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特許7029213新規な化合物およびこれを含む肥満または代謝症候群の予防または治療用薬学的組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-22
(45)【発行日】2022-03-03
(54)【発明の名称】新規な化合物およびこれを含む肥満または代謝症候群の予防または治療用薬学的組成物
(51)【国際特許分類】
C07C 217/64 20060101AFI20220224BHJP
C07C 217/66 20060101ALI20220224BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20220224BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20220224BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20220224BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20220224BHJP
A61P 9/12 20060101ALI20220224BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20220224BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20220224BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20220224BHJP
A61K 31/137 20060101ALI20220224BHJP
【ＦＩ】
C07C217/64 CSP
C07C217/66
A61P3/04
A61P3/00
A61P9/10
A61P9/10 101
A61P3/06
A61P9/12
A61P7/04
A61P1/16
A61P3/10
A61K31/137
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2021502678
(86)(22)【出願日】2019-03-26
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-07-15
(86)【国際出願番号】 KR2019003514
(87)【国際公開番号】W WO2019190172
(87)【国際公開日】2019-10-03
【審査請求日】2020-09-25
(31)【優先権主張番号】62/648,381
(32)【優先日】2018-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】520373796
【氏名又は名称】プロテック・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＴＥＣＨ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】＃４０８， １０３， ＤＡＥＨＡＫ‐ＲＯ， ＪＯＮＧＮＯ‐ＧＵ， ＳＥＯＵＬ ０３０８０， ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】特許業務法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ヨン・テ
(72)【発明者】
【氏名】ガニピセッティ，スリニヴァスラオ
(72)【発明者】
【氏名】ソン，ギ・ウン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，ウィ・ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ペ，テ・ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ムン，ス・ラン
(72)【発明者】
【氏名】ジョン，チャン・フン
【審査官】三木 寛
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１３／０２２９１９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／２００８２７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／０３０２９２（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｃ ２１７／６４
Ｃ０７Ｃ ２１７／６６
Ａ６１Ｐ ３／０４
Ａ６１Ｐ ３／００
Ａ６１Ｐ ９／１０
Ａ６１Ｐ ３／０６
Ａ６１Ｐ ９／１２
Ａ６１Ｐ ７／０４
Ａ６１Ｐ １／１６
Ａ６１Ｐ ３／１０
Ａ６１Ｋ ３１／１３７
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１で表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：【化1】
Ｒ１は、－Ｌ１－（フェニル）であり、
Ｒ２は、水素、または－Ｌ２－（フェニル）であり、
Ｌ１は、Ｃ１－５アルキレンであり、
Ｌ２は、Ｃ１－５アルキレンであり、
但し、Ｒ１およびＲ２が両方ともベンジルであることはない。
【請求項2】
Ｌ１は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項3】
Ｌ２は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項4】
Ｒ１は、－ＣＨ２－（フェニル）であり、Ｒ２は、水素、－ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項5】
Ｒ１およびＲ２は互いに同一である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項6】
Ｒ１およびＲ２は、－ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）である、請求項５に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項7】
前記化合物は、１）２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
２）２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
３）２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
４）２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール、
５）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
６）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、および、
７）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール、から構成される群より選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項8】
請求項１～７のうちのいずれか一項の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、肥満または代謝症候群の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項9】
前記代謝症候群は、心筋梗塞、動脈硬化症、高脂血症、高血圧、脳梗塞、脳出血、脂肪肝、および２型糖尿病からなる群より選択されるいずれか一つである、請求項８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、肥満または代謝症候群の予防または治療に有用に使用することができる新規な化合物およびこれを含む薬学的組成物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
単純疾患としてのみ見なされた肥満は最近、疾病に分類されており、２型糖尿病、心血管疾患のような代謝症候群および特定癌の発病と関連性があると報告されている［１］。肥満は、社会環境的、遺伝的、精神的、内分泌的原因など多様な原因が複合的に作用して発生する疾病である。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ＷＨＯ）によれば、全世界的に肥満人口が１９８０年代以後２倍に増加し［２］、米国の場合、２０１３年基準全体人口の約３４％が肥満に分類された［３］。米国政府は肥満による社会経済的損失を減らすために毎年国家全体医療費の１０％を肥満関連医療サービスおよびキャンペーンなどに使用しているのが実情である。最近はアジアおよびアフリカ国家の肥満率の増加も目立っており、英国医学専門紙‘Ｌａｎｃｅｔ’によれば、２０１４年中国内肥満人口は約９０００万人に達すると調査された［４］。ＷＨＯはこのように漸進的に増加している肥満の深刻性を認識し２００４年５月に‘ダイエット、運動、健康に対する世界戦略’を議題化して肥満の解決のための努力を傾けてきた。しかし、現在まで肥満が減少した国は全世界的にただ一ヶ所も報告されていない。
【0003】
マッキンゼー報告書によれば、２０１２年肥満によって発生する健康問題を管理するのに使用された経済的費用が一年約２兆ドルに達すると分析された［５］。これは韓国の年間ＧＤＰを大きく上回る数値であり、アルコールの摂取によって発生する社会経済的費用より高い数値である。このように肥満は全世界的に台頭している健康問題であるにもかかわらず、研究開発を通じて米国ＦＤＡから臨床的使用が許可された薬物は総５種類に止まっているのが実情である［６］。
【0004】
しかし、米国ＦＤＡから承認を受けて使用されている薬物の作用機序は、摂取された飲食物を通じて小腸から脂肪が吸収されることを阻害する方法と脳の中枢神経内摂食中枢の活性を変化させて虚構的満腹感を誘発することによって栄養分の摂取を減少させて体重減少を誘導する方法および体内流入したエネルギーを脂肪の形態に貯蔵せず熱エネルギーとして放出するようにする方法に分けられる。しかし、このような薬物は栄養不均衡のような代謝的問題点および無気力感あるいは憂鬱感のような感情の変化が伴われる副作用が発生する可能性がある［６］。
【0005】
したがって、肥満の最も効果的な治療および予防法は、生体内システムを用いて原因物質である剰余体脂肪を根源的に除去することである。しかし、現在まで外科的処置以外には超過蓄積された脂肪のみを選択的に除去することができる効果的であり安定性の確保された方法は無いのが実情である。したがって、副作用が無く剰余脂肪の選択的除去という難題を解決することができれば、個人の健康問題を超えて肥満によって発生する社会的費用などを節減することができるはずである。また、肥満が主な原因であると知られた心血管および脳血管系疾患、第２型糖尿病および脂肪肝などのような代謝症候群の軽減にも効果があるはずである。
【0006】
組織および血中に過剰蓄積された脂肪は、体重の増加と共に多様な代謝症候群の主な原因である。高脂肪食餌によって増加された腹部脂肪は体内脂肪と糖代謝に影響を与えるようになって血中中性脂肪の濃度を増加させる。血液内中性脂肪の増加は、多様な組織で中性脂肪の蓄積を招く。組織内蓄積された脂肪が疾患の直接的な原因になる代表的な代謝症候群として肝疾患が挙げられる。肝細胞内に中性脂肪が５％以上蓄積された状態を脂肪肝と定義し、脂肪肝炎に発展することがある［７］。したがって、肝疾患を予防および治療するためには、組織内蓄積された脂肪を効果的に除去することが最も効果的な方法である。肥満を予防または治療することにおいて、薬物を使用する主目的は単純体重減量でなく蓄積された過剰体脂肪による代謝異常を是正することが目標にならなければならず、窮極的に肥満によって誘発することがある糖尿病、肝疾患のような代謝症候群の予後を良好にすることに焦点が合わせなければならない。したがって、抗－肥満薬物の場合、全体的な代謝作用の変化なく、剰余脂肪に対する選択的減少が行われることが優先目標にならなければならない。
【0007】
現在まで体内過度に蓄積された剰余脂肪のみを選択的に除去することができる技術は皆無な状態であり、これに対する研究も不在の状態である。標準体脂肪を維持しながら不必要な脂肪のみを除去するためには、細胞内恒常性維持のために存在するシステムを活用する方法が最も効果的である。細胞内には損傷するか不必要な細胞小器官および蛋白質などのような構成成分をリソソームという器官を活用して分解し再利用する自食作用機序が存在する。細胞がストレス状況に露出されるか栄養欠乏状況に置かれた時に活性化され、細胞はこのような機序を用いて細胞内環境を適切に維持する。分解される基質によってマイトファジー（Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ）、ゼノファジー（Ｘｅｎｏｐｈａｇｙ）、リポファジー（Ｌｉｐｏｐｈａｇｙ）などに多様に分類される［８］。リポファジー（Ｌｉｐｏｐｈａｇｙ）システムは細胞内蓄積された脂肪滴を除去する機能を果たすと知られており、２００９年ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）ジャーナルにＭａｒｋ Ｊ．ＣｚａｊａとＡｎａ Ｍａｒｉａ Ｃｕｅｒｖｏ研究陣が共同研究を通じて細胞内蓄積された脂肪滴がリポファジー作用によって除去されるという研究結果を発表した後、その機序および活性方法に対する研究が活発に行われている。したがって、技術的な方法でリポファジー過程を調節することができれば、摂食形態およびエネルギー代謝の調整によって脂肪の蓄積を防止する既存の肥満治療剤を代替できる効果的な治療剤として使用できる。
【0008】
よって、本発明者らはこのような薬物を開発するために鋭意努力した結果、後述する新規な化合物が前記のような特性を充足するのを確認して本発明を完成した。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＤＥ， ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＭＷ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｂｅｓｉｔｙ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｍｅｄ ２００３；５４：４５３－４７１［１］
【文献】Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ： Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｆｏｒ Ｅｕｒｏｐｅ． Ｏｂｅｓｉｔｙ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］． Ｇｅｎｅｖａ： Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ， ｃ２０１３ ［ｃｉｔｅｄ ２０１３ Ｍａｒ ３０］． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎ／ｗｈａｔ－ｗｅ－ｄｏ／ｈｅａｌｔｈｔｏｐｉｃｓ／ｎｏｎｃｏｍｍｕｎｉｃａｂｌｅ－ｄｉｓｅａｓｅ／ｏｂｅｓｉｔｙ／ｆａｃｔｓ－ａｎｄ－ｆｉｇｕｒｅｓ．［２］
【文献】Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ． Ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ Ｏｂｅｓｉｔｙ： Ａｄｕｌｔｓ Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｆａｃｔｓ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ２０１２ ［ｕｐｄａｔｅｄ ２０１２； ｃｉｔｅｄ ２０１３ Ｍａｒ ６］． Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｏｂｅｓｉｔｙ／ｄａｔａ／ａｄｕｌｔ．ｈｔｍｌ．［３］
【文献】Ｎｇ Ｍ， Ｆｌｅｍｉｎｇ Ｔ， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｍ， Ｇｒａｅｔｚ Ｎ， Ｍａｒｇｏｎｏ Ｃ， Ｍｕｌｌａｎｙ ＥＣ ｅｔ ａｌ． Ｇｌｏｂａｌ， ｒｅｇｉｏｎａｌ， ａｎｄ ｎａｔｉｏｎａｌ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｏｂｅｓｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ ｄｕｒｉｎｇ １９８０－２０１３： ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｂｕｒｄｅｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｔｕｄｙ ２０１３． Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ２０１４；３８４：７６６－７８１［４］
【文献】Ｄｏｂｂｓ Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ： Ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ． ＭｃＫｉｎｓｅｙ Ｇｌｏｂａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ２０１４［５］
【文献】Ｄａｎｅｓｃｈｖａｒ ＨＬ， Ｓｍｅｔａｎａ ＧＷ． ＦＤＡ－ａｐｐｒｏｖｅｄ ａｎｔｉ－ｏｂｅｓｉｔｙ ｄｒｕｇｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ． Ｔｈｅ Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ ２０１６；１２９：８７９．ｅ１－８７９．ｅ６［６］
【文献】Ｋｎｅｅｍａｎ ＪＭ， Ｍｉｓｄｒａｊｉ Ｊ， Ｃｏｒｅｙ ＫＥ． Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｔｈｅｒａｐ． Ａｄｖ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１２；５：１９９－２０７［７］
【文献】Ａｎｄｉｎｇ ＡＬ， Ｂａｅｈｒｅｃｋｅ ＥＨ． Ｃｌｅａｎｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ： Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｏｆ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ２０１７；１０：４１：１０－２２［８］
【文献】Ｋａｕｓｈｉｋ Ｓ， Ｃｕｅｒｖｏ ＡＭ． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ． Ｎａｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１５；１７：７５９－７７０［９］
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明は、肥満または代謝症候群の予防または治療に有用に使用することができる新規な化合物またはその薬学的に許容可能な塩、およびこれを含む薬学的組成物を提供するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
前記課題を解決するために、本発明は、下記化学式１で表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【0012】
【化1】
Ｒ１は、－Ｌ１－（フェニル）であり、
Ｒ２は、水素、または－Ｌ２－（フェニル）であり、
Ｌ１は、Ｃ１－５アルキレンであり、
Ｌ２は、Ｃ１－５アルキレンであり、
但し、Ｒ１およびＲ２が両方ともベンジルであることはない。
【0013】
好ましくは、Ｌ１は、直鎖Ｃ１－５アルキレンである。より好ましくは、Ｌ１は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
【0014】
好ましくは、Ｌ２は、直鎖Ｃ１－５アルキレンである。より好ましくは、Ｌ２は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－である。
【0015】
好ましくは、Ｒ１は－ＣＨ２－（フェニル）であり；Ｒ２は水素、－ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）である。
【0016】
好ましくは、Ｒ１およびＲ２は互いに同一である。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は－ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－（フェニル）である。
【0017】
前記化学式１で表される化合物の代表的な例は下記の通りである：
１）２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
２）２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
３）２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
４）２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール、
５）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
６）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、および
７）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール。
１）２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
２）２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
３）２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール、
４）２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール、
５）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール、
６）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール、および
７）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール。
【0018】
一方、前記化学式１で表される化合物は薬学的に許容可能な塩の形態で使用することができ、塩としては、薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜硝酸、亜リン酸などのような無機酸類、脂肪族モノおよびジカルボキシレート、フェニル－置換されたアルカノエート、ヒドロキシアルカノエートおよびアルカンジオエート、芳香族酸類、脂肪族および芳香族スルホン酸類などのような無毒性有機酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、乳酸、マレイン酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、４－トルエンスルホン酸、酒石酸、フマル酸などのような有機酸から得る。このような薬学的に無毒な塩の種類としては、スルフェート、ピロスルフェート、ビスルフェート、スルフィド、ビスルフィド、ニトレイト、ホスフェート、モノヒドロゲンホスフェート、ジヒドロゲンホスフェート、メタホスフェート、ピロホスフェートクロリド、ブロミド、ヨージド、フルオリド、アセテート、プロピオネート、デカノエート、カプリレート、アクリレート、ホルメート、イソブチレート、カプレート、ヘプタノエート、プロピオレート、オキサレート、マロネート、サクシネート、スベレート、セバケート、フマレート、マレエート、ブチン－１，４－ジオネート、ヘキサン－１，６－ジオエート、ベンゾエート、クロロベンゾエート、メチルベンゾエート、ジニトロベンゾエート、ヒドロキシベンゾエート、メトキシベンゾエート、フタレート、テレフタレート、ベンゼンスルホネート、トルエンスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、キシレンスルホネート、フェニルアセテート、フェニルプロピオネート、フェニルブチレート、シトレート、ラクテート、β－ヒドロキシブチレート、グリコレート、マレエート、タルトレート、メタンスルホネート、プロパンスルホネート、ナフタレン－１－スルホネート、ナフタレン－２－スルホネート、マンデレートなどを含む。
【0019】
前記酸付加塩は通常の方法で製造することができ、例えば、化学式１の誘導体をメタノール、エタノール、アセトン、ジクロロメタン、アセトニトリルなどのような有機溶媒に溶かし有機酸または無機酸を加えて生成された沈殿物をろ過、乾燥させて製造するか、溶媒と過量の酸を減圧蒸留した後に乾燥させて有機溶媒下で結晶化させて製造することができる。
【0020】
また、塩基を使用して薬学的に許容可能な金属塩を製造することができる。アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩は、例えば、化合物を過量のアルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物溶液中に溶解し、非溶解化合物塩をろ過し、濾液を蒸発、乾燥させて得る。この時、金属塩としては、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩を製造するのが製薬上適する。また、これに対応する塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩を適当な銀塩（例えば、硝酸銀）と反応させて得る。
【0021】
さらに、本発明は、前記化学式１で表される化合物およびその薬学的に許容可能な塩だけでなく、これから製造できる溶媒和物、光学異性体、水和物などを全て含む。
【0022】
また、本発明は、一例として、下記反応式１のような前記化学式１で表される化合物の製造方法を提供する。
【0023】
【化2】
【0024】
上記反応式１中、Ｒ１およびＲ２は先に定義した通りである。
【0025】
前記反応は、前記化学式１－１で表される化合物と前記化学式１－２で表される化合物を反応させて前記化学式１で表される化合物を製造する反応であって、実質的に２段階からなる。具体的に、前記化学式１－１で表される化合物と前記化学式１－２で表される化合物を反応させてイミン化合物を製造した後、これを還元させて前記化学式１で表される化合物を製造する。
【0026】
前記反応で使用できる溶媒としては水、エタノール、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン、またはアセトニトリルを使用することができるが、これに制限されない。また、前記反応温度は特別な制約はないが、１０℃～９０℃、好ましくは１０℃～３０℃または６０℃～８０℃で行うことができる。また、前記還元剤（ｒｅｄｕｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は特別な制限がなく、一例としてＮａＢＨ４を使用することができる。また、前記反応後、必要によって精製段階が含まれる。
【0027】
また、本発明は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、肥満または代謝症候群の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0028】
後述の実験例のように、本発明による化合物はＯｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色法で確認した通り、脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）で過剰蓄積された脂肪滴（ｌｉｐｉｄ ｄｒｏｐｌｅｔ）を選択的に分解して蓄積された脂肪滴の大きさが小さくなることを確認した。また、高脂肪飼料摂取マウスで本発明の化合物の体重減量効果を確認した通り、高脂肪飼料を通じて肥満を誘導したマウスに腹腔内投与方式で注入した時、対照群薬物投与マウスに比べて統計的に有意水準の体重減量効果を確認した。
【0029】
このような結果は本発明による化合物が過剰蓄積された脂肪細胞、即ち、疾病誘発の原因になることのある脂肪細胞のみ選択的に減少または除去することができるという証拠であり、したがって代謝過程の変化によるエネルギー消費量の増加や摂食形態の変化を誘導することによって副作用の発生の憂慮される既存の薬物に対する効果的な対案になり得る。
【0030】
前記代謝症候群の例としては、心筋梗塞、動脈硬化症、高脂血症、高血圧、脳梗塞、脳出血、脂肪肝、および２型糖尿病からなる群より選択されるいずれか一つが挙げられる。このような代謝症候群は、高脂肪食餌摂取と共に身体活動の減少による肥満が主な原因として作用し、体脂肪の増加、血圧上昇、血中脂質異常などの代謝機能異常が伴われる疾病である。したがって、過剰蓄積された体脂肪の除去による肥満の治療または予防は、代謝症候群の予後も向上させるのに効果的である。
【0031】
本発明の用語“予防”は本発明の薬学的組成物の投与で前述の疾患の発生、拡散および再発を抑制させるか遅延させる全ての行為を意味し、“治療”は本発明の薬学的組成物の投与で前記疾患の症状が好転するか良い方向に変更される全ての行為を意味する。
【0032】
本発明による薬学的組成物は、標準薬学的実施によって経口または非経口投与形態に剤形化することができる。これら剤形は、有効成分以外に薬学的に許容可能な担体、補助剤または希釈液などの添加物を含有することができる。適当な担体としては例えば、生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物性オイルおよびイソプロピルミリステートなどがあり、希釈液としては例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンなどがあるが、これらに限定されるのではない。また、本発明の化合物は注射溶液の製造に通常使用されるオイル、プロピレングリコールまたは他の溶媒に溶解させることができる。また、局所作用のために本発明の化合物を軟膏やクリームに剤形化することができる。
【0033】
本発明による化学式１で表される化合物の好ましい投与量は患者の状態および体重、疾病の程度、薬物の形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適切に選択できる。しかし、好ましい効果のために、本発明による化学式１で表される化合物を１日０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することが良い。投与は１日１回または分割して経口または非経口的経路を通じて投与することができる。
【0034】
投与方法によって、本発明による薬学的組成物は、本発明による化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を０．００１～９９重量％、好ましくは０．０１～６０重量％含有することができる。
【0035】
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜および人間などをはじめとする哺乳動物に多様な経路で投与することができる。投与の全ての方式は予想することができ、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内硬膜または脳血管注射によって投与することができる。
【発明の効果】
【0036】
前述のように、本発明による化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、肥満または代謝症候群の予防または治療に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色によって本発明の化合物が３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞とＨｅｐ Ｇ２肝細胞で脂肪滴の大きさを減少させる効能を確認した結果である。
【図2】Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色によって本発明の化合物が３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞とＨｅｐ Ｇ２肝細胞で脂肪滴の大きさを減少させる効能を確認した結果である。
【図3】ＢＯＤＩＰＹ染色によって３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞で本発明の化合物が脂肪滴の大きさと数を減少させる効能を確認した結果である。
【図4a】３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（図４ａ）とＨｅｐ Ｇ２肝細胞（図４ｂ）で免疫蛍光染色法によって本発明の化合物がリポファジー過程を活性化し、活性化されたリポファジー過程が細胞内蓄積された脂肪滴の大きさおよび数を減少させる現象を確認した結果である。
【図4b】３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞（図４ａ）とＨｅｐ Ｇ２肝細胞（図４ｂ）で免疫蛍光染色法によって本発明の化合物がリポファジー過程を活性化し、活性化されたリポファジー過程が細胞内蓄積された脂肪滴の大きさおよび数を減少させる現象を確認した結果である。
【図5】本発明の化合物がリポファジー過程によって脂肪滴を除去したのを検証するために、本発明の化合物とリポファジー作用の抑制剤であるＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎを共に処理して脂肪滴の除去が起こらないのを確認した結果である。
【図6】本発明の化合物の抗肥満効果を生体水準で確認するために野生型マウスに高脂肪飼料の供給によって肥満を誘導し、偽薬と本発明による化合物を処理した後に体重および腹部脂肪組織の大きさが減少したのを確認した結果である。
【図7】偽薬と本発明の化合物処理によるそれぞれの体重変化を週次別に記録して示した結果である。
【図8】本発明の化合物の処理によって示された体重減少効果が脂肪組織重量の減少に起因したことであるのを確認するために各組織の重量を測定した結果を示したグラフである。
【図9】本発明の化合物によって減少した脂肪組織の重量をグラフを通じて比較した結果である。
【図10】脂肪組織のみの重量が減少したのを確認するために摘出した各組織の実際の様子を比較した写真である。各写真で、左側がｖｅｈｉｃｌｅを、右側が本発明の化合物を処理したものである。
【図11】本発明の化合物によって減少した体重の比率を示すグラフである。また、投与期間中の発達程度を比較するために身長を測定した結果を示した。体重減少効果が飼料摂取の減少に起因したのかを判断するために飼料摂取量を調査した結果を示した。
【図12】本発明の化合物による体重減少が血中脂質成分および血糖、組織の病的状態に対して効果があるのを把握するために偽薬群と化合物投与群マウスの血液を採取して検査した項目に対する結果である。
【図13】本発明の化合物によって組織内蓄積された脂肪滴の除去効果を確認するためにＨｎＥ染色法によってマウスの肝組織を観察した結果である。黄色の矢印で表示された白い円形構造物が脂肪滴を示す。
【図14】本発明の化合物によって脂肪細胞の大きさが減少したのを確認するためにＨｎＥ染色法によってマウスの脂肪組織を観察した結果である。青色の矢印と黒色および黄色の点で表示された構造物が脂肪組織内の脂肪細胞を示す。
【図15】本発明の化合物によって示された体重減少および脂肪滴の減少効果がリポファジー作用によるものであるのを確認するために組織免疫化学染色法によってリポファジー活性の標識者であるＬＣ３蛋白質の発現向上を確認した結果である。
【図16】過度な脂肪滴の蓄積によって引き起こされる肝組織内の炎症症状において本発明の化合物の緩和効果を観察するために組織免疫化学染色法によって炎症細胞である大食細胞の発現様相を観察した結果である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下、本発明の実施例および実験例について詳しく説明する。これら実施例および実験例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例および実験例に限定されるのではない。
【実施例】
【0039】
実施例１：２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
【0040】
段階１）３，４－ジフェネトキシベンズアルデヒドおよび３－ヒドロキシ－４－フェネトキシベンズアルデヒドの製造
【化3】
【0041】
３，４－ジヒドロキシベンズアルデヒド（０．５０ｇ、３．６２ｍｍｏｌ）溶液をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希釈しながら攪拌した。（２－ブロモエチル）ベンゼン（１．２４ｍＬ、９．０５ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、無水Ｋ２ＣＯ３（２．５ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を添加した。前記混合物を室温で２時間攪拌し、Ｋ２ＣＯ３（２．４ｇ、１７．３ｍｍｏｌ）をさらに添加し、７０℃で３０分間加熱した後に室温で冷却させた。混合物を水およびエーテル（それぞれ１２０ｍＬ）の間に分割した。有機層を分離し、水層をエーテル（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ヘキサン（７５ｍＬ）で洗浄した後に濃縮した。生成された残留物をエチルアセテート：ヘキサン（１：４）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色の固体の３，４－ジフェネトキシベンズアルデヒド（６．５７ｇ、９５％）およびクリーム色の固体の３－ヒドロキシ－４－フェネトキシベンズアルデヒドをそれぞれ製造した。
【0042】
３－ヒドロキシ－４－フェネトキシベンズアルデヒド：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．７８（ｓ、１Ｈ）、７．２２－７．４０（ｍ、１２Ｈ）、６．９１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、４．２３（ｔｄ、４Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ６．０Ｈｚ）、３．１５（ｔｄ、４Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ６．０Ｈｚ）；ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ２４３．１７［Ｍ＋Ｈ］＋
【0043】
３，４－ジフェネトキシベンズアルデヒド：１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．８４（ｓ、１Ｈ）、７．２６－７．４３（ｍ、７Ｈ）、６．９６（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、５．６２（ｓ、１Ｈ）、４．３６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．１７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）；ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ３４７．３３［Ｍ＋Ｈ］＋
【0044】
段階２）２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノールの製造
【化4】
【0045】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した３，４－ジフェネトキシベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）に２－アミノエタノール（２７ｍｇ（２７μＬ）、０．４５ｍｍｏｌ）を添加しながら攪拌した。８０℃で１２時間攪拌した後、室温で冷却した。ＮａＢＨ４（１７ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を添加し、追加的に１２時間攪拌した。溶媒を真空中で蒸発させ残留物を水に溶解させた後、エチルアセテートで抽出した。有機層を結合してＮａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール（９６ｍｇ、８５％）を製造した。
【0046】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ３９２．９２［Ｍ＋Ｈ］＋
【0047】
段階３）２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
先に段階２で製造した２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間さらに攪拌し約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を製造し、ろ過し乾燥して最終化合物の２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
先に段階２で製造した２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間さらに攪拌し約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を製造し、ろ過し乾燥して最終化合物の２－（３，４－ジフェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
【0048】
実施例２：２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
【0049】
段階１）３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒドの製造
【化5】
【0050】
３，４－ジヒドロキシベンズアルデヒド（５００ｍｇ、３．６２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希釈し、無水Ｋ２ＣＯ３（１．５ｇ、１０．８６ｍｍｏｌ）および（３－ブロモプロピル）ベンゼン（１．２ｍＬ、７．９６ｍｍｏｌ）を順次に徐々に添加した。混合物を８０℃まで加熱し２時間攪拌した後、室温に冷却した。混合物を水およびエーテル（それぞれ５０ｍＬ）の間に分割し、有機層を分離し、水をエーテル（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色の抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ヘキサン（７５ｍＬ）で洗浄した後に濃縮させた。残留物は酢酸エチル：ヘキサン（１：４）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色固体の３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒド（１．３ｇ、９６％）を製造した。
【0051】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．８６（ｓ、１Ｈ）、７．４５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ９．０Ｈｚ）、７．４１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、７．２２－７．３４（ｍ、１０Ｈ）６．９５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、４．１２（ｔｄ、４Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ９．０Ｈｚ）、２．８７（ｔｄ、４Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ９．０Ｈｚ）、２．１７－２．２８（ｍ、４Ｈ）。
【0052】
段階２）２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【化6】
【0053】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）に２－アミノエタノール（２５ｍｇ（２５μＬ）、０．４０ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加し、６０℃で１２時間攪拌した。反応溶液を室温まで冷却し、ＮａＢＨ４（１５．２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を徐々に添加して１２時間さらに攪拌した。溶媒を真空で蒸発させ、残留物を水に溶かしてエチルアセテートで抽出した。有機層を結合し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過して真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（９６ｍｇ、８６％）を製造した。
【0054】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ４２１．０［Ｍ＋２Ｈ］＋
【0055】
段階３）２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）－ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
先に段階２で製造した２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間追加的に攪拌し約１ｍＬに蒸発させ、ヘキサンを添加して固体を得てろ過し乾燥して２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）－ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
先に段階２で製造した２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間追加的に攪拌し約１ｍＬに蒸発させ、ヘキサンを添加して固体を得てろ過し乾燥して２－（３，４－ビス（３－フェニルプロポキシ）－ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
【0056】
実施例３：２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【0057】
段階１）３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒドの製造
【化7】
【0058】
３，４－ジヒドロキシベンズアルデヒド（１４７ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希釈し、無水Ｋ２ＣＯ３（４４２ｍｇ、３．２０ｍｍｏｌ）および（４－ブロモブチル）ベンゼン（０．４ｍＬ、２．３５ｍｍｏｌ）を順次に徐々に添加した。混合物を８０℃まで加熱し２時間攪拌した後、室温に冷却した。混合物を水およびエーテル（それぞれ５０ｍＬ）の間に分割し、有機層を分離し、水をエーテル（３×５０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色の抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ヘキサン（７５ｍＬ）で洗浄した後に濃縮させた。残留物はメタノール（１％ ｔｏ ５％ ｉｎ ＤＣＭ）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色固体の３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒド（３９８ｍｇ、９３％）を製造した。
【0059】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ７．４６－７．２６（ｍ、１０Ｈ）、６．８４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、６．５９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０Ｈｚ）、６．３８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．０ ａｎｄ ９．０Ｈｚ）、５．１２（ｓ、１Ｈ）、５．０７（ｓ、１Ｈ）、４．０３（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝３．６ ａｎｄ ５．１Ｈｚ）、３．９３－３．８６（ｍ、２Ｈ）、３．２５（ｓ、２Ｈ）、２．９２－２．８６（ｍ、２Ｈ）、２．７２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．１ ａｎｄ １２．０Ｈｚ）、１．１２（ｄ、６Ｈ、Ｊ＝６．３Ｈｚ）
【0060】
ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ：４９６［Ｍ＋Ｈ］＋
【0061】
段階２）２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【化8】
【0062】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒド（０．３５ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）に２－アミノエタノール（１０６ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加し、６０℃で１２時間攪拌した。反応溶液を室温まで冷却し、ＮａＢＨ４（３３ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）を徐々に添加して１２時間さらに攪拌した。溶媒を真空で蒸発させ、残留物を水に溶かしエチルアセテートで抽出した。有機層を結合し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過し真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（３，４－ビス（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール（０．３３ｇ、８５％）を製造した。
【0063】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ４４９．０［Ｍ＋２Ｈ］＋
【0064】
実施例４：２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール塩酸塩の製造
【0065】
段階１）４－ベンジルオキシ－３－ヒドロキシベンズアルデヒドの製造
【化9】
【0066】
不活性ガス（Ｎ２）雰囲気下の室温で無水アセトニトリル（３０ｍＬ）中の３，４－ジヒドロキシベンズアルデヒド（２．５ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）溶液に攪拌しながらＫ２ＣＯ３（２．５ｇ、１８．１ｍｍｏｌ）を添加し、ベンジルブロミド（３．４４ｍＬ、２９．０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。加熱しながら還流し２時間攪拌しながら反応を行った。反応溶媒を減圧蒸発させることによって除去し、結果物に冷たい１０％ＮａＯＨ溶液を添加して１０分間攪拌した後、エチルアセテート（１００ｍＬ）を添加した。生成された二相（ｂｉｐｈａｓｉｃ）の混合物を分離して水性層を４Ｎ ＨＣｌで酸性化させ、ＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で抽出した。有機層を塩水、および水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ減圧濃縮して残留物を収得し、エチルアセテートで結晶化して精製することによって白い粉末の４－ベンジルオキシ－３－ヒドロキシベンズアルデヒド（２．９０ｇ、７０％）を製造した。
【0067】
１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ９．８３（ｓ、１Ｈ、ＣＨＯ）、７．３９－７．４６（ｍ、７Ｈ、ＡｒＨ）、７．０３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ、ＡｒＨ）、５．８８（ｓ、１Ｈ、ＯＨ）、５．２０（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２Ｐｈ）
【0068】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ２２９．２５［Ｍ＋Ｈ］＋
【0069】
段階２）２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノールの製造
【化10】
【0070】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した４－（ベンジルオキシ）－３－ヒドロキシベンズアルデヒド（２００ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）を攪拌しながら２－アミノエタノール（８１ｍｇ（８０μＬ）、１．３２ｍｍｏｌ）を添加し６０℃で１２時間攪拌した後に室温で冷却した。ＮａＢＨ４（５０ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ）を徐々に添加して１２時間さらに攪拌した。溶媒を真空状態で蒸発させ残留物を水に溶かしてエチルアセテートで抽出した。有機層を結合しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過し真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール（０．２２ｇ、９２％）を製造した。
【0071】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ２７４．７５［Ｍ＋Ｈ］＋
【0072】
段階３）２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール塩酸塩の製造
先に段階２で製造した２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）－フェノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、１時間ＨＣｌガスを注入した。混合物を２時間攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後にヘキサンを添加して固体を収得し、ろ過し乾燥して２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
先に段階２で製造した２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）－フェノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、１時間ＨＣｌガスを注入した。混合物を２時間攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後にヘキサンを添加して固体を収得し、ろ過し乾燥して２－（ベンジルオキシ）－５－（（２－ヒドロキシエチルアミノ）メチル）フェノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
【0073】
実施例５：２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
【0074】
段階１）４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンズアルデヒドの製造
【化11】
【0075】
４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．５０ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希薄させ、無水Ｋ２ＣＯ３（６０４ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ）および（２－ブロモエチル）ベンゼン（０．３６ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を順次に徐々に添加した。混合物を７０℃で２時間加熱し、室温まで冷却した。混合物を水およびエーテル（それぞれ２０ｍＬ）の間に分割して有機層を分離し、水層をエーテル（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。残留物をエチルアセテート：ヘキサン（１：９）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色固体の４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンズアルデヒド（０．６６ｇ、９０％）を製造した。
【0076】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．８０（ｓ、１Ｈ）、７．２１－７．３９（ｍ、１２Ｈ）、６．９８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．１７（ｓ、２Ｈ）、４．２７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．１４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）
【0077】
段階２）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノールの製造
【化12】
【0078】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）溶液に２－アミノエタノール（２２ｍｇ（２２μＬ）、０．３６ｍｍｏｌ）を添加して攪拌した。反応混合物を６０℃で１２時間攪拌し、室温まで冷却させ、ＮａＢＨ４（１７．１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を攪拌しながら徐々に添加し、１２時間追加的に攪拌した。溶媒を真空で蒸発させ、残留物を水に溶解させ、エチルアセテートで抽出した。有機層を結合しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過し真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール（０．１０ｇ、９０％）を製造した。
【0079】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ３７８．９［Ｍ＋Ｈ］＋
【0080】
段階３）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
先に段階２で製造した２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。２時間攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を収得し、これをろ過し乾燥して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
先に段階２で製造した２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。２時間攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を収得し、これをろ過し乾燥して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－フェネトキシベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
【0081】
実施例６：２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
【0082】
段階１）４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒドの製造
【化13】
【0083】
４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．５０ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希薄させ、無水Ｋ２ＣＯ３（６０４ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ）および（３－ブロモプロピル）ベンゼン（０．４ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を順次に徐々に添加した。混合物を７０℃で２時間加熱し、室温まで冷却した。混合物を水およびエーテル（それぞれ２０ｍＬ）の間に分割して有機層を分離し、水層をエーテル（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。残留物をエチルアセテート：ヘキサン（１：９）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色固体の４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒド（０．６８ｇ、９０％）を製造した。
【0084】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．８１（ｓ、１Ｈ）、７．１８－７．３８（ｍ、１２Ｈ）、７．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、５．２３（ｓ、２Ｈ）、４．０９（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、３．１４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、２．１２－２．２２（ｍ、２Ｈ）
【0085】
段階２）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【化14】
【0086】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）に２－アミノエタノール（２２ｍｇ（２２μＬ）、０．３６ｍｍｏｌ）を添加しながら攪拌した。６０℃で１２時間攪拌した後、室温に冷却した。ＮａＢＨ４（１６．７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、追加的に１２時間攪拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残留物を水に溶解させた後、エチルアセテートで抽出した。有機層を結合しＮａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過し、真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（９３ｍｇ、８２％）を製造した。
【0087】
ＥＳＩ ＭＳ：ｍ／ｚ ３９２．９２［Ｍ＋Ｈ］＋
【0088】
段階３）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩の製造
先に段階２で製造した２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間さらに攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を収得し、ろ過し乾燥して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
先に段階２で製造した２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）をメタノール（２５ｍＬ）に溶解させ、ＨＣｌガスを１時間注入した。混合物を２時間さらに攪拌し、約１ｍＬに蒸発させた後、ヘキサンを添加して固体を収得し、ろ過し乾燥して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（３－フェニルプロポキシ）ベンジルアミノ）エタノール塩酸塩（７２０ｍｇ、６５％）を製造した。
【0089】
実施例７：２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【0090】
段階１）４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒドの製造
【化15】
【0091】
４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－ヒドロキシベンズアルデヒド（０．５０ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）で希薄させ、無水Ｋ２ＣＯ３（６０４ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ）および（４－ブロモプロピル）ベンゼン（０．４６ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を順次に徐々に添加した。混合物を７０℃で２時間加熱し、室温まで冷却した。混合物を水およびエーテル（それぞれ２０ｍＬ）の間に分割して有機層を分離し、水層をエーテル（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出された有機層を水（２×２０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）で飽和させた。薄い淡黄色抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させて濃縮した。残留物をエチルアセテート：ヘキサン（１：９）を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製してクリーム色固体の４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒド（０．６９ｇ、８８％）を製造した。
【0092】
１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）：δ９．８６（ｓ、１Ｈ）、７．２９－７．４８（ｍ、８Ｈ）、７．２２－７．２４（ｍ、３Ｈ）、７．０３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、５．２５（ｓ、２Ｈ）、４．１４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、２．７４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．０Ｈｚ）、１．８７－１．９４（ｍ、４Ｈ）
【0093】
段階２）２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノールの製造
【化16】
【0094】
エタノール（５ｍＬ）中の先に段階１で製造した４－（ベンジルベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンズアルデヒド（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）に２－アミノエタノール（２５．６ｍｇ（２５μＬ）、０．４２ｍｍｏｌ）を添加しながら攪拌した。６０℃で１２時間攪拌した後、室温に冷却した。ＮａＢＨ４（１６ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を徐々に添加し、追加的に１２時間攪拌した。溶媒を真空中で蒸発させ、残留物を水に溶解させた後、エチルアセテートで抽出した。有機層を結合し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後にろ過し、真空で蒸発させた。残留物をフラッシュカラムで精製して２－（４－（ベンジルオキシ）－３－（４－フェニルブトキシ）ベンジルアミノ）エタノール（９９ｍｇ、８９％）を製造した。
【0095】
１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、３００ＭＨｚ）：δ７．４４－７．４１（ｍ、２Ｈ）、７．３２－７．１４（ｍ、８Ｈ）、７．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．８Ｈｚ）、７．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．１Ｈｚ）、６．９０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．８ ＆ ８．１Ｈｚ）、５．１０（ｓ、２Ｈ）、４．０９－４．０５（ｍ、２Ｈ）、３．９０（ｓ、２Ｈ）、３．７２（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．８８（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝５．４Ｈｚ）、２．７０－２．６５（ｍ、２Ｈ）、１．８５－１．８１（ｍ、４Ｈ）
【0096】
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ４０６（Ｍ＋Ｈ）＋ ａｎｄ ３４５（Ｍ－６０）＋
【0097】
実験例１：Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法による３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で本化合物の脂肪滴除去効果分析
本発明の化合物が細胞内に蓄積された脂肪滴を減少させる効果を評価するために下記のように実験を行った。
本発明の化合物が細胞内に蓄積された脂肪滴を減少させる効果を評価するために下記のように実験を行った。
【0098】
脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１を韓国細胞株銀行から購入し、１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）と高グルコースＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に培養して維持した。脂肪細胞に分化させるために１０万個細胞／ｍｌ密度の３Ｔ３－Ｌ１を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と高グルコースＤＭＥＭで２日間細胞を密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）させた後、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｙｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．５μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、５μｇ／ｍｌインシュリン（ＭＤＩ）を添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭを入れて２日間培養し、５μｇ／ｍｌインシュリン（Ｉ）のみ添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭに４日さらに培養した後に、１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭのみを入れて再び６日をさらに培養して、総１０日間培養して脂肪細胞に分化させた。細胞を密集させて培養させた後に培地を取り替えるたびに化合物を１０μＭの濃度で処理した。分化１０日目培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定させた後、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色溶液で染色した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色溶液は０．５ｇ／２００ｍｌイソプロパノールの標準溶液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を６０％で蒸留水で希釈して染色し、４００×倍率で顕微鏡観察を行って、結果は図１に示した。
【0099】
図１で、赤色円形の構造物が細胞内蓄積された脂肪滴を示す。図１に示されているように、本発明による化合物処理によって脂肪滴の大きさと数が減少するのを示し、したがって、本発明による化合物は、３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞で脂肪滴除去効果があるのを確認することができた。
【0100】
実験例２：Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法によるＨｅｐ Ｇ２肝細胞で本化合物の脂肪滴除去効果分析
本発明の化合物が肝細胞内に蓄積された脂肪滴を除去する効果を評価するために下記のように実験を行った。
本発明の化合物が肝細胞内に蓄積された脂肪滴を除去する効果を評価するために下記のように実験を行った。
【0101】
具体的に、Ｈｅｐ Ｇ２細胞を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、米国）が添加されたＤＭＥＭ培地で培養し、細胞が５０％程度密集した時、細胞内脂肪蓄積を誘導するために１ｍＭのｏｌｅｉｃ ａｃｉｄと０．５ｍＭのｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄが混合されたＤＭＥＭ培地に交替して２４時間を培養した後、本発明によって合成されたそれぞれの化合物が１０μＭ含まれているＤＭＥＭ培地に交替して２４時間を追加的に培養した。終了後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定させた後にＰＢＳで三回洗浄した。その後、細胞を６０％イソプロパノールで洗いおとした後、希釈されたオイルレッドО溶液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３ｍｇ／ｍＬ ｉｎ ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ；ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、６０％ Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｉｌｕｔｅｄ ｉｎ ｗａｔｅｒ）で１時間染色した。Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色溶液は、０．５ｇ／２００ｍｌイソプロパノールの標準溶液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を６０％で蒸留水で希釈して染色し、４００×倍率で顕微鏡観察を行い、結果は図２に示した。
【0102】
図２で、赤色円形の構造物が細胞内蓄積された脂肪滴を示す。図２に示されているように、本発明による化合物処理によって脂肪滴の大きさと数が減少するのを示し、したがって、本発明による化合物はＨｅｐ Ｇ２肝細胞で脂肪滴除去効果があるのを確認することができた。
【0103】
実験例３：ＢＯＤＩＰＹ染色法による３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞およびＨｅｐ Ｇ２肝細胞で本化合物の脂肪滴除去効果分析
本発明の化合物が細胞内に蓄積された脂肪滴を減少させる効果を免疫蛍光染色法によって評価するために下記のように実験を行った。
本発明の化合物が細胞内に蓄積された脂肪滴を減少させる効果を免疫蛍光染色法によって評価するために下記のように実験を行った。
【0104】
脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１を韓国細胞株銀行から購入し、１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）と高グルコースＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に培養して維持した。脂肪細胞に分化させるために１０万個細胞／ｍｌ密度の３Ｔ３－Ｌ１を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と高グルコースＤＭＥＭで２日間細胞を密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）させた後、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｙｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．５μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、５μｇ／ｍｌインシュリン（ＭＤＩ）を添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭを入れて２日間培養し、５μｇ／ｍｌインシュリン（Ｉ）のみ添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭに４日さらに培養した後に、１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭのみを入れて再び６日をさらに培養して、総１０日間培養して脂肪細胞に分化させた。細胞を密集させて培養させた後に培地を取り替えるたびに化合物を１０μＭの濃度で処理した。分化１０日目培養細胞を４％ホルムアルデヒドで固定させた後、脂肪滴の標識者であるＢＯＤＩＰＹを用いて脂肪滴を染色し、ＤＡＰＩ染色によって細胞の核を標識した。結果は図３に示した。
【0105】
図３で、緑色の円形構造物が細胞内蓄積された脂肪滴を示し、本発明による化合物処理によって大きさと数が減少するのを示す。したがって、本発明による化合物は脂肪前駆細胞で脂肪滴除去効果があるのを確認することができた。
【0106】
実験例４：本発明の化合物の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞およびＨｅｐ Ｇ２肝細胞でリポファジー作用による脂肪滴除去効果分析
本発明の化合物によって除去された細胞内脂肪滴がリポファジー作用によって減少したのを確認するために以下の実験を行った。
本発明の化合物によって除去された細胞内脂肪滴がリポファジー作用によって減少したのを確認するために以下の実験を行った。
【0107】
脂肪前駆細胞３Ｔ３－Ｌ１を韓国細胞株銀行から購入し、１０％新生仔ウシ血清（ＮＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）と高グルコースＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）に培養して維持した。脂肪細胞に分化させるために１０万個細胞／ｍｌ密度の３Ｔ３－Ｌ１を１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）と高グルコースＤＭＥＭで２日間細胞を密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）させた後、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（３－ｉｓｏｂｙｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌ ｘａｎｔｈｉｎｅ）、０．５μＭデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、５μｇ／ｍｌインシュリン（ＭＤＩ）を添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭを入れて２日間培養し、５μｇ／ｍｌインシュリン（Ｉ）のみ添加した１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭに４日さらに培養した後に、１０％ＦＢＳ／高グルコースＤＭＥＭのみを入れて再び６日をさらに培養して、総１０日間培養して脂肪細胞に分化させた。細胞を密集させて培養させた後に培地を取り替えるたびに化合物を１０μＭの濃度で処理した。
【0108】
また、Ｈｅｐ Ｇ２肝細胞をｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐが含まれている２４ ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに接種し、１ｍＭのｏｌｅｉｃ ａｃｉｄと０．５ｍＭのｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄが混合されたＤＭＥＭ培地で２４時間培養して脂肪の蓄積を誘導した後、それぞれの化合物を１０μＭ処理して２４時間を追加的に培養した。
その後、各細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて１５分間固定し、２％ＢＳＡが含まれているＰＢＳ溶液で１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇが完了した後、１次抗体と反応させた。１次抗体反応は、ＬＣ３ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：３００、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩行った。１次抗体反応が終わったｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐをＰＢＳを用いて２回洗浄し、２次抗体（１：５００、ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳ）を常温で１時間反応させた。２次抗体反応終了後、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を常温で１０分間反応させた後、マウンティング媒質を用いてｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓにマウントした。染色された細胞は共焦点顕微鏡を用いてイメージを撮影し、その結果を図４に示した。
その後、各細胞をＰＢＳ溶液で２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて１５分間固定し、２％ＢＳＡが含まれているＰＢＳ溶液で１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇが完了した後、１次抗体と反応させた。１次抗体反応は、ＬＣ３ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（１：３００、Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用いて４℃で一晩行った。１次抗体反応が終わったｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐをＰＢＳを用いて２回洗浄し、２次抗体（１：５００、ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｒａｂｂｉｔ Ａｌｅｘａ ｆｌｏｕｒ ５５５、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ＵＳ）を常温で１時間反応させた。２次抗体反応終了後、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３を常温で１０分間反応させた後、マウンティング媒質を用いてｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓにマウントした。染色された細胞は共焦点顕微鏡を用いてイメージを撮影し、その結果を図４に示した。
【0109】
図４ａで、緑色の円形構造物は細胞内蓄積された脂肪滴を示し、３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞から脂肪細胞への分化過程によって蓄積されたのを確認することができる。脂肪細胞への分化完了と共に本発明の化合物を処理する場合、偽薬を処理した細胞に比べてリポファジーの活性程度を追跡できる標識者である赤色で染色されたＬＣ３が増加したのを確認することができる。また、脂肪滴とＬＣ３の重畳された程度を比較してみれば、偽薬を処理した細胞に比べて本発明の化合物を処理する場合、重畳された程度が顕著に増加したのを確認することができる。したがって、３Ｔ３－Ｌ１脂肪細胞に生成された脂肪滴が本発明による化合物によって増加されたリポファジー作用を通じて大きさと数が減少したことが分かった。
【0110】
また、図４ｂで、緑色の円形構造物は細胞内蓄積された脂肪滴を示し、脂肪酸の一種であるｏｌｅｉｃ ａｃｉｄとｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄを処理することによってＢＳＡを処理した統制群に比べて脂肪滴の蓄積が誘導されたのを確認することができる。Ｏｌｅｉｃ ａｃｉｄとｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄを処理した後に本発明による化合物を処理する場合、リポファジーの活性程度を追跡できる標識者である赤色で染色されたＬＣ３が増加したのを確認することができる。また、緑色で染色された脂肪滴のイメージと赤色で染色されたＬＣ３のイメージを重畳して示したイメージを通じてリポファジーの標識者であるＬＣ３が脂肪滴の表面に位置していることが分かる。したがって、本発明の化合物によって示された脂肪滴の数と大きさの減少効果はリポファジー作用によって媒介されたことが分かった。
【0111】
また、本発明による化合物の処置による脂肪滴の除去がリポファジー作用による結果であるのを確認するために、脂肪前駆細胞から分化して脂肪滴が蓄積された脂肪細胞に本発明による化合物と共にリポファジー作用の抑制剤であるＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎを５ｎＭの濃度で処理した後、脂肪滴の除去効果が示されないのを確認して、その結果を図５に示した。
【0112】
図５で、赤色円形構造物が脂肪滴を示し、本発明の化合物によって減少した脂肪滴がｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎを処理することによって減少しないのを示す。したがって、本発明による化合物を処理した場合、脂肪滴の数と大きさの減少効果が示されないことから、本化合物の脂肪滴除去効果はリポファジー作用によって起こったことが分かった。
【0113】
実験例５：高脂肪飼料摂取マウスで本発明の化合物の体重減量効果分析
実験用マウスに肥満を誘導するために６週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスをソウル大学校実験動物資源研究センターから分譲を受けて、無作為割り当てによって一般飼料摂取グループ（ＬＦＤ）と高熱量食餌摂取グループ（ＨＦＤ）に分けた後、高脂肪摂取グループは再び偽薬処理群と本発明の化合物の処理群に分類して総３個のグループに分けて肥満誘導および化合物処理を同時に行った。これによって、本化合物が過度に流入される脂肪を効果的に除去して肥満を予防することができるか分析した。
実験用マウスに肥満を誘導するために６週齢の野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスをソウル大学校実験動物資源研究センターから分譲を受けて、無作為割り当てによって一般飼料摂取グループ（ＬＦＤ）と高熱量食餌摂取グループ（ＨＦＤ）に分けた後、高脂肪摂取グループは再び偽薬処理群と本発明の化合物の処理群に分類して総３個のグループに分けて肥満誘導および化合物処理を同時に行った。これによって、本化合物が過度に流入される脂肪を効果的に除去して肥満を予防することができるか分析した。
【0114】
具体的に、分譲を受けたマウスは飼育ケージで１週間の適応期間を経た後、水分の摂取は自由に行われるようにし、飼料は総熱量（４．６０ｋｃａｌ／ｇ）の６０％が脂肪から構成された高脂肪飼料（蛋白質：１０％、炭水化物：３０％）と総熱量（３．８ｋｃａｌ／ｇ）の１７．２％が脂肪から構成された一般飼料（蛋白質：１８．８％、炭水化物：６３．９％）をそれぞれ供給した。肥満の予防および治療効果などを評価するために、本発明の化合物をＤＭＳＯに１μＬ／ｍｇ（ｖ／ｗ）で溶かした後、ＰＢＳに希釈してマウスの体重１ｇ当り２０μｇの濃度で週３回腹腔投与した。偽薬処理群は、同量のＤＭＳＯをＰＢＳに希釈して投与した。高脂肪食餌摂取による体重の増加および本発明の化合物投与による体重増加阻害効果を評価するために週３回マウスの体重を測定し、マウスの体内脂肪除去効果を検証するために最終投与後、８時間の空腹時間を含んで２４時間後にＣＯ２の過多供給による安楽死を誘導し、開腹して体脂肪の変化を観察した。高脂肪飼料および本発明による化合物の投与による体脂肪除去効果に対する結果、体重変化、飼料摂取量の差および伸張の差は、それぞれ図６、７、８、９、１０、１１に示した。
【0115】
図６に示されているように、本発明による化合物を投与した場合、偽薬処理群に比べて蓄積された腹部脂肪の大きさが顕著に減少したのを確認することができる。体脂肪の顕著な減少は窮極的に体重減少を招き、これに対する結果は図７に示した。
【0116】
飼料の摂取量には有意差が示されないことから、図８～１０に示されているように、白色脂肪組織の重量減量による体重の減少が脂肪の体内流入量の減少による現象ではない、体内で白色脂肪組織の消滅が直接発生していることが分かった。これによって、他の組織には影響を与えなく脂肪組織の重量のみを減少させたことが分かった。
【0117】
また、本発明による化合物によって減少した体重の比率、身長の変化、飼料摂取量の変化を図１１に示した。このような結果は体重減少効果が飼料摂取の減少に起因したのかを判断するために飼料摂取量を調べた結果であり、有意差が示されなかったのを示した。
【0118】
また、本発明の化合物による体重減少効果が血中脂質成分および血糖、組織の病的状態を把握するために偽薬群と化合物投与群マウスの血液を採取して検査した項目に対する結果を図１２に示した。これによって、血中中性脂肪の数値が有意に減少したのを確認した。
【0119】
実験例６：ＨｎＥ染色法を用いて高脂肪飼料摂取マウスの組織で本発明の化合物の脂肪滴除去効果分析
本発明の化合物によって組織内蓄積された脂肪滴の除去効果を確認するためにＨｎＥ染色法によって先に実験例５のマウスの肝組織を観察してその結果を図１３に示した。図１３で黄色の矢印で表示された白色の円形構造物が脂肪滴を示し、本発明の化合物の処理によって肝細胞内に蓄積された脂肪滴の大きさと数が減少したことが分かる。
本発明の化合物によって組織内蓄積された脂肪滴の除去効果を確認するためにＨｎＥ染色法によって先に実験例５のマウスの肝組織を観察してその結果を図１３に示した。図１３で黄色の矢印で表示された白色の円形構造物が脂肪滴を示し、本発明の化合物の処理によって肝細胞内に蓄積された脂肪滴の大きさと数が減少したことが分かる。
【0120】
本発明の化合物によって脂肪細胞の大きさが減少したのを確認するためにＨｎＥ染色法によって先に実験例５のマウスの脂肪組織を観察してその結果を図１４に示した。図１４で青色の矢印と黒色および黄色の点で表示された構造物が脂肪組織内の脂肪細胞を示し、化合物の処理によって脂肪細胞の大きさが減少したことが分かる。
【0121】
実験例７：免疫組織化学染色法を用いてリポファジー作用による脂肪滴除去効果分析
先に実験例５のマウスを解剖検査して肝で脂肪滴の大きさ減少または除去が起こるか免疫組織化学染色法によって分析した。免疫組織化学染色法のために使用された染色溶液はＳｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈから購入した。全ての過程は室温でパラフィンに包埋させた肝組織の５μｍ切片上で行われた。抗原再生は免疫組織化学染色法に先立ちウォーターバスで１００℃で１５分間ホルマリン固定組織上で行われた。細胞内過酸化酵素活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を水素過酸化酵素で遮断した。一次抗体をＨＲＰ－結合重合体で検出してＤＡＢで現像した。その後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、多段階アルコールで脱水させた後、マウンティング媒質でマウントした。その結果を図１５に示した。図１５で、黄色四角形で表示された地域で脂肪滴の表面に茶色で染色されたＬＣ３蛋白質が位置していることが分かった。これによって、脂肪滴の表面で発生するリポファジー作用によって直接的に脂肪滴の除去が起こっていることが分かった。
先に実験例５のマウスを解剖検査して肝で脂肪滴の大きさ減少または除去が起こるか免疫組織化学染色法によって分析した。免疫組織化学染色法のために使用された染色溶液はＳｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈから購入した。全ての過程は室温でパラフィンに包埋させた肝組織の５μｍ切片上で行われた。抗原再生は免疫組織化学染色法に先立ちウォーターバスで１００℃で１５分間ホルマリン固定組織上で行われた。細胞内過酸化酵素活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を水素過酸化酵素で遮断した。一次抗体をＨＲＰ－結合重合体で検出してＤＡＢで現像した。その後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、多段階アルコールで脱水させた後、マウンティング媒質でマウントした。その結果を図１５に示した。図１５で、黄色四角形で表示された地域で脂肪滴の表面に茶色で染色されたＬＣ３蛋白質が位置していることが分かった。これによって、脂肪滴の表面で発生するリポファジー作用によって直接的に脂肪滴の除去が起こっていることが分かった。
【0122】
また、過度な脂肪滴の蓄積によって引き起こされる肝組織内の炎症症状において、本発明の化合物の緩和効果を観察するために組織免疫化学染色法によって炎症細胞である大食細胞の発現様相を観察してその結果を図１６に示した。図１６で、茶色で標識された細胞が大食細胞を示し、本発明による化合物の処理によって肝組織に蓄積された大食細胞が減少することが分かった。これによって、本発明の化合物の処理によって肝組織に蓄積された大食細胞が減少することが分かる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
