特許 7028795 グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-21

(45)【発行日】2022-03-02

(54)【発明の名称】グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/037 20060101AFI20220222BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20220222BHJP

   C07K 1/30 20060101ALI20220222BHJP

【ＦＩ】

C07K5/037

C07K1/14

C07K1/30

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2018558052

(86)(22)【出願日】2017-12-20

(86)【国際出願番号】 JP2017045805

(87)【国際公開番号】W WO2018117186

(87)【国際公開日】2018-06-28

【審査請求日】2020-09-18

(31)【優先権主張番号】P 2016246115

(32)【優先日】2016-12-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】308032666

【氏名又は名称】協和発酵バイオ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】特許業務法人栄光特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】藤本 晃広

(72)【発明者】

【氏名】長野 宏

【審査官】田村 直寛

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１１／１３２７２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０６７７０８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／１５９３１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, vol.202, no.3, pp.1380-1386

【文献】J. Chromatogr., 1971, vol.59, no.1, pp.181-184

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ ５／０３７

Ｃ０７Ｋ １／１４

Ｃ０７Ｋ １／３０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶。

【請求項2】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、３０．５±０．２°、１７．７±０．２°、１７．５±０．２°及び２１．２±０．２°にピークを有する、請求項１に記載の結晶。

【請求項3】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２５．３±０．２°、２１．５±０．２°、２１．８±０．２°及び１９．０±０．２°にピークを有する、請求項２に記載の結晶。

【請求項4】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、１９．２±０．２°、１２．１±０．２°、２５．０±０．２°、及び２０．３±０．２°にピークを有する、請求項３に記載の結晶。

【請求項5】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２０．６±０．２°、２９．７±０．２°、９．５±０．２°、及び１４．４±０．２°にピークを有する、請求項４に記載の結晶。

【請求項6】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２７．３±０．２°、１９．５±０．２°、１６．５±０．２°、及び２５．８±０．２°にピークを有する、請求項５に記載の結晶。

【請求項7】

粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、１１．９±０．２°、２３．２±０．２°、及び３０．０±０．２°にピークを有する、請求項６に記載の結晶。

【請求項8】

単結晶Ｘ線構造解析において、－１７３℃で測定した場合、次の概略的単位胞パラメーター：ａ＝５．３７７７Å；ｂ＝９．４３９０Å；ｃ＝１４．７８２２Å；α＝８２．８３３°；β＝８９．１０１°；γ＝８９．３９２°；Ｖ＝７４４．３７Å^３；Ｚ＝１；を有し、かつ空間群がＰ１；である、請求項１～７のいずれか１項に記載の結晶。

【請求項9】

グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程、及び該析出したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を採取する工程を含み、
該グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程の前に、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌することにより、該グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を調製する工程を含む、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の製造方法。

【請求項10】

グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程が、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を濃縮することによりグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程である、請求項９に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶及びその製造方法に関する。また、本発明は、チオ硫酸塩を用いた水性溶媒中でのポリスルフィドの簡便な製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

トリスルフィドの一種であるグルタチオントリスルフィドは、酸化型グルタチオンの類縁物質として知られている（非特許文献１）。グルタチオントリスルフィドは、生体内において、グルタチオン還元酵素によって還元され、その際に硫化水素を発生させる（非特許文献２）。そして、発生した硫化水素はγ－グルタミルシステイン合成酵素を活性化し、活性化したγ－グルタミルシステイン合成酵素は生体内のグルタチオンレベルを上昇させる（非特許文献３）。

【0003】

グルタチオンは抗酸化作用を有するため、生体内グルタチオンレベルが上昇すると、過酸化物や活性酸素種から効率的に細胞を保護することができる。以上の作用から、近年、グルタチオントリスルフィドは、抗酸化成分として期待が高まっている。

【0004】

グルタチオントリスルフィドの調製方法としては、塩基性条件下で酸化型グルタチオンに二硫化炭素を反応させる化学合成による方法（非特許文献２）が知られている。また、グルタチオントリスルフィドの精製方法としては、高速液体クロマトグラフィーなどの手法によってグルタチオントリスルフィド濃縮液を取得する方法（非特許文献２）や、イオン交換樹脂と合成吸着樹脂の混床により分離する方法（非特許文献４）が知られている。非特許文献２及び４に記載の方法においては、合成、精製されたグルタチオントリスルフィドは、凍結乾燥によって採取されていた。

【0005】

グルタチオントリスルフィドのように、複数の硫黄原子が連なった構造を有する化合物のことを、ポリスルフィドという。ポリスルフィドの製造方法としては、これまでにアルキルポリスルフィドの製造方法が多く報告されている（非特許文献５）。アルキルポリスルフィドは、予備硫化剤、コークス精製抑制剤、及び潤滑油添加剤として広く利用されている。アルキルポリスルフィドは疎水性の化合物であり、水に対する溶解度が極めて低い。そのため、アルキルポリスルフィドの製造方法としては、溶媒として有機溶媒を使用するものが多かった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【文献】Biochem.Biophys.Res.Commun. 42, 730-738, 1971

【文献】Biochem. Biophys. Res. Commun., 202, 1380-1386, 1994

【文献】FASEB J., 18, 1165-1167, 2004

【文献】J.Chromatogr., 59, 181-184, 1971

【文献】David A. Atwood, M. Kamruz Zaman, “Sulfur: Organic Polysulfanes”, Encyclopedia of Inorganic Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd., 2006

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

しかし、非特許文献２及び４に記載の凍結乾燥で取得されるグルタチオントリスルフィドは非晶質であり、これまでグルタチオントリスルフィドの結晶及びその製造方法に関する報告はない。

【0008】

また、従来知られていたアルキルポリスルフィドの製造方法では、溶媒として有機溶媒を使用することが多く、有機溶媒への溶解度が低い親水性のポリスルフィドを効率的に製造することができなかった。そして、水性溶媒を用いたポリスルフィド製造方法においては、硫化水素や塩素などの有毒ガスを用いるか、又は有毒ガスが発生する危険性がある不安定な化合物を用いることが多かった。

【0009】

これより、有毒ガスを用いない、あるいは安定な化合物を用いた、水性溶媒中での簡便なポリスルフィドの製造方法が求められていた。

【0010】

したがって、本発明は、グルタチオントリスルフィドの結晶及びその製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、チオ硫酸塩を用いた水性溶媒中での簡便なポリスルフィドの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、以下の（１）～（１４）に関する。
（１）グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶。
（２）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、３０．５±０．２°好ましくは±０．１°、１７．７±０．２°好ましくは±０．１°、１７．５±０．２°好ましくは±０．１°及び２１．２±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（１）の結晶。
（３）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２５．３±０．２°好ましくは±０．１°、２１．５±０．２°好ましくは±０．１°、２１．８±０．２°好ましくは±０．１°及び１９．０±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（２）の結晶。
（４）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、１９．２±０．２°好ましくは±０．１°、１２．１±０．２°好ましくは±０．１°、２５．０±０．２°好ましくは±０．１°、及び２０．３±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（３）の結晶。
（５）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２０．６±０．２°好ましくは±０．１°、２９．７±０．２°好ましくは±０．１°、９．５±０．２°好ましくは±０．１°、及び１４．４±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（４）の結晶。
（６）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、２７．３±０．２°好ましくは±０．１°、１９．５±０．２°好ましくは±０．１°、１６．５±０．２°好ましくは±０．１°、及び２５．８±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（５）の結晶。
（７）粉末Ｘ線回折において、回折角（２θ°）が、さらに、１１．９±０．２°好ましくは±０．１°、２３．２±０．２°好ましくは±０．１°、及び３０．０±０．２°好ましくは±０．１°にピークを有する、上記（６）の結晶。
（８）単結晶Ｘ線構造解析において、－１７３℃で測定した場合、次の概略的単位胞パラメーター：ａ＝５．３７７７Å；ｂ＝９．４３９０Å；ｃ＝１４．７８２２Å；α＝８２．８３３°；β＝８９．１０１°；γ＝８９．３９２°；Ｖ＝７４４．３７Å^３；Ｚ＝１；を有し、かつ空間群がＰ１；である、上記（１）～（７）のいずれか１に記載の結晶。
（９）グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程、及び該析出したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を採取する工程を含む、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の製造方法。
（１０）グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程の前に、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌することにより、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を調製する工程を含む、上記（９）に記載の製造方法。
（１１）グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程が、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を濃縮することによりグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程である、上記（９）又は（１０）に記載の製造方法。
（１２）チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌する工程を含む、以下の一般式（Ｉ）で表わされる、ポリスルフィドの製造方法。
式（Ｉ） Ｒ－Ｓ_ｎ－Ｒ
（ここで、ｎは３以上の任意の自然数を、Ｒは、任意の化合物から水素原子を除いた組成を表わす）
（１３）チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物が還元型グルタチオン又は酸化型グルタチオンであり、ポリスルフィドがグルタチオントリスルフィド、グルタチオンテトラスルフィド、及びグルタチオンペンタスルフィドから選ばれる少なくとも１である、上記（１２）に記載の製造方法。
（１４）チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物がＮ－アセチル－Ｌ－システイン又はＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィドであり、ポリスルフィドがＮ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインペンタスルフィド、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインヘキサスルフィドから選ばれる少なくとも１である、上記（１２）に記載の製造方法。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、実施例１で得られた、酸化型グルタチオン水溶液のｐＨとグルタチオントリスルフィドの生成効率の相関を表わす。縦軸はグルタチオントリスルフィド濃度（ｇ／Ｌ）を、横軸は攪拌時間（時間）を表わす。

【図2】図２は、実施例２で得られた、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の粉末Ｘ線回折の結果を表わす。縦軸は強度（ｃｐｓ）を、横軸は回折角２θ（°）を表わす。

【図3】図３は、実施例２で得られた、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の赤外分光（ＩＲ）分析の結果を表わす。縦軸は光の透過率（％Ｔ）を、横軸は波数（１／ｃｍ）を表わす。

【発明を実施するための形態】

【0013】

１．本発明の結晶
本発明の結晶は、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶である。

【0014】

結晶がグルタチオントリスルフィドの結晶であることは、例えば、ＨＰＬＣを用いた分析により確認することができる。

【0015】

ＨＰＬＣを用いた分析における分析条件としては、例えば、以下の条件を挙げることができる。
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ φ３．０×１５０ｍｍ ３μｍ（ジーエルサイエンス社製）
カラム温度：３５℃
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
溶離液：０．２％の１－ヘプタンスルホン酸ナトリウム及び６．８％のリン酸二水素カリウムを含む、３％メタノール溶液（リン酸でｐＨ３．０に調整）
検出器：ＵＶ検出器（波長２１０ｎｍ）

【0016】

結晶がグルタチオントリスルフィドの結晶であることは、粉末Ｘ線回折による分析によっても確認することができる。

【0017】

粉末Ｘ線回折による分析は、例えば、粉末Ｘ線回折装置（ＸＲＤ）Ｕｌｔｉｍａ ＩＶ（リガク社製）を使用し、Ｘ線源としてＣｕＫαを用い、付属の使用説明書に従って行うことができる。

【0018】

グルタチオントリスルフィドの結晶が２水和物の結晶であることは、カールフィッシャー法又は熱重量示差熱分析により、該結晶中の水分含量が、通常５．３±１．０重量％、好ましくは５．３±０．５重量％、より好ましくは５．３±０．３重量％であることにより確認することができる。

【0019】

熱重量示差分析は、例えば、ＥＸＳＴＡＲ６０００（セイコーインスツル社製）を使用し、付属の使用説明書に従って、３０℃から２００℃（温度変化速度：１０℃／ｍｉｎ）における重量変化及び示差熱を測定することにより行うことができる。

【0020】

本発明の結晶としては、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折において、下記（ｉ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶を挙げることができ、下記（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶が好ましく、下記（ｉ）～（ｉｉｉ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶がより好ましく、下記（ｉ）～（ｉｖ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶がさらに好ましく、下記（ｉ）、～（ｖ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶が特に好ましく、下記（ｉ）～（ｖｉ）に記載の回折角（２θ°）にピークを有する結晶が最も好ましい。

【0021】

（ｉ）３０．５±０．２°好ましくは±０．１°、１７．７±０．２°好ましくは±０．１°、１７．５±０．２°好ましくは±０．１°及び２１．２±０．２°好ましくは±０．１°
（ｉｉ）２５．３±０．２°好ましくは±０．１°、２１．５±０．２°好ましくは±０．１°、２１．８±０．２°好ましくは±０．１°及び１９．０±０．２°好ましくは±０．１°
（ｉｉｉ）１９．２±０．２°好ましくは±０．１°、１２．１±０．２°好ましくは±０．１°、２５．０±０．２°好ましくは±０．１°、及び２０．３±０．２°好ましくは±０．１°
（ｉｖ）２０．６±０．２°好ましくは±０．１°、２９．７±０．２°好ましくは±０．１°、９．５±０．２°好ましくは±０．１°、及び１４．４±０．２°好ましくは±０．１°
（ｖ）２７．３±０．２°好ましくは±０．１°、１９．５±０．２°好ましくは±０．１°、１６．５±０．２°好ましくは±０．１°、及び２５．８±０．２°好ましくは±０．１°
（ｖｉ）１１．９±０．２°好ましくは±０．１°、２３．２±０．２°好ましくは±０．１°、及び３０．０±０．２°好ましくは±０．１°

【0022】

本発明の結晶として具体的には、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンが、図２に示すパターン及び表２に示す回折角の値で規定されるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶、並びに、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンが、表３に示す回折角の値で規定されるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を挙げることができる。

【0023】

また、赤外分光（ＩＲ）分析に供した場合、図３に示す赤外吸収スペクトルを示すグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶も、本発明の結晶の具体例として挙げることができる。

【0024】

赤外分光（ＩＲ）分析は、例えば、ＦＴＩＲ－８４００型（島津製作所製）を使用し、付属の使用説明書に従って行うことができる。

【0025】

また、例えば、単結晶Ｘ線構造解析において、およそ－１７３℃で測定した場合、単位格子寸法：ａ＝５．３７７７Å；ｂ＝９．４３９０Å；ｃ＝１４．７８２２Å；α＝８２．８３３°；β＝８９．１０１°；γ＝８９．３９２°；Ｖ＝７４４．３７Å^３；Ｚ＝１；を有し、かつ空間群がＰ１；であるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶も、本発明の結晶の例として挙げることができる。

【0026】

より具体的には、単結晶Ｘ線構造解析を行ったときに表６に示す各種の結果を示すグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を挙げることができる。

【0027】

単結晶Ｘ線構造解析は、例えば、Ｒ－ＡＸＩＳ ＲＡＰＤ－Ｆ（リガク社製）を用い、使用説明書に従って行うことができる。

【0028】

具体的には、例えば、グルタチオントリスルフィド・２水和物の単結晶を回折計に取り付け、室温の大気中または所定の温度の不活性ガス気流中で、所定の波長のＸ線を用いて、回折画像を測定する。回折画像から算出された面指数と回折強度の組から、直接法による構造決定と最小二乗法による構造精密化を行い、単結晶構造を得る。

【0029】

２．本発明の結晶の製造方法
本発明の結晶の製造方法は、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程、及び該析出したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を採取する工程を含む、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の製造方法である。

【0030】

グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液に含有されるグルタチオントリスルフィドは、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩を水溶液中で反応させる方法その他の化学合成法、発酵法、酵素法、天然物からの抽出法等のいずれの製造方法によって製造されたものであってもよい。

【0031】

グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液に、結晶化の障害となる固形物が含まれている場合には、遠心分離、濾過又はセラミックフィルタ等を用いて固形物を除去することができる。

【0032】

また、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液に、結晶化の障害となる水溶性の不純物や塩が含まれている場合には、イオン交換樹脂等を充填したカラムに通塔する等により、水溶性の不純物や塩を除去することができる。

【0033】

また、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液に、結晶化の障害となる疎水性の不純物が含まれる場合には、合成吸着樹脂や活性炭等を充填したカラムに通塔する等により、疎水性の不純物を除去することができる。

【0034】

本発明の結晶の製造方法に用いるグルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液は、グルタチオントリスルフィドの濃度が通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上となるように調整して用いることが好ましい。

【0035】

前記水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程は、例えば、該水溶液を濃縮、該水溶液を冷却、又は該水溶液中へアルコール溶液を添加若しくは滴下すること等により、行うことができる。

【0036】

また、例えば、前記水溶液の濃縮、該水溶液の冷却、該水溶液中へのアルコール溶液の添加又は滴下等は、１以上を組み合わせて行うこともできる。

【0037】

前記水溶液を濃縮する場合、例えば、加熱濃縮法又は減圧濃縮法などの一般的な濃縮方法を用いることができる。

【0038】

前記水溶液を加熱濃縮する場合における、該水溶液の温度としては、通常４０～８０℃、好ましくは４０～７０℃、最も好ましくは４０～６０℃を挙げることができる。

【0039】

前記水溶液を加熱濃縮する場合における、濃縮に要する時間は、該水溶液のグルタチオントリスルフィドの濃度や該水溶液の温度によって変わってくるが、該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶が析出する時間であればよく、当業者であれば、例えば、通常２～１００時間、好ましくは３～７０時間、最も好ましくは５～５０時間の範囲で適宜適切に設定することができる。

【0040】

前記水溶液を減圧濃縮する場合における、該水溶液の温度としては、通常１０～６０℃、好ましくは２０～５５℃、最も好ましくは３０～５０℃を挙げることができる。

【0041】

前記水溶液を減圧濃縮する場合における、濃縮に要する時間は、該水溶液のグルタチオントリスルフィドの濃度や該水溶液の温度によって変わってくるが、該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶が析出する時間であればよい。具体的には、例えば、通常２～１００時間、好ましくは３～７０時間、最も好ましくは５～５０時間の範囲が好ましい。

【0042】

具体的には、例えば、後述の実施例２に記載のとおり、０．５６ｇ／Ｌの濃度のグルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を減圧濃縮する場合、好ましくは４０～５０℃にて、好ましくは１０時間減圧濃縮することにより、本発明の結晶を析出させることができる。

【0043】

前記水溶液を冷却する場合における、該水溶液の温度及び該水溶液の冷却に要する時間は、該水溶液のグルタチオントリスルフィドの濃度によって変わってくるが、該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶が析出する条件であればよい。具体的には、例えば、該水溶液の温度は、通常０～１５℃、好ましくは０～１０℃、最も好ましくは０～５℃の範囲が好ましい。また、例えば、冷却に要する時間は、通常６時間～８日間、好ましくは１２時間～７日間、最も好ましくは２４時間～６日間の範囲が好ましい。

【0044】

前記水溶液中にアルコール溶液を添加又は滴下する場合における、アルコール溶液は、複数種のアルコールの混合物、又はアルコールと他の有機溶媒若しくは水の混合物であってもよい。

【0045】

アルコール溶液がアルコールと水の混合物（以下、アルコール水溶液ともいう。）である場合は、アルコールとしては、好ましくはＣ１～Ｃ６のアルコール類を、より好ましくはＣ１～Ｃ３のアルコール類を、さらに好ましくはメタノール、エタノール、ｎ－プロパノール及びイソプロピルアルコールからなる群より選ばれるアルコール類を、よりさらに好ましくはメタノール又はエタノールを、最も好ましくはメタノールを挙げることができる。

【0046】

また、アルコール溶液がアルコール水溶液である場合、含水量としては、通常４０重量％以下、好ましくは２０重量％以下、さらに好ましくは１０重量％以下、最も好ましくは５重量％以下を挙げることができる。

【0047】

前記水溶液中にアルコール溶液を添加又は滴下する場合における、該水溶液の温度、滴下又は添加するアルコール溶液の液量、及びアルコール溶液の添加又は滴下に要する時間は、該水溶液のグルタチオントリスルフィドの濃度によって変わってくるが、該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶が析出する条件であればよい。具体的には、例えば、該水溶液の温度は、通常０～４０℃、好ましくは０～３５℃、最も好ましくは５～３０℃の範囲が好ましい。また、例えば、添加又は滴下するアルコール溶液の液量は、該水溶液の通常０．１～１００倍等量、好ましくは０．１～１０倍等量、最も好ましくは０．１～３倍等量の範囲が好ましい。また、例えば、アルコール溶液の添加又は滴下に要する時間は、通常１分間～２４時間、好ましくは１分間～１０時間、最も好ましくは１～７時間の範囲が好ましい。

【0048】

本発明の結晶の製造方法においては、該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程を開始する直前に、又は該水溶液中にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程においてグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶が析出する前に、種晶を添加してもよい。

【0049】

種晶としては、例えば、本発明の結晶の製造方法により取得したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を用いることができる。

【0050】

種晶は、該水溶液中の濃度が通常０．００１～５０ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１～５ｇ／Ｌとなるように添加する。

【0051】

前記水溶液中にアルコール溶液を添加又は滴下することによりグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる場合において、種晶を添加する時間は、例えば、アルコール溶液の添加又は滴下を開始してから通常０～１２時間後、好ましくは０～８時間後、最も好ましくは０～４時間後の範囲で設定することができる。

【0052】

上記の方法によりグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させた後、析出した結晶を通常１～４８時間、好ましくは１～２４時間、最も好ましくは１～１２時間熟成させることができる。

【0053】

結晶を熟成させるとは、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程を停止して、結晶を成長させることをいう。
結晶を成長させるとは、析出した結晶を元にして、結晶を増大させることをいう。
結晶の熟成は、結晶を成長させることを主な目的として行うが、結晶の成長と同時に、新たな結晶の析出が起こっていてもよい。

【0054】

グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程を停止するとは、例えば、該水溶液中にアルコール溶液を添加又は滴下することによりグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる場合においては、アルコール溶液の添加又は滴下を中断することをいう。

【0055】

結晶を熟成させた後は、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程を再開してもよい。

【0056】

グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を採取する工程においては、例えば、濾取、加圧濾過、吸引濾過、遠心分離等を行うことができる。さらに結晶への母液の付着を低減し、結晶の品質を向上させるために、結晶を採取した後、適宜、結晶を洗浄することができる。

【0057】

結晶洗浄に用いる溶液としては、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、ｎ－プロパノール、及びイソプロピルアルコールからなる群より選ばれる１種類又は複数種類を任意の割合で混合した溶液を用いることができる。

【0058】

このようにして得られた湿晶を乾燥させることにより、本発明の結晶を取得することができる。
乾燥条件としては、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の形態を保持できるならば特に制限はなく、例えば、減圧乾燥、真空乾燥、流動層乾燥、通風乾燥等を適用することができる。

【0059】

乾燥温度としては、付着水分又は溶液を除去できる範囲であればいずれでもよいが、好ましくは８０℃以下、より好ましくは７０℃以下、最も好ましくは６０℃以下を挙げることができる。
乾燥時間としては、好ましくは１～６０時間、より好ましくは１～４８時間を挙げることができる。

【0060】

本発明の結晶の製造方法では、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液にグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を析出させる工程の前に、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌することにより、グルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を調製する工程を含んでいてもよい。

【0061】

酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌することにより、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩を反応させてグルタチオントリスルフィドを生成することができる。

【0062】

前記工程で使用する酸化型グルタチオンは、非結晶性アモルファスであっても結晶であってもよいし、結晶の場合、無水物であっても水和水を有していてもよい。

【0063】

前記工程に使用するチオ硫酸塩としては、特に限定されないが、例えば、チオ硫酸ナトリウム及びチオ硫酸アンモニウムを、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを挙げることができる。

【0064】

前記工程に使用するチオ硫酸塩は、無水物であってもよいし、水和水を有していてもよい。

【0065】

前記工程における、該水溶液中の酸化型グルタチオンの濃度としては、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0066】

前記工程における、該水溶液中のチオ硫酸塩の濃度としては、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0067】

前記工程における、該水溶液の温度としては、通常５～４０℃、好ましくは１０～３０℃を挙げることができる。

【0068】

前記工程における、該水溶液のｐＨとしては、通常ｐＨ２～４を挙げることができる。

【0069】

前記工程における、酸化型グルタチオン及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌する時間としては、通常２～４８時間、好ましくは５～３６時間、より好ましくは８～２４時間を挙げることができる。

【0070】

前記工程により調製したグルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液に、結晶化の障害となる固形物が含まれている場合、結晶化の障害となる水溶性の不純物や塩が含まれている場合、結晶化の障害となる疎水性の不純物が含まれる場合は、前述したとおり、不純物を除去することができる。

【0071】

具体的には、例えば、後述の実施例２に記載のとおり、上記の方法で調製したグルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を濾過して硫黄などの固形物を除去した後、濾液を合成吸着樹脂を充填したカラムに通塔することにより、高純度のグルタチオントリスルフィドが溶解した水溶液を調製することができる。

【0072】

上記の方法によって、高純度のグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を取得することができる。

【0073】

グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の純度としては、通常９３％以上、好ましくは９４％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上を挙げることができる。

【0074】

グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の純度は、例えば、上記１と同様のＨＰＬＣを用いた分析により確認することができる。

【0075】

上記の製造方法によって製造することができるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶としては、具体的には、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンが、図２に示すパターン及び表２に示す回折角の値で規定されるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶、並びに、Ｘ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折パターンが、表３に示す回折角の値で規定されるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を挙げることができる。

【0076】

また、赤外分光（ＩＲ）分析に供した場合、図３に示す赤外吸収スペクトルを示すグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶も、上記の製造方法によって製造することができるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の具体例として挙げることができる。

【0077】

また、単結晶Ｘ線構造解析により表６に示す各種の結果を示すグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶も、上記の製造方法によって製造することができるグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の具体例として挙げることができる。

【0078】

３．本発明のポリスルフィドの製造方法
また、本発明は、チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌する工程を含む、ポリスルフィドの製造方法に関する。

【0079】

ポリスルフィドとは、以下の一般式（Ｉ）で表わされる、多数の連続した硫黄原子を含む化合物のことをいう。
式（Ｉ） Ｒ－Ｓ_ｎ－Ｒ
（ここで、ｎは３以上の任意の自然数を表わし、好ましくは３～１０の任意の自然数を、より好ましくは３～６の任意の自然数を、最も好ましくは３又は４を表わす。また、Ｒは、任意の化合物から水素原子を除いた組成を表わす。そして、Ｒにおいて、硫黄原子が結合しているのは、Ｒの炭素原子である。）

【0080】

Ｒとしては、具体的には、例えば、還元型グルタチオンの有するチオール基から水素原子を除いた組成（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの有するチオール基から水素原子を除いた組成（Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３）、及びＬ－システインの有するチオール基から水素原子を除いた組成（Ｃ_３Ｈ_６ＮＯ_２）を挙げることができる。

【0081】

本発明において、ポリスルフィドとしては特に制限されないが、親水性のポリスルフィドであることが好ましい。

【0082】

本明細書において、「親水性のポリスルフィド」とは、該ポリスルフィドを水に溶解させたときの該ポリスルフィドの濃度が、０．１ｇ／Ｌ以上となり得るポリスルフィドのことをいう。

【0083】

親水性のポリスルフィドとしては、具体的には、例えば、グルタチオントリスルフィド（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６－Ｓ_３－Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６）、グルタチオンテトラスルフィド（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６－Ｓ_４－Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６）、グルタチオンペンタスルフィド（Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６－Ｓ_５－Ｃ_１０Ｈ_１６Ｎ_３Ｏ_６）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド（Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３－Ｓ_３－Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド（Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３－Ｓ_４－Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインペンタスルフィド（Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３－Ｓ_５－Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３）及びＮ－アセチル－Ｌ－システインヘキサスルフィド（Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３－Ｓ_６－Ｃ_５Ｈ_８ＮＯ_３）を、好ましくはグルタチオントリスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィドを挙げることができる。

【0084】

チオ硫酸塩としては、特に限定されないが、例えば、チオ硫酸ナトリウム及びチオ硫酸アンモニウムを、好ましくはチオ硫酸ナトリウムを挙げることができる。チオ硫酸塩は、無水物であってもよいし、水和水を有していてもよい。

【0085】

チオール基を有する化合物とは、以下の一般式（ＩＩ）で表わされる化合物をいう。
式（ＩＩ） Ｒ－Ｓ－Ｈ
（ここで、Ｒは、任意の化合物から水素原子を除いた組成を表わす。また、Ｒにおいて、硫黄原子が結合しているのは、Ｒの炭素原子である。）

【0086】

ジスルフィド結合を有する化合物とは、以下の一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物をいう。
式（ＩＩＩ） Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ
（ここで、Ｒは、任意の化合物から水素原子を除いた組成を表わす。また、Ｒにおいて、硫黄原子が結合しているのは、Ｒの炭素原子である。）

【0087】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物の具体例としては、例えば、ポリスルフィドとしてグルタチオンポリスルフィド、より具体的にはグルタチオントリスルフィド、グルタチオンテトラスルフィド、及びグルタチオンペンタスルフィドから選ばれる少なくとも１を製造する場合、好ましくは酸化型グルタチオン及び還元型グルタチオンを、より好ましくは酸化型グルタチオンを挙げることができる。チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物として酸化型グルタチオンを用いる場合の酸化型グルタチオンは、非結晶性アモルファスであっても結晶であってもよいし、結晶の場合、無水物であっても水和水を有していてもよい。

【0088】

また、例えば、ポリスルフィドとしてＮ－アセチル－Ｌ－システインポリスルフィド、より具体的にはＮ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインペンタスルフィド、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインヘキサスルフィドから選ばれる少なくとも１を製造する場合、好ましくはＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィド及びＮ－アセチル－Ｎ－システインを、より好ましくはＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィドを挙げることができる。

【0089】

本発明の方法でポリスルフィドを製造する場合の反応水溶液中のチオール基又はジスルフィド結合を有する化合物の濃度、チオ硫酸塩の濃度、及び反応水溶液のｐＨは、当業者であれば、使用するチオール基又はジスルフィド結合を有する化合物によって、適宜設定することができる。

【0090】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物として酸化型グルタチオンを用いる場合の、チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液中の酸化型グルタチオンの濃度としては、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0091】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物として酸化型グルタチオンを用いる場合の該水溶液中のチオ硫酸塩の濃度としては、通常０．１ｇ／Ｌ以上、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0092】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物として酸化型グルタチオンを用いる場合の該水溶液のｐＨとしては、通常ｐＨ２～４を挙げることができる。

【0093】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物としてＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィドを用いる場合の、チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液中のＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィドの濃度としては、通常１０ｇ／Ｌ以上、好ましくは３０ｇ／Ｌ以上、より好ましくは５０ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0094】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物としてＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィドを用いる場合の該水溶液中のチオ硫酸塩の濃度としては、通常１ｇ／Ｌ以上、好ましくは５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以上を挙げることができる。

【0095】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物としてＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィドを用いる場合の該水溶液のｐＨとしては、通常ｐＨ１．５～４を挙げることができる。

【0096】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌する際の温度としては、通常５～４０℃、好ましくは１０～３０℃を挙げることができる。

【0097】

チオール基又はジスルフィド結合を有する化合物、及びチオ硫酸塩が溶解した水溶液を静置又は攪拌する時間としては、通常２～４８時間、好ましくは５～３６時間、より好ましくは８～２４時間を挙げることができる。

【0098】

以上の工程により、硫化水素を用いることなく、水性溶媒中で簡便にポリスルフィドを製造することができる。

【0099】

前記工程により調製したポリスルフィドが溶解した水溶液に固形物が含まれている場合及び目的とするポリスルフィド以外の不純物が含まれる場合は、濾過、遠心分離、合成吸着樹脂やイオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーなどにより、目的とするポリスルフィドを単離、精製することができる。

【実施例】

【0100】

以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0101】

［実施例１］
グルタチオンポリスルフィドの製造
種々の含硫化合物と酸化型グルタチオンを用いて、グルタチオンポリスルフィドの生成検討を行った。

【0102】

酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）を水に溶解させて１００ｇ／Ｌに調製し、そこへ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸、又は亜硫酸を酸化型グルタチオンと等モル濃度となるよう添加し、室温にて約４０時間撹拌した。攪拌開始０時間、１６時間、及び４１時間後の該溶液中のグルタチオントリスルフィド濃度を測定した。それぞれの化合物を添加した場合の経過時間ごとのグルタチオントリスルフィド濃度（ｇ／Ｌ）を表１に示す。

【0103】

【表1】

【0104】

表１に示すように、チオ硫酸ナトリウムを添加した場合にのみグルタチオントリスルフィドが著量生成し、それ以外の場合はグルタチオントリスルフィドが生成されなかった。また、３２００ＱＴＲＡＰ（エービーサイエックス社製）を用いた液体クロマトグラフィー質量分析測定の結果、該溶液中には、グルタチオントリスルフィドの他、グルタチオンテトラスルフィド及びグルタチオンペンタスルフィドが生成していることが確認された。

【0105】

さらに、グルタチオントリスルフィドの製造時における、反応溶液のｐＨと反応効率の検討を行った。酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）１０ｇを、３０℃の水７５ｍＬに溶解させ、酸化型グルタチオン水溶液を調製した。その後、２Ｎの水酸化ナトリウム（和光純薬社製）を用いて、酸化型グルタチオン水溶液のｐＨを、それぞれ３、４、５、６又は７に調整し、水を加えて１００ｍＬまでメスアップした。

【0106】

続いて、各酸化型グルタチオン水溶液に、チオ硫酸ナトリウム（和光純薬社製）１．３ｇを添加し、攪拌を開始した。攪拌中、２４時間ごとに、各水溶液中のグルタチオントリスルフィド濃度を測定した。結果を図１に示す。

【0107】

図１に示すように、反応溶液のｐＨが低い方が、各時間におけるグルタチオントリスルフィド濃度が高く、グルタチオントリスルフィドの生成効率が高いことがわかった。

【0108】

［実施例２］
グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の取得－１
酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）６５ｇを水に溶解して調製した酸化型グルタチオン水溶液１Ｌに、チオ硫酸ナトリウム（和光純薬社製）１７ｇを加え、室温下で１２時間攪拌し、１５．９ｇ／Ｌのグルタチオントリスルフィド水溶液（純度３４％）を調製した。

【0109】

前記水溶液を濾過して硫黄などの沈殿物を濾別し、得られた濾液を合成吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱化学社製）５００ｍＬを充填したカラムに通塔した。続いて、水３０Ｌを用いて溶出を実施し、０．５６ｇ／Ｌのグルタチオントリスルフィド水溶液２５Ｌ（純度９８％）を取得した。

【0110】

取得したグルタチオントリスルフィド水溶液２５Ｌを、４０～５０℃にて１０時間減圧濃縮を行い、５００ｍＬまで濃縮すると、結晶が析出した。析出した結晶を濾過によって水溶液から分離して採取し、室温下で減圧乾燥を行い、９．１ｇの結晶を取得した。

【0111】

ＨＰＬＣを用いた分析により、得られた結晶はグルタチオントリスルフィドの結晶であることが確認された。
また、熱重量示差熱分析より、取得したグルタチオントリスルフィドの結晶は、温度上昇（３０℃～２００℃）に伴って徐々に脱水され、６１℃で無水物に至ること、また、減少した水分重量から２水和物であることが分かった（理論値：５．３重量％、実測値：５．３重量％）。

【0112】

また、ＨＰＬＣによる純度測定により、得られた結晶は９６％（面積％）以上のグルタチオントリスルフィド純度であることを確認した。

【0113】

得られた結晶の粉末Ｘ線回折の結果より、相対強度比（Ｉ／Ｉ_０）が３０以上であったピークの回折角を表２に示す。表中、「２θ」は回折角（２θ°）を、「相対強度」は、相対強度比を示す。また、得られた結晶のＸ線源としてＣｕＫαを用いた粉末Ｘ線回折の結果を図２に、赤外分光（ＩＲ）分析の結果を図３に示す。

【0114】

【表2】

【0115】

［実施例３］
グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の取得－２
酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）３０ｇとチオ硫酸ナトリウム（和光純薬社製）４ｇを水３Ｌに溶解させ、該水溶液を２５℃にて２０時間撹拌したところ、結晶が析出した。該水溶液を濾過し、析出した結晶を含む沈殿物１０ｇを回収した。

【0116】

続いて、回収した沈殿物１０ｇを６０℃の水３Ｌに溶解させ、該水溶液を０．４５μｍのメンブレンフィルター（ミリポア社製）で濾過した後、得られた濾液を５０℃にて５時間減圧濃縮を行い、５００ｍＬまで濃縮したところ、結晶が析出した。

【0117】

析出した結晶を濾過によって水溶液から分離して採取し、室温下で減圧乾燥を行い、６．５ｇの結晶を取得した。

【0118】

得られた結晶の粉末Ｘ線回折の結果より、相対強度比（Ｉ／Ｉ_０）が３０以上であったピークの回折角を表３に示す。表中、「２θ」は回折角（２θ°）を、「相対強度」は、相対強度比を示す。

【表3】

【0119】

また、当該結晶を赤外分光（ＩＲ）分析及び熱重量示唆分析に供した。当該結晶の粉末Ｘ線結晶回折パターン、赤外吸収スペクトル、熱重量示差熱分析の結果は実施例２で取得した結晶と同一であったことから、当該結晶は、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶であることがわかった。

【0120】

［実施例４］
グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の保存安定性
実施例２で製造したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶１ｇを水に溶解し、１００ｍＬとした。該水溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後凍結乾燥することで、白色を帯びた透明の粉末を得た。当該粉末の粉末Ｘ線回折を測定したところ、Ｘ線回折ピークが確認されなかったことから、当該粉末はグルタチオントリスルフィドの非結晶性アモルファスであることがわかった。

【0121】

続いて、取得したグルタチオントリスルフィドの非結晶性アモルファスと、実施例２で製造したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の吸湿性を比較した。

【0122】

各サンプル約１００ｍｇを精密天秤で秤量後、ガラス容器に充填し、４０℃、相対湿度７５％の条件下でＴＨＥ０５１ＦＡ（アドバンテック東洋社製）に保管後、再度サンプルを秤量することで重量変化率を算出した。なお、試験開始時のそれぞれの重量を１００％として各経過時間後のサンプルの重量を測定した。

【0123】

結果を表４に示す。

【0124】

【表4】

【0125】

表４に示すように、非結晶性アモルファスが時間の経過に伴って重量が増加したのに対し、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶は重量がほとんど変わらなかった。このことから、非結晶性アモルファスと比較して、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶は吸湿性が低く、保存安定性に優れていることがわかった。

【0126】

［実施例５］
グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の不純物淘汰性
実施例２で製造したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶３ｇと、還元型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）０．３ｇ及び酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）０．３ｇを水に溶解し、１００ｍＬとした。該水溶液を０．４５μｍのフィルターで濾過した後凍結乾燥することで、白色を帯びた透明の粉末を得た。当該粉末の粉末Ｘ線回折を測定したところ、Ｘ線回折ピークが確認されなかったことから、当該粉末は非結晶性アモルファスであることがわかった。

【0127】

また、実施例２で製造したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶３ｇと、還元型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）０．３ｇ及び酸化型グルタチオン（協和発酵バイオ社製）０．３ｇを水に溶解し、１００ｍＬとした。該水溶液を５０℃にし、減圧することで１００ｍＬまで濃縮し、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を含むスラリーを得た。このスラリーを濾過することでグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶を回収した。

【0128】

上記で得られた非結晶性アモルファス及びグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶をそれぞれ１００ｍＬメスフラスコに２００ｍｇずつ評量した後、水を加えて１００ｍＬとした。続いて、ＨＰＬＣを用いた分析により該水溶液に含まれる還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンを定量し、該水溶液に含まれるグルタチオントリスルフィドの重量に対する還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンの重量（重量％）を算出した。
結果を表５に示す。

【0129】

【表5】

【0130】

表５に示すように、グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶に含まれる還元型グルタチオン及び酸化型グルタチオンは、非結晶性アモルファスと比べて少なかった。このことから、２水和物の結晶へと結晶化することにより、グルタチオントリスルフィドから不純物を効率的に除去できることがわかった。

【0131】

［実施例６］
グルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶の単結晶Ｘ線構造解析
結晶の構造を決定するために、実施例２で取得したグルタチオントリスルフィド・２水和物の結晶に対し、測定装置（アジレント・テクノロジー社製単結晶Ｘ線構造解析装置ＳｕｐｅｒＮｏｖａ）を用いて、－１７３℃において単結晶Ｘ線回折（ＳＸＲＤ）を実施した。

【0132】

まず、グルタチオントリスルフィド・２水和物の単結晶を回折計に取り付け、室温の大気中あるいは所定の温度の不活性ガス気流中で、所定の波長のＸ線を用いて、回折画像を測定した。次に、回折画像から算出された面指数と回折強度の組から、直接法による構造決定と最小二乗法による構造精密化［Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ６４，１１２（２００８）］を行い、単結晶構造を得た。その結果を表６にまとめた。

【0133】

【表6】

【0134】

単結晶Ｘ線構造解析の結果、当該結晶が確かにグルタチオントリスルフィドの結晶であり、単位格子内に水分子を有する２水和物であることが確認された。また、フラック パラメーター（Ｆｌａｃｋ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）［Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ３９，８７６．（１９８３）］は０．１５（４）とほぼ０となることから、解析結果の絶対構造に矛盾がないことを確認した。

【0135】

［実施例７］
Ｎ－アセチル－Ｌ－システインポリスルフィドの製造－１
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン(協和発酵バイオ社製)２０２ｇを水に溶解して調製したＮ-アセチル-Ｌ-システイン水溶液２Ｌに、２ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬社製）を加えてｐＨ７．５に調整したのち、過酸化水素水（和光純薬社製）６３ｍＬを加え、室温下にて２４時間反応させることで、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインをＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィドに酸化した。

【0136】

続いて、該水溶液を、Ｈ^＋型の強カチオン交換樹脂ＵＢＫ１６（三菱ケミカル社製）１６０ｍＬを充填したカラムに通塔し、６５ｇ／ＬのＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィド水溶液３１００ｍＬを取得した。取得したＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィド水溶液にチオ硫酸ナトリウム（和光純薬社製)４８ｇを加え、室温下にて１２時間攪拌した。

【0137】

３２００ＱＴＲＡＰ（エービーサイエックス社製）を用いた液体クロマトグラフィー質量分析測定の結果、攪拌後の水溶液中にはＮ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインペンタスルフィド、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインヘキサスルフィドが生成していることが確認された。

【0138】

該水溶液を濾過して硫黄などの沈殿物を濾別し、得られた濾液を合成吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱ケミカル社製）１６０ｍＬを充填したカラムに通塔した。続いて、水２４０ｍＬ、５％メタノール水溶液（関東化学社製）７００ｍＬの順でカラムを洗浄したのち、１０％メタノール水溶液（関東化学社製）を用いて溶出を実施し、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィドを含む水溶液２５００ｍＬを取得した。

【0139】

取得したＮ-アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド水溶液２５００ｍＬを、４０～５０℃で３時間減圧濃縮を行うことで液体成分をすべて蒸発させ、アセチル－Ｌ－システイントリスルフィドを含む固体０．２ｇを取得した。

【0140】

ＨＰＬＣによる純度測定の結果、得られた固体は７５％（面積％）以上のアセチル－Ｌ－システイントリスルフィド純度であることが確認された。

【0141】

［実施例８］
Ｎ－アセチル－Ｌ－システインポリスルフィドの製造－２
Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン(協和発酵バイオ社製)２０２ｇを水に溶解して調製したＮ－アセチル－Ｌ－システイン水溶液２Ｌに、２ｍｏｌ/Ｌの水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬社製）を加えてｐＨ７．５に調整したのち、過酸化水素水（和光純薬社製）６３ｍＬを加え、室温下にて２４時間反応させることで、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインをＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィドに酸化した。

【0142】

続いて、該水溶液を、Ｈ^＋型の強カチオン交換樹脂ＵＢＫ１６（三菱ケミカル社製）１６０ｍＬを充填したカラムに通塔し、６５ｇ／ＬのＮ－アセチル－Ｎ－システインジスルフィド水溶液３１００ｍＬを取得した。取得したＮ－アセチル－Ｌ－システインジスルフィド水溶液にチオ硫酸ナトリウム（和光純薬社製)４８ｇを加え、室温下にて１２時間攪拌した。

【0143】

３２００ＱＴＲＡＰ（エービーサイエックス社製）を用いた液体クロマトグラフィー質量分析測定の結果、攪拌後の水溶液中にはＮ－アセチル－Ｌ－システイントリスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインペンタスルフィド、及びＮ－アセチル－Ｌ－システインヘキサスルフィドが生成していることが確認された。

【0144】

該水溶液を濾過して硫黄などの沈殿物を濾別し、得られた濾液を合成吸着樹脂ＳＰ２０７（三菱ケミカル社製）１６０ｍＬを充填したカラムに通塔した。続いて、水２４０ｍＬ、５％メタノール水溶液（関東化学社製）７００ｍＬ、１０％メタノール水溶液（関東化学社製）２５００ｍＬの順でカラムを洗浄したのち、３０％メタノール水溶液（関東化学社製）を用いて溶出を実施し、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィドを含む水溶液５５０ｍＬを取得した。

【0145】

取得したＮ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド水溶液５５０ｍＬを、４０～５０℃で３時間減圧濃縮を行うことで液体成分をすべて蒸発させ、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィドを含む固体０．２ｇを取得した。

【0146】

ＨＰＬＣによる純度測定の結果、得られた固体は７３％（面積％）以上のＮ－アセチル－Ｌ－システインテトラスルフィド純度であることが確認された。

【0147】

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１６年１２月２０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１６－２４６１１５）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

【産業上の利用可能性】

【0148】

本発明により、抗酸化成分として有用であるグルタチオントリスルフィドの結晶及びその製造方法が提供される。

【0149】

また、本発明により、硫化水素を用いない、チオ硫酸塩を用いた水性溶媒中でのポリスルフィドの簡便な製造方法が提供される。

【図1】

【図2】

【図3】