ホーム > 特許ランキング > ＰＲＯＴＨＩＸ ＢＶ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-21
(45)【発行日】2022-03-02
(54)【発明の名称】第ＸＩ因子の活性部位に対するモノクローナル抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220222BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220222BHJP
A61P 7/02 20060101ALI20220222BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20220222BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220222BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220222BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20220222BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20220222BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220222BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20220222BHJP
C07K 16/36 20060101ALI20220222BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20220222BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20220222BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220222BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220222BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220222BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220222BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20220222BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
A61K39/395 N
A61P7/02
A61P9/00
A61P9/10
A61P9/10 101
A61P11/00
A61P13/12
A61P19/02
A61P29/00
A61P39/02
C07K16/36
C07K16/40
C07K16/46
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
【請求項の数】
23
(21)【出願番号】P 2019501757
(86)(22)【出願日】2017-03-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-06-20
(86)【国際出願番号】 EP2017056924
(87)【国際公開番号】W WO2017162791
(87)【国際公開日】2017-09-28
【審査請求日】2020-03-18
(31)【優先権主張番号】2016477
(32)【優先日】2016-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(73)【特許権者】
【識別番号】518336363
【氏名又は名称】プロティックス ビーヴイ
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＴＨＩＸ ＢＶ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ボロス， ペーテル
(72)【発明者】
【氏名】イルディズ， カフェル
(72)【発明者】
【氏名】ハック， コルネリス エリック
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５１７３０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００９／１５４４６１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2013, Vol.11, p.2118-2127
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／１３
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｐ ７／０２
Ａ６１Ｐ ９／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ １１／００
Ａ６１Ｐ １３／１２
Ａ６１Ｐ １９／０２
Ａ６１Ｐ ２９／００
Ａ６１Ｐ ３９／０２
Ｃ０７Ｋ １６／３６
Ｃ０７Ｋ １６／４０
Ｃ０７Ｋ １６／４６
Ｃ１２Ｎ １／１５
Ｃ１２Ｎ １／１９
Ｃ１２Ｎ １／２１
Ｃ１２Ｎ ５／１０
Ｃ１２Ｐ ２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
第ＸＩ因子の軽鎖に結合し、Ｌ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリンに対する活性化第ＸＩ因子の発色活性を減少させ、第ＸＩ因子への前記結合について、重鎖可変ドメインが配列番号１を含み、且つ軽鎖可変ドメインが配列番号２を含む抗体と交差競合するヒト化抗体又はその抗原結合性断片であって、前記ヒト化抗体の前記重鎖可変ドメインが、配列番号１３～１６のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％の配列同一性があるアミノ酸配列を含み、
前記ヒト化抗体の前記軽鎖可変ドメインが、配列番号１７～２０のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％の配列同一性があるアミノ酸配列を含み、
前記ヒト化抗体が、超可変領域（ＨＶＲ）である、配列番号３の配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４の配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５の配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号６の配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７の配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号８の配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む、ヒト化抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項2】
Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２及びナノボディから選択される、請求項１に記載の抗原結合性断片。
【請求項3】
前記ヒト化抗体の前記重鎖可変ドメインが配列番号１６のアミノ酸配列を含み、前記ヒト化抗体の前記軽鎖可変ドメインが配列番号２０のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項4】
前記ヒト化抗体が、ヒンジ領域に、前記重鎖の鎖内ジスルフィド架橋形成よりも鎖間ジスルフィド架橋に有利な突然変異を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項5】
前記突然変異が、Ｓ２４１Ｐである、請求項４に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項6】
前記ヒト化抗体が、ＩｇＧ４領域である重鎖定常領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項7】
前記ヒト化抗体が、ヒトＦＸＩａの軽鎖に結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む医薬組成物。
【請求項9】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
医薬として使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は請求項８若しくは９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ｉ）ＦＸＩ活性化が介在する疾患、障害又は状態；及びｉｉ）ＦＸＩの阻害が有益な効果を有する疾患、障害又は状態のうちの少なくとも１つの防止又は処置に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は請求項８若しくは９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記疾患、障害又は状態が、凝固が関係する疾患、障害又は状態である、請求項１１に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は医薬組成物。
【請求項13】
前記疾患が、ＦＸＩを介する凝固活性化を伴う血栓塞栓性疾患又は炎症性疾患である、請求項１１又は１２に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は医薬組成物。
【請求項14】
使用が、病理学的血栓症を防止若しくは処置するため又は医療手順が原因で血栓症を発症するリスクが増大している対象において血栓症を防止するためのものである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は医薬組成物。
【請求項15】
使用が、心筋梗塞、虚血性脳卒中、心房細動による心原性脳塞栓症、血管アクセス血栓症、深部静脈血栓症、動脈血栓、冠血栓症、アテローム性動脈硬化症、関節炎、脈管炎、呼吸障害症候群、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、肺塞栓症、手術若しくは固定化に起因する静脈血栓塞栓症、人工血管移植、ステント、若しくは動静脈瘻の血栓症及び閉塞、人工心臓弁、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、血液透析、心房細動、敗血症、感染性ショック、臓器不全、腎不全、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ投与によって誘導される毒性、多発性損傷、虚血－再灌流傷害、局所的な望ましくない線維素沈着並びに成人呼吸窮迫の間の肺胞における線維素沈着からなる群から選択される少なくとも１つの障害、疾患又は状態を防止又は処置するためのものである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は医薬組成物。
【請求項16】
前記抗体その抗原結合性断片又は組成物が、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下投与されるためのものである、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は医薬組成物。
【請求項17】
前記抗体、その抗原結合性断片又は組成物が、ボーラス注入又は２時間未満～２４時間にわたる持続注入として静脈内投与されるためのものである、請求項１６に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は医薬組成物。
【請求項18】
前記抗体、その抗原結合性断片又は組成物が、定期的な透析を受けている腎臓患者における人工血管移植、ステント又は動静脈瘻の血栓症及び閉塞の防止、減少又は処置に使用するためのものであり、前記抗体、その抗原結合性断片又は組成物が、前記患者に戻される透析された体液中で前記患者に投与されるためのものである、請求項１５に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は医薬組成物。
【請求項19】
前記抗体、その抗原結合性断片又は組成物が、心房細動、不安定狭心症、静脈血栓塞栓症、人工心臓弁、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、人工血管、汎発性血管内凝固、敗血症の患者又は前立腺若しくは整形外科手術を受けている患者において血栓症を防止又は処置するのに使用するためのものであり、抗体、その抗原結合性断片又は組成物が、２週間に１回以下で投与されるためのものである、請求項１５に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は医薬組成物。
【請求項20】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項21】
前記核酸分子が、前記抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのうちの少なくとも１つをコードしているヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項22】
前記コーディングヌクレオチド配列が、宿主細胞において前記コーディングヌクレオチド配列を発現するために調節配列に作動可能に連結されている、請求項２０又は２１に記載の核酸分子。
【請求項23】
請求項２０～２２のいずれか一項に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に医学及び薬学の分野、特に血液凝固に使用するためのバイオ医薬品の分野に関する。より具体的には、本発明は、活性化された第ＸＩ因子による第ＩＸ因子の活性化を阻害する第ＸＩ因子の活性部位に対する抗体に関する。第ＸＩ因子の活性部位に対する抗体は、病理学的血栓形成又は血栓塞栓症に関連する状態の防止及び処置に有用である。
【背景技術】
【0002】
凝固は、体液性及び細胞性反応からなり、止血の必須部分であり、損傷又は傷害によって血液が失われることを停止させる過程である。病理学的凝固又は血栓症とは、正常な止血性過程の部分でなく、疾患症状をもたらし得る凝血塊形成のことを指す。深部静脈血栓症、人工血管に対する血栓症、冠状動脈におけるアテローム硬化性プラークに対する血栓症、微小血管性血栓症及び敗血症における汎発性血管内凝固は、病理学的凝固の例である。加えて、病理学的血栓の部分が、遊離し、血流によって運ばれて肺又は脳など身体内の他の部分で血管を塞ぐ場合があり、その過程は塞栓形成と呼ばれる。塞栓形成を伴う又は伴わない血栓症が役割を果たす疾患は、血栓塞栓性疾患と呼ばれる。
【0003】
血栓塞栓性疾患の主要な処置は抗凝固薬の投与からなり、その薬物は凝固系を阻害する。この系は、不活性酵素及び補因子として循環し、カスケード様の様式で互いを活性化し得る一組の血漿タンパク質である。このカスケードにおける鍵酵素は、トロンビンであり、その酵素は、可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに変換し、ＦＸＩ、ＦＶＩＩＩ及びＦＶを含めた他のいくつかの凝固因子を活性種に活性化し、それにより活性化の増幅をもたらす（凝固因子は、ＦＸＩ、ＦＩＸ等と；活性化された凝固因子は、ＦＸＩａ、ＦＩＸａ、等と呼ばれる）。凝固の過剰な活性化は、アンチトロンビンなどの阻害剤を循環させることによって防止される。
【0004】
凝固カスケードの簡略化したスキームを、図１０に図示する。凝固は、主要又は基礎経路及び２つの増幅ループによって起こる。
【0005】
現在の抗凝固薬は、凝固の共通経路を阻害する：ヘパリン（アンチトロンビンによる）は、トロンビン、ＦＸａ及びＦＩＸａをたたき、クマリンは、プロトロンビン、第ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子の合成を阻害し、一方で低分子量ヘパリンは主にＦＸａを阻害する。これら薬物の治療濃度域は狭く、その使用は、１年間に患者の１～２％に重篤な出血有害事象をもたらす場合があり、一方で軽度の出血事例は、更に頻繁に起こる。例えば、静脈血栓症のため、抗凝固剤で処置される患者は、１００人年当たり７．２事象の大量出血のリスクを有し、致命的出血のリスクは、１００人年当たり１．３１事象であり、大量出血の致死率は１３．４％である（Ｌｉｎｋｉｎｓ ＬＡ、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ ２００３年；１３９：８９３～９００頁）。従って、日常的な抗凝固剤の使用は、出血副作用のリスクが高く、患者の注意深い監視を必要とする。
【0006】
現在のところ、ＦＸＩを標的とする承認済みの抗凝固剤は存在しない。これは、止血におけるＦＸＩの役割が限定されていると考えられていたので、ＦＸＩが、血栓塞栓性過程において、あるとしても、小さな役割しか果たさないと長らく考えられていたことを反映している。実際、ＦＸＩ欠損は、血友病Ａ及びＢなど、関節並びに軟部組織における特発性出血事例を伴う重篤な出血傾向を生じず、むしろ傷害関連出血障害と関連している（Ｄｕｇａ Ｓ、ら、Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２０１３年；３９：６２１～３１頁；Ｆ Ｐｅｙｖａｎｄｉら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２００２年；８７：５１２～５１４頁）。ＦＸＩ欠損の多くの人は、重篤な出血事例を決して経験しない（Ｃａｓｔａｍａｎ Ｇら、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ ２０１４年；２０：１０６～１３頁）。しかしながら、いくつかの研究が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＸＩ機能の阻害により、出血時間に影響を及ぼすことなく病理学的血栓症を防止できることを示し（Ｍｉｎｎｅｍａら、１９９８年、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：１０～１４頁；Ｇｒｕｂｅｒ及びＨａｎｓｏｎ、２００３年、Ｂｌｏｏｄ １０２：９５３～９５５頁；Ｔｕｃｋｅｒら、２００９年、Ｂｌｏｏｄ、１１３：９３６～４４頁；Ｃｈｅｎｇら、２０１０年、Ｂｌｏｏｄ １１６：３９８１～９頁；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２０１０年、Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ、１２５：４６４～７０頁；ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔら、２０１３年、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １１０：１０６５～７３頁）、このことが、病理学的血栓形成におけるＦＸＩの重要な役割を支持した。おそらく、正常な止血対病理学的血栓形成におけるＦＸＩのこの差異的使用は、正常な止血が高い組織因子（ＴＦ）濃度によって主に起動され、従ってＦＸＩ増幅ループ（図１０を参照のこと）から独立しているが、病理学的血栓形成は低いＴＦ濃度で開始されることを反映している。正常な止血対血栓塞栓性過程におけるこの差異的役割のため、ＦＸＩを血液凝固阻止戦略の魅力的な標的である（Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ ＥＣら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１０年；８：２３４９～５７頁）。ＦＸＩを標的とする一手法は、肝臓におけるＦＸＩの合成を低下させることを狙うアンチセンスオリゴヌクレオチドに基づく治療である。この手法は、動物モデル（Ｚｈａｎｇ Ｈら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０年；１１６：４６８４～４６９２頁；Ｙｏｕｎｉｓ ＨＳら、Ｂｌｏｏｄ ２０１２年；１１９：２４０１～０８頁）及びヒト（Ｂｕｌｌｅｒ Ｈら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５年；３７２：２３２～４０頁）において有望な結果を示した。しかしながら、ＦＸＩの合成を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＸＩレベルを十分に下げるのに少なくとも１～２週間かかるので、急性血栓塞栓性状態に使用することができない（Ｙｏｕｎｉｓ ＨＳら、Ｂｌｏｏｄ ２０１２年；１１９：２４０１～０８頁）。更に、長期毒性については知られていない。それ故、血液凝固阻止戦略としてＦＸＩを標的とするための異なる手法が必要である。別の一手法は、ＦＸＩの機能的活性を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を適用することである。
【0007】
本発明は、ＦＸＩを標的とし、出血のリスクが、あるとしても低い新規の抗凝固薬を開示する。従って、これら新規の抗凝固剤の臨床的使用は、患者の監視を必要としない。ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性部位を遮断する阻害剤は、ＦＸＩを標的とする好ましい手法となり得る。しかしながら、ＦＸＩは、セリンプロテアーゼであり、その活性部位は、他の多くのセリンプロテアーゼ、特にセリンプロテアーゼのトリプシンファミリーの活性部位と相同である。他の凝固因子、線維素溶解及び補体プロテアーゼは同じファミリーに属し、全てが、相同な活性部位を有する。それ故、ＦＸＩａの小分子阻害剤は、他のセリンプロテアーゼとの交差反応のため、それ特有の毒性のリスクを有する。ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性部位に結合し、ＦＸＩａによるタンパク質及びペプチド基質の変換を遮断するｍＡｂは、治療適用に好ましい選択肢である。しかしながら、ＦＸＩａの活性部位に対するそのような阻害性ｍＡｂは、これまで記述されていない。
【0008】
Ｓｉｎｈａら（Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８５年；２６０：１０７１４～９頁）は、ＦＸＩａの軽鎖に対して作られたと思われる５Ｆ４ ｍＡｂを開示しており、その抗体は、ＦＸＩａ活性を１００％阻害すると開示されている。しかしながら、Ａｋｉｙａｍａら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８６年；７８：１６３１～１６３７頁）は、５Ｆ４ ｍＡｂがＦＸＩａの発色活性を阻害せず、従ってＦＸＩａの活性部位に結合しないことをその後報告した。５Ｆ４ ｍＡｂは、おそらくＦＸＩａの軽鎖上のエキソサイトに対して作られている（Ｓｉｎｈａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年；４６：９８３０～９頁）。
【0009】
従って、第ＸＩ（ａ）因子のセリンプロテアーゼドメインに結合し、第ＸＩａ因子の小さい発色性基質の変換及び第ＸＩａ因子による第ＩＸａ因子への第ＩＸ因子の変換を阻害する抗体を提供することが本発明の目的である。本発明は、そのようなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のヒト化バージョン、及び血栓塞栓性疾患を処置又は防止するための抗体の適用を更に提供する。
【発明の概要】
【0010】
第１の態様において、本発明は、第ＸＩ因子（第ＸＩ因子）の軽鎖に結合する抗体に関する。抗体は、活性化された第ＸＩ因子（第ＸＩａ因子）の発色活性を減少させることが好ましく、その際発色基質は、Ｌ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリンであることが好ましい。抗体は、第ＸＩ因子への結合について、重鎖可変ドメインが配列番号１を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２を含む抗体と交差競合することが更に好ましい。
【0011】
本発明による好ましい抗体は、配列番号３の配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４の配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５の配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号６の配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７の配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号８の配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される超可変領域（ＨＶＲ）を少なくとも１つ含む。抗体は、配列番号３の配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４の配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５の配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号６の配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７の配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号８の配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される超可変領域（ＨＶＲ）を２、３、４、５又は６個含むことがより好ましい。
【0012】
本発明による抗体は、マウス、キメラ又はヒト化抗体であることが好ましい。別法として、抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２及びナノボディから選択される抗体断片であり得る。
【0013】
本発明による好ましい抗体又は抗体断片は、配列番号１３～１６のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％の配列同一性があるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号１７～２０のうちの少なくとも１つと少なくとも９５％の配列同一性があるアミノ酸配列を含む抗体の軽鎖可変ドメインを含む。抗体又は抗体断片において、抗体の重鎖可変ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【0014】
本発明による抗体は、ヒンジ領域に、重鎖の鎖内ジスルフィド架橋形成よりも鎖間ジスルフィド架橋に有利な突然変異を含むことが好ましい。突然変異はＳ２４１Ｐであることがより好ましい。
【0015】
本発明による好ましい抗体において、抗体は、ＩｇＧ４領域、より好ましくはヒトＩｇＧ４領域である重鎖定常領域を含む。
【0016】
本発明による抗体は、ヒトＦＸＩａの軽鎖に結合することが更に好ましい。
【0017】
第２の態様において、本発明は、本発明による抗体又は抗体断片及び任意選択で薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物に関する。
【0018】
第３の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体、抗体断片又は医薬組成物に関する。
【0019】
第４の態様において、本発明は、ｉ）ＦＸＩ活性化が介在する疾患、障害又は状態；及びｉｉ）ＦＸＩの阻害が有益な効果を有する疾患、障害又は状態のうちの少なくとも１つの防止又は処置に使用するための本発明による抗体、抗体断片又は医薬組成物に関する。疾患、障害又は状態は、凝固が関係する疾患、障害又は状態であることが好ましい。疾患は、ＦＸＩを介する凝固活性化を伴う血栓塞栓性疾患又は炎症性疾患であることがより好ましい。別法として、抗体、抗体断片又は医薬組成物は、本発明による使用のためのものであり、その使用は、病理学的血栓症を防止若しくは処置するため又は医療手順が原因で血栓症を発症するリスクが増大している対象において血栓症を防止するためのものである。従って、本発明による使用は、心筋梗塞、虚血性脳卒中、心房細動による心原性脳塞栓症、血管アクセス血栓症、深部静脈血栓症、動脈血栓、冠血栓症、アテローム性動脈硬化症、関節炎、脈管炎、呼吸障害症候群、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、肺塞栓症、手術若しくは固定化に起因する静脈血栓塞栓症、人工血管移植、ステント、若しくは動静脈瘻の血栓症及び閉塞、人工心臓弁、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、血液透析、心房細動、敗血症、感染性ショック、臓器不全、腎不全、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ投与によって誘導される毒性、多発性損傷、虚血－再灌流傷害、局所的な望ましくない線維素沈着並びに成人呼吸窮迫の間の肺胞における線維素沈着からなる群から選択される少なくとも１つの障害、疾患又は状態を防止又は処置するための使用であり得る。
【0020】
抗体、抗体断片又は医薬組成物は、本発明による使用のためのものであることが好ましく、抗体は、静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下投与される。静脈内投与は、ボーラス注入又は２時間未満～２４時間にわたる持続注入であることが好ましい。
【0021】
抗体、抗体断片又は医薬組成物が、定期的な透析を受けている腎臓患者における人工血管移植、ステント又は動静脈瘻の血栓症（及び閉塞）の防止、減少又は処置に使用するためのものである場合、抗体、抗体断片又は組成物は、患者に戻される透析された体液中で患者に投与されることが好ましい。
【0022】
別法として、本発明による使用のための抗体、抗体断片又は医薬組成物は、心房細動、不安定狭心症、静脈血栓塞栓症、人工心臓弁、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、人工血管、汎発性血管内凝固、敗血症の患者又は前立腺若しくは整形外科手術を受けている患者において血栓症を防止又は処置するのに使用するためのものであり、前記結合分子が、２週間に１回以上（頻繁に）投与されない。
【0023】
第５の態様において、本発明は、本発明による抗体又は抗体断片をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。核酸分子は、抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのうちの少なくとも１つをコードしているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。核酸分子において、コーディングヌクレオチド配列は、宿主細胞においてコーディングヌクレオチド配列を発現するために調節配列に作動可能に連結されていることがより好ましい。
【0024】
第６の態様において、本発明は、第５の態様による核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1A】Ａ）ａＰＴＴ、Ｂ）ＰＴ又はＣ）ヒト血漿のＦＸＩ活性に対する精製マウス抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂの効果を示す図である。ＭＡｂ ０．２～０．９ｍｇ／ｍＬを指示の通り希釈し、ヒト血漿と１：１で混合した。ＡＰＴＴ（Ａ）、ＰＴ（Ｂ）又は混合物のＦＸＩ活性Ｃ）を測定した。
【図1B】Ａ）ａＰＴＴ、Ｂ）ＰＴ又はＣ）ヒト血漿のＦＸＩ活性に対する精製マウス抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂの効果を示す図である。ＭＡｂ ０．２～０．９ｍｇ／ｍＬを指示の通り希釈し、ヒト血漿と１：１で混合した。ＡＰＴＴ（Ａ）、ＰＴ（Ｂ）又は混合物のＦＸＩ活性Ｃ）を測定した。
【図1C】Ａ）ａＰＴＴ、Ｂ）ＰＴ又はＣ）ヒト血漿のＦＸＩ活性に対する精製マウス抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂの効果を示す図である。ＭＡｂ ０．２～０．９ｍｇ／ｍＬを指示の通り希釈し、ヒト血漿と１：１で混合した。ＡＰＴＴ（Ａ）、ＰＴ（Ｂ）又は混合物のＦＸＩ活性Ｃ）を測定した。
【図2A】ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２が、ＦＸＩのセリンプロテアーゼドメイン内のエピトープ、及びｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３が、アップル２ドメイン内のエピトープに結合することを示す図である。ＥＬＩＳＡウェルを、ｔＰＡ及びＦＸＩの単一アップルドメインの融合タンパク質（図においてアップル１～４と示す）、又は精製血漿ＦＸＩ（第ＸＩ因子）でコーティングした。抗ＦＸＩ ｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、アップルドメインのいずれにも結合しないが、４つのアップルドメインに加えて、セリンプロテアーゼドメインも含む血漿第ＸＩ因子だけに結合する。
【図2B】ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２が、ＦＸＩのセリンプロテアーゼドメイン内のエピトープ、及びｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３が、アップル２ドメイン内のエピトープに結合することを示す図である。ＥＬＩＳＡウェルを、ｔＰＡ及びＦＸＩの単一アップルドメインの融合タンパク質（図においてアップル１～４と示す）、又は精製血漿ＦＸＩ（第ＸＩ因子）でコーティングした。抗ＦＸＩ ｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、アップルドメインのいずれにも結合しないが、４つのアップルドメインに加えて、セリンプロテアーゼドメインも含む血漿第ＸＩ因子だけに結合する。
【図3A】血漿中のトロンビン生成に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果が、Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）低濃度ＴＦ（１ｐＭ）又はＣ）高濃度ＴＦ（５ｐＭ）によって誘導されたことを示す図である。ｍＡｂを、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）、終濃度１ｐＭでＴＦ（Ｂ）又は終濃度５ｐＭでＴＦ（Ｃ）を添加し、トロンビンの生成を材料及び方法に記載の通りリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン（ＦＩＩａ）濃度（ｎＭ）である。
【図3B】血漿中のトロンビン生成に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果が、Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）低濃度ＴＦ（１ｐＭ）又はＣ）高濃度ＴＦ（５ｐＭ）によって誘導されたことを示す図である。ｍＡｂを、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）、終濃度１ｐＭでＴＦ（Ｂ）又は終濃度５ｐＭでＴＦ（Ｃ）を添加し、トロンビンの生成を材料及び方法に記載の通りリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン（ＦＩＩａ）濃度（ｎＭ）である。
【図3C】血漿中のトロンビン生成に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果が、Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）低濃度ＴＦ（１ｐＭ）又はＣ）高濃度ＴＦ（５ｐＭ）によって誘導されたことを示す図である。ｍＡｂを、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）、終濃度１ｐＭでＴＦ（Ｂ）又は終濃度５ｐＭでＴＦ（Ｃ）を添加し、トロンビンの生成を材料及び方法に記載の通りリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン（ＦＩＩａ）濃度（ｎＭ）である。
【図4A】Ａ）ＦＸＩａの発色活性及びＦＸＩａによるＦＩＸの変換Ｂ）に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２の効果を示す図である。Ａ）ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩａの発色活性を阻害する。精製ＦＸＩａ（およそ３ｎＭ）を、精製抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２と２５及び５０ｎＭで、並びに対照ｍＡｂとインキュベートした。ＦＸＩａの活性を、発色基質Ｓ２３６６で次いで評価した。Ｂ）ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩａによるＦＩＸの変換を阻害する。精製ＦＸＩａを、精製抗ＦＸＩ ｍＡｂとインキュベートした。活性を、精製ＦＩＸとのインキュベーションによって次いで評価した。ＦＩＸａの生成を、ＦＸとのインキュベーションによって次いで監視した。その後、混合物中のＦＸａレベルを、発色基質Ｓ２２２２で測定した。ｍＡｂとインキュベートしていないＦＸＩａを、１００％に設定した。
【図4B】Ａ）ＦＸＩａの発色活性及びＦＸＩａによるＦＩＸの変換Ｂ）に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２の効果を示す図である。Ａ）ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩａの発色活性を阻害する。精製ＦＸＩａ（およそ３ｎＭ）を、精製抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２と２５及び５０ｎＭで、並びに対照ｍＡｂとインキュベートした。ＦＸＩａの活性を、発色基質Ｓ２３６６で次いで評価した。Ｂ）ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩａによるＦＩＸの変換を阻害する。精製ＦＸＩａを、精製抗ＦＸＩ ｍＡｂとインキュベートした。活性を、精製ＦＩＸとのインキュベーションによって次いで評価した。ＦＩＸａの生成を、ＦＸとのインキュベーションによって次いで監視した。その後、混合物中のＦＸａレベルを、発色基質Ｓ２２２２で測定した。ｍＡｂとインキュベートしていないＦＸＩａを、１００％に設定した。
【図5A】ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果を示す図である。Ａ）マウスにおけるＩＶＣ血栓症に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果。ＦＸＩ－／－マウスにヒトＦＸＩを与え、続いて生理食塩水又はｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（８ｍｇ／ｋｇ）を注射した。血栓症を、ＩＶＣに、１０％ＦｅＣｌ３に浸漬した濾紙を３分間適用することにより次いで誘導した。静脈血流を、３０分間測定した。データは、５匹の動物の平均及びＳＤを示す。Ｂ）マウスにおいて尾部出血時間を延長するエノキサパリンとは対照的に、ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は尾部出血時間に影響を及ぼさない。ＦＸＩ－／－マウスにヒトＦＸＩを与え、続いて生理食塩水（対照）、エノキサパリン（１ｍｇ／ｋｇ）又はｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（８ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを単回投与した。その後、尾部出血を誘導し、出血停止までの時間を秒で記録した。各記号は、１匹の動物を示し、水平な線は中央値を示す。
【図5B】ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果を示す図である。Ａ）マウスにおけるＩＶＣ血栓症に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果。ＦＸＩ－／－マウスにヒトＦＸＩを与え、続いて生理食塩水又はｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（８ｍｇ／ｋｇ）を注射した。血栓症を、ＩＶＣに、１０％ＦｅＣｌ３に浸漬した濾紙を３分間適用することにより次いで誘導した。静脈血流を、３０分間測定した。データは、５匹の動物の平均及びＳＤを示す。Ｂ）マウスにおいて尾部出血時間を延長するエノキサパリンとは対照的に、ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は尾部出血時間に影響を及ぼさない。ＦＸＩ－／－マウスにヒトＦＸＩを与え、続いて生理食塩水（対照）、エノキサパリン（１ｍｇ／ｋｇ）又はｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（８ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを単回投与した。その後、尾部出血を誘導し、出血停止までの時間を秒で記録した。各記号は、１匹の動物を示し、水平な線は中央値を示す。
【図6A】Ａ）ヒト血漿のａＰＴＴに対するＡ）キメラマウス－ヒト抗ＦＸＩ ３４．２又はＢ）精製したコンポジットヒト抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂの効果を示す図である。Ａ）キメラｍＡｂを、指示濃度でヒト血漿に添加した。その後、混合物のａＰＴＴを、決定した。Ｂ）元のマウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２及びマウス－ヒトキメラ抗体の効果を、比較のために示す。ＮＰＰ＝正常なプールされた血漿（ｍＡｂ含まず）。ＭＡｂ抗Ｃ２－６０は、対照ｍＡｂであり、ｍＡｂ抗ＦＸＩ－２０Ｄ４及び抗ＦＸＩ－１００は、対照として含めた非阻害性抗ＦＸＩ ｍＡｂである。
【図6B】Ａ）ヒト血漿のａＰＴＴに対するＡ）キメラマウス－ヒト抗ＦＸＩ ３４．２又はＢ）精製したコンポジットヒト抗ヒトＦＸＩ ｍＡｂの効果を示す図である。Ａ）キメラｍＡｂを、指示濃度でヒト血漿に添加した。その後、混合物のａＰＴＴを、決定した。Ｂ）元のマウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２及びマウス－ヒトキメラ抗体の効果を、比較のために示す。ＮＰＰ＝正常なプールされた血漿（ｍＡｂ含まず）。ＭＡｂ抗Ｃ２－６０は、対照ｍＡｂであり、ｍＡｂ抗ＦＸＩ－２０Ｄ４及び抗ＦＸＩ－１００は、対照として含めた非阻害性抗ＦＸＩ ｍＡｂである。
【図7A】Ａ）Ａ）ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４又はＢ）マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２とドナー２０名からのＰＢＭＣとのインキュベーションに対して観察した５～８日目における増殖インデックスを示す図である。刺激指数≧２を陽性と考える。増殖境界線を、星印で示す。
【図7B】Ａ）Ａ）ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４又はＢ）マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２とドナー２０名からのＰＢＭＣとのインキュベーションに対して観察した５～８日目における増殖インデックスを示す図である。刺激指数≧２を陽性と考える。増殖境界線を、星印で示す。
【図8A】Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）５ｐＭ ＴＦ、Ｃ）１ｐＭ ＴＦ、又はＤ）０．２５ｐＭ ＴＦによって誘導した血漿中トロンビン生成に対するｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の効果を示す図である。ＭＡｂ ＶＨ４ＶΚ４を、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）又は終濃度５ｐＭ ＴＦ（Ｂ）、１ｐＭ ＴＦ（Ｃ）若しくは０．２５ｐＭ ＴＦ（Ｄ）を添加し、トロンビンの生成をリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン濃度（ｎＭ）である。
【図8B】Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）５ｐＭ ＴＦ、Ｃ）１ｐＭ ＴＦ、又はＤ）０．２５ｐＭ ＴＦによって誘導した血漿中トロンビン生成に対するｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の効果を示す図である。ＭＡｂ ＶＨ４ＶΚ４を、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）又は終濃度５ｐＭ ＴＦ（Ｂ）、１ｐＭ ＴＦ（Ｃ）若しくは０．２５ｐＭ ＴＦ（Ｄ）を添加し、トロンビンの生成をリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン濃度（ｎＭ）である。
【図8C】Ａ）ａＰＴＴ試薬、Ｂ）５ｐＭ ＴＦ、Ｃ）１ｐＭ ＴＦ、又はＤ）０．２５ｐＭ ＴＦによって誘導した血漿中トロンビン生成に対するｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の効果を示す図である。ＭＡｂ ＶＨ４ＶΚ４を、指示した終濃度になるようにプールされている正常なヒト血漿に添加した。ａＰＴＴ試薬（Ａ）又は終濃度５ｐＭ ＴＦ（Ｂ）、１ｐＭ ＴＦ（Ｃ）若しくは０．２５ｐＭ ＴＦ（Ｄ）を添加し、トロンビンの生成をリアルタイムで測定した。Ｘ軸は、時間（分）を示し、Ｙ軸は、指示時間での血漿中のトロンビン濃度（ｎＭ）である。
【図9】マウスにおける実験的ＩＶＣ血栓症に対するｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４の効果を示す図である。ＦＸＩ－／－マウスにヒトＦＸＩを与え、続いて生理食塩水又はｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４（８ｍｇ／ｋｇ）を単回投与した。血栓症を、下大静脈（ＩＶＣ）に、１０％ＦｅＣｌ３に浸漬した濾紙を３分間適用することにより次いで誘導した。静脈血流を、３０分間測定した。データは、６匹の動物の平均及びＳＥＭを示す。生理食塩水対照は、図５Ａの場合と同じである。
【図10】凝固の簡略化したスキームである。明確にするためにリン脂質膜などの重要な成分、アンチトロンビン及びＴＦＰＩなどの調節タンパク質並びにプロテインＣ系は、図示しない。
【発明を実施するための形態】
【0026】
［発明の説明］
定義
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、例えば抗体又はその断片、ユニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、特にＦＸＩ／ＦＸＩａに結合し、ＦＸＩ／ＦＸＩａの機能的活性を阻害する四価若しくは他の多価抗体を特に包含する。用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体組成物、ファージライブラリに由来する全長又は無傷なモノクローナル抗体を含めたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗原結合タンパク質並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片を含めた抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の断片（下記参照）、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、一本鎖Ｆｖのことを指す。ラクダ科動物抗体又はその断片（「ナノボディ」）など他の動物種において作製される抗体も、この適用の範囲に該当する。更に、設計反復タンパク質様ＤＡＲＰｉｎｓ（設計アンキリン反復タンパク質）などの抗体様の結合特性を持つ分子は、この適用の範囲内である。これら抗体形態の全ては、所望の生物学的及び／又は免疫学的活性を呈する限り、本発明の範囲内である。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書における抗体と交換可能で使用される。抗体は、ヒト及び／又はヒト化であり得る。
定義
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、例えば抗体又はその断片、ユニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、特にＦＸＩ／ＦＸＩａに結合し、ＦＸＩ／ＦＸＩａの機能的活性を阻害する四価若しくは他の多価抗体を特に包含する。用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体組成物、ファージライブラリに由来する全長又は無傷なモノクローナル抗体を含めたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体、ヒト抗体、合成抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗原結合タンパク質並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片を含めた抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の断片（下記参照）、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、一本鎖Ｆｖのことを指す。ラクダ科動物抗体又はその断片（「ナノボディ」）など他の動物種において作製される抗体も、この適用の範囲に該当する。更に、設計反復タンパク質様ＤＡＲＰｉｎｓ（設計アンキリン反復タンパク質）などの抗体様の結合特性を持つ分子は、この適用の範囲内である。これら抗体形態の全ては、所望の生物学的及び／又は免疫学的活性を呈する限り、本発明の範囲内である。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書における抗体と交換可能で使用される。抗体は、ヒト及び／又はヒト化であり得る。
【0027】
用語「抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体」又は「ＦＸＩ／ＦＸＩａに結合する抗体」とは、抗体が、ＦＸＩ／ＦＸＩａを標的とし、阻害する診断及び／又は治療的薬剤として有用であるような充分な親和性でＦＸＩ／ＦＸＩａに結合する能力がある抗体のことを指す。天然のＦＸＩに対する結合親和性は、ＦＸＩａに対する結合親和性と類似であり得、又はＦＸＩａに対して天然のＦＸＩより高くなり得、又はＦＸＩａと比較してＦＸＩに対してより高くなり得る。本文において、抗体は、他の場所において抗ＦＸＩａ抗体又は抗ＦＸＩ抗体として示されるが、抗ＦＸＩ ｍＡｂの３つの型の全てが、この発明の範囲にあると考えられる。無関係な、非ＦＸＩタンパク質への抗ＦＸＩ／ＦＸＩａ抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡによって測定されるＦＸＩ／ＦＸＩａへの抗体結合の約１０％未満であることが好ましい。ある特定の実施形態において、ＦＸＩ／ＦＸＩａに結合する抗体は、≦１ｍＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦５ｎＭ、≦１ｎＭ又は≦０．１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。ある特定の実施形態において、抗ＦＸＩａ抗体は、異なる種由来のＦＸＩａに共通して保存されているＦＸＩａのエピトープに結合する。
【0028】
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から同定され、分離及び／又は回収された抗体である。その天然の環境の汚染物質成分は、抗体の治療上の使用と干渉することになる材料であり、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は（１）ローリー法で決定される抗体の９５重量％を超える、最も好ましくは９９重量％より多く、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって少なくともＮ末端又は内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度、又は（３）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を使用する還元若しくは非還元状態下のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一に精製されることになる。抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しなくなるので、単離された抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕで組換え細胞中に抗体を含む。しかしながら、通常、単離した抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。
【0029】
基本的な４鎖抗体単位は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとともに５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、従って１０個の抗原結合部位を含有し、一方で分泌型ＩｇＡ抗体は重合して、Ｊ鎖とともに基本的な４鎖単位を２～５個含む多価集合を形成できる）。ＩｇＧの場合、４鎖単位は、一般に約１５００００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結され、一方で２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＩｇＧ４サブクラスは、非共有結合性の方法で連結され得る２つのＨ鎖からなる。各Ｈ及びＬ鎖は、規則正しく間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）、それに続きα及びγ鎖のそれぞれに対して３つの定常ドメイン（ＣＨ）並びにμ及びεアイソタイプに対して４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、それに続き他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨと整列され、ＣＬは、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）と整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬの対合が、単一の抗原結合部位を共に形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えばＢａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ及びＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４年、７１頁及び第６章を参照のこと。
【0030】
あらゆる脊椎動物種由来のＬ鎖が、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる明らかに異なる２つの型のうちの１つに割り当てられ得る。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンを異なるクラス又はアイソタイプに割り当てられ得る。５つのクラスの免疫グロブリン：それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される、重鎖を有するＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在する。γ及びαクラスは、ＣＨ配列における比較的小さい差異及び機能に基づいてサブクラスに更に分けられ、例えば、ヒトは、サブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２を発現する。
【0031】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖若しくは軽鎖のアミノ末端ドメインのことを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と称し得る。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と称し得る。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変的な部分であり、抗原結合部位を含有する。
【0032】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定のセグメントが、抗体間の配列において大きく異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を仲介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸幅の全体にわたって均一に分布していない。その代わりに、Ｖ領域は、各９～１２アミノ酸長の「相補性決定領域」（ＣＤＲ）又は「超可変領域」（ＨＶＲ）と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって隔てられている１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的一様な区間からなる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、主にβ－シート配置の形をとり、３つの超可変領域によって接続されているＦＲをそれぞれ４つ含み、超可変領域は、β－シート構造を接続するループを形成し、時には部分を形成する。各鎖の超可変領域はＦＲによって近接近にまとめられ、他の鎖の超可変領域と共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、［１９９１年］を参照のこと）。定常ドメインは、抗原に抗体を結合させることに直接関係しないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など様々なエフェクター機能を呈する。
【0033】
「無傷な」抗体は、抗原結合部位並びにＣＬ及び少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えばヒトの天然配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列バリアントであり得る。無傷な抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有することが好ましい。
【0034】
本明細書の目的の場合「裸の抗体」とは、細胞傷害性部分にコンジュゲートされていない又は放射性標識がない抗体である。
【0035】
「抗体断片」は、無傷な抗体の一部、好ましくは無傷な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号［実施例２］；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７～１０６２頁［１９９５年］を参照のこと）；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体がある。一実施形態において、抗体断片は、無傷な抗体の抗原結合部位を含み、従って抗原に結合する能力を保持する。
【0036】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の抗原結合性断片を２つ、及び命名が容易に結晶化する能力を反映している残りの「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は、完全なＬ鎖並びにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、即ち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価の抗原結合活性を有するジスルフィド結合された２つのＦａｂ断片におおよそ対応し、抗原を架橋する能力がなおある１つの大きいＦ（ａｂ’）２断片を産する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含めＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加の数残基を有することによりＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つＦａｂ’に対する本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、Ｆａｂ’断片の対として最初産生され、対間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学結合も、公知である。
【0037】
Ｆｃ断片は、ジスルフィドによってまとめられた両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、その領域は、特定の型の細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【0038】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、堅く、非共有結合性会合している１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、軽及び重鎖が、２本鎖Ｆｖ種の構造に類似の「二量体」構造で会合できるように、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインは、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合され得る。これら２つのドメインの折りたたみにより、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（それぞれＨ及びＬ鎖からの３つのループ）が生じる。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原特異的なＣＤＲを３つしか含まない、Ｆｖの半分）さえ、抗原を認識し、結合する能力を有する。但し完全な結合部位より低い親和性である。
【0039】
「ｓＦｖ」又は「ｓｃＦｖ」と略記される「一本鎖Ｆｖ」も、単一ポリペプチド鎖に接続されたＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含むことが好ましく、そのリンカーは、ｓＦｖが望ましい構造を形成して抗原結合することを可能にする。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９～３１５頁（１９９４年）を参照のこと。
【0040】
本明細書では用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体のことを指し、即ち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に発生する可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して作られている。更にまた、異なる決定基（エピトープ）に対して作られている異なる抗体を含むポリクローナル抗体標本に対し、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して作られている。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体による汚染を含まずに合成できるという点で有利である。修飾子「モノクローナル」は、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきでない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５年）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって調製することができ、又は細菌、真核生物動物若しくは植物細胞における組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）を使用して作製できる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４～６２８頁（１９９１年）及びＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１～５９７頁（１９９１年）に記述される技術を使用してファージ抗体ライブラリから単離することもできる。
【0041】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一若しくは相同であり、一方で鎖（複数可）の残りは、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが望ましい生物活性を呈する限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；及びＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１～６８５５頁［１９８４年］を参照のこと）。本明細書における対象のキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、サル等）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【0042】
非ヒト（例えば、齧歯目）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する配列を最小限含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類など非ヒト種の超可変領域（ドナー抗体）の残基によって置き換えられるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練するために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、及び一般に２つの可変ドメインの実質的に全てを含むことになり、超可変ループの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般にヒト免疫グロブリンの定常領域、の少なくとも一部も任意選択で含むことになる。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２～５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３～３２９頁（１９８８年）；及びＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３～５９６頁（１９９２年）を参照のこと。以下の総説論文及びその中の引用文献も参照のこと：Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１）：１０５～１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２３：１０３５～１０３８頁（１９９５年）；Ｈｕｒｌｅ及びＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５：４２８～４３３頁（１９９４年）。
【0043】
本明細書において使用される場合、用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」とは、配列内で超可変であり、及び／又は抗原結合に関与する構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つの超可変領域；ＶＨ中に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。いくつかの超可変領域描写が使用されており、本明細書に包含される。超可変領域は、「相補性決定領域」若しくは「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ付番方式；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、公衆衛生局、米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．［１９９１年］に従って付番した場合、ＶＬにおいて残基約２４～３４［Ｌ１］、５０～５６［Ｌ２］及び８９～９７［Ｌ３］前後、並びにＶＨにおいて約３１～３５［Ｈ１］、５０～６５［Ｈ２］及び９５～１０２［Ｈ３］前後）；及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１～９１７頁［１９８７年］に従って付番した場合、ＶＬにおいて残基２４～３４［Ｌ１］、５０～５６［Ｌ２］及び８９～９７［Ｌ３］、並びにＶＨにおいて２６～３２［Ｈ１］、５２～５６［Ｈ２］及び９５～１０１［Ｈ３］）；及び／又は「超可変ループ」／ＣＤＲのアミノ酸残基（例えば、ＩＭＧＴ付番方式；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：２０９～２１２頁［１９９９年］、Ｒｕｉｚ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２１９～２２１頁［２０００年］に従って付番した場合、ＶＬにおいて残基２７～３８［Ｌ１］、５６～６５［Ｌ２］及び１０５～１２０［Ｌ３］、並びにＶＨにおいて２７～３８［Ｈ１］、５６～６５［Ｈ２］及び１０５～１２０［Ｈ３］）を一般に含む。任意選択で、抗体は、Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．及びＰｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．、（Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７～６７０頁［２００１年］）に従って付番した場合、ＶＬにおいて２８、３６（Ｌ１）、６３、７４～７５（Ｌ２）及び１２３（Ｌ３）、並びにＶＨにおいて２８、３６（Ｈ１）、６３、７４～７５（Ｈ２）及び１２３（Ｈ３）の点の１つ以上で対称性の挿入を有する。本発明の抗体の超可変領域／ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ付番方式に従って好ましくは定義され、付番される。
【0044】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書に定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【0045】
「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物活性を阻害又は減少させる抗体である。好ましいブロッキング抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的に又は完全に阻害する。
【0046】
本明細書では「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的活性の少なくとも１つを模倣する抗体である。
【0047】
「種依存的抗体」、例えば、哺乳動物の抗ヒトＩｇＥ抗体は、第２の哺乳動物種からの、第１の哺乳動物種抗原の相同物に対してより第１の哺乳動物種からの抗原に強い結合親和性を有する抗体である。通常、種依存的抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（即ち、約１×１０－７Ｍを超えない、好ましくは約１×１０－８Ｍを超えない、最も好ましくは約１×１０－９Ｍを超えない結合親和性［ＫＤ］値を有する）が、第２の非ヒト哺乳動物種からの抗原の相同物に対して、ヒト抗原に対する結合親和性より少なくとも約５０倍、又は少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１０００倍弱い結合親和性を有する。種依存的抗体は、上で定義した抗体の様々な型のいずれであることもできるが、好ましくはヒト化又はヒト抗体である。
【0048】
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合性相互作用の総計の強さのことを一般に指す。特に明記しない限り、本明細書では、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する内的結合親和性のことを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、親和定数（ＫＤ）によって一般に示し得る。親和性は、本明細書に記述される方法を含め、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定できる。低親和性抗体は、一般にゆっくり抗原に結合し、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は、一般に速く抗原に結合し、より長く結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が、当技術分野において公知であり、そのいずれも、本発明の目的に使用できる。特定の例示的な実施形態を、以下に記述する。
【0049】
「ＫＤ」又は「ＫＤ値」は、およそ１０～５０反応単位（ＲＵ）で抗原を固定化したＣＭ５チップを用いて２５℃でビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（商標）－２０００又はビアコア（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定できる。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、供給元の説明書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を、流速５μＬ／分で注射する前に、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍＬ（およそ０．２μＭ）に希釈して、およそ１０反応単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。抗原の注射後に、１Ｍエタノールアミンを注射して、反応していない基をブロッキングする。動態測定の場合、抗体又はＦａｂの２倍系列希釈（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）が、流速およそ２５μＬ／分で、２５℃で０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に注射される。会合速度（ｋｏｎ又はｋａ）及び解離速度（ｋｏｆｆ又はｋｄ）は、会合及び解離センサグラムを同時に当てはめることによって、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ版３．２）を使用して算出される。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出される。例えば、Ｃｈｅｎ，Ｙ．ら、（１９９９年）Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３：８６５～８８１頁を参照のこと。ｏｎーｒａｔｅが、上記の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ－１Ｓ－１を上回る場合、次いでｏｎーｒａｔｅは、ストップフローを備えた分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）又は撹拌赤色キュベットを含む８０００－シリーズＳＬＭ－Ａｍｉｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計において測定される通り、抗原の濃度増大の存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中の２０ｎＭ抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の２５℃での蛍光放射強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域）の増減を測定する蛍光消光技術を使用することによって決定できる。
【0050】
この発明による「ｏｎ－ｒａｔｅ」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、上記のビアコア（商標）－２０００又はビアコア（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する上述の同じ表面プラズモン共鳴技術で決定できる。
【0051】
対象の抗原、即ちＦＸＩの活性中心に「結合する」抗体は、抗体が、ＦＸＩの機能的活性を阻害する治療的薬剤として有用であるような充分な親和性で抗原に結合するものであり、他のタンパク質と有意に交差反応しない。そのような実施形態において、「非標的」タンパク質に対する抗体の結合の程度は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析又は放射性免疫沈降法（ＲＩＡ）で決定した特定の標的タンパク質への抗体の結合の約１０％未満になる。標的分子に対する抗体の結合に関連して、用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」又は「に対して特異的である」は、非特異的相互作用と測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば一般に、結合活性がない類似構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と類似している対照分子、例えば、過剰の非標識標的との競合によって決定され得る。この場合、プローブへの標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害されるならば、特異的結合が示される。本明細書では用語「特異的結合」又は特定のポリペプチド若しくは特定のポリペプチド標的上のエピトープ「に特異的に結合する」又は「に対して特異的である」は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、別法として少なくとも約１０－５Ｍ、別法として少なくとも約１０－６Ｍ、別法として少なくとも約１０－７Ｍ、別法として少なくとも約１０－８Ｍ、別法として少なくとも約１０－９Ｍ、別法として少なくとも約１０－１０Ｍ、別法として少なくとも約１０－１１Ｍ、別法として少なくとも約１０－１２Ｍ、又はより大きい標的に対するＫＤ（上記の通り決定できる）を有する分子によって呈され得る。一実施形態において、用語「特異的結合」とは、分子が、特定のポリペプチド又は特定のポリペプチド上のエピトープに結合し、他の任意のポリペプチド又はポリペプチドエピトープに実質的に結合しない結合のことを指す。
【0052】
用語「エピトープ」は、抗原結合タンパク質、例えば抗体が結合する分子の部分である。用語は、抗体又はＴ細胞受容体など抗原結合タンパク質に特異的に結合する能力がある任意の決定基を含む。エピトープは、隣接することも又は隣接しないこともできる（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチド配列中では互いに隣接していないが、分子中において抗原結合タンパク質が結合するアミノ酸残基）。ある特定の実施形態において、エピトープは、抗原結合タンパク質を生成するために使用されるエピトープと類似の３次元構造を含み、更に抗原結合タンパク質を生成するために使用されるエピトープに見られるアミノ酸残基を全く又は少ししか含まないという点で模倣体であり得る。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質に存在するが、一部の例において核酸など他の種類の分子にも存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、スルホニル若しくは硫酸基など分子の化学的に活性な表面基を含み得、特定の３次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質及び／又は巨大分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識することになる。
【0053】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル若しくはローカル整列化アルゴリズムを使用して２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列の整列化によって決定され得る。類似の長さの配列は、完全長にわたって配列を最適に整列させるグローバル整列化アルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して好ましくは整列され、実質的に異なる長さの配列は、ローカル整列化アルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して好ましくは整列される。配列は、少なくとも特定の最小のパーセンテージの配列同一性（以下で定義する）を共有する場合（初期値パラメータを使用して例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列させた場合）、それ故「実質的に同一」又は「本質的に類似している」と呼び得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバル整列化アルゴリズムを使用して、２つの配列をその完全長（全長）にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。２つの配列が類似の長さを有する場合、グローバル整列化を適切に使用して、配列同一性を決定する。一般に、ＧＡＰ初期値パラメータは、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）で使用される。ヌクレオチドの場合、使用される初期値スコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、初期値スコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ ８９、９１５～９１９頁）である。パーセンテージ配列同一性のための配列整列化及びスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．、９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから利用可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータプログラムを使用して、又はＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０中にあるプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して、上記のＧＡＰの場合と同じパラメータを使用して、若しくは初期値設定を使用して決定され得る（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方について、並びにタンパク質及びＤＮＡ整列化両方について、初期値Ｇａｐ開始ペナルティは１０．０であり、初期値ギャップ伸長ペナルティは０．５であり；初期値スコアマトリックスはタンパク質に対してＢｌｏｓｓｕｍ６２及びＤＮＡに対してＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が、実質的に異なる全体長を有する場合、Ｓｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する整列化などローカル整列化が好ましい。別法として、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、等などのアルゴリズムを使用する公開データベースに対する検索によって決定できる。
【0054】
２つのアミノ酸配列が、上記の整列化プログラムのいずれかを使用して整列されたら、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（別法としてそれは、所与のアミノ酸配列Ｂへ、それと、若しくはそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと、言い表せる）が、以下の通りに算出される：分数Ｘ／Ｙを１００倍する、ここで、Ｘは、Ａ及びＢの配列整列化プログラムの整列化においてそのプログラムによって同一の一致とスコアされるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないことは理解されよう。
【0055】
「核酸構築物」又は「核酸ベクター」は、組換えＤＮＡ技術の使用により得られる人工核酸分子を意味すると本明細書において理解される。従って、用語「核酸構築物」は、天然に存在する核酸分子を含まない、但し核酸構築物は、天然に存在する核酸分子（の部分）を含み得る。用語「発現ベクター」又は「発現構築物」とは、そのような配列と適合性がある宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を生じさせる能力があるヌクレオチド配列のことを指す。これらの発現ベクターは、少なくとも適切な転写調節配列及び任意選択で、３’転写終結シグナルを一般に含む。発現エンハンサーエレメントなど、発現を生じさせるのに必要な又は有益な追加の因子も存在し得る。発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養においてコード配列の発現を生じさせ得ることになる。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物中での複製に適切であることになる。
【0056】
本明細書では、用語「プロモーター」又は「転写調節配列」とは、１つ以上のコード配列の転写を制御するために機能し、コード配列の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、及び転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位を含むがそれに限らない他の任意のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写量を調節するために直接又は間接的に作用する当業者に公知のヌクレオチドの他の任意の配列の存在によって構造的に同定される核酸断片のことを指す。「構成的」プロモーターは、大部分の生理的及び発達条件下で大部分の組織において活性であるプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、例えば化学誘導物質の適用により、生理的に又は発達上調節されるプロモーターである。
【0057】
本明細書では、用語「作動可能に連結される」とは、機能的関係にあるポリヌクレオチドエレメントの連結のことを指す。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置される場合、「作動可能に連結されている」。例えば、転写調節配列が、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、転写調節配列は、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているとは、連結されているＤＮＡ配列が、一般に隣接しており、２つのタンパク質コード領域を接続するために必要な場合、隣接し且つ読み枠が合っていることを意味する。
【0058】
発明の詳細な説明
本発明の抗ＦＸＩ抗体
本発明は、ＦＸＩを標的とする抗凝固療法の手段及び方法に関する。ＦＸＩは、正常な止血において果たす役割が小さいので、ＦＸＩ阻害剤は、出血副作用のリスクがより少ない。実際、動物においてＦＸＩ欠損又はＦＸＩ阻害は、出血時間に対する効果がなく、出血時間を著しく延長し、診療における重篤な出血副作用と関連する高用量ヘパリンと対照的である。従って、病的血栓症におけるその活性な役割、及びあるとしても、正常な止血における小さい役割のため、ＦＸＩは、抗凝固療法に対する魅力的な標的である。本発明者らは、ヒトにおいてＦＸＩ活性を阻害するための固有の抗体を開発した。
本発明の抗ＦＸＩ抗体
本発明は、ＦＸＩを標的とする抗凝固療法の手段及び方法に関する。ＦＸＩは、正常な止血において果たす役割が小さいので、ＦＸＩ阻害剤は、出血副作用のリスクがより少ない。実際、動物においてＦＸＩ欠損又はＦＸＩ阻害は、出血時間に対する効果がなく、出血時間を著しく延長し、診療における重篤な出血副作用と関連する高用量ヘパリンと対照的である。従って、病的血栓症におけるその活性な役割、及びあるとしても、正常な止血における小さい役割のため、ＦＸＩは、抗凝固療法に対する魅力的な標的である。本発明者らは、ヒトにおいてＦＸＩ活性を阻害するための固有の抗体を開発した。
【0059】
第１の態様において、本発明は、ＦＸＩ又はＦＸＩａの活性中心に特異的に結合し、ＦＸＩａの機能的活性を阻害するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）に関する。本明細書においてＦＸＩは、哺乳動物の血漿凝固第ＸＩ因子と理解される。本発明の抗体は、ヒト第ＸＩ因子のセリンプロテアーゼドメインに特異的に結合し、ＦＸＩａによる基質の変換を阻害することが好ましい。
【0060】
発色アッセイにおいて決定されるＦＸＩａの発色活性に対する（部分的）阻害効果によって同定されるように、本発明の抗体はＦＸＩａの触媒中心を阻害する。発色性基質は、ｐ－ニトロアニリド（ｐＮＡ）に結合した小さいペプチドからなる。基質の加水分解は、分光光度計で測定できるｐＮＡを遊離する。特定のプロテアーゼに対する基質の特異性は、ｐＮＡに連結されるペプチドの正確な配列によって決まる。ＦＸＩａの場合、基質Ｓ２３６６（Ｌ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリン；Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｍｏｌｎｄａｌ、Ｓｗｅｄｅｎ）が、適当である。この基質によるＦＸＩａ活性の測定は、Ｍｉｎｎｅｍａ ＭＣらによって記述されている方法を使用して行い得る（Ｂｌｏｏｄ １９９８年；９２：３２９４～３３０１頁）。
【0061】
本発明の抗体は、ＦＸＩ及びＦＸＩａの少なくとも一方に好ましくは結合し、ＦＸＩａの酵素活性を阻害する。ＦＸＩａのこれら阻害される活性には、ＦＩＸａへのＦＩＸの変換、ＦＸＩａへのＦＸＩの変換（ＦＸＩの自己活性化の間）、及び発色性基質の変換のうちの１つ以上が好ましくはある。本発明の抗体は、ＦＸＩがどのように活性化されているかとは無関係にＦＸＩ／ＦＸＩａの活性を阻害することがより好ましい。
【0062】
抗体は、分子のセリンプロテアーゼドメインに位置する活性部位に結合又は接近することよってＦＸＩ／ＦＸＩａの活性を阻害することが好ましく、ＦＸＩａの基質であるＦＩＸとの相互作用に関係するセリンプロテアーゼドメイン中の部位に結合又は接近することによることがより好ましい。
【0063】
抗体は、ＦＸＩの天然の形態及び活性化形態であるＦＸＩａに結合し、ＦＸＩａの基質であるＦＩＸとの相互作用に関係する部位に結合又は接近することによってＦＸＩａの活性を阻害することが好ましい。
【0064】
従って、本発明の抗体は、ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性部位ドメインに結合し、ＦＸＩａの酵素活性を阻害し、ＦＩＸの活性化を阻害する能力によって特徴付けられる。前記抗体は、本明細書の実施例に記載のアッセイにおいてその効果を評価することにより選択できる。特に、抗ＦＸＩ抗体は、ヒト血漿において活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）によって決定される、凝固系の凝固活性に対する効果を評価することによって選択できる。本発明のＦＸＩ抗体の機能特性は、新鮮なヒト血漿にこれらを添加し、その後標準の凝固アッセイにおいてＡＰＴＴを測定することによって試験できる。ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性を阻害する抗体の場合、ＡＰＴＴの延長が観察される。対照として正常な血漿（正常なＡＰＴＴ）及びＦＸＩ欠損した血漿（延長されるＡＰＴＴ）が、試験される。これらの凝固アッセイは、当技術分野において周知である（本明細書の実施例も参照のこと）。
【0065】
本発明の好ましい抗体は、ａ）活性化第ＸＩ因子の軽鎖に結合し、ｂ）Ｌ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリンに対する第ＸＩａ因子の発色活性を減少させ、ｃ）第ＸＩ因子への結合について、重鎖可変ドメインが配列番号１を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２を含む抗体と交差競合する抗体である。
【0066】
本発明の抗体は、本明細書において上で定義した活性化第ＸＩ因子の軽鎖に特異的に結合することが好ましい。従って、抗体は、抗体が、上記の発色アッセイにおいてＦＸＩの機能的活性を阻害する治療的薬剤として有用であるような充分な親和性でＦＸＩの活性中心に結合することが好ましい。抗体は、他のタンパク質と有意に交差反応しないことが好ましい。本発明の抗体は、１００、５０、１０又は５ｎＭ未満、より好ましくは１ｎＭ未満の親和性でＦＸＩに結合することになることが好ましい。ＦＸＩに対する抗体の特異性は、表面プラズモン共鳴及び／又は酵素免疫測定法などの結合アッセイを含めた当技術分野においてそれ自体公知の任意の適切な様式で決定され得る。
【0067】
本発明の抗体は、発色基質であるＬ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリン（Ｓ２３６６）に対する第ＸＩａ因子の発色活性を減少させることが好ましい。抗体は、Ｓ２３６６基質に対する第ＸＩａ因子の発色活性を少なくとも２、５、１０、２０又は５０％減少させることが好ましい。
【0068】
本発明の抗体は、第ＸＩａ因子への結合について、重鎖可変ドメインが配列番号１を含み、軽鎖可変ドメインが配列番号２を含む抗体と交差競合することが好ましい。２つ以上の抗体の文脈において本明細書で使用される場合、用語「と競合する」又は「と交差競合する」は、２つ以上の抗体が、ＦＸＩへの結合について競合すること、例えば、本明細書の実施例１．４に記述されるＥＬＩＳＡにおいてＦＸＩ結合について競合することを示す。一部の抗体の対の場合、実施例１．４のアッセイにおける競合は、一方の抗体がプレート上にコーティングされ、他方が競合に使用される場合にだけ観察され、その逆はない。用語「と競合する」は、本明細書において使用される場合、そのような組合せ抗体を包含することも意図される。第ＸＩａ因子への結合について配列番号１及び２の可変ドメインによって定義された抗体と交差競合する本発明の抗体は、ＦＸＩａへの定義した抗体の結合を、ＥＬＩＳＡにおいて少なくとも２、５、１０、２０又は５０％減少させることが好ましい。
【0069】
一実施形態において、本発明の抗体は、ＦＸＩ／ＦＸＩａの機能的活性を阻害し、ＡＰＴＴアッセイにおいて約２５～１００ｎＭの濃度でＦＸＩ活性の少なくとも１０、２０、５０又は９０％阻害をもたらす分子であることが好ましい。分子は、ＡＰＴＴアッセイにおいて約２５～１００ｎＭの濃度でＦＸＩ活性の少なくとも９５％阻害をもたらすことがより好ましい。
【0070】
本発明の抗体は、配列番号３の配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４の配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５の配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号６の配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７の配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号８の配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される超可変領域（ＨＶＲ）を少なくとも１つ含むことが好ましい。抗体は、配列番号３の配列を含むＨＶＲ－Ｈ１、配列番号４の配列を含むＨＶＲ－Ｈ２、配列番号５の配列を含むＨＶＲ－Ｈ３、配列番号６の配列を含むＨＶＲ－Ｌ１、配列番号７の配列を含むＨＶＲ－Ｌ２及び配列番号８の配列を含むＨＶＲ－Ｌ３から選択される超可変領域（ＨＶＲ）を２、３、４、５又は６個含むことがより好ましい。
【0071】
本発明の抗体は、マウス、キメラ又はヒト化抗体であることが好ましく、又は抗体は、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２及びナノボディから選択される抗体断片である。
【0072】
本発明による好ましい抗体又は抗体断片は、配列番号１３～１６のうちの少なくとも１つと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性があるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７～２０のうちの少なくとも１つと少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の配列同一性があるアミノ酸配列を含む。抗体の重鎖可変ドメインは配列番号１６のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変ドメインは配列番号２０のアミノ酸配列を含むことがより好ましい。
【0073】
本発明は、例の抗体の重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン又は１つ以上のＨＶＲの機能的バリアントを含む抗体も提供する。抗ＦＸＩ抗体の文脈において使用される重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン又は１つ以上のＨＶＲの機能的バリアントは、抗体が、親抗体の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はより多く）を保持することがなお可能であり、いくつかの場合において、そのような抗ＦＸＩ抗体は、親抗体より大きな親和性、選択性及び／又は特異性と関連する場合がある。本明細書に記載の通り上で決定され得たように、そのような機能的バリアントは、親抗体に対して有意なアミノ酸配列同一性を一般に保持する。
【0074】
ＨＶＲバリアントの配列は、主に保存的置換によって親抗体配列のＨＶＲの配列と異なり得る；例えば、バリアント内の置換の少なくとも約３５、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％は、保存的アミノ酸残基置きかえである。ＨＶＲバリアントの配列は、主に保存的置換によって親抗体配列のＨＶＲの配列と異なり得る；例えば、バリアント内の置換の少なくとも１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個は、保存的アミノ酸残基置きかえである。本発明の文脈において、保存的置換は、以下の３つの表の１つ以上に反映されているアミノ酸クラス内の置換によって定義され得る：
【0075】
【表1】
【表2】
【表3】
【0076】
より保存的な置換群には、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン及びアスパラギン－グルタミンがある。アミノ酸の更なる群は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４年）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（第２版１９９３年）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙに記述される原理を使用して定めることもできる。
【0077】
本発明の一実施形態において、保存も、ヒドロパシー／親水性特性及び残基重量／サイズの点で、例の抗体のＨＶＲと比較してバリアントＨＶＲにおいて実質的に保持される（例えば、重量クラス、ヒドロパシースコア、又は配列の両方が、少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％保持される）。例えば、保存的残基置換はまた、又は別法として、強弱に基づく、重量に基づく保存群の置きかえに基づくことができ、このことは当技術分野において公知である。
【0078】
類似残基の保持は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、標準的な設定ＢＬＯＳＵＭ６２、開始ギャップ＝１１及び伸張ギャップ＝１を使用するＮＣＢＩを通して利用可能なＢＬＡＳＴ２．２．８）の使用により決定される、類似性スコアによっても又は別法として測定され得る。適切なバリアントは、親ペプチドに対して少なくとも約４５、５５、６５、７５、８５、９０、９５又は９９％類似性を一般に呈する。
【0079】
本発明の一実施形態において、抗体は、ヒンジ領域に、重鎖の鎖内ジスルフィド架橋形成よりも鎖間ジスルフィド架橋に有利な突然変異を含む。Ａｎｇｅｌら（１９９３年、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１０５～８頁）に記述されるように、突然変異はＳ２４１Ｐであることが好ましい。
【0080】
本発明の別の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ４領域、好ましくはヒト又はヒト化ＩｇＧ４領域、マウスＩｇＧ１領域、ＩｇＧ１領域、好ましくはヒト又はヒト化ＩｇＧ１領域、より好ましくは補体活性化又はＦｃ受容体相互作用を減少させる若しくは防止するために定常領域において突然変異されているＩｇＧ１領域である重鎖定常領域を含む。別法として、抗体は、単量体ＩｇＭ抗体サブユニット又は単量体ＩｇＡ抗体サブユニット、好ましくは単量体ヒト（化）ＩｇＭ抗体サブユニット又は単量体ヒト（化）ＩｇＡ抗体サブユニット）である。
【0081】
本発明の抗体を生成する
本発明のＭＡｂは、ヒトＦＸＩ／ＦＸＩａ又はこれら分子の部分で免疫した動物から免疫細胞を単離することにより、及び免疫細胞を不死化してハイブリドーマなどの抗体分泌細胞株を得ることによって得られる。様々な精製方法によって単離された、ヒトＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩの単離されたセリンプロテアーゼドメインなどその断片、及び／又はＦＸＩアミノ酸配列を含む合成ペプチドを使用して、適当な宿主動物を免疫できる。所望の抗体を産生する細胞株は、抗体活性の存在について培養上清をスクリーニングし、ＦＸＩの機能的活性に対して選択した抗体の効果を確立することによって同定され得る。
本発明のＭＡｂは、ヒトＦＸＩ／ＦＸＩａ又はこれら分子の部分で免疫した動物から免疫細胞を単離することにより、及び免疫細胞を不死化してハイブリドーマなどの抗体分泌細胞株を得ることによって得られる。様々な精製方法によって単離された、ヒトＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩの単離されたセリンプロテアーゼドメインなどその断片、及び／又はＦＸＩアミノ酸配列を含む合成ペプチドを使用して、適当な宿主動物を免疫できる。所望の抗体を産生する細胞株は、抗体活性の存在について培養上清をスクリーニングし、ＦＸＩの機能的活性に対して選択した抗体の効果を確立することによって同定され得る。
【0082】
ＭＡｂは、当業者によってよく理解されている様々な技術で産生され得る。この適用の範囲は、抗体若しくはその断片がどのように作製又は製造されるかとは無関係に、ＦＸＩ／ＦＸＩａのセリンプロテアーゼドメインの活性部位に結合し、ＦＸＩａによる基質の変換を遮断することによってヒトＦＸＩ／ＦＸＩａの活性を遮断する任意の抗体又はその断片を目的とする。活性部位におけるｍＡｂに対するエピトープの局在化は、ｍＡｂが、ＦＸＩａの発色活性を（部分的に）阻害することを実証することによって確認される。
【0083】
様々な動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ及びヒト若しくはマウス又は他の動物のリンパ球によるｉｎ ｖｉｔｒｏ両方での様々な免疫化プロトコールを利用することができ、当業技術者に周知である。ヒトＦＸＩに対する抗体を持つ患者、例えば投与された外来性ＦＸＩに対する抗体応答を起こした（Ｓａｌｏｍｏｎ Ｏら、Ｂｌｏｏｄ ２００３年；１０１：４７８３～８頁）又は他の理由からＦＸＩ欠損を獲得したＦＸＩ欠損の人、由来のヒトリンパ球を使用してｍＡｂを生成することもできる。
【0084】
ＦＸＩ、ＦＸＩａ、その部分又はＦＸＩペプチドで免疫したマウスのリンパ球と適当な融合パートナーとの融合によって得られるハイブリドーマの培養上清の初期のスクリーニングステップは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、行われることが好ましい。このアッセイは、当業技術者に公知である。その後、ＦＸＩ（ａ）の活性に対する抗体の効果が、試験される。簡便なアッセイは、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する効果を試験することである。ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性を遮断する抗体が、ヒト血漿に添加された場合、ＡＰＴＴを延長することになる。ｍＡｂ又はその断片に対するエピトープの局在化は、ＦＸＩａの発色活性に対するｍＡｂの効果を評価することによって検出され得る。
【0085】
本発明の抗体を含む組成物
第２の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した抗体又は抗体断片を含む医薬組成物に関係する。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を更に含むことが好ましい。アジュバント又は媒体などの薬学的に許容可能な担体は、対象に抗体又は抗体断片を投与するためのものある。前記医薬組成物は、それを必要とする対象に組成物の有効量を投与することにより本明細書において以下に記述される処置の方法に使用され得る。本明細書では用語「対象」とは、哺乳動物に分類され、霊長類及びヒトを含むがそれに制限されない全ての動物のことを指す。対象は、あらゆる年齢又は人種の男性若しくは女性であることが好ましい。
第２の態様において、本発明は、本明細書において上で定義した抗体又は抗体断片を含む医薬組成物に関係する。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を更に含むことが好ましい。アジュバント又は媒体などの薬学的に許容可能な担体は、対象に抗体又は抗体断片を投与するためのものある。前記医薬組成物は、それを必要とする対象に組成物の有効量を投与することにより本明細書において以下に記述される処置の方法に使用され得る。本明細書では用語「対象」とは、哺乳動物に分類され、霊長類及びヒトを含むがそれに制限されない全ての動物のことを指す。対象は、あらゆる年齢又は人種の男性若しくは女性であることが好ましい。
【0086】
本明細書では用語「薬学的に許容可能な担体」は、医薬投与に適合するすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤、などを含むことを意図する（例えば「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅら編、第７版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照のこと）。薬学的に活性な物質としてのそのような培地及び薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の通常媒体又は薬剤が、活性化合物と適合しない場合以外、組成物におけるその使用が検討される。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、利用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含めた酸化防止剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾールなど）；低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含めた単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；及び／又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商標）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商標）若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0087】
本発明の抗体は、同じ処方で又は異なる処方で投与され得る。投与は、併用又は連続であることができ、いずれの順序においても有効であり得る。
【0088】
更なる実施形態において、本発明の抗体は、所望のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を達成するために修飾される。この目的のために、ポリアルキレングリコール基（例えばポリエチレングリコール［ＰＥＧ］基、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール）又は例えば血清アルブミン若しくはトランスフェリンなどの血清タンパク質が、抗体に連結又はコンジュゲートされ得、及び／又は抗体のアミノ酸配列が、修飾され得る。特に、抗体である抗体の定常ドメインのアミノ酸配列が、修飾され得る（例えば、アミノ酸置換、削除及び／又は挿入を導入する）。従って、これら修飾のいずれかを使用して、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期を１、２、５、１０又は２０日間を超えて増大させることができる。当業者には当然のことながら、半減期を増大させるための本発明の抗体の修飾は、抗体が、低用量で及び／又は繰り返し投与の場合頻度を減少させて投与されることを可能にする。
【0089】
医薬組成物は、静脈若しくは皮下注射又は注入を含めた任意の適切な経路及び様式によって投与され得る。当業者に認識されるであろうように、投与の経路及び／又は方法は、所望の結果に応じて変わることになる。非経口投与の場合、ｍＡｂは、薬学的に許容される非経口媒体と組み合わせた注射可能な形態に処方されることになる。そのような媒体は当技術分野において周知であり、例には、生理食塩水、デキストロース溶液、リンガー溶液及びヒト血清アルブミンを少量含有する溶液がある。一般に、ｍＡｂ又はその断片は、１ｍＬ当たり約２０ｍｇ～約１００ｍｇの濃度でそのような媒体中に処方されることになる。この発明の一実施形態において、抗体は、静脈注射によって投与される。
【0090】
本発明の抗体の使用
第３の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書において上で定義した抗体若しくは抗体断片、又は前記抗体若しくは抗体断片を含む医薬組成物に関する。
第３の態様において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書において上で定義した抗体若しくは抗体断片、又は前記抗体若しくは抗体断片を含む医薬組成物に関する。
【0091】
第４の態様において、本発明は、ＦＸＩ活性化が介在する並びに／又はＦＸＩの阻害が有益な効果を有する疾患、障害及び／若しくは状態を防止若しくは処置する方法に関係する。本方法は、対象に本明細書において上で開示した抗体若しくは抗体断片を、疾患、障害及び／若しくは状態を処置又は防止するのに有効な量で投与するステップを含むことが好ましい。従ってこの態様において、本発明は、ｉ）ＦＸＩ活性化が介在する疾患、障害又は状態；及びｉｉ）ＦＸＩの阻害が有益な効果を有する疾患、障害又は状態のうちの少なくとも１つの防止又は処置に使用するための本明細書において上で定義した抗体若しくは抗体断片又は前記抗体若しくは抗体断片を含む医薬組成物に関する。疾患、障害及び／若しくは状態を防止又は処置することが、疾患、障害及び／若しくは状態又は疾患、障害及び／若しくは状態に関連する症状が起こるリスクを減少させることを意味することは、本明細書において理解される。この態様において、疾患、障害又は状態は、凝固が関係する疾患、障害又は状態であることが好ましい。疾患は、ＦＸＩを介する凝固活性化が介在する血栓塞栓性疾患又は炎症性疾患であることがより好ましい。従ってこれらの実施形態において、本発明の抗体は、病理学的血栓症を防止若しくは処置するため又は医療手順が原因で血栓症を発症するリスクが増大している対象における血栓症の防止に使用される。これらの実施形態において、使用は、心筋梗塞、虚血性脳卒中、心房細動による心原性脳塞栓症、血管アクセス血栓症、深部静脈血栓症、動脈血栓、冠血栓症、アテローム性動脈硬化症、関節炎、脈管炎、呼吸障害症候群、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、肺塞栓症、手術若しくは固定化に起因する静脈血栓塞栓症、人工血管移植、ステント、若しくは動静脈瘻の血栓症及び閉塞、人工心臓弁、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、血液透析、心房細動、敗血症、感染性ショック、臓器不全、腎不全、治療用タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ投与によって誘導される毒性、多発性損傷、虚血－再灌流傷害、局所的な望ましくない線維素沈着並びに成人呼吸窮迫の間の肺胞における線維素沈着からなる群から選択される少なくとも１つの障害、疾患又は状態を防止又は処置するためであることが好ましい。
【0092】
別の実施形態によると、本発明の抗体を使用して、様々なヒト疾患において凝固を阻害できる。その結果、本発明の阻害剤を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで凝固を阻害することにより血栓塞栓障害を減弱するための医薬を調製できる。抗体は、単独で又は他の薬物と組み合わせて使用することができる。
【0093】
更なる実施形態において、本発明の抗体を単独又は任意の適切な割合で他の薬物と組み合わせて使用して医薬を調製し、それによって疾患又は病的血栓症及び若しくは塞栓に起因する疾患症状を患っている、或いはそのような疾患に対するリスクがある対象を処置することができる。
【0094】
従って、本発明において、凝固が介在する損傷を含めた疾患を患っている患者は、ＦＸＩの活性化が阻害されるように、本発明の抗ＦＸＩ抗体の有効量を投与され得る。「有効量」により、トロンビン生成及びフィブリンの形成を阻害できる抗体の濃度が意味される。
【0095】
処置（予防的又は治療的）は、本発明の抗体、例えば抗体又はその断片を含む組成物を、非経口的、好ましくは静脈内、動脈内、筋肉内又は皮下投与するステップから一般になることになる。Ｇｒｕｂｅｒ及びＨａｎｓｏｎ（Ｇｒｕｂｅｒ及びＨａｎｓｏｎ、２００３年、Ｂｌｏｏｄ １０２：９５３～９５５頁）は、ヒヒにおいて１６～５０ｍｇ／ｋｇの用量でヤギ抗ＦＸＩ抗体を投与して、ＦＸＩの充分な阻害を達成した。それに対して、本発明の抗体の用量及び投与レジメンは、ｋｇ体重当たり１週間につきＩｇＧ ０．５～１０ｍｇの投薬量に等しい投薬量の範囲であることが好ましい。本発明の抗体は、１週間につきｋｇ体重当たりＩｇＧ １８、１６、１４、１２、１０、８、６又は４ｍｇ未満の投薬量に等しい投薬量及び／又は１週間につきｋｇ体重当たりＩｇＧ少なくとも０．６、０．８、１．０、１．２、１．５、２又は４ｍｇの投薬量に等しい投薬量で投与されることがより好ましい。例えば抗体断片の場合、使用される投薬量は、指示したｋｇ体重当たりのＩｇＧ分子ｍｇ量に対応するモル当量になるものと理解される。
【0096】
本発明の抗体に対する投薬量レジメンが、約７日間のヒト抗体の平均血清半減期に基づくことは更に理解される。当業者は、７日間より短い又は長い半減期を持つ抗体の投薬量レジメンを調整する方法を知ることになる。
【0097】
更なる実施形態において、本発明の抗体は、静脈注入によってヒト患者に投与される場合、好ましくは１０又は５ｍｇ／ｋｇ体重未満の投薬量で少なくとも５０、６０、７０、８０若しくは９０％のＦＸＩの阻害をもたらす。別法として、本発明の抗体は、静脈注入によってヒト患者に投与される場合、好ましくは１０又は５ｍｇ／ｋｇ体重未満の投薬量で少なくとも係数１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、２．０、２．２、２．５、３若しくは４にａＰＴＴの延長をもたらす。
【0098】
更なる実施形態において、本発明の抗体は、静脈注入によってヒト患者に投与される場合、１０又は５ｍｇ／ｋｇ体重未満の投薬量で治療的有用性を提供する。
【0099】
一実施形態において、本発明による抗体の、上に示した週投薬量の当量が、注入によって投与され得る。そのような投与は、望まれるなら何度も繰り返され得る。投与は、ボーラス注射若しくは注入、又は２～１２時間など２時間未満～２４時間の期間にわたる持続注入によって実行され得る。別の実施形態において、本発明の抗体は、２４時間を超えてなど長時間にわたるゆっくりした持続注入によって投与され得る。そのようなレジメンは、継続する、又は必要に応じて、例えば６ヵ月若しくは１２ヵ月後に１回以上繰り返し得る。投薬量は、本発明のｍＡｂを標的とする抗イディオタイプ抗体を使用することにより生体サンプル中の投与に応じて循環している抗ＦＸＩ抗体の量を測定することによって決定又は調整され得る。更に別の実施形態において、抗体は、例えば、６ヵ月又はより長期にわたって１、２、３、４又は６週間当たり１回などの維持療法によって投与され得る。
【0100】
一実施形態において、本発明の抗体は、例えば定期的な透析を受けている患者における人工血管移植、ステント又は動静脈瘻の血栓症（及び閉塞）の防止又は減少に使用される。好ましくは患者が透析を受けている場合、これら患者において抗体は、少なくとも毎週又は週当たり数回（例えば２、３又は４回）投与され得る。好ましい実施形態において、抗体は、透析装置によって、例えば患者に戻される透析された体液中で患者に投与される。
【0101】
別の実施形態において、本発明の抗体は、例えば心房細動、不安定狭心症、深部静脈血栓症、汎発性血管内凝固、前立腺手術、整形外科、特に股関節又は膝及び他の血栓塞栓障害がある患者においてなど、持続的な抗凝固療法を必要とするにもかかわらず、定期的な非経口接近がない患者に投与される。これらの患者において、時間当たり一定回数の抗体の投与、例えば２、３、４又は６週間当たり１回、が適用されることが好ましい。
【0102】
共通の全般的な知見に基づいて、当技術に熟達した者は、本発明の抗体を投与する適切な方法を選択して、循環中又は局所的いずれかにおいて十分高いレベルの抗体を得、それにより（ａ）ＦＸＩ活性の実質的な遮断、及び（ｂ）ＦＸＩ活性化が介在する並びに／又はＦＸＩの阻害が有益な効果を有するあらゆる所与の疾患、障害及び／若しくは状態に必要とされる所望の予防若しくは治療効果のためのトロンビン生成の実質的な遮断のうちの少なくとも１つとして少なくとも１つを達成できることになる。
【0103】
本発明の抗体の産生及び精製
本発明の抗ＦＸＩ抗体は、多くの従来通りの技術のいずれかにより調製され得る。抗ＦＸＩ抗体は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、組換え発現系で通常産生されることになる。例えばＳｈｕｋｌａ及びＴｈｏｍｍｅｓ（２０１０年、「Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８［５］：２５３～２６１頁）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。当技術分野において公知の任意の発現系を使用して、本発明の組換えポリペプチドを作ることができる。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。
本発明の抗ＦＸＩ抗体は、多くの従来通りの技術のいずれかにより調製され得る。抗ＦＸＩ抗体は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して、組換え発現系で通常産生されることになる。例えばＳｈｕｋｌａ及びＴｈｏｍｍｅｓ（２０１０年、「Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８［５］：２５３～２６１頁）、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、並びにＳａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。当技術分野において公知の任意の発現系を使用して、本発明の組換えポリペプチドを作ることができる。一般に、宿主細胞は、所望のポリペプチドをコードしているＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換される。
【0104】
一態様において、従って、本発明は、本発明の抗ＦＸＩ抗体をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。１つのヌクレオチド配列は、本発明の抗ＦＸＩ抗体の軽鎖の可変ドメインを少なくとも含むポリペプチドをコードし、別のヌクレオチド配列は、本発明の抗ＦＸＩ抗体の重鎖の可変ドメインを少なくとも含むポリペプチドをコードする。好ましい核酸分子は、発現ベクターであり、本発明の抗体ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列は、例えばプロモーター及びシグナル配列などの発現調節配列に作動可能に連結されている。
【0105】
別の態様において、本発明は、本節において上で定義した核酸分子を含む細胞に関係する。細胞は、単離された細胞又は培養細胞であることが好ましい。宿主細胞のうち利用できるのは、原核生物、酵母又は高等真核細胞である。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はバチルスがある。高等真核細胞には、昆虫細胞及び哺乳動物起源の樹立細胞株がある。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、サル腎培養細胞のＣＯＳ－７系（Ｇｌｕｚｍａｎら、１９８１年、Ｃｅｌｌ ２３：１７５頁）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞株及びＭｃＭａｈａｎら、１９９１年、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１頁に記述されるアフリカミドリザル腎培養細胞株ＣＶＩに由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株がある。細菌、真菌、酵母並びに哺乳動物細胞宿主での使用に適当なクローニング及び発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓらによって記述されている（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５年）。
【0106】
形質転換細胞は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養され得る。従って一態様において、本発明は、本発明の抗ＦＸＩ抗体を産生する方法に関し、方法は、本明細書において定義される少なくとも１つの発現ベクターを含む細胞をポリペプチドの発現を促す条件下で培養するステップと、任意選択でポリペプチドを回収するステップとを含む。
【0107】
本発明の抗ＦＸＩ抗体は、例えばプロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は例えばキャプチャーセレクト（ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）（商標）リガンドを使用する親和性クロマトグラフィーが、ラクダ科動物由来の単一ドメイン（ＶＨＨ）抗体断片に基づく固有の親和性精製溶液を提供する（例えばＥｉｆｌｅｒら、２０１４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ＤＯＩ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．１９５８を参照のこと）ことを含めた親和性クロマトグラフィー（例えばＬｏｗら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、８４８：４８～６３頁；Ｓｈｕｋｌａら、２００７年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｂ、８４８：２８～３９頁を参照のこと）を含めた従来通りのタンパク質精製手順によって回収され得る。本明細書における使用を検討するポリペプチドは、内在性汚染材料を実質的に含まない実質的に均一な組換え抗ＦＸＩ抗体ポリペプチドを含む。
【0108】
この文書及びその請求項において、動詞「含む」及びその活用型は、その単語に続く項目を含むが、特別に言及されていない項目を除外しないことを意味するために非限定的な意義で使用される。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への参照は、その文脈が、１つ及び１つだけの要素があるということを明確に必要としない限り、１つより多い要素が存在するという可能性を除外しない。従って、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【0109】
本明細書において引用される特許及び文献参照の全ては、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【0110】
以下の例は、例示的な目的のためだけ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【0111】
１．材料及び方法
１．１材料
ヒト凝固因子ＦＸＩ、ＦＸ及びＦＩＸを、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ．（Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ、ＵＳＡ）から購入した。血漿ＦＸＩも、ＬＦＢ（Ｈｅｍｏｌｅｖｅｎ；ＬＦＢ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。加えて、ＦＸＩの供給源は、下で開示する実験の成果とは無関係なので、他の供給源からのＦＸＩ（血漿から精製されたＦＸＩ又はＰｒｏｆ ＪＣ Ｍｅｉｊｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍから入手した組換えヒトＦＸＩ）を使用した。プレカリクレイン（ＰＫ）を、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、 Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ ＳＬ又はカオリン（Ｋａｏｌｉｎ）ＳＴＡ（Ｓｔａｇｏ）（ａＰＴＴ試薬）、組換えイノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）及びＦＸＩ欠損血漿を、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。トロンビンキャリブレーター及びＦｌｕＣａキットを、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。蛍光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣを、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した。リン脂質（ＰＣ／ＰＳ／ＰＥ、４０／４０／２０）を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａから入手した。発色性基質Ｓ２３６６及びＳ２２２２を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。ｔＰＡ及びＦＸＩの個々のアップルドメインの組換え融合タンパク質を、記述されている通り（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ ＭＬら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）調製した。エノキサパリン（クレキサン［Ｃｌｅｘａｎｅ］）を、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。
１．１材料
ヒト凝固因子ＦＸＩ、ＦＸ及びＦＩＸを、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ．（Ｅｓｓｅｘ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＶＴ、ＵＳＡ）から購入した。血漿ＦＸＩも、ＬＦＢ（Ｈｅｍｏｌｅｖｅｎ；ＬＦＢ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。加えて、ＦＸＩの供給源は、下で開示する実験の成果とは無関係なので、他の供給源からのＦＸＩ（血漿から精製されたＦＸＩ又はＰｒｏｆ ＪＣ Ｍｅｉｊｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍから入手した組換えヒトＦＸＩ）を使用した。プレカリクレイン（ＰＫ）を、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、 Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ ＳＬ又はカオリン（Ｋａｏｌｉｎ）ＳＴＡ（Ｓｔａｇｏ）（ａＰＴＴ試薬）、組換えイノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）及びＦＸＩ欠損血漿を、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍａｒｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。トロンビンキャリブレーター及びＦｌｕＣａキットを、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓから入手した。蛍光発生基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣを、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入した。リン脂質（ＰＣ／ＰＳ／ＰＥ、４０／４０／２０）を、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａから入手した。発色性基質Ｓ２３６６及びＳ２２２２を、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）から入手した。ｔＰＡ及びＦＸＩの個々のアップルドメインの組換え融合タンパク質を、記述されている通り（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ ＭＬら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）調製した。エノキサパリン（クレキサン［Ｃｌｅｘａｎｅ］）を、Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。
【0112】
１．２ ヒトＦＸＩに対するマウスｍＡｂの生成
ＦＸＩに対するＭＡｂを、精製ヒト血漿ヒトＦＸＩによるマウスの注射後に従来の方法によって生成した。簡潔には、０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６～８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全フロイントアジュバント中の精製ＦＸＩ（各マウスとも、完全フロイントアジュバント［Ｓｉｇｍａ］２５０μＬと混合した、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４［ＰＢＳ］２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）で皮下注射した。マウスにおける抗体応答を、２１日目及び４２日目における不完全フロイントアジュバント中の精製ＦＸＩ（各マウスとも、不完全フロイントアジュバント［Ｓｉｇｍａ］２５０μＬと混合したＰＢＳ ２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）の皮下注射、並びに６３日目及び６４日目におけるアジュバントを含まないＦＸＩ（各マウスとも、ＰＢＳ ２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）の腹腔内注射により次いで追加免疫した。
ＦＸＩに対するＭＡｂを、精製ヒト血漿ヒトＦＸＩによるマウスの注射後に従来の方法によって生成した。簡潔には、０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、６～８週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、完全フロイントアジュバント中の精製ＦＸＩ（各マウスとも、完全フロイントアジュバント［Ｓｉｇｍａ］２５０μＬと混合した、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４［ＰＢＳ］２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）で皮下注射した。マウスにおける抗体応答を、２１日目及び４２日目における不完全フロイントアジュバント中の精製ＦＸＩ（各マウスとも、不完全フロイントアジュバント［Ｓｉｇｍａ］２５０μＬと混合したＰＢＳ ２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）の皮下注射、並びに６３日目及び６４日目におけるアジュバントを含まないＦＸＩ（各マウスとも、ＰＢＳ ２５０μＬ中のＦＸＩ ２５μｇ）の腹腔内注射により次いで追加免疫した。
【0113】
６７日目に、免疫したマウスからの脾細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ；２５６：４９５～７頁）によって最初に記述された標準的なハイブリドーマ技術を使用してＳＰ２／０－Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合した。簡潔には、免疫したマウスを屠殺した。脾細胞を脾臓から剥ぎ取り、グルタマックス（ＧｌｕｔａＭａｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ）を含む無血清ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地中で洗浄した。対数的に成長するＳＰ２／０－Ａｇ１４骨髄腫細胞を、無血清培地で洗浄し、脾細胞対骨髄腫細胞の比５：１で脾細胞に添加した。細胞を次いでペレット化し、上清を除去した。次いでポリエチレングリコール４０００（Ｍｅｒｃｋ）の３７％（ｗ／ｖ）溶液１ｍＬを、６０秒間にわたり滴下し、その後細胞を、３７℃で更に６０秒間インキュベートした。無血清培地８ｍＬ、その後グルタマックス／１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ；Ｂｏｄｉｎｃｏ）を含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地５ｍＬを、穏やかに撹拌しながら次いでゆっくりと添加した。室温（ＲＴ）で３０分間後、細胞をペレット化し、グルタマックス／１０％ ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉで洗浄して、残りのポリエチレングリコールを除去し、アミノプテリン選択培地、即ち５０×ハイブリマックス（Ｈｙｂｒｉ－Ｍａｘ）（商標）アミノプテリン（ｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成阻害剤；Ｓｉｇｍａ）で補充したグルタマックス／１０％ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ培地中にウェル当たり１０５個細胞／２００μＬの濃度で最終的に播種した。融合実験の７日目から、アミノプテリン選択培地を２～３日毎に継ぎ足し、１３日目にアミノプテリン選択培地をグルタマックス／１０％ＦＣＳを含むｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉによって置き換えた。
【0114】
融合後１３日目から、ハイブリドーマの上清を、９６ウェルプレートにコーティングされている精製血漿ＦＸＩによるＥＬＩＳＡを使用して抗ＦＸＩ抗体産生についてスクリーニングした。スクリーニングＥＬＩＳＡを、以下の通りに実行した。ヒトＦＸＩを使用して、コーティングした（ＰＢＳ中に１μｇ／ｍＬ；１００μＬ／ウェル）。ＰＢＳ／０．０５％、ｗ／ｖ、トゥイーン２０による多量の洗浄後に、プレートを、ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０／１％、ｗ／ｖ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｒｏｃｈｅ）で、ＲＴで１時間ブロッキングした。その後、プレートを、無希釈のハイブリドーマ上清１００μＬ／ウェルとＲＴで１時間インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０中での多量の洗浄後、抗体の結合を、１：５０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ抗マウスＦｃγ－特異抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とＲＴで１時間、続いて比色検出用のＴＭＢ基質の既製溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で決定した。１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加した後、光学密度を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）を使用して波長４５０ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）で測定した。このＥＬＩＳＡにおけるハイブリドーマ陽性を展開し、冷凍保存した。
【0115】
ａＰＴＴを延長したｍＡｂを産生するハイブリドーマを、更に培養した。マウスＩｇＧを、製造業者の説明書に従って充填済みのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するプロテインＧクロマトグラフィーによりこの上清から精製した。
【0116】
抗ＦＸＩ ｍＡｂとプレカリクレイン（ＰＫ）との交差反応性を、ＦＸＩの代わりに精製ＰＫをウェル当たり１００ｎｇで使用してコーティングし、ＢＳＡによるブロッキングステップを省略し、ヤギ抗マウスＦｃγ－特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を１／１０００希釈で使用して結合しているｍＡｂを検出したことを除いて、上記のＥＬＩＳＡと同等のＥＬＩＳＡで試験した。ＢＳＡでコーティングしたウェルを、対照として含めた。
【0117】
１．３ 表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴を、研究品質のｃｍ５センサーチップを装着したビアコア２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＦＸＩに対するｍＡｂの親和定数を評価した。第ＸＩ因子を、アミンカップリング化学反応を使用して固定化した。表面を、０．１Ｍ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）プロピル－Ｎ－エチルカルボジイミドの１：１混合物で、流速１０μＬ／分で７分間活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で濃度１０μｇ／ｍＬのリガンドを、密度１０００ｒｕで固定化した。無処理のフローセルを、参照表面として使用した。全ての表面を、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０の７分間の導入によりブロッキングした。以下のプロトコールを使用して、ＦＸＩへのｍＡｂの動力学的結合を評価した。分析物を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン２０、ｐＨ７．４中に濃度６．２５～１００ｎＭの範囲で、流速６０μＬ／分、温度２０℃で２つのフローセルに導入した。複合体を、それぞれ３６０及び６００秒間結合及び解離させた。表面を、５０ｍＭ ＮａＯＨの１０秒間の導入により再生させた。各サンプル及び緩衝液ブランクの３つ組の導入（ランダムな順序）を、２つの表面に流した。データを、１Ｈｚの率で収集した。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア内で利用可能なグローバルデータ分析オプションを使用して単純な１：１相互作用モデルに当てはめた。
表面プラズモン共鳴を、研究品質のｃｍ５センサーチップを装着したビアコア２０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＦＸＩに対するｍＡｂの親和定数を評価した。第ＸＩ因子を、アミンカップリング化学反応を使用して固定化した。表面を、０．１Ｍ Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド及び０．１Ｍ ３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）プロピル－Ｎ－エチルカルボジイミドの１：１混合物で、流速１０μＬ／分で７分間活性化した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５中で濃度１０μｇ／ｍＬのリガンドを、密度１０００ｒｕで固定化した。無処理のフローセルを、参照表面として使用した。全ての表面を、１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０の７分間の導入によりブロッキングした。以下のプロトコールを使用して、ＦＸＩへのｍＡｂの動力学的結合を評価した。分析物を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％トゥイーン２０、ｐＨ７．４中に濃度６．２５～１００ｎＭの範囲で、流速６０μＬ／分、温度２０℃で２つのフローセルに導入した。複合体を、それぞれ３６０及び６００秒間結合及び解離させた。表面を、５０ｍＭ ＮａＯＨの１０秒間の導入により再生させた。各サンプル及び緩衝液ブランクの３つ組の導入（ランダムな順序）を、２つの表面に流した。データを、１Ｈｚの率で収集した。データを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア内で利用可能なグローバルデータ分析オプションを使用して単純な１：１相互作用モデルに当てはめた。
【0118】
１．４ ＦＸＩドメインに対する阻害性ｍＡｂのエピトープの局在化
ＦＸＩの個々のアップルドメインを、記述されているように（Ｍｅｉｊｅｒｓ ＪＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２年；３１：４６８０～４頁）ｔＰＡとの融合タンパク質として発現させた。これら融合タンパク質に対するｍＡｂの結合を、４つの融合タンパク質及び精製血漿ＦＸＩを１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後異なるｍＡｂ（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）とインキュベートするＥＬＩＳＡを使用して評価した。次いで融合タンパク質へのｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧで測定し、プレートに結合している抗体を、オルト－フェニレンジアミン－二塩酸（ＯＰＤ）とのインキュベーションによって検出した。結果を４９０ｎｍでのＯＤとして表示した。
ＦＸＩの個々のアップルドメインを、記述されているように（Ｍｅｉｊｅｒｓ ＪＣら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９２年；３１：４６８０～４頁）ｔＰＡとの融合タンパク質として発現させた。これら融合タンパク質に対するｍＡｂの結合を、４つの融合タンパク質及び精製血漿ＦＸＩを１μｇ／ｍＬでＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後異なるｍＡｂ（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）とインキュベートするＥＬＩＳＡを使用して評価した。次いで融合タンパク質へのｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧで測定し、プレートに結合している抗体を、オルト－フェニレンジアミン－二塩酸（ＯＰＤ）とのインキュベーションによって検出した。結果を４９０ｎｍでのＯＤとして表示した。
【0119】
１．５ 凝固アッセイ
プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を、製造業者（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の試薬及びプロトコールを用いて自動凝固分析器（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）で測定した。
プロトロンビン時間（ＰＴ）及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）を、製造業者（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の試薬及びプロトコールを用いて自動凝固分析器（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）で測定した。
【0120】
ｍＡｂの効果を試験するために、ハイブリドーマ上清を、等容積の新鮮なヒト血漿と混合した。ＦＸＩの活性に対するハイブリドーマ上清の効果を、精製ＦＸＩの希釈物（２５ｎＭ及びそれ以下）と１：１混合したＦＸＩ欠損血漿との比較によって定量化した。結果を、ＦＸＩを添加していないＦＸＩ欠損血漿を１００％阻害と設定し、２５ｎＭ ＦＸＩと混合した血漿を含むそれを０％阻害と設定したＦＸＩの％阻害で表示した。
【0121】
ａＰＴＴを延長したＭＡｂ並びにいくつかの対照ｍＡｂを精製し、血漿に添加し、ａＰＴＴ、ＰＴ及びＦＸＩ活性に対する効果を試験した。
【0122】
１．６ 血漿におけるトロンビン生成
リアルタイムでの血漿におけるトロンビン生成を、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ ２００２年；３２：２４９～５３頁）によって記述される通り、及び製造業者（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供されるマニュアルにおいて測定した。簡潔には、凝固を、組換えヒト組織因子（イノビン、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１若しくは５ｐＭ又はａＰＴＴ試薬（８倍希釈した；Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ ＳＬ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のいずれか、４μＭリン脂質及び４１７μＭ蛍光発生基質ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下で血漿のカルシウム再沈着によって引き起こした。蛍光を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して監視し、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、ピーク、ピークに至るまでの時間、遅延時間及び速度指数をトロンビノスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）（登録商標）ソフトウェアを使用して算出した。
リアルタイムでの血漿におけるトロンビン生成を、Ｈｅｍｋｅｒら（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ ２００２年；３２：２４９～５３頁）によって記述される通り、及び製造業者（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって提供されるマニュアルにおいて測定した。簡潔には、凝固を、組換えヒト組織因子（イノビン、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）１若しくは５ｐＭ又はａＰＴＴ試薬（８倍希釈した；Ｐａｔｈｒｏｍｔｉｎ ＳＬ、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のいずれか、４μＭリン脂質及び４１７μＭ蛍光発生基質ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下で血漿のカルシウム再沈着によって引き起こした。蛍光を、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して監視し、内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）、ピーク、ピークに至るまでの時間、遅延時間及び速度指数をトロンビノスコープ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）（登録商標）ソフトウェアを使用して算出した。
【0123】
１．７ ＦＸＩの活性化に対するｍＡｂの効果を評価するためのアッセイ
発色アッセイを、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で実行した。
発色アッセイを、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＣａＣｌ２及び０．１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で実行した。
【0124】
ＦＸＩＩａによるＦＸＩの活性化に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を評価するために、１００ｎＭ精製ＦＸＩを、１～１０倍モル過剰のｍＡｂと室温（ＲＴ）で３０分間インキュベートした。次に、５ｍＭ ＦＸＩＩａを添加し、サンプルを、ＲＴで２時間インキュベートした。混合物中のＦＸＩａレベルを、発色基質Ｓ２３６６（０．５ｍＭ）で次いで測定した。このアッセイを、５０ｎＭ高分子量キニノゲン（ＨＫ）のあり及びなしで実行した。
【0125】
同等の実験において、トロンビン（ＦＩＩａ）によるＦＸＩの活性化に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を評価した。ＦＸＩ（５０ｎＭ）を、１０倍過剰のｍＡｂとＲＴで３０分間インキュベートした。次いで、１０ｎＭトロンビンを添加し、混合物を終夜インキュベートした。混合物中の生成したＦＸＩａの量を、１Ｕヒルジン（トロンビンを遮断するため）及び発色基質Ｓ２３６６（０．５ｍＭ）を添加することにより、次いで測定した。
【0126】
１．８ ＦＸＩａの活性に対するｍＡｂの効果を評価するためのアッセイ
ＦＸＩａの酵素活性に対する精製抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を評価するために、ＦＸＩａ及び精製ｍＡｂを、発色アッセイ緩衝液中にそれぞれ終濃度５０ｎＭ及び５００ｎＭで、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、発色基質Ｓ２３６６を、終濃度０．５ｍＭで添加し、基質の変換を４０５ｎｍで測定した。ＦＸＩａの発色活性に対するｍＡｂ 抗ＦＸＩ ３４．２の効果を確認するいくつかの実験において、少し異なる条件、即ち２．５ｎＭ ＦＸＩａ及び２５ｎＭ抗ＦＸＩ ｍＡｂを使用した。
ＦＸＩａの酵素活性に対する精製抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を評価するために、ＦＸＩａ及び精製ｍＡｂを、発色アッセイ緩衝液中にそれぞれ終濃度５０ｎＭ及び５００ｎＭで、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、発色基質Ｓ２３６６を、終濃度０．５ｍＭで添加し、基質の変換を４０５ｎｍで測定した。ＦＸＩａの発色活性に対するｍＡｂ 抗ＦＸＩ ３４．２の効果を確認するいくつかの実験において、少し異なる条件、即ち２．５ｎＭ ＦＸＩａ及び２５ｎＭ抗ＦＸＩ ｍＡｂを使用した。
【0127】
ＦＸＩａによるＦＩＸの活性化に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を評価するために、１０ｎＭ ＦＸＩａを、７ｍＭ ＣａＣｌ２を含む発色基質緩衝液中で抗ＦＸＩ ｍＡｂと３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、１００ｎＭ ＦＩＸを添加し、混合物を、３７℃で１０分間インキュベートした。混合物中のＦＩＸａを評価するために、精製ＦＸ（１００ｎＭ）及び発色基質Ｓ２２２２（０．５ｍＭ）を添加した。発色基質の変換を、４０５ｎｍで次いで測定した。
【0128】
１．９ マウスにおける実験的血栓症モデル
動物の手順を、アカデミックメディカルセンター（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実行し、機関の動物実験委員会によって承認された。
動物の手順を、アカデミックメディカルセンター（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で実行し、機関の動物実験委員会によって承認された。
【0129】
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの８週齢雄及び雌第ＸＩ因子ノックアウトマウス（ＦＸＩ－／－マウス）を、本研究に含めた（Ｒｏｓｅｎ ＥＤら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００２年；８７：７７４～６頁）。マウスを、マイクロアイソレータケージ中で一定の明暗サイクルで飼育し、食物及び水へ不断に接近可能にした。
【0130】
血栓症を誘導する外科的手順の前に、動物に、５Ｕヒト血漿第ＸＩ因子濃縮物を補充した（１単位は、プールした正常ヒト血漿１ｍＬ中に存在するＦＸＩの量である）。その後、マウスを、ｍＡｂ（８ｍｇ／ｋｇ）又は生理食塩水で静脈内注射した。エノキサパリン（ＬＭＷＨ；１ｍｇ／ｋｇ）を、手順の６時間前に皮下注射した。
【0131】
確立されているマウス血栓症モデル、塩化鉄（ＦｅＣｌ３）誘導下大静脈（ＩＶＣ）血栓症を使用して、ｍＡｂの有効性を評価した。簡潔には、ＦＸＩ－／－マウスを、２．５％吸入用イソフルラン及びケタミン／キシラジン（２：１）の混合物で麻酔した。次いで、正中切開を行い、ＩＶＣを鈍的切開によって露出させた。その後、１０％ＦｅＣｌ３溶液に浸漬した濾紙を、ＩＶＣ上の腎静脈の下に３分間置いた。紙を除去し、静脈流を、組織灌流モニター（ＢＬＦ２２型；Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｉｔｈａｃａ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して３０～４５分間測定した。ＦｅＣｌ３投与前の流れを、１００％と設定し、参照として使用した。投与後の流速を、投与前フローの％として算出した。６匹のマウスの群を、処置当たり研究した。
【0132】
１．１０ 出血アッセイ
マウス尾部出血アッセイを、記述されている通り使用した（Ｗａｎｇ Ｘら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００６年；４：１９８２～８頁）。簡潔には、マウスを麻酔し、３７℃電気パッド上に置いた。尾部直径約１ｍｍ（先端から２～４ｍｍ）で尾部を切断し、満たした生理食塩水中に３７℃で置いた。出血が停止するまでの時間を記録した。３０分後、動物が、まだ出血していても実験を停止し、動物を屠殺した。失血を、出血尾部から血液を採集するために使用した生理食塩水の５７５ｎｍのＯＤを測定することによって評価した。
マウス尾部出血アッセイを、記述されている通り使用した（Ｗａｎｇ Ｘら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００６年；４：１９８２～８頁）。簡潔には、マウスを麻酔し、３７℃電気パッド上に置いた。尾部直径約１ｍｍ（先端から２～４ｍｍ）で尾部を切断し、満たした生理食塩水中に３７℃で置いた。出血が停止するまでの時間を記録した。３０分後、動物が、まだ出血していても実験を停止し、動物を屠殺した。失血を、出血尾部から血液を採集するために使用した生理食塩水の５７５ｎｍのＯＤを測定することによって評価した。
【0133】
１．１１ ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のｃＤＮＡのクローニング
ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、分注し、ペレットとして－８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニアイソレーションキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによりこれらペレットから単離した。ＲＮＡ濃度を、分光光度計（Ａ２６０ｎｍ）で決定した。逆転写酵素によって、ｃＤＮＡを、リバートエイドＨマイナスファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してＲＮＡ ２μｇから合成し、更なる使用まで－２０℃で保存した。アイソタイプ特異的プライマー（センス及びアンチセンス）を設計して、マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶ領域を増幅した（表４）。
ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、分注し、ペレットとして－８０℃で保存した。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニアイソレーションキット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによりこれらペレットから単離した。ＲＮＡ濃度を、分光光度計（Ａ２６０ｎｍ）で決定した。逆転写酵素によって、ｃＤＮＡを、リバートエイドＨマイナスファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ Ｍｉｎｕｓ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ）（商標）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してＲＮＡ ２μｇから合成し、更なる使用まで－２０℃で保存した。アイソタイプ特異的プライマー（センス及びアンチセンス）を設計して、マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶ領域を増幅した（表４）。
【0134】
【表4】
【0135】
ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶ領域の配列を確認するために、定常マウスκ及びＣＨドメインがヒトドメインに交換されているｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のキメラヒトＩｇＧ４形式を作製した。重鎖間ジスルフィド架橋を確実にするために、ヒンジ領域内の突然変異を配列に導入した（Ｓ２４１Ｐ；Ａｎｇａｌ Ｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２年；３０：１０５～８頁）。この目的のために、キメラヒトＩｇＧ４重鎖及びキメラヒトκ軽鎖をコードしているＣＨＯ細胞に最適化されたｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、それらｃＤＮＡ配列は、マウスシグナルペプチドの後ろに、ヒトＩｇＧ４定常領域に連結されているマウス重鎖可変又はヒトカッパ定常領域に連結されているマウス軽鎖可変のいずれかをそれぞれコードした。抗体を、フリースタイル（ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ）（商標）ＭＡＸ ＣＨＯ（ＣＨＯ－Ｓ細胞）発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＣＨＯ細胞において発現させ、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ヒトＦＸＩをコーティングとして使用したＥＬＩＳＡによってヒトＦＸＩに対する結合、及びヒト血漿にプロテインＧ精製標本を添加し、ａＰＴＴを測定することによって機能的活性について試験した。
【0136】
１．１２ マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のヒト及び脱免疫化バリアント
マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の配列を、コンポジットヒト抗体（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）技術（ｗｗｗ．ａｎｔｉｔｏｐｅ．ｃｏ．ｕｋ）を使用してヒト化し、脱免疫化した。コンポジットヒト抗体は、無関係なヒト抗体のＶ領域に由来する複数の配列セグメント（「コンポジット」）を含む。ヒトＶ領域データベースから得られた選択した配列セグメントの全てを、潜在的なＴ細胞エピトープの存在についてｉｎ ｓｉｌｉｃｏでフィルタリングした。
マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の配列を、コンポジットヒト抗体（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）技術（ｗｗｗ．ａｎｔｉｔｏｐｅ．ｃｏ．ｕｋ）を使用してヒト化し、脱免疫化した。コンポジットヒト抗体は、無関係なヒト抗体のＶ領域に由来する複数の配列セグメント（「コンポジット」）を含む。ヒトＶ領域データベースから得られた選択した配列セグメントの全てを、潜在的なＴ細胞エピトープの存在についてｉｎ ｓｉｌｉｃｏでフィルタリングした。
【0137】
この目的のために、開始抗体の抗原結合に重要であると考えられたアミノ酸を、第一に決定した。次いで、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκドメインの配列を使用して、無関係なヒトＶ領域データベースから得られる相同な配列セグメントを選択した。異なる４つのＶＨ及び異なる４つのＶκ配列を設計して、１６個の異なる抗体を得た。Ｖ領域遺伝子を、選択したヒト配列セグメントの組合せをコードしている合成オリゴヌクレオチドを使用して次いで生成した。これらを、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２４１Ｐ（Ａｎｇａｌ Ｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２年；３０：１０５～８頁）を含有するヒトＩｇＧ４重鎖及びカッパ軽鎖を含有するベクターに次いでクローニングした。キメラ抗体遺伝子及び選択した抗ＦＸＩ ３４．２ ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）の組合せの全てを、エレクトロポレーションによってＮＳ０細胞に安定にトランスフェクトした。各細胞株の同一性を、ゲノムＤＮＡの可変ドメインのＤＮＡ配列決定によって確認した。最も良く発現している株を選択し、使用して、１７個のｍＡｂ（１６個のコンポジットヒト抗体（商標）バリアント、及びマウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２）を発現させた。組換え抗体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で細胞培養上清から精製した。
【0138】
ヒトＦＸＩへの結合について様々なｍＡｂを試験するために、ヒトＦＸＩをコーティングに使用し、ビオチン化マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２を参照抗体として使用する競合ＥＬＩＳＡを最初に使用した。この目的のために、精製マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２抗体の希釈系列を、キメラ抗体及び濃度１６．６６μｇ／ｍＬ～０．０２３μｇ／ｍＬのｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の１６個のコンポジットバリアントのそれぞれと一緒に一定濃度のビオチン化マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（終濃度０．１２μｇ／ｍＬ）と前もって混合し、その後１×ＰＢＳ ｐＨ７．４に希釈した０．５μｇ／ｍＬ第ＸＩ因子でプレコートしたＮｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ ＭａｘｉＳｏｒｐ ９６ウェル平底マイクロタイタープレート上で、室温で１時間インキュベートした。ビオチン化抗体の結合を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）及びＯＰＤ基質（Ｓｉｇｍａ）で検出した。反応を３Ｍ ＨＣｌで停止させ、吸光度を、Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭＲＸ ＴＣ ＩＩプレートリーダーで、４９０ｎｍで読み取り、結合曲線をプロットした。
【0139】
１．１３ ヒト化ｍＡｂ ３４．２の免疫原性を評価するためのｉｎ ｖｉｔｒｏモデル
リード、完全なヒトコンポジットリード抗ＦＸＩ ｍＡｂの免疫原性潜在性を、ＨＬＡタイピング済みドナーの末梢血単核細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した（エピスクリーン［ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ］［商標］技術；Ａｎｔｉｔｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離を使用して健康な群集ドナーの白血球層から単離し、続いてＴ細胞を除去した（ＣＤ８＋ロゼットセップ［ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ］［商標］；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）。ドナーを、ＨＬＡ ＳＳＰ－ＰＣＲに基づく組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｓｏｌｉｈｕｌｌ、ＵＫ）を使用してＨＬＡ－ＤＲハプロタイプについてタイピングした。世界及びヨーロッパ／北アメリカ集団において発現されているＨＬＡ－ＤＲアロタイプの数及び頻度を示す２０名のドナーからＰＢＭＣを選択し、サンプル当たり５０μｇ／ｍＬの終濃度で精製コンポジット抗体とインキュベートした。各ドナーに対して、再現性対照（１００μｇ／ｍＬキーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］、Ｐｉｅｒｃｅ［Ｐｅｒｂｉｏ］、Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ ＫＬＨとインキュベートした細胞）、臨床対照（５０μｇ／ｍＬヒト化Ａ３３抗体）、培養培地のみの対照及びキメラマウス－ヒトｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の対照も含めた。培養を、合計８日間インキュベートした。５、６、７及び８日目に、０．７５μＣｉ［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を含む丸底９６ウェルプレートにアリコート３×１００μＬをパルスすることによって細胞の増殖を更に１８時間測定した。次いで細胞を、フィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）に採取し、各サンプルに対する１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）を、メルチレックス（Ｍｅｌｔｉｌｅｘ）（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）シンチレーション計数によって決定した。刺激指数（ＳＩ）を、試験サンプルとインキュベートしたＰＢＭＣの増殖（ｃｐｍ）、対、培地だけとインキュベートしたＰＢＭＣの増殖の比を評価することによって次いで決定した。刺激指数≧２を、有意な反応を示すと考えた。
リード、完全なヒトコンポジットリード抗ＦＸＩ ｍＡｂの免疫原性潜在性を、ＨＬＡタイピング済みドナーの末梢血単核細胞を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した（エピスクリーン［ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ］［商標］技術；Ａｎｔｉｔｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。簡潔には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、リンフォプレップ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離を使用して健康な群集ドナーの白血球層から単離し、続いてＴ細胞を除去した（ＣＤ８＋ロゼットセップ［ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ］［商標］；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）。ドナーを、ＨＬＡ ＳＳＰ－ＰＣＲに基づく組織タイピングキット（Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｓｏｌｉｈｕｌｌ、ＵＫ）を使用してＨＬＡ－ＤＲハプロタイプについてタイピングした。世界及びヨーロッパ／北アメリカ集団において発現されているＨＬＡ－ＤＲアロタイプの数及び頻度を示す２０名のドナーからＰＢＭＣを選択し、サンプル当たり５０μｇ／ｍＬの終濃度で精製コンポジット抗体とインキュベートした。各ドナーに対して、再現性対照（１００μｇ／ｍＬキーホールリンペットヘモシアニン［ＫＬＨ］、Ｐｉｅｒｃｅ［Ｐｅｒｂｉｏ］、Ｃｒａｍｌｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ ＫＬＨとインキュベートした細胞）、臨床対照（５０μｇ／ｍＬヒト化Ａ３３抗体）、培養培地のみの対照及びキメラマウス－ヒトｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の対照も含めた。培養を、合計８日間インキュベートした。５、６、７及び８日目に、０．７５μＣｉ［３Ｈ］チミジン（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ、Ｂｅａｃｏｎｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）を含む丸底９６ウェルプレートにアリコート３×１００μＬをパルスすることによって細胞の増殖を更に１８時間測定した。次いで細胞を、フィルターマット（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）に採取し、各サンプルに対する１分間当たりのカウント（ｃｐｍ）を、メルチレックス（Ｍｅｌｔｉｌｅｘ）（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＲ）シンチレーション計数によって決定した。刺激指数（ＳＩ）を、試験サンプルとインキュベートしたＰＢＭＣの増殖（ｃｐｍ）、対、培地だけとインキュベートしたＰＢＭＣの増殖の比を評価することによって次いで決定した。刺激指数≧２を、有意な反応を示すと考えた。
【0140】
２． 結果
２．１ ヒトＦＸＩに対する阻害抗体の生成
ＥＬＩＳＡにおいてヒトＦＸＩに結合するｍＡｂを産生する３２個のハイブリドーマを生成した。これらのハイブリドーマの上清を、ヒト血漿に添加し、ａＰＴＴにおける阻害活性について試験した。このａＰＴＴにおいて、様々な量のＦＸＩで補充したＦＸＩ欠損血漿を、参照として使用した。２つのハイブリドーマ上清、抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２及び抗ＦＸＩ ｍＡｂ １５Ｆ８．３は、９０％より高くＦＸＩを阻害した。これらｍＡｂを、限界希釈によってサブクローニングし、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーによってハイブリドーマ上清から精製した。精製ｍＡｂを、ヒト血漿に添加し、ａＰＴＴ及びＰＴ凝固活性に対する効果を試験した（図１Ａ及び１Ｂ）。ＭＡｂ ３４．２及び１５Ｆ８．３は、ａＰＴＴを用量依存的に延長したが、ＰＴに影響を及ぼさなかった。更に、対照（非阻害性抗ＦＸＩ）ｍＡｂは、ａＰＴＴ試験において効果が全くなかった。
２．１ ヒトＦＸＩに対する阻害抗体の生成
ＥＬＩＳＡにおいてヒトＦＸＩに結合するｍＡｂを産生する３２個のハイブリドーマを生成した。これらのハイブリドーマの上清を、ヒト血漿に添加し、ａＰＴＴにおける阻害活性について試験した。このａＰＴＴにおいて、様々な量のＦＸＩで補充したＦＸＩ欠損血漿を、参照として使用した。２つのハイブリドーマ上清、抗ＦＸＩ ｍＡｂ ３４．２及び抗ＦＸＩ ｍＡｂ １５Ｆ８．３は、９０％より高くＦＸＩを阻害した。これらｍＡｂを、限界希釈によってサブクローニングし、プロテインＧ親和性クロマトグラフィーによってハイブリドーマ上清から精製した。精製ｍＡｂを、ヒト血漿に添加し、ａＰＴＴ及びＰＴ凝固活性に対する効果を試験した（図１Ａ及び１Ｂ）。ＭＡｂ ３４．２及び１５Ｆ８．３は、ａＰＴＴを用量依存的に延長したが、ＰＴに影響を及ぼさなかった。更に、対照（非阻害性抗ＦＸＩ）ｍＡｂは、ａＰＴＴ試験において効果が全くなかった。
【0141】
最後に、精製ｍＡｂとヒト血漿の混合物を、ＦＸＩ凝固アッセイにおいて試験した（図１Ｃ）。結果を、１００％ＦＸＩを含有すると言われるヒト血漿プールの希釈を参照することにより％ＦＸＩ活性として表示した。ａＰＴＴを延長した２つのｍＡｂは、ヒト血漿においてＦＸＩ活性を＞９０％減少させたが、他の抗体は効果が全くなかった（図１Ｃ）。表面プラズモン共鳴（ビアコア）を使用して、ヒトＦＸＩに対するｍＡｂ ３４．２のＫＤが、０．２ｎＭであると判明したが、ｍＡｂ １５Ｆ８．３のＫＤは０．１５ｎＭであった。
【0142】
２．２ エピトープマッピング
ＦＸＩのドメイン上のエピトープをマップするために、ｍＡｂを、単一アップルドメインのｔＰＡとの組換え融合タンパク質、又は血漿ＦＸＩでコーティングしたＥＬＩＳＡウェル中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートへのｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧで評価した。この系を使用して、ｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３に対するエピトープが、アップル２ドメインに位置することが判明したが、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２が、アップルドメインのいずれにも結合せず、血漿ＦＸＩだけに結合したことは、そのエピトープがＦＸＩのセリンプロテアーゼドメインに位置することを示唆した（図２）。
ＦＸＩのドメイン上のエピトープをマップするために、ｍＡｂを、単一アップルドメインのｔＰＡとの組換え融合タンパク質、又は血漿ＦＸＩでコーティングしたＥＬＩＳＡウェル中でインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートへのｍＡｂの結合を、ペルオキシダーゼコンジュゲートした抗マウスＩｇＧで評価した。この系を使用して、ｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３に対するエピトープが、アップル２ドメインに位置することが判明したが、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２が、アップルドメインのいずれにも結合せず、血漿ＦＸＩだけに結合したことは、そのエピトープがＦＸＩのセリンプロテアーゼドメインに位置することを示唆した（図２）。
【0143】
２．３ 血漿中でのトロンビン生成に対する阻害性抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果
ＦＸＩ活性に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を更に評価するために、トロンビンを、抗ＦＸＩ ｍＡｂの有り無しで、様々な刺激、即ち高組織因子（ＴＦ；５ｐＭ）、低ＴＦ（１ｐＭ）又はａＰＴＴ試薬によってヒト血漿中に生成させ、リアルタイムで測定した。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（図３Ａ）及び抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３（データ不掲載）は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されたトロンビン生成を用量依存的に減少させ、このことは、それらｍＡｂをヒト血漿に添加した場合にその両方がａＰＴＴを延長するので予想される（図１Ａを参照のこと）。低ＴＦ濃度によって誘導される血漿中でのトロンビン生成は、ＦＸＩに一部依存していることが公知である。トロンビン生成が、血漿中で低ＴＦによって誘導された場合、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２だけが、３０～４０％以下までトロンビンを用量依存的に減少させた（図３Ｂ）。それに対しｍＡｂ １５Ｆ８．３は、低ＴＦによってトロンビン生成を減少させなかった（データ不掲載）。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（図３Ｃ）とｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３（データ不掲載）のどちらも、高ＴＦによるトロンビン生成に効果がなかった。
ＦＸＩ活性に対する抗ＦＸＩ ｍＡｂの効果を更に評価するために、トロンビンを、抗ＦＸＩ ｍＡｂの有り無しで、様々な刺激、即ち高組織因子（ＴＦ；５ｐＭ）、低ＴＦ（１ｐＭ）又はａＰＴＴ試薬によってヒト血漿中に生成させ、リアルタイムで測定した。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（図３Ａ）及び抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３（データ不掲載）は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されたトロンビン生成を用量依存的に減少させ、このことは、それらｍＡｂをヒト血漿に添加した場合にその両方がａＰＴＴを延長するので予想される（図１Ａを参照のこと）。低ＴＦ濃度によって誘導される血漿中でのトロンビン生成は、ＦＸＩに一部依存していることが公知である。トロンビン生成が、血漿中で低ＴＦによって誘導された場合、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２だけが、３０～４０％以下までトロンビンを用量依存的に減少させた（図３Ｂ）。それに対しｍＡｂ １５Ｆ８．３は、低ＴＦによってトロンビン生成を減少させなかった（データ不掲載）。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２（図３Ｃ）とｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３（データ不掲載）のどちらも、高ＴＦによるトロンビン生成に効果がなかった。
【0144】
これらの実験から、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、活性化の機序とは無関係にＦＸＩを阻害するが、ｍＡｂ抗ＦＸＩ １５Ｆ８．３は、ＦＸＩＩａによって活性化される場合にだけＦＸＩを阻害すると結論される。従って、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２を、更なる特徴付け及びヒト化のために選択した。
【0145】
２．４ モノクローナル抗体抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩの活性部位に結合することによってＦＸＩ活性を阻害し、ＦＸＩ活性化を防止する。
【0146】
ＦＸＩ／ＦＸＩａの活性部位に対するｍＡｂは、発色基質などの小さい基質の変換を含めたＦＸＩａの基質の変換を一般に阻害する。ＦＩＸなどの大きな基質も、エキソサイトとして公知の、活性部位の外側にあるＦＸＩａ上の部位と相互作用するが、小さい基質は、もっぱら活性部位だけと相互作用する。従って、ｍＡｂによるＦＸＩａの発色活性の阻害により、そのｍＡｂに対するエピトープが活性部位と（少なくとも部分的に）重なっていることが明らかになる。エキソサイトに対する抗体は、ＦＸＩａによる大きな基質の変換を阻害するが、ＦＸＩａの発色活性に対する効果がないことによって特徴付けられる。ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、セリンプロテアーゼドメインに結合し（図２）、血漿中でＦＸＩの機能的活性を阻害する（図１Ｃ）。次に、このｍＡｂを、ＦＸＩａによる小さい基質の変換に対する効果について試験した。精製第ＸＩａ因子を、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２及び対照ｍＡｂとインキュベートした。残存しているＦＸＩａ活性を、発色基質Ｓ２３６６で次いで測定した。
【0147】
ＭＡｂ抗ＦＸＩ－３４．２は、小さな阻害効果を有したが、他のいずれのｍＡｂも、ＦＸＩａ発色活性を阻害しなかった（図４Ａ）。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のこの小さな効果は、実験の全体を通じて一貫して観察され、抗ＦＸＩ ３４．２の組換えキメラヒト－マウスｍＡｂ形式による別の実験においても観察された。発色基質Ｓ２３６６は、ｐ－ニトロアニリンに連結された小さなトリペプチドからなる（Ｌ－ピログルタミル－Ｌ－プロリル－Ｌ－アルギニン－ｐ－ニトロアニリン）ので、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の阻害効果により、そのｍＡｂが、ＦＸＩａの活性部位に（少なくとも部分的に）重なるエピトープに結合することが明らかになる。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、非活性化ＦＸＩに対して高い親和性を有し（表面プラズモン共鳴による見かけのＫＤ ０．２ｎＭ；結果の節２．１を参照のこと）、従ってｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のエピトープが、ＦＸＩ及びＦＸＩａ上で発現している点に注意すべきである。
【0148】
発色性基質は比較的小さいが、ＦＸＩａの天然の基質である凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸ）は、比較的大きな基質である。別の組の実験において、ＦＸＩａの活性を、ＦＩＸａへのＦＩＸの変換を監視することによって測定した。ＦＩＸａ活性をＦＸａに変換される基質としてＦＸで測定し、ＦＸａを発色基質Ｓ２２２２で次いで測定する。ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩａによるＦＩＸａへのＦＩＸの変換を阻害するが、対照ｍＡｂは効果がなかった（図４Ｂ）。
【0149】
従って、この実施例において示される実験は、ｍＡｂ ＦＸＩ ３４．２が、活性部位に（少なくとも部分的に）位置するエピトープに結合することによってＦＸＩａの基質の変換を阻害することによりＦＸＩ活性を阻害することを示す。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のこの作用機序は固有であり、ヒトＦＸＩに対する抗体について以前に記述されていない。
【0150】
２．５ 実験的血栓症マウスモデルにおけるｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果
ヒトＦＸＩ（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ Ｍら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）で補充したＦＸＩ－ノックアウトマウス（Ｗａｎｇ Ｘら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００６年；４：１９８２～８頁）における下大静脈（ＩＶＣ）血栓症マウスモデルを使用して、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果を評価した。外来性ＦＸＩなしでは、ＦＸＩ－／－－マウスにおけるａＰＴＴは、野生型マウスにおける２５～３４秒に対して＞１５０秒である。ＩＶＣ血栓症を、ＩＶＣへの１０％ＦｅＣｌ３の適用によって誘導した。ＩＶＣを通る血流の急速な低下が、１０％ＦｅＣｌ３適用後１分以内に観察された（図５Ａにおける生理食塩水群）。マウスのエノキサパリン処置は、４５分間の観察時間の間にこのＦｅＣｌ３誘導血流機能障害を完全に防止した（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ Ｍら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁；本論文の図７を参照のこと）。塩化鉄による血栓症誘導前のｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の投与は、全観察時間の全体を通じて血流機能障害を防止した（図５Ａ）。
ヒトＦＸＩ（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ Ｍら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁）で補充したＦＸＩ－ノックアウトマウス（Ｗａｎｇ Ｘら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００６年；４：１９８２～８頁）における下大静脈（ＩＶＣ）血栓症マウスモデルを使用して、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の効果を評価した。外来性ＦＸＩなしでは、ＦＸＩ－／－－マウスにおけるａＰＴＴは、野生型マウスにおける２５～３４秒に対して＞１５０秒である。ＩＶＣ血栓症を、ＩＶＣへの１０％ＦｅＣｌ３の適用によって誘導した。ＩＶＣを通る血流の急速な低下が、１０％ＦｅＣｌ３適用後１分以内に観察された（図５Ａにおける生理食塩水群）。マウスのエノキサパリン処置は、４５分間の観察時間の間にこのＦｅＣｌ３誘導血流機能障害を完全に防止した（ｖａｎ Ｍｏｎｔｆｏｏｒｔ Ｍら、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２０１３年；１１０：１０６５～７３頁；本論文の図７を参照のこと）。塩化鉄による血栓症誘導前のｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の投与は、全観察時間の全体を通じて血流機能障害を防止した（図５Ａ）。
【0151】
正常な止血に対するｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の影響を評価するために、尾部出血アッセイ（Ｗａｎｇ Ｘら、Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００６年；４：１９８２～８頁）を使用した。尾部出血の時間を著しく延長したエノキサパリンとは対照的に、ＭＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、尾部出血時間に対する効果がなかった（図５Ｂ）。それに対し、エノキサパリン処置した動物は、観察時間（３０分間）の最後まで出血した。
【0152】
従って、この実施例に記述される実験は、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２が、血栓症を防止するのにエノキサパリンと同程度に有効であるが、エノキサパリンとは対照的に、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、出血時間に影響を及ぼさないことを実証する。
【0153】
２．６ ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のｃＤＮＡ配列
ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκ領域を、上記方法の節に記載の通りクローニングした。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκドメインのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２として配列表に示す。これらの配列を使用して、ヒトＩｇＧ４のＣＨドメイン及びヒトＣκドメインに連結されたマウスＶＨ及びＶκ可変ドメインを持つキメラｍＡｂを構築した。
ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκ領域を、上記方法の節に記載の通りクローニングした。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκドメインのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２として配列表に示す。これらの配列を使用して、ヒトＩｇＧ４のＣＨドメイン及びヒトＣκドメインに連結されたマウスＶＨ及びＶκ可変ドメインを持つキメラｍＡｂを構築した。
【0154】
マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２を、ＣＨＯ細胞において発現させ、精製し、正常な血漿と混合し、混合物のａＰＴＴを測定することによって阻害活性について試験した（図６Ａ）。図６Ａに示すように、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２及びマウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ａＰＴＴ（複数可）を用量依存的に減少させた。
【0155】
２．７． ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のヒト化
ｍＡｂの配列に基づいて、あるとしても、最小の免疫原性である抗ＦＸＩコンポジットヒト抗ＦＸＩ ｍＡｂを、コンポジットヒト抗体基盤（Ａｎｔｉｔｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して設計した。
ｍＡｂの配列に基づいて、あるとしても、最小の免疫原性である抗ＦＸＩコンポジットヒト抗ＦＸＩ ｍＡｂを、コンポジットヒト抗体基盤（Ａｎｔｉｔｏｐｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して設計した。
【0156】
ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のＶＨ及びＶκ配列は、表５に示す通り、典型的なフレームワーク残基並びにＣＤＲ １、２及び３モチーフからなることが判明した。
【0157】
【表5】
【0158】
上記の分析から、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２のコンポジットヒト配列は、ＣＤＲの外側の多くの別の残基、及びＣＤＲ配列内のほんの少数の可能な残基だけで創出され得ると考えられた。予備分析は、いくつかのヒト抗体由来の対応する配列セグメントを組み合わせて、マウス配列のＣＤＲと類似又は同一のＣＤＲを創出できることを示した。ＣＤＲの外側及び隣接する領域の場合、ヒト配列セグメントの広い選択肢が、新規のコンポジットヒト抗ＦＸＩ抗体Ｖ領域の可能な成分として同定された。
【0159】
構造分析に基づいて、ヒト化ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２を創出するために使用し得る配列セグメントの予備組を多数選択し、公知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープの存在についてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで分析した。ヒトにおいて潜在的に免疫原性であると同定された配列セグメントを廃棄した。これにより、セグメントの組を減少させた。これらの組合せを、潜在的免疫原性について再び分析して、セグメント間の接合部が、潜在的Ｔ細胞エピトープを含有しないことを確実にした。選択した配列セグメントを、有意なＴ細胞エピトープを欠いている完全なＶ領域配列に組立てた。好ましい４つの重鎖（ＶＨ１～４）及び４つの軽鎖（Ｖκ１～４）配列を、次いで選択した。表６は、好ましい４つの重鎖（ＶＨ１～４）及び４つの軽鎖（Ｖκ１～４）配列のアミノ酸配列を示す配列番号の概要を提供する。
【0160】
【表6】
【0161】
ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の全てのバリアントコンポジットヒト抗体（商標）ＶＨ及びＶκ領域遺伝子を合成し、カッパ軽鎖及びＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、ヒンジ変異体；Ａｎｇａｌ ｓら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２年；３０：１０５～８頁）重鎖と共に発現させた。構築物を、配列決定によって確認した。元のマウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２抗体のＶＨ及びＶκ配列も、発現させた。キメラ抗体遺伝子並びにコンポジットｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２ ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＶＨ及びＶκ鎖の可能な全ての組合せ、即ち合計１６個の対、Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３又はＶκ４と組み合わせたＶＨ１；Ｖκ１、Ｖκ２、Ｖκ３又はＶκ４とＶＨ２；など、をエレクトロポレーションによってＮＳ０細胞に安定にトランスフェクトした。ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の様々なコンポジットヒトバリアントを、それらの鎖組成物、即ちＶＨ１Ｖκ１、ＶＨ２Ｖκ４など、によって更に示す。最も良く発現している系を使用して、１７個のｍＡｂ（１６個のコンポジットヒト抗体（商標）バリアント、及びマウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２）を発現させた。組換え抗体を、プロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で細胞培養上清から精製し、方法の節に記載の通り、競合ＥＬＩＳＡにおいてヒトＦＸＩに対する結合について試験した。結果から、ｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の全てのコンポジットバリアントが、マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２と同様にヒトＦＸＩに良く結合することが明らかになった（データ不掲載）。
【0162】
次いでデータを使用して、各抗体に対するＩＣ５０値を算出し、これをキメラマウス－ヒトｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２抗体のＩＣ５０に対して標準化した（表７）。試験したバリアント全ての標準化したＩＣ５０データは、０．６９～１．１３の範囲であり、このことは、全てのコンポジット抗ＦＸＩ ｍＡｂの結合効率が、キメラ３４．２のそれと同程度であったことを示す。更に、大部分のバリアントは、それぞれのＮＳ０細胞株によって、キメラ抗体より良く発現された。
【0163】
【表7】
【0164】
コンポジットヒト抗ＦＸＩ ｍＡｂの親和性を確認するために、それらｍＡｂを、ビアコア系を使用する表面プラズモン共鳴によりＦＸＩへの結合について試験した。マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２は、ＦＸＩへの結合についてＫＤ ０．２ｎＭを有する。結果を、上記表７に要約する。
【0165】
コンポジットヒトｍＡｂで測定した親和性は０．０７１～１．１４ｎＭの範囲であり（表７）、このことは、ＫＤ ０．２ｎＭを有するマウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２と比較して、いくつかの抗ＦＸＩコンポジットｍＡｂで少し低い親和性及び他の抗ＦＸＩコンポジットｍＡｂで少し高い親和性を示した。
【0166】
コンポジットｍＡｂの阻害活性を、正常なヒト血漿と精製ｍＡｂを混合し、血漿混合物のａＰＴＴを測定することにより評価した。結果は、全てのコンポジットヒト抗ＦＸＩ ｍＡｂが、同程度の範囲にａＰＴＴを延長することを示した（図６Ｂ；表７を参照のこと）。
【0167】
これらの実験から、マウスｍＡｂより少し高いＫＤを有するコンポジットｍＡｂ ＶＨ２Ｖκ３及びＶＨ４Ｖκ１を考え得る例外として、全てのコンポジットヒト抗ＦＸＩ抗体が、ＫＤ ０．２ｎＭを有する元のマウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２の範囲内の親和性を有することが明らかになった。ａＰＴＴにおいて測定した機能的活性に関しても、全てのコンポジットｍＡｂが、マウスｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２と同程度の阻害活性を有した。最後に、全てのｍＡｂは、ＮＳ０細胞において妥当な発現レベルを有した。コンポジットｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４は、最低の免疫原性潜在性を有すると予測され、このｍＡｂは、親和性、機能的活性及び発現に関して他の大部分のｍＡｂと同程度だったので、このコンポジットｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４を、更なる分析のために選択した。特に、この抗体の形式は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用に関してヒトＩｇＧ４であり、補体又はＦｃγ－受容体と相互作用することを意図しない。ヒンジ領域（Ｓ２４１Ｐ）における突然変異は、ＩｇＧ４重鎖の鎖内ジスルフィド架橋ではなく鎖間ジスルフィド架橋形成に有利に働くので、この突然変異をＩｇＧ４重鎖に導入した。
【0168】
２．８ ｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４の免疫原性潜在性
ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の免疫原性潜在性を、２０名の健康なドナーのパネル由来ＰＢＭＣとのインキュベーションによって試験し、細胞の増殖を時間内測定した。この試験において、ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４を、５０μｇ／ｍＬの終濃度で試験する。更にアッセイを改善するために、Ｔ細胞活性化の尺度として増殖の毎日の測定を４回、５～８日目に評価した。６名のドナー由来の細胞及び培養７日後のＰＢＭＣのトリパンブルー色素排除によって決定した通り、ＭＡｂ ＶＨ４Ｖκ４は、ＰＢＭＣ生存率に影響を及ぼさなかった（図７Ａ）。加えて、図７Ｂは、マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２で観察された増殖結果を与える。示す通り、４名のドナー由来のＰＢＭＣで有意な増殖が観察され、別のドナー由来のＰＢＭＣで、境界線上の増殖が起こった。
ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の免疫原性潜在性を、２０名の健康なドナーのパネル由来ＰＢＭＣとのインキュベーションによって試験し、細胞の増殖を時間内測定した。この試験において、ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４を、５０μｇ／ｍＬの終濃度で試験する。更にアッセイを改善するために、Ｔ細胞活性化の尺度として増殖の毎日の測定を４回、５～８日目に評価した。６名のドナー由来の細胞及び培養７日後のＰＢＭＣのトリパンブルー色素排除によって決定した通り、ＭＡｂ ＶＨ４Ｖκ４は、ＰＢＭＣ生存率に影響を及ぼさなかった（図７Ａ）。加えて、図７Ｂは、マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２で観察された増殖結果を与える。示す通り、４名のドナー由来のＰＢＭＣで有意な増殖が観察され、別のドナー由来のＰＢＭＣで、境界線上の増殖が起こった。
【0169】
一般に、ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４で観察される刺激指数は、キメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２で観察される刺激指数より低く、わずか１つの場合に２をわずかに上回るＳＩが観察された。これらのデータは、ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４とのインキュベーションに対して、キメラｍＡｂとよりも少ないＣＤ４ Ｔ細胞の増殖を示す。従って、これらの結果は、マウス－ヒトキメラｍＡｂ抗ＦＸＩ ３４．２と比較して、より低い免疫原性潜在性ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４を支持した。
【0170】
２．９ ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ヒト血漿への精製ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の添加は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されるトロンビン生成を事実上無効にした（図８Ａ）が、ＴＦによるトロンビン生成に対する効果は、血漿中でトロンビンを生成するために使用されたＴＦの用量に依存的であった（図８Ｂ～Ｄ）。従って、ＭＡｂ ＶＨ４Ｖκ４は、これらの実験においてＦＸＩ阻害剤の典型的な挙動を示し、その挙動は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されるトロンビン生成の完全阻害、低ＴＦ濃度によるトロンビン生成の部分的な阻害及び高ＴＦ濃度におけるトロンビン生成の阻害なしである。
ヒト血漿への精製ｍＡｂ ＶＨ４Ｖκ４の添加は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されるトロンビン生成を事実上無効にした（図８Ａ）が、ＴＦによるトロンビン生成に対する効果は、血漿中でトロンビンを生成するために使用されたＴＦの用量に依存的であった（図８Ｂ～Ｄ）。従って、ＭＡｂ ＶＨ４Ｖκ４は、これらの実験においてＦＸＩ阻害剤の典型的な挙動を示し、その挙動は、ａＰＴＴ試薬によって誘導されるトロンビン生成の完全阻害、低ＴＦ濃度によるトロンビン生成の部分的な阻害及び高ＴＦ濃度におけるトロンビン生成の阻害なしである。
【0171】
２．１０ 血栓症マウスモデルにおけるｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４のｉｎ ｖｉｖｏ試験
ＭＡｂ ＶＨ４ＶΚ４を、節２．５に記載の通り血栓症マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ＦｅＣｌ３により血栓症を誘導する前のヒト化ｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４の投与は、全観察の間血流機能障害を防止し、このことはＭＡＢ ＶＨ４ＶΚ４が、血栓症の形成を効果的に防止したことを示す（図９）。
ＭＡｂ ＶＨ４ＶΚ４を、節２．５に記載の通り血栓症マウスモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで試験した。ＦｅＣｌ３により血栓症を誘導する前のヒト化ｍＡｂ ＶＨ４ＶΚ４の投与は、全観察の間血流機能障害を防止し、このことはＭＡＢ ＶＨ４ＶΚ４が、血栓症の形成を効果的に防止したことを示す（図９）。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10】
【配列表】