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特許7029138連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及び連結核酸断片から構成されるライブラリ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-22
(45)【発行日】2022-03-03
(54)【発明の名称】連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及び連結核酸断片から構成されるライブラリ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20220224BHJP
C12P 19/34 20060101ALI20220224BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20220224BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20220224BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20220224BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12P19/34 Z
C40B40/06
C12Q1/686 Z
C07K14/00
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2018038797
(22)【出願日】2018-03-05
(65)【公開番号】P2019149985
(43)【公開日】2019-09-12
【審査請求日】2021-01-29
(73)【特許権者】
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
(73)【特許権者】
【識別番号】516255448
【氏名又は名称】株式会社Ｅｐｓｉｌｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
(74)【代理人】
【識別番号】110002332
【氏名又は名称】特許業務法人綾船国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】根本 直人
(72)【発明者】
【氏名】熊地 重文
(72)【発明者】
【氏名】山本 恭秀
【審査官】松田 芳子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１６／１２６９８７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２００３／０２５０２０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１６－０９８１９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５２６０６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００８－０４８７２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】BMC Biotechnol.，2013年，13:81
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸と、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことで前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製する複製工程と、前記核酸断片の端部において、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、異なる塩基数の突出末端を形成する突出末端形成工程と、
前記突出末端形成工程で形成された突出末端のうち、一致する塩基数の突出末端を含む核酸断片同士を、前記突出末端同士を酵素で連結することにより連結して、複数の連結核酸断片を製造する連結工程と、を含む制限酵素非依存性連結核酸断片の製造方法。
【請求項2】
前記連結工程において、異なる塩基数の突出末端が形成された核酸断片同士を、一段階で連結する請求項１に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項3】
前記突出末端を構成する塩基数が３塩基以上１２塩基以下であって、異なる塩基数が突出する突出末端の塩基数の差が２塩基以上である、請求項１又は２に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項4】
前記イノシンの導入位置が、アミノ酸に対応するトリプレット配列の第三塩基にあたる位置であって、前記トリプレット配列は第三塩基が変化しても同一のアミノ酸に対応しているトリプレット配列であるように前記プライマーを設計するプライマー設計工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項5】
前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域は、ランダム変異が挿入されたランダム領域である、請求項１～４のいずれか一項に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項6】
イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素がEndonuclease V、又はT4ピリミジンダイマーグリコシラーゼ（PDG）である、請求項１～５のいずれか一項に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項7】
前記断片同士を連結する酵素がTaq DNAリガーゼ、T4 DNA Ligase、及びE. coli DNA Ligaseからなる群から選択されるいずれかの酵素である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項8】
前記複製工程において、イノシンを認識するＤＮＡポリメラーゼを使用する請求項１～７のいずれか一項に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項9】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、KOD -Multi & Epi-、KOD DNAポリメラーゼ、及びTaKaRa Taqからなる群から選択される酵素である請求項８に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項10】
前記鋳型核酸が抗体をコードするＤＮＡ配列である請求項１～９のいずれか一項に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項11】
前記特定の遺伝子配列領域が、抗体の相補性決定領域をコードする配列領域を含む領域である、請求項１０に記載の連結核酸断片の製造方法。
【請求項12】
配列表の配列番号１５で表されるヌクレオチド配列によりコードされる連結ペプチドで構成される連結ペプチドライブラリであって、配列番号１５において、r, b, d, v, k, s, h及びsは、混合塩基であり、ｒはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの出現率が25％であることを表し；bはＴ及びＣの出現率が50%であることを表し；dはＴ及びＧの出現率が19％、Ｃ及びＡの出現率が27%であることを表し；vは、Ｔ、Ｃ及びＡの出現率は28％であることを表し、Ｇの出現率は16％であることを表し；kは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；hは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；sはＴ及びＣの出現率が37%であり、Ｇの出現率が26％であることを表す、連結ペプチドライブラリ。
【請求項13】
配列表の配列番号２０～５９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで構成されることを特徴とする、請求項１２に記載の連結ペプチドライブラリ。
【請求項14】
配列表の配列番号１５で表されるヌクレオチド配列を有する核酸断片で構成される連結核酸断片ライブラリであって、配列番号１５において、r, b, d, v, k, s, h及びsは、混合塩基であり、ｒはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの出現率が25％であることを表し；bはＴ及びＣの出現率が50%であることを表し；dはＴ及びＧの出現率が19％、Ｃ及びＡの出現率が27%であることを表し；vは、Ｔ、Ｃ及びＡの出現率は28％であることを表し、Ｇの出現率は16％であることを表し；kは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；hは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；sはＴ及びＣの出現率が37%であり、Ｇの出現率が26％であることを表す、連結核酸断片ライブラリ。
【請求項15】
配列表の配列番号２０～５９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸断片で構成されることを特徴とする、請求項１４に記載の連結核酸断片ライブラリ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及びこれらの連結核酸断片から構成されるライブラリに関する。
【背景技術】
【0002】
機能性タンパクの開発は、医薬品、食品、研究開発用試薬等様々な分野において進められている。このような機能性タンパクの開発において、様々なタンパク質、ペプチド等の機能分子の集団（ライブラリ）の中から目的の機能をもったペプチドやタンパク質分子を選択するための「進化工学」と呼ばれる技術が開発されている。かかる技術の中でも、機能のあるペプチド分子を選択し、それに対応するDNAやＲＮＡ等の核酸の断片をこれらの分子に連結させて増幅させた後にシーケンシングによってそれらの配列を読み取る、というディスプレイ技術が知られている。
【0003】
これらディスプレイ技術等で用いられる核酸断片は以下のような方法で製造される。すなわち、まず鋳型となる核酸から、プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「PCR」と略すことがある。）を行うことで特定の遺伝配列を部分的に持つ核酸断片を複製し、さらにこれらの核酸断片を連結することで複数の遺伝子配列を有する連結核酸断片として製造される。
【0004】
核酸断片を連結する技術としては、例えば、特許文献１に、制限酵素で各核酸断片の端部に突出末端を形成する技術が開示されている（以下、「先行技術１」という）。制限酵素は、特定の塩基配列を認識してその箇所（以下、「認識塩基配列」という。）を特異的に切断する酵素である。その認識塩基配列は４塩基～６塩基対と比較的短い。そのため、長鎖の核酸分子中には、対応する認識塩基配列が一定の確率で確実に存在するため、様々な核酸分子で突出末端を形成できるというメリットがある。
その一方で、長鎖の核酸分子中には、対応する認識塩基配列が一定の確率で確実に存在するため、望ましくない部分で核酸断片が切断されることもある。
その一方で、長鎖の核酸分子中には、対応する認識塩基配列が一定の確率で確実に存在するため、望ましくない部分で核酸断片が切断されることもある。
【0005】
また、制限酵素で形成される突出末端の突出した塩基数が比較的短いため、つなぎ合わせるはずではない断片同士が連結されることもある。また、長い断片が形成された場合には、同じ断片の３’側の突出末端と、５’側の突出末端とが連結されてしまい、環状となることもある。すなわち、制限酵素を用いると、連結時のつなぎ間違いが起きやすく、所望の配列を有する連結断片を得ることは難しい。
このため、一段階で、精度良く目的とする連結核酸断片を得るためには、連結しようとする断片を連結して精製し、次に連結しようとする断片と連結して精製するという作業を繰り返して行う段階的処理が必要となり、作業が煩雑で効率が悪く、コストも高いという問題がある。
このため、一段階で、精度良く目的とする連結核酸断片を得るためには、連結しようとする断片を連結して精製し、次に連結しようとする断片と連結して精製するという作業を繰り返して行う段階的処理が必要となり、作業が煩雑で効率が悪く、コストも高いという問題がある。
【0006】
また、新規機能分子を創生するためには、連結核酸断片にランダム変異が挿入されたランダム配列領域を持たせることが重要である。例えば、特許文献２には、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ等のラクダ科動物の軽鎖を持たない特殊な抗体のVHH（Variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody）の領域に変異を導入する技術が提案されている（以下、「先行技術２」という。）。この特殊な抗体は、分子量が小さく、熱安定性も高く、タンパク質工学による改変も抗体分子に比べれば容易に行うことができる等の多くの利点を有するため、様々な分野での利用が期待されている。
しかし、天然のVHHには分子量が１，０００以下の低分子化合物を認識し、特異的に結合することができないという問題がある。このため、先行技術２は、前記ラクダ抗体のVHH領域をコードするDNAの領域に変異を導入することで、分子量が１，０００以下の低分子に対する高分子とも結合し得る抗体をコードするDNAライブラリを作製する技術を開示している。
しかし、天然のVHHには分子量が１，０００以下の低分子化合物を認識し、特異的に結合することができないという問題がある。このため、先行技術２は、前記ラクダ抗体のVHH領域をコードするDNAの領域に変異を導入することで、分子量が１，０００以下の低分子に対する高分子とも結合し得る抗体をコードするDNAライブラリを作製する技術を開示している。
【0007】
しかし、ランダム変異を導入された核酸断片から連結核酸断片を得る際に制限酵素を使用した場合、例えば、ランダム変異が導入された配列に認識塩基配列が含まれていると、当該箇所が制限酵素によって切断されてしまうため、以下のような問題が生じる。すなわち、（１）設計通りの配列を有する連結核酸断片が得られず、機能を有するタンパク質が生成されない、（２）制限酵素による切断によって読み枠がずれてしまい、生成されたタンパク質が機能を喪失している、（３）以上のような現象が生じることにより、ライブラリデザインの自由度が低くなって多様性の維持が難しくなるためライブラリの質が低下する、（４）ライブラリデザインの自由度が制限される、といった問題も生じ得る。
【0008】
非特許文献１には、プラスミドベクターに導入するDNA断片を作製する際に、PCR反応で使用するプライマーにイノシンを導入し、さらに、制限酵素の代わりに核酸分解酵素Endonuclease Vを用いて断片の末端に突出末端を形成する技術が開示されている（以下、「先行技術３」という。）。ここで、Endonuclease Vはイノシンを認識して、イノシンから特定の塩基数離れた位置にあるホスホジエステル結合を切断する酵素である。
この性質を利用すると、プラスミドベクターに導入したい目的の配列領域以外の部分にイノシンを導入しておくことにより、確実にプラスミドベクターへ導入する目的の配列領域を切り出すことができる。しかしながら、先行技術３は、DNA断片をそのままプラスミドベクターに導入する技術であり、DNA断片同士を効率よく連結するものではない。
この性質を利用すると、プラスミドベクターに導入したい目的の配列領域以外の部分にイノシンを導入しておくことにより、確実にプラスミドベクターへ導入する目的の配列領域を切り出すことができる。しかしながら、先行技術３は、DNA断片をそのままプラスミドベクターに導入する技術であり、DNA断片同士を効率よく連結するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】特願２０１４－２３６０４５号公報
【文献】特開２０１６－４４１２６号公報
【非特許文献】
【0010】
【文献】Baumann et al. BMC Biotechnology 2013, 13:81
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明が解決しようとする課題は、目的とする遺伝子配列領域を含む連結核酸断片を効率よく且つ精度よく得られる連結核酸断片の製造方法を提供すること、及び、目的とする遺伝子配列領域を精度良く含む連結核酸断片並びにこれらの連結核酸断片から構成されるライブラリを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明の発明者らは、以上のような状況の下で鋭意研究を進め、本願発明を完成したものである。
すなわち、本発明は、特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸と、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことで前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製する複製工程と；前記核酸断片の端部において、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、異なる塩基数の突出末端を形成する突出末端形成工程と；前記突出末端において、一致する塩基数の突出末端同士をホスホジエステル結合で連結する酵素を用いて核酸断片同士を連結して、複数の連結核酸断片を製造する連結工程と、を含む制限酵素非依存性連結核酸断片の製造方法である。
すなわち、本発明は、特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸と、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことで前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製する複製工程と；前記核酸断片の端部において、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、異なる塩基数の突出末端を形成する突出末端形成工程と；前記突出末端において、一致する塩基数の突出末端同士をホスホジエステル結合で連結する酵素を用いて核酸断片同士を連結して、複数の連結核酸断片を製造する連結工程と、を含む制限酵素非依存性連結核酸断片の製造方法である。
【0013】
ここで、前記連結工程において、異なる塩基数の突出末端が形成された核酸断片同士を一段階で連結することが好ましい。また、前記突出末端の塩基数は、３塩基以上１２塩基以下であって、異なる塩基数が突出する突出末端の塩基数の差が２塩基以上であることが好ましい。
【0014】
前記イノシンの導入位置は、アミノ酸に対応するトリプレット配列の第三塩基にあたる位置であって、前記トリプレット配列は第三塩基が変化しても同一のアミノ酸に対応しているトリプレット配列であるように前記プライマーを設計するプライマー設計工程をさらに含むことが好ましい。
【0015】
そして、前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域は、ランダム変異が挿入されたランダム領域であることが好ましい。ここで使用する、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素は、Endonuclease V、及びT4ピリミジンダイマーグリコシラーゼ（PDG）からなる群から選択されるいずれかの酵素であることが好ましい。
【0016】
また、前記ホスホジエステル結合で連結する酵素は、Taq DNAリガーゼ、T4 DNA リガーゼ及び E. coli DNA リガーゼからなる群から選択されるいずれかの酵素であることが好ましい。さらに、前記複製工程において、イノシンを認識するDNAポリメラーゼを使用することが好ましく、前記DNAポリメラーゼは、KOD DNAポリメラーゼ、KOD -Multi & Epi-及び KOD DNAポリメラーゼ、及びTaKaRa Taqからなる群から選択されるいずれかの酵素であることが好ましい。
【0017】
前記鋳型核酸は、抗体をコードするDNA配列であることが好ましく、前記特定の遺伝子配列領域は、抗体の相補性決定領域をコードする配列領域であることが好ましい。また、前記特定の遺伝子配列領域は、長さの等しい複数の相補性決定領域であることが好ましい。
【0018】
本発明の別の態様は、配列表の配列番号１５で表されるヌクレオチド配列によりコードされる連結ペプチドで構成される連結ペプチドライブラリであって、配列番号15において、r, b, d, v, k, s, h及びsは、混合塩基であり、ｒはＡ、Ｔ、Ｇ及びＣの出現率が25％であることを表し；bはＴ及びＣの出現率が50%であることを表し；dはＴ及びＧの出現率が19％、Ｃ及びＡの出現率が27%であることを表し；vは、Ｔ、Ｃ及びＡの出現率は28％であることを表し、Ｇの出現率は16％であることを表し；kは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；hは、Ｔの出現率が13％、Ｃの出現率が20％、Ａの出現率が35％、Ｇの出現率が32％であることを表し；sはＴ及びＣの出現率が37%であり、Ｇの出現率が26％である連結ペプチドライブラリを表す。また、本発明のさらに別の態様は、配列表の配列番号20～59で表されるアミノ酸配列を有するペプチドで構成されることを特徴とする、連結ペプチドライブラリである。
また、本発明のさらにまた別の態様は、配列表の配列番号15で表されるヌクレオチド配列を有する核酸断片で構成される連結核酸断片ライブラリである。ここで、配列番号15中のr, b, d, v, k, s, h及びsは、上記と同様である。
本発明のまた別の態様は、配列表の配列番号２０～５９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドコードする核酸断片で構成されることを特徴とする、連結核酸断片ライブラリである。
また、本発明のさらにまた別の態様は、配列表の配列番号15で表されるヌクレオチド配列を有する核酸断片で構成される連結核酸断片ライブラリである。ここで、配列番号15中のr, b, d, v, k, s, h及びsは、上記と同様である。
本発明のまた別の態様は、配列表の配列番号２０～５９で表されるアミノ酸配列を有するペプチドコードする核酸断片で構成されることを特徴とする、連結核酸断片ライブラリである。
【発明の効果】
【0019】
本発明によれば、連結核酸断片を効率よく且つ精度よく得られる連結核酸断片の製造方法を提供すること、及び、効率よく得られ且つ精度の高い連結核酸断片並びにこれらの連結核酸断片から構成されるライブラリを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【発明を実施するための形態】
【0026】
以下に、本発明に係る連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片及びこれらの連結核酸断片から構成されるライブラリの態様を図１～25を参照しつつ説明する。
【0027】
１．連結核酸断片の製造方法
本実施形態の連結核酸断片の製造方法は、(a1) 複数の核酸断片を複製する複製工程と；(a2) 突出末端を形成する突出末端形成工程と；(a3) 連結核酸断片を製造する連結工程とを含む。ここで、前記(a1)の複製工程では、特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸と、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことにより、前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製する。次いで、前記(a2)の前記突出末端形成工程で、前記核酸断片の端部において、イノシンを認識して特定位置にあるホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、異なる塩基数の突出末端を形成する。その後、(a3)前記一致する塩基数の突出末端同士を酵素でホスホジエステル結合によって連結し、連結核酸断片を製造する。
本実施形態の連結核酸断片の製造方法の概略を図１に示す。
本実施形態の連結核酸断片の製造方法は、(a1) 複数の核酸断片を複製する複製工程と；(a2) 突出末端を形成する突出末端形成工程と；(a3) 連結核酸断片を製造する連結工程とを含む。ここで、前記(a1)の複製工程では、特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸と、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーとを用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行うことにより、前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製する。次いで、前記(a2)の前記突出末端形成工程で、前記核酸断片の端部において、イノシンを認識して特定位置にあるホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、異なる塩基数の突出末端を形成する。その後、(a3)前記一致する塩基数の突出末端同士を酵素でホスホジエステル結合によって連結し、連結核酸断片を製造する。
本実施形態の連結核酸断片の製造方法の概略を図１に示す。
【0028】
（１）複製工程
（１－１）鋳型核酸
本実施形態で用いられる特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸は、特に限定されるものではない。例えば、化学的に合成された非天然由来のもの、天然由来のもの、非天然由来又は天然由来の核酸に変異をランダムに導入したもの、等が挙げられる。
（１－１）鋳型核酸
本実施形態で用いられる特定の遺伝子配列領域を含む鋳型核酸は、特に限定されるものではない。例えば、化学的に合成された非天然由来のもの、天然由来のもの、非天然由来又は天然由来の核酸に変異をランダムに導入したもの、等が挙げられる。
【0029】
本実施態様の鋳型核酸は、抗体をコードするDNAであってもよい。さらに、前記抗体は、図２に示すVHH抗体（Variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody）であってもよい。ここで、VHH抗体とは、フタコブラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ等のラクダ科動物の血液中に存在する軽鎖を持たない特殊な抗体であって、次世代抗体として注目されている。そして、VHH抗体のDNAライブラリは産業上有用性が高いと言われている。
【0030】
ラクダ科動物由来の重鎖抗体は、従来から知られている抗体の一種免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略す）と同じくＹ字構造をとっているが、図２に示ようにＩｇＧと異なって、軽鎖が存在せず重鎖のみで構成されている。また、IgGはＹ字構造の二股に分かれているＶ字型の先端２ヶ所で分子認識を行うが、この重鎖抗体は２つの単一重鎖のループ構造の可変領域でもそれぞれ分子認識を行う。
【0031】
このVHHは３つのCDR（相補性決定領域：Complementarity-Determining Region）と呼ばれる可変領域とそれ以外のフレームワークとから成り、様々な変異体が存在するが、基本的には同様の領域を含む構成となっている。CDR1とCDR2との鎖長は8 a.a. （8アミノ酸）程度であるのに対し、CDR3は７～20a.a.程度と比較的長い。
VHHはＩｇＧの分子認識部位であるscFv(Single-ChainVariable Fragment)と比較すると分子量が小さく、熱変性後のリフォールディング効率が高く、さらに、化学修飾が容易であるといった特徴がある。このため、抗体や低分子化抗体のような可変領域を複数有する分子認識スキャフォールドとして使用できる分子として、近年注目されており、医薬品や診断薬等の開発に使用できる分子として有望視されている。
VHHはＩｇＧの分子認識部位であるscFv(Single-ChainVariable Fragment)と比較すると分子量が小さく、熱変性後のリフォールディング効率が高く、さらに、化学修飾が容易であるといった特徴がある。このため、抗体や低分子化抗体のような可変領域を複数有する分子認識スキャフォールドとして使用できる分子として、近年注目されており、医薬品や診断薬等の開発に使用できる分子として有望視されている。
【0032】
一方で、VHHは、従来の抗体がもっている重鎖軽鎖界面が欠如しているため、糖鎖のような低分子、特に、MW＜1,500 Daのような低分子に対する分子認識が弱いという傾向がある。VHHが分子を認識する場合、３つのCDRで形成されるタンパク質が３本の指で目的とする分子をつまむような立体配置をとって、この分子を認識し捕捉する。しかし、CDR同士の長さが相違するために、低分子化合物を補足することが難しく、その結果、分子認識力が低下するからである。
【0033】
こうしたVHHの弱点を改良するために、本実施形態の鋳型核酸として、例えば、上述したVHHの３つのCDRを最も長いCDR3の長さとほぼ等しくなるように、CDR1及び２の長さを延長し、小さい分子に対する認識能力を向上させたDNA断片を使用することが挙げられる。例えば、天然には存在しない、等しい長さのCDR1＝CDR2＝CDR3＝16a.aを有したDNA断片を、鋳型核酸として使用することができる。このような長さの揃った３つのCDRを含むようにすることで、低分子化合物の認識力を委改善することができるからである。
【0034】
（１-２）イノシンを含むプライマーの設計
本実施形態の複製工程では、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。本実施例では、イノシンを含むプライマーを設計し、そのプライマーを用いてイノシンを含むDNA断片を４種類作製する。
本実施形態の複製工程では、任意の位置にイノシンが導入されたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う。本実施例では、イノシンを含むプライマーを設計し、そのプライマーを用いてイノシンを含むDNA断片を４種類作製する。
【0035】
プライマーの設計にあたっては以下の点を考慮する必要がある。
（ｉ）PCRの際、プライマーにイノシンが挿入されると、その相補の位置に出現する塩基は、ほとんどの場合シトシン（配列表記はＣ）になる（Ｃ＞Ａ＝Ｔ＞＞＞Ｇ）。
（ｉｉ）突出末端形成工程において使用可能な核酸分解酵素の切断位置を考慮する。
例えば、核酸分解酵素として使用可能なEndonuclease Vの切断箇所は図３に示すようにイノシンの３’側にある２番目、及び３番目のホスホジエステル結合をそれぞれ９５％、５％の効率で切断する。
（ｉ）PCRの際、プライマーにイノシンが挿入されると、その相補の位置に出現する塩基は、ほとんどの場合シトシン（配列表記はＣ）になる（Ｃ＞Ａ＝Ｔ＞＞＞Ｇ）。
（ｉｉ）突出末端形成工程において使用可能な核酸分解酵素の切断位置を考慮する。
例えば、核酸分解酵素として使用可能なEndonuclease Vの切断箇所は図３に示すようにイノシンの３’側にある２番目、及び３番目のホスホジエステル結合をそれぞれ９５％、５％の効率で切断する。
【0036】
以上の点を考慮して翻訳の際に正確にアミノ酸を再現できるように、イノシンを適当な位置に挿入する。具体的には、本実施形態では、プライマー設計工程において、イノシンの導入位置が、アミノ酸に対応するトリプレット配列の第三塩基にあたる位置であって、前記トリプレット配列は第三塩基が変化しても同一のアミノ酸に対応しているトリプレット配列であるように前記プライマーを設計することが好ましい。なお、本実施形態において、トリプレット配列の第一塩基、第二塩基、第三塩基とは、トリプレットの５’末端側から数えてそれぞれ一番目、二番目、三番目に位置する塩基を指す。
【0037】
図４にはトリプレットの第三塩基が他の塩基に置換されても、翻訳されたアミノ酸が変わらないアミノ酸をコードするトリプレットを示す（図中の枠でかこまれたアミノ酸）。例えば、ＡＣＸのトリプレットで表されるアミノ酸は、Ｘ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔのどれであってもスレオニンである。よって、翻訳された際にスレオニンをコードするプライマーのトリプレットの第三塩基の位置にイノシンを挿入することが好ましい。このような位置にイノシンが導入されたプライマーを設計することで、読み枠のずれが起こらないため、得られた連結核酸断片から正確にアミノ酸を発現させることができる。
【0038】
プライマーの設計又は鋳型核酸の作製時に、特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域にランダム変異が挿入されたランダム領域を含むようにすることもできる。
ここで、ランダム領域において出現するアミノ酸の比率は任意に設定でき、例えば、すべてのアミノ酸が出現するように設定することができる。また、システインの出現比率を低くすることもできる。システインの出現頻度が高い場合、分子内あるいは分子間でジスルフィド結合を形成してしまうため、VHHの立体構造に影響を及ぼす可能性があり、こうした立体構造の形成は得られるタンパク質の機能の低下にも直結する。こうしたことを抑制するためにシステインの出現比率を低くすることが有効だからある。さらに、ランダム領域の多様性を確保するため、終止コドンの出現比率を低くすることが好ましい。
ここで、ランダム領域において出現するアミノ酸の比率は任意に設定でき、例えば、すべてのアミノ酸が出現するように設定することができる。また、システインの出現比率を低くすることもできる。システインの出現頻度が高い場合、分子内あるいは分子間でジスルフィド結合を形成してしまうため、VHHの立体構造に影響を及ぼす可能性があり、こうした立体構造の形成は得られるタンパク質の機能の低下にも直結する。こうしたことを抑制するためにシステインの出現比率を低くすることが有効だからある。さらに、ランダム領域の多様性を確保するため、終止コドンの出現比率を低くすることが好ましい。
【0039】
PCRで複製する鋳型核酸が例えば上述のようなVHH抗体をコードするＣＲＤ１～３を有するDNAである場合には、図１に示すように、CDR1及び２を含む断片、CDR3を含む断片、及び両端の断片、すなわち４種類の断片が形成されるように複製するプライマーを設計することが好ましい。
【0040】
４種類の断片を複製するためのプライマーを設計するには、各断片の末端において、後述する突出末端形成工程で異なる塩基数が突出するような突出末端を形成可能なプライマーを各断片用にそれぞれ設計することが好ましい。このような突出末端を形成することによって、断片同士を突出末端で連結させる際に、つなぎ間違いが起こる蓋然性を低下させることができるからである。
【0041】
異なる塩基数の突出末端は以下のように定義される。４種類の核酸断片（第1断片から第4断片）を作製する場合を例に挙げると、連結する突出末端が３種類存在することになるが（第一断片－第二断片間、第二断片－第三断片間、第三断片－第四断片間を連結する突出末端）、こうした３カ所の切断位置の突出末端の塩基数がそれぞれ異なっていることを意味する。なお、連結するそれぞれの突出末端と対となる突出末端の塩基数とは、一致している必要がある。
【0042】
このように各断片の突出末端の塩基数がそれぞれ異なる塩基数となるようにプライマーを設計するためには、上述のような点に留意してイノシンの導入箇所を調節することが好ましい。本実施形態では、後述する突出末端形成工程において、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いるため、イノシンの導入位置を調整することで任意の位置で塩基配列を切断できる。従って、異なる突出末端の塩基数となるように、各断片の切断位置を特定したプライマーを設計することができる。
【0043】
この異なる突出末端の塩基数は、例えば、６塩基以上１２塩基以下であって、異なる塩基数が突出する突出末端の塩基数の差が３塩基以上であるように、プライマーの設計をすることが好ましい。特に、９塩基及び１２塩基という異なる塩基数の突出末端は、天然の制限酵素では形成されない突出末端における塩基数を含むため、連結する際により精度よく連結しやすくなる。そして、突出末端の塩基数の差は３塩基以上であることが好ましいため、CDR1～CDR3を別々の断片に含める場合には、６塩基、９塩基及び12塩基という３種類の異なる塩基数の突出末端を有する断片とすることが好ましい。
【0044】
（１－３）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR反応）
前記のようなプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製することができる。
PCRは、例えば、後述する実施例に示す他、任意の条件、試薬、装置を用いて常法にて行うことができる。
前記のようなプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、前記特定の遺伝子配列領域に対応する配列領域を含む複数の核酸断片を複製することができる。
PCRは、例えば、後述する実施例に示す他、任意の条件、試薬、装置を用いて常法にて行うことができる。
【0045】
本実施形態では、PCR反応にイノシンを含むプライマーを用いるため、PCRによる増幅率が非常に低くなるか、又は増幅しないおそれがある。そこで、イノシンを確実に認識でき、効率よく正確な増幅が可能なDNA複製酵素（DNAポリメラーゼ）を選択して使用することが好ましい。
【0046】
通常、PCRに用いられるDNAポリメラーゼは一般的な４種の核酸塩基アデニン、チミン、グアニン、シトシン（配列中の表記は、各々、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃである。）を認識し、DNA鎖を増幅させるが、配列中にイノシンのような“特殊”塩基を含むプライマーを用いた場合、PCRによる増幅率は非常に低くなったり、増幅されないことがある。そこで、複製忠実度（fidelity）を維持するために、イノシンを認識でき、かつ効率よく正確な増幅が可能なDNAポリメラーゼを用いることが好ましい。
【0047】
こうしたDNAポリメラーゼとしては、例えば、KOD-Multi&Epi-（TOYOBO社製）等のKOD DNAポリメラーゼその他のポリメラーゼを挙げることができ、KOD DNAポリメラーゼを使用することが耐熱性が高いことから好ましい。
【0048】
（２）突出末端形成工程
この工程では、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、前記のような複製された核酸断片の少なくとも一方の端部に、それぞれ異なる塩基数の突出末端を形成する。
この工程では、イノシンを認識して特定位置のホスホジエステル結合を分解する酵素を用いて、前記のような複製された核酸断片の少なくとも一方の端部に、それぞれ異なる塩基数の突出末端を形成する。
【0049】
イノシンを認識して特定位置にあるホスホジエステル結合を分解する酵素としては、例えば、Endonuclease Vその他のエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【0050】
突出末端形成工程では、例えば、後述する実施例に示す他の任意の条件で、前記PCR反応により得られたDNA断片にEndonuclease Vを加え、所定の温度で（例えば、３７℃）、所定の時間（例えば、１時間）静置しイノシンを含むDNA断片を切断するようにすることができる。
【0051】
前記突出末端形成工程では、上述のようなプライマーを用いて断片が複製されているため任意の位置で自由に突出末端を形成することができる。例えば、上述したPCR反応で４種類の核酸断片（第1断片から第4断片）が得られた場合には、各断片を連結する突出末端が３種類存在し、且つ、かかる３カ所の突出末端の塩基数がそれぞれ異なっているような突出末端を形成されることが好ましい。
【0052】
一般的に使用される制限酵素では、特定の塩基配列が存在すると、その位置で塩基配列を切断する。このため、例えば、ランダム領域にそのような塩基配列が存在すると、そこで塩基配列が切断されてしまうため、目的の塩基配列領域を含む断片が得られない。これに対し、Endonuclease Vはイノシンを認識して、イノシンから特定の数離れた位置で特定の塩基間の結合を切断するため、イノシンを導入していない箇所で塩基間の結合が切断されることがない。このため、本実施形態の突出末端形成工程では、イノシンを組み込む位置を目的とするランダム領域以外とすることによって、目的の塩基配列の領域で切断が起こることがなく、効率よく、且つ精度よく目的の断片が得られる。
【0053】
（３）連結工程
前記連結工程では、前記突出末端に形成された、一致する塩基数の突出末端同士をホスホジエステル結合で連結する酵素を用いて、核酸断片同士を間違いなく連結して、複数の連結核酸断片を製造する。
前記連結工程では、前記突出末端に形成された、一致する塩基数の突出末端同士をホスホジエステル結合で連結する酵素を用いて、核酸断片同士を間違いなく連結して、複数の連結核酸断片を製造する。
【0054】
こうした一致する塩基数の突出末端同士を連結する酵素としては、Taq DNAリガーゼその他のリガーゼを挙げることができ、Taq DNAリガーゼを使用することが好ましい。Taq DNAリガーゼは、相補となる２つの隣接するDNAの５’末端のリン酸基と３’末端のヒドロキシル基とのホスホジエステル結合を触媒する酵素であり、塩基配列が完全に対となっており、ギャップがない場合にのみ、すなわち、完全に相補な配列である場合にのみ連結反応を起こす。よって、より正確に突出末端を連結することができるからである。
【0055】
例えば、上述したように、６塩基、９塩基及び１２塩基という３種類の異なる塩基数の突出末端が形成された断片を連結する場合には、天然の制限酵素では形成されない突出末端が形成されており、それらが上記の連結反応を条件を満たすために、高い精度で連結をすることが可能となる。
【0056】
すなわち、前記連結工程においては、異なる塩基数で構成された突出末端を有する断片を混合しても、断片同士を連結する際につなぎ間違いが起こる確率は極めて低い。このため、例えば、４種類の核酸断片を一度に連結することが可能となる。
これによって、すべての各断片を混合して、前記酵素と混合して連結反応を行うことで、一度の連結反応で連結核酸断片を得ることができる。
これによって、すべての各断片を混合して、前記酵素と混合して連結反応を行うことで、一度の連結反応で連結核酸断片を得ることができる。
【0057】
２．連結核酸断片から構成された核酸ライブラリ
以上のようにして得られた連結核酸断片を用いてDNAライブラリを構成することができる。
本実施形態の連結核酸断片として、例えば、上述したようにVHH抗体のCDR1、CDR2及びCDR3にランダム変異を導入して、天然には存在しない等しい長さのCDR1～CDR3を有するものを用いた場合を例に挙げて、以下に説明する。
このような連結核酸断片から非天然型VHH DNAライブラリを構築することにより、天然には存在しない、低分子に対しても高い認識能力を有する新規抗体を得ることができるようになる。
以上のようにして得られた連結核酸断片を用いてDNAライブラリを構成することができる。
本実施形態の連結核酸断片として、例えば、上述したようにVHH抗体のCDR1、CDR2及びCDR3にランダム変異を導入して、天然には存在しない等しい長さのCDR1～CDR3を有するものを用いた場合を例に挙げて、以下に説明する。
このような連結核酸断片から非天然型VHH DNAライブラリを構築することにより、天然には存在しない、低分子に対しても高い認識能力を有する新規抗体を得ることができるようになる。
【0058】
得られた連結核酸断片をダイレクトシーケンシングで解析し、変異の有無を確認することで、より精度良く、且つ、多様性が維持された制限酵素非依存DNAライブラリを構築することができる。
【0059】
本実施形態の連結核酸断片からなるライブラリは、例えばディスプレイ技術に応用することもできる。こうしたディスプレイとしては、細胞表層ディスプレイ、ファージディスプレイ等の細胞要求性ディスプレイや、リボソームディスプレイ、mRNAディスプレイ、cDNAディスプレイ等の細胞非要求性ディスプレイが知られている。
中でも、目的ペプチドである新規VHH抗体を効率的に取得するためには、cDNAディスプレイ技術の適用が好ましい。すなわち、cDNAディスプレイ技術によって、本実施形態のライブラリから特定のVHH抗体の遺伝子をスクリーニングし、得られたVHH抗体の遺伝子を元に効率よく大量のVHH抗体を生産させることができる。
中でも、目的ペプチドである新規VHH抗体を効率的に取得するためには、cDNAディスプレイ技術の適用が好ましい。すなわち、cDNAディスプレイ技術によって、本実施形態のライブラリから特定のVHH抗体の遺伝子をスクリーニングし、得られたVHH抗体の遺伝子を元に効率よく大量のVHH抗体を生産させることができる。
【0060】
cDNAディスプレイにおける前記ライブラリの利用としては、例えば以下のような方法が挙げられる。
まず、連結核酸断片からなるライブラリから所望の配列を有するmRNAを得て、このmRNAとリンカーとを結合させたmRNA－リンカーを得る。次いで、mRNA－リンカーを無細胞翻訳して、mRNA－変異導入抗体を得る。その後、mRNA－変異導入抗体をビーズ等の固相に固定させて固相結合mRNA－変異導入抗体を得る。引き続き、固相結合mRNA－変異導入抗体を逆転写して、mRNA－リンカー－cDNA－変異導入抗体結合体を得て、固相から遊離させたcDNAディスプレイを得る。
まず、連結核酸断片からなるライブラリから所望の配列を有するmRNAを得て、このmRNAとリンカーとを結合させたmRNA－リンカーを得る。次いで、mRNA－リンカーを無細胞翻訳して、mRNA－変異導入抗体を得る。その後、mRNA－変異導入抗体をビーズ等の固相に固定させて固相結合mRNA－変異導入抗体を得る。引き続き、固相結合mRNA－変異導入抗体を逆転写して、mRNA－リンカー－cDNA－変異導入抗体結合体を得て、固相から遊離させたcDNAディスプレイを得る。
【0061】
そして、cDNAディスプレイから、抗体コード領域のＣ末端側の融合タンパク質による親和性セレクションにより、変異導入抗体をコードするDNAをセレクションし、セレクションされた変異導入抗体をコードするDNAをPCRで増幅させる。
このように、ディスプレイされたcDNA又はペプチドを生成して配列を特定するという淘汰プロセスを繰り返すことによって、cDNAライブラリ又はペプチドライブラリを構築することができる
このように、ディスプレイされたcDNA又はペプチドを生成して配列を特定するという淘汰プロセスを繰り返すことによって、cDNAライブラリ又はペプチドライブラリを構築することができる
【0062】
本実施形態にかかる連結核酸断片の製造方法、連結核酸断片、及び連結核酸断片から構成される核酸ライブラリは、以上のとおりであるが、今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は前記説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【実施例】
【0063】
次に、本発明の実施例について説明する。尚、本発明は下記の実施例に限定して解釈されるものではない。
【0064】
（実施例１）
１．制限酵素非依存性VHH DNA断片の作製
本実施例では制限酵素非依存のVHH DNA断片を作製した。
１．制限酵素非依存性VHH DNA断片の作製
本実施例では制限酵素非依存のVHH DNA断片を作製した。
【0065】
（１）鋳型DNA
埼玉大学根本研究室所有の非天然VHHクローンDNA（541 bp）にFlag-tag配列を挿入して、鋳型VHH DNA（574 bp）の作製を行った。これは、後述するVHH DNAを４種類のDNA断片に分割をする際、4th DNA断片の鎖長が100 bpに満たないとPCR Clean UP Mini Kit（Favorgen社製）での反応を行うことができないためである。従って、4th DNA断片の鎖長を伸ばすため、抗体を精製するときなどに一般的に用いられているFlag-tag配列を導入した。鋳型作製のPCR反応組成を表１に示す。
埼玉大学根本研究室所有の非天然VHHクローンDNA（541 bp）にFlag-tag配列を挿入して、鋳型VHH DNA（574 bp）の作製を行った。これは、後述するVHH DNAを４種類のDNA断片に分割をする際、4th DNA断片の鎖長が100 bpに満たないとPCR Clean UP Mini Kit（Favorgen社製）での反応を行うことができないためである。従って、4th DNA断片の鎖長を伸ばすため、抗体を精製するときなどに一般的に用いられているFlag-tag配列を導入した。鋳型作製のPCR反応組成を表１に示す。
【0066】
使用した非天然VHHクローンDNA（541bp）を配列番号１に示した。また、Flag-tag配列を導入するためのプライマーFlag-tag insertion primerを配列番号２に、New Leftを配列番号３に、それぞれ示した。下記の配列番号１中、Nの連続する表記はCDRを表わす。
【0067】
[配列番号１]
GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGAGGAGGA TCCGTGCAGG CTGGAGGAAG CCTGCGCCTG AGCTGCGCTG CTAGCGGANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNTGGTT CCGCCAGGCT CCTGGAAAGG AGCGCGAGGG AGTGNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNAC CTACTACGCT GACAGCGTGA AGGGACGCTT CACCATCAGC CAGGACAACG CCAAGAACAC CGTGTACCTG CAGATGAACA GCCTGAAGCC TGAGGACACC GCTATCTACT ACTGCGCTGC TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN TACTGGGGAC AGGGAACCCA GGTGACCGTG GGAGGAGGCA GCCATCATCA TCATCATCAC GGCGGAAGCA GGACGGGGGG CGGCGGGGAA A
GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGAGGAGGA TCCGTGCAGG CTGGAGGAAG CCTGCGCCTG AGCTGCGCTG CTAGCGGANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNTGGTT CCGCCAGGCT CCTGGAAAGG AGCGCGAGGG AGTGNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNAC CTACTACGCT GACAGCGTGA AGGGACGCTT CACCATCAGC CAGGACAACG CCAAGAACAC CGTGTACCTG CAGATGAACA GCCTGAAGCC TGAGGACACC GCTATCTACT ACTGCGCTGC TNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN TACTGGGGAC AGGGAACCCA GGTGACCGTG GGAGGAGGCA GCCATCATCA TCATCATCAC GGCGGAAGCA GGACGGGGGG CGGCGGGGAA A
【0068】
[配列番号２]：Flag-tag insertion primer(82 mer)
5’-AAAGGTGCGGCGGGGGGCAGGACGATGGTGGGAACAGTAGCAGTAGGAACATCAGCGAAGGCGGCACTACTACTACTACTAC-3’
5’-AAAGGTGCGGCGGGGGGCAGGACGATGGTGGGAACAGTAGCAGTAGGAACATCAGCGAAGGCGGCACTACTACTACTACTAC-3’
【0069】
[配列番号３]：Newleft(33 mer)
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG
【0070】
【表1】
【0071】
上記配列番号１～３に示すDNA断片を表１に示すような組成のPCR反応液として調整した。PCRプログラムは以下の通りとし、ステップ１～２を25サイクル繰り返した。
１．９８℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ １０秒
４．７２℃ １分
５．７２℃ ２分
６．１０℃
１．９８℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ １０秒
４．７２℃ １分
５．７２℃ ２分
６．１０℃
【0072】
以上のようなPCRプログラムを行うことで、図５及び図６に示すような鋳型VHH DNAを得た。得られた鋳型VHH DNAをゲル電気泳動（200V、50分間）にかけて、VHHクローンDNAのバンドのアップシフトを確認した。なお、マーカーとしては100 bpのDNAラダー（Promega社製）を用い、第一レーンには非天然VHHクローンDNA（541 bp）を、第二レーンにはPCR産物を、それぞれ乗せて泳動した。
【0073】
図７に示すように、PCR産物（第三レーン）は574 bpの位置にバンドを示しており、Flag-tag配列を挿入することができたことが確認できた。これを一度カラム精製し、不要なプライマーを取り除き。その後、全長PCRを行い複製した。ゲル電気泳動は以下の方法で行った。
【0074】
（変性ポリアクリルアミドゲルの作成）
２枚のガラス板（１枚はスペーサー付き）とガスケットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させる。乾燥したら２枚のガラス板の間にガスケットを挟み入れ、左右からクリップで挟み込んで固定する。サンプルをアプライするレーンを作るコームも７０％エタノールで洗浄しておく。
２枚のガラス板（１枚はスペーサー付き）とガスケットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥させる。乾燥したら２枚のガラス板の間にガスケットを挟み入れ、左右からクリップで挟み込んで固定する。サンプルをアプライするレーンを作るコームも７０％エタノールで洗浄しておく。
【0075】
４％アクリルアミドゲル液は、以下のように調整した。4.8gの尿素、1 mLの5XのTBE、1ｍLの40％アクリルアミド溶液を混合して、超純水で10 mLにメスアップした。ここに、25μLのAPS（Ammonium peroxodisulfate:ペルオキソ二硫酸アンモニウム）及び１０μＬのTEMED（N,N,N,N-Tetramethy-ethylenediamine：N,N,N,N－テトラメチルエチルレンジアミン）を加えて、速やかに攪拌し、クリップで固定したガラス板の間に流し入れ、コームを差し込んだ。その後アクリルアミドの重合反応が終わるまで約30分静置した。
【0076】
（電気泳動）
0.5X TBEを電気泳動槽の下層に入れ、60℃の恒温槽で循環する。重合反応が終わったアクリルアミドゲルは左右のクリップとコームを外し、泳動の妨げになるようなアクリルアミドの欠片をスパーテルと水で洗い流した後、電気泳動槽装置にセットする。電気泳動槽の上層にも0.5XのTBEを入れ、９分間のプレランニングを行った。
0.5X TBEを電気泳動槽の下層に入れ、60℃の恒温槽で循環する。重合反応が終わったアクリルアミドゲルは左右のクリップとコームを外し、泳動の妨げになるようなアクリルアミドの欠片をスパーテルと水で洗い流した後、電気泳動槽装置にセットする。電気泳動槽の上層にも0.5XのTBEを入れ、９分間のプレランニングを行った。
【0077】
サンプルには2XのLoading bufferを1Xの濃度になるように混ぜ、85℃で３分間変性させる。その後プレランニングが終わったアクリルアミドゲルのレーンから尿素の沈殿を水流によって飛ばし、サンプルをアプライした。そして200Vの定電圧で任意の時間電気泳動を行った。
【0078】
（イメージャーによる解析）
電気泳動が終了した後、ポリアクリルアミドゲルを装置から取り出し、104倍希釈したSYBR Goldを直接かけることによって核酸を染色する。その後ポリアクリルアミドゲルをガラス板の上に乗せ、イメージャー（Typhoon FLA 9500、GE ヘルスケア・ジャパン社製）で解析した。
電気泳動が終了した後、ポリアクリルアミドゲルを装置から取り出し、104倍希釈したSYBR Goldを直接かけることによって核酸を染色する。その後ポリアクリルアミドゲルをガラス板の上に乗せ、イメージャー（Typhoon FLA 9500、GE ヘルスケア・ジャパン社製）で解析した。
【0079】
（２）プライマー設計
コンスタント配列をもつプライマー（前記配列番号３及び配列番号４）、イノシンを導入したプライマー（配列番号５～10）及びイノシンとランダム領域をもつプライマー（配列番号11～13）を準備した（表２参照）。
コンスタント配列をもつプライマー（前記配列番号３及び配列番号４）、イノシンを導入したプライマー（配列番号５～10）及びイノシンとランダム領域をもつプライマー（配列番号11～13）を準備した（表２参照）。
【0080】
【表2】
【0081】
（３）DNA断片の作製
前記各プライマーを用いてPCRを行うことにより、４種類のDNA断片（1st DNA断片～4th DNA断片）の作製を行った。
前記各プライマーを用いてPCRを行うことにより、４種類のDNA断片（1st DNA断片～4th DNA断片）の作製を行った。
【0082】
（３－１）1st DNA断片
1st DNA断片の作製用のPCR反応液は表３に示すような組成に調整した。PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～３を25サイクル繰り返した。なお、DNAポリメラーゼとしてはKOD-Multi&Epi-を、バッファーとして2X PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-(TOYOBO社製）を用いた。1st DNA断片の作製の概略は図８に示した。
1st DNA断片の作製用のPCR反応液は表３に示すような組成に調整した。PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～３を25サイクル繰り返した。なお、DNAポリメラーゼとしてはKOD-Multi&Epi-を、バッファーとして2X PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-(TOYOBO社製）を用いた。1st DNA断片の作製の概略は図８に示した。
【0083】
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６８℃ ５秒
４．６８℃ ２分
５．１０℃
２．９８℃ １０秒
３．６８℃ ５秒
４．６８℃ ２分
５．１０℃
【0084】
【表3】
【0085】
（３－２） 2nd DNA断片
2nd DNA断片の作製用のPCR反応液は表４及び表５に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記の通りとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した。
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６２℃ ５秒
４．６８℃ １０５秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
2nd DNA断片の作製用のPCR反応液は表４及び表５に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記の通りとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した。
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６２℃ ５秒
４．６８℃ １０５秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
【0086】
【表4】
【0087】
【表5】
【0088】
なお、DNAポリメラーゼとしてはKOD-Multi&Epi-を、バッファーとして2X PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-(TOYOBO社製）を用いた。2nd DNA断片の作製の概略は図９に示した。
【0089】
（３－３）3rd DNA断片
3rd DNA断片の作製用のPCR反応液は表６に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記のとおりとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６０℃ ５秒
４．６８℃ １０秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
3rd DNA断片の作製用のPCR反応液は表６に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記のとおりとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６０℃ ５秒
４．６８℃ １０秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
【0090】
【表6】
【0091】
なお、DNAポリメラーゼとしてKOD-Multi&Epi-を、バッファーとして2X PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-(TOYOBO社製）をそれぞれ用いた。3rd DNA断片の作製の概略は図10に示した。
【0092】
（３－４） ４th DNA断片
４th DNA断片の作製用のPCR反応液は表７に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記のとおりとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した。
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ ５秒
４．６８℃ １０秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
４th DNA断片の作製用のPCR反応液は表７に示すような組成に調整した。PCRプログラムはそれぞれ下記のとおりとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した。
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ ５秒
４．６８℃ １０秒
５．６８℃ ２分
６．１０℃
【0093】
【表7】
【0094】
尚、DNAポリメラーゼとしては、KOD-Multi&Epi-及び2X PCR Buffer for KOD -Multi & Epi-(TOYOBO社製）を用いた。4th DNA断片の作製の概略は図11に示した。
【0095】
得られた各DNA断片を上記と同様の方法でゲル電気泳動（200V、20分間）にかけて、各断片のバンドのアップシフトを確認した。なお、マーカーとしては100 bpのDNAラダー（プロメガ社製）を用い、第1レーン～第4レーンにはそれぞれ1st～4th DNA断片を用いたときのPCR産物を流した。
図12に示すように、それぞれ目的のDNA断片の合成に成功したことを確認した。これらのDNA断片を500μLスケール（50μL×10本）に増やしてPCRを行い、さらにエタノール沈殿、及び上記と同様の方法を用いたカラム精製を行い４種類のDNA断片を得た。
図12に示すように、それぞれ目的のDNA断片の合成に成功したことを確認した。これらのDNA断片を500μLスケール（50μL×10本）に増やしてPCRを行い、さらにエタノール沈殿、及び上記と同様の方法を用いたカラム精製を行い４種類のDNA断片を得た。
【0096】
（４）Endonuclease Vによる突出末端の形成
PCRにより得られた４種類のDNA断片にEndonuclease V（NEB社製）及び10X NE Buffer 4（NEB社製）を加えた表８及び９に示す反応組成液を用い、37℃にて１時間静置しイノシンを含むDNA断片の切断を行った。なお、2nd DNA断片と3rd DNA断片とは、それぞれの配列中にイノシンを２つ含む設計になっているため、表８の反応組成におけるEndonuclease Vのユニット数（酵素量）を倍量にして反応を行った。
PCRにより得られた４種類のDNA断片にEndonuclease V（NEB社製）及び10X NE Buffer 4（NEB社製）を加えた表８及び９に示す反応組成液を用い、37℃にて１時間静置しイノシンを含むDNA断片の切断を行った。なお、2nd DNA断片と3rd DNA断片とは、それぞれの配列中にイノシンを２つ含む設計になっているため、表８の反応組成におけるEndonuclease Vのユニット数（酵素量）を倍量にして反応を行った。
【0097】
その後、8Mの尿素（特級、和光純薬社製）を酵素処理反応液の量の比が９：１になるように加え（終濃度7.2 M）、42℃にて、０分、５分、10分、20分、30分間それぞれ静置してDNAを変性させた。PCR Clean UP Mini Kit（Favorgen社製）を用いて切断されたイノシンを含む短いDNA断片を取り除き、突出末端を形成したDNA断片を得た。
【0098】
【表8】
【0099】
【表9】
【0100】
突出末端形成後の各DNA断片を上記と同様の方法でゲル電気泳動（200V、150分間）に供し、各断片のバンドのアップシフトを図13～図16に示した。なお、マーカーとしては100 bpのDNAラダー（プロメガ社製）を用いた。
図13には1st DNA断片、図14は4th DNA断片、図15には2nd DNA断片、図16は3rd DNA断片の電気泳動の結果を示す。また、図17には、突出末端形成前の各DNA断片及び突出末端形成後の各DNA断片を電気泳動にかけた各断片のバンドのアップシフトを示した。
図13には1st DNA断片、図14は4th DNA断片、図15には2nd DNA断片、図16は3rd DNA断片の電気泳動の結果を示す。また、図17には、突出末端形成前の各DNA断片及び突出末端形成後の各DNA断片を電気泳動にかけた各断片のバンドのアップシフトを示した。
【0101】
図13～16に示すように、各断片はEndonuclease Vによってイノシンを含む短いDNA断片が切断されていることが確認できた。また、図14～17に示す結果から、1st DNA断片には６塩基の突出末端が、2nd DNA断片には６塩基と12塩基の突出末端が、3rd DNA断片には１２塩基と９塩基の突出末端が、4th DNA断片には９塩基の突出末端が形成されていることが確認できた。
すなわち、各断片はイノシン導入プライマーで調整した箇所で切断されていることが確認でき、DNA断片の両端において突出塩基の数を調節できることが確認できた。
すなわち、各断片はイノシン導入プライマーで調整した箇所で切断されていることが確認でき、DNA断片の両端において突出塩基の数を調節できることが確認できた。
【0102】
また、尿素処理については時間条件を５分から30分の間で変化させ、温度条件42℃、8M 尿素（終濃度7.2 M）でのDNAの変性を観察した。図13及び図14に示すように、1st DNA断片と4th DNA断片では、尿素処理の時間で変化は見られなかったが、図15に示すように2nd DNA断片で尿素処理時間が30分では12塩基のDNA断片が除かれることによって、168bpのバンドが濃くなっていた。
このことから、1st DNA断片と4th DNA断片では、変性によって除かれるDNA断片が６塩基、９塩基と比較的短いため尿素を用いて変性させる必要ないこと、及び12塩基のように比較的長い突出末端を作製する場合は、尿素処理を行うことで突出末端を形成したDNAの収率が向上する可能性があることが示唆された。
このことから、1st DNA断片と4th DNA断片では、変性によって除かれるDNA断片が６塩基、９塩基と比較的短いため尿素を用いて変性させる必要ないこと、及び12塩基のように比較的長い突出末端を作製する場合は、尿素処理を行うことで突出末端を形成したDNAの収率が向上する可能性があることが示唆された。
【0103】
（５）連結反応
前記４種類の突出末端を形成したDNA断片を組み合わせ、それぞれTaq DNA リガーゼ及び10 X Taq DNA リガーゼ反応バッファー（NEB社製）を用いて連結反応を行った。
まず、それぞれのDNA断片を混合し、表10に示す反応組成物とし、45℃、30分間静置して連結反応を行った。さらに、４種類の突出末端を形成したDNA断片をまとめて混合し、表１１に示す反応組成物として、45℃、30分間静置し連結反応を行い、非天然型VHH DNAの合成を行った。連結反応の概略は図18に示した。
前記４種類の突出末端を形成したDNA断片を組み合わせ、それぞれTaq DNA リガーゼ及び10 X Taq DNA リガーゼ反応バッファー（NEB社製）を用いて連結反応を行った。
まず、それぞれのDNA断片を混合し、表10に示す反応組成物とし、45℃、30分間静置して連結反応を行った。さらに、４種類の突出末端を形成したDNA断片をまとめて混合し、表１１に示す反応組成物として、45℃、30分間静置し連結反応を行い、非天然型VHH DNAの合成を行った。連結反応の概略は図18に示した。
【0104】
【表10】
【0105】
【表11】
【0106】
各連結反応を行った連結DNA断片を電気泳動にかけて、各断片のバンドのアップシフトを確認した。図19には、突出末端形成前の各DNA断片及び以下の組み合わせで連結反応を行った結果物の電気泳動結果を示す。なお、マーカーとしては100 bpのDNAラダー（プロメガ社製）を用い、第一レーン～第四レーンには突出末端形成前の各DNA断片、第五レーンから第十レーンには上記ａ～ｆの組み合わせで連結反応を行った結果物を載せて泳動した。
【0107】
ａ：突出末端形成を行った1st DNA断片と2nd DNA断片の組み合わせ、
ｂ：突出末端形成を行った2nd DNA断片と3rd DNA断片との組み合わせ、
ｃ：突出末端形成を行った3rd DNA断片と4th DNA断片との組み合わせ、
ｄ：突出末端形成を行った1st DNA断片と3rd DNA断片の組み合わせ、
ｅ：突出末端形成を行った1st DNA断片と4th DNA断片の組み合わせ、
ｆ：突出末端形成を行った2nd DNA断片と4th DNA断片の組み合わせ
ｂ：突出末端形成を行った2nd DNA断片と3rd DNA断片との組み合わせ、
ｃ：突出末端形成を行った3rd DNA断片と4th DNA断片との組み合わせ、
ｄ：突出末端形成を行った1st DNA断片と3rd DNA断片の組み合わせ、
ｅ：突出末端形成を行った1st DNA断片と4th DNA断片の組み合わせ、
ｆ：突出末端形成を行った2nd DNA断片と4th DNA断片の組み合わせ
【0108】
図20に示す結果から、突出塩基数が一致する組み合わせ（ａ，ｂ，ｃ）でのみ連結反応が行われることが確認できた。このことから、制限酵素と比較して特異性の高い連結反応を行えると考えられる。
【0109】
また、図20には、すべての突出末端形成後のDNA断片を混合して連結反応を行った結果物の反応時間を30分から120分の間で検討したもの、前記全ての連結反応物をPCRによって増幅させた産物（５サイクル、８サイクル）の電気泳動結果を示す。なお、マーカーとしては100 bpのDNAラダー（プロメガ社製）を用いた。
【0110】
図21に示す結果から、連結反応を行ったDNA断片混合液の原液では電気泳動に連結反応の結果物の存在は確認できなかったが、混合液を用いて全長PCRをしたところ８サイクルの複製によって連結反応結果物が確認できた。すなわち、４種類のDNA断片を一度に連結させることで長鎖DNAの合成に成ができたことが確認できた。尚、バンド強度比から、長鎖DNAの連結効率は5.9％だった。
【0111】
（６）シーケンス解析
全長連結反応を行い、合成されたVHH DNAを全長PCRして得られたPCR産物をダイレクトシーケンシングで解析を行った。下記の７項目を確認した。
ａ：連結反応を行ったDNAのＡテーリング
ｂ：DNAのベクターへの挿入
ｃ：ベクターの大腸菌への形質転換
ｄ：プレート培養
ｅ：コロニーPCRによる確認
ｆ：液体培養と精製
ｇ：解析
全長連結反応を行い、合成されたVHH DNAを全長PCRして得られたPCR産物をダイレクトシーケンシングで解析を行った。下記の７項目を確認した。
ａ：連結反応を行ったDNAのＡテーリング
ｂ：DNAのベクターへの挿入
ｃ：ベクターの大腸菌への形質転換
ｄ：プレート培養
ｅ：コロニーPCRによる確認
ｆ：液体培養と精製
ｇ：解析
【0112】
以下にそれぞれの方法を詳しく記述する。
ａ：連結反応を行ったDNAのＡテーリング
連結反応を行ったDNAのＡテーリングは、Ex TaqでPCRを行うことによって、３’末端にＡを１塩基付加した。これにより、pGEM-T Easy Vector等の３’末端にＴを１塩基付加してあるベクターへの挿入が可能となる。反応組成及び反応条件は以下に示す。
ａ：連結反応を行ったDNAのＡテーリング
連結反応を行ったDNAのＡテーリングは、Ex TaqでPCRを行うことによって、３’末端にＡを１塩基付加した。これにより、pGEM-T Easy Vector等の３’末端にＴを１塩基付加してあるベクターへの挿入が可能となる。反応組成及び反応条件は以下に示す。
【0113】
PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～３を25サイクル繰り返した。
１．９８℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ ５秒
４．７２℃ １分
５．７２℃ ２分
６．１０℃
１．９８℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．６６℃ ５秒
４．７２℃ １分
５．７２℃ ２分
６．１０℃
【0114】
【表12】
【0115】
b:DNAのベクターへの挿入
連結反応を行ったDNAをベクターに挿入するために、pGEM-T Easy Vector system（pGEM-T Easy Vector、T4 DNA リガーゼ、2X Rapid Ligation Buffer、T4 DNA:Promega社製）を用いた。
まずpGEM-T Easy Vectorの入ったチューブを遠心し、ベクターをチューブの底に集めた。次に表13に示す反応溶液を調整した。最後にこの反応溶液をピペッティングで攪拌し、室温で１時間インキュベートした。
連結反応を行ったDNAをベクターに挿入するために、pGEM-T Easy Vector system（pGEM-T Easy Vector、T4 DNA リガーゼ、2X Rapid Ligation Buffer、T4 DNA:Promega社製）を用いた。
まずpGEM-T Easy Vectorの入ったチューブを遠心し、ベクターをチューブの底に集めた。次に表13に示す反応溶液を調整した。最後にこの反応溶液をピペッティングで攪拌し、室温で１時間インキュベートした。
【0116】
【表13】
【0117】
c:ベクターの大腸菌への形質転換
DNAを挿入したベクターをコンピテントセルDH5αに取り込ませた。まず、インキュベートが終わった反応溶液を遠心し、ベクターをチューブの底に集めた。次にこの反応溶液２μＬを氷上に置いたチューブに入れ、氷上で融解したコンピテントセルDH5αを50μＬ加えて混合した。この混合溶液を軽く攪拌した後、氷上に20分間静置した。20分後、そのチューブを42℃の恒温プレートに45秒間置き、コンピテントセルにヒートショックを与え、その後、速やかに氷上に戻して２分間静置した。２分後、室温のSOC培地を950μＬ加えて混合し、振とうさせながら37℃で1.5時間インキュベートした。
DNAを挿入したベクターをコンピテントセルDH5αに取り込ませた。まず、インキュベートが終わった反応溶液を遠心し、ベクターをチューブの底に集めた。次にこの反応溶液２μＬを氷上に置いたチューブに入れ、氷上で融解したコンピテントセルDH5αを50μＬ加えて混合した。この混合溶液を軽く攪拌した後、氷上に20分間静置した。20分後、そのチューブを42℃の恒温プレートに45秒間置き、コンピテントセルにヒートショックを与え、その後、速やかに氷上に戻して２分間静置した。２分後、室温のSOC培地を950μＬ加えて混合し、振とうさせながら37℃で1.5時間インキュベートした。
【0118】
d:プレート培養
プレート培養では、まず表14に示す組成物のプレート培地を作成した。その後プレートに形質転換済の大腸菌を播種し、37℃で一晩インキュベートした。なお、表中の材料は、Bacto-tryptone（Becton社製）、Bacto-yeast extract（Becton社製）、NaCl（特級、和光純薬社製）、寒天（特級、和光純薬社製）を用いた。
プレート培養では、まず表14に示す組成物のプレート培地を作成した。その後プレートに形質転換済の大腸菌を播種し、37℃で一晩インキュベートした。なお、表中の材料は、Bacto-tryptone（Becton社製）、Bacto-yeast extract（Becton社製）、NaCl（特級、和光純薬社製）、寒天（特級、和光純薬社製）を用いた。
【0119】
【表14】
【0120】
e:コロニーPCRによる確認
コロニーPCRによる確認では、PCRのテンプレートとしてプレート培養で得られたコロニーを入れてPCRを行い、電気泳動に供してコロニーに含まれるベクター中に、目的のDNAが挿入されているか否かを確認した。以下にPCR反応溶液の組成とPCRサイクル条件を示す。
コロニーPCRによる確認では、PCRのテンプレートとしてプレート培養で得られたコロニーを入れてPCRを行い、電気泳動に供してコロニーに含まれるベクター中に、目的のDNAが挿入されているか否かを確認した。以下にPCR反応溶液の組成とPCRサイクル条件を示す。
【0121】
PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～４を25サイクル繰り返した。
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．５５℃ １０秒
４．６８℃ ３６秒
５．６８℃ １分
６．１０℃ 静置
１．９４℃ ２分
２．９８℃ １０秒
３．５５℃ １０秒
４．６８℃ ３６秒
５．６８℃ １分
６．１０℃ 静置
【0122】
【表15】
【0123】
f:液体培養と精製
まず、コロニーPCRによってDNAの挿入が確認された大腸菌を、以下に示す組成の液体培地中で培養した。その後Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen社製）を用いてベクターを精製した。
まず、コロニーPCRによってDNAの挿入が確認された大腸菌を、以下に示す組成の液体培地中で培養した。その後Plasmid DNA Extraction Mini Kit（Favorgen社製）を用いてベクターを精製した。
【0124】
【表16】
【0125】
g:解析
ユーロフィンジェノミクスに指定の組成の溶液を送付することによって配列の解析を依頼した。その結果、配列番号14で示すような全長628bpのDNA配列を読み取れた。
ユーロフィンジェノミクスに指定の組成の溶液を送付することによって配列の解析を依頼した。その結果、配列番号14で示すような全長628bpのDNA配列を読み取れた。
【0126】
[配列番号１４]
GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGAGGAGGA TCCGTGCAGG CTGGAGGAAG CCTGCGCCTG AGCTGCGCTG CTAGCGGANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNTGGT TCCGCCAGGC TCCTGGAAAG GAGCGCGAGG GAGTGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNACCTACT ACGCCGACAG CGTGAAGGGA CGCTTCACCA TCAGCCAGGA CAACGCCAAG AACACCGTGT ACCTGCAGAT GAACAGCCTG AAGCCAGAGG ACACCGCTAT CTACTACTGC GCTGCTNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNTACTGG GGCCAGGGCA CCCAGGTGAC CGTGGGAGGA GGCAGCCATC ATCATCATCA TCACGGCGGA AGCGACTACA AGGATGACGA TGACAAGGGT GGTAGCAGGA CGGGGGGCGG CGTGGAAA
GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGGAAGTAT TTTTACAACA ATTACCAACA ACAACAACAA ACAACAACAA CATTACATTT TACATTCTAC AACTACAAGC CACCATGGGC GAGGTGCAGC TGGTGGAGAG CGGAGGAGGA TCCGTGCAGG CTGGAGGAAG CCTGCGCCTG AGCTGCGCTG CTAGCGGANN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNTGGT TCCGCCAGGC TCCTGGAAAG GAGCGCGAGG GAGTGNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNACCTACT ACGCCGACAG CGTGAAGGGA CGCTTCACCA TCAGCCAGGA CAACGCCAAG AACACCGTGT ACCTGCAGAT GAACAGCCTG AAGCCAGAGG ACACCGCTAT CTACTACTGC GCTGCTNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNTACTGG GGCCAGGGCA CCCAGGTGAC CGTGGGAGGA GGCAGCCATC ATCATCATCA TCACGGCGGA AGCGACTACA AGGATGACGA TGACAAGGGT GGTAGCAGGA CGGGGGGCGG CGTGGAAA
【0127】
正しく読み取ることができた８本のサンプル中、イノシン置換による変異ではない位置に１ヶ所だけ変異が起こっていることが確認された。この変異では、426番目のＣがＴへと変異していたが、この変異によって発現するアミノ酸（プロリン）に変化はなかった。また、イノシンを挿入した位置の相補に現れる塩基はシトシンであるが、発現するアミノ酸はどれも変化しなかった。
以上より、制限酵素非依存DNAライブラリの作製が成功したことを確認できた。
以上より、制限酵素非依存DNAライブラリの作製が成功したことを確認できた。
【0128】
【0129】
（実施例２）
２．cDNAディスプレイによるライブラリの作製及び選別
上記実施例１と同様の方法で得られた制限酵素非依存DNAライブラリからcDNAディスプレイ分子を得てセレクションを行い、さらにライブラリを作製した。
２．cDNAディスプレイによるライブラリの作製及び選別
上記実施例１と同様の方法で得られた制限酵素非依存DNAライブラリからcDNAディスプレイ分子を得てセレクションを行い、さらにライブラリを作製した。
【0130】
（１）cDNAディスプレイ用コンストラクト用断片
上記実施例１と同様の方法で、以下のような配列のVHHのフルコンストラクトDNAを得た。以下の配列中、ｒ、ｂ、ｄ、ｖ、ｋ、ｓ、ｈ及びｓは、それぞれ混合塩基を示す略号である。ｒは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの割合が25％ずつ、ｂはＴ及びＣが50％ずつである。また、ｄは、ＴとＧとが１９％でＣとＡとが２７％、ｖはＴ、Ｃ及びＡが２８％でＧが１６％である。ｋは、Ｔが１３％、Ｃが２０％、Ａが３５％、Ｇが３２％であり、ｈは、ＴとＧとが２４％、Ｃが２２％、Ａが３０％であり、ｓは、Ｔ及びＣｇａ３７％で、Ｇが２６％である。
上記実施例１と同様の方法で、以下のような配列のVHHのフルコンストラクトDNAを得た。以下の配列中、ｒ、ｂ、ｄ、ｖ、ｋ、ｓ、ｈ及びｓは、それぞれ混合塩基を示す略号である。ｒは、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの割合が25％ずつ、ｂはＴ及びＣが50％ずつである。また、ｄは、ＴとＧとが１９％でＣとＡとが２７％、ｖはＴ、Ｃ及びＡが２８％でＧが１６％である。ｋは、Ｔが１３％、Ｃが２０％、Ａが３５％、Ｇが３２％であり、ｈは、ＴとＧとが２４％、Ｃが２２％、Ａが３０％であり、ｓは、Ｔ及びＣｇａ３７％で、Ｇが２６％である。
【0131】
[配列番号１５]
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGATCCGTGCAGGCTGGAGGAAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTGCTAGCGGArbrrbrdvbkhskhskhsdvbrbrrbrTGGTTCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGAGCGCGAGGGAGTGrbrrbrdvbkhskhskhskhsdvbACCTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGACGCTTCACCATCAGCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCGCTGCTdvbdvbkhskhskhskhskhskhskhskhskhskhsdvbTACTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACCGTGGGAGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3’
5’-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAAGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACAACTACAAGCCACCATGGGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGAGGAGGATCCGTGCAGGCTGGAGGAAGCCTGCGCCTGAGCTGCGCTGCTAGCGGArbrrbrdvbkhskhskhsdvbrbrrbrTGGTTCCGCCAGGCTCCTGGAAAGGAGCGCGAGGGAGTGrbrrbrdvbkhskhskhskhsdvbACCTACTACGCTGACAGCGTGAAGGGACGCTTCACCATCAGCCAGGACAACGCCAAGAACACCGTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAAGCCTGAGGACACCGCTATCTACTACTGCGCTGCTdvbdvbkhskhskhskhskhskhskhskhskhskhsdvbTACTGGGGACAGGGAACCCAGGTGACCGTGGGAGGAGGCAGCCATCATCATCATCATCACGGCGGAAGCAGGACGGGGGGCGGCGGGGAAA-3’
【0132】
（２）完全長VHHをコードしたライブラリDNAの選別
挿入、欠損等によるフレームシフト又は終止コドンの出現により不完全なVHHがコードされたDNAを除去するために、得られたVHHをコードしたライブラリを、一旦、cDNAディスプレイ化し、His-tagによる精製を行った。以下に具体的な手順を示す。
挿入、欠損等によるフレームシフト又は終止コドンの出現により不完全なVHHがコードされたDNAを除去するために、得られたVHHをコードしたライブラリを、一旦、cDNAディスプレイ化し、His-tagによる精製を行った。以下に具体的な手順を示す。
【0133】
（２－１） ライブラリDNAの転写
転写は、プロメガのキット（RiboMAX Large Scale RNA Production Systems- T7）に付属のプロトコルに従い、2.34 pmolのｄｓDNAを用いて、２０μＬスケールで転写を行った。３７℃で２時間インキューベションした後、上記キットに付属するDNAse（RQ1 DNAse）をこの系に１μＬ加え、さらに３７℃で１５分インキュベートした。合成されたmRNAは、After Tri-Reagent RNA Clean-Up Kit（Favogen社製）を使用して精製した。
転写は、プロメガのキット（RiboMAX Large Scale RNA Production Systems- T7）に付属のプロトコルに従い、2.34 pmolのｄｓDNAを用いて、２０μＬスケールで転写を行った。３７℃で２時間インキューベションした後、上記キットに付属するDNAse（RQ1 DNAse）をこの系に１μＬ加え、さらに３７℃で１５分インキュベートした。合成されたmRNAは、After Tri-Reagent RNA Clean-Up Kit（Favogen社製）を使用して精製した。
【0134】
以下で使用する短いビオチン－セグメント・ピューロマイシンリンカー（Short Biotin-segment Puromycin (SBP)-linker)の作製に使用する修飾されたオリゴヌクレオチドである、「ピューロマイシンセグメント(PS)」、及び「短いビオチンセグメント(SBS)」は、ジーンワールド社(Tokyo,Japan)より入手した。このPSは、以下の構造を有する。
【0135】
5’-(S)-TC(F)-（(Spc18)x4）-CC-(Puro)-3’
【0136】
ここで、（Ｓ）は5’-チオールモディファイヤーC6を表し、(F)はフルオレセイン-dTを表す。（Puro）はピューロマイシンCPGを表し、（Spc18）はスペーサー・ホスホロアミダイト18を表す。また、上記SBSは以下の構造を有する。
【0137】
[配列番号１６]
5’-CC-(rG)C(T-B)C(rG)ACCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3’
5’-CC-(rG)C(T-B)C(rG)ACCCCGCCGCCCCCCG(T)CCT-3’
【0138】
ここで、（Ｔ）はアミノモディファイヤーＣ６ｄＴを表し、（Ｔ－Ｂ）は、ビオチン－ｄＴを表す。（ｒＧ）はリボＧを表す。ＥＭＣＳは、同仁化学（熊本、日本国）より購入した。プロテインＡのＢドメインは、pEZZ 18 プロテインＡ遺伝子融合ベクター（GEヘルスケア社製）より得た。フォワードプライマーは、Ｔ７プロモーター、タバコモザイクウイルスの「オメガ」５’－未翻訳領域、コザック配列、及びＡＴＧ開始コドンを含んでいた。リバースプライマーは、ヘキサヒスチジンｔａｇ、スペーサー配列（GGGGGAGGCAGC：配列番号１７）、及びピューロマイシンリンカーDNAの３’末端でmRNAとピューロマイシンリンカーDNAとの間にライゲーション可能な相補的配列（AGGACGGGGGGCGGGGAAA：配列番号１８）を含んでいた。Oct-1のPou特異的DNA結合ドメインof Oct-1（PDO）の場合には、鋳型はPDOでＢドメインが置き換えられて生成された。
【0139】
[配列番号１７]
GGGGAGGCAGC
GGGGAGGCAGC
【0140】
[配列番号１８]
AGGACGGGGGGCGGGGAAA
AGGACGGGGGGCGGGGAAA
【0141】
使用の直前に、20 nmolのPS 5’-チオール基を、0.1 ＭのDTTを用いて、50μLの１Ｍのリン酸バッファ（pH 7.0）中で、１時間、室温にて還元し、NAP-5カラム（GEヘルスケア社製）で脱塩した。全量10 nmolのSBS及び２μmolのEMCSを、100μLの0.2 Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（pH 7.0）に加え、この混合物を37℃にて30分間インキュベートし、共沈剤（Quick-precip Plus, Edge BioSystems）を用いてエタノール沈殿させた。その後、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水に溶解させた。還元されたＰＳを、ただちにこの溶液に加え、この混合物を４℃で終夜撹拌した。DTTを終濃度が50 mMとなるように加えて室温で30分間インキュベートし、反応を停止させた。室温でエタノール沈殿を行ない、過剰なPSを除去した。SBA及び未架橋のSBS-EMCS複合体を除去するために、エタノール沈殿物を、DEPC処理水に溶解させ、C18 HPLCを用いて以下の条件で精製した。
【0142】
カラム：AR-300, 4.6 x 250 mm（ナカライテスク社製、日本国）
溶媒Ａ：0.1 M トリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）
溶媒Ｂ：アセトニトリル／水（80:20、v/v）
グラジエントＢ／Ａ：33分以上かけて15～35％
流速：0.5 mL/分
検出： 吸光度254 nm及び490 nm
溶媒Ａ：0.1 M トリエチルアンモニウムアセテート（TEAA）
溶媒Ｂ：アセトニトリル／水（80:20、v/v）
グラジエントＢ／Ａ：33分以上かけて15～35％
流速：0.5 mL/分
検出： 吸光度254 nm及び490 nm
【0143】
吸光度254nmでのピークに対応する画分（490 nmでの単一ピークに対応）を集め、この画分を乾燥させて、ピューロマイシン－リンカーDNAを、DEPC処理水に再懸濁させ、保存した。
【0144】
転写によって得られた200 pmolのmRNAに、220 pmolの上記のSBSピューロマイシンリンカーDNA、20μLの10 ｘT4 RNAリガーゼバッファー（TaKaRa社製）、12μLの0.1％BSAを加え、Nuclease-free water（プロメガ社製）を加えて、合計185μLとなるように調製した。90℃で１分間インキュベートした後に、70℃で１分間インキュベートし、0.04℃／秒のスピードで25℃まで降温させた。５μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（TaKaRa社製）及び10μLのT4RNAリガーゼ（TaKaRa社製）を加え、25℃で１時間インキュベートした。
【0145】
（２－２）翻訳
180 pmolのmRNA－リンカー連結体を、1.5 mLスケールの無細胞翻訳系（Retic Lysate IVTKit、Ambion）で翻訳した。翻訳はmRNA－リンカー連結体を、50μＬずつProtein LoBindチューブ（エッペンドルフ社製）に分注し、30℃で20分間行った。その後、MgCl2及びKClを、それぞれ、終濃度が75 mM及び900 mMとなるように加え、37℃で１時間インキュベートし、翻訳産物であるmRNA－タンパク質連結体を得た。
180 pmolのmRNA－リンカー連結体を、1.5 mLスケールの無細胞翻訳系（Retic Lysate IVTKit、Ambion）で翻訳した。翻訳はmRNA－リンカー連結体を、50μＬずつProtein LoBindチューブ（エッペンドルフ社製）に分注し、30℃で20分間行った。その後、MgCl2及びKClを、それぞれ、終濃度が75 mM及び900 mMとなるように加え、37℃で１時間インキュベートし、翻訳産物であるmRNA－タンパク質連結体を得た。
【0146】
（２－３）逆転写
翻訳産物が入っているチューブを５本分ずつまとめ（400 μL x 6本）、80 μLの0.5 MのEDTA（pH 8.0）、480μＬの2 x 結合バッファ（2 MのNaCl，2 mMのEDTA、0.2％のTween-20を含む20 mMのTris-HCl（ｐＨ7.5））を加えて、４℃で10分間インキュベートすることでmRNA－タンパク質連結体に結合しているリボソームを除去した。１ｘ結合バッファでDynabeads MyOne C1 Streptavidinを予め洗浄した。新しい1.75mLチューブを６本用意し、ここに150μLの洗浄済みのDynabeads MyOne C1 Streptavidin、及び960μL分の上記の翻訳産物（mRNA－タンパク質連結体）を加え、冷却サーモブロックローテーター（日伸理化社製、SNP-24B）を用いて、20℃で15分撹拌した。
翻訳産物が入っているチューブを５本分ずつまとめ（400 μL x 6本）、80 μLの0.5 MのEDTA（pH 8.0）、480μＬの2 x 結合バッファ（2 MのNaCl，2 mMのEDTA、0.2％のTween-20を含む20 mMのTris-HCl（ｐＨ7.5））を加えて、４℃で10分間インキュベートすることでmRNA－タンパク質連結体に結合しているリボソームを除去した。１ｘ結合バッファでDynabeads MyOne C1 Streptavidinを予め洗浄した。新しい1.75mLチューブを６本用意し、ここに150μLの洗浄済みのDynabeads MyOne C1 Streptavidin、及び960μL分の上記の翻訳産物（mRNA－タンパク質連結体）を加え、冷却サーモブロックローテーター（日伸理化社製、SNP-24B）を用いて、20℃で15分撹拌した。
【0147】
この上清を、150μＬのDynabeads MyOne C1 Streptavidinを含む新たな1.75 mLをチューブに移し、同様に撹拌した。さらに同様の操作を、Dynabeads MyOne C1 Streptavidinを含む新たなチューブを用いてもう一度行い、合計３回の操作とした。以上のようにして得られたDynabeads MyOne C1 Streptavidinを、150 μLの１ｘ結合バッファで２回洗浄しつつ、合計６本のチューブに、それぞれ450 μLずつまとめた。逆転写は、ReverTra Ase（東洋紡社製）を用いて、このキットに付属のプロトコルに従い、450 μL分のDynabeadsに対して225 μLのスケールで行った。冷却サーモブロックローテーターを使用して、42℃で40分間撹拌した。
【0148】
（２－４）磁性体ビーズ上からの回収
450μLの1x His-tag結合バッファ（0.5 MのNaCl及び0.05％のTween 20を含む20 mMのリン酸バッファ（pH 7.4））でDynabeadsを洗浄した後に、1,000 UのRNase T1（Ambion）を含む225 μLの1 x His-tag結合バッファを加え、37℃で10分間インキュベートした。上清を回収し、この操作を、もう１回繰り返した。以上の操作を、６本の450 μL分のDynabeadsに対して順番に行うことでmRNA／cDNA－タンパク質を450 μLスケールに回収した。
450μLの1x His-tag結合バッファ（0.5 MのNaCl及び0.05％のTween 20を含む20 mMのリン酸バッファ（pH 7.4））でDynabeadsを洗浄した後に、1,000 UのRNase T1（Ambion）を含む225 μLの1 x His-tag結合バッファを加え、37℃で10分間インキュベートした。上清を回収し、この操作を、もう１回繰り返した。以上の操作を、６本の450 μL分のDynabeadsに対して順番に行うことでmRNA／cDNA－タンパク質を450 μLスケールに回収した。
【0149】
（２－５）His-tagによる精製
His Mag Sepharose Ni（磁性粒子、GE healthcare社製）を、1 x His-tag結合バッファで洗浄した。上記のように回収したmRNA／cDNA－タンパク質サンプルから450 μLを取り、ここに、上記のように洗浄したMag Sepharose Niを50 μL加え、冷却サーモブロックローテーターを使用して、10℃で３時間撹拌し、mRNA／cDNA－タンパク質をMag Sepharose Niに結合させた。この磁性粒子を、100μLの１ｘHis-tag結合バッファで２回洗浄した。その後、溶出バッファ（1MのNaCl、5 mMのEDTA、0.1％のTween-20を含む50 mMのTris-HCl（pH7.4））を25μＬ加え、マイクロチューブミキサー（トミー精工社製、MT-360）を使用して、室温で15分撹拌した。同様の操作を、再度行った。合計50μＬの溶出バッファを、Quick-Precip Plus Solution（Edge Bio）を用いて、エタノール沈殿させた。
His Mag Sepharose Ni（磁性粒子、GE healthcare社製）を、1 x His-tag結合バッファで洗浄した。上記のように回収したmRNA／cDNA－タンパク質サンプルから450 μLを取り、ここに、上記のように洗浄したMag Sepharose Niを50 μL加え、冷却サーモブロックローテーターを使用して、10℃で３時間撹拌し、mRNA／cDNA－タンパク質をMag Sepharose Niに結合させた。この磁性粒子を、100μLの１ｘHis-tag結合バッファで２回洗浄した。その後、溶出バッファ（1MのNaCl、5 mMのEDTA、0.1％のTween-20を含む50 mMのTris-HCl（pH7.4））を25μＬ加え、マイクロチューブミキサー（トミー精工社製、MT-360）を使用して、室温で15分撹拌した。同様の操作を、再度行った。合計50μＬの溶出バッファを、Quick-Precip Plus Solution（Edge Bio）を用いて、エタノール沈殿させた。
【0150】
（２－６）cDNAディスプレイ分子からのフルコンストラクトDNA調製
エタノール沈殿させたcDNAディスプレイ分子を、100μLのPCR反応液（0.2 mMのdNTPs、８μＭのF1、８μＭのNewYtag to HGGS-R（配列：5’‐TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3’：配列番号19）、0.02U/μLのPrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼを含む１ｘPrimeSTARバッファ（Mg2+））に加え、以下のPCRプログラムを行って増幅させた。PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～４を10サイクル行った。
１．９４℃ ２分
２．９４℃ １５秒
３．６８℃ ５秒
４．７２℃ ３５秒
５．７２℃（２分）
エタノール沈殿させたcDNAディスプレイ分子を、100μLのPCR反応液（0.2 mMのdNTPs、８μＭのF1、８μＭのNewYtag to HGGS-R（配列：5’‐TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3’：配列番号19）、0.02U/μLのPrimeSTAR HS DNA ポリメラーゼを含む１ｘPrimeSTARバッファ（Mg2+））に加え、以下のPCRプログラムを行って増幅させた。PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～４を10サイクル行った。
１．９４℃ ２分
２．９４℃ １５秒
３．６８℃ ５秒
４．７２℃ ３５秒
５．７２℃（２分）
【0151】
[配列番号１９]
5’‐TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3’
5’‐TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT‐3’
【0152】
PCR産物を８Ｍの尿素変性4.5％PAGEにて泳動し、フルコンストラクトDNA（541mer）を切出して精製した。精製したフルコンストラクトDNAを、200μLのPCR反応液（1x PrimeSTARバッファ（Mg2+）、0.2 mMのdNTPs、0.4 μMのNewleft、0.4 μMのNewYtag、0.02U/μＬのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ）に加え、50μＬずつ、上記チューブ中に分注した後、以下のPCRプログラムを行った。PCRプログラムは、以下の通りとし、ステップ２～４を６サイクル行った。
【0153】
１．９４℃ ２分
２．９４℃ １５秒
３．６８℃ ５秒
４．７２℃ ３５秒
５．７２℃ ２分
２．９４℃ １５秒
３．６８℃ ５秒
４．７２℃ ３５秒
５．７２℃ ２分
【0154】
以上のPCR増幅で得られた二本鎖としたフルコンストラクトDNAは、PCR産物を125μＬ x 2本にまとめスピンカラム（FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit、Favorgen社製)を２本を用いて精製した。この溶出液80μＬに、120μLのNuclease-free water (Kitに付属)を加え、さらに共沈剤（Quick-Precip Plus Solution, EdgeBio）を1/10倍量添加してエタノール沈殿させ、最後に20μＬのNuclease-free waterに溶解し-20℃でストックした。
【0155】
（２－７）クローニング
上述したHis-tagによる精製を行った後のVHH DNAライブラリのクォリティ（完全長VHHがコードされたDNAがどの程度含まれているか）を調べるために、以下のように、このライブラリDNAのクローニングおよびシーケンシング解析を行った。
まず、ライブラリDNAをpGEM-T easy Vector (Promega社製）へライゲーションし、これを用いてCompetent high ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、LBプレートで、37℃、オーバーナイトの条件で培養した。
上述したHis-tagによる精製を行った後のVHH DNAライブラリのクォリティ（完全長VHHがコードされたDNAがどの程度含まれているか）を調べるために、以下のように、このライブラリDNAのクローニングおよびシーケンシング解析を行った。
まず、ライブラリDNAをpGEM-T easy Vector (Promega社製）へライゲーションし、これを用いてCompetent high ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換し、LBプレートで、37℃、オーバーナイトの条件で培養した。
【0156】
40個のクローンをピックアップして、オペロンバイオテクノロジー株式会社に依頼して、シーケンシング解析を行った。DNA配列から得られたVHH配列の情報を以下に示す。なお、「＊」はStopコドンの出現を示す。配列解析の結果、40個のクローン中、35個のクローンが完全長VHHをコードしているDNAであることが確認できた。このライブラリの完全長VHHをコードした割合は、約88％であった。
以上より、ライブラリが作製できたことが確認された。
以上より、ライブラリが作製できたことが確認された。
【0157】
【表17】
【産業上の利用可能性】
【0158】
本発明は、医薬及び診断薬の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【0159】
配列番号１：VHH DNA ライブラリの塩基配列
配列番号２：Flag-tag挿入用プライマーの塩基配列
配列番号３：プライマー（Newleft）の塩基配列
配列番号４：プライマー（NewYtag）の塩基配列
配列番号５：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号６：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号７：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号８：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号９：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号１０：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号１１：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１２：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１３：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１４：制限酵素非依存DNAライブラリの塩基配列
配列番号１５：VHHのフルコンストラクトの塩基配列
配列番号１６：ピューロマイシンセグメントの塩基配列
配列番号１７：スペーサー配列
配列番号１８：mRNAとピューロマイシンリンカーDNAとの間にライゲーション可能な相補的配列
配列番号１９：NewY tag to HGGS-Rの塩基配列
配列番号２０：クローニングで得られたVHHの配列情報（１)
配列番号２１：クローニングで得られたVHHの配列情報（２)
配列番号２２：クローニングで得られたVHHの配列情報（３)
配列番号２３：クローニングで得られたVHHの配列情報（４)
配列番号２４：クローニングで得られたVHHの配列情報（５)
配列番号２５：クローニングで得られたVHHの配列情報（６)
配列番号２６：クローニングで得られたVHHの配列情報（７)
配列番号２７：クローニングで得られたVHHの配列情報（８)
配列番号２８：クローニングで得られたVHHの配列情報（９)
配列番号２９：クローニングで得られたVHHの配列情報（１０)
配列番号３０：クローニングで得られたVHHの配列情報（１１)
配列番号３１：クローニングで得られたVHHの配列情報（１２)
配列番号３２：クローニングで得られたVHHの配列情報（１３)
配列番号３３：クローニングで得られたVHHの配列情報（１４)
配列番号３４：クローニングで得られたVHHの配列情報（１５)
配列番号３５：クローニングで得られたVHHの配列情報（１６)
配列番号３６：クローニングで得られたVHHの配列情報（１７)
配列番号３７：クローニングで得られたVHHの配列情報（１８)
配列番号３８：クローニングで得られたVHHの配列情報（１９)
配列番号３９：クローニングで得られたVHHの配列情報（２０)
配列番号４０：クローニングで得られたVHHの配列情報（２１)
配列番号４１：クローニングで得られたVHHの配列情報（２２)
配列番号４２：クローニングで得られたVHHの配列情報（２３)
配列番号４３：クローニングで得られたVHHの配列情報（２４)
配列番号４４：クローニングで得られたVHHの配列情報（２５)
配列番号４５：クローニングで得られたVHHの配列情報（２６)
配列番号４６：クローニングで得られたVHHの配列情報（２７)
配列番号４７：クローニングで得られたVHHの配列情報（２８)
配列番号４８：クローニングで得られたVHHの配列情報（２９)
配列番号４９：クローニングで得られたVHHの配列情報（３０)
配列番号５０：クローニングで得られたVHHの配列情報（３１)
配列番号５１：クローニングで得られたVHHの配列情報（３２)
配列番号５２：クローニングで得られたVHHの配列情報（３３)
配列番号５３：クローニングで得られたVHHの配列情報（３４)
配列番号５４：クローニングで得られたVHHの配列情報（３５)
配列番号５５：クローニングで得られたVHHの配列情報（３６)
配列番号５６：クローニングで得られたVHHの配列情報（３７)
配列番号５７：クローニングで得られたVHHの配列情報（３８)
配列番号５８：クローニングで得られたVHHの配列情報（３９)
配列番号５９：クローニングで得られたVHHの配列情報（４０)
配列番号２：Flag-tag挿入用プライマーの塩基配列
配列番号３：プライマー（Newleft）の塩基配列
配列番号４：プライマー（NewYtag）の塩基配列
配列番号５：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号６：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号７：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号８：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号９：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号１０：イノシンプライマーの塩基配列
配列番号１１：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１２：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１３：ランダム変異挿入用のプライマーの塩基配列
配列番号１４：制限酵素非依存DNAライブラリの塩基配列
配列番号１５：VHHのフルコンストラクトの塩基配列
配列番号１６：ピューロマイシンセグメントの塩基配列
配列番号１７：スペーサー配列
配列番号１８：mRNAとピューロマイシンリンカーDNAとの間にライゲーション可能な相補的配列
配列番号１９：NewY tag to HGGS-Rの塩基配列
配列番号２０：クローニングで得られたVHHの配列情報（１)
配列番号２１：クローニングで得られたVHHの配列情報（２)
配列番号２２：クローニングで得られたVHHの配列情報（３)
配列番号２３：クローニングで得られたVHHの配列情報（４)
配列番号２４：クローニングで得られたVHHの配列情報（５)
配列番号２５：クローニングで得られたVHHの配列情報（６)
配列番号２６：クローニングで得られたVHHの配列情報（７)
配列番号２７：クローニングで得られたVHHの配列情報（８)
配列番号２８：クローニングで得られたVHHの配列情報（９)
配列番号２９：クローニングで得られたVHHの配列情報（１０)
配列番号３０：クローニングで得られたVHHの配列情報（１１)
配列番号３１：クローニングで得られたVHHの配列情報（１２)
配列番号３２：クローニングで得られたVHHの配列情報（１３)
配列番号３３：クローニングで得られたVHHの配列情報（１４)
配列番号３４：クローニングで得られたVHHの配列情報（１５)
配列番号３５：クローニングで得られたVHHの配列情報（１６)
配列番号３６：クローニングで得られたVHHの配列情報（１７)
配列番号３７：クローニングで得られたVHHの配列情報（１８)
配列番号３８：クローニングで得られたVHHの配列情報（１９)
配列番号３９：クローニングで得られたVHHの配列情報（２０)
配列番号４０：クローニングで得られたVHHの配列情報（２１)
配列番号４１：クローニングで得られたVHHの配列情報（２２)
配列番号４２：クローニングで得られたVHHの配列情報（２３)
配列番号４３：クローニングで得られたVHHの配列情報（２４)
配列番号４４：クローニングで得られたVHHの配列情報（２５)
配列番号４５：クローニングで得られたVHHの配列情報（２６)
配列番号４６：クローニングで得られたVHHの配列情報（２７)
配列番号４７：クローニングで得られたVHHの配列情報（２８)
配列番号４８：クローニングで得られたVHHの配列情報（２９)
配列番号４９：クローニングで得られたVHHの配列情報（３０)
配列番号５０：クローニングで得られたVHHの配列情報（３１)
配列番号５１：クローニングで得られたVHHの配列情報（３２)
配列番号５２：クローニングで得られたVHHの配列情報（３３)
配列番号５３：クローニングで得られたVHHの配列情報（３４)
配列番号５４：クローニングで得られたVHHの配列情報（３５)
配列番号５５：クローニングで得られたVHHの配列情報（３６)
配列番号５６：クローニングで得られたVHHの配列情報（３７)
配列番号５７：クローニングで得られたVHHの配列情報（３８)
配列番号５８：クローニングで得られたVHHの配列情報（３９)
配列番号５９：クローニングで得られたVHHの配列情報（４０)
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【配列表】