確にするために、最大で０．１ｍＭの濃度の１２の化合物のいずれに対しても結合を検出しなかった）。データは、３つのトリプリケートの平均およびＳＥＭである。

【図2C】ハプタン（ｈａｐｔａｎ）およびＦａｂ特異性。（Ｃ）ＴＩＣＡ０２１２（ＭＥＤＩ ２４５２）の特異性プロファイル。特異性プロファイルは、チカグレロル、ＴＡＭ、ＴＩＭ、アデノシン、ＡＤＰ、ＡＴＰおよび図４の１２の関連化合物のうちの３つを含む（明確にするために、最大で０．１ｍＭの濃度の１２の化合物のいずれに対しても結合を検出しなかった）。データは、３つのトリプリケートの平均およびＳＥＭである。

【図3】ビオチン化リンカーチカグレロルに対するｓｃＦｖ結合（ｘ軸）および５０倍過剰の非修飾チカグレロル中のビオチン化リンカーチカグレロルに対する結合（ｙ軸）の相関を示す。過剰な非修飾チカグレロルの存在下におけるｓｃＦｖ結合の阻害は、０％、５０％、８０％および９０％の阻害についての線で示される。

【図4】チカグレロルに対するある程度の２Ｄ、３Ｄまたは静電的類似性で同定される化合物を示す。

【図5】ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂについての選択性試験を提供する。ａ～ｃ 列挙される化合物によるビオチン化チカグレロルに対するＴＩＣＡ００４９ Ｆａｂ結合の競合。ｄ～ｆ 列挙される化合物によるビオチン化チカグレロルに対するＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂ結合の競合。データはＤＭＳＯ正規化される。

【図6】第二世代エピトープ競合アッセイにおける親ＴＩＣＡ００７２および最適化された変異体ＴＩＣＡ０１５２、ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２ Ｆａｂについての競合曲線を提供する。

【図7】ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２ Ｆａｂについての選択性試験の結果を示す。ａ～ｃ 列挙される化合物によるビオチン化チカグレロルに対するＴＩＣＡ０１６２ Ｆａｂ結合の競合。ｄ～ｆ 列挙される化合物によるビオチン化チカグレロルに対するＴＩＣＡ０２１２ Ｆａｂ結合の競合。データはＤＭＳＯ正規化される。

【図8A】チカグレロルのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２またはＴＩＣＡ００７２の濃度に依存する拮抗の結果を示す。（Ａ）２０μＭのＡＤＰ誘導性凝集のＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２ １ｕＭのチカグレロル（▲）または１ｕＭのＴＡＭ（●）媒介性阻害。

【図8B】チカグレロルのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２またはＴＩＣＡ００７２の濃度に依存する拮抗の結果を示す。（Ｂ）ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、１ｕＭのチカグレロルの存在下における血漿中の遊離チカグレロル濃度の低下を示す。平均（ｎ＝５）±平均の標準誤差。

【図8C】チカグレロルのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２またはＴＩＣＡ００７２の濃度に依存する拮抗の結果を示す。（Ｃ）チカグレロルのＴＩＣＡ００７２拮抗およびＰ２Ｙ₁₂シグナル伝達のＴＡＭ阻害。

【図9】チカグレロルで処理されたマウスへの投与後のＡＤＰ誘導性の生体外全血凝集のＴＩＣＡ０２１２（２５０ｍｇ／ｋｇ）に媒介される拮抗の結果を示す。

【図10】チカグレロルとの複合体におけるＴＩＣＡ００７２（Ａ）およびＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２（Ｂ）の結晶構造の部分図を示す。Ｆａｂは、棒状物（ｓｔｉｃｋ）として示されるチカグレロルから７Åの範囲内のアミノ酸残基を含むリボン図で示される。いくつかの主鎖原子は、明確にするために省略された。軽鎖はベージュ色で示され、重鎖は薄青色で示される。両方の鎖からのＣＤＲ３は緑色である。Ｖ_H ＣＤＲ３は、ＴＩＣＡ００７２構造においてモデル化できず、一時的な位置は、破線として描かれる。オレンジ色の矢印は、ＴＩＣＡ００７２と比較して、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２において観察されるＶ_L ＣＤＲ３の変化を示す。残基は、ｋａｂａｔに従う番号であり、軽鎖または重鎖を示すためにＬまたはＨが前に付いている。

【図11】ＡＤＰ誘導性の生体外全血凝集の拮抗を示す。（Ａ）チカグレロル注入の停止後の各処理群の個々のデータ。ビヒクル対照（■）、チカグレロル単独（●）、チカグレロル＋ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２（○）およびチカグレロル＋アイソタイプ対照（△）。バーは、平均データ（ｎ＝４）を表す。ＡＵ＝凝集単位。１５分の時点で、チカグレロル＋ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２群のみのデータを収集した。（Ｂ）ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２によって誘導される拮抗パーセンテージ、平均データ（ｎ＝４）±ＳＥＭ。

【図12】チカグレロル誘導性の出血の改善を示す。（Ａ）全失血についての個々のデータおよび（Ｂ）全出血時間についての個々のデータ。ビヒクル対照（■）、チカグレロル単独（●）およびチカグレロル＋ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２（○）。バーは、平均データ（ｎ＝１２）を表す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

引き続き本開示をさらに詳細に記載する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって異なってもよいことを理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される場合、単数形「１つの（ａ）、「１つの（ａｎ）」および「前記（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の意味を含むことに留意しなければならない。

【0029】

他に記載がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が関連する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を持つ。たとえば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、当業者にとって本発明に使用される多くの用語の一般的な辞書となる。

【0030】

本明細書においてアミノ酸は、その一般に知られる３文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）により推奨される１文字記号で示すことがある。ヌクレオチドも、同様に、その一般的に認められた１文字記号で示すことがある。

【0031】

抗体の可変ドメイン、相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸の番号付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）に記載されるＫａｂａｔの定義に従う。この番号付け体系を使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮またはＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に対応して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含むことができる。たとえば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の１個のアミノ酸の挿入（Ｋａｂａｔによれば残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（たとえば、Ｋａｂａｔによれば残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃなど）を含むことができる。残基のＫａｂａｔの番号付けは個々の抗体に対して、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号が付けられた配列との相同性領域でアライメントを行うことにより決定することができる。フレームワーク残基の最大のアライメントには、Ｆｖ領域に使用される、この番号付け体系の「スペーサー」残基の挿入が必要とされることが多い。さらに、任意の特定のＫａｂａｔ部位番号における個々の特定の残基の種類は、種間の相違または対立遺伝子の相違のため抗体鎖によって異なることもある。

【0032】

本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンとも呼ばれ、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合フラグメントから形成される多重特異性抗体（たとえば、多重特異性抗体、たとえば、その全体を本明細書に援用する国際公開第２００９／０１８３８６号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１２／０４５２２９号明細書）、ｂｉＭａｂ、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、所望の生物活性を示す抗体フラグメント（たとえば抗原結合部分）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体など）、イントラボディ、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを包含する。本明細書に提供される特定の実施形態では、抗体は、抗体の活性結合フラグメント、すなわち、たとえばｓｃＦｖおよびＦａｂなどの少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子に関する。抗体はまた、抗体またはその一部とのペプチド融合体、たとえばＦｃドメインとの融合タンパク質を含む。免疫グロブリン分子は、どのようなアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、サブアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはアロタイプ（たとえば、Ｇｍ、たとえば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂまたはｃ）、Ａｍ、ＥｍおよびＫｍ（１、２または３））であってもよい。抗体は、任意の哺乳動物、以下に限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、または他の動物、たとえばトリ（たとえばニワトリ）に由来してもよい。

【0033】

本明細書で使用する場合、Ｃ₁～Ｃ₆アルキルは、１～６個の炭素原子を有する直鎖状および分枝鎖状アルキルを指し、メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、およびヘキシルを含む。

【0034】

本明細書で使用する場合、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシは、基中に酸素を有する上記のアルキルを指す。いくつかの実施形態では、酸素原子は、置換基をコア構造（すなわち、環構造）に結合する位置に配置される。

【0035】

本明細書で使用する場合、Ｃ₁～Ｃ₆アルキルチオは、基中に硫黄を有する上記のアルキルを指す。いくつかの実施形態では、硫黄原子は、置換基をコア構造（すなわち、環構造）に結合する位置に配置される。

【0036】

本明細書で使用する場合、Ｃ₁～Ｃ₆アルカノールは、置換基構造の末端にヒドロキシル基を有する上記のアルキルを指す。

【0037】

本明細書で使用する場合、Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルを指す。

【0038】

本明細書で使用する場合、「置換」Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキルおよびＣ₁～Ｃ₆アルキルは、少なくとも１個の炭素原子上で、１～３個のハロゲン原子でさらに置換されるアリール基で置換される上記のアルキルおよびシクロアルキル基を指す。

【0039】

本明細書で使用する場合、「チカグレロル」は、化学構造：

【化5】

を有する可逆的Ｐ２Ｙ₁₂阻害剤（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）－３－［７－｛［（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル］－５－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン－１，２－ジオール）を指す。

【0040】

本明細書で使用する場合、「チカグレロル活性代謝産物」または「ＴＡＭ」は、化学構造：

【化6】

を有する可逆的Ｐ２Ｙ₁₂阻害剤である、ＡＲ－Ｃ１２４９１０ＸＸとも呼ばれる、チカグレロルの主要活性代謝産物を指す。

【0041】

本明細書で使用する場合、「チカグレロル不活性代謝産物」または「ＴＩＭ」は、化学構造：

【化7】

を有する、ＡＲ－Ｃ１３３９１３ＸＸとも呼ばれる、チカグレロルの不活性代謝産物を指す。

【0042】

抗体
一般的な意味で、本開示は、式（Ｉａ）：

【化8】

（式中、
Ｒ₁が、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシおよびＣ₁～Ｃ₆アルキルチオからなる群から選択され；
Ｒ₂が、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、置換Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキル、および置換Ｃ₃～Ｃ₆シクロアルキルからなる群から選択され；および
Ｒ₃が、Ｈ、Ｃ₁～Ｃ₆アルキル、Ｃ₁～Ｃ₆アルコキシ、およびＣ₁～Ｃ₆アルカノールからなる群から選択される）
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に結合する新規な抗体を提供する。

【0043】

特定の実施形態では、抗体は、

【化9】

からなる群から選択される化合物に特異的に結合する。

【0044】

特定の態様では、本開示は、高い結合特異性、高い結合親和性、迅速な発現時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｏｎｓｅｔ）、および迅速な消失時間（ｔｉｍｅ ｔｏ ｏｆｆｓｅｔ）（たとえば、チカグレロルを含む治療の任意選択の連続または同時投与を可能にする）を含む以下の特徴のいずれか１つまたは複数を有するチカグレロルおよびＴＡＭに結合する抗体を提供する。

【0045】

いくつかの実施形態では、抗体は、チカグレロルに結合し、チカグレロルおよびＴＡＭの抗血小板凝集活性を中和し、したがって、チカグレロルおよびＴＡＭの存在下でＡＤＰ誘導性血小板凝集を修復する。

【0046】

いくつかの実施形態では、被験体の抗体半減期は、チカグレロルおよびＴＡＭの半減期とほぼ同じである。いくつかの実施形態では、抗体半減期は、約４～２４時間（たとえば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間）である。いくつかの実施形態では、抗体半減期は、約４～１２時間（たとえば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間）である。

【0047】

いくつかの実施形態では、抗体は、迅速な作用発現を提供する。たとえば、実施形態では、抗体が、チカグレロルおよびＴＡＭ媒介性血小板阻害を発現する時間または中和する時間は、約１５～１２０分間、または約１５～６０分間である。いくつかの実施形態では、発現時間は、６０分未満である。

【0048】

いくつかの実施形態では、抗体は、たとえば、抗体を投与された被験体が、所定のチカグレロル治療を再開し得るように、迅速な作用消失を提供するＰＫ／ＰＤプロファイルを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体を与えられた被験体（たとえば、静脈内（ｉ．ｖ．）注入による）は、抗体の投与後２４時間以内にチカグレロル治療を受けるかまたは再開し得る。

【0049】

本明細書のある実施形態に説明され、例示されるように、抗体は、チカグレロルまたはその代謝産物に結合し、他の構造的に関連する化合物、または連携療法としてチカグレロルと共に投与され得る化合物に結合しない。たとえば、好適には、抗体は、フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物の活性を阻害しない。

【0050】

本明細書に記載の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ジ－ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂフラグメントなどの抗体分子の選択された部分のみを含有する抗原結合フラグメントを含んでもよく、診断用剤または治療剤として使用され得る。さらに、可変ドメイン中の特定の残基は、抗体および抗体フラグメントの結合特異性および／または安定性を向上させるように改変され得る。非ヒト抗体の領域を「ヒト化」し、抗体の免疫原性を減少させるために、抗原結合に直接関与しない他の残基が置換された。

【0051】

ある態様では、抗体は、Ｆａｂフラグメント、たとえば、抗体のＦａｂフラグメントまたは可変軽鎖（ＶＬ）、定常軽鎖（ＣＬ）、可変重鎖（ＶＨ）、および定常重鎖部分（ＣＨ１）を含む組換えにより産生された抗原結合フラグメントである。任意に、Ｆａｂの軽鎖および重鎖は、１つまたは複数のジスルフィド結合を介して（たとえば、好適な抗体ヒンジ領域を介して）相互に連結され得る。本明細書に記載されるように、Ｆａｂは、経口活性薬剤のシクロペンチルトリアゾロピリミジンクラスの化合物のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、チカグレロルまたはその代謝産物に結合する。

【0052】

ある態様では、Ｆａｂは、従来のマウス、ヒト化またはヒト抗体などの、抗体の配列に由来するかまたはそれに基づき得る。ある態様では、Ｆａｂは、ライブラリーからスクリーニングされるかまたは由来するｓｃＦｖなどの１つまたは複数のｓｃＦｖに由来するかまたはそれに基づき得る。このような実施形態では、従来の抗体またはｓｃＦｖの配列に由来するかまたはそれに基づくＦａｂは、従来の抗体の１つまたは複数の機能活性を保持する（たとえば、機能活性の少なくとも８０％以上（８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％）を保持する）。たとえば、ある態様では、Ｆａｂは、抗原（たとえば、チカグレロル）の親和性、阻害活性、および／または抗体またはｓｃＦｖの選択性の１つまたは複数を保持する。

【0053】

Ｆａｂフラグメントが、シクロペンチルトリアゾロピリミジンのエピトープに結合する配列を含み得る一方、特定の実施形態では、Ｆａｂは、チカグレロルに結合する。いくつかの態様では、Ｆａｂは、チカグレロルの活性代謝産物に結合する。ある態様では、Ｆａｂは、チカグレロルおよびチカグレロルの活性代謝産物の両方に結合し得る。

【0054】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、チカグレロルまたはその活性代謝産物に結合する異なる抗体からのＣＤＲ領域の組み合わせを含み得る。

【0055】

ある態様では、Ｆａｂは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む軽鎖部分（ＶＬ）を含む。さらなる実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖部分を含む。ある態様では、Ｆａｂは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２のいずれかに記載されるアミノ酸を含む重鎖部分（ＶＨ）を含む。さらなる実施形態では、Ｆａｂは、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む重鎖部分を含む。ある態様では、Ｆａｂは、軽鎖部分（ＶＬ）をコードするヌクレオチド配列および重鎖部分（ＶＨ）をコードするヌクレオチド配列、たとえば、配列番号１、配列番号１１、配列番号２１、配列番号３１、配列番号４１、配列番号５１、配列番号６１、または配列番号７１に記載される核酸配列を含むヌクレオチド配列；および配列番号６、配列番号１６、配列番号１６、配列番号１６、配列番号１６、配列番号１６、配列番号１６、または配列番号７６に記載される核酸配列を含むヌクレオチド配列によってコードされる。

【0056】

ある態様では、抗体は、ｓｃＦｖであり得る。ｓｃＦｖが、フレキシブルポリペプチドリンカーを介して可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に連結された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含むポリペプチド鎖を包含することが理解される。いくつかの態様では、ＶＨとＶＬとの間のポリペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含む。ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインは、同一または異なる抗体に由来し得る。いくつかの態様では、ｓｃＦｖのＶＨまたはＶＬは、対象とする標的に結合する１つまたは複数のＣＤＲを含み得る一方、ＶＨまたはＶＬドメインの残りが、異なる抗体に由来するかまたは合成である。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、抗体、たとえば、チカグレロルまたはその代謝産物に対する結合活性を有する抗体の少なくとも１つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、所与の抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、所与の抗体の少なくとも３つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、所与の抗体の少なくとも４つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、所与の抗体の少なくとも５つのＣＤＲを含む。いくつかの態様では、ｓｃＦｖは、所与の抗体の少なくとも６つのＣＤＲを含む。

【0057】

いくつかの方法が、ｓｃＦｖ分子の安定性を向上させるために、単独でまたは組み合わせて使用され得る。単独でまたは他の方法の１つまたは複数と組み合わせて使用され得る１つの方法は、ｓｃＦｖ部分を安定させるために、ｓｃＦｖドメインを結合するリンカーの長さおよび／または組成を操作することである。

【0058】

単独あるいは本明細書に記載の他の方法１つまたは複数を組み合わせて使用できると考えられる別の方法は、ジスルフィド結合の形成を促進するようにｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインに少なくとも２つのアミノ酸置換（修飾または突然変異ともいう）を導入することによる（たとえばＢｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ，９０：７５３８－４２；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：７８１－８；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３：５４５１－９；Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ １４：１２３９－４５；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：８２５－３１；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．３７７：１３５－９；Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９：１３６２－７を参照されたい）。

【0059】

ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインに１つの突然変異を導入して、ｓｃＦｖの発現時にＶＨドメインとＶＬドメインとの間の鎖間ジスルフィド結合の形成を促進する。別の態様では、鎖の同じドメインに２つの突然変異を導入する。ある態様では、異なる鎖に２つの突然変異を導入する。ある態様では、２つの突然変異の複数対を導入して、複数のジスルフィド結合の形成を促進する。ある態様では、システインを導入してジスルフィド結合の形成を促進する。システインに変異させてもよい例示的アミノ酸として、ＶＨ２のアミノ酸４３、４４、４５、４６、４７、１０３、１０４、１０５および１０６、ならびにＶＬ２のアミノ酸４２、４３、４４、４５、４６、９８、９９、１００および１０１が挙げられる。前述の番号付けは、ｓｃＦｖのＶＨ２およびＶＬ２のみに対する（抗体の全長配列におけるアミノ酸の位置に対するものではない）位置を特定するＫａｂａｔの番号付けに基づく。システイン残基に変異させてもよいアミノ酸位置の例示的組み合わせとして、ＶＨ４４－ＶＬ１００、ＶＨ１０５－ＶＬ４３、ＶＨ１０５－ＶＬ４２、ＶＨ４４－ＶＬ１０１、ＶＨ１０６－ＶＬ４３、ＶＨ１０４－ＶＬ４３、ＶＨ４４－ＶＬ９９、ＶＨ４５－ＶＬ９８、ＶＨ４６－ＶＬ９８、ＶＨ１０３－ＶＬ４３、ＶＨ１０３－ＶＬ４４およびＶＨ１０３－ＶＬ４５が挙げられる。いくつかの態様では、ＶＨのアミノ酸４４およびＶＬのアミノ酸１００をシステインに変異させる。

【0060】

単独あるいは本明細書に記載の１つまたは複数の他の方法と組み合わせて使用してもよいとさらに考えられる方法は、ｓｃＦｖの順序を選択することである。ある態様では、ＶＬドメインに対するＶＨドメインの配向を安定性のために最適化する。ある態様では、ｓｃＦｖは、ＶＨ－リンカー－ＶＬの配向である。ある態様では、ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨの配向である。

【0061】

単独あるいは１つまたは複数の本明細書に記載の方法と組み合わせて使用してもよい別の方法は、ｓｃＦｖの１つまたは複数の表面残基を変異させて１つまたは複数の安定化突然変異を導入することによる。いくつかの態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの一方または両方の１、２、３、４、５、６または６を超える残基を変異させる。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインのみの変更を行う。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＬドメインのみの変更を行う。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよびＶＬドメインの両方の変更を行う。各ドメインに同じ数の変更を行っても、あるいは各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾の親ｓｃＦｖに存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾の親ｓｃＦｖに存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。ｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一方あるいは両方に複数の置換を行う場合、置換は各々独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換は全て保存的置換である。ある態様では、置換は全て非保存的である。ある態様では、置換の少なくとも１つは保存的である。ある態様では、少なくとも１つまたは置換は非保存的である。

【0062】

単独あるいは１つまたは複数の本明細書に記載の他の方法と組み合わせて使用してもよいさらに別の方法は、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの１つまたは複数の残基を変異させて１つまたは複数の置換を導入して、既知であり、スクリーニングされ、かつ／または識別された抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのコンセンサス配列の前記特定位置で最も頻度の高い残基にマッチさせることによる。ある態様では、ｓｃＦｖのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインの一方または両方に１、２、３、４、５、６または６を超える位置で置換を導入する。各ドメインに同じ数の変更を行ってもよく、あるいは各ドメインに異なる数の変更を行ってもよい。ある態様では、あるコンセンサス配列にマッチさせる配列の１つまたは複数の変更は、未修飾のＶＨ配列および／またはＶＬ配列に存在する残基の保存的アミノ酸置換である。他の態様では、１つまたは複数の変更は、未修飾のＶＨ配列および／またはＶＬ配列に存在する残基の非保存的アミノ酸置換である。ｓｃＦｖのＶＨドメインまたはＶＬドメインの一方あるいは両方に複数の置換を行う場合、置換は各々独立に保存的置換または非保存的置換である。ある態様では、置換は全て保存的置換である。ある態様では、置換は全て非保存的置換である。ある態様では、置換の少なくとも１つは保存的である。ある態様では、少なくとも１つまたは置換は非保存的である。

【0063】

ｓｃＦｖ部分の修飾または安定化に有用であると記載された修飾のいずれも、Ｆａｂ部分の修飾に適用できることに留意されたい。たとえば、Ｆａｂの可変ドメインを修飾して、安定性、抗原結合および同種のものを向上させることができる。さらに、Ｆａｂ部分あるいはｓｃＦｖ部分を修飾して免疫原性を低下させることもできる。

【0064】

ある態様では、抗体は、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む可変軽鎖部分（ＶＬ）を含むｓｃＦｖであり得る。さらなる実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖部分を含む。ある態様では、ｓｃＦｖは、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２のいずれかに記載されるアミノ酸を含む重鎖部分（ＶＨ）を含む。さらなる実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２のいずれかに記載されるアミノ酸配列を含む重鎖部分を含む。

【0065】

本明細書に開示される抗体は、１つまたは複数のリンカーポリペプチドをさらに含み得る。リンカーは、重鎖ドメインおよび軽鎖ドメイン（ｓｃＦｖ）を相互に連結し、または抗体またはその抗原結合フラグメントを、標識、Ｆｃドメインなどの別の作用因子に結合し得る。リンカーは、長さおよび配列が異なることがあり、概して当該技術分野において公知である。

【0066】

Ｆｃ領域を含む抗体の血清中半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を高めることにより延長することができる。「抗体半減期」という用語は、本明細書で使用する場合、投与後の抗体分子の平均生存時間の指標である抗体の薬物動態特性を意味する。抗体半減期は、既知量の免疫グロブリンの５０パーセントを患者の体内（または他の哺乳動物）またはその特定のコンパートメントから除去するのに要する時間を、たとえば血清中で見て（すなわち、血中半減期）または他の組織で見て表すことができる。半減期は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスによって異なってもよい。一般に、抗体半減期を延長すると、投与された抗体の循環血中の平均滞留時間（ＭＲＴ）が長くなる。

【0067】

半減期を延長すると、患者に投与される薬剤量の減少および投与頻度の低下を可能にし得る。抗体の血清半減期を延長するには、たとえば米国特許第５，７３９，２７７号明細書に記載されているようなサルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）に組み込んでもよい。本明細書で使用する場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボでの血清中半減期に関わる、ＩｇＧ分子（たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープをいう。あるいは、半減期の延長された本開示の抗体は、ＦｃとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが確認されたアミノ酸残基を修飾することにより作製してもよい（たとえば、米国特許第６，８２１，５０５号明細書および同第７，０８３，７８４号明細書；および国際公開第０９／０５８４９２号パンフレットを参照されたい）。さらに、本開示の抗体の半減期は、当該技術分野において広く利用される技術によりＰＥＧまたはアルブミンへのコンジュゲーションによって延長してもよい。

【0068】

本開示の範囲内に含まれる抗体は、本明細書において特定される構造的および／または機能的特性のいずれかによって特定され得る。たとえば、抗体は、本明細書に示されるかまたは当該技術分野において公知の技術のいずれかを用いて、特定の結合特徴（たとえば、Ｋ_off、Ｋｄ、ＩＣ₅₀、チカグレロルおよびチカグレロル代謝産物に対する特異性／選択性）のためにスクリーニングされ得る。

【0069】

標識、コンジュゲートおよび部分
本開示の抗体は、診断および他のアッセイを目的として標識にコンジュゲートしてもよく、抗体および／またはその標的を検出することができる。標識には、以下に限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素および放射性同位元素がある。

【0070】

ある態様では、抗体をフルオロフォアにコンジュゲートする。抗体に結合するフルオロフォアの選択により、コンジュゲートした抗体の吸収および蛍光発光特性が決定される。抗体および抗体結合リガンドに使用することができるフルオロフォア標識の物理的性質には、スペクトル特性（吸収、発光およびストークスシフト）、蛍光強度、寿命、偏光および光退色速度またはこれらの組み合わせがあるが、これに限定されるものではない。これらの物理的性質は全て、あるフルオロフォアを別のフルオロフォアと区別するのに使用することができ、したがって多重解析が可能になる。蛍光標識の他の望ましい特性として、たとえば細胞またはモデル生体（たとえば、生きている動物）において抗体の標識を行った場合の細胞透過性および低毒性を挙げることができる。

【0071】

ある態様では、酵素が標識であり、抗体にコンジュゲートされる。酵素は、検出可能なシグナルの増幅を行い、アッセイ感度を高められるため望ましい標識である。酵素自体は検出可能な反応を起こさないが、適切な基質に接触すると基質を分解する働きをし、変質した基質が蛍光シグナル、比色シグナルまたは発光シグナルを発するようになる。標識試薬上の１つの酵素が複数の基質を検出可能なシグナルに変換できるため、酵素により検出可能なシグナルが増幅される。酵素基質は、測定可能な好ましい結果、たとえば比色、蛍光または化学発光が得られるように選択する。こうした基質は当該技術分野において広く使用され、当業者に公知であり、たとえば、オキシドレダクターゼ、たとえば西洋わさびペルオキシダーゼおよび基質、たとえば３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；ホスファターゼ酵素、たとえば酸性ホスファターゼ、アルカリ性および基質、たとえば５－ブロモ－６－クロロ－３－インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）；グリコシダーゼ、たとえばβ－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－グルコシダーゼおよび基質、たとえば５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）が挙げられ、別の酵素として、加水分解酵素、たとえばコリンエステラーゼおよびペプチダーゼ、オキシダーゼ、たとえばグルコースオキシダーゼおよびシトクロムオキシダーゼ、ならびに好適な基質が公知であるレダクーゼが挙げられる。

【0072】

酵素および化学発光を示すその適切な基質は、いくつかのアッセイに好適である。そうしたものとして、天然および組換え形態のルシフェラーゼおよびエクオリンがあるが、これに限定されるものではない。加えて、ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼの化学発光性基質、たとえば安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウムエステルを含むものも有用である。

【0073】

また、別の態様では、ビオチンなどのハプテンを標識として利用してもよい。ビオチンは、酵素系で検出可能なシグナルをさらに増幅する働きをすることができ、さらに単離を目的としてアフィニティークロマトグラフィーに使用されるタグとしても機能できるため有用である。検出には、ビオチンに対して親和性を有する酵素コンジュゲート、たとえばアビジン－ＨＲＰを使用する。その後ペルオキシダーゼ基質を加えて検出可能なシグナルを発生させる。

【0074】

ハプテンはさらに、ホルモン、天然および合成薬剤、汚染物質、アレルゲン、アフェクター分子、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間体、ヌクレオチドおよび同種のものも含む。

【0075】

ある態様では、標識として蛍光タンパク質を抗体にコンジュゲートしてもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびフィコビリンタンパク質ならびにこれらの誘導体が挙げられる。蛍光タンパク質、特にフィコビリンタンパク質は、タンデム色素標識した標識試薬を作製するのに特に有用である。こうしたタンデム色素には、より大きなストークスシフトを得ることを目的とした蛍光タンパク質およびフルオロフォアがあり、発光スペクトルが蛍光タンパク質の吸収スペクトルの波長からさらにシフトする。

【0076】

ある態様では、標識は放射性同位元素である。好適な放射性物質として、ヨウ素（¹²¹Ｉ、¹²³Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ）、炭素（¹⁴Ｃ）、硫黄（³⁵Ｓ）、トリチウム（³Ｈ）、インジウム（¹¹¹Ｉｎ、¹¹²Ｉｎ、¹¹³ｍＩｎ、¹¹⁵ｍＩｎ）、テクネチウム（⁹⁹Ｔｃ、⁹⁹ｍＴｃ）、タリウム（²⁰¹Ｔｉ）、ガリウム（⁶⁸Ｇａ、⁶⁷Ｇａ）、パラジウム（¹⁰³Ｐｄ）、モリブデン（⁹⁹Ｍｏ）、キセノン（¹³⁵Ｘｅ）、フッ素（¹⁸Ｆ）、¹⁵³ＳＭ、¹⁷⁷Ｌｕ、¹⁵⁹Ｇｄ、¹⁴⁹Ｐｍ、¹⁴⁰Ｌａ、¹⁷⁵Ｙｂ、¹⁶⁶Ｈｏ、⁹⁰Ｙ、⁴⁷Ｓｃ、¹⁸⁶Ｒｅ、¹⁸⁸Ｒｅ、¹⁴²Ｐｒ、¹⁰⁵Ｒｈおよび⁹⁷Ｒｕがあるが、これに限定されるものではない。

【0077】

いくつかの態様では、薬剤を抗体にコンジュゲートしてもよい。たとえば、ｓｃＦｖを含む抗体は、心血管疾患および／または急性冠症候群の治療のための薬剤にコンジュゲートしてもよい。

【0078】

ある特徴では、薬剤および他の分子が、部位特異的なコンジュゲーションにより抗体を標的としてもよい。たとえば、抗体は、コンジュゲーション反応のための遊離チオール基が得られるシステイン操作ドメイン（結合ユニットおよび／またはＦｃドメインに導入されたシステインを含む）を含んでもよい。ある態様では、特異的なコンジュゲーション部位を組み込むように抗体が操作される。

【0079】

抗体をコードする核酸分子
本開示は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を提供する。本開示の一態様は、本明細書に具体的に記載される抗体のいずれかをコードする核酸分子を提供する。核酸分子は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードし得る。

【0080】

いくつかの態様では、抗体は、ＦａｂまたはｓｃＦｖであり、ここで、ＦａｂまたはｓｃＦｖをコードする核酸部分は、ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列およびＶＨをコードするヌクレオチド配列を含み、ＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列は、フレキシブルポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列によりＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列に任意に連結される。

【0081】

さらなる態様は、本明細書に記載の核酸分子のいずれかで形質転換された宿主細胞を提供する。本開示の別の態様では、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞が提供される。一態様では、宿主細胞は、２つ以上のベクターを含み得る。

【0082】

本開示は、本開示のいずれかの抗体、ならびに抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコードする核酸分子を想定している。たとえば、本開示は、配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、配列番号７２、配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７の１つまたは複数をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を想定している。本開示は、さらなる領域（たとえば、Ｆｃまたは修飾Ｆｃ）をさらに含む本開示のいずれかの抗体をコードする核酸分子をさらに想定している。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６の１つまたは複数から選択され得る。さらなる実施形態では、本開示は、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６の１つまたは複数から選択される核酸分子を含むベクターを提供する。

【0083】

抗体、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖを産生するための方法
本開示は、本明細書に記載の抗体およびそのフラグメントを産生するための方法を提供する。いくつかの態様では、チカグレロルならびに本明細書に開示されるチカグレロルおよび／またはＴＡＭの特定のエピトープを認識する抗体の抗原結合フラグメントは、当業者に公知の任意の技術によって生成され得る。たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）₂フラグメントは、パパインなどの酵素（Ｆａｂフラグメントを産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを産生するため）を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって抗体から産生され得る。さらに、本明細書に記載のｓｃＦｖおよびＦａｂを含む抗体は、当該技術分野において公知の様々なファージディスプレイ方法を用いて生成され得る。

【0084】

概して、ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリー（たとえば、リンパ系組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に組み換えられ、ファージミドベクター中にクローニングされる。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中にエレクトロポレーションされ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ヘルパーファージに感染する。これらの方法に使用されるファージは、ｆｄを含む繊維状ファージであってもよく、Ｍ１３およびＶＨおよびＶＬドメインは、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組み換えにより融合され得る。チカグレロルおよび／またはＴＡＭに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、たとえば、標識された抗原あるいは固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて選択または同定され得る。同様に、チカグレロルおよび／またはＴＡＭに加えてまたはそれ以外に抗原／ハプテンに結合する結合ドメインが、除外（ｄｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）のために同定され得る。本発明の抗体を作製するのに使用され得るファージディスプレイ方法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９１／Ｏ１ １３４号明細書；ＰＣＴ公開番号国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、国際公開第９１／１０７３７号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９３／１１２３６号パンフレット、国際公開第９５／１５９８２号パンフレット、国際公開第９５／２０４０１号パンフレット、および国際公開第９７／１３８４４号パンフレット；および米国特許第５，６９８，４２６号明細書、同第５，２２３，４０９号明細書、同第５，４０３，４８４号明細書、同第５，５８０，７１７号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，７５０，７５３号明細書、同第５，８２１，０４７号明細書、同第５，５７１，６９８号明細書、同第５，４２７，９０８号明細書、同第５，５１６，６３７号明細書、同第５，７８０，２２５号明細書、同第５，６５８，７２７号明細書、同第５，７３３，７４３号明細書および同第５，９６９，１０８号明細書に開示されるものが挙げられ；これらの文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。

【0085】

上記の参照文献に記載されるように、ファージの選択後、ファージに由来する領域をコードする抗体は、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の他の所望の抗原結合フラグメント（ｓｃＦｖおよびＦａｂ）を生成するために、単離され、使用され、たとえば、後述されるような、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを組み換えにより生成するための技術はまた、ＰＣＴ公開番号国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４－８６９；Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＡＪＲＩ ３４：２６－３４；およびＢｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１－１０４３（前記参照文献は、全体が参照により援用される）に開示されるものなど、当該技術分野において公知の方法を用いて利用され得る。

【0086】

ある態様では、本明細書に開示される核酸を発現コンストラクトの１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。抗体の軽鎖および重鎖をコードする核酸配列は、任意の配向（たとえば、軽鎖が重鎖の前またはその逆）で同じ発現ベクターにクローニングしてもよく、あるいは２つの異なるベクターにクローニングしてもよい。１つのベクターを用いて発現を行う場合、２つのコーディング遺伝子は、それ自体の遺伝子エレメント（たとえば、プロモーター、ＲＢＳ、リーダー、停止、ポリＡなど）を有していてもよく、あるいは１セットの遺伝子エレメントでクローニングしてもよいが、シストロンエレメントに連結する。調節ヌクレオチド配列は一般に、発現に使用される宿主細胞に適切なものとする。種々の宿主細胞に適切な発現ベクターおよび好適な調節配列の多くの種類が当該技術分野において公知である。典型的には、前記１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列として、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始および終結配列、翻訳開始配列および終結配列、ならびにエンハンサーまたはアクチベーター配列を挙げることができるが、これに限定されるものではない。本開示は、当該技術分野において公知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを意図している。プロモーターは、天然プロモーターでも、あるいは２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターでもよい。発現コンストラクトは細胞のエピソーム、たとえばプラスミド上に存在してもよく、あるいは発現コンストラクトを染色体に挿入してもよい。

【0087】

ある態様では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択可能なマーカー遺伝子は当該技術分野において周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。ある態様では、本開示は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつ少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結された発現ベクターに関する。調節配列は当該技術分野で知られており、コードされたポリペプチドの発現を誘導するように選択される。したがって、調節配列という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。例示的かつ非限定的な調節配列については、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載される。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択および／または発現が望まれるタンパク質の種類のような要因によって異なることがあることを理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を制御する能力、およびベクターによりコードされた他の任意のタンパク質、たとえば抗生物質マーカーの発現も考慮すべきである。

【0088】

本開示の抗体を産生するための方法は、たとえば、抗体をコードする１つまたは２つ以上の発現ベクター（たとえば、重鎖および軽鎖またはその可変領域をコードする単一のベクター、または１つが重鎖をコードし、１つが軽鎖またはその可変領域をコードする２つのベクター）をトランスフェクトした宿主細胞を適切な条件下で培養して抗体の発現が起こるようにし得ることを含み得る。抗体を分泌させ、抗体を含有する細胞と培地との混合物から単離してもよい。あるいは、抗体を細胞質または膜画分に保持し、細胞を採取、溶解してタンパク質を単離してもよい。細胞培養物は、宿主細胞、培地および他の副産物を含む。細胞培養に好適な培地は当該技術分野において周知である。イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、およびイムノアフィニティ精製を含む、タンパク質、抗体、およびその抗原結合抗体フラグメントを精製するための当該技術分野において公知の技術を用いて、抗体を細胞培養基、宿主細胞、または両方から単離してもよい。ある態様では、抗体は、溶解度を高め、精製を容易にし得る重鎖および軽鎖可変領域を含む抗体の抗原結合フラグメントとして作製される。

【0089】

クローン化遺伝子またはその一部を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫または哺乳動物）あるいは両方の発現に好適なベクターにライゲートして組換え核酸を作製してもよい。組換えポリペプチドを産生する発現媒体には、プラスミドおよび他のベクターがある。たとえば、好適なベクターとして、原核細胞、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用の下記の種類のプラスミド：ｐＢＲ３２２由来のプラスミド、ｐＥＭＢＬ由来のプラスミド、ｐＥＸ由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ由来のプラスミドおよびｐＵＣ由来のプラスミドが挙げられる。ある態様では、哺乳動物発現ベクターは、細菌においてベクターを伝播しやすくする原核生物配列および真核細胞に発現する１つまたは複数の真核生物転写ユニットの両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ由来、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ由来、ｐＲｃ／ＣＭＶ由来、ｐＳＶ２ｇｐｔ由来、ｐＳＶ２ｎｅｏ由来、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ由来、ｐＴｋ２由来、ｐＲＳＶｎｅｏ由来、ｐＭＳＧ由来、ｐＳＶＴ７由来、ｐｋｏ－ｎｅｏ由来およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに好適な哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの一部は、細菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２由来の配列で修飾して、原核生物細胞および真核細胞の両方において複製および薬剤耐性選択を行いやすくする。あるいは、真核細胞におけるタンパク質の一過性発現には、ウイルス、たとえばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ－１）またはエプスタインバーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来およびｐ２０５）の誘導体を使用してもよい。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換に使用される様々な方法は、当該技術分野において周知である。原核細胞および真核細胞の両方に好適な他の発現系の他、一般的な組換え手順については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７を参照されたい。場合によっては、組換えポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の使用により発現させると望ましい場合がある。そうしたバキュロウイルス発現系の例として、ｐＶＬ由来のベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来のベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来のベクター（β－ｇａｌを含むｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ）が挙げられる。

【0090】

融合遺伝子を作製するための技術はよく知られている。基本的に、異なるポリペプチド／抗体配列をコードする様々な核酸フラグメントの連結は、ライゲーションのための平滑末端または付着末端、適切な末端を与える制限酵素消化、必要に応じて付着末端の平滑化、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを利用して従来の技術により行われる。別の態様では、融合遺伝子は、自動ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成してもよい。あるいは、アンカープライマーを用いて遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行ってもよく、２つの連続した核酸フラグメント間に相補的オーバーハングを形成し、その後これをアニールしてキメラ遺伝子配列を得てもよい（たとえば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。

【0091】

いくつかの態様では、本明細書に記載される核酸のいずれかを発現する発現ベクターを使用して宿主細胞に抗体を発現させてもよい。たとえば、抗体は、細菌細胞、たとえばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（たとえば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母または哺乳動物細胞に発現させてもよい。他の好適な宿主細胞も当業者に知られている。

【0092】

従来の技術により発現ベクターを宿主細胞に移動したら、次いで従来の技術によりトランスフェクト細胞を培養して抗体を産生させる。このため、本開示は、抗体またはそのフラグメントをコードし、異種プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を含む。ある態様では、全抗体の発現のため、重鎖および軽鎖および／または重鎖および軽鎖可変領域の両方を宿主細胞に（同一または異なるベクターから）共発現させてもよい。ある態様では、抗体の重鎖および軽鎖の両方を単一のプロモーターから発現させる。ある態様では、抗体の重鎖および軽鎖を複数のプロモーターから発現させる。ある態様では、抗体の重鎖および軽鎖は単一のベクターにコードされる。ある態様では、抗体の重鎖および軽鎖は複数のベクターにコードされる。

【0093】

組換え抗体の発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当該技術分野において周知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手できる多くの不死化細胞株、以下に限定されるものではないが、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト腎臓上皮２９３細胞、およびいくつかの他の細胞株がある。各宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系を選択すれば、発現される抗体またはその一部の正しい修飾およびプロセシングを確実なものにすることができる。この目的のため、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核宿主細胞を使用してもよい。こうした哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＹ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２Ｏ細胞およびＴ４７Ｄ細胞、ＮＳ０細胞（機能的免疫グロブリン鎖を内因性にまったく産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＳＰ２０細胞、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ細胞およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞があるが、これに限定されるものではない。一態様では、ヒトリンパ球の不死化により開発されたヒト細胞株を使用して組換え技術によりモノクローナル抗体を産生させてもよい。一態様では、ヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して組換え技術によりモノクローナル抗体を産生してもよい。

【0094】

組換え抗体の発現用の宿主として使用してもよい別の細胞株には、昆虫細胞（たとえばＳｆ２１／Ｓｆ９、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）Ｂｔｉ－Ｔｎ５ｂ１－４）または酵母細胞（たとえばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、米国特許第７，３２６，６８１号明細書；など）、植物細胞（米国特許出願公開第２００８００６６２００号明細書）；およびニワトリ細胞（国際公開第２００８１４２１２４号パンフレット）があるが、これに限定されるものではない。

【0095】

ある態様では、本開示の抗体は細胞株に安定発現させる。安定発現は、組換えタンパク質、抗体およびその抗原結合フラグメントを長期間高い収率で産生するために使用してもよい。たとえば、抗体分子を安定発現する細胞株を作製してもよい。発現制御エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカー遺伝子を含む適切に設計されたベクターで宿主細胞を形質転換してもよい。外来ＤＮＡの導入後、細胞を濃縮培地で１～２日間増殖させてから、選択培地に切り換えてもよい。組換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、染色体にプラスミドを安定に組み込んだ細胞を増殖させて細胞増殖巣を形成させ、次にこれをクローニングにし、細胞株として増殖させてもよい。高収率で安定な細胞株を作製するための方法は当該技術分野において周知であり、試薬は一般に市販されている。

【0096】

ある態様では、本開示の抗体を細胞株に一過性に発現させる。一過性トランスフェクションは、細胞に導入された核酸がその細胞のゲノムまたは染色体ＤＮＡに組み込まれないプロセスである。実際、核酸は細胞内に染色体外エレメント、たとえばエピソームとして維持される。エピソームの核酸の転写プロセスは影響を受けず、エピソームの核酸によりコードされたタンパク質が産生される。

【0097】

細胞株は、安定なトランスフェクションあるいは一過性トランスフェクションを問わず、細胞培養基にモノクローナル抗体の発現および産生につながる当該技術分野において周知の条件で維持される。ある態様では、哺乳動物細胞培養基は、たとえば、ＤＭＥＭまたはＨａｍ’ｓ Ｆ１２を含む市販されている培地（ｍｅｄｉａ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）に基づく。他の態様では、細胞増殖および生物学的タンパク質発現の両方の増加を支援するように細胞培養基を改変する。本明細書で使用する場合、「細胞培養基」、「培養基」および「培地（ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」という用語は、多細胞生物または組織の外側の人工的なインビトロ環境で細胞を維持、成長、伝播または増殖するための栄養液をいう。細胞培養基は、たとえば、細胞増殖を促進するように処方された細胞培養増殖培地、または組換えタンパク質の産生を促進するように処方された細胞培養産生培地を含む特定の細胞培養用途に最適化してもよい。栄養素、成分および要素という用語は、本明細書において同義で使われ、細胞培養基を構成する成分をいう。

【0098】

分子が産生されたら、分子を免疫グロブリン分子またはそのフラグメントを精製するための当該技術分野において公知の任意の方法により、たとえば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー（特に特異的な抗原プロテインＡまたはプロテインＧに対する親和性による）、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質、抗体、および／または抗体フラグメントの精製のための他の任意の標準的技術により精製してもよい。さらに、本開示の分子またはそのフラグメントは、上述あるいはそれ以外の当該技術分野において公知の異種ポリペプチド配列（本明細書で、ヒスチジンタグなどの「タグ」という）と融合して精製しやすくしてもよい。

【0099】

組換え技術を用いる場合、分子は、細胞内のペリプラズムに産生させても、あるいは培地に直接分泌させてもよい。分子を細胞内に産生させる場合、第１のステップとして、たとえば、遠心分離または限外濾過により、宿主細胞または溶解フラグメントを問わず、微粒子状の破片を除去する。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３－１６７（１９９２）には、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズムに分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。分子を培地に分泌させる場合、市販されているタンパク質濃縮フィルター、たとえば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過装置を用いて、そうした発現系の上清を最初に濃縮するのが一般的である。プロテアーゼ阻害剤、たとえばＰＭＳＦを前述のステップのいずれかに含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来汚染物質の増殖を防止してもよい。

【0100】

細胞から調製された組成物は、たとえば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および／またはアフィニティークロマトグラフィーを単独あるいは他の精製ステップと組み合わせて精製してもよい。プロテインＡの親和性リガンドとしての適合性は、分子に任意の免疫グロブリンＦｃドメインが存在する場合、その種およびアイソタイプに依存し、その適合性は当業者に理解されるであろう。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用できる。機械的に安定なマトリックス、たとえばコントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンを用いると、アガロースで達成できるよりも流速を速くし処理時間を短縮することができる。回収される分子に応じてタンパク質精製の他の技術、たとえばイオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）を用いたセファロースクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿も利用することができる。

【0101】

任意の予備精製ステップ後、目的の分子および汚染物質を含む混合物は、ｐＨ約２．５～４．５の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付し、低塩濃度（たとえば、約０～０．２５Ｍ塩）で行ってもよい。

【0102】

抗体は、たとえば、上記および／または実施例に記載の技術の任意の１つまたは組み合わせを用いて作製および精製してもよい。どのように抗体を精製するかにかかわらず、本開示の抗体の機能的結合を確認するため、結合アッセイ（精製の前および／または後）を行ってもよい。たとえば、二重ＥＬＩＳＡアッセイを使用してもよい。いくつかの態様では、第１の抗原（たとえば、チカグレロルまたはその競合品）をウェルにコートし、この抗原に結合すると、検出に備えて抗体が固定化される。

【0103】

医薬製剤
ある態様では、本開示は医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、抗体をコードする核酸分子を含む組成物であってもよい。また、こうした医薬組成物は、抗体または抗体の組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物であってもよい。ある態様では、本開示の医薬組成物は薬物として使用される。

【0104】

ある態様では、抗体または抗体の組み合わせ（または抗体または抗体の組み合わせをコードする核酸分子）を薬学的に許容されるキャリア、賦形剤または安定剤と共に医薬組成物として製剤化してもよい。ある態様では、こうした医薬組成物は、当該技術分野において公知の方法を用いて任意の１つまたは複数の投与経路を介してヒトまたは非ヒト動物に投与するのに好適である。当業者であれば理解するように、経路および／または投与モードは所望の結果によって異なる。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を阻害しない１種または複数種の無毒性材料を意味する。こうした調製物は通常、塩、緩衝剤、防腐剤、相性のよいキャリアおよび任意に他の治療薬を含んでもよい。こうした薬学的に許容される調製物は、相性のよい固体もしくは液体充填剤、希釈液またはヒトへの投与に好適なカプセル化材料をさらに含んでもよい。本明細書に記載の製剤に利用してもよい他の意図しているキャリア、賦形剤および／または添加剤には、たとえば、着香剤、抗菌剤、甘味料、酸化防止剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤、たとえば血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン、塩形成対イオン、たとえばナトリウムおよび同種のものがある。これらおよび本明細書に記載の製剤に使用するのに好適な別の公知の薬学的キャリア、賦形剤および／または添加剤については、たとえば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１^st ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）、および「Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ」、６０^th ｅｄ．，Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．（２００５）に記載されているように当該技術分野において公知である。所望または要求される投与モード、溶解性および／または安定性に好適な薬学的に許容されるキャリアを選択すればよい。

【0105】

本明細書に記載の製剤は、所望の投与に適切なｗ／ｖが得られる濃度で有効剤（たとえば、ＦａｂまたはｓｃＦｖなどの抗体または抗体フラグメント）を含む。ある態様では、有効剤は、約１ｍｇ／ｍｌ～約２００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌまたは約１ｍｇ／ｍｌ～約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤に存在する。ある態様では、有効剤は約２５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。ある態様では、製剤における有効剤の濃度は、約０．１～約１００重量％の範囲であってもよい。ある態様では、有効剤の濃度は、０．００３～１．０モルの範囲である。

【0106】

一態様では、本開示の製剤は、エンドトキシンおよび／または関連する発熱性物質を実質的に含まないパイロジェンフリー製剤である。エンドトキシンには、微生物内部に閉じ込められているトキシンがあり、微生物が破壊されるかまたは死んだときにのみ放出される。発熱性物質には、細菌および他の微生物の外膜由来の、発熱を引き起こす耐熱性物質（糖タンパク質）がある。これらの物質はどちらも、ヒトに投与される場合、発熱、低血圧およびショックを引き起こす恐れがある。有害作用の可能性があるため、少量のエンドトキシンでも静脈内投与される医薬品溶液から除去しなければならない。食品医薬品局（「ＦＤＡ」）は、静脈内薬剤投与の場合、１回につき体重１キログラム当たり１回１時間以内に５エンドトキシン単位（ＥＵ）の上限を設定している（Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｆｏｒｕｍ ２６（１）：２２３（２０００））。ある特定の態様では、組成物におけるエンドトキシンおよび発熱性物質のレベルは１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。

【0107】

本開示の製剤は、インビボ投与に使用する場合、無菌にすべきである。本開示の製剤は、無菌化濾過、放射線などを含む様々な滅菌方法により滅菌することができる。一態様では、滅菌済０．２２ミクロンフィルターで製剤を濾過滅菌する。注射用無菌組成物は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２１^st ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２００５）に記載されているような従来の医療慣行に従い、製剤化してもよい。

【0108】

本開示の治療用組成物は、経口投与、経鼻投与、経肺投与、局所（頬粘膜および舌下など）投与、直腸投与、経膣投与および／または非経口投与など特定の投与経路用に製剤化してもよい。「非経口投与」および「非経口投与する」という語句は、本明細書で使用する場合、経腸投与および局所投与以外の通常注射による投与モードをいい、以下に限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄膜内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入がある。局所投与または経皮投与に好適な本開示の製剤には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、溶液剤、パッチ剤および吸入剤がある。抗体は、滅菌条件下で薬学的に許容されるキャリア、および必要とされる場合がある任意の防腐剤、緩衝液または噴霧剤と混合してもよい（米国特許第７，３７８，１１０号明細書；同第７，２５８，８７３号明細書；同第７，１３５，１８０号明細書；米国特許出願公開第２００４－００４２９７２号明細書；および同第２００４－００４２９７１号明細書）。

【0109】

製剤は、単位剤形で提供すると都合がよいことがあり、薬学の技術分野において公知の任意の方法により調製することができる。本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、個々の患者に毒性がなく、患者、組成物および投与モードに求められる治療反応を達成するのに効果的な活性成分の量（たとえば、「治療有効量」）を得られるように変化させてもよい。選択される投与量レベルは、利用する特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用している特定の化合物の排泄速度、処置の期間、他の薬剤、利用する特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および／または材料、処置されている患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態および既往歴、および医療技術分野でよく知られている同様の因子など種々の薬物動態学的因子によって異なる。好適な投与量は、約０．０００１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重以上、たとえば約０．１ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよく、約１～約１０ｍｇ／ｋｇ体重が好適である。

【0110】

本開示は同様に、診断および研究用途に好適な製剤を製造することも意図していることに留意されたい。こうした製剤の有効剤の濃度の他、賦形剤および／または発熱性物質の有無は、個々の用途および使用目的に基づき選択することができる。

【0111】

使用
本明細書に開示される抗体は、血小板活性化、凝集および脱顆粒の阻害剤、血小板脱凝集の促進剤、および抗血栓剤の活性を中和するための、併用療法を含む治療方法に有用である。このため、本明細書に記載の抗体は、チカグレロルの投与（併用方法（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を含む）に関連するいくつかの用途があり、チカグレロルおよび／またはチカグレロルの１つまたは複数の代謝産物の効果を中和するのに好適に有用である。このような方法では、抗体は、任意に可逆的に、チカグレロルの活性を低下させ、中和し、なくし、または阻害し、チカグレロル投与に関連し、および／またはチカグレロルを含む治療から生じるいくつもの作用、障害および／または症状を治療または予防することができる。

【0112】

抗体は、たとえば、不安定狭心症、血栓性脳卒中または塞栓性脳卒中などの、アテローム性動脈硬化症の主要な動脈血栓性合併症、一過性脳虚血発作、末梢血管疾患、血栓溶解を伴うかまたは伴わない心筋梗塞、冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）、動脈内膜切除術、ステント留置術、冠動脈および他の血管移植手術を含む、血管形成などのアテローム性動脈硬化症への介入に起因する動脈合併症（ａｒｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、事故による外傷または手術による外傷、皮膚および筋肉弁を含む再建手術の後の組織サルベージなどの手術の損傷または機械的損傷の血栓性合併症、播種性血管内凝固などのびまん性血栓症／血小板消費構成要素を伴う病態、血栓性血小板減少性紫斑病、溶血性尿毒症症候群、敗血症の血栓性合併症、成人呼吸窮迫症候群、抗リン脂質抗体症候群、ヘパリン起因性血小板減少症および子癇前症／子癇、または深部静脈血栓症、静脈閉塞性疾患などの静脈血栓症、血小板血症を含む骨髄増殖性疾患、鎌状赤血球病などの血液疾患を含む、チカグレロル（ＢＲＩＬＩＮＴＡ）が治療可能な、および／または適応とされる（treatable and/or indicated for ticagrelor）適応症について、治療をされているか、または治療または予防の必要がある患者；あるいは心肺バイパスおよび膜型人工肺などのインビボで機械的に誘発される血小板活性化の予防（微小血栓の予防）、血液製剤、たとえば濃縮血小板の保存時の使用、または腎臓透析および血漿交換などにおけるシャント閉塞などの機械的に誘発されるインビトロの血小板活性化、脈管炎、動脈炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患および臓器移植拒絶などの、血管損傷／炎症に続発する血栓症、片頭痛などの病態の予防中の患者に投与され得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗体は、チカグレロルを含む治療を受けているかまたは受けた患者、および冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）、心臓胸郭部手術、縦隔再検査（ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｒｅ－ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ）、術後脳卒中、機械的人工換気、集中治療室での長期入院、緊急の心臓以外の手術、たとえば、神経学的または眼科的手術、脊髄手術、頭蓋内手術、眼窩手術、整形外科手術、腎摘出術、半結腸切除術などに関連する出血または潜在的出血の治療の必要がある患者、または今後治療が必要になる患者に投与され得る。したがって、本明細書に提供される方法は、チカグレロルとの併用治療として（同時に）、またはチカグレロル投与の（たとえば、数分、数時間、または数日）後の所定の期間内の抗体の投与を包含し得る。たとえば、いくつかの実施形態では、本方法は、チカグレロル投与の１０～１２０分以内の、チカグレロルを投与された患者への抗体の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、チカグレロル投与の１～４８時間以内の、チカグレロルを投与された患者への抗体の投与を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、被験体からのチカグレロルおよび／またはその代謝産物の代謝および除去を可能にしないであろう時間内に、チカグレロルを投与された被験体に投与される。

【0114】

いくつかの実施形態では、本開示は、患者における（Ｐ２Ｙ₁₂）受容体に対する、チカグレロル、またはその活性代謝産物の影響を阻害する方法を提供する。

【0115】

いくつかの実施形態では、本開示は、患者におけるＰ２Ｙ₁₂受容体に対する、チカグレロル、またはその活性代謝産物の結合を阻害する方法を提供する。

【0116】

いくつかの実施形態では、本開示は、チカグレロルを投与された患者におけるＡＤＰ誘導性血小板凝集を活性化する方法を提供する。

【0117】

実施例に例示されるものなどの、本開示の抗体はまた診断を目的として使用してもよい。たとえば、被検体におけるチカグレロルの血中量を決定またはスクリーニングするため、被検体の組織または細胞において１つまたは複数の標的剤（チカグレロルまたはその代謝産物）を検出してもよい。診断キットは、１つまたは複数の抗体、および抗体とチカグレロルまたはその代謝産物との反応がある場合にそれを知らせる検出系を含んでもよい。

【0118】

したがって、本開示は、治療用途、診断用途および研究用途を含む抗体の多くの用途を意図している。診断用途および研究用途はインビボでも、あるいはエキソビボでもよい。

【0119】

キット
本開示の別の態様はキットである。一態様では、キットは、上述の核酸、抗体、発現ベクターまたは宿主細胞の組成物または医薬組成物のいずれか、および適切な使用または投与を指示する説明書またはラベルを含む。任意に、キットは、１つまたは複数の容器および／もしくはシリンジ、または送達もしくは使用を容易にする他の装置をさらに含んでもよい。本開示は、研究アッセイ、診断アッセイを行うための、および／または治療有効量の投与を行うための要素の全サブセットまたは任意のサブセットがキットに入れられていてもよいことを意図している。同様に、キットは、たとえば本開示の抗体をコードする核酸を好適な条件下で発現する宿主細胞を培養して、抗体を作製するための説明書を含んでもよい。別の例として、本開示の抗体の治療投与用のキットは、抗体の医薬製剤を含む溶液または抗体の凍結乾燥調製物と、組成物の投与を必要とする患者に組成物を投与するための説明書および／または凍結乾燥物を再溶解するための説明書とを含んでもよい。特定の実施形態では、キットは、被検体への投与に適した製剤（たとえば、ＢＲＩＬＩＮＴＡ（商標）、ＢＲＩＬＩＱＵＥ（商標））中でチカグレロルをさらに含む。このような実施形態では、キットは、抗体、チカグレロル、または抗体およびチカグレロルの両方による治療を必要とする患者への、抗体およびチカグレロル製剤の両方の投与についての説明書をさらに含み得る。

【0120】

本開示はまた、パッケージ化され、ラベルが付けられた最終医薬製品を包含する。この製品は、適切な入れ物または容器、たとえばガラスバイアルまたは密封された他の容器に適切な単位剤形を含む。非経口投与に好適な剤形の場合、活性成分、たとえば、上述の抗体、および／またはチカグレロル製剤は無菌であり、粒子を含まない溶液としての投与に好適である。ある態様では、製剤は注射可能な投与経路に好適である。いくつかの実施形態では、投与は皮下投与である。いくつかの実施形態では、投与は静脈内投与である。このため、ヒトまたは動物への注入または点滴を含む投与経路が考えられる。

【0121】

特定の態様では、本開示の製剤は滅菌液として単回投与バイアルに処方される。例示的容器には、バイアル、ビン、プレフィルドシリンジ、ＩＶバッグ、ブリスターパック（１種または複数種の丸剤を含む）があるが、これに限定されるものではない。任意に、こうした容器には、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形式の注意書が添付されていてもよく、注意書は、ヒトの診断および／または投与のための製造、使用または販売に関する政府機関による承認を反映する。

【0122】

どのような医薬製品であっても、包装材料および容器は、保管および輸送中の製品の安定性を保護するように設計される。さらに、本開示の製品は、使用説明書、または対象の疾患または障害を適切に予防または処置する方法について医師、技術者または患者に助言する他の情報資料を含む。言い換えれば、製品は、投与レジメン、以下に限定されるものではないが、実際の用量、モニタリング手順など、および他のモニタリング情報を指示または推奨する指示手段を含む。

【0123】

診断アッセイ用のキットは、本開示の抗体を含む溶液または抗体の凍結乾燥調製物を含んでもよく、抗体はチカグレロルおよび／またはその代謝産物の他、そうした抗体を検出するための試薬に特異的に結合する。抗体は、当該技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法により標識してもよく、以下に限定されるものではないが、小分子蛍光タグなどの標識、ビオチン、ＧＦＰもしくは他の蛍光タンパク質などのタンパク質、またはｈｉｓもしくはｍｙｃなどのエピトープ配列がある。同様に、キットには、抗体の検出に使用される一次抗体を含めてもよい。一次抗体は、抗体上の配列または抗体を標識した標識、タグ、もしくはエピトープを標的としてもよい。一次抗体は検出のために標識されていてもよく、あるいは一次抗体は、さらなるシグナルの増幅が求められる場合、やはりキットに含まれていてもよい二次抗体により検出されてもよい。

【0124】

また、研究用途のキットも考慮されている。このようなキットは、たとえば、診断用途または治療用途向けのキットに類似していてもよいが、キットおよびその用途が研究目的のみに限定されることを明記するラベルをさらに含む。

【実施例】

【0125】

略語のリスト
略語 説明
ＡＣＮ アセトニトリル
ｂｒ ブロード
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
ＣＶ カラム体積
ｄ 二重項
ｄｄ 二重項の二重項
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＢＳ ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
ＥＤＣ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＦＡ ギ酸
ＨＯＡｃ 酢酸
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー
ＨＲＭＳ 高分解能質量分析法
ＨＴＳ ハイスループットスクリーニング
ＨＴＲＦ（登録商標） 均一性時間分解蛍光法
ＨＹＦＬＯ（登録商標） 炭酸ナトリウムで処理され、フラックス焼成された濾過助剤
Ｈｚ ヘルツ
Ｊ 結合定数
ＬＣ 液体クロマトグラフィー
ｍ 多重項
ＭＳ 質量スペクトル
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＯＡｃ アセテート
Ｐｄ／Ｃ パラジウム炭素
ｐＭ ピコモル
ＰＫ／ＰＤ 薬物動態／薬力学
ＫＦ フッ化カリウム
ｑ 四重項
ｒ．ｔ． 室温
ｓ 一重項
ｓａｔ． 飽和
ｓｃＦｖ 単鎖可変フラグメント
ｔ 三重項
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＢＭＥ ｔｅｒｔ－ブチルメチルエーテル
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＩＭ チカグレロル不活性代謝産物
ＴＬＣ 薄層クロマトグラフィー
ＴＲ－ＦＲＥＴ 時間分解蛍光共鳴エネルギー移動

【0126】

実施例１：ハプテンの調製および特性評価
この実施例は、本明細書に記載の例示的な抗体を生成するのに使用したいくつかのハプテンの合成、最適化、単離、および特性評価の方法を記載する。ハプテンは、チカグレロル、チカグレロル代謝産物（ＴＡＭおよびＴＩＭ）、ビオチン化チカグレロル、およびビオチン化アデノシンを含む（たとえば、非ビオチン化形態の化学的ハプテン構造については図２を参照されたい）。チカグレロルを、国際特許公報国際公開第２０００／０３４２８３号パンフレット（Ｇｕｉｌｅ，ｅｔ ａｌ．，２０００）に記載されるように合成し、ＴＡＭを、国際特許公報国際公開第１９９９／００５１４３号パンフレット（Ｇｕｉｌｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）に記載されるように合成し、これらの文献はそれぞれ、全体が参照により援用される。

【0127】

順相クロマトグラフィーを、Ｂｉｏｔａｇｅシリカゲル４０Ｓ、４０Ｍ、１２ｉまたはＭｅｒｃｋシリカゲル６０（０．０６３～０．２００ｍｍ）を用いて行った。フラッシュ－クロマトグラフィーを、標準的なガラス－またはプラスチック－カラムのいずれかを用いてまたはＢｉｏｔａｇｅ Ｈｏｒｉｚｏｎシステムにおいて行った。化学シフトが、内部標準として溶媒を用いてｐｐｍで示される。ＮＨおよびＯＨプロトンなどのヘテロ原子上のプロトンは、ＮＭＲで検出されたときのみ報告されるため、記載がない場合がある。

【0128】

実施例１．１：ビオチン化チカグレロル
Ｎ－（２－（（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－４－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－２，３－ジヒドロキシシクロペンチル）オキシ）エチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド（１．１）

【化10】

（ｉ）２－（（（３ａＲ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＳ）－６－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）オキシ）エチルメタンスルホネート（１．ａ）の調製

【化11】

【0129】

メタンスルホニルクロリド（０．０８６ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌ）を、０℃でＤＣＭ（５ｍＬ）中の２－（（（３ａＲ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＳ）－６－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）オキシ）エタノール（Ｓｐｒｉｎｇｔｈｏｒｐｅ，Ｂ．ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００７，１７，６０１３－６０１８を参照されたい）（０．５６３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．２０９ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。混合物を３時間にわたって０℃～約５℃で撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３０ｍＬ）で希釈し、水（５ｍＬ）で洗浄した。混合物を、相分離器に通すことによって乾燥させた。溶媒の蒸発およびトルエンからの同時蒸発により、表題化合物（１．ａ）（７１４ｍｇ、１１１％）が黄色の高粘度の油として得られ、それをさらに精製せずに使用した。

【0130】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ １．０２（ｄｄ，３Ｈ）、１．３－１．４７（ｍ，５Ｈ）、１．５５（ｓ，３Ｈ）、１．７２（ｄ，２Ｈ）、２．２０（ｄ，１Ｈ）、２．６－２．７１（ｍ，２Ｈ）、２．９７（ｓ，３Ｈ）、３－３．１９（ｍ，３Ｈ）、３．５７－３．６８（ｍ，１Ｈ）、３．６９－３．７９（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｔｄ，１Ｈ）、４．１３－４．２４（ｍ，２Ｈ）、４．７８（ｄｄ，１Ｈ）、５．１３（ｔｄ，１Ｈ）、５．５７（ｓ，１Ｈ）、６．５０（ｓ，１Ｈ）、７．０３（ｓ，１Ｈ）、７．０７－７．１６（ｍ，２Ｈ）．

【0131】

¹⁹Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ －１４１．３７（Ｊ＝２１．３）、－１３８．１０（Ｊ＝２１．３）．

【0132】

（ｉｉ）３－（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＲ）－６－（２－アジドエトキシ）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－Ｎ－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－７－アミン（１．ｂ）の調製

【化12】

ＤＭＦ（７ｍＬ）中の、２－（（（３ａＲ，４Ｓ，６Ｒ，６ａＳ）－６－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）オキシ）エチルメタンスルホネート（１．ａ）（０．６４１ｇ、１ｍｍｏｌ）と、アジ化ナトリウム（０．０７０ｍＬ、２．００ｍｍｏｌ）との混合物を、窒素雰囲気下で１５．５時間にわたって６０℃に加熱した。白色の沈殿物が形成された。水を加え（２０ｍＬ）、生成物をＴＢＭＥ（１００＋４０ｍＬ）で２回抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。有機相を濾過し、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、溶離剤としてヘプタン／ＥｔＯＡｃ １／１を用いた２×８ｃｍのシリカカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン／ＥｔＯＡｃ １／１を用いたＴＬＣ（Ｒｆ生成物＝０．５））によって精製した。関連する画分の収集および溶媒の蒸発により、表題化合物（１．ｂ）（５１４ｍｇ、８７％）が透明の高粘度の油として得られた。

【0133】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ １．００（ｓ，３Ｈ）、１．３３－１．４２（ｍ，５Ｈ）、１．５９（ｓ，３Ｈ）、１．７３（ｄ，２Ｈ）、２．１７（ｓ，１Ｈ）、２．６８（ｔ，２Ｈ）、２．９６－３．１７（ｍ，３Ｈ）、３．１９－３．３３（ｍ，２Ｈ）、３．５２－３．６３（ｍ，１Ｈ）、３．７２（ｄｄｄ，１Ｈ）、４．０３（ｔｄ，１Ｈ）、４．７９（ｄｄ，１Ｈ）、５．１３（ｔｄ，１Ｈ）、５．５４（ｄｄ，１Ｈ）、６．４３（ｓ，１Ｈ）、６．９６－７．２３（ｍ，３Ｈ）．

【0134】

（ｉｉｉ）中間体３－（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＲ）－６－（２－アミノエトキシ）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－Ｎ－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－７－アミン（１．ｃ）の調製

【化13】

ＥｔＯＨ（９９．５％）（２ｍＬ）中の３－（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＲ）－６－（２－アジドエトキシ）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－Ｎ－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－７－アミン（１．ｂ）（６２．０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を、Ｐｄ／Ｃ（５％のＰｄ、５０重量％のＰｄ／Ｃ、２２．４６ｍｇ、５．２８μｍｏｌ）に加え、混合物を２時間にわたって大気圧で水素化した。反応混合物をＨＹＦＬＯ（登録商標）に通して濾過し、プラグをＥｔＯＨ（９９．５％）でさらにすすいだ。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭ（２×２ｍＬ）に再溶解させ、溶媒を減圧下で除去した。残渣を、溶離剤としてＭｅＯＨ ９５／５中のＤＣＭ／ＮＨ₃（飽和）を用いた２×８ｃｍのシリカカラムにおけるフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。関連する画分の収集により、表題化合物（１．ｃ）（４１ｍｇ、６９％）が得られた。

【0135】

¹Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ ０．９８（ｍ，３Ｈ）、１．２８－１．４６（ｍ，７Ｈ）、１．５４（ｓ，３Ｈ）、１．６２－１．８１（ｍ，２Ｈ）、２．１５（ｓ，１Ｈ）、２．４８－２．８１（ｍ，４Ｈ）、３．０７（ｔｔ、３Ｈ）、３．３４－３．４７（ｍ，１Ｈ）、３．５３（ｄｄｄ，１Ｈ）、３．９９（ｔｄ，１Ｈ）、４．７９（ｄｄ，１Ｈ）、５．１２（ｔｄ，１Ｈ）、５．５２（ｄｄ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、７．０９（ｄｔ，２Ｈ）、７．２３（ｓ，１Ｈ）．

【0136】

¹⁹Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ、ＣＤＣｌ₃）δ －１４１．４３（Ｊ＝２１．３）、－１３８．１３（Ｊ＝２１．３）．

【0137】

（ｉｖ）中間体（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）－３－（２－アミノエトキシ）－５－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）シクロペンタン－１，２－ジオール（１．ｄ）の調製

【化14】

予め冷却された、氷／水浴温度で、ＴＦＡ（８ｍＬ、１０３．８４ｍｍｏｌ）と水（０．８８ｍＬ、４８．８５ｍｍｏｌ）との混合物を、３－（（３ａＳ，４Ｒ，６Ｓ，６ａＲ）－６－（２－アミノエトキシ）－２，２－ジメチルテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－Ｎ－（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－７－アミン（１．ｃ）（３４０ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）を含む予め冷却されたフラスコに加えた。反応混合物を０～５℃で１時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨＣＯ₃（飽和、１０ｍＬ）で洗浄した。塩水（５ｍＬ）を水相に加え、これをＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。濾過、続いて溶媒による蒸発により、粗生成物がオフホワイトの固体として得られた。化合物を、１００ｍＬ／分の流量で２０分間にわたって、Ｈ₂Ｏ／ＡＣＮ／ＮＨ₃ ９５／５／０．２緩衝液中３５～７５％のＡＣＮの勾配を用いて、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（１０μｍ ２５０×５０ ＩＤ ｍｍ）における分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物を、２９８ｎｍでＵＶによって検出した。ピーク画分を減圧下で蒸発乾固させた。残渣をＤＣＭに溶解させ、相分離器に通して濾過した。減圧下における溶媒の除去により、表題化合物（１．ｄ）（２１３ｍｇ、６７．５％）が得られた。ＬＣ－ＭＳ ｍ／ｚ ５２２．３（Ｍ＋Ｈ）⁺．

【0138】

（ｖ）化合物Ｎ－（２－（（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－４－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）－２，３－ジヒドロキシシクロペンチル）オキシ）エチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド．（１．１）の調製
２，５－ジオキソピロリジン－１－イル６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサノエート（２１．７７ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，５Ｒ）－３－（２－アミノエトキシ）－５－（７－（（（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル）アミノ）－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル）シクロペンタン－１，２－ジオール（２０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の溶液に加え、混合物を窒素雰囲気下に置き、室温で６時間撹拌した。溶媒を、４０℃で、減圧下で除去した。化合物を、１９ｍＬ／分の流量で２０分間にわたって、Ｈ₂Ｏ／ＡＣＮ／ＦＡ ９５／５／０．２緩衝液中２０～６０％のＡＣＮの勾配を用いたＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム（１０μｍ ２５０×２０ ＩＤ ｍｍ）における分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物を２９８ｎｍでＵＶによって検出した。ピーク画分を収集し、濃縮し、凍結乾燥させたところ、表題化合物（１．１）（２１．４ｍｇ、５７．３％）が得られた。

【0139】

¹Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ）：２つの回転異性体が存在する（比率５：１）、δ ０．８１（ｔ，３Ｈ）、１．１５－１．６４（ｍ，２０Ｈ）、２．０３（ｄｄｄ，７Ｈ）、２．１２（ｄｄｄ，１Ｈ）、２．５７（ｄ，１Ｈ）、２．５９－２．６７（ｍ，１Ｈ）、２．７７－２．８９（ｍ，２Ｈ）、２．９３（ｄｄ，１Ｈ）、２．９６－３．０１（ｍ，４Ｈ）、３．０５－３．１２（ｍ，１Ｈ）、３．１５（ｔｄ，１Ｈ）、３．１８－３．２５（ｍ，２Ｈ）、３．３９－３．４６（ｍ，１Ｈ）、３．４８（ｔｔ、１Ｈ）、３．７－３．７６（ｍ，１Ｈ）、３．９２（ｓ，１Ｈ）、４．０８－４．１４（ｍ，１Ｈ）、４．３０（ｄｄ，１Ｈ）、４．５４（ｄｄ，１Ｈ）、４．９５（ｑ，１Ｈ）、５．０６（ｓ，１Ｈ）、５．１３（ｄ，１Ｈ）、６．３５（ｓ，１Ｈ）、６．４２（ｓ，１Ｈ）、７．０７（ｄ，１Ｈ）、７．３１（ｄｄｔ，２Ｈ）、７．７１（ｄｔ，２Ｈ）、７．８２（ｔ，１Ｈ）、９．３６（ｄ，１Ｈ）における主回転異性体からのシグナル。δ ０．９８（ＣＨ₃）、８．９５（ＡｒＮＨ）における副回転異性体からの選択されたシグナル。

【0140】

［Ｃ４５Ｈ６５Ｆ２Ｎ１１Ｏ７Ｓ２］⁺についてのＨＲＭＳ計算値：９７４．４５５６；実測値：９７４．４５８５（Ｍ＋Ｈ）⁺

【0141】

実施例１．２：ビオチン化アデノシン
Ｎ－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド（１．２）

【化15】

（ｉ）Ｎ－（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド（１．ｅ）の調製

【化16】

ＤＭＦ（２ｍＬ）を、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサノエート（５５．６ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）および９－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（アミノメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）－９Ｈ－プリン－６－アミン（３０ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）に室温で加え（Ａｕｓｔｉｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｕ，Ｆ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．Ｌｅｔｔ．，２００１，３１５３－３１５４を参照されたい）、反応混合物を窒素雰囲気下に置き、１時間４５分間にわたって撹拌して、（１．ｅ）を得た。その後、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をさらに精製せずに使用した。ＬＣ－ＭＳ ｍ／ｚ ７５９（Ｍ＋Ｈ）⁺、７５７（Ｍ－Ｈ）^-．

【0142】

（ｉｉ）最終化合物Ｎ－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド（１．２）の調製
ＴＦＡ（１．８ｍｌ、２３．３６ｍｍｏｌ）と水（０．２ｍＬ、１１．１０ｍｍｏｌ）との混合物を、粗Ｎ－（（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）メチル）－６－（６－（５－（（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル）ペンタンアミド）ヘキサンアミド）ヘキサンアミド（１．ｅ）（７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）に加え、反応混合物を０℃で１時間２５分間にわたって撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＤＭＳＯに溶解させた。化合物を、１９ｍＬ／分の流量で２０分間にわたってＨ₂Ｏ／ＡＣＮ／ＮＨ₃ ９５／５／０．２緩衝液中５～４５％のＡＣＮの勾配を用いたＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（１０μｍ ２５０×１９ ＩＤ ｍｍ）における分取ＨＰＬＣによって精製した。化合物を２５９ｎｍでＵＶによって検出した。ピーク画分を濃縮し、凍結乾燥させたところ、表題化合物（１．２）（５０ｍｇ、６９．６％）が白色のふんわりした固体として得られた。

【0143】

¹Ｈ ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ、４０℃）δ １．１７－１．２６（ｍ，４Ｈ）、１．２７－１．４（ｍ，６Ｈ）、１．４３－１．５４（ｍ，７Ｈ）、１．６２（ｄｄｔ，１Ｈ）、１．９９－２．０６（ｍ，４Ｈ）、２．１２（ｔ，２Ｈ）、２．５８（ｄ，１Ｈ）、２．８２（ｄｔ，１Ｈ）、２．９６－３．０５（ｍ，４Ｈ）、３．０５－３．１４（ｍ，１Ｈ）、３．３６（ｄｔ，１Ｈ）、３．４４（ｄｔ，１Ｈ）、３．９６（ｄｄ，１Ｈ）、４．０４（ｄｄ，１Ｈ）、４．１１－４．１５（ｍ，１Ｈ）、４．２９－４．３３（ｍ，１Ｈ）、４．６７（ｄｄ，１Ｈ）、５．１６（ｄ，１Ｈ）、５．３８（ｄ，１Ｈ）、５．８４（ｄ，１Ｈ）、６．２９（ｓ，１Ｈ）、６．３３（ｄ，１Ｈ）、７．２５（ｓ，２Ｈ）、７．６４（ｄｔ，２Ｈ）、８．１１（ｔ，１Ｈ）、８．１６（ｓ，１Ｈ）、８．３１（ｓ，１Ｈ）．［Ｃ３２Ｈ５０Ｎ１０Ｏ７Ｓ］＋についてのＨＲＭＳ計算値：７１９．３６５７；実測値：７１９．３６６７（Ｍ＋Ｈ）＋

【0144】

実施例２：抗チカグレロル／ＴＡＭ抗体の単離および同定
この実施例は、チカグレロルおよびその代謝産物に対する抗体、ＡＴＰに対する構造的類似性を有し、アデノシンのようなコアを含む化合物の産生に使用され得る手法および技術を例示する（Ｓｐｒｉｎｇｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ ２００７ Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．１７：６０１３－６０１８）。チカグレロル、チカグレロル活性代謝産物（ＴＡＭ）およびチカグレロル不活性代謝産物（ＴＩＭ）の化学構造が、図２に示される。上述されるように、本明細書において開示され、生成される抗体は、チカグレロルおよびＴＡＭに結合し、それを中和することができ、ＴＩＭに結合し得るが、アデノシンなどの他の構造的に関連する化合物に結合せず、または実質的に阻害しない。ＴＩＭに対する結合活性が、本明細書に開示される抗体の任意選択の特徴である一方、ＴＩＭが、典型的に、チカグレロル代謝産物の少ないまたはわずかな画分であるため、ＴＩＭに対する結合活性を示す抗体は、必要とされる抗体／解毒剤の用量に影響を与えることが予測されていない。

【0145】

共通のエピトープ、すなわち、チカグレロルおよびＴＡＭの固有のＲ基（ジ－フルオロフェニル－シクロプロピルおよびチオプロピル置換基）を、それらの化合物に抗体結合特異性および選択性を与えるために標的化した。対象とするエピトープが、図２において破線で囲まれる。実施例１に記載されるハプテンを用いて、抗体エピトープに、ジ－フルオロフェニル－シクロプロピルおよびチオプロピル置換基を標的とさせた。実施例１に記載されるように、ビオチン化ハプテン（ビオチン化チカグレロルおよびビオチン化アデノシン）のためのリンカーをグリコール基に配置した。この手法は、非修飾ジ－フルオロフェニル－シクロプロピルおよびチオプロピル基、ビオチン化チカグレロル／ＴＡＭに対する結合特異性を有する抗体の産生を可能にし、また、アデノシンに結合する抗体ライブラリーのスクリーニングおよび除外を可能にした。

【0146】

公知の技術を用いて、ヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを用いて、ｓｃＦｖ抗体を生成し、特に、参照により本明細書に援用されるＬｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ ２００９ ＰＥＤＳ ２２：１５９－１６８に記載されるように、ビオチン化アデノシンに対する除外を伴うビオチン化チカグレロルに対する一連の反復する選択サイクルにおいて、特異的なｓｃＦｖをライブラリーから単離した。ラウンド２およびラウンド３選択アウトプットからのいくつかの個々のクローンを選択し、ｓｃＦｖを細菌ペリプラズムにおいて発現し、３つの並行する生化学的アッセイにおいて特異性についてスクリーニングした。アッセイを、ｉ）ビオチン化チカグレロルに対する結合（アッセイ１）、ｉｉ）ビオチン化アデノシンに対する結合（アッセイ２）およびｉｉｉ）５０倍過剰の非修飾チカグレロルの存在下におけるビオチン化チカグレロルに対する結合（アッセイ３）についてスクリーニングして、ビオチン化リンカーではなくチカグレロルに対する特異性を確認した。アッセイ１、２、および３を、同じ一般的な技術および手法を用いて行った。簡潔には、ビオチン化チカグレロルまたはビオチン化アデノシンに対する結合についての粗ペリプラズムｓｃＦｖサンプルのＨＴＳを、ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイ技術を用いて行った。ＨＴＲＦ（登録商標）（均一性時間分解蛍光法）は、ＴＲ－ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）の原理に基づいている。簡潔には、ＴＲ－ＦＲＥＴは、ドナーフルオロフォア（この場合、ユウロピウムクリプテート）からアクセプターフルオロフォア（この場合、ＸＬ⁶⁶⁵）へのエネルギーの移動を用いる。ドナーおよびアクセプターフルオロフォアが十分に近接（約１０ｎｍ未満）である場合、ユウロピウムクリプテートドナー（３３７ｎｍ）の励起により、６６５ｎｍで蛍光シグナルを発するＸＬ⁶⁶⁵アクセプターへのエネルギーの移動が生じる。この技術を用いて、ドナーおよびアクセプターフルオロフォアを（直接または間接的に）特定の相互作用において各結合パートナーに結合することによって、生体分子の相互作用を感度良く（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｙ）測定することができる。ビオチン化チカグレロルに対するｓｃＦｖ結合（アッセイ１）のＨＴＳフォーマットが、以下に表され、これは、ビオチン化チカグレロルおよびｈｉｓタグ化ペリプラズムｓｃＦｖの両方に対する化学的タグの存在に依存する。
ユウロピウムクリプテートストレプトアビジン：ビオチン化チカグレロル：ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ：抗Ｈｉｓ－ＸＬ⁶⁶⁵

【0147】

黒色シャローウェル３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ ３６７６）を用いて、１０ｕｌのアッセイ体積中にＤＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ １４１９０－０８６）、ＫＦ（ＶＷＲ １０３４４４Ｔ）（０．４Ｍ）およびＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１６）（０．０５％）を含む緩衝液中でアッセイを行った。５ｕｌのビオチン化チカグレロル（３０ｎＭの最終濃度を得るために６０ｎＭ）、２ｕｌのペリプラズムｓｃＦｖサンプル（２０％の最終濃度）およびユウロピウムクリプテート標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ ６１０ＳＡＫＬＢ）（１．２６ｎＭの最終濃度を得るために４．２ｎＭ）およびＸＬ⁶⁶⁵標識抗Ｈｉｓ抗体（ＣｉｓＢｉｏ ６１ＨＩＳＸＬＢ）（１２ｎＭの最終濃度を得るために４０ｎＭ）の両方を含有する３ｕｌの溶液の添加によって、アッセイを設定した。２ｕｌのアッセイ緩衝液をペリプラズムｓｃＦｖの代わりに加えたことを除いて上記のアッセイ構成要素の全てを含有する陰性結合対照ウェルを設定した。アッセイプレートを室温で４時間インキュベートしてから、サンプルが３３７ｎｍで励起される標準的なＨＴＲＦ読み取りプロトコルを用いて、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて読み取り、時間分解蛍光発光を、６２０ｎｍおよび６６５ｎＭの両方で測定する。

【0148】

未加工の６６５ｎｍおよび６２０ｎｍカウントを、まず、６６５ｎｍ／６２０ｎｍの比率値に換算し、その後、結果をデルタＦ（％）値で表した。デルタＦを、下式に従って計算した。
デルタＦ（％）＝｛（（サンプル６６５／６２０比）－（陰性６６５／６２０比））／（陰性６６５／６２０比）｝×１００

【0149】

（陰性比（Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒａｔｉｏ）を陰性結合対照ウェルから取得した）。１００％を超えるデルタＦ値を与えるｓｃＦｖを、このアッセイにおいてヒット（ｈｉｔ）として定義した。

【0150】

上記と同じプロトコルを用いて、ビオチン化アデノシンに対する結合についての粗ペリプラズムｓｃＦｖサンプルのＨＴＳを行った（最終アッセイ濃度３０ｎＭ）。アッセイ２のフォーマットは、以下に記載されるように示され得る。
ユウロピウムクリプテートストレプトアビジン：ビオチン化アデノシン：ｓｃＦｖ－Ｈｉｓ：抗Ｈｉｓ－ＸＬ⁶⁶⁵

【0151】

アッセイ３は、上記と同じプロトコルを用いて、ＨＴＳを行い、ＨＴＳは、過剰な遊離非修飾チカグレロルの存在下におけるビオチン化チカグレロルに対する減少した結合を示す粗ペリプラズムｓｃＦｖサンプルを同定した。このプロトコルは、アッセイ３を５０倍モル過剰の遊離非修飾チカグレロル（１５００ｎＭ）の存在下で行った点でアッセイ１から変更された。

【0152】

ヒットを、ビオチン化チカグレロルに対する結合（アッセイ１においてデルタＦ＞１００％）、ビオチン化アデノシンに対する結合なし（アッセイ２においてデルタＦ＜２５％）および過剰な遊離非修飾チカグレロルの存在下におけるビオチン化チカグレロルに対する５０％超減少した結合として定義した。アッセイ１および３からのデータの相関の例が、図３に示される。いくつかのｓｃＦｖは、過剰な遊離非修飾チカグレロルの存在下における限られた阻害を示し、これは、それらが、チカグレロルおよびリンカーのいくつかの構成要素との結合相互作用を有していたことを示す。ビオチン化チカグレロルに対する結合が過剰な遊離非修飾チカグレロルの存在下で（＞５０％）阻害されたｓｃＦｖのサブセットを同定した。ｓｃＦｖを、アッセイ１に対してアッセイ３において観察された結合の阻害％（５０～８０％、８０～９０％、＞９０％）に基づいて順位付け、ここで、９０％超の阻害を示すｓｃＦｖ（ＴＩＣＡ００７２を含む）を、さらなる特性評価のために優先した。配列に固有のｓｃＦｖヒットをＦａｂに変換し、標準的な技術を用いてＣＨＯ細胞中で発現させた。

【0153】

Ｆａｂ発現および精製
別個のＨＣおよびＬＣ発現プラスミドを、Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．１９９７によって記載される発現ベクターに基づいて、一過性トランスフェクションに使用した。ベクターを、ＥＢＶ複製起点（ＯｒｉＰ）を含むように修飾した。Ｆａｂ（ＨＣ）ベクターは、定常領域１（ＣＨ１）およびヒンジ領域のみを含み、ＣＨ２およびＣＨ３を除去した。ＨＣおよびＬＣ ＤＮＡを、製造業者の推奨に従って、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５－ｋＤａの線形ＰＥＩに加えた（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ ２３９６６）。次に、ＤＮＡ－ＰＥＩ複合体を、懸濁培養に適合されたＣＨＯＫ１細胞株（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５０５１００５）に由来するチャイニーズハムスターの卵巣野生型（ＣＨＯ ｗｔ）細胞に加えた（Ｄａｒａｍｏｌａ Ｏ，ｅｔ ａｌ ２０１４）。７日後、細胞を遠心分離によって収集し、上清を濾過した。Ｆａｂタンパク質を含有する細胞培養上清を、Ａｅｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５ｍＬ／分の流量で５ｍｌのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を備えたクロマトグラフィーカラムに直接充填した。カラムを平衡化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２で洗浄し、樹脂製造業者の説明書に従って、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ３．５（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＩｇＧ－ＣＨ１）で溶離した。溶離されたＦａｂをｐＨ５．５に調整し、分析前に濾過した（０．２２μｍ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＥＭＤ，Ｂｅｔｈｄｅｓａ，ＵＳＡ）。タンパク質濃度を、ＤＵ５２０ ＵＶ／ｖｉｓ分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＵＳＡ）を用いて２８０ｎｍにおける吸光度によって決定した。サンプル純度を、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）および１．０ｍｌ／分で動作する１１００ ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）を用いて決定した。

【0154】

実施例３：抗チカグレロル／ＴＡＭ Ｆａｂ
チカグレロルに対するいくらかの構造類似性を有する分子を同定するために、市販の薬剤を含有する構造データベース（「ＤｒｕｇｓＤＢ」、参照により本明細書に援用されるＯｐｒｅａ Ｔ．Ｉ ｅｔ ａｌ ２０１１ Ｍｏｌ．Ｉｎｆｏｒｍ．３０（２－３），１００－１１１）を調べた。同定されたら、これらの構造的に類似した分子を用いて、アデノシンおよびそのリン酸化形態（たとえば、ＡＤＰおよびＡＴＰ）を超えるＦａｂの結合特異性を試験した。データベースを、チカグレロルｘ線およびＮＭＲ構造に基づいて、チカグレロルに対する２Ｄフィンガープリント類似性、３Ｄ形状、および静電的類似性を有する分子について調べた。このインシリコ分析から、６つの潜在的なコメディケーション（ｃｏ－ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）を含む１２の化合物のパネルを選択した。これらの化合物の構造が、図４に示される。

【0155】

特異性を、競合結合アッセイフォーマットにおいて調べ、ここで、各試験化合物が、関連するＦａｂとのビオチン化チカグレロルの相互作用を競合的に阻害する能力等を試験した。ＨＴＲＦ（登録商標）競合アッセイフォーマットを、以下に記載されるように使用し、ここで、目的は、試験化合物のパネルによる各Ｈｉｓ－Ｆａｂに対するビオチン化チカグレロル結合の競合を測定することであった。
ユウロピウムクリプテート抗Ｈｉｓ抗体：試験Ｈｉｓ－Ｆａｂ：ビオチン化チカグレロル：ＸＬ⁶⁶⁵標識ストレプトアビジン。

【0156】

この基本的なアッセイフォーマットを用いて、リード単離およびリード最適化段階の両方の終了からのリードＦａｂの選択性プロファイルを評価し、これらの試験のために、Ｈｉｓ－Ｆａｂ発現ベクターを用いてＦａｂを生成した。

【0157】

黒色シャローウェル３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ ３６７６）中で、２０ｕｌのアッセイ体積中にＤＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ １４１９０－０８６）、ＫＦ（ＶＷＲ １０３４４４Ｔ）（０．４Ｍ）およびＢＳＡ（ＰＡＡ Ｋ０５－０１３）（０．１％）を含む緩衝液中でアッセイを行った。アッセイの設定は、５ｕｌのビオチン化チカグレロル、各試験選択性化合物の５ｕｌの滴定、５ｕｌの関連するＨｉｓ－Ｆａｂおよびユウロピウムクリプテート標識抗Ｈｉｓ抗体（ＣｉｓＢｉｏ ６１ＨＩＳＫＬＢ）（１．３３ｎＭの最終濃度を得るために５．３３ｎＭ）およびＸＬ⁶⁶⁵標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ ６１１ＳＡＸＬＢ）（１０ｎＭの最終濃度を得るために４０ｎＭ）の両方を含有する５ｕｌの組み合わされた溶液の添加を含んでいた。５ｕｌのアッセイ緩衝液を試験選択性化合物添加の代わりに加えたことを除いて上記のアッセイ構成要素の全てを含有する全結合対照ウェルを設定した。５ｕｌのアッセイ緩衝液をＨｉｓ－Ｆａｂ添加の代わりに加えたことを除いて全結合対照ウェルに含まれるアッセイ構成要素の全てを含有する陰性結合対照ウェルを設定した。試験化合物の連続滴定は、具体的な実験に応じて１／２または１／３のいずれかであり、最高最終アッセイ化合物濃度を、化合物に特異的に最適化した。ビオチン化チカグレロルおよびＨｉｓ－Ｆａｂの濃度を、別個の実験においてＦａｂに特異的に最適化した。リード単離段階の終了時に調べられた４つのＦａｂ（ＴＩＣＡ００１０、ＴＩＣＡ００４９、ＴＩＣＡ００５３およびＴＩＣＡ００７２）について、使用される最終アッセイ試薬濃度が、以下の表１に記載される。

【0158】

【表1】

【0159】

リード最適化段階の終了時に調べられた２つのＦａｂ（ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２）について、使用された最終アッセイ試薬濃度は、いずれの場合も５ｎＭのビオチン化チカグレロルおよび１ｎＭのＨｉｓ Ｆａｂであった。これらの実験に使用される試験選択性化合物のいくつかを１００％のＤＭＳＯに溶解させ、アッセイシグナルのビヒクルに関連する減少が、約１％超のＤＭＳＯの濃度で起こり始めることがある。任意のこのようなビヒクルに関連する影響を補正するためにデータのその後の正規化を可能にするために、ＤＭＳＯ単独の並行滴定がほとんどの実験に含まれ、ここで、最終アッセイＤＭＳＯ濃度は、試験化合物連続希釈の濃度を反映していた。設定手順の終了時に、そのアッセイを室温で３時間インキュベートしてから、標準的な読み取りプロトコルを用いてＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて読み取った。

【0160】

その後のデータ分析では、未加工の６６５ｎｍおよび６２０ｎＭカウントを、まず、６６５ｎｍ／６２０ｎｍ比率値に換算し、それを用いて、アッセイ１に記載される式に従って％デルタＦ値を計算した。％デルタＦの計算に使用される陰性比値を、陰性結合対照ウェルから導き出した。次に、％デルタＦ値を用いて、下式に従って％特異的結合値を計算した。
特異的結合（％）＝｛（サンプルデルタＦ－陰性結合デルタＦ）／（全結合デルタＦ－陰性結合デルタＦ）｝×１００

【0161】

％特異的結合の標準的な計算の場合、アッセイの上記の構成要素の全てを含有するが、競合する試験化合物を含まない全結合対照ウェルから全結合デルタＦを取得した。

【0162】

ＤＭＳＯ正規化が適用された実験では、この場合、全結合対照ウェル中の構成要素の全てならびに関連するサンプルウェル中の濃度と同等の濃度のＤＭＳＯを含有するウェルから全結合デルタＦを取得したことを除いて、実質的に上記の式に従って、ＤＭＳＯ正規化された％特異的結合を計算した。

【0163】

このタイプの初期実験からの結果が、表２にまとめられている。調べられた４つの初期Ｆａｂ（ＴＩＣＡ００１０、ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００５３）のうちの３つにおいて、化合物カングレロルは、ビオチン化チカグレロルに対するＦａｂ結合の競合的阻害を示した。ＴＩＣＡ００４９の場合、パントプラゾールおよびリネゾリドの両方が、部分的な競合的阻害を示した。表２に示されるように、ＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂは、１２の化合物のうちの１１で阻害を示さず、ここで、パントプラゾールは、弱い部分的な阻害を示す。

【0164】

非修飾チカグレロルおよびＴＡＭによる阻害が、０．１μＭ～０．５μＭの範囲に含まれるＩＣ₅₀値で、この第１の一連の実験で試験された全ての４つのＦａｂについて観察された。競合的阻害はまた、４つのＦａｂのうちの２つ（ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００７２）についてＴＩＭにより検出されたが、ＩＣ₅₀値は５０μＭ超であり、これは、非修飾チカグレロルおよびＴＡＭと比べてＴＩＭに対する大幅に低下した親和性を示唆している。表２中の結果に基づいて、ＴＩＣＡ００７２は、最も好ましい選択性プロファイルを有するものとして同定された。ＴＩＣＡ００４９は、このＦａｂが残りの３つのＦａｂ内でカングレロルに対する最も少ない結合を示したという基準に基づいて、潜在的なバックアップとして同定された。

【0165】

【表2】

【0166】

第２の一連の実験では、さらなる選択性データを、ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂについて生成し、ここで、図４に列挙される１２の化合物のうちの４つのサブセットを、チカグレロル、ＴＡＭおよびＴＩＭおよびいくつかのアデノシンに関連する化合物と共に再試験した。ここで、表２中の前の研究への精密化において、ＤＭＳＯによる任意の非特異的ビヒクルに関連する影響を補正するためにパーセント特異的結合値の正規化を可能にするために実験を設計した。この第２の一連の実験からの実施例のプロットされたデータが、表３中の一覧にしたＩＣ₅₀値と共に図５に示される。

【0167】

【表3】

【0168】

前の実験と同様に、ＴＩＣＡ００７２は、試験される４つの化合物内で最も好ましい選択性プロファイルを示し、パントプラゾールのみが弱い部分的な阻害（ＩＣ₅₀＞１５００μＭ）を示した。ＴＩＣＡ００４９の場合、有意な阻害がカングレロルおよびパントプラゾールで観察され、弱い阻害がリネゾリドおよびブクラデシンについて観察された。特定の試験化合物についての第１および第２の一連の実験の間の絶対ＩＣ₅₀値のわずかな差が、全体的な結論を基本的に変化させないことに留意されたい。このような差は、いくつかの場合、非常に弱い阻害を測定しようとしたことと共に、ＤＭＳＯ正規化が第２の一連の実験に組み込まれたことに起因し得る。

【0169】

ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００７２の両方の場合、チカグレロルおよびＴＡＭについて測定されたＩＣ₅₀値は、０．３μＭ～０．５μＭの範囲であり、２を超えるｌｏｇ値でＴＩＭについてのＩＣ₅₀値は、それぞれ７４．８μＭおよび１１９．５μＭでより高い。わずかな阻害が、ＴＩＣＡ００４９およびＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂの両方に対して、アデノシン、ＡＤＰ、ＡＴＰおよび後者の２つの化合物のメチル－チオ誘導体で観察されたが、これは、試験される最も高い化合物濃度でのみ検出され、有意であるとみなされなかった。

【0170】

ＴＩＣＡ００７２は、チカグレロルおよびＴＡＭに特異的であるとみなされる唯一のＦａｂであったと結論付けられる。

【0171】

実施例４：抗チカグレロル／ＴＡＭ Ｆａｂの親和性測定
上で生成された抗チカグレロルＦａｂの親和性を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ３８４においてＢｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを用いて決定した。親和性測定のために、抗チカグレロルＦａｂ抗体を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ＢＳＡ ０．０２％）、たとえば２００ｎＭ中の２×最終アッセイ濃度の濃度になるまで希釈した。チカグレロルの１０．２倍連続希釈を、Ｇｒｅｉｎｅｒポリプロピレン９６－ウェルプレートにおいて調製した。次に、等体積（たとえば７０μＬおよび７０μＬ）の希釈された抗体および遊離チカグレロルを、第２のＧｒｅｉｎｅｒポリプロピレンプレートに移した。サンプルをピペット操作によって混合し、プレートシールで被覆し、室温で３～５日間にわたって平衡化した。平衡化後、６０μＬの抗体／チカグレロル滴定を、デュプリケートで、３８４ウェル黒色傾斜底ポリプロピレンプレートに移した。ビオチン化チカグレロルを、アッセイ緩衝液中で２５０ｎＭに希釈し、３８４ウェルアッセイプレートの最初の２つのカラムの別のウェルに加え、残りのウェルは、アッセイ緩衝液のみを含有していた。ストレプトアビジンバイオセンサを、少なくとも１０分間にわたってアッセイ緩衝液に予め浸漬させた。次に、サンプルプレートおよびバイオセンサを、ＯｃｔｅｔＲｅｄ３８４の段に充填した。

【0172】

全てのアッセイを室温で行った。アッセイ緩衝液中での６０秒間にわたるベースライン平衡化後、ビオチン化チカグレロルを、３００秒間にわたってストレプトアビジンバイオセンサに充填した後、アッセイ緩衝液を６００秒間にわたって充填して、新たなベースラインを確立した。次に、抗体／チカグレロル混合物を、使用される抗体の濃度に応じて、３０～６００秒間にわたってビオチン化チカグレロルセンサ表面に結合させた。得られた結合相（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅ）データを、ＯｃｔｅｔＲｅｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析した。シグナルをベースラインに合わせ、基準センサシグナル（抗体対照なし）を各サンプルについて減算し、次に、データを、ＫｉｎＥｘＡ ｎ－Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析のためにエクスポートした。Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｐａｒｔｎｅｒ分析を用いて、抗チカグレロルＦａｂ抗体の平衡ＫＤを決定した。データは、ＦａｂＴＩＣＡ００７２およびＴＩＣＡ００４９が、それぞれ７．４ｎＭおよび１１．６ｎＭのチカグレロルに対する親和性を有していたことを示した（表４）。

【0173】

【表4】

【0174】

実施例５：抗チカグレロル／ＴＡＭ抗体ＴＩＣＡ００７２の最適化
抗体ＴＩＣＡ００７２を、親和性に基づくファージ選択を用いて最適化した。リードｓｃＦｖ配列に由来する大きいｓｃＦｖライブラリーを、記載される標準的な分子生物学技術を用いて、可変重鎖（ＶＨ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２または３または可変軽（ＶＬ）鎖ＣＤＲ１、２または３のオリゴヌクレオチド特異的突然変異によって作成した（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｌｏｗｍａｎ ２００４ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ ２６６）。チカグレロルおよびＴＡＭに対してより高い親和性を有する変異体を選択するために、ライブラリーを、親和性に基づくファージディスプレイの選択に供した。簡潔には、ｓｃＦｖ－ファージ粒子を、実質的に以前に記載されているように（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ １９９６ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２５６（１）：７７－８８）、ビオチン化チカグレロルの減少する濃度（典型例は、４回の選択にわたって２０ｎＭ～２０ｐＭであり得る）の溶液中でインキュベートした。粗ｓｃＦｖ含有ペリプラズム抽出物を、ＣＤＲ標的化選択アウトプットからの代表的な数の個々のｓｃＦｖのために調製し、ＴＩＣＡ０７２と比べた親和性の向上のためのスクリーニングするように設計されたＨＴＲＦ（登録商標）エピトープ競合アッセイフォーマットにおいてスクリーニングした。

【0175】

簡潔には、向上した親和性のｓｃＦｖおよびＦａｂ変異体をスクリーニングするために、ＨＴＲＦ（登録商標）エピトープ競合アッセイを、親ＴＩＣＡ００７２ＩｇＧとビオチン化チカグレロルとの間の相互作用の、試験ｓｃＦｖ変異体による競合に基づいて実施した。このアッセイを、粗ペリプラズム抽出物ｓｃＦｖサンプルをスクリーニングするための一次単一点ＨＴＳ、ならびに親ＴＩＣＡ００７２に対して精製されたｓｃＦｖおよびＦａｂ変異体の両方のＩＣ₅₀値の向上を測定するための多点二次プロファイリングアッセイとして使用した。本明細書に記載のものなどのエピトープ競合アッセイは概して、絶対親和性値を決定するのに使用されないが、このようなアッセイは、親和性に基づくＨＴＳの基準として使用され得る。さらに、（親ｓｃＦｖ／Ｆａｂに対する）精製されたｓｃＦｖ／Ｆａｂ変異体のＩＣ₅₀の向上の倍数（ｆｏｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ）は、親和性の全体的な倍増の優れた指標となり得、リード最適化キャンペーンにおけるｓｃＦｖ／Ｆａｂ変異体の親和性順位付けのための有効な方法であり得る。本明細書に記載のＴＩＣＡ００７２親ＩｇＧに基づくエピトープ競合アッセイのフォーマットが以下に記載される。ユウロピウム標識ストレプトアビジン：ビオチン化チカグレロル：ＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧ：ＸＬ⁶⁶⁵標識抗ヒト－Ｆｃ抗体

【0176】

黒色シャローウェル３８４ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ ３６７６）中で、ＤＰＢＳ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ １４１９０－０８６）、ＫＦ（ＶＷＲ １０３４４４Ｔ）（０．４Ｍ）およびＴｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１６）（０．０５％）を含む緩衝液中でアッセイを行った。粗ペリプラズムｓｃＦｖ変異体の単一点試験のために、１０ｕｌのアッセイ体積を使用したが、多点二次ＩＣ₅₀プロファイリングアッセイにおいて精製されたｓｃＦｖおよびＦａｂを試験するとき、２０ｕｌのアッセイ体積を使用した。

【0177】

単一点ＨＴＳのために、３ｕｌのＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧ（１６ｎＭの最終濃度を得るために５３．３ｎＭ）、２ｕｌの粗ペリプラズム抽出物ｓｃＦｖサンプル、２．５ｕｌのビオチン化チカグレロル（２ｎＭの最終濃度を得るために８ｎＭ）およびユウロピウム標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ ６１０ＳＡＫＬＢ）（０．７５ｎＭの最終アッセイ濃度のための３ｎＭ）およびＸＬ⁶⁶⁵標識抗ヒト－Ｆｃ抗体（ＣｉｓＢｉｏ ６１ＨＦＣＸＬＢ）（７．５ｎＭの最終アッセイ濃度を得るために３０ｎＭ）を含有する２．５ｕｌの組み合わされた溶液を加えることによって、アッセイを設定した。親ＴＩＣＡ００７２粗ペリプラズムｓｃＦｖをベンチマークとして使用し、ＨＴＳを、親と比べて向上した阻害を示す変異体を同定するように構成した。全結合対照ウェルは、２ｕｌのアッセイ緩衝液をｓｃＦｖサンプルの代わりに加えたことを除いて全てのアッセイ構成要素を含有していた。陰性結合対照ウェルは、３ｕｌのアッセイ緩衝液をＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧの代わりに加えたことを除いて全結合対照ウェルの構成要素の全てを含有していた。

【0178】

精製されたｓｃＦｖ／Ｆａｂ変異体の多点ＩＣ₅₀試験のために、５ｕｌのＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧ（１６ｎＭの最終濃度を得るために５３．３ｎＭ）、精製された試験ｓｃＦｖまたはＦａｂ変異体の５ｕｌの１／３滴定、５ｕｌのビオチン化チカグレロル（２ｎＭの最終濃度を得るために８ｎＭ（ｓｃＦｖプロファイリング）、１ｎＭの最終アッセイ濃度を得るために４ｎＭ（Ｆａｂプロファイリング））およびユウロピウム標識ストレプトアビジン（ＣｉｓＢｉｏ ６１０ＳＡＫＬＢ）（０．７５ｎＭの最終アッセイ濃度のために３ｎＭ）およびＸＬ⁶⁶⁵標識抗ヒト－Ｆｃ抗体（ＣｉｓＢｉｏ ６１ＨＦＣＸＬＢ）（７．５ｎＭの最終アッセイ濃度を得るために３０ｎＭ）を含有する５ｕｌの組み合わされた溶液を加えることによって、アッセイを設定した。精製された親ＴＩＣＡ００７２（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）を、全ての実験においてベンチマークとして使用して、最適化された変異体（ｓｃＦｖまたはＦａｂ）で測定されたＩＣ₅₀の向上が、親ＴＩＣＡ００７２に対する向上の倍数として表されるようにした。全結合対照ウェルは、５ｕｌのアッセイ緩衝液を精製されたｓｃＦｖまたはＦａｂサンプルの代わりに加えたことを除いて全てのアッセイ構成要素を含有していた。陰性結合対照ウェルは、５ｕｌのアッセイ緩衝液をＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧの代わりに加えたことを除いて全結合対照ウェルの構成要素の全てを含有していた。

【0179】

アッセイの単一点ＨＴＳおよび多点ＩＣ₅₀プロファイリングバージョンの両方において、プレートを室温で３時間インキュベートしてから、サンプルが３３７ｎｍで励起される標準的なＨＴＲＦ読み取りプロトコルを用いてＥｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーにおいて読み取り、時間分解蛍光発光を６２０ｎｍおよび６６５ｎＭの両方で測定した。

【0180】

未加工の６６５ｎｍおよび６２０ｎｍカウントを用いて、デルタＦ（％）を計算し、それぞれアッセイ１および４において上述される式に従って、％特異的結合を計算した。多点二次プロファイリング実験のために、Ｓ字状用量反応（可変スロープ）曲線当てはめ（４パラメータロジスティック方程式）を用いて、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、ＩＣ₅₀値を決定した。

【0181】

スクリーニングにおいて同定されるヒット、すなわち、親ＴＩＣＡ００７２ ｓｃＦｖと比較した際に有意に向上した阻害効果を示したｓｃＦｖ変異体を、ＤＮＡシークエンシングに供し、次に、可変重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３および可変軽鎖ライブラリーＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アウトプットからの固有の変異体を、精製されたｓｃＦｖとして産生し、濃度応答ＩＣ₅₀曲線を決定するために同じアッセイにおいて再試験した。次に、最も向上したＩＣ₅₀値を示すｓｃＦｖ変異体をＦａｂとして産生し、後述される第二世代エピトープ競合アッセイにおいて試験した。

【0182】

最も高い親和性Ｆａｂのスクリーニング／順位付けのための第二世代エピトープ競合アッセイ
リード最適化キャンペーンの終了時に非常に高い親和性の精製されたＦａｂを有効に区別するために、さらなるＨＴＲＦ（登録商標）エピトープ競合アッセイを実施したが、この場合、アッセイは、親ＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧではなくビオチン化チカグレロルに結合する中親和性最適化ＴＩＣＡ００７２系統ＩｇＧ（ＴＩＣＡ０１５９）の競合的阻害に基づくものであった。このアッセイを、（ＨＴＳフォーマットではなく）多点ＩＣ₅₀プロファイリングフォーマットのみで使用し、親ＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧに基づくエピトープ競合アッセイにおける精製されたＦａｂ変異体の多点ＩＣ₅₀プロファイリングのためのアッセイ５（上記）において示される方法と実質的に同じように行った。ＴＩＣＡ０１５９ ＩｇＧ（唯一の相違である）を、アッセイ設定の適切な時点で、ただし同じ１６ｎＭの最終アッセイ濃度で、ＴＩＣＡ００７２ ＩｇＧの代わりに使用した。全ての他の点で、このアッセイを、精製されたＦａｂの多点二次プロファイリングバージョンにおいてまさに上述されるとおりに行った。

【0183】

第二世代アッセイは、より有効な区別を可能にするために、ＴＩＣＡ００７２の代わりに、部分的に最適化された抗体ＴＩＣＡ０１５９を用い、最も高い親和性Ｆａｂの順位付けが、ＴＩＣＡ００７２に基づくエピトープ競合アッセイにおいて可能であった。

【0184】

最も向上したＶＨを、ＣＤＲ３変異体ＴＩＣＡ０１６２として同定した。最も向上したＶＬを、ＣＤＲ３変異体ＴＩＣＡ０１５２として同定した。さらなる親和性向上を生じるために、向上した抗体からの異なるＣＤＲを、標準的な分子生物学技術を用いて新たなＦａｂに組み合わせた。この組換え作業から、ＴＩＣＡ０１６２とＴＩＣＡ０１５２との組み合わせが、さらに向上したエピトープ競合プロファイルを有する新たなＦａｂ ＴＩＣＡ０２１２を生成した。第二世代エピトープ競合アッセイにおけるＴＩＣＡ００７２、ＴＩＣＡ０１５２、ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２ Ｆａｂについてのプロットされた競合曲線が、表５中の測定されたＩＣ₅₀値と共に、図６に示される。ＴＩＣＡ０２１２は、親ＴＩＣＡ００７２ Ｆａｂと比べてＩＣ₅₀の約２ｌｏｇの向上を示す。

【0185】

【表5】

【0186】

実施例６：最適化された抗チカグレロル／ＴＡＭ Ｆａｂの親和性測定
実施例５において生成された抗チカグレロル／ＴＡＭ Ｆａｂの親和性を、ＫｉｎＥｘＡ３２００を用いて決定した。ＫｉｎＥｘＡ親和性測定のために、ビーズ（６００ｍｇのアズラクトンビーズ）を、それらを５０ｍＭのＮａＨＣＯ₃中の１ｍｇのストレプトアビジンと一晩反応させることによってまず調製した。トリス緩衝液（１ＭのトリスｐＨ８．７、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ）の２回の交換でブロッキングした後、ストレプトアビジンで被覆されたビーズを、８ｍＬの総体積中で再懸濁させた。ビーズ（１．３３ｍＬ、１００ｍｇの元の乾燥アズラクトンビーズに相当する）を、ＰＢＳで完全に洗浄し、次に、時折撹拌しながら１０分間にわたって、１ｍＬのＰＢＳ中の約２．５μｇのビオチン－チカグレロルに結合させた。得られたビオチン－チカグレロルで被覆されたビーズをＰＢＳで洗浄し、次に、０．１％のＢＳＡおよび０．０２％のＮａＮ₃を含有する５０ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁させ、ＫｉｎＥｘＡビーズバイアルに移すまで室温で貯蔵した。

【0187】

抗体／チカグレロルサンプルの調製を、以前の方法に実質的に記載されるように行った。抗チカグレロルＦａｂ抗体を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０５％、ＢＳＡ ０．０２％、０．０２％のＮａＮ₃）、たとえば２００ｎＭ中の最終アッセイ濃度の２倍の濃度に希釈した。チカグレロルの１０．２倍連続希釈を、Ｆａｌｃｏｎ ５０ｍＬのポリプロピレンチューブ中で調製した。次に、等体積、たとえば５ｍＬおよび５ｍＬの希釈された抗体および遊離チカグレロルを、第２のＦａｌｃｏｎポリプロピレンチューブに移した。サンプルをピペット操作によって混合し、室温で３～５日間にわたって平衡化した。平衡化後、サンプルチューブを分析のためにＫｉｎＥｘＡ ３２００に移した。

【0188】

全てのアッセイを室温で行った。抗体／チカグレロル混合物を採取し、バイオ－チカグレロルビーズと混合させた一方、非結合遊離チカグレロルを洗い流した。次に、結合抗体を、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９標識マウス抗ヒト重鎖および軽鎖抗体を用いて検出した。サンプル体積（３００～１３００μＬ）および注入時間（９０～１２０秒間）は、濃度によって変化し、２～３つの読み取りがサンプルごとに変化された。データを、ＫｉｎＥｘＡ ｎ－Ｃｕｒｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて分析した。Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｐａｒｔｎｅｒ分析を用いて、抗チカグレロルＦａｂ抗体の平衡ＫＤを決定した。

【0189】

前の実施例と同様に、Ｆａｂを、２０倍過剰からの濃度で、非修飾チカグレロルまたはＴＡＭのいずれかの存在下で、室温で平衡化した。ビオチン化チカグレロルを、ストレプトアビジンで被覆された表面上に充填した。平衡化後、残りの遊離抗体をビオチン化チカグレロルに結合させた。次に、結合抗体を、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９標識マウス抗ヒト重鎖および軽鎖検出抗体を用いて検出した。遊離チカグレロルまたはＴＡＭの滴定を、抗体の少なくとも３つの異なる一定の濃度で調製して、見かけのＫＤの少なくとも１０倍の変化を有する別個の滴定プロファイルを生成した。データを、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏ ｎ－Ｃｕｒｖｅ分析ソフトウェアを用いて分析して、遊離チカグレロルまたはＴＡＭの平衡ＫＤを決定した。Ｆａｂ ＴＩＣＡ０２１２は、約２０ｐＭの非修飾チカグレロルおよびＴＡＭに対する親和性を有していた（表６）。平衡データから、ＴＩＣＡ０２１２は、チカグレロルおよびＴＡＭに結合する同等の高い親和性（約２０ｐＭ）を示す。

【0190】

【表6】

【0191】

実施例７：抗チカグレロル／ＴＡＭ Ｆａｂ ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２の特異性
Ｆａｂ、ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２の特異性を、実施例３において試験し、ＤＭＳＯに対して正規化した。ＴＩＣＡ０１６２およびＴＩＣＡ０２１２のための全ての利用可能な選択性データの概要の表が、表７に含まれる。さらに、図４に列挙される１２の化合物のうちの５つがチカグレロル、ＴＡＭ、ＴＩＭおよびいくつかのアデノシンファミリー化合物と並行して試験される実験からの実施例のプロットされたデータが図７に示される。

【0192】

【表7】

【0193】

データによって示されるように、ＴＩＣＡ０２１２（ＭＥＤＩ２４５２）は、チカグレロルおよびＴＡＭに対する実質的に等しい結合特異性、およびＴＩＭに対するより弱い結合を有する。さらに、ＭＥＤＩ２４５２／ＴＩＣＡ０２１２は、他の構造的に関連する薬剤またはアデノシンに関連する化合物に対する有意な結合を示さなかった。

【0194】

実施例８：タンパク質結晶学
Ｃ末端ｈｉｓ－タグを有するＴＩＣＡ００７２を、ＰＢＳ中で９ｍｇ／ｍｌに濃縮した。複合体形成を、ＤＭＳＯに溶解された１ｍＭのチカグレロルの添加によって行った。複合体を室温で２時間インキュベートしてから、結晶化試験を、シッティングドロップによる蒸気拡散方法を用いて設定した。広範なスクリーニングを、３つの市販のスクリーニングを用いて行い、いくつかのヒットが得られた。最良の回折結晶が、Ｍｏｒｐｈｅｕｓ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ，ＵＫ）ヒットのグリッド最適化（ｇｒｉｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）から得られた。等体積のＴＩＣＡ００７２－チカグレロル複合体および１２．８％のＰＥＧ ３３５０、１２．８％のＰＥＧ １０００、１２．８％のＭＰＤ、１．７％の１，６－ヘキサンジオール、１．７％の１－ブタノール、１．７％の１，２－プロパンジオール、１．７％の２－プロパノール、１．７％の１，４ブタンジオール、１．７％の１，３－プロパンジオール、２５ｍＭのイミダゾール、２５ｍＭのカコジル酸ナトリウム、２５ｍＭのＭＥＳおよび２５ｍＭのビス－トリスｐＨ６．５のリザーバ溶液（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を混合することによって、構造決定に使用される結晶を、２０℃で成長させた。抗凍結剤を添加せずに、結晶を液体窒素中で急速冷凍した。

【0195】

約１５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中のＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２を、１ｍＭの濃度になるまでチカグレロルと混合し、室温で２時間インキュベートしてから、広範なスクリーニングを行った。自発的な（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）ヒットは得られなかった。ＴＩＣＡ００７２－チカグレロル結晶からのシードを、いくつかの結晶を３０ｕｌのウェル溶液中で破砕することによって調製し、広範な市販のスクリーニングへのＭＭＳ（マイクロシードマトリックススクリーニング）に使用した。いくつかのヒットが得られたが、構造決定に使用される結晶を、２０％のグリセロール、２０％のＰＥＧ ４０００、１０％の２－プロパノール、０．１ＭのＮａＣｌおよび０．５ＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ ｐＨ４．６の条件から２０℃で成長させた。滴を、０．２ｕｌのタンパク質、０．１８ｕｌのウェル溶液および０．０２ｕｌのシードストックを用いて設定した。抗凍結剤を添加せずに、結晶を液体窒素中で急速冷凍した。

【0196】

データを、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で、ビームラインＩＤ２３－１で収集した。データを処理し、スケーリングし、ＡｕｔｏＰｒｏｃ ｗｏｒｋｆｌｏｗ［Ｖｏｎｒｈｅｉｎ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．２０１１；Ｄ６７：２９３－３０２］を用いてさらに縮小させた。統計については、表８を参照されたい。ＴＩＣＡ００７２の場合、初期フェージング（ｉｎｉｔｉａｌ ｐｈａｓｉｎｇ）を、出発モデルとして高分解能Ｆａｂ構造（ＰＤＢ ｉｄ ｃｏｄｅ １ａｑｋ［Ｆａｂｅｒ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９８；３：２５３－７０］）を用いた分子置換によって行った。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の場合、ＴＩＣＡ００７２の構造を出発モデルとして使用した。モデル再構築を、Ｃｏｏｔ［Ｂｒｉｃｏｇｎｅ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）．ＢＵＳＴＥＲ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１１．４．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ：Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｔｄ］を用いて行い、精密化を、ａｕｔｏｂｕｓｔｅｒ［Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，Ｓｅｃｔ．Ｄ：Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００４，Ｄ６０，２１２６－２１３２］を用いて行った。最終モデルの統計については、表８を参照されたい。

【0197】

【表8】

【0198】

チカグレロルとの複合体中のＴＩＣＡ００７２の構造を、１．７Åの分解能まで決定した（図１０）。ＣＤＲが、非常に窪んだ表面を形成し、チカグレロルが、ＶＨとＶＬドメインとの境界に深く挿入される。このタイプの結合は、小さいハプテンについて一般的に観察される。ＶＬ ＣＤＲ２以外の全てのＣＤＲは、チカグレロル結合に直接寄与しており、大部分のＶＨ ＣＤＲ３が不規則である。チカグレロルのジフルオロフェニル基は、残基ＶＨ Ｔｒｐ４７、ＶＬ Ｐｈｅ９８およびＶＨ ＣＤＲ３残基Ｌｅｕ１００Ｌを含む疎水性残基で囲まれたキャビティに配置される。チカグレロルとの相互作用における主な残基は、ＶＬ Ｔｒｐ９１であり、これは、アデノシンのようなコアに対するπスタッキングおよびシクロペンチル部分におけるリボースヒドロキシル基の１つへの水素結合の両方に関与する。アデノシンのようなコアとのさらなる相互作用が、ＶＨ ＣＤＲ１ Ｈｉｓ３５およびＶＨ ＣＤＲ３ Ｔｙｒ９９によって提供される。チオプロピル置換基は、ＶＨ ＣＤＲ２ループの主鎖に対して積み重なる。シクロペンチル部分上のヒドロキシエチル置換基は、溶媒中に突出しており、Ｆａｂとの相互作用を生じない。

【0199】

親和性が向上されたＦａｂ、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の構造において、チカグレロル結合は、ＴＩＣＡ００７２のものと類似しており、ここで、上記の全ての相互作用は、いくらかの重要な相違を除いて保持された（図１０Ｂ）。ＶＬ ＣＤＲ３突然変異Ａｓｐ９２ＬｅｕとＳｅｒ９４Ａｓｐとの組み合わせが、ＶＬ ＣＤＲ３ループ内の水素結合を破断して、より「弛緩した（ｒｅｌａｘｅｄ）」構造を形成する。新たな配座が、シクロプロピル－ジフルオロフェニル置換基の結合の周りのピリミジン環の１５°の傾きと相関している。ピリミジン環の新たな位置は、それを、Ｆａｂ ７２と比較してＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２中のＶＨ ＣＤＲ３ Ｔｙｒ９９に近い約０．２Åにする。さらに、ＶＬ Ｉｌｅ９３Ｔｙｒが、水素結合供与体を導入し、水素結合供与体は、ＶＨ ＣＤＲ３ループとの相互作用を生じるため、結合部位をさらに画定する。

【0200】

ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の結晶構造は、Ｖ_HおよびＶ_L境界の間の深い隙間に結合されたチカグレロルを示す。結晶構造は、ヒドロキシエチル基がＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２との相互作用に関与しないことを示すため、ヒドロキシエチル基に対するトリアミドリンカーを介して、チカグレロルをビオチンで標識する設計手法が実証される。これは、Ｆａｂが、ヒドロキシエチル基を欠く、同一の親和性を有するＴＡＭにも結合することによってさらに裏付けられる。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、シクロプロピル－ジフルオロフェニル基を欠くＴＩＭに対する弱い結合を示す。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２－チカグレロル複合体において、シクロプロピル－ジフルオロフェニル基は、疎水性ポケットの底に埋められ、チカグレロルのアデノシンのようなコアを、Ｖ_L ＣＤＲ３残基Ｔｒｐ Ｌ９１と位置合わせする主な構造的役割を果たすはずである。チカグレロルの化学的出発点がＡＴＰであり、アデノシンのようなコアを保持するため、解毒剤特異性の重大な属性は、アデノシンの結合がないことを実証することであった。リード単離手法が、高スループットおよび詳細な特異性分析の両方に関与し、アデノシンの結合がないことが、競合または直接結合分析のいずれかによって検出された。構造分析から、アデノシンのプリン環およびリボース基が、チカグレロルのアデノシンのようなコアの相互作用を模倣することが予測され得る。しかしながら、結合の欠如は、相対形状相補性および結合相互作用の疎水性の両方を著しく低下させる２つの疎水性Ｒ基（シクロプロピル－ジフルオロフェニルおよびチオプロピル）の非存在によって説明され得る。

【0201】

親ＴＩＣＡ００７２およびＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の構造の分析は、親和性成熟中に挿入される変化のいくつかの有意性を示す。Ｖ_L ＣＤＲ３中の突然変異は、特に大きい影響を有するようであり、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２中の異なるループ配座およびさらなる水素結合を生じて、結合キャビティを画定する。対照的に、Ｖ_H ＣＤＲ３中の突然変異からの寄与は、構造的にあまり明らかでない。構造からのこれらの観察は、ＴＩＣＡ００７２よりそれぞれ２００倍および５０倍の向上をもたらしたＶ_L ＣＤＲ３（ＴＩＣＡ０１５２）またはＶ_H ＣＤＲ３（ＴＩＣＡ０１６２）のみに修飾を含有する修飾抗体についてのデータによって部分的に確認される。しかしながら、Ｖ_L ＣＤＲ３の変化は、より大きい影響を有するようであるが、両方の組の突然変異は、有意な向上を加える。結晶構造は複合体中の静止画像であり、結合に関与するタンパク質およびリガンド動態のいずれも捕捉することができないことに留意されたい。

【0202】

実施例９：インビトロでの、チカグレロルまたはＴＡＭの存在下における、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２濃度に依存して修復される血小板凝集
ＡＤＰ誘導性血小板凝集のチカグレロルまたはＴＡＭ媒介性阻害を拮抗するＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の程度および有効性を、光透過凝集測定を用いて、ヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）中で決定した。

【0203】

インビトロのヒトＰＲＰアッセイのために、血液を、橈側皮静脈の静脈穿刺によって絶食した健常なボランティアから採取した。最初の２ｍＬの血液を廃棄してから、０．１０９Ｍのクエン酸ナトリウム、１＋９（クエン酸塩＋血液）を含むチューブに、最終濃度１０．９ｍＭになるまでアリコートを収集した。抗凝固処理されたヒト血液を、１５分間にわたって２４０×ｇで遠心分離した。ＰＲＰを注意深く除去し、透明のバイアルに移した。乏血小板血漿（ＰＰＰ）を、１５分間にわたる２０００×ｇにおけるＰＲＰの遠心分離によって調製した。光透過凝集測定（ＬＴＡ）を、Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（ＰＡＰ－８Ｅ，Ｂｉｏ／Ｄａｔａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ．）によってＰＲＰにおいて評価した。０％の凝集を、ＰＲＰの光透過として定義し、１００％の凝集をＰＰＰの光透過として定義した。

【0204】

ＰＲＰを、１時間にわたって１μＭのチカグレロルまたはＴＡＭと共に予めインキュベートしてから、３０分間にわたって異なる濃度のＴＩＣＡ０２１２またはアイソタイプ対照Ｆａｂと共に共インキュベートした。血小板凝集を、２０μＭのＡＤＰの添加によって開始し、６分間にわたって連続して記録した。６分間の時点での最終凝集（ＦＡ）程度のデータを分析した。

【0205】

最大半量の（ｈａｌｆ－ｍａｘｉｍｕｍ）拮抗（ＩＣ₅₀）を示したＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の濃度を計算した。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、それぞれ０．６４および０．７８μＭの計算された平均（ｎ＝５）ＩＣ₅₀値で、１μＭのチカグレロルの濃度依存的拮抗および２０μＭのＡＤＰに誘導される血小板凝集の１μＭのＴＡＭに媒介される阻害をもたらした（図８）。１：１の条件（１μＭのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２：１μＭのチカグレロルまたはＴＡＭ）で評価されるとき、拮抗の平均程度は、それぞれ７８％および６２％であった。アイソタイプ対照Ｆａｂは、チカグレロルの有意な拮抗およびＴＡＭ ＡＤＰ誘導性血小板凝集を引き起こさなかった。たとえば、３０分間のインキュベーション後、アイソタイプ対照Ｆａｂは、チカグレロルおよびＴＡＭのそれぞれの－３％および２％の拮抗をもたらした。

【0206】

このことから、データは、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２が、濃度依存的にインビトロでＡＤＰ誘導性血小板凝集のチカグレロルおよびＴＡＭ媒介性阻害の両方に拮抗し得ることを示す。最大およびほぼ完全な拮抗作用は、１：１の実験設定で評価されるときに達成され、これは、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２が１：１の化学量論でチカグレロルまたはＴＡＭに結合するときに予測され得る。

【0207】

実施例１０：ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、インビトロで、チカグレロルまたはＴＡＭの存在下で血小板凝集を有効にかつ迅速に修復する
ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２がチカグレロルまたはＴＡＭに拮抗する発現時間を、実施例８と同様に光透過凝集測定を用いてヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）において決定した。ＰＲＰを、１時間にわたって１μＭのチカグレロルまたはＴＡＭと共に予めインキュベートしてから、１μＭのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２を加え、５、１０、１５、３０および６０分間にわたって共インキュベートし、または３０分間にわたってアイソタイプ対照Ｆａｂを加えた。血小板凝集を、２０μＭのＡＤＰの添加によって開始し、６分間にわたって連続して記録した。６分間の時点での最終凝集（ＦＡ）程度のデータを分析した。

【0208】

拮抗の平均（ｎ＝３）程度は、５、１０、１５、３０および６０分後にそれぞれ８５％、６９％、７４％、８０％および８１％であったため、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、共インキュベーション時間にかかわらずチカグレロル媒介性阻害の拮抗の同様の程度をもたらした。同様に、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２によって誘導されるＴＡＭ拮抗の平均（ｎ＝３）程度は、５、１０、１５、３０および６０分後にそれぞれ５３％、５６％、５８％、６９％、７４％であった。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、ＡＤＰ誘導性血小板凝集のチカグレロルおよび媒介性阻害を迅速にかつ有効に拮抗した。拮抗なし、平均（ｎ＝３）－２％は、アイソタイプ対照Ｆａｂとの共インキュベーションの３０分後に存在した。このデータから、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、１：１の実験の設定で評価されるとき、ＡＤＰ誘導性凝集のチカグレロルおよびＴＡＭ媒介性阻害の両方を迅速にかつ有効に拮抗することが示された。

【0209】

実施例１１：ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、インビボで、チカグレロルで処理されたマウスに投与した後、血小板凝集を有効にかつ迅速に修復した
全血中のＡＤＰ誘導性血小板凝集のチカグレロル媒介性阻害のＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２に媒介される拮抗の発現速度および程度（インピーダンス凝集測定）を、マウスへのチカグレロルの静脈内（ｉ．ｖ．）投与後に生体外で決定した。５分間にわたる１２００μｇ／ｋｇのボーラス投与、続いて３０μｇ／ｋｇ／分の１５分間の持続注入として、マウスにチカグレロルを静脈内で与えた。チカグレロル注入の停止後、チカグレロルの血漿中曝露量が、平均１．４μＭであると測定されたとき、マウスに、２５０ｍｇ／ｋｇのＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の静脈内ボーラス投与を与えた。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２投与の５、３０、および６０分後の時点で、マウスを殺処分し、血液サンプルを収集した。この試験において、ＡＤＰ誘導性凝集応答を、６分間測定し、データを、時間の経過と共に記録される凝集単位（ＡＵ）（ＡＵ^*分）の曲線下の平均面積として表した。

【0210】

インピーダンス凝集測定アッセイを行う際、マウスを殺処分し、血液サンプルを７μＭのヒルジン中に収集した。血液（１７５μＬ）を、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｍｉｎｉ試験細胞中の予め加熱されたＮａＣｌ₂（３７℃、１７５μＬ）に加え、３分間混合してから、６．５μＭの最終濃度になるまでＡＤＰ、１２μＬを加えた。使い捨てのＭｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｍｉｎｉ試験細胞は、撹拌子を含み、血液サンプルに浸漬される電極の２つの別個の対を有する。

【0211】

アゴニスト（ＡＤＰ）が加えられ、せん断が撹拌によって引き起こされるとき、血小板が、電極に付着し、凝集することになる。これは、電極にわたるインピーダンスの増加をもたらし、これは、Ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅインピーダンス血小板凝集計（ＤｙｎａＢｙｔｅ，Ｍｕｎｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって時間と共に連続して記録される。

【0212】

凝集応答が、チカグレロル注入およびＰＢＳボーラス投与の５、３０、および６０分後にそれぞれ、４３２から２、４７４から６および４９４から１４ ＡＵ^*分に減少した（図９）ため、チカグレロル処理は、平均（ｎ＝４）としてＡＤＰ誘導性凝集のほぼ完全な阻害を誘導した。平均（ｎ＝４）凝集応答としてのインビボのチカグレロル媒介性阻害のＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２媒介性拮抗は、チカグレロル注入およびＴＩＣＡ０２１２ボーラス投与の５、３０、および６０分後の時点でそれぞれ、２から１４７、６から４４８および１４から４１３ ＡＵ^*分に増加した（図９）。凝集応答が６～４ ＡＵ^*分で変化しないままであったため、平均（ｎ＝４）としてのアイソタイプ対照の投与の３０分後に拮抗は存在しなかった。

【0213】

このデータは、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２が、ＡＤＰ誘導性凝集の完全な阻害を提供する１．４μＭのチカグレロル血漿濃度になるまで投与されるマウスへの静脈内ボーラス投与として与えられるとき、ＡＤＰ誘導性血小板凝集を迅速にかつ有効に修復し得ることを示す。

【0214】

実施例１２：チカグレロルで処理されたマウスにおけるマウス出血
ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の意図される適応の１つが、緊急手術を必要とする患者へのチカグレロルの解毒剤としての適応であるため、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２を、完全な拮抗が手術の開始前に達成されるべきである臨床状況を模倣するように設計されたマウス出血実験において評価した。

【0215】

マウスを、チカグレロル、３００μｇ／ｋｇ／分または２０分間にわたるビヒクルの持続注入で前処理した。注入の停止後（ｔ＝０）、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２（６００ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ヒスチジンスクロース緩衝液）のボーラス投与を、４５秒間にわたって与え、ｔ＝３０分の時点で、尾の先端から５ｍｍを切断することによって出血を引き起こした。尾の先端を水（２ｍＬ／分）ですすぎ、血液と水との混合物を小さいチャンバに収集し、ここで、撹拌器が流体を混合して、溶血を促進し、均一な溶液を形成した。終末血液サンプルを血小板凝集のために腹部大動脈から採取したとき、５２５ｎｍにおける光透過を、３０分間記録した。光透過を、吸光度に換算し、それを用いて、吸光度曲線下の面積（ＡＵＣ、吸光度^*秒）および時間の経過と共に吸光度をプロットすることによる全出血時間（ＢＴ、秒）として失血を計算した。９５％未満の全ての透過を出血として定義した。また、血小板凝集のためのサンプルならびに全血漿および遊離血漿中曝露量を、チカグレロル注入の終了時（ｔ＝０）および尾切断時（ｔ＝３０分）に収集した。

【0216】

試験は、ヨーテボリ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ）（Ｓｗｅｄｅｎ）において動物研究のための倫理委員会によって承認された。マウスにイソフルランガス（Ｆｏｒｅｎｅ（登録商標）、Ａｂｂｏｔ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎ）で麻酔をかけた。カテーテルをビヒクルまたは薬剤の投与のために左頸静脈に挿入した。体温を外部加熱によって３８℃に維持した。

【0217】

血小板凝集に対するＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の影響を、出血に対する潜在的影響に変換するために、予防的なマウス尾出血試験を行った。チカグレロルをそれぞれ７．６および０．３μＭの平均全チカグレロルおよびＴＡＭ血漿濃度になるまで注入して、有意な薬剤依存的出血ウインドウを得た。チカグレロル注入を停止した直後に、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２を、３０秒間にわたる６００ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス投与として投与した。３０分後、ＡＤＰ誘導性凝集を完全に正規化し、チカグレロルの平均遊離血漿濃度は、４．７ｎＭから０．０３ｎＭ（定量化の下限）未満に減少した。出血を、尾切断によって開始させ、３０分間監視した。ビヒクルで処理されたマウスでは、尾切断の時点での平均全チカグレロルおよびＴＡＭ血漿濃度は、２．４および０．６μＭであった。３０分間にわたる全失血および出血時間は、それぞれ約３．８倍および１．６倍だけチカグレロルによって有意に（ｐ＜０．０５）向上された。ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、チカグレロル単独と比べて失血および出血時間を有意に（ｐ＜０．０５）改善し、チカグレロルで処理されていないマウスとそれほど異ならないレベルに戻した（図１２）。この予防的な設定では、ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２は、チカグレロル依存的な出血を正規化した。エキソビボモデルからＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２を実証するこのインビボモデルに変換される３０分間の発現時間は、失血および出血時間の両方を、チカグレロルで処理されていないマウスの失血および出血時間に対して正規化することができる。

【0218】

実施例１３：チカグレロルおよびＴＡＭの全血漿濃度
血液サンプルを、ＥＤＴＡ抗凝固剤を含むチューブに収集し、室温で、１００００×ｇで５分間遠心分離して、血漿を調製した。チカグレロルおよびＴＡＭの血漿濃度を、以下の差異を含む、公開された方法に記載されるタンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）［Ｓｉｌｌｅｎ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１０；８７８：２２９９－３０６］を用いて、タンパク質沈殿および液体クロマトグラフィーによって決定した。血漿、５０μＬは、アセトニトリル中の１８０μｌの内部標準（Ｄ７－ＺＤ６１４０）を用いて沈殿されたタンパク質であった。液体クロマトグラフシステムおよび質量分析計は、Ｗａｔｅｒｓ製のＸｅｖｏ ＴＱ－Ｓ質量分析計に結合されたＡｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣであった。クロマトグラフ分離を、Ａｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８カラム（２．１×５０ｍｍ、粒度１．７μｍ）において行った。陰性エレクトロスプレーイオン化を用いた。溶離剤Ａは、１０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム、ｐＨ５を含む水であり、溶離剤Ｂは、１０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウムを含むアセトニトリルであった。注入量は１～５μＬであり、分析勾配は４％のＢから開始し、１．５分で９５％に増加し、２．３分まで保持してから、２．４分以内に初期条件に戻した後、０．３分の再平衡化が続いた。品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）サンプルを分析に使用しなかった。定量化の下限（ＬＬＯＱ）は０．００５μｍｏｌ／Ｌであり、較正範囲は、０．００５～１５．０μＭであった。

【0219】

ＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の存在下におけるチカグレロルおよびＴＡＭの全血漿濃度を、上述されるように、１％のギ酸（ＦＡ：サンプル、１：５）の添加、続いてタンパク質の沈殿およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって決定した。ギ酸をサンプルに加えて、チカグレロルおよびＴＩＣＡ０２１２／ＭＥＤＩ２４５２の解離を促進した。

【0220】

実施例１４：チカグレロル遊離血漿濃度
本方法を、以前に公開された方法［Ｓｉｌｌｅｎ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ａｎａｌｙｔ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｍｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０１１ Ａｕｇ １；８７９（２３）：２３１５－２２］に基づいて最適化した。６～８ｋＤａ未満の質量の分子を通過させる透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を、１０～１５分間にわたってＥＬＧＡ水に浸漬させ、透析プレート半部（社内で作製された）の間に入れた。血漿、１３０μＬを、透析プレートの片側に加え、１３０μＬのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０を、反対側に加えた。ウェルの両側を蓋で密封し、アルミニウム板をプレートの各側の上に置いて、漏れを防いだ。次に、プレートを、２４時間にわたって３７℃で、１００ｒｐｍ／分でオービタルシェーカーに垂直に置いた。血漿側からの５０μＬの濃縮液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）および緩衝液側からの７５μＬの透析液を、１５０μＬの、アセトニトリル中のそれぞれの７５μＬの内部標準（Ｄ７－ＺＤ６１４０）を含むタンパク質ＬｏＢｉｎｄ ＰＣＲ透明９６ディープ－ウェルプレートに移すことによって、透析を終了した。プレートを１分間混合し、次に、４℃で、１５００×ｇで２０分間にわたって遠心分離した。遠心分離後、沈殿された濃縮液から５０μＬの上清を移し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（Ｘｅｖｏ ＴＱ－Ｓ質量分析計に結合されたＡｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ））分析の前に５０μＬのＥＬＧＡ Ｈ₂Ｏで希釈した。品質管理サンプルを分析に使用しなかった。濃縮液の較正範囲は、０．４～１０００ｎｍｏｌ／Ｌであり、透析液の較正範囲は、０．００３～５０ｎｍｏｌ／Ｌであった。透析液中のチカグレロルのＬＬＯＱは、０．０３ｎｍｏｌ／Ｌであった。

【0221】

以下の表９は、上記の実施例に記載され、本明細書に開示される技術の特定の実施形態を例示するのに使用される例示的な抗体の概要を提供する。

【0222】

【表9-1】

【0223】

【表9-2】

【0224】

【表9-3】

【0225】

【表9-4】

【0226】

【表9-5】

【0227】

【表9-6】

【0228】

【表9-7】

【0229】

【表9-8】

【0230】

【表9-9】

【0231】

参照文献および援用
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【0232】

本明細書に言及した刊行物および特許は全て、各個別の刊行物または特許を援用するために具体的に個々に示してかのようにその全体を本明細書に援用する。

【0233】

本開示の具体的な態様について考察してきたが、上記の記載は例示であり、限定するものではない。本明細書および下記の特許請求の範囲を検討すると、本開示の多くの変更形態が当業者には明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に、および本明細書をその変更形態と共に参照して決定されるべきである。本発明は以下の態様も提供する。
［１］ 式（Ｉａ）：

【化17】

（式中、
Ｒ ₁ が、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシおよびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルキルチオからなる群から選択され；
Ｒ ₂ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、置換Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキル、および置換Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキルからなる群から選択され；および
Ｒ ₃ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシ、およびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルカノールからなる群から選択される）
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体。
［２］ 式（ＩＩａ）

【化18】

として括弧で識別される前記化合物の部分内でエピトープにおいて前記式（Ｉａ）の前記シクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に結合する、［１］に記載の抗体。
［３］ 式（ＩＩＩａ）

【化19】

（式中、Ｒ’ ₁ が、Ｃ ₁ ～Ｃ ₄ アルキルからなる群から選択される）
として括弧で識別される前記化合物の部分内でエピトープにおいて前記式（Ｉａ）の前記シクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に結合する、［１］に記載の抗体。
［４］ 式（Ｉｂ）：

【化20】

のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体。
［５］ Ｒ ₁ がＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルキルチオである、［４］に記載の抗体。
［６］ 式（Ｉｂ）の前記化合物が、チカグレロル（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）－３－［７－｛［（１Ｒ，２Ｓ）－２－（３，４－ジフルオロフェニル）シクロプロピル］アミノ｝－５－（プロピルチオ）－３Ｈ－［１，２，３］トリアゾロ［４，５－ｄ］ピリミジン－３－イル］－５－（２－ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン－１，２－ジオール）またはその代謝産物もしくは誘導体である、［４］に記載の抗体。
［７］ 式（Ｉｂ）の前記化合物が、

【化21】

からなる群から選択される、［４］に記載の抗体。
［８］ ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ₂ 、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、および抗体可変ドメインから選択される、［１］～[７]のいずれか一に記載の抗体。
［９］ ｓｃＦｖを含む、［８］に記載の抗体。
［１０］ Ｆａｂを含む、［８］に記載の抗体。
［１１］ 約２００ｎＭ以下のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１２］ 約１００ｎＭ～約１ｎＭの範囲のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１３］ 約１０ｎＭ～約１ｎＭの範囲のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１４］ 約５０ｎＭ以下のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１５］ 約２５０ｐＭ～約１ｐＭの範囲のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１６］ 約１００ｐＭ～約１ｐＭの範囲のＫｄを有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１７］ フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物について約５０μＭ以下のＩＣ ₅₀ を示す、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１８］ 約１２時間の生体内半減期を有する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［１９］ チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［２０］ 投与から約３０分以内にチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［２１］ チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ＡＤＰ誘導性血小板凝集を修復する、［１］～[１０]のいずれか一に記載の抗体。
［２２］ 式（Ｉａ）：

【化22】

（式中、
Ｒ ₁ が、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシおよびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルキルチオからなる群から選択され；
Ｒ ₂ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、置換Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキル、および置換Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキルからなる群から選択され；および
Ｒ ₃ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシ、およびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルカノールからなる群から選択される）
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、
配列番号２、配列番号１２、配列番号２２、配列番号３２、配列番号４２、配列番号５２、配列番号６２、および配列番号７２からなる群から選択される重鎖可変領域（ＶＨ）配列；ならびに
配列番号７、配列番号１７、配列番号２７、配列番号３７、配列番号４７、配列番号５７、配列番号６７、および配列番号７７からなる群から選択される軽鎖可変領域（ＶＬ）配列
を含む抗体またはそのフラグメント。
［２３］ 配列番号２および配列番号７；配列番号１２および配列番号１７；配列番号２２および配列番号２７；配列番号３２および配列番号３７；配列番号４２および配列番号４７；配列番号５２および配列番号５７；配列番号６２および配列番号６７；ならびに配列番号７２および配列番号７７からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬ配列の組み合わせを含む、［２２］に記載の抗体。
［２４］ 配列番号５２および配列番号５７；配列番号６２および配列番号６７；ならびに配列番号７２および配列番号７７からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬの組み合わせを含む、［２３］に記載の抗体。
［２５］ 式（Ｉａ）：

【化23】

（式中、
Ｒ ₁ が、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシおよびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルキルチオからなる群から選択され；
Ｒ ₂ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、置換Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキル、および置換Ｃ ₃ ～Ｃ ₆ シクロアルキルからなる群から選択され；および
Ｒ ₃ が、Ｈ、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルキル、Ｃ ₁ ～Ｃ ₆ アルコキシ、およびＣ ₁ ～Ｃ ₆ アルカノールからなる群から選択される）
のシクロペンチルトリアゾロピリミジン化合物に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、
重鎖可変領域および軽鎖可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、および３を含み、ここで、前記重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、
配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号４（ＣＤＲ２）、および配列番号５（ＣＤＲ３）； 配列番号１３（ＣＤＲ１）、配列番号１４（ＣＤＲ２）、および配列番号１５（ＣＤＲ３）；
配列番号２３（ＣＤＲ１）、配列番号２４（ＣＤＲ２）、および配列番号２５（ＣＤＲ３）；
配列番号３３（ＣＤＲ１）、配列番号３４（ＣＤＲ２）、および配列番号３５（ＣＤＲ３）；
配列番号４３（ＣＤＲ１）、配列番号４４（ＣＤＲ２）、および配列番号４５（ＣＤＲ３）；
配列番号５３（ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＣＤＲ２）、および配列番号５５（ＣＤＲ３）；
配列番号６３（ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＣＤＲ２）、および配列番号６５（ＣＤＲ３）；または
配列番号７３（ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＣＤＲ２）、および配列番号７５（ＣＤＲ３）
を含み；
前記軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、
配列番号８（ＣＤＲ１）、配列番号９（ＣＤＲ２）、および配列番号１０（ＣＤＲ３）；
配列番号１８（ＣＤＲ１）、配列番号１９（ＣＤＲ２）、および配列番号２０（ＣＤＲ３）；
配列番号２８（ＣＤＲ１）、配列番号２９（ＣＤＲ２）、および配列番号３０（ＣＤＲ３）；
配列番号３８（ＣＤＲ１）、配列番号３９（ＣＤＲ２）、および配列番号４０（ＣＤＲ３）；
配列番号４８（ＣＤＲ１）、配列番号４９（ＣＤＲ２）、および配列番号５０（ＣＤＲ３）；
配列番号５８（ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＣＤＲ３）；
配列番号６８（ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＣＤＲ２）、および配列番号７０（ＣＤＲ３）；または
配列番号７８（ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＣＤＲ２）、および配列番号８０（ＣＤＲ３）
を含む、抗体またはそのフラグメント。
［２６］ 配列番号５３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号５４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号５５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号５８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号５９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号６０（ＶＬ ＣＤＲ３）；
配列番号６３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号６４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号６５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号６８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号６９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号７０（ＶＬ ＣＤＲ３）；ならびに
配列番号７３（ＶＨ ＣＤＲ１）、配列番号７４（ＶＨ ＣＤＲ２）、配列番号７５（ＶＨ ＣＤＲ３）、配列番号７８（ＶＬ ＣＤＲ１）、配列番号７９（ＶＬ ＣＤＲ２）、および配列番号８０（ＶＬ ＣＤＲ３）
からなる群から選択されるＣＤＲ領域の組み合わせを含む、［２５］に記載の抗体。
［２７］ ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） ₂ 、一本鎖ダイアボディ、抗体模倣体、および抗体可変ドメインから選択される、［２２］～[２６]のいずれか一に記載の抗体。
［２８］ ｓｃＦｖを含む、［２７］に記載の抗体。
［２９］ Ｆａｂを含む、［２７］に記載の抗体。
［３０］ 約１００ｎＭ以下のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３１］ 約１００ｎＭ～約１ｎＭの範囲のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３２］ 約１００ｎＭ～約１ｎＭの範囲のＩＣ ₅₀ を有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３３］ 約５０ｎＭ以下のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３４］ 約２５０ｐＭ～約１ｐＭの範囲のＫｄを有してチカグレロルまたはその代謝産物もしくは誘導体に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３５］ 約１００ｐＭ～約１ｐＭの範囲のＫｄを有してチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物に結合する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３６］ フェノフィブラート、ニルバジピン、シロスタゾール、ブクラデシン、レガデノソン、シクロチアジド、シフルトリン、ロバスタチン、リネゾリド、シンバスタチン、カングレロル、パントプラゾール、アデノシン、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、２－ＭｅＳアデノシン二リン酸、および２－ＭｅＳアデノシン三リン酸からなる群から選択される化合物について約５０μＭ以下のＩＣ ₅₀ を示す、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３７］ 約１２時間の生体内半減期を有する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３８］ チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［３９］ 投与から約３０分以内にチカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の抗血小板作用を中和する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［４０］ チカグレロルまたはチカグレロルの活性代謝産物の存在下で、ＡＤＰ誘導性血小板凝集を修復する、［２２］～[２９]のいずれか一に記載の抗体。
［４１］ チカグレロルを投与された患者の急な出血を治療する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４２］ 外科手術を受けたか、または受けており、かつチカグレロルを投与された患者の重度の出血を治療する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４３］ チカグレロルを投与された患者の出血を予防する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４４］ 患者における（Ｐ２Ｙ ₁₂ ）受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の影響を阻害する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４５］ 患者におけるＰ２Ｙ ₁₂ 受容体に対する、チカグレロルまたはその活性代謝産物の結合を阻害する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４６］ チカグレロルを投与された患者におけるＡＤＰ誘導性血小板凝集を活性化する方法であって、有効量の［１］～[４０]のいずれか一に記載の抗体を前記患者に投与する工程を含む方法。
［４７］ 前記患者が外科手術を受ける予定である、［４３］～[４６]のいずれか一に記載の方法。
［４８］ ［２２］～[２６]のいずれか一に記載の抗体をコードする配列を含む核酸分子を含む組成物。
［４９］ 前記核酸分子が、配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６を含む、［４８］に記載の組成物。
［５０］ 配列番号１、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５６、配列番号６１、配列番号６６、配列番号７１、または配列番号７６を含む核酸分子を含むベクター。
［５１］ ［５０］に記載のベクターを含む宿主細胞。
［５２］ チカグレロルのシクロペンチル環上のヒドロキシエチル基を含むエピトープに結合しない、［１］～[１０]または［２２］～［２９］のいずれか一に記載の抗体。
［５３］ チカグレロルのシクロプロピル－ジフルオロフェニル基を含むエピトープに結合する、［１］～[１０]または［２２］～［２９］のいずれか一に記載の抗体。
［５４］ チカグレロルのシクロプロピル－ジフルオロフェニル基を含むエピトープに結合するが、チカグレロルのシクロペンチル環上のヒドロキシエチル基を含むエピトープに結合しない、［１］～[１０]または［２２］～［２９］のいずれか一に記載の抗体。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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