特許 7029618 プログラム可能な遺伝子発現システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-24

(45)【発行日】2022-03-04

(54)【発明の名称】プログラム可能な遺伝子発現システム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20220225BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20220225BHJP

   C12Q 1/48 20060101ALN20220225BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A ZNA

C12N15/09 Z

C12Q1/48 Z

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2019556767

(86)(22)【出願日】2018-11-30

(86)【国際出願番号】 JP2018044292

(87)【国際公開番号】W WO2019107568

(87)【国際公開日】2019-06-06

【審査請求日】2021-11-19

(31)【優先権主張番号】P 2017232193

(32)【優先日】2017-12-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(31)【優先権主張番号】P 2018135358

(32)【優先日】2018-07-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】517422135

【氏名又は名称】多田隈 尚史

(74)【代理人】

【識別番号】100179039

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 洋介

(74)【代理人】

【識別番号】100203253

【弁理士】

【氏名又は名称】村岡 皓一朗

(72)【発明者】

【氏名】多田隈 尚史

(72)【発明者】

【氏名】増渕 岳也

(72)【発明者】

【氏名】原田 慶恵

【審査官】鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】多田隈 尚史，DNA-蛋白質ハイブリッドナノシステムを用いた，次世代無細胞蛋白質翻訳系の開発，Rep. Grant. Res., Asahi Glass Foundation，2014年，No. 17，pp. 1-3

【文献】LI J., et al.，Engineering nucleic acid structures for programmable molecular circuitry and intracellular biocomput，Nat. Chem.，2017年09月25日，Vol. 9，pp. 1056-1067

【文献】NGUYEN T. M., et al.，Design of Modular Protein Tags for Orthogonal Covalent Bond Formation at Specific DNA Sequences，J. Am. Chem. Soc.，2017年05月18日，Vol. 139，pp. 8487-8496

【文献】MASUBUCHI T., et al.，Construction of integrated gene logic-chip，Nat. Nanotechol.，2018年10月，Vol. 13，pp. 933-940

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

Ｃ１２Ｑ １／４８

Ｃ１２Ｎ １５／０９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

遺伝子回路用のデバイスであって、前記デバイスは：
触媒、標的遺伝子、及び形状変化要素を有して構成される開閉機構とベース部材とを有し、
前記触媒は、前記標的遺伝子と接触することで前記標的遺伝子の発現を誘導するものであり、
前記形状変化要素は、第1部位と第2部位を有し、かつ、活性化源の作用によって、前記第1部位と第2部位との間の距離が変化する構造を有するものであり、
前記開閉機構は、前記形状変化要素を可動部として有し、
前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が、前記ベース部材に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側は、前記ベース部材に固定され、
前記形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されているか、又は
前記形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている、前記デバイス。

【請求項2】

遺伝子回路用のデバイスであって、前記デバイスは：
触媒、標的遺伝子、及び形状変化要素を有して構成される開閉機構とベース部材とを有し、
前記触媒は、前記標的遺伝子と接触することで前記標的遺伝子の発現を誘導するものであり、
前記形状変化要素は、第１部位と第２部位を有し、かつ、活性化源の作用によって、前記第１部位と第２部位との間の距離が変化する構造を有するものであり、
前記開閉機構は、前記形状変化要素を可動部として有し、
互いに独立した第１の可動部としての第１の形状変化要素と、第２の可動部としての第２の形状変化要素を有し、
前記触媒が、第１の可動部における第１の形状変化要素の第１部位の側に固定され、
前記標的遺伝子が、第２の可動部における第２の形状変化要素の第１部位の側に固定され、
第１及び第２の可動部における各形状変化要素の第２部位の側が、前記ベース部材に固定され、
各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されているか、又は
各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている、前記デバイス。

【請求項3】

遺伝子回路用のデバイスであって、前記デバイスは：
触媒、標的遺伝子、及び形状変化要素を有して構成される開閉機構と可撓性を有するベース部材とを有し、
前記触媒は、前記標的遺伝子と接触することで前記標的遺伝子の発現を誘導するものであり、
前記形状変化要素は、第1部位と第2部位を有し、かつ、活性化源の作用によって、前記第1部位と第2部位との間の距離が変化する構造を有するものであり、
前記開閉機構は、前記形状変化要素を可動部として有し、
前記ベース部材に前記触媒と標的遺伝子とが配置されており、前記形状変化要素の第１部位と第２部位が前記ベース部材に固定され、第１部位と第２部位との間の距離の減少、又は増大が前記ベース部材を変形させ、前記ベース部材の変形によって触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている、前記デバイス。

【請求項4】

前記可動部が、互いに接続されたｎ個の形状変化要素を有し、ここで、ｎは２以上の整数であり、
前記ｎ個の形状変化要素のうちの少なくとも１個の形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、
請求項１又は２に記載のデバイス。

【請求項5】

前記ｎ個の形状変化要素のうちの全ての形状変化要素のそれぞれの第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、請求項４に記載のデバイス。

【請求項6】

前記可動部が、互いに接続されたｎ個の形状変化要素を有し、ここで、ｎは３以上の整数であり、
前記ｎ個の形状変化要素のうちの半数以上の形状変化要素のそれぞれの第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、
請求項１又は２に記載のデバイス。

【請求項7】

前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の第２アンカー部に固定され、
可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、ベース部材には、可動部の第３固定部が届く位置に第３アンカー部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部は、互いに結合可能であるようにそれぞれ構成されている、
請求項１に記載のデバイス。

【請求項8】

前記第３アンカー部が、前記第１アンカー部と第２アンカー部との間に位置する、請求項７に記載のデバイス。

【請求項9】

前記第３アンカー部と第３固定部は、結合用の活性化源の作用によって互いに結合可能である、請求項７又は８に記載のデバイス。

【請求項10】

前記第３固定部が前記第３アンカー部に結合した場合に、前記第３アンカー部と前記第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能である、請求項７又は８に記載のデバイス。

【請求項11】

前記可動部が、接続された複数の形状変化要素を有し、前記第３固定部が、複数の形状変化要素同士の間に位置する、請求項７～１０のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項12】

前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の第２アンカー部に固定され、
ベース部材には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、
ベース部材における第３アンカー部の位置は、第１固定部が第１アンカー部に届かないように選択されており、解放用の活性化源の作用によって第３アンカー部と第３固定部とが互いに離脱した場合に、第１固定部が第１アンカー部に届きそれにより前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するように構成されている、
請求項１に記載のデバイス。

【請求項13】

前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の第２アンカー部に固定され、
ベース部材には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、
ベース部材における第３アンカー部の位置は、第１アンカー部と第３アンカー部との間の距離が、第１固定部と第３固定部との間の距離に等しいか長くなるように選択され、それにより、前記標的遺伝子と前記触媒とが接するように構成されている、
請求項１に記載のデバイス。

【請求項14】

前記解放用の活性化源の作用によって第３アンカー部と第３固定部とが互いに離脱した場合に、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の変化によって、第１固定部から第２固定部までの距離が、第１アンカー部から第２アンカー部までの距離よりも短くなるか又は長くなる、
請求項１３に記載のデバイス。

【請求項15】

前記ベース部材が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、ペプチド、タンパク質、若しくはポリマー、又はそれらの組み合わせからなるナノ構造物である、請求項１～３及び請求項７～１４のいずれか1項に記載のデバイス。

【請求項16】

前記触媒が、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、人工核酸ポリメラーゼ、又はポリマー合成酵素であり、前記形状変化要素が核酸、人工核酸、又はポリマーであり、前記活性化源が、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、人工核酸、ポリマーＬａｃＩタンパク質、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）化合物、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抗生物質、又は光である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか１項に記載のデバイスを１以上有し、前記１以上のデバイスの開閉機構によって論理演算を行うよう構成された論理回路を有する、遺伝子回路。

【請求項18】

下記（Ｉ）の論理回路及び下記（ＩＩ）の論理回路のうちの、一方又は両方を有する、
請求項１７に記載の遺伝子回路。
（Ｉ）上記１以上のデバイスによって構成された、ＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ/ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、及びＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチから選ばれる１以上のスイッチを有する論理回路
（ＩＩ）上記１以上のデバイスによって構成された、ＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ/ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、及びＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチから選ばれる２以上のスイッチの組み合わせを有する論理回路

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、プログラム可能な遺伝子発現システムに関し、具体的には、遺伝子回路用のデバイス、該デバイスを含む遺伝子回路に関する。

【背景技術】

【0002】

合成生物学において、遺伝子発現の調節は、基本的なゴールである。遺伝子発現の調節において鍵となるステップは、環境を感知し、情報を演算し、結果を出力することである。そのような機能を得るためには、労力をかけて触媒と基質遺伝子とを組み合わせたネットワークを構築する必要がある。

【0003】

従来の遺伝子回路における遺伝子発現システムでは、関連する因子(触媒や基質)が、溶液中を自由に漂う反応拡散系を基にしており、生化学反応が起こるためには、拡散によって互いに見つけ合う必要がある。従って、このシステムには、（１）生化学反応が、触媒、基質及び他の成分の濃度に依存する、及び（２）触媒と基質の非特異的結合が、遺伝子回路間のクロストークを引き起こすという、２つの大きな欠点がある。そのため、有用な遺伝子回路を開発するためには、構成要素の濃度及び活性の微調整という大変労力と時間のかかる試みが必要であり、複数の直交する遺伝子反応を構築する際の限界に繋がっていた。また、反応速度は触媒と基質の衝突頻度に依存するため、触媒と基質の濃度が低い場合には、反応速度の低下がみられ、多段階反応の制限に繋がる。さらに、従来の遺伝子回路では、遺伝子発現の調節において鍵となる環境を感知するセンサーが、触媒の基質である必要があり、該センサーに使用できる材料が極めて制限されるという問題もあった。非特許文献１では、これらの問題を解決するために、半導体設計の手法を用い、自動設計の手法を導入したが、非特異相互作用を排除できない為、複雑度に限界があった。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Nielsen et al., Science. 352, aac7341, 2016

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

従来の遺伝子回路における遺伝子発現システムが有する、（１）生化学反応が、触媒、基質及び他の成分の濃度に依存する、及び（２）触媒と基質の非特異的結合が、遺伝子回路間のクロストークを引き起こすという２つの大きな欠点を克服することができる、環境を感知するセンサーの材料的制約が極めて低減された新たな遺伝子回路用のデバイス、及び該デバイスを含む遺伝子回路を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、上記（１）及び（２）の欠点を克服するために、触媒と基質間の分子間距離を制御することに着目し、その制御方法について検討した。鋭意研究を行った結果、伸縮動作や、展開・折り畳み動作を行わせることが可能であるリンカーを用いることで、触媒と基質間の分子間距離が制御でき、その結果、両者の接触頻度が制御され、クロストークの発生が抑えられた適切な遺伝子発現を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。また、リンカーを用いて触媒と基質の分子間距離を制御する手法を見出したため、環境を検知するセンサーが触媒の基質である必要性がなくなり、材料の制約を著しく低減させることにも成功した。さらに、本発明者らは、触媒と基質間の分子間距離を任意に変更することで、論理演算を変更する方法も見出し、再プログラミングという機能を付加することにも成功した。

【0007】

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］遺伝子回路用のデバイスであって、前記デバイスは：
触媒、標的遺伝子、及び形状変化要素を有して構成される開閉機構を有し、
前記触媒は、前記標的遺伝子と接触することで前記標的遺伝子の発現を誘導するものであり、
前記形状変化要素は、第１部位と第２部位を有し、かつ、活性化源の作用によって、前記第１部位と第２部位との間の距離が変化する構造を有するものであり、
前記開閉機構は、前記形状変化要素を可動部として有し、前記形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の変化に応じて、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れる開閉動作を実行するように構成されている、前記デバイス。
［２］前記デバイスが、ベース部材をさらに有し、
前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が、前記ベース部材（の１つの面上）に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側は、前記ベース部材（の前記面）に固定され、
前記形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されているか、又は
前記形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている
［１］に記載のデバイス。
［３］前記デバイスが、ベース部材をさらに有し、かつ、互いに独立した第１の可動部としての第１の形状変化要素と、第２の可動部としての第２の形状変化要素を有し、
前記触媒が、第１の可動部における第１の形状変化要素の第１部位の側に固定され、
前記標的遺伝子が、第２の可動部における第２の形状変化要素の第１部位の側に固定され、
第１及び第２の可動部における各形状変化要素の第２部位の側が、前記ベース部材（の１つの面上に互いに離れて）に固定され、
各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されているか、又は
各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、前記触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている、
［１］に記載のデバイス。
［４］前記デバイスが、可撓性を有する（シート状の）ベース部材をさらに有し、
前記（シート状の）ベース部材（の１つの面上、一方の面上、又はある面上）に前記触媒と標的遺伝子とが（互いに離れて）配置されており、前記形状変化要素の第１部位と第２部位が（前記シート状の）ベース部材（の互いに同じ面上に互いに離れて）に固定され、第１部位と第２部位との間の距離の減少、又は増大が（前記シート状の）ベース部材を変形させ、（前記シート状の）ベース部材の変形によって触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように、前記開閉機構が構成されている、
［１］に記載のデバイス。
［５］前記可動部が、互いに接続されたｎ個の形状変化要素を有し、ここで、ｎは２以上の整数であり、
前記ｎ個の形状変化要素のうちの少なくとも１個の形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、
［１］～［３］のいずれかに記載のデバイス。
［６］前記ｎ個の形状変化要素のうちの全ての形状変化要素のそれぞれの第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、［５］に記載のデバイス。
［７］前記可動部が、互いに接続されたｎ個の形状変化要素を有し、ここで、ｎは3以上の整数であり、
前記ｎ個の形状変化要素のうちの半数以上の形状変化要素のそれぞれの第１部位と第２部位との間の距離が変化したときに、前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている、
［１］～［３］のいずれかに記載のデバイス。
［８］前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材（の１つの面上）の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の（前記面上の）第２アンカー部に固定され、
可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、ベース部材（の前記面上）には、可動部の第３固定部が届く位置に第３アンカー部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部は、互いに結合可能であるようにそれぞれ構成されている、
［２］に記載のデバイス。
［９］前記第３アンカー部が、前記第１アンカー部と第２アンカー部との間に位置する、［８］に記載のデバイス。
［１０］前記第３アンカー部と第３固定部は、結合用の活性化源の作用によって互いに結合可能である、［８］又は［９］に記載のデバイス。
［１１］前記第３固定部が前記第３アンカー部に結合した場合に、前記第３アンカー部と前記第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能である、［８］又は［９］に記載のデバイス。
［１２］前記可動部が、（直列状に）接続された複数の形状変化要素を有し、前記第３固定部が、複数の形状変化要素同士の間に位置する、［８］～［１１］のいずれかに記載のデバイス。
［１３］前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材（の１つの面上）の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材（の前記面上）の第２アンカー部に固定され、
ベース部材（の前記面上）には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、
ベース部材（の前記面上）における第３アンカー部の位置は、第１固定部が第１アンカー部に届かないように選択されており、解放用の活性化源の作用によって第３アンカー部と第３固定部とが互いに離脱した場合に、第１固定部が第１アンカー部に届きそれにより前記標的遺伝子と前記触媒とが相対的に近づいて接するように構成されている、
前記［２］に記載のデバイス。
［１４］前記触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が前記ベース部材（の１つの面上）の第１アンカー部に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、
可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の（前記面上の）第２アンカー部に固定され、
ベース部材（の前記面上）には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、
第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、
ベース部材（の前記面上）における第３アンカー部の位置は、第１アンカー部と第３アンカー部との間の距離が、第１固定部と第３固定部との間の距離に等しいか長くなるように選択され、それにより、前記標的遺伝子と前記触媒とが接するように構成されている、前記［２］に記載のデバイス。
［１５］前記解放用の活性化源の作用によって第３アンカー部と第３固定部とが互いに離脱した場合に、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の変化によって、第１固定部から第２固定部までの距離が、第１アンカー部から第２アンカー部までの距離よりも短くなるか又は長くなる、
前記［１４］に記載のデバイス。
［１６］前記ベース部材が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、ペプチド、タンパク質、若しくはポリマー、又はそれらの組み合わせからなるナノ構造物である、［２］～［４］及び［８］～［１５］のいずれかに記載のデバイス。
［１７］前記触媒が、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、人工核酸ポリメラーゼ、又はポリマー合成酵素であり、前記形状変化要素が核酸、人工核酸、又はポリマーであり、前記活性化源が、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、人工核酸、ポリマーＬａｃＩタンパク質、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）化合物、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ抗生物質、又は光である、[１]～［１６］のいずれかに記載のデバイス。
［１８］［１］～［１７］のいずれかに記載のデバイスを１以上有し、前記１以上のデバイスの開閉機構によって論理演算を行うよう構成された論理回路を有する、遺伝子回路。
［１９］下記（Ｉ）の論理回路及び下記（ＩＩ）の論理回路のうちの、一方又は両方を有する、［１８］に記載の遺伝子回路。
（Ｉ）上記１以上のデバイスによって構成された、ＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ/ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、及びＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチから選ばれる１以上のスイッチを有する論理回路
（ＩＩ）上記１以上のデバイスによって構成された、ＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ/ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、及びＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチから選ばれる２以上のスイッチの組み合わせを有する論理回路

【発明の効果】

【0008】

本発明のデバイスは、触媒と標的遺伝子との互いの位置関係又は接触関係を制御し得るよう構成された開閉機構を有することを特徴とする。該開閉機構は、
（ｉ）互いに離れた状態（開状態）にある触媒と標的遺伝子とを互いに近づけて接触させる動作（即ち、開いた回路を閉じる閉動作）を行うように構成されているか、又は、
（ｉｉ）互いに接触した状態（閉状態）にある触媒と標的遺伝子とを切り離す動作（即ち、閉じた回路を開く開動作）を行うように構成されている。
触媒と標的遺伝子とを互いに近づけて接触させる動作には、両者の接触を完了させる動作のみならず、両者が接触する確率をより高くする動作が含まれる。また、互いに接触した状態にある触媒と標的遺伝子とを切り離す動作には、互いに接触する確率が高い状態にある触媒と標的遺伝子に対して、両者が接触する確率をより低くする動作が含まれる。
開閉機構の前記（ｉ）、（ｉｉ）の閉動作と開動作（開閉動作）を達成するための可動部（駆動源）として、本発明では１以上の形状変化要素を用いている。

【0009】

形状変化要素は、第１の部位と第２の部位を有し、典型的な例であるステムループ構造のように、（例えば、外部から加えられる）活性化源の作用によって、第１部位と第２部位との間の距離が変化する構造を有するものである。第１部位と第２部位との間の距離の変化は、形状変化要素の伸縮動作による距離の増減であってもよいし、形状変化要素の展開／折り畳み動作による距離の増減であってもよい。例えば、ステムループ構造の場合には、その両端部（即ち、ステムの２つの直線部分のそれぞれの基端部）だけに着目すると、該両端部同士の間の距離が単純に増減すると解することもできるし、また、ステムループ構造全体の形態に着目すると、ステムループ構造全体の展開と折り畳み動作によって、該両端部同士の間の距離が増減すると解することもできる。
形状変化要素は、複数連なって１つの可動部を構成していてもよい。また、当該デバイスは、２以上の可動部を有していてもよい。１つのデバイス中に複数の形状変化要素が含まれている場合、それら複数の形状変化要素を１つの可動部と見なすか、任意の複数の可動部と見なすかは、各形状変化要素の動作、意図された目的、便宜上のグループ分けなどに応じて、適宜定めることができる。

【0010】

形状変化要素は、例えば、ＲＮＡにおけるステムループ構造のように全体の形状が変化し得る要素であってもよいし、その一端又は両端にさらにアーム部がつながった要素であってもよい。以下、前記ステムアンドループ構造のような全体の形状が変化し得る要素をセンサー部と呼び、形状の変化に寄与しないアーム部と区別する。よって、形状変化要素の態様としては、センサー部単独の態様、センサー部の片端にアーム部が接続された態様、センサー部の両端にそれぞれにアーム部が接続された態様などが挙げられる。
形状変化要素の第１部位と第２部位は、典型的な例では、センサー部の両端の部位が挙げられるが、アーム部を含んだ形状変化要素中の任意の２つの部位であってもよく、（例えば、外部から加えられる）活性化源の作用によって、それら２つの部位の間の距離が変化し得るように選択された部位であればよい。

【0011】

開閉機構は、可動部である形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離が変化することを利用して、触媒と標的遺伝子とを開閉するための種々の構成を有する機構として構築され得る。
例えば、形状変化要素の第１部位と第２部位は、互いの間の距離が増減するだけでなく、ステムループ構造におけるステム部分の２つの基端部のように、互いに接触し離れることが可能である。よって、そのような互いに接触し離れることが可能な形状変化要素では、該形状変化要素の第１部位に触媒を付与し、第２部位に標的遺伝子を付与すれば、触媒と標的遺伝子との間の開閉動作が得られる。また、形状変化要素の第１部位と第２部位とが互いに直接的に接触し得ず、単に両者の間の距離が増減するだけの関係にある場合であっても、この距離の増減を利用して、例えば、バイメタル構造のように、触媒と標的遺伝子とを開閉する構成を構築することができる。
また、形状変化要素の第１部位と第２部位とが互いに直接的に接触し得ず、単に両者の間の距離が増減するだけの関係にある場合、第１部位をあるベース部材の面上の基準位置に固定すれば、第２部位と該基準位置との間の距離が増減する。よって、第２部位に触媒（又は標的遺伝子）を付与し、前記基準位置から所定の距離に存在する他の位置に標的遺伝子（又は触媒）を付与すれば、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増減に応じて、触媒と標的遺伝子とを接触させまた離脱させることが可能になる（触媒と標的遺伝子とが接触する確率を増減することが可能になることも含まれる）。前記したベース部材の基準位置と、そこから所定の距離に存在する他の位置は、共に同じ１つのベース部材上の２点であってもよいし、互いに所定の位置関係にある２つの部材上のそれぞれの１点であってもよい。

【0012】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスはベース部材を有する。本態様では、触媒（標的遺伝子でもよい）がベース部材の１つの面上に固定され、標的遺伝子（触媒でもよい）が可動部における形状変化要素の第１部位の側に固定される。また、可動部における形状変化要素の第２部位の側が、前記ベース部材の前記面上に固定される。これにより、例えば、可動部全体が短いために、触媒と標的遺伝子とが互いに離れている場合、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。また、触媒と標的遺伝子とが互いに接触している場合、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離（以下、形状変化要素の長さともいう）の増大によって、触媒と標的遺伝子との接触を解除することができる。逆に、可動部全体が長過ぎるために、触媒と標的遺伝子とが互いに離れている場合、形状変化要素の長さの減少によって、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。また、触媒と標的遺伝子とが互いに接触している場合、形状変化要素の長さの減少によって、触媒と標的遺伝子とを引き離すことができる。

【0013】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスはベース部材を有し、かつ、互いに独立した２つの可動部（第１の可動部、第２の可動部）を有する。本態様では、触媒が、第１の可動部における第１の形状変化要素の第１部位の側に固定され、標的遺伝子が、第２の可動部における第２の形状変化要素の第１部位の側に固定される。一方、各形状変化要素の第２部位の側は、ベース部材の１つの面上に互いに離れて固定される。これにより、例えば、両方の可動部全体がそれぞれ短いために、触媒と標的遺伝子とが互いに離れている場合、形状変化要素の長さの増大によって、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。また、触媒と標的遺伝子とが互いに接触している場合、形状変化要素の長さの増大によって、触媒と標的遺伝子との接触を解除することができる。逆に、両方の可動部全体がそれぞれ長過ぎるために、触媒と標的遺伝子とが互いに離れている場合、形状変化要素の長さの減少によって、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。また、触媒と標的遺伝子とが互いに接触している場合、形状変化要素の長さの減少によって、触媒と標的遺伝子とを引き離すことができる。

【0014】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスは、可撓性を有するベース部材を有する。該ベース部材の１つの面（第１面）に触媒と標的遺伝子とが互いに離れて配置される。そして、該ベース部材の１つの面又はその他の面（第２面）には、形状変化要素の第１部位と第２部位が同じ面上に互いに離れて固定される。これにより、例えば、触媒と標的遺伝子と形状変化要素とがベース部材の同じ面（例えば、第１面）に配置される場合、形状変化要素の長さが減少すると、ベース部材は湾曲し、同じ面上の触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができ、形状変化要素の長さが増大すると、湾曲が解除されるか、逆に反り、触媒と標的遺伝子とを引き離すことができる。一方、触媒と標的遺伝子とがベース部材の第１面に配置され、形状変化要素が裏面である第２面に配置される場合、形状変化要素の長さが減少すると、ベース部材は変化し、第１面の側にある触媒と標的遺伝子とを引き離すことができ、形状変化要素の長さが増大すると、シート状のベース部材は逆に変化し、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。

【0015】

上記本発明の好ましい態様に含まれるより具体的な態様として、例えば、可撓性を有するベース部材は、シート状のベース部材である。該シート状のベース部材の一方の面（第１面）に触媒と標的遺伝子とが互いに離れて配置される。そして、該シート状のベース部材の第１面又はその裏面（第２面）には、形状変化要素の第１部位と第２部位が同じ面上に互いに離れて固定される。これにより、例えば、触媒と標的遺伝子と形状変化要素とがベース部材の同じ面（例えば、第１面）に配置される場合、形状変化要素の長さが減少すると、シート状のベース部材は湾曲し、同じ面上の触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができ、形状変化要素の長さが増大すると、湾曲が解除されるか、逆に反り、触媒と標的遺伝子とを引き離すことができる。一方、触媒と標的遺伝子とがベース部材の第１面に配置され、形状変化要素が裏面である第２面に配置される場合、形状変化要素の長さが減少すると、シート状のベース部材は湾曲し、第１面の側にある触媒と標的遺伝子とを引き離すことができ、形状変化要素の長さが増大すると、シート状のベース部材は逆に湾曲し、触媒と標的遺伝子とを近づけて接触させることができる。

【0016】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスはベース部材を有し、触媒（標的遺伝子でもよい）がベース部材の１つの面上の第１アンカー部に固定され、標的遺伝子（触媒でもよい）が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の前記面上の第２アンカー部に固定される。さらに、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられ、ベース部材の前記面上には、可動部の第３固定部が届く位置に第３アンカー部が設けられる。ベース部材の第３アンカー部と、可動部の第３固定部とは、互いに結合可能である。これにより、第３アンカー部が第３固定部に結合しない状態では、可動部全体の動作の固定端部は第２固定部であるが、第３アンカー部が第３固定部に結合すると、可動部全体の動作の固定端部は第３固定部へと移る。この固定端部の移動により、（例えば、可動部全体のうち、自由に動くことができる部分の長さが短くなり、可動部の動作範囲が制限され、）触媒と標的遺伝子とが接触する確率をより高めることが可能になる。
また、可動部が複数の形状変化要素を有する場合、それら形状変化要素同士の間に第３固定部を設ければ、触媒と標的遺伝子との開閉のために作動させるべき形状変化要素を別の形状変化要素へと変化させることも可能になる。触媒と標的遺伝子との開閉という出力に対して、形状変化要素が変化するということは、入力の条件の変化を意味し、それは、１つの回路における入出力の論理の変化を意味する。

【0017】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスはベース部材を有し、触媒（標的遺伝子でもよい）がベース部材の１つの面上の第１アンカー部に固定され、標的遺伝子（触媒でもよい）が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の前記面上の第２アンカー部に固定される。さらに、ベース部材の前記面上には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられる。第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、かつ、ベース部材の前記面上における第３アンカー部の位置は、第１固定部が第１アンカー部に届かないように選択されている。これにより、解放用の活性化源の作用によって第３アンカー部と第３固定部とが互いに離脱した場合に、第１固定部が第１アンカー部に届くことができ、標的遺伝子と触媒とが相対的に近づいて接することができる。この動作は、最初ＯＦＦであったスイッチが、解放用の活性化源の作用という入力によって、ＯＮになる動作であるということができる。

【0018】

本発明の好ましい態様では、当該デバイスはベース部材を有し、触媒（標的遺伝子でもよい）がベース部材の１つの面上の第１アンカー部に固定され、標的遺伝子（触媒でもよい）が可動部における形状変化要素の第１部位の側にある第１固定部に固定され、可動部における形状変化要素の第２部位の側にある第２固定部が、前記ベース部材の前記面上の第２アンカー部に固定される。さらに、ベース部材の前記面上には第３アンカー部が設けられ、可動部の第１固定部と第２固定部との間には第３固定部が設けられる。第３アンカー部と第３固定部とは、解放用の活性化源の作用によって互いに離脱可能に結合されており、ベース部材の前記面上における第３アンカー部の位置は、第１アンカー部と第３アンカー部との間の距離が、第１固定部と第３固定部との間の距離に等しいか長くなるように選択される。これにより、第３アンカー部と第３固定部とが互いに結合された状態では、触媒と標的遺伝子とを高い確率で接触可能にし得るか、実際に接触させることができる。
この態様では、解放用の活性化源の作用によって、第３アンカー部と第３固定部とを互いに離脱させた場合に、可動部における自由に動くことができる部分の長さが長くなり、可動部の動作範囲の制限が解除され、触媒と標的遺伝子とが接触する確率をより低くすることが可能になる。また、第３アンカー部と第３固定部とを互いに離脱させ、かつ、形状変化要素の長さを変化させれば、第１固定部から第２固定部までの距離を、第１アンカー部から第２アンカー部までの距離よりも短くするか又は長くすることができる。これにより触媒と標的遺伝子とを接触状態から相対的に離れさせることができる。

【0019】

本発明のデバイスは、後述するように、ＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、ＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチなど、種々のスイッチや論理スイッチとして機能する。よって、当該デバイスを１以上用い、及び／又は、２以上組み合わせることによって、種々の論理演算が行われるように構成された論理回路を有する遺伝子回路を提供することができる。当該遺伝子回路としては、例えば、前記のＯＮスイッチ、ＯＦＦスイッチ、ＯＮ／ＯＦＦ切り替えスイッチ、ＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＮＡＮＤスイッチ、ＮＯＲスイッチ、ＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチから選ばれる１以上のスイッチを含んだ回路や、さらにこれらのスイッチを２以上任意に組み合わせた種々の論理演算を行う回路が例示される（前記２以上のスイッチは、同じスイッチが重複的に選択されたものでもよい）。当該遺伝子回路は、用途に応じて、前記したスイッチや回路を任意に含んでいてもよい。

【0020】

本発明によれば、環境を感知するセンサーの材料的制約が極めて低減された新しい遺伝子回路用デバイス、及び該デバイスを含む遺伝子回路を提供し、十分にクロストークが抑えられた制御された遺伝子発現を行うことができる遺伝子回路として、例えば、遺伝子疾患の治療や、バイオマーカー検出、バイオ医薬の効率的合成のために利用されることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１Ａ－Ｆは、Ｔ７チップの組立て及びその活性を示す。（図１Ａ）ＳＮＡＰリガンド・ハンドルを長方形のＤＮＡオリガミタイルの特定の位置に導入し、ＳＮＡＰｆタンパク質を融合したＴ７ＲＮＡＰ（Ｔ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}）を加えた。ＤＮＡオリガミとＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}の複合体(Ｔ７チップ)を、トーホールド溶出法を用いた磁気ビーズで精製した。（図１Ｂ）サンプルを１％アガロースゲル電気泳動によって分離した。結合しなかったフリーのＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}（左のゲル(Ｃｙ５チャンネル)の矢じり）が見られたので、精製段階で除去した。右のゲルの矢印(Ｃｙ３チャンネル)は、長方形タイル(Ｒｅｃｔ－ｔｉｌｅ)の位置を示す。（図１Ｃ）１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果でも、結合しなかったフリーＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}(矢じり)の除去を確認した。矢印は、結合したＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}の位置を示す。対照レーン（ｃｔｒｌ）はフリーのＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}の位置を示す。（図１Ｄ）Ｔ７チップのＡＦＭイメージでは、Ｔ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}は、左下部に結合していた。結合率は９５％（２２２／２３４タイル）であり、スケールバーは、２０ｎｍである。（図１Ｅ）Ｔ７チップの動態特性を評価する実験の模式図である。（図１Ｆ）Ｔ７チップ(下)の転写活性は、見かけのミカエリス・メンテン型であった。見かけのＫｍ値(１０１０ｎＭ)は、自由拡散系のＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}よりも高く、溶液中では、自由拡散系の外来基質遺伝子に対して、より低い親和性を示した。また、Ｖｍａｘ値（３４ｎｔ／ｓ）は、自由拡散系のＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}（６２ｎｔ／ｓ）よりも低かった（速度は、１０ｎＭのＴ７ＲＮＡPに相当に変換した値）。これらの結果は、Ｔ７チップが外来基質遺伝子を転写しにくいことを示している。

【図2】図２Ａ－Ｅは、遺伝子ナノチップ活性の特性及びその合理的設計を示す。（図２Ａ）５つの遺伝子ナノチップの分子配置を示す。黒丸と黒四角は、それぞれＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}と標的遺伝子の位置を示す。スケールバーは５０ｎｍである。（図２Ｂ）５’末端(灰色丸)及び３’末端(黒丸)で結合させた遺伝子の転写活性を示す。エラーバーは、３回の独立した実験の標準偏差を示す。転写活性は、１０ｎＭのＴ７ ＲＮＡＰに相当する値に変換した。（図２Ｃ）（左図）競合アッセイの模式図を示す。(右上図)４％尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ）の結果を示す。Ｅｎｄｏは、ナノチップに固定させたｓｆＧＦＰ遺伝子（９４２ｎｔ）の転写を、Ｅｘｏは、自由拡散系の競合ＤＨＦＲ遺伝子（６８２ｎｔ）の転写を示す。アッセイを転写バッファー中で行い、そしてナノチップの濃度は約１ｎＭであった。（右下図）Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥデータの定量は、ＤＮＡオリガミのチップ内遺伝子の有効濃度が２μＭより大きいことを示した。（図２Ｄ）（上図）Ｔ７遺伝子チップの模式図を示す。Ｐはプロモーター配列であり、Ｌｉｎｋｅｒは固定位置とプロモーター配列間の二本鎖リンカーＤＮＡである。（下図）最適なＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}と遺伝子間の距離は、リンカー長に依存している。アッセイは、転写バッファー中で行った。転写活性は、１０ｎＭのＴ７ＲＮＡＰに相当する値に変換した。（図２Ｅ）２遺伝子の発現比は、それぞれの遺伝子の分子配置を変更することで調節することができる。この実験においては、Ｔ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}(黒丸)とｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子(灰黒色長方形)の位置を固定し、ｓｆＧＦＰ遺伝子(灰色長方形)の位置を変化させた。従って、標的遺伝子の分子比又はプロモーター配列を変更する比率制御の従来の方法(挿入図を参照)とは対照的に、ナノチップは同じ材料を使うが、分子配置を変更する。アッセイをＰＵＲＥシステム中で行い、そしてナノチップの濃度は約１ｎＭであった。反応時間は３００、６００、１８００及び３６００秒（５、１０、３０、６０分）で、蛍光イメージを３６００秒で取得した。

【図3】図３Ａ－Ｂは、単一ナノチップが、人工細胞内で特定の遺伝子を発現できることを示す。（図３Ａ）（左図）実験で用いたマイクロ流体装置を示す。人工細胞、すなわちＰＵＲＥシステムを封入した油中水（ｗ／ｏ）滴を、空気圧を用いて作製した。スケールバーは、２０μｍである。（右図）各々の細胞で発現しているｓｆＧＦＰの蛍光強度を示す。ナノチップ活性(黒丸)を、ＤＮＡ開始型(灰色丸)及びｍＲＮＡ開始型(黒四角)のものと比較した。下部パネルは、０．８ｐＭのナノチップ濃度での細胞の代表的なイメージであり、ｓｆＧＦＰの蛍光の不均一な強度を示す（左半分）。右半分は、位相コントラストのイメージを示す。（図３Ｂ）示された標的遺伝子濃度での細胞数のヒストグラムを示す。矢印は、バックグラウンドシグナル強度を示す。一重と二重の矢じりは、１つ又は２つの遺伝子を含む細胞に相当する特有のピークを示す。ナノチップ上に固定されたＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}濃度は、ほぼナノチップ濃度（０．４ｐＭ）と等しい一方、自由拡散系を用いた場合（ＤＮＡ開始型反応）は、Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}濃度が、１００ｎMであることに注目すべきである（下部のビングラフ）。

【図4-1】図４Ａ－Ｆは、ナノチップに基づく遺伝子回路が、人工細胞のｍｉＲＮＡプロファイルに自律的に応答することを示す。（図４Ａ）ＯＮスイッチの構造を説明する模式図を示す。ｍｉＲＮＡの結合の際、基質遺伝子の有効アーム長が伸びることで、プロモーター配列とのＲＮＡＰの相互作用を可能にする。（挿入図）ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡの添加によって、ｌｅｔ－７のＯＮスイッチが活性化した。ｗ／はｍｉＲＮＡあり、ｗ／ｏはｍｉＲＮＡなしを意味する。（図４Ｂ）ＯＮスイッチの直交性を示す。各々のセンサーの活性は、コグネイトなトリガーｍｉＲＮＡを伴ったスイッチで測定されたｓｆＧＦＰ出力によって標準化した。（図４Ｃ）ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－２０６及びｍｉＲ－９２ａ－３ｐに応答する３入力ＡＮＤスイッチを示す。油中水滴（ｗ／ｏ）実験により、単一の３入力ＡＮＤスイッチ活性を確認したことに注目すべきである（図２３Ａ－Ｅを参照）。（図４Ｄ）（挿入図）特定のリンカー長で、ナノチップの活性は、分子間距離に沿ってピークを示した（図２Ｄを参照）。逆にいえば、特定の分子間距離で、最適なリンカー長が存在するはずである。従って、ｍｉＲＮＡ結合によって、非最適な長さ（例えば、短すぎる）から最適な長さに、有効リンカー長が変化する場合、チップは活性化された（図４Ａ）。加えて、ＯＦＦからＯＮへの有効リンカー長の変更の転換点を仮定できるのであれば、ある特定数のｍｉＲＮＡの結合によって、有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することができる（例えば、転換点に必要なｍｉＲＮＡの結合が、１つであれば３入力ＯＲ、２つであれば３入力ＭＡＪＯＲＩＴＹ（多数決）スイッチ、３つであれば３入力ＡＮＤスイッチ）。（外側）例えば、３入力ＡＮＤスイッチにおいては、転換点と交わるためには結合した３つのｍｉＲＮＡが必要である（左上図、図２４Ａ-Ｄも参照）。ここで、酵素と基質遺伝子の固定位置間の分子間距離を、ｍｉＲＮＡが２つ結合したことによって達成される伸長分と同等な長さ短くした場合、この統合センサーは１つのｍｉＲＮＡの結合によって活性化される３入力ＯＲスイッチとして機能する。（図４Ｅ）３入力ＡＮＤスイッチの機能が、ナノチップ構造の変更で、３入力ＯＲスイッチ（上図）や３入力ＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチ（下図）に変更し得ることを示す。図４Ｅの左側は、ナノチップの分子配置及びその同等スイッチを示す。エラーバーは３つの独立した実験で得られたデータの標準偏差を示す。（図４Ｆ）光応答性人工核酸塩基ｃｎｖＫを用いた架橋及び乖離（開裂）の模式図を示す。

【図4-2】（図４Ｇ）ＵＶに反応して、３入力ＡＮＤスイッチから、３入力ＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチに論理を変換することが可能であることを示す。（図４Ｈ）油中水（ｗ／ｏ）滴のｍｉＲＮＡプロファイルを自律的に感知する２つのＡＮＤチップからなる遺伝子回路は、論理演算を実行し応答する。回路において、チップ１は、ｍｉＲ－２０６及びｍｉＲ－９ａ－３ｐを検出し、そして情報伝達物質（出力）のｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７）を産生した。チップ２は、ｍｉＲＮＡ－１９７－３ｐと情報伝達物質のｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ－７）の両方が存在する時にのみ、ｓｆＧＦＰのｍＲＮＡを産生した。ボックスプロットは、各細胞中の発現したｓｆＧＦＰの蛍光強度の分布を示す。スケールバーは２０μｍを示す。

【図5】図５Ａ－Ｃは、Ｔ７チップを用いた外因性遺伝子転写の代表的な生データを示す。（図５Ａ）４％ Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。反応時間は、１００、２５０及び４００ｎＭの外因性遺伝子については、３００、６００及び１８００秒であり、１０００及び２０００ｎＭの外因性遺伝子については、３００及び６００秒であった。電気泳動後、［^３２Ｐ］ＵＴＰをＢＡＳ－５０００でイメージ化した。（図５Ｂ）図５Ａのデータの定量を示す。３００及び６００秒で得たデータを用いてフィッティングした。（図５Ｃ）外因性遺伝子濃度に対して、図５Ｂの傾きをプロットした。ミカエリス・メンテン型反応を想定して曲線のフィッティングを行った。活性値は、１０ｎＭのＴ７ＲＮＡＰの活性相当に補正した。

【図6】図６Ａ－Ｂは、２重ビオチンを用いる事で、結合遺伝子数が確実に1つに限定されることを示す。（図６Ａ）内因性遺伝子組立ての模式図を示す。２重ビオチンを、ＤＮＡオリガミ・タイルへのストレプトアビジン（ＳＡ）の結合、及びＳＡに対する内因性遺伝子の結合の両方で用いた。（図６Ｂ）２重ビオチン(左)と通常ビオチン(右)を用いた内因性遺伝子組立ての典型的なアガロースゲルイメージを示す。矢じりの数は、ＤＮＡオリガミ・タイル毎の結合遺伝子の数を示す。

【図7】図７は、ＡＦＭイメージ及びＴ７遺伝子チップの収率を示す。ｗ／ｇｅｎｅは、遺伝子（Ｔ７遺伝子チップ、及び遺伝子チップ）を含むナノチップの観察された比率であり、ゲル分析からのデータと直接比較することができる。ｎ.ｄ.は、決定されていないことを示す。３２、５０及び７０ｎｍの複合体の結果から計算されたように、３重の複合体（Ｔ７遺伝子チップ）の形成効率は、ゲル分析で得られたデータの８９±２％である（Ｔ７遺伝子チップ及び遺伝子チップの両方を含む）。従って、４及び２４ｎｍの３重の複合体は、両方とも効率６９％であったと概算した。

【図8】図８Ａ－Ｃは、５’末端又は３’末端をＴ７遺伝子チップに固定した場合の典型的な生データを示す。（図８Ａ）Ｔ７チップに５’末端又は３’末端を固定した場合の分子配置の模式図を示す(Ｔ７ＲＮＡＰと遺伝子の固定位置間の分子間距離は５０ｎｍである)。（図８Ｂ）４％ Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。反応時間は、３００、６００、１８００、及び３６００秒（それぞれ、５、１０、３０、及び６０分)であった。（図８Ｃ）図８Ｂのデータの定量を示す。５’末端及び３’末端を固定した場合についてのＴ７チップの濃度は、それぞれ０．３７及び０．５ｎＭであった。

【図9】図９Ａ－Ｂは、Ｔ７遺伝子チップが、転写反応後に無傷のままであったことを示す。（図９Ａ）１％アガロースゲルの典型的なイメージを示す。反応時間は、０、５、１０及び６０分であった。メインバンド(Ｔ７遺伝子チップ)とエキストラバンド(Ｔ７チップ：遺伝子を有さないナノチップ)の位置を線で示す。（図９Ｂ）図９Ａのデータの定量を示す。

【図10】図１０Ａ－Ｂは、競合実験の典型的な生データを示す。（図１０Ａ）４％Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。反応時間は、３００、６００及び１８００秒（それぞれ、５、１０、及び３０分)であった。ｅｎｄｏは内因性遺伝子（ｓｆＧＦＰ、９４２ｂｐ）であり、ｅｘｏは外因性遺伝子（ＤＨＦＲ、６８２ｂｐ）を意味する。（図１０Ｂ）図１０Ａのデータの定量を示す。

【図11】図１１Ａ－Ｃは、Ｔ７チップの直交性を示す。（図１１Ａ）４％ Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥゲルのイメージを示す。反応時間は、６００、１８００、及び３６００秒（それぞれ、５、３０、及び６０分）であった。（図１１Ｂ）図１１Ａのデータの定量を示す。６００及び１８００秒で得たデータを用いてフィッティングした。（図１１Ｃ）比活性を示す。値は、１０ｎＭのＴ７ＲＮＡＰ濃度相当の値に換算した。

【図12】図１２Ａ－Ｃは、酵素基質衝突効率曲線の予測を示す。（図１２Ａ）単純化のために、１次元分布を検討した。ＲＮＡＰのプロモーター認識ドメインのサイズdrを0.1nmと想定した。（図１２Ｂ及びＣ）持続長（ｌｐ）が５０ｎｍ（Ｂ）及び３０ｎｍ（Ｃ）であると想定して、衝突効率を予測した。プロットしたデータは、図２Ｄに示した２２ｎｍ（黒丸）、４４ｎｍ（灰丸）、６６ｎｍ（白丸）のリンカーのプロットしたデータと同じであった。ＤＮＡのワーム・ライク・チェインモデルを想定すると、ナノチップの分子間依存性は、おおよそ予測した衝突効率曲線に従っていたが、より小さい持続長が、より短いリンカー条件（２５～３５ｎｍ（右）、５０ｎｍ（左）という既知の値より小さい）に必要である。２つの可能性のある機構によって、計算の相違を説明し得る：１つはＤＮＡ（遺伝子）のより柔らかい状態を反映した可能性（R. S. Mathew-Fenn, R. Das, P. A. Harbury. Science 322, 446-449 (2008)、及びR. Vafabakhsh, T. Ha. Science 337, 1097-1101 (2012)）、もう１つはＲＮＡＰのスキャニング能力を介して到達可能範囲が拡がった可能性を示している。センサー統合チップの結果に従って推測すると、後者の機構がこの相違を説明し得る。

【図13】図１３は、ＡＦＭイメージ及びＴ７遺伝子チップの２重遺伝子バージョンの収率を示す。ｗ／ｇｅｎｅは、遺伝子を含むナノチップの観察された比率であり、ゲル分析からのデータと直接比較することができる。

【図14】図１４Ａ－Ｄは、液滴のｓｆＧＦＰ強度プロファイルを示す。（図１４Ａ－Ｃ）（Ａ）ナノチップ、（Ｂ）ＤＮＡ開始型、及び（Ｃ）ｍＲＮＡ開始型の反応の強度プロファイルを示す。（Ｃ）ｍＲＮＡ開始型の遺伝子濃度が、（Ａ）ナノチップ及び（Ｂ）ＤＮＡ開始型の反応と比して非常に高いことに注目すべきである。（図１４Ｄ）液滴における単一の遺伝子の発現によって生じる蛍光強度のＴ７ＲＮＡＰ濃度依存性を示す。単一のナノチップの遺伝子発現レベルは、約１５００（ａ.ｕ.）であり、１００ｎＭの自由拡散系のＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}のものと同等である。

【図15】図１５Ａ－Ｄは、ナノチップ・ユニット要素の能力を示す。（図１５Ａ）より低い濃度では、構成要素の確率的分布の結果、２つの遺伝子のうち１つしか発現しない「不活性」細胞が生じた。（図１５Ｂ）ナノチップによる２重遺伝子発現の典型的な蛍光強度プロファイルを示す。（図１５Ｃ）ナノチップ及びＤＮＡ開始型反応に対応する代表的な円グラフ。（図１５Ｄ）規定された遺伝子セットの発現の成功比率を示す。共発現比は、（２重陽性細胞数／ｓｆＧＦＰ陽性細胞)、及び(２重陽性細胞数／ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞)の平均値として定義した。線は、確率的分布を想定したＤＮＡ開始型反応の期待値を示す。

【図16-1】図１６Ａ－Ｃは、センサー統合ナノチップの特徴を示す。（図１６Ａ）酵素と基質間の分子間距離の調節により、ナノチップ活性を切り替えることが可能である。本研究で使用したセンサーの概略図を示す。固定位置とプロモーター配列の間のリンカーは、センサーとして機能した。リンカー部分は酵素反応から独立しているので、センサーには材料的な制約がない。（図１６Ｂ）従来の方法（反応拡散システム、左）、及び本発明の方法（統合チップ、右）に関する、オペレーターの配列の制約とセンサーの材料の制約を示す。（図１６Ｃ）制約の概要を示す。本発明の方法（統合チップ）は、配列又は材料の制約を受けない。

【図16-2】図１６Ｄ－Ｅは、センサー統合ナノチップの特徴を示す。（図１６Ｄ）従来の方法（左）及び本発明の方法（右）における、低い酵素・基質濃度での動態と反応速度の環境依存性を示す。本発明の方法では、環境依存性が小さい。加えて、全ての必要な構成要素が同じチップに統合されており、従って、高い有効濃度を有するので、反応速度はチップ（酵素・基質）濃度に依存しない。（図１６Ｅ）従来の方法（左、リコンビナーゼを使用）及び本発明の方法（右）における、論理機能の機能的調節を示す。本発明の方法では、シグナル結合の際の衝突効率変更を数多くのアプローチを介して設計できるため（例えば、リンカー長の変更、分子配置変更、及び足場形状の変形）、異なるナノチップ配置により、異なる論理機能を持たせることが可能である。

【図17】図１７Ａ－Ｄは、センサー設計の重要な要素及び有効リンカー長の推定を示す。（図１７Ａ）センサー設計において３つの重要な要素：Ｉ．センサーの剛性、ＩＩ．ＲＮＡＰのスキャニング能力、及びＩＩＩ．基質・遺伝子に結合したセンサーのリンカー部分を伸長するＲＮＡＰの引張力を検討すべきである。（図１７Ｂ）センサー統合ナノチップの構造を説明する模式図を示す。ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡドメインを含むリンカー部分は、センサーとして機能した。前者のｓｓＤＮＡドメインは、ｍｉＲＮＡ結合部位を提供し、そして後者のｄｓＤＮＡドメインは、剛性スペーサーとして機能する。センサーを設計するために、有効なセンサーアーム長を評価することが重要であり、よってｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡドメインの有効長の予測が重要である。従って、固定した酵素と基質の間の分子間距離（５０ｎｍ）で、ｓｓＤＮＡ（０－６０ｎｔ）及びｄｓＤＮＡ（２５－８５ｂｐ）を含むリンカー長を変えつつ、チップ活性を測定した。（図１７Ｃ）同じｄｓＤＮＡリンカー長では、短いｓｓＤＮＡリンカーを有するセンサーアームの到達距離は、チップ活性の活性化のためには短すぎるが、長いｓｓＤＮＡリンカーでは十分な長さとなる。そこで、ＯＦＦからＯＮへ移行する転換点のアーム長の存在を仮定した。（図１７Ｄ）異なるｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡリンカーを有するナノチップの活性を示す。本発明者らの実験条件下では、短いｄｓＤＮＡは、一定の長さを有する剛体棒として考えることができ、一方で、ｓｓＤＮＡリンカーは、伸長可能な柔軟なリンカーとして考えることができる。従って、有効センサーアーム長を評価するために、ｓｓＤＮＡの有効長を予測することは、重要な検討事項である。異なるｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡの組み合せで得られたデータが、推定されたセンサーアーム長に沿って同じような活性プロファイルを示したので、ｓｓＤＮＡの有効なユニット長を推定するために、ＯＦＦからＯＮに移行する転換点となるアーム長に注目した。異なるｄｓＤＮＡリンカー長から得られたデータで、各ｄｓＤＮＡリンカー長にとっての転換点となるアーム長を推定し、各転換点となるアーム長の相違の合計を計算した。下記ユニット長の場合のデータが相違の最少合計を提供したので、実験に基づいたｓｓＤＮＡのユニット長（ＣｓｓＤＮＡ）を、約０．２３ｎｍ／ｎｔと推定した（挿入像、方法を参照）。異なるｄｓＤＮＡリンカー長から得られたデータを、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡについて、それぞれ０．２３及び０．３４ｎｍ／ｎｔを用いてプロットした。

【図18-1】図１８Ａ－Ｆは、ＯＮスイッチの設計を示す。（図１８Ａ）ｍｉＲＮＡのＯＮスイッチの構造変化を説明する模式図を示す。トーホールド領域(図中の「Ｔ」)へのｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションの際、ｍｉＲＮＡが、スイッチ(図中の「Ｈ」)のステム・ハイブリダイズ部分に侵入し、そしてスイッチの短い相補的な部位(図中の「Ｈ^＊」)を置き換える。従って、スイッチ構造は、伸長されたオープン型に変換される。Ｌは、スイッチのループ部位(ポリＴ)を、ｈ^＊は、「Ｈ」に対するｍｉＲＮＡの相補的部分を、ｔ^＊は、「Ｔ」に対する、ｍｉＲＮＡの相補的部分を示す。（図１８Ｂ）ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡのＯＮスイッチの代表的な構造を示す。１つの追加のハイブリダイゼーション部分を、ハイブリダイズ領域の末端に導入したことに注目すべきである（図１８Ｆを参照）。ＤＧは、１Ｍ Ｎａ^＋及び３７℃での、ＮＵＰＡＣＫによって予測されたセンサー構造の最小自由エネルギー（ＭＦＥ）を示す。（図１８Ｃ）有効センサードメイン長（ΔＬ）における違いを以下に示すように計算した。単純化のために、ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションを、センサードメインの５’末端から開始した。ｄｓＤ／ＲＮＡは、ＤＮＡ－ＲＮＡのハイブリッド二本鎖を示す。（図１８Ｄ）（上）３７℃、１Ｍ Ｎａ^＋濃度(黒丸)、及びＰＵＲＥシステム(５０ｍＭ Ｎａ^＋及び１８ｍＭ Ｍｇ^２＋、灰色丸)でのセンサー構造のＭＦＥを示す。５９ｎｔのｓｓＤＮＡドメイン及び４５ｂｐのｄｓＤＮＡドメインを有するセンサーを使用した。（中）異なるハイブリダイゼーション部位長を有するｌｅｔ－７センサーの比活性を示す（黒丸：ｗ／ｍｉＲＮＡ、灰色丸：ｗ／ｏ ｍｉＲＮＡ）。９０分での対照ナノチップの活性を用いて、活性を標準化した（図１８Ｆ及びＨでも同様）。１Ｍ Ｎａ^＋濃度で計算したセンサー構造のＭＦＥを用いた（図１８Ｆ及びＨでも同様）図１８Ｄについて、１００ｎＭ ｍｉＲＮＡをナノチップとともに氷上で３０分間インキュベートし、そして３×過剰量のＰＵＲＥシステム溶液を、反応混合物に添加した。ｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎＭであった（図１８Ｆ及びＨでも同様）。（下）各センサーのＯｎ／Ｏｆｆ比を示す。（図１８Ｅ）センサー構造を安定化するために、追加のハイブリダイゼーションペアをステム構造の根元部分に導入した。ＭＦＥは、図１８Ｄと同様にして算出した。（図１８Ｆ）（上）異なるハイブリダイゼーションペア長を有するｌｅｔ－７センサーの比活性を示す（黒丸：ｗ／ｍｉＲＮＡ、灰色丸：ｗ／ｏ ｍｉＲＮＡ）。活性は、９０分での対照ナノチップの活性を用いて標準化した。１Ｍ Ｎａ^＋で計算したセンサー構造のＭＦＥを使用した。図１９Ｆについて、１００ｎＭ ｍｉＲＮＡをナノチップとともに氷上で３０分間インキュベートし、そして３×過剰量のＰＵＲＥシステム溶液を、反応混合物に添加した。従って、最終的なｍｉＲＮＡ濃度は、２５ｎＭであった。（下）各々のセンサーのＯｎ／Ｏｆｆ比を示す。

【図18-2】図１８Ｇ－Ｈは、ＯＮスイッチの設計を示す。（図１８Ｇ）有効ループ長Ｌ’（＝Ｔ＋Ｌ）の影響を評価するために、Ｌ’長を変更させて、ナノチップ活性を測定した。（図１８Ｈ）（上）ＮＵＰＡＣＫを用いて予測したように、効果的なハイブリダイゼーション長Ｈ’＝Ｈ＋１＝１２ｂｐ（黒丸）、１１ｂｐ（白丸）について、３７℃、１Ｍ Ｎａ^＋でのセンサー構造のＭＦＥを示す。（下）異なる有効ループ長Ｌ’（黒丸：Ｈ’＝１２及びｗ／ｍｉＲＮＡ、灰色丸：Ｈ’＝１２及びｗ／ｏｍｉＲＮＡ、白丸：Ｈ’＝１１及びｗ／ｍｉＲＮＡ、灰白色丸：Ｈ’＝１１及びｗ／ｏ ｍｉＲＮＡ）を有するｌｅｔ－７センサーの比活性。活性は、９０分での対照ナノチップの活性を用いて標準化した。図１８Ｈについて、最終的なｍｉＲＮＡ濃度は、２５ｎＭであった。主な結論として、センサー構造の十分なＭＦＥは、スイッチのリークを抑制するために重要であった。十分なループ長Ｌ'（及び全リンカー長）は、スイッチを十分に活性化するために重要であった。

【図19】図１９Ａ－Ｃは、ナノチップに対するｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションの速度論分析を示す。（図１９Ａ）１％アガロースゲル（１ｍＭ Ｍｇ^２＋をゲル中に添加）のイメージである。反応時間は、３７℃で、６０、３００、１８００秒（１、５、及び３０分）であった。この図では、ナノチップに結合していない溶液を漂う基質遺伝子を除去せず実験を行った。残存する結合していない基質遺伝子は、対照として使用した。（図１９Ｂ）（上）（Ａ）におけるデータの定量を示す。同じゲル（非表示）におけるキャリブレーション用のレーンを用いて、結合したｍｉＲＮＡを定量した。（下）推定した結合定数Ｋｏｎは、ナノチップ及び自由拡散系の基質遺伝子について、それぞれ３．４×１０^５［／Ｍ／ｓ]、及び２．８×１０^５［／Ｍ／s］であった。これは、ナノチップに統合されたセンサーに対するｍｉＲＮＡのＫｏｎ値が、自由拡散系における値と同様のオーダーであったことを示している。（図１９Ｃ）ｌｅｔ－７センサーの見かけのＫｍ値を測定した。図１９Ｃについては、ｍｉＲＮＡを、ナノチップを含むＰＵＲＥシステムに直接添加し、そして転写・翻訳反応を開始する前に、氷上で３０分インキュベートした。

【図20】図２０Ａ－Ｃは、ｌｅｔ－７ ＯＮスイッチのミスマッチの影響を示す。（図２０Ａ）ミスマッチ(灰色)の影響を調べるために、ｍｉＲＮＡを、シングルｌｅｔ－７ ＯＮスイッチ(ハイブリダイゼーション部分＝１２ｎｔ)とともに用いた。ＮＵＰＡＣＫを用いて予測したような、３７℃、及び１Ｍ Ｎａ^＋でのセンサー構造のＭＦＥを示す。（図２０Ｂ）実験データと予測値との比較を示す。（上）ミスマッチ部位の影響を推定するための、予測結合比（黒線）と実験データ（白棒）の比較を示す。（下）予測値と実験データとの間の関連性を評価するために、これらのパラメーターを比較した。これにより、１５％超の結合比では、ミスマッチ部位は完全にチップを活性化し得ることが示された。図２０Ｂについては、ｍｉＲＮＡは、ナノチップを含むＰＵＲＥシステム溶液に直接添加し、転写・翻訳反応が開始する前に、氷上で３０分、インキュベートした。（図２０Ｃ）実験データの疑似カラー表示を示す。ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡの標的部位を、黒丸で示した。

【図21】図２１Ａ－Ｅは、ＯＮスイッチの直交性を示す。（図２１Ａ）３７℃でのセンサー構造の配列及びＭＦＥを示す。（図２１Ｂ）ｌｅｔ－７センサーの直交性に関する代表的なデータを示す。（図２１Ｃ）８つのセンサー間のクロストークに関するマトリックスデータを示す。９０分での対照ナノチップの活性を用いて、比活性を標準化した。独立した３回の実験で得られたデータを示す（平均値±標準偏差）。図２１Ｂ及びＣでは、ｍｉＲ－２２４－５ｐを除くｍｉＲＮＡについて、１００ｎＭで、氷上で３０分間、ナノチップとともにインキュベートし、その後３×過剰量のＰＵＲＥシステム溶液を反応混合物に添加した。従って、ｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎＭであった。ｍｉＲ－２２４－５ｐについては、ｍｉＲＮＡの終濃度は、１００ｎＭである。（図２１Ｄ）ｍｉＲ－１－３ｐとｍｉＲ－２０６の５’末端における同一のヌクレオチドは、スイッチの直交性に僅かに影響を及ぼした。（図２１Ｅ）ｍｉＲ－２２４－５ｐは、試験条件において自己二量体化し、これがｍｉＲ－２２４－５ｐセンサーの低い反応性に関与している可能性がある。

【図22】図２２Ａ－Ｅは、ＯＦＦスイッチの設計を示す。（図２２Ａ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションによって、センサー構造が安定化され、折り畳まれた構造が支配的となり、その結果、センサーアームの有効な到達距離が短くなり、ナノチップの活性のスイッチが切られた。（図２２Ｂ）ＮＵＰＡＣＫを用いて予測したＯＦＦスイッチの代表的な二次構造(サポートハイブリダイゼーションペアを6ｂｐとする)。（図２２Ｃ）ＯＦＦスイッチの、センサー単独(上)及びセンサーｍｉＲＮＡ(下)の安定性を示す。ＮＵＰＡＣＫを用いた予測のように、２３℃（３７℃ではない）で、１Ｍ Ｎａ^＋（黒丸）、及びＰＵＲＥシステム（５０ｍＭ Ｎａ^＋及び１８ｍＭ Ｍｇ^２＋、灰色丸）における該構造のＭＦＥを示す。（図２２Ｄ）(上)異なるサポートハイブリダイゼーション部位長を有するｌｅｔ－７ ＯＦＦセンサーの比活性を示す。活性は、９０分での参照ナノチップの活性を用いて標準化した。測定を、２３℃（３７℃でない）で行ったことに注目すべきである。図２３Ｄでは、１００ｎＭ ｍｉＲＮＡを、氷上で３０分間、ナノチップとともにインキュベートし、その後３×過剰量のＰＵＲＥシステム溶液を反応混合物に添加した。従って、ｍｉＲＮＡの終濃度は、２５ｎＭであった。（下）各々のセンサーのＯｎ／Ｏｆｆ比を示す。（図２２Ｅ）測定されたｌｅｔ－７ＯＦＦスイッチの見かけのＫｍ値を示す。図２２Ｅでは、ｍｉＲＮＡを、ナノチップを含むＰＵＲＥシステム溶液に直接添加し、そして転写・翻訳反応を開始する前に、氷上で３０分インキュベートした。

【図23】図２３Ａ－Ｅは、２入力ＡＮＤスイッチの設計を示す。（図２３Ａ）センサーの末端間距離の伸長を説明する模式図を示す。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションの際、ステムループ構造が伸長される。（図２３Ｂ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。２つの異なるｍｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際、センサーアームの到達距離の長さは、ナノチップを活性化するのに十分な長さとなる。（図２３Ｃ）３７℃、及び１Ｍ Ｎａ^＋でのＮＵＰＡＣＫを用いた予測ＡＮＤスイッチの二次構造を示す。（図２３Ｄ）溶液系（ｂｕｌｋ）実験におけるＡＮＤスイッチの活性を示す。ナノチップの濃度は、約１ｎＭである。図２３Ｄでは、４００ｎＭ ｍｉＲＮＡをナノチップとともに氷上で３０分間インキュベートし、その後、３×過剰量のＰＵＲＥシステム溶液を反応混合物に添加した。従って、ｍｉＲＮＡの終濃度は、１００ｎＭであった。（図２３Ｅ）油中水（ｗ／ｏ）滴における単一ＡＮＤチップ活性を示す。ナノチップの濃度は、０．４ｐＭである。図２３Ｅでは、ｍｉＲＮＡを、ナノチップを含むＰＵＲＥシステム溶液に直接添加し、転写・翻訳反応を開始する前に、２０℃で３０分(油中水（ｗ／ｏ）滴を形成するために必要な時間)インキュベートした。

【図24】図２４Ａ－Ｄは、３入力ＡＮＤスイッチの設計を示す。（図２４Ａ）センサーの末端間距離の伸長を説明する模式図を示す。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションの際、ステムループ構造が伸長された。（図２４Ｂ）３７℃、１Ｍ Ｎａ^＋での、ＮＵＰＡＣＫを用いた、ｌｅｔ－７／ｍｉＲ－２０６／ｍｉＲ－９２ａ－３ｐについての３入力ＡＮＤスイッチの予測された二次構造を示す。（図２４Ｃ）ｌｅｔ－７／ｍｉＲ－２０６／ｍｉＲ－１９７－３ｐ（上）及びｌｅｔ－７／ｍｉＲ－３６５ａ－３ｐ／ｍｉＲ－１８３－５ｐ（下）についての３入力ＡＮＤスイッチの溶液系（ｂｕｌｋ）実験の結果を示す。（図２４Ｄ）油中水（ｗ／ｏ）滴における単一の３入力ＡＮＤチップの活性を示す。ナノチップの濃度は、０．４ｐＭであった。図２４Ｃでは、ｍｉＲＮＡを、ナノチップを含むＰＵＲＥシステム溶液に直接添加し、転写・翻訳反応を開始する前に、２０℃で３０分間（油中水（ｗ／ｏ）滴を形成するために必要な時間）インキュベートした。

【図25】図２５Ａ－Ｂは、分子配置を変更することによる、３入力ＡＮＤスイッチの機能調節を示す。（図２５Ａ）ＡＮＤスイッチからＯＲスイッチへの変換を示す。相違は、２入力分から、２つのステム構造の厚み分を引いた分である（２２ｎｔ×２×０．３４ｎｍ／ｎｔ＋２２ｎｔ×２×０．２３ｎｍ／ｎｔ－４ｎｍ～２１ｎｍ）。従って、ＲＮＡＰ酵素と基質・遺伝子間の分子間距離を５０から７０ｎｍに変更した。（図２５Ｂ）ＡＮＤスイッチからＭＡＪＯＲＩＴＹ（多数決）スイッチへの変換を示す。ｄｓＤＮＡリンカー長を４５から８５ｂｐに変更し、違いは、おおよそ１入力分から、１つのステム構造分の厚み分を引いた分である（２２ｎｔ×１×０．３４ｎｍ／ｎｔ＋２２ｎｔ×１×０．２３ｎｍ／ｎｔ－２ｎｍ～１１ｎｍ～３１ｎｔ ｄｓＤＮＡ）。

【図26】図２６Ａ－Ｄは、ＰＵＲＥシステムにおけるナノチップ活性を示す。（図２６Ａ）ナノチップ濃度の影響を示す。活性を、０．５２ｎＭのナノチップ濃度における、１８０分の値を用いて、標準化した。（図２６Ｂ）ｍｉＲＮＡ濃度の影響を示す。蛍光強度を、０ｎＭのｍｉＲＮＡにおける、１８０分の値を用いて、標準化した。（図２６Ｃ）ｍｉＲＮＡの添加時間のＯＮスイッチ統合ナノチップ活性に与える影響。矢印は、ｍｉＲＮＡの添加時間を示す(５０ｎＭのｍｉＲＮＡ終濃度)。ナノチップの終濃度は、０．１３ｎＭである。活性を、１８０分での対照ナノチップの活性を用いて、標準化した。破線、黒、及び灰色の線はナノチップの活性を示し、破線は、不活性ナノチップを示し、黒線は、センサーは活性化しているがｓｆＧＦＰ ｍＲＮＡ産生が不活性であるナノチップを示し、そして灰色線は、センサーとｍＲＮＡ産生が活性化しているナノチップを示す。（図２６Ｄ）他のチップ活性のセンサーを統合したナノチップに与える影響を示す。矢印は、ｍｉＲＮＡ添加のタイミングを示す(５０ｎＭのｍｉＲＮＡの終濃度)。両方のナノチップの終濃度は、０．１３ｎＭである。活性を、対照ナノチップにおける１８０分での活性を用いて、標準化した。破線、黒、灰色及び灰黒色の線は、ナノチップの活性を示し、破線は、不活性ナノチップを示し、黒線は、センサーは活性化しているがｓｆＧＦＰのｍＲＮＡ産生が不活性であるナノチップを示し、灰色線は、センサーとｍＲＮＡ産生が活性化しているナノチップを示し、そして灰黒色線は、ｓｆＣｈｅｒｒｙのｍＲＮＡ産生が活性化しているナノチップを示す。ｓｆＧＦＰ産生の減少は、タンパク質を産生する資源の不足によって説明し得る（例えば、ＰＵＲＥシステムの成分）。主な結論として、ナノチップ濃度をより低減する（～０．５ｎＭ）ことが、資源の消費を防ぐために重要である。他のチップが機能しており、それによってバックグラウンドで転写・翻訳システムが作動しているのであれば、ｍｉＲＮＡ活性化のタイミングは、ｍｉＲＮＡ感受性チップの活性にとって重要である。

【図27】図２７Ａ－Ｇは、ナノチップ コミュニケーションが遺伝子回路を可能にすることを示す。（図２７Ａ）２つの「緩衝（ＯＮスイッチ）」機能ナノチップを含む遺伝子回路の模式図を示す。（図２７Ｂ）（Ａ）に示した回路の活性を示す。（図２７Ｃ）２つのＡＮＤスイッチを有するナノチップからなる遺伝子回路の模式図を示す。（図２７Ｄ）（Ｃ）に示した回路のリークチェックを示す。（図２７Ｅ）チップ１の濃度が、（Ｃ）に示した遺伝子回路の全体的な産生に影響を及ぼすことを示す。（図２７Ｆ）対照反応におけるｓｆＧＦＰタンパク質産生のタイムラグを示す。（図２７Ｇ）（Ｆ）に示した遺伝子発現の動態分析を示す。ドットは実験データを示し、そしてフィッティングラインは、それぞれ、ナノチップ開始型（ナノチップと同濃度でのＲＮＡＰ）、及びＤＮＡ開始型（ＲＮＡＰ～３０ｎＭ、ナノチップのものよりさらに高濃度）の反応についての基質・遺伝子の推定された転写速度：０．０３４及び０．０２／秒／分子を用いた、予測された経時的推移を示す。高いＲＮＡＰ濃度では、実験値は予測値よりも低かったことから、遺伝子発現系の資源消費を反映している可能性がある。

【図28】図２８は、ナノチップに基づく遺伝子回路が、人工細胞のｍｉＲＮＡプロファイルを検出し応答することを示す。関心領域（ＲＯＩ）は、図４Ｆに示した位置を示す。

【図29】図２９Ａ－Ｆは、ＬａｃＩスイッチの設計を示す。（図２９Ａ）（上）ＬａｃＩ－ＤＮＡの３次元タンパク質・核酸立体構造（ＰＤＢ：１ｌｂｇ）を、ｉＣｎ３Ｄ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/icn3d/icn3d.html）で描画した。ＬａｃＩ４量体は、２つのＤＮＡ認識部位に結合する。（下）２つのＬａｃＯ配列を実験に用いた。（図２９Ｂ）（上）ＬａｃＩセンサーの模式図を示す。Ｐはプロモーターを、ＲＢＳはリボソーム結合部位を、ＯＲＦはオープンリーディングフレームを、Ｔはターミネーターを示す。（下）ＯＮ及びＯＦＦスイッチを得るために、同じセンサーをＤＮＡオリガミの異なる部位に固定した。酵素（Ｔ７ＲＮＡＰ、黒丸）と基質遺伝子（ＬａｃＩセンサー、黒四角）の固定位置間の分子間距離は、ＯＮスイッチで３２ｎｍ、ＯＦＦスイッチで７０ｎｍであった。（図２９Ｃ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。ＬａｃＩ ４量体の結合の際、ナノチップを活性化するために、センサーアームの到達距離は十分に短い。（図２９Ｄ）ナノチップ（上）と反応拡散系(溶液中の自由拡散系ＬａｃＩ－Ｔ７ＲＮＡＰと反応する自由拡散系ＬａｃＩセンサー)におけるＬａｃＩセンサーの活性を示す。灰色丸はＩＰＴＧなし、黒丸は１００ｍＭ ＩＰＴＧありを示す。活性を、１８０分でのデータを用いて標準化した（０ｎＭ ＬａｃＩ ＩＰＴＧなしを１に設定した）。（図２９Ｅ）ＬａｃＩのＯＦＦスイッチのスイッチング機構を説明する模式図を示す。ＬａｃＩ ４量体の結合の際、センサーアームの到達距離が短すぎて、ナノチップを活性化できない。（図２９Ｆ）ＬａｃＩのＯＦＦスイッチの活性を示す。

【図30】図３０Ａ－Ｃは、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐ）スイッチの設計を示す。（図３０Ａ）Ａｍｐアプタマーの構造を示す。（図３０Ｂ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。Ａｍｐの結合の際、センサーアームの到達距離が短くなるので、ナノチップの活性が低下する。（図３０Ｃ）ＡｍｐのＯＦＦスイッチの活性を示す。

【図31】図３１Ａ－Ｃは、ＮＡＮＤスイッチの設計を示す。(図３１Ａ)スイッチの論理動作を示す。（図３１Ｂ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。ｍｉＲＮＡとのハイブリダイゼーションの際、センサーアームの到達距離の長さが伸び、ナノチップは不活性化される。（図３１Ｃ）ＮＡＮＤスイッチの活性を示す。

【図32】図３２Ａ－Ｂは、固定点変化による論理変更の設計を示す。（図３２Ａ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。ＩＰＴＧが元の固定点（ＬａｃＩ）と結合する際、センサーアームの到達距離の長さが伸び、ナノチップは活性化される。（図３２Ｂ）スイッチング機構を説明する模式図を示す。ＩＰＴＧが元の固定点（ＬａｃＩ）と結合する際、センサーアームの到達距離の長さが短くなり、ナノチップは不活性化される。

【図33】図３３Ａ－Ｂは、ＵＶに反応してナノチップの機能をＯＮ/ＯＦＦスイッチングする設計を示す。（図３３Ａ）Ｐはプロモーターを、ｃｎｖｋは光応答性人工核酸塩基を示す。３６６ｎｍのＵＶを５分間照射した際（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ１）、センサーアームの到達距離が短くなるので、ナノチップの活性が低下する。該活性が低下した状態にて、さらに３１２ｎｍのＵＶを１０分間照射した場合(Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ２)、センサーアームの到達距離の長さが伸び、ナノチップは活性化される。（図３３Ｂ）ＵＶによるＯＮ/ＯＦＦスイッチングの活性を示す。

【図34】図３４Ａ－Ｂは、ＵＶ入力とｍｉＲＮＡプロファイルに応答する回路の設計を示す。(図３４Ａ)チップ１は、３６６ｎｍのＵＶ照射を行わない場合、情報伝達物質（出力）のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２０６）を産生した。チップ２は、ｍｉＲ－２０６、ｌｅｔ－７、及びｍｉＲ－９２ａ－３ｐの３つが存在する時にのみ、ｓｆＧＦＰのｍＲＮＡを産生した（上部）。下部は、回路の論理動作を示す。（図３４Ｂ）ＵＶとｍｉＲＮＡプロファイルに応じて、試験管内で発現したｓｆＧＦＰの蛍光強度の時間変化を示す（上部）。下部は、相対値を示す(ＵＶの入力がなく、ｍｉＲＮＡが２つ存在する場合を１とした)。

【図35】図３５Ａ－Ｃは、個体（生体）内で機能するチップの設計及びその結果を示す。(図３５Ａ）筒状のチップ（Ｃａｇｅ）の内側にＲＮＡＰと標的遺伝子が固定してあることを示す。（図３５Ｂ）実験の概略図。ゼブラフィッシュの初期胚(受精卵、未受精卵)にマイクロインジェクションによりサンプル（～５ｎＭ）を導入し(１nL程度)、２８℃で１時間インキュベーションした後に、トライゾール液やＤＮａｓｅＩ酵素処理等を用いて、ＲＮＡを抽出した。合成されたＲＮＡ量はリアルタイムＰＣＲ装置で確認した。（図３５Ｃ）合成されたＲＮＡの相対値を示す(ＲＮＡＰと遺伝子を両方固定したサンプルの合成量を１とした)。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、本発明が属する技術分野で通常に用いられる意味を有する。

【0023】

遺伝子回路用デバイス
本発明において、「触媒」とは、なんらかの化学反応を促進、又は抑制させるような物質を意味し、例えば、生体触媒、無機触媒が挙げられる。具体的には、例えば、酵素、タンパク質、核酸、人工核酸が挙げられ、より具体的には、ＤＮＡ／ＲＮＡ／人工核酸ポリメラーゼ、ポリマー合成酵素、核酸結合タンパク質（制限酵素、ライガーゼ、ニッカーゼ、メチラーゼ、転写因子などが挙げられるが、これらに限定されない）、分子シャペロン（ＨＳＰ７０，ＨＳＰ９０などが挙げられるが、これらに限定されない）、分子モーター（キネシン、ミオシン、ダイニンなどが挙げられるが、これらに限定されない）、膜タンパク質、修飾酵素（リン酸化キナーゼ、ユビキチンリガーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない）、合成酵素（Ｆ１－ＡＴＰ合成酵素などが挙げられるが、これらに限定されない）、分解タンパク質（プロテアーゼ、プロテオソームなどが挙げられるが、これらに限定されない）、ＲＮＡ酵素（リボザイム、Ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない）、ＤＮＡ酵素、人工核酸酵素、核酸－タンパク質複合体（リボソーム(非天然アミノ酸を取り込む改変体を含む)、ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ（ＲＩＳＣ）やＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなどが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。本明細書において、「人工核酸ポリメラーゼ」とは、人工核酸、あるいは人工核酸と天然核酸の両方、あるいは化学修飾された人工核酸／天然核酸を基質とするポリメラーゼを意味し（VB Pinheiro et al., Science 336, 341-344 (2012); AI. Taylor et al., Nature 518, 427-430 (2015); N. Ramsay et al., JACS 132, 5096-5104 (2010)）、「ポリマー合成酵素」とは高分子ポリマー（例えば、バイオプラスチック）や、その原料を合成する酵素を意味する（BH. Rehm, Nat Rev Microbiol. 8, 578-92 (2010); T. Iwata, Angew Chem Int Ed Engl. 54, 3210-3215 (2015)）。また、本発明において使用される酵素、タンパク質等は、自体公知の組み換えタンパク質発現技術を用いて生成されてもよい。
上記触媒は、後述する形状変化要素と結合していてもよく、していなくてもよい。また、該触媒が、形状変化要素と結合していない場合、該触媒は、ベース部材と結合していてもよい。

【0024】

本発明において、「標的遺伝子」とは、上記触媒と接触することで遺伝子の発現が誘導される遺伝子を意味し、具体的には、例えばｓｆＧＦＰ遺伝子、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ遺伝子が、挙げられる。また、標的遺伝子は、任意数の適切な制御配列（転写及び翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない）、他の要素（選択遺伝子、シグナルペプチド又はタグペプチドをコードする配列、ターミネーター配列）等を含んでもよく、これらは全て、本発明が属する技術分野でよく知られるように作動可能に連結される。

【0025】

本明細書において、「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子などが結合することができる領域も含んでもよい。本明細書において、遺伝子の発現とは、転写・翻訳を経てタンパク質が合成されることを意味してもよく、またＲＮＡとして機能する遺伝子（ノンコーディングＲＮＡ）の場合は、ＲＮＡの合成を意味してもよい。上記標的遺伝子は、後述する形状変化要素と結合していてもよく、していなくてもよい。該標的遺伝子が、形状変化要素と結合していない場合、該標的遺伝子は、ベース部材と結合していてもよい。

【0026】

本発明の遺伝子回路用デバイスは、「スイッチ」として使用されてもよい。本発明において、「スイッチ」は、標的遺伝子の発現の制御に関わるものであり、少なくとも１つの「開閉機構」を有する。該開閉機構は、形状変化要素を駆動部として有する。該形状変化要素は、第１部位と第２部位を有し、かつ、活性化源の作用によって、該第１部位と第２部位との間の距離が変化する構造を有している。該第１部位と第２部位は、形状変化要素の任意の部位でよく、例えば、形状変化要素の両端が挙げられる。また、形状変化要素は、第１部位側に第１固定部を、第２部位側に第２固定部を有し、触媒や標的遺伝子が形状変化要素と結合している場合、該固定部に固定される。形状変化要素の第１部位と第１固定部とは、同一の部位であってもよく、異なる部位であってもよい。同様に、形状変化要素の第２部位と第２固定部とは、同一の部位であってもよく、異なる部位であってもよい。

【0027】

本発明の形状変化要素は、長さを規定できるものであれば、特に限定されないが、具体的には、例えば、タンパク質／ペプチド鎖、核酸(ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸)、タンパク質－核酸複合体、金属材料(金属断片、金ナノロッド)、半導体(シリコン)、 炭素同素体(ＣＮＴ、グラファイト、フラーレン、ダイヤモンド)、無機材料(セラミック)、非晶質固体(ガラス)、有機材料、高分子ポリマーが挙げられる。
本発明において、「リンカー」、「アンカーアーム」、「センサー」及び「センサーアーム」は、「形状変化要素」に該当する。また、本明細書において、「リンカー」、「アンカーアーム」、「センサー」及び「センサーアーム」は、それぞれ互換的に使用される。また、本発明において、形状変化要素は、活性化源の作用により具体的に変化する部分（例えば、センサー部と称する）とその他の部分（例えば、アーム部と称する）の２つの部分から構成されていてもよい。

【0028】

本明細書では、形状変化要素の大きさ（長さ）は、形状変化要素のベース部材における固定位置から、該形状変化要素との結合対象が標的遺伝子の場合、プロモーター配列までの長さであるアーム（リンカー）長として規定され、該形状変化要素との結合対象が触媒の場合、該触媒までの長さであるアーム（リンカー）長として規定される。また、本明細書では、形状変化要素がベース部材に固定される部分を、固定端と称する場合がある。

【0029】

開閉機構は、該形状変化要素を可動部として有し、該形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の変化に応じて、上記標的遺伝子と上記触媒とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されている。また、上記のような構成を採る限り、いかなる構成を有していてもよい。
開閉機構の全体が形状変化要素であってもよく、その一部が形状変化要素であってもよい。

【0030】

形状変化要素の具体的な構造として、例えば、ステムループ構造が挙げられ、該ステムループは、基本構造として、トーホールド、ハイブリダイゼーション、ループ、アンチハイブリダイゼーション、及びステムループとリンカーの他の部分との間のスペーサーの５つのドメインを有する（図１８Ｂ）。トーホールドドメイン及びハイブリダイゼーションドメインに結合するｍｉＲＮＡが、先ずトーホールドドメインに結合し、次にステム構造に侵入し、最後にステムループを展開する。また、安定したハイブリダイゼーションをサポートするために、ステム構造の根元にサポートハイブリダイゼーションをさらに導入してもよい。

【0031】

また、他の具体的な構造として、二本鎖ＤＮＡを使用した、ＬａｃＩ－ＬａｃＯ対を用いた形状変化要素が挙げられる（図２９Ａ-Ｄ）。ＬａｃＩは、四量体を形成する二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、２つのＬａｃＯ配列に結合できる（図２９Ａ）。ＬａｃＩ－ＬａｃＯ対を用いた形状変化要素は、まず第１の活性化源であるＬａｃＩが２つのＬａｃＯ配列に結合することで、二本鎖ＤＮＡが折り畳まれ、その長さが短くなり、さらに第２の活性化源であるイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）添加により、ＬａｃＯ配列からＬａｃＩの離脱が誘導され、再度二本鎖ＤＮＡが展開され本来の長さになる（図２９Ｃ及びＥ）機構である。

【0032】

また、他の具体的な構造として、光応答性人工核酸塩基ｃｎｖＫ（３－ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）を用いた形状変化要素が挙げられる（図４Ｆ）。ｃｎｖＫは光応答性であり、紫外光に反応し、相補鎖ピリミジン（チミン塩基、シトシン塩基）と共有結合性の架橋を形成できる。ｃｎｖＫを用いた形状変化要素は、まず第１の活性化源である３６６ｎｍの紫外光が架橋を誘導することで、ベース部剤（ＤＮＡオリガミ）と標的遺伝子固定用ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎの間のリンカーオリゴヌクレオチドが折り畳まれ、その長さが短くなり、さらに第２の活性化源である３１２ｎｍの紫外光により、架橋が開裂し、再度リンカーオリゴヌクレオチドが展開され、本来の長さになる機構である。

【0033】

本発明のスイッチのうち、活性化源の作用によって、標的遺伝子と触媒とが相対的に近づいて接するように構成されているスイッチを、「ＯＮスイッチ」と称する。ＯＮスイッチが入力されると、標的遺伝子と触媒との接触頻度が、入力前と比して高められ、その結果、標的遺伝子の発現量がバックグラウンドと比して上昇する。
一方、本発明のスイッチのうち、活性化源の作用によって、標的遺伝子と触媒とが接触状態から相対的に離れるように構成されているスイッチを、「ＯＦＦスイッチ」と称する。ＯＦＦスイッチが入力されると、標的遺伝子と触媒との接触頻度が、入力前と比して低められ、その結果、標的遺伝子の発現量がバックグラウンドと比して有意な差がない程度にまで低下する。

【0034】

本発明のスイッチの具体的な構造及び機構（スイッチング機構）は、例えば、以下：
（ｉ）互いに独立した第１の可動部としての第１の形状変化要素と、第２の可動部としての第２の形状変化要素を有し、触媒が、第１の可動部における第１の形状変化要素の第１部位の側に固定され、標的遺伝子が、第２の可動部における第２の形状変化要素の第１部位の側に固定され、第１及び第２の可動部における各形状変化要素の第２部位の側が、ベース部材（例えば、ベース部材の１つの面上）に（例えば、互いに離れて）固定され、各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように構成されているか、又は各形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように構成されているような構造及び機構や、
（ｉｉ）触媒及び標的遺伝子のいずれか一方が、ベース部材（例えば、ベース部材の１つの面上）に固定され、他方が可動部における形状変化要素の第１部位の側に固定され、可動部における形状変化要素の第２部位の側は、ベース部材（の前記面上）に固定され、形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の増大によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるように構成されているか、又は形状変化要素の第１部位と第２部位との間の距離の減少によって、触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するように若しくは接触状態から相対的に離れるよう構成されているような構造や機構が挙げられる。

【0035】

また、ベース部材の形状自体が変化する場合も、本発明のスイッチに含まれ、具体的な構造及び機構（スイッチング機構）としては、例えば、以下：（シート状の）ベース部材（の一方の面上）に触媒と標的遺伝子とが（互いに離れて）配置されており、形状変化要素の第１部位と第２部位が（前記シート状の）ベース部材（の両面のうちの互いに同じ面上に互いに離れて）に固定され、第１部位と第２部位との間の距離の減少、又は増大が前記（シート状の）ベース部材を変形させ、前記（シート状の）ベース部材の変形によって触媒と標的遺伝子とが相対的に近づいて接するか、又は接触状態から相対的に離れるように構成されているような構造が挙げられる。

【0036】

本発明において、「ベース部材」とは、触媒、標的遺伝子、形状変化要素などの分子を固定でき、そして所望する位置に配置できる面を有するものであれば特に限定されず、可撓性を有していてもよい。また、本明細書において、触媒、標的遺伝子、形状変化要素などの分子が固定されるベース部材上の部位を、アンカー部と称する場合があり、複数のアンカー部が存在する場合、それぞれを区別するために、例えば、第１アンカー部、第２アンカー部、第３アンカー部のように称してもよい。ベース部材の形態は、帯状、シート状、ヒモ状や線状であっても塊状であってもよい。ベース部材としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸、タンパク質、ポリマーなどからなるナノ構造物が挙げられ、具体的には、例えば、ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミ、ペプチドオリガミ、タンパク質オリガミ、超分子ポリマーが挙げられる。
また、「ベース部材」は、本明細書において、「足場」と互換的に使用される。

【0037】

本発明において、「ＡＮＤスイッチ」とは、２つ以上の入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、全ての入力（端子）に「１」が入力された場合に、出力（端子）に「１」を出力し、入力（端子）の少なくとも１つに「０」が入力された場合は、「０」を出力する素子を意味する。ここで「入力」とは、例えば、活性化源の作用により形状変化要素が駆動し得る状態になることが挙げられ、「出力」とは、例えば、標的遺伝子が発現することが挙げられる。
該ＡＮＤスイッチは、例えば、２つ、３つ又はそれ以上の異なる形状変化要素を直接的に結合させ、入力（端子）の全てに「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することで、構築することができる（図４Ｄ、図１６Ｅ）。また、形状変化要素同士の結合様式は、それぞれの形状変化要素の距離の変化が妨げられないように結合されていれば特に限定されず、例えば、直列、並列等の結合様式が挙げられる。本明細書において、「転換点」とは、活性化源の作用により形状変化要素が変化し、触媒活性が不活化状態から活性化状態、あるいは、活性化状態から不活化状態へと遷移する、特定のリンカー長のことを意味する（図１７）。
上記のような論理演算を行うＡＮＤスイッチは、本明細書において、「ＡＮＤゲート」と互換的に使用される。

【0038】

本発明において、「ＯＲスイッチ」とは、２つ以上の入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、入力（端子）の少なくとも１つに「１」が入力された場合に、出力（端子）に「１」を出力し、全ての入力（端子）に「０」が入力され場合は、「０」を出力する素子を意味する。
該ＯＲスイッチは、例えば、２つ、３つ又はそれ以上の異なる形状変化要素を直接的に結合させ、入力（端子）の少なくとも１つに「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することで、構築することができる（図４Ｄ、図１６Ｅ、図２５）。また、形状変化要素同士の結合様式は、それぞれの形状変化要素の距離の変化が妨げられないように結合されていれば特に限定されず、例えば、直列、並列等の結合様式が挙げられる。
上記のような論理演算を行うＯＲスイッチは、本明細書において、「ＯＲゲート」と互換的に使用される。

【0039】

発明において、「ＭＡＪＯＲＩＴＹ(多数決)スイッチ」とは、３つ以上の入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、多数決の原理に基づいて、過半数の入力（端子）に「１」が入力された場合に、出力（端子）に「１」を出力し、過半数の入力（端子）に「０」が入力され場合は、「０」を出力する素子を意味する。
該ＭＡＪＯＲＩＴＹスイッチは、例えば、２つ、３つ又はそれ以上の異なる形状変化要素を直接に結合させ、多数決の原理に基づいて、過半数の入力（端子）に「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することですることで、構築することができる（図４Ｄ、図１６Ｅ、図２５）。また、形状変化要素同士の結合様式は、それぞれの形状変化要素の距離の変化が妨げられないように結合されていれば特に限定されず、例えば、直列、並列等の結合様式が挙げられる。
上記のような論理演算を行うＭＡＪＯＲＩＴＹ(多数決)スイッチは、本明細書において、「ＭＡＪＯＲＩＴＹ(多数決)ゲート」と互換的に使用される。

【0040】

本発明において、「ＮＯＴスイッチ」とは、１つの入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、入力（端子）に「１」が入力された場合に、出力（端子）に「０」を出力する素子を意味する。該ＮＯＴスイッチは、例えば、入力（端子）に「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することで、構築することができる。
上記のような論理演算を行うＮＯＴスイッチは、本明細書において、「ＮＯＴゲート」、「ＯＦＦスイッチ」、「ＯＦＦゲート」と互換的に使用される。

【0041】

本発明において、「ＮＯＲスイッチ」とは、２つ以上の入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、入力（端子）の少なくとも１つに「１」が入力された場合に、出力（端子）に「０」を出力し、全ての入力（端子）に「０」が入力され場合は、「１」を出力する素子を意味する。
該ＮＯＲスイッチは、例えば、２つ、３つ又はそれ以上の異なる形状変化要素を直接的に結合させし、入力（端子）の少なくとも１つに「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することで、構築することができる（図４Ｄ、図１６Ｅ）。形状変化要素同士の結合様式は、それぞれの形状変化要素の距離の変化が妨げられないように結合されていれば特に限定されず、例えば、直列、並列等の結合様式が挙げられる。
上記のような論理演算を行うＮＯＲスイッチは、本明細書において、「ＮＯＲゲート」と互換的に使用される。

【0042】

本発明において、「ＮＡＮＤスイッチ」とは、２つ以上の入力（端子）と１つの出力（端子）を有し、全ての入力（端子）に「１」が入力された場合に、出力（端子）に「０」を出力し、入力（端子）の少なくとも１つに「０」が入力された場合は、「１」を出力する素子を意味する。
該ＡＮＤスイッチは、例えば、２つ、３つ又はそれ以上の異なる形状変化要素を直接的に結合させすることで、入力（端子）の全てに「１」が入力された場合に、生じた有効リンカー長の伸長変化が、転換点と交わるのに十分な伸長を誘導するようにチップを設計することで、構築することができる（図４Ｄ、図１６Ｅ）。形状変化要素同士の結合様式は、それぞれの形状変化要素の距離の変化が妨げられないように結合されていれば特に限定されず、例えば、直列、並列等の結合様式が挙げられる。
上記のような論理演算を行うＮＡＮＤスイッチは、本明細書において、「ＮＡＮＤゲート」と互換的に使用される。

【0043】

本明細書において、ベース部材に少なくとも１つの上述したようなスイッチが統合されたものを「チップ」と称する。また、本明細書において、「チップ」、「ナノチップ」、及び「遺伝子ナノチップ」は、互換的に使用される。また、本発明の遺伝子回路用デバイスは、それ自体が上述のスイッチであってもよい。

【0044】

本発明のＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、及びＭＡＪＯＲＩＴＹ(多数決)スイッチは、本発明で用いたような触媒と標的遺伝子の間の分子間距離を調節するアプローチにより、それらの分子配置(アンカー部位)の変更、ベース部材の形状の変化、又はリンカー長の変更によって、異なる構造のナノチップにおける論理機能の変更が可能である。具体的には、例えば、異なる波長の光線を照射することで架橋と乖離（開裂）を切り替えることが可能な人工核酸をステムループ構造の一部に導入したり、ベース部材と遺伝子間のリンカー部分に導入したりすることで、リンカー長を制御し、触媒と標的遺伝子の間の分子間距離を調節することで、論理機能の変更が可能となる。また、例えば、形状変化要素中の第１部位と第２部位との間の任意の固定部と、ベース部材上のアンカー部が結合された状態が、該結合を解放し得る解放用の活性化源により互いに分離されることや、形状変化要素中の第１部位と第２部位との間の任意の固定部とベース部材上のアンカー部とが、結合用の活性化源の作用により結合されることでも、論理機能の変更が可能となる。

【0045】

また本発明のＡＮＤスイッチ、ＯＲスイッチ、ＭＡＪＯＲＩＴＹ（多数決）スイッチ、ＮＯＴスイッチ、ＮＯＲスイッチ、及び／又はＮＡＮＤスイッチを組み合わせてベース部材に配置することで、遺伝子回路を作製することができる。該遺伝子回路は、複数のスイッチを配置することが可能なベース部材にそれぞれのスイッチを配置することで作製されてもよく、少なくとも２つ以上の上述のチップを組み合わせることで作製されてもよい。

【0046】

ベース部材への固定
本発明の標的遺伝子、触媒、及び形状変化要素のベース部材への固定方法は、限定されないが、例えば、核酸同士のハイブリダイゼーションのような水素結合、核酸同士のスタッキング相互作用、アビジン（Ａｖｉｄｉｎ）タンパク質－ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）化合物間のような非共有結合、ＳＮＡＰタンパク質－ＳＮＡＰリガンド間のような共有結合、あるいは、これらを組み合わせた方法を介して行われる。具体的には、例えば、ベース部材がＤＮＡオリガミである場合、標的遺伝子及び形状変化要素（例えば、核酸）を自体公知の方法でビオチン修飾し、ＤＮＡオリガミ上にストレプトアビジンを自体公知の方法で結合させて、ビオチン・アビジン相互作用によりＤＮＡオリガミ上に標的遺伝子及び形状変化要素を固定させてもよい。また、触媒（例えば、タンパク質）については、自体公知の組み換えタンパク質発現技術を用いて、ＳＮＡＰタグを結合させたタンパク質を作製し、自体公知の方法でＤＮＡオリガミ上に固定してもよい。

【0047】

プロモーター
本発明において使用されるプロモーターは、本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境内で、標的遺伝子を発現することが可能なものであれば特に限定されず、誘導型プロモーターでも、構成型プロモーターでもよい。
具体的には、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来プロモーター（例：ＣＭＶ前初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来プロモーター（例：ＨＩＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）由来プロモーター（例：ＲＳＶ ＬＴＲ）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）由来プロモーター（例：ＭＭＴＶ ＬＴＲ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来プロモーター （例：ＭｏＭＬＶ ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来プロモーター（例：ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター）、ＳＶ４０由来プロモーター（例：ＳＶ４０初期プロモーター）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来プロモーター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来プロモーター（例：ＡＡＶ ｐ５プロモーター）、アデノウイルス（ＡｄＶ）由来プロモーター（Ａｄ２又はＡｄ５主要後期プロモーター）などが用いられてもよい。
また、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが用いられてもよい。
さらに、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔＲＮＡプロモーターなどが用いられてもよい。

【0048】

シグナルペプチド
本発明において使用されるシグナルペプチドは、例えば、ゴルジ体移行シグナルペプチド、細胞膜移行シグナルペプチド、ミトコンドリア移行シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、シナプス移行シグナルペプチド、核小体移行シグナルペプチド、核膜移行シグナルペプチド、ペルオキシソーム移行シグナルペプチド等が挙げられる。

【0049】

タグペプチド
本発明において使用されるタグペプチドは、例えば、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグ等が挙げられる。

【0050】

ターミネーター
本発明において使用されるターミネーターは、限定されず、当業者に知られている任意の転写ターミネーターでもよい。具体的には、例えば、ウイルス遺伝子由来、各種哺乳動物又は鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列が挙げられる。より具体的には、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０ターミネーター、ｓｐｙ、ｙｅｊＭ、ＳＥＣＧ－ｌｅｕＵ、ｔｈｒＬＡＢＣ、ｒｒｎＢ Ｔ１、ｈｉｓＬＧＤＣＢＨＡＦＩ、ｍｅｔＺＷＶ、ｒｒｎＣ、ｘａｐＲ、ａｓｐＡ及びａｒｃＡターミネーターが挙げられる。

【0051】

遺伝子回路用のデバイスの使用環境
本発明の遺伝子回路用のデバイスは、予定される最終用途に依存して、例えば、反応容器、生細胞、人工細胞、細胞ゴースト（すなわち、赤血球ゴースト又は血小板ゴースト）、死細胞、細胞外顆粒（エキソソーム等）、ウイルス、人工ウイルス、又は擬ビリオン中で使用されてもよい。
本発明の遺伝子回路用のデバイスは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、細胞透過性ペプチド、ＤＮＡナノ構造の形状を利用した細胞内取り込みなどを利用した自体公知の方法により、細胞内に取り込むことができる。
本発明の遺伝子回路用のデバイスは、例えば、注射、経口投与、皮膚・粘膜への塗布、吸引、噴霧、食餌、などを利用した自体公知の方法により、動物及び植物体内に取り込むことができる。
本発明の遺伝子回路用のデバイスは、例えば、バイオマーカーの検出、遺伝子治療、遺伝子又はゲノム改変(例：置換、挿入、欠失等などの編集)、細胞死誘導、細胞活性化／不活性化誘導、予防医療、再生医療、有用物質（例：サイトカイン、ホルモンなどの生理活性物質）の生産などの様々な用途に使用することができ、各用途に応じて、自体公知の方法により、例えば、注射、経口投与、皮膚・粘膜への塗布、吸引、噴霧、食餌、投入などに適した形態で製剤化したり、検出用試薬として調製したりすることができる。 本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境としては、例えば、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物、植物細胞、植物などが挙げられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞などが用いられてもよい。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられてもよい。
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられてもよい。また、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類、ゼブラフィッシュ、メダカ、キンギョ、コイ、マグロなどの魚類等が用いられてもよい。
植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などが用いられてもよい。

【0052】

本発明の触媒（例えば、タンパク質）の作製において使用される発現ベクターの種類は特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド(例: pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、枯草菌由来のプラスミド (例: pUB110、pTP5、pC194)、酵母由来プラスミド (例: pSH19、pSH15)、昆虫細胞発現プラスミド (例: pFast-Bac)、動物細胞発現プラスミド (例: pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)、λファージなどのバクテリオファージ、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター (例: BmNPV、AcNPV)、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられてもよい。
また、ＦＬＡＧタグペプチド、ＨＡタグペプチド、ＭＹＣタグペプチド、ＧＦＰタグペプチド、ＭＢＰタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＨＩＳタグ、ＳＮＡＰタグ、ＡＣＰタグ、ＣＬＩＰタグ、ＴＡＰタグ、Ｖ５タグなどとの融合タンパク質を発現可能なベクターが用いられてもよく、具体的には、例えば、ｐＳＮＡＰｆベクターが挙げられる。

【0053】

入力（活性化源）
本発明において使用される活性化源は、本発明の形状変化要素を駆動し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、1本鎖ＤＮＡ、2本鎖ＤＮＡ、核酸ナノ構造物（ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミなど）、ＩＰＴＧ、酵素、タンパク質、核酸―タンパク質複合体、ペプチド、脂質、糖鎖、代謝物、イオン、コロイド、錯体、光線、ｐＨ、熱、電場、磁場が挙げられる。該活性化源は、本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境中に内在してもよく、外部から加えられてもよい。

【0054】

出力（産物）
本発明のスイッチにより出力される産物は、特に限定されないが、例えば、タンパク質（例えば、蛍光タンパク質、転写リプレッサー、転写アクチベーター、酵素、受容体タンパク質、リガンドタンパク質）、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボスイッチ、ｌｎｃＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、1本鎖ＤＮＡ）、イオン、代謝物（例えば、ＡＴＰ）、核酸ナノ構造物（ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミなど）、光、熱が挙げられる。本発明のスイッチにより出力される産物の量は、自体公知の方法により定量することができる。本発明のスイッチを複数用いる場合、一のスイッチの出力（産物）が、他のスイッチの活性化源（入力）として機能してもよい。また、本発明のスイッチにより出力される産物により、本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境（例えば、細胞）におけるタンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、代謝物等の合成を制御し得る。また、該タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ，代謝物等の合成の制御により、特定の疾患を検知及び／又は予防及び／又は治療し得る。また、該タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、代謝物等の合成の制御により、反応容器において、特定の物質(例えば、バイオ医薬や、有害物質)の生産・分解効率を向上及び／又は低下させ得る。

【0055】

本発明において、形状変化要素の第１固定部と第２固定部の間の任意の固定部（例えば、第３固定部）と結合可能な、ベース部材上のアンカー部（例えば、第３アンカー部）は、該固定部と結合し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、1本鎖ＤＮＡ、2本鎖ＤＮＡ、核酸ナノ構造物（ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミなど）、ＩＰＴＧ、酵素、タンパク質（リガンドタンパク質、受容体タンパク質など）、核酸―タンパク質複合体、ペプチド、脂質、糖鎖、代謝物、イオン、コロイド、錯体が挙げられる。また、上述の本発明の標的遺伝子、触媒、及び形状変化要素をベース部材に固定する際に使用するようなものを用いてもよい。

【0056】

結合用の活性化源
本発明において使用される結合用の活性化源は、第１固定部と第２固定部の間の任意の固定部（例えば、第３固定部）と、ベース部材上のアンカー部（例えば、第３アンカー部）との結合を活性化し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、1本鎖ＤＮＡ、2本鎖ＤＮＡ、核酸ナノ構造物（ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミなど）、ＩＰＴＧ、酵素、タンパク質、核酸―タンパク質複合体、ペプチド、脂質、糖鎖、代謝物、イオン、コロイド、錯体、光線、ｐＨ、熱、電場、磁場が挙げられる。該活性化源は、本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境中に内在してもよく、外部から加えられてもよい。

【0057】

解放用の活性化源
本発明において使用される解放用の活性化源は、第１固定部と第２固定部の間の任意の固定部（例えば、第３固定部）と、ベース部材上のアンカー部（例えば、第３アンカー部）との結合を分離し得るものであれば、特に限定されないが、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、1本鎖ＤＮＡ、2本鎖ＤＮＡ、核酸ナノ構造物（ＤＮＡオリガミ、ＲＮＡオリガミなど）、ＩＰＴＧ、酵素、タンパク質、核酸―タンパク質複合体、ペプチド、脂質、糖鎖、代謝物、イオン、コロイド、錯体、光線、ｐＨ、熱、電場、磁場が挙げられる。該活性化源は、本発明の遺伝子回路用のデバイスが使用される環境中に内在してもよく、外部から加えられてもよい。

【0058】

以下の実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

【実施例】

【0059】

[材料と方法]
１．プラスミド構築及びタンパク質精製
ＳＮＡＰｆタグをコードする核酸配列を含むＤＮＡ断片を、ｐＳＮＡＰｆベクター（ＮＥＢ）を鋳型として用いてＰＣＲによって増幅した。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｐＱＥ－３０(Ｑｉａｇｅｎ)のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼのＮ末端に連結した。ｓｆＧＲＰ配列又はｍＣｈｅｒｒｙ配列を、ｐＥＴ３２ｂ（Ｍｅｒｃｋ）のＮｄｅＩ－ＥｃｏＲＩ部位に挿入した。タンパク質生産効率を改善するため、ｍＣｈｅｒｒｙの最初の２１コドン（対応するアミノ酸配列：ＭＶＳＫＧＥＥＤＮＭＡＩＩＫＥＦＭＲＦＫＶ（配列番号７３））を、ＡＴリッチな配列へと最適化した（オリジナル：ＡＴＧＧＴＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＧＡＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＴＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＴＧ（配列番号７１）；最適化後：ＡＴＧ ＧＴＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＴ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＡ ＡＴＴ ＡＴＴ ＡＡＡ ＧＡＡ ＴＴＴ ＡＴＧ ＣＧＴ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＴＴ（配列番号７２））。最適化されたｍＣｈｅｒｒｙ配列を用いた場合、ＰＵＲＥシステム（ＰＵＲＥ ｆｒｅｘ ２．０）におけるタンパク質産生が、オリジナル配列を用いた場合と比較して４～５倍に増加したことが、［^３５Ｓ］メチオニンを用いた定量により示された。かかる配列は、実施例６等において使用した。該組み換えタンパク質は、大腸菌ＢＬ２１株において、Ｎ末端にＨｉｓタグを付与した状態で発現させた。通常、大腸菌細胞は１Ｌ培地で培養し、超音波破砕し、遠心し、次いで、該タンパク質を公知の方法（Y. Shimizuら、Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001)）を用いて、５ｍＬ容量のＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム(ＧＥヘルスケア)を用いて精製した。Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}を、さらに、５ｍＬ容量のＨｉＴｒａｐＱカラム(ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いて精製した。ピーク画分を採取し、ＨＴバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、４０％グリセロール、７ｍＭβメルカプトエタノール）に置換し、液体窒素中で凍結した後、－８０℃で保存した。

【0060】

２．足場及びオリゴヌクレオチド
一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡをＮＥＢから購入し、ＤＮＡオリガミの足場として用いた。未修飾のステープル鎖は、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（ＯＰＣ）グレードのものをＳｉｇｍａ－Ｇｅｎｏｓｙｓより購入した。蛍光色素（Ｃｙ３及びＣｙ５）で修飾したステープル鎖は、ＰＡＧＥ精製グレードのものをＳｉｇｍａ－Ｇｅｎｏｓｙｓより購入した。２重ビオチンで修飾したステープル鎖は、ＨＰＬＣ精製グレードのものをＩＤＴより購入した。アミノ基修飾したステープル鎖は、ＨＰＬＣ２回精製グレードのものをＩＤＴより購入した。公知の方法（N. D. Derrら、Tug-of-war in motor protein ensembles revealed with a programmable DNA origami scaffold. Science 338, 662-665 (2012)）に従い、ステープル鎖とＧＢ－ＧＬＡ－ＮＨＳ（ＮＥＢ、ＤＭＳＯ溶解）を混合することにより、ＳＮＡＰリガンドをアミノ基修飾ステープル鎖に共有結合的に結合させた。精製したＳＮＡＰタグタンパク質を用いたゲルシフトアッセイにより、ＳＮＡＰリガンドのラベル効率は９５～９８％であると推定した。光架橋性塩基(ｃｎｖＫ：３－Ｃｙａｎｏｖｉｎｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ)修飾したステープル鎖は、ＨＰＬＣ精製グレードのものをつくばオリゴサービスより購入した。以下に本明細書で使用したプライマー等の配列を示す。

【0061】

【表1】

【0062】

【表2】

【0063】

【表3】

【0064】

【表4】

【0065】

【表5】

【0066】

【表6】

【0067】

【表7】

【0068】

【表8】

【0069】

【表9】

【0070】

３．ＤＮＡオリガミの構築及びＴ７ ＲＮＡＰ _{ＳＮＡＰｆ} の組立て
長方形のＤＮＡオリガミタイル(１ターン当たり１０.４ｂｐ)を、１×タイルバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ)中で折り畳んだ。通常、４０ｎＭの一本鎖Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（ＮＥＢ）と１１０ｎＭの各ステープル鎖(３倍等量超)を１×タイルバッファー中で混合し、ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、１℃／３０秒の平均速度で、８５℃から２５℃に温度を下げることでアニールさせた。折り畳まれたＤＮＡオリガミタイルを、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－３００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、過剰量のステープル鎖を除去した。次に、ＤＮＡオリガミタイルを２０倍等量のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡ）と混ぜ、２３℃で１０分間反応させ、ＳＡを結合させた後に、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－４００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、過剰量のステープル鎖を除去した。最後に、Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}をＤＮＡオリガミに混合し、公知のトーホールド置換メカニズム（ｔｏｅｈｏｌｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）を介したＤＮＡコンジュゲート磁気ビーズ(Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を用いて精製した（Ｔ７－ＳＡ－チップ。T. Torisawaら、Autoinhibition and cooperative activation mechanisms of cytoplasmic dynein. Nat. Cell Biol. 16, 1118-1124 (2014)）。

【0071】

４．Ｔ７チップ上への第１及び第２の遺伝子の固定
第１の遺伝子は、アビジン－ビオチン法を用いてＤＮＡオリガミタイルに結合させた。２重ビオチンで修飾したプライマーを用いてＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物を、未精製又はアガロースゲル精製を行った状態のいずれかで用いた。また、必要に応じて濃縮を行った。続いて、２重ビオチンが結合した遺伝子を、Ｔ７－ＳＡ－チップと混ぜ、精製せずに活性評価に用いた。第２の遺伝子は、修復法によってＤＮＡオリガミタイルに集積化（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）させた。まず、２重ビオチンが結合した第２の遺伝子を、２０倍等量のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ(ＳＡ)と混ぜ、２３℃で１０分間反応させ、ＳＡを結合させた後に（ＳＡ－ｇｅｎｅ）、１％アガロースゲルを用いてゲル切り出し精製を行った（１ｘＴＡＥバッファーで30分泳動）。精製したＳＡ－Ｇｅｎｅは遠心エバポレーター(ＴＯＭＹ ＭＶ－１００)で２００－２５０ｎＭ程度に濃縮した。続いて、ＤＮＡオリガミタイルを、１つを除く全てのステープル鎖でアニールした。第１の遺伝子を組み込んだ後、折り畳まれたＤＮＡオリガミを、２重ビオチンタグを５’末端に有する、組み込まれなかったステープル鎖（５倍等量）と共に５０℃で1時間反応した後にＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－４００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、過剰量の追加ステープル鎖を除去した。次いで、ストレプトアビジンでプレコンジュゲートした第２の遺伝子をＤＮＡオリガミタイル上に固定した後、Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}を混ぜ、上記の磁気ビーズ法によって精製して実験に用いた。サンプルの収率を、アガロースゲル電気泳動及びＡＦＭによって推定した。アガロースゲルを、ＦＬＡ－３０００イメージアナライザー(Ｆｕｊｉｆｉｌｍ)によって撮像した。

【0072】

５．センサー付遺伝子のＴ７チップへの固定
センサー付遺伝子を、上記と同様の方法によってＴ７チップ上に固定した。ただし、一部のセンサー付遺伝子は２重ビオチンの代わりにビオチンを用いた。センサー付遺伝子の大半は(ｍｉＲＮＡを産生するセンサー付遺伝子を除く)、４℃で３０分、Ｔ７チップと共にインキュベートし(５ｎＭセンサー結合遺伝子及び０．５ｎＭのＴ７チップ)、精製することなく用いた。ｍｉＲＮＡを産生する論理チップを、上記の磁気ビーズ法によって精製した。自由拡散系の基質遺伝子に対するＴ７チップの見かけのＫｍ値がμモルオーダーであったことから、ｓｆＧＦＰのＯＲＦを有する、過剰量の自由拡散系のセンサー結合遺伝子はＴ７チップによっては転写されないことが確認された（μモルオーダーのＫｍ値は２００ｂｐの基質遺伝子長に至ることが確認された（データ非開示））。

【0073】

６．再プログラム可能なチップの作製と論理の書き換え
光架橋性塩基がついたステープルは、まず、ＵＶ光（３６５ｎｍ）を用いて架橋反応（室温、３０分）を行った後に、ゲル切り出しを行い（１５％ Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ泳動、３００Ｖ、６０分）、カラム（ＱＩＡＧＥＮ社 ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｍｏｖａｌ ｃｏｌｕｍｎ）精製した。精製した架橋済みステープルは乾燥させ、ＴＥで溶かした後に、他のステープルと混ぜ、上記と同様の方法で、遺伝子付のＴ７チップを作製した。論理の書き換えは、別の波長のＵＶ光（３１２ｎｍ）を照射し(４℃、１０分)、行った。

【0074】

７．個体（生体）内におけるＲＮＡ産生
Ｃａｇｅのスキャフォルド(3614nt)を、２つの方法で調製した。１つ目の方法では、自体公知の方法(P. Shresthaら、Confined Space Facilitates G-quadruplex Formation. Nat. Nanotechnol. 12, 582-588 (2017))に従った。市販の1本鎖ＤＮＡのｐ８０６４スキャフォルド(tilibit nanosystems/Eurofins Genomics)に２つの相補的ＤＮＡ(TAAGGGAAAATTAATTAATAGCGACGAT (PacI用)と(TAGCCTTTGTAGATCTCTCAAAAATA (Bg1II用))を加えた後、制限酵素(PacI/Bg1II)でｐ８０６４スキャフォルドを２箇所切断し、長さ３６１４ｎｔの1本鎖ＤＮＡを得た。２つ目の方法では、自体公知の方法(Veneziano Rら、Enzymatic synthesis of gene-length single-stranded DNA. Sci Rep. 8, 6548 (2018))に従い、非対称増幅ＰＣＲ(asymmetric PCR)で該当箇所を増幅し(Forward primer: "p8064_F4475_20nt" TAATAGCGACGATTTACAGA、Reverse primer: "p8064_R24_23nt" TACAAAGGCTATCAGGTCATTGC、ＰＣＲ酵素: Quanta社 AccuStart Taq DNA Polymerase HiFi)、ゲル切り出しで１本鎖ＤＮＡを精製した後に使用した。実験には主に非対称増幅ＰＣＲで作製した1本鎖ＤＮＡスキャフォルドを使用した。Ｃａｇｅの組み立ては、自体公知の方法(P. Shresthaら、Confined Space Facilitates G-quadruplex Formation. Nat. Nanotechnol. 12, 582-588 (2017))に従った。通常、２０ｎＭの一本鎖スキャフォルドと８０ｎＭの各ステープル鎖(４倍等量超)を１×Ｃａｇｅバッファー(２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ)中で混合し、ＰＣＲ装置（Ｍａｔｓｕｓａｄａ）を用いて、６５℃ １５分置いた後に、５０℃に１時間置き、アニールさせた。折り畳まれたＣａｇｅを、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｓ－２００ ＨＲカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、過剰量のステープル鎖を除去した。ＲＮＡＰや標的遺伝子の固定は前述の方法に従った。作製したＣａｇｅ（約５ｎＭ）は、マイクロインジェクターを用いてゼブラフィッシュの初期胚に導入した。その際、産生された新生ＲＮＡ鎖の分解を防ぐため、新生ＲＮＡ鎖の末端に結合するモルフォリノオリゴ（１０μＭ）をＣａｇｅ溶液に混ぜた。インジェクション後、２８℃で１時間インキュベーションした後に、トライゾール液やＤＮａｓｅＩ酵素処理等を用いて、ＲＮＡを抽出した。合成されたＲＮＡ量を、キット(ＴＡＫＡＲＡ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ)を用いて逆転写反応を行った後に、リアルタイムＰＣＲ装置(Applied Biosystems社 StepOne Realtime PCR system)でＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Iを用いて確認した。

【0075】

８．ＡＦＭイメージング
高速ＡＦＭ（Ｎａｎｏ Ｅｘｐｌｏｒｅ，ＲＩＢＭ）をイメージングに用いた。サンプルを、ＡＦＭイメージングバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ Ｍｇ(ＯＡｃ)_２)で希釈し、マイカ表面に浸し、公知の方法に従って、タッピングモードでイメージ化した（O. I. Wilnerら、Enzyme cascades activated on topologically programmed DNA scaffolds. Nat. Nanotechnol. 4, 249-254 (2009)）。

【0076】

９．転写アッセイ
転写活性は、転写バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ スペルミジン、１．２５ｍＭの各ＮＴＰ、０．２５μｇ／ｍｌ ＰＰＩａｓｅ、１２．５ｍＭ ＧＭＰ)中で、[α^３２Ｐ]－ＵＴＰ(ＰａｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＮＥＧ００７Ｈ)を用いて、３７℃で測定した。転写産物をＰＡＧＥで分析し、ＢＡＳ－５０００(ＦｕｊｉＦｉｌｍ)で画像化した。転写産物は、[α^３２Ｐ]－ＵＴＰの段階希釈プロットによって作成した検量線を用いて定量した。

【0077】

１０．ＰＵＲＥシステムにおける転写－翻訳共役アッセイ
反応は、ＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０中において、３７℃で行った。Ｔ７チップ又はＴ７遺伝子チップを用いたナノチップアッセイに関しては、自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰを除き、反応の各時間にナノチップを添加した。転写産物は、上述の方法により分析した。タンパク質産生に関しては、ＲＩ、又はｓｆＧＦＰ及び／又はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度により測定した。ＲＩ分析では、［^３５Ｓ］－メチオニンを使用し、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、ＢＡＳ－５０００で画像化した。蛍光強度分析においては、ｑＰＣＲ装置(ＳｔｅｐＯｎｅ、ＡＢＩ)を、タイムラプスインキュベーターとして用いた。図２Ｅに示されるデータに関しては、反応混合物を、励起フィルターであるＦＦ０１－４７５／３５及びＦＦ０１－４８２／５６３－２５（Ｓｅｍｒｏｃｋ）を用いたＬＥＤ(Ｌｉｇｈｔ Ｅｎｇｉｎｅ，Ｌｕｍｅｎｃｏｒ)によって励起し、該励起光源をダイクロイックミラー(Ｄｉ０１－Ｒ４８８／５６１、Ｓｅｍｒｏｃｋ)で反射させ、その蛍光イメージをｉＰｈｏｎｅ（登録商標）５で記録した。

【0078】

１１．人工細胞形成のためのマイクロ流体装置
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）装置は標準的なソフトリソグラフィ及びモールドレプリカ技術を用いて調製した。該装置は２つの注入口（オイル用及び水溶液用の注入口)、１つの排出口、並びにｆｌｏｗ－Ｆｏｃｕｓｉｎｇジャンクションから構成される（図３Ａ）。主な流路及びｆｌｏｗ－ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎの幅は、それぞれ、１００μｍ及び４０μｍであった。全ての流路の高さは、５０μｍであった。マイクロ流体装置の流路の表面を、(ヘプタデカフルオロ－１，１，２，２－テトラヒドロデシル)ジメチルクロロシラン（Ｇｅｌｅｓｔ、ＳＩＨ５８４０．４）で被覆することで流路壁の液滴による湿りを防止した。ＰＤＭＳは、ＤＯＷ ＣＯＲＮＩＮＧ ＴＯＲＡＹ（ＳＩＬＰＯＴ １８４Ｗ／Ｃ）から購入した。

【0079】

１２．人工細胞構築及び転写－翻訳活性の観察
油中水（ｗ／ｏ）液滴は、上述のＰＤＭＳベースのマイクロ流体装置を用いて生成させた。簡潔に説明すると、ＰＤＭＳ装置の１つの注入口をオイル(９８％ ｖ／ｖ ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５９０４)、及び２％ ｖ／ｖ ＡＢＩＬ ＥＭ９０(Ｃｅｔｙｌ ＰＥＧ／ＰＰＧ－１０／１ Ｄｉｍｅｔｈｉｃｏｎｅ、ＥＶＯＮＩＫ)）で満たし（図３Ａ中の注入口１）、もう一方の注入口を水溶液(遺伝子基質を含むＰＵＲＥシステム水溶液)で充填した。２０℃で、オイルに対しては４０ｋＰａの空気圧で、ＰＵＲＥシステムに対しては２０ｋＰａの空気圧で溶液を流し、直径２０μｍ、容積４ｐＬのｗ／ｏ液滴を１００Ｈｚ（１０^２液滴／秒）で生成させた。液滴形成過程はハイスピードカメラ(ＤｉｇｉＭｏ、ＬＲＨ２５００ＸＥ)でモニターし、自作のＶｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ ．ＮＥＴ２０１０（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標））プログラムの補助下、手動で圧力を調整した。ＰＵＲＥシステム成分の非特異的な結合を防ぐために、過剰量のアミノ酸(ｆ．８ｍＭをＰＵＲＥｆｒｅｘ２．０に添加し、且つ、ＰＤＭＳの表面をＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（商標）ＰＡ６５１（ＪＳＲ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でさらに被覆した。加えて、データの再現性を改善するために、自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰ酵素を用いたＤＮＡ（ＰＣＲ産物）開始型実験では、Ｔ７ ＲＮＡＰ濃度を１００ｎＭに増加させた。ＰＤＭＳ装置中において３７℃で３時間インキュベートした後に、サンプルをピペットで採取し、クォーツ製カバーガラス（７９８０ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｒａｄｅ、ｃｏｒｎｉｎｇ)上に置き、逆位相型顕微鏡（ＩＸ－７０、Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察した。ｓｆＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの蛍光イメージは、Ｗ－Ｖｉｅｗ（ＨａｍａｍａｔｓｕＰｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて分離し、そして電子倍増型ＣＣＤカメラ(ｉＸｏｎ Ｕｌｔｒａ ８９７、Ａｎｄｏｒ)に、並べて投影した。イメージを、０～１００のＥＭゲインで1秒当たり１～１０フレームの速度で記録し、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。検量線は、大腸菌から精製したｓｆＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を用いて作成した。

【0080】

１３．酵素・基質衝突効率曲線の予測
ＤＮＡの剛性は３つのパラメーター：伸長、折り曲げ、及びねじれ、によって決定されるが（Y. Miyazono, M. Hayashi, P. Karagiannis, Y. Harada, H. Tadakuma. Strain through the neck linker ensures processive runs: a DNA-kinesin hybrid nanomachine study. EMBO J. 29, 93-106 (2010)）、衝突効率の推定に際して、折り曲げ効果のみを考慮した。計算に関しては、ＤＮＡの末端がＷｏｒｍ－Ｌｉｋｅ Ｃｈａｉｎ（ＷＬＣ）モデル（以下式：Ｅｑ．Ｓ１）（D. Thirumalai, B. Y. Ha. Theoretical and Mathematical Models in Polymer Research, ed. Grosberg, A. (Academia, New York), pp. 1-35 (1988)）に従って挙動すると仮定した。なお、該モデルは、ポリプロリン残基を用いて実測されており（B. Schuler, E. A. Lipman, P. J. Steinbach, M. Kumke, W. A. Eaton. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 2754-2759 (2005)）、以下の式で表される：

【0081】

【数1】

【0082】

式中、ｒはＤＮＡの末端間の距離、ＬはＤＮＡの輪郭長、Ｐ（ｒ）はｒを有するＤＮＡの確率、ｌｐはＤＮＡの折り曲げ持続長、及びＣは標準化係数である。単純化のため、ｌｐ＝５０ｎｍ（図１２Ｂ）及び３０ｎｍ（図１２Ｃ）の１次元分布を検討した。

【0083】

［実施例１］酵素・基質複合体の足場の調製
酵素・基質複合体の足場として、Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄの長方形ＤＮＡオリガミを用いた。まず、ＳＮＡＰタグのリガンドが結合しており、ＤＮＡオリガミから突出しているハンドル上に、ＳＮＡＰｆタグタンパク質を融合させたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ(Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ})を共有結合によって取り付けた(図１Ａ)。Ｔ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}が結合していることはゲル分析(図１Ｂ、Ｃ)と原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）イメージング(図１Ｄ)によって確認した。ＤＮＡナノ構造体(Ｔ７チップ)にＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}が結合したものが高収率(～９５％)で得られたことを確認した。Ｔ７チップの転写活性は、ミカエリス・メンテン型の動態を示した(図１Ｅ、Ｆ、図５)。しかし、チップに組み込まれていない拡散系の基質遺伝子に対する見かけのＫｍ値は、固定されていない自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}のＫｍ値と比較して約２００倍大きかった(図１Ｆ)。９４２ ｎｔからなるｓｆＧＦＰ遺伝子の転写に関するＴ７チップのＫｍ値は１０００ｎＭであり、自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}のＫｍ値は５．６ｎＭであった。これは、チップ外で拡散している基質遺伝子に対してＴ７チップは親和性が低いことを示している。また、Ｔ７チップのＶｍａｘ値は、自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}のＶｍａｘ値よりも低く、それぞれ、３４ｎｔ／ｓ（Ｔ７チップ）及び６２ｎｔ／ｓ（自由拡散系のＴ７ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}）であった(図１Ｆ)。これらの結果は、Ｔ７チップが外来基質遺伝子を転写しにくいことを示している。

【0084】

［実施例２］アビジン・ビオチンを用いた基質遺伝子のチップへの結合
次に、アビジン・ビオチン相互作用を介して基質遺伝子をＴ７チップに一体化させた(Ｔ７遺伝子チップ、図６)。分子配置をｎｍ単位の正確性で調節できるＤＮＡオリガミの長所を活用した。グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）やマレイン酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）等の酸化還元カスケードを担う酵素では、中間媒体基質のＮＡＤがチャネリングするときの分子間距離依存性が観察されていることから、高分子量のポリマー基質もまた、酵素（ＲＮＡＰ）及び基質遺伝子の分子間距離に対する依存性を示すと予測した。加えて、結合方向（すなわち、５'末端や３'末端）や固定位置とプロモーター配列のリンカー長等のポリマー－基質特性に関わる何らかの特異点が存在するはずであると考えられた。そこで、ＲＮＡＰと基質遺伝子の分子間距離が４、２４、３２、５０及び７０ｎｍとなるように基質遺伝子を固定する部位を５カ所設定した(図２Ａ)。５つの複合体の収率は、６９－８３％の範囲であった(図７)。５’末端近傍（５’末端から４４ｎｍの距離にある）にプロモーターを挿入した遺伝子の５’末端側又は３’末端側でチップに結合させ、転写活性を比較した。その結果、５’末端側でチップに結合させた方が、３’末端側でチップに結合させるよりも転写活性が高かった（図２Ｂ、図８、図９）。これにより、固定位置からプロモーター配列までの長さであるアーム（リンカー）長とプロモーター配列と酵素の間の付随する衝突効率が、転写活性に影響することが示唆された。５’末端を固定したＴ７遺伝子チップの活性は、酵素と基質遺伝子間が約５０ｎｍの距離にあるときに最大となった。ここで注目すべきは、この結果は、低分子中間基質ＮＡＤで報告されていた結果と比較して著しく対照的であったという点である。既報の結果では、ＮＡＤは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）アンカーでＤＮＡオリガミに固定されており、ＧＤＨ酵素とＮＡＤ基質の距離が短くなるにつれて酵素活性が上昇し、一方で分子間距離を０ｎｍから１０－２０ｎｍへと広げるにつれて、当該酵素活性を亢進させる効果は減退した（O. I. Wilnerら、Enzyme cascades activated on topologically programmed DNA scaffolds. Nat. Nanotechnol. 4, 249-254 (2009).；J. Fuら、Interenzyme substrate diffusion for an enzyme cascade organized on spatially addressable DNA nanostructures. J. Am. Chem. Soc. 134, 5516-5519 (2012).；J. Fuら、Multi-enzyme complexes on DNA scaffolds capable of substrate channelling with an artificial swinging arm. Nat. Nanotechnol. 9, 531-536 (2014)）。この結果は、アンカーアーム（リンカー）の剛性（乃ち、二本鎖ＤＮＡをリンカーに用いたＴ７遺伝子チップと、一本鎖ＤＮＡをリンカーに用いたＧＤＨ－ＮＡＤ対）の違いが、酵素に対するプロモーター配列の衝突効率及び付随する酵素活性に強く影響することを示す。

【0085】

［実施例３］ナノチップの反応速度特性の測定
準最適条件において、ナノチップの反応速度特性を測定した。まず、チップ内遺伝子とＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ}の衝突効率が有効濃度に対応するものと仮定して、競合アッセイを介して、Ｔ７遺伝子チップに一体化させたチップ内遺伝子有効濃度を見積もった。おおよそ１ｎＭのＴ７遺伝子チップと、チップ外の競合因子として０－２０００ｎＭ ＤＨＦＲ遺伝子を用いた競合アッセイに基づくと、該一体化させた遺伝子の有効濃度は２μＭ超と見積られた(図２Ｃ、図１０)。

【0086】

［実施例４］ナノチップの直交性の確認
次に、ナノチップの直交性についても確認した。ＲＮＡＰしか結合していないナノチップ(Ｔ７チップ)又は基質遺伝子しか結合していないナノチップ(遺伝子チップ)の２種類を調製したが、これらは殆んど転写が見られなかったことから、基質遺伝子の直交性が確認された(図１１)。５’末端側で固定したＴ７遺伝子チップのＶｍａｘ値は８７ｎｔ／ｓであり、自由拡散系のＴ７ ＲＮＡＰ_{ＳＮＡＰｆ} の値(６２ｎｔ／ｓ)よりも大きかった。理論に拘束されることを望むものではないが、本結果は、強固に結合した水和層の作用、又はその他の機構（例えば、表面近傍のｐＨが、他の大部分におけるｐＨよりも小さい等）の作用を介して、多価陰イオン性の表面に固定された酵素の活性が促進され得ることを反映している可能性がある。

【0087】

［実施例５］酵素活性に影響を与える分子間距離の検討
次に、基質遺伝子固定部位（アンカー部位）とプロモーター配列間のリンカー長や、ＲＮＡＰ及び基質遺伝子固定位置間の距離を変えることにより、分子間距離が活性に与える影響を調べた(図２Ｄ、Ｅ)。異なるリンカー毎の分子間距離依存性により異なるピークプロファイルが生じ、これらはＤＮＡのワーム・ライク・チェイン（ＷＬＣ）モデルを前提とする予測衝突効率曲線におおよそ従っていた（図１２）。分子間距離を変更することで転写活性が変化したことから、２つの遺伝子の発現量を、その分子配置を変更することにより調節できることが期待された(図２Ｅ)。そこで、ＲＮＡＰと２つの遺伝子(ｓｆＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ)の分子間距離を調節し得るＴ７遺伝子チップを調製した。無細胞翻訳システム（ＰＵＲＥシステム）におけるＴ７遺伝子チップの転写活性及び付随する翻訳活性は、それらの発現比から、当該２遺伝子の相対的な分子間距離依存性を明確に示しており(図２Ｅ、図１３)、これは、各々の分子間距離を調節することによって、複数の遺伝子発現モジュールを合理的に設計できることを示している。乃ち、上記結果は、ＤＮＡオリガミテクノロジーのナノレベルでの分子配置能力により、直交性の転写ナノチップを合理的に設計し得ることを証明している。

【0088】

回路間のクロストークを完全に回避することが困難であることから、合成生物学における重要な課題は、細胞サイズの閉鎖系反応容量中において複雑な遺伝子回路を構築することといえる。電子コンピュータ工学では、論理チップのユニットを組み合わせて用いることにより、論理回路の各サブセットが閉鎖領域に配置された、高性能の大規模な回路(例えば、ＬＳＩ（大規模集積回路）)が製造される。仮に、閉鎖されたチップ内において、あるシグナルを感知し、論理演算を実行し、且つ、出力を生成することができる直交性ユニット要素が存在するならば、生物学的遺伝子回路においてもまた電子工学におけるアプローチと同様のアプローチを採用し得る可能性があり、かかるアプローチは、同一のナノチップ上に必要とされる要素の全てを一体化させることができ、且つ、直交性の転写ナノチップの合理的設計を達成可能なＤＮＡオリガミ技術を用いることにより実現し得る可能性がある。

【0089】

［実施例６］ナノチップが単一ユニット要素として機能し得るかの確認
先ず、ナノチップが単一ユニット要素として機能し得るかを、極度に希釈されたナノチップの活性を測定することにより確認した。そのために、人工細胞を模したＰＵＲＥ無細胞翻訳システムを含有する油中水（ｗ／ｏ）滴内に、ナノチップを封入した。次いで、当該油中水（ｗ／ｏ）滴内における、１）結合ナノチップシステムの遺伝子発現活性を、２）ＤＮＡによって開始される拡散反応をベースとした系の遺伝子発現活性、又は３）ｍＲＮＡによって開始される拡散反応をベースとした系の遺伝子発現活性と比較した(図３Ａ)。チップ濃度が１チップとなるまで液滴中のチップ濃度を低下させた。期待していた通り、３つの系全てにおいて、核酸基質濃度を下げるにつれてタンパク質の全産生量は減少した(図３Ａ、図１４)。しかし、ｍＲＮＡが開始させる反応においては、他の２つの系に比べて、ｓｆＧＦＰタンパク質を産生するために必要な基質濃度が３オーダー高かった。この違いは、他の２つの系が転写での追加的増幅を経ているのに対して、ｍＲＮＡが開始させる反応では翻訳段階によってしか遺伝子発現が増幅されないとの事実を反映している可能性がある。さらに遺伝子濃度を低減することにより、各人工細胞は不均一な蛍光強度を示し、遺伝子濃度の低下に伴って蛍光を発さない細胞数が増加した(図３Ａ、Ｂ)。０．８ｐＭのナノチップ濃度では、各細胞の蛍光強度分布は、約１５００（ａ．ｕ．）の間隔で量子化された特有のピークを示した。０．４ｐＭのナノチップ濃度では、ピーク数は１つまで減少し、大半の細胞は蛍光を発さず、僅かな細胞だけが約１４５０±１１７（ａ．ｕ．）（ｎ＝３、１２ｎＭのｓｆＧＦＰ分子に相当)のピークを示した。これは、該後者のピークが、単一のナノチップを有する人工細胞に相当することを示す。自由拡散系のＤＮＡ遺伝子の系では、１００ｎＭの自由拡散系のＲＮＡＰを用いた場合に、約１３１０±４６６（ａ．ｕ．）（ｎ＝３）のピークを示し(図４Ｂ)、これより単一のナノチップの活性は１００ｎＭの自由拡散系のＲＮＡＰ(すなわち、直径２０μｍの人工細胞において１０^４～１０^５分子)の活性と同等であることが示された(図１４)。これらの結果は、ナノチップの高い転写活性を示すバルク実験(図１Ｆ、図２Ｂ)と合わせると、バルク溶液及び人工細胞系において、ナノチップは基質遺伝子を効率的に転写していることを示す。なお、本発明者らは２遺伝子の共発現アッセイを用いて、必要な要素全てを同一ナノチップ上に固定できることも確認した(図１５)。

【0090】

［実施例７］論理チップとしてナノチップが機能し得るかの検討
ナノチップがユニット要素（素子）として機能することを確認した後、ナノチップが、あるシグナルを感知し、論理演算を実行し、アウトプットを生成し得る論理チップとして機能するかどうかを調べた。この目的のために、同一チップ上にセンサー及びアクチュエータ(ＲＮＡＰ酵素)を組み合わせ、ナノチップ上に論理ゲートを固定させた(図１６、図１７)。これにより、感知されたシグナルは演算され、出力に直接変換される。

【0091】

［実施例８］論理チップの再プログラムの検討
ナノチップが論理チップとして機能することを確認した後、ナノチップに搭載されている論理が、作製後に書き換え可能かを調べた。この目的のために、光架橋性塩基が入ったステープルをチップに導入し、センサーを結合させた（図４）。これにより、搭載センサーは、ＵＶ光照射の有無で、論理内容が変更される。

【0092】

＜センサー設計の３つの重要な要素＞
本実施例では、核酸ベースの生体高分子を含むセンサーを使用した。そのため、以下の３つの重要な要素が考慮された（図１７Ａ）。

【0093】

１）センサーの剛性
センサーの剛性が酵素・基質間の衝突効率の分子間距離依存性を決定する。ＤＮＡのワーム・ライク・チェイン(ＷＬＣ)モデルを想定することで、ｄｓＤＮＡリンカーが予測される衝突効率曲線に概ね従うことが示された。

【0094】

２）ＲＮＡＰのスキャニング能力
ＲＮＡＰは、プロモーター領域外の他の配列と相互作用し、ｄｓＤＮＡに沿って長距離を移動することができる。この特徴は、センサー(リンカー)の剛性に基づく予測値を超えてＲＮＡＰがアクセスし得る領域を拡大し得る可能性がある。

【0095】

３）ＲＮＡＰの引張力
統合システムでは、センサーとＲＮＡＰは剛性の足場に固定されており、これにより両者に内部張力(力)がもたらされる。具体的には、引張(伸張)力がセンサーにかかり、アシスト力がＲＮＡＰにかかった。引張力とアシスト力の影響を評価するために、それぞれを順に検討した。引張力に関しては、シグナル(ｍｉＲＮＡ)の非存在下であってさえも、いくらかの「ＯＮスイッチ」がセンサーのステムループの平衡定数より計算された値よりも高いリーク活性を有していた(図１８Ｄ)。例えば、センサーの二次構造形成における自由エネルギー変化ΔＧが約－５ｋｃａｌ／ｍｏｌである場合、平衡定数Ｋ＝ｅｘｐ（－ΔＧ／ＲＴ）は数千のオーダー(約３４００)であり、センサーの大部分は折畳まれた状態となる。しかしながら、ΔＧが約－５ｋｃａｌ／ｍｏｌでは、センサーは、ｍｉＲＮＡシグナルが存在しない場合ですら、半分活性化した。このリークは、引張（伸張）力の影響によって説明できると推測された。そこで、ΔＧを指標とした引張力の影響を検討した。アシスト力に関しては、微小管に沿って移動するキネシンモータータンパク質は高い負荷依存性を有する一方で、高いＮＴＰ濃度においてＲＮＡＰの負荷依存性は低いとの事実を考慮し、ナノチップ設計に関しては、ＲＮＡＰにかかる引張(伸張)力の影響のみを考慮し、アシスト力は考慮しなかった。

【0096】

＜効果的なセンサーアーム長への引張(伸張)力の影響＞
本実施例においては、ｍｉＲＮＡプロファイルを検出するために、ｓｓＤＮＡドメイン及びｄｓＤＮＡドメインを有するセンサーを設計した(図１７Ｂ)。前者のｓｓＤＮＡドメインはｍｉＲＮＡ結合部位を提供し、後者のｄｓＤＮＡドメインは剛性スペーサーとして働く。テンションが無い場合、ｓｓＤＮＡは柔軟なバネとして挙動するため、ｄｓＤＮＡリンカーに隣接し、それ故プロモーター領域に近接するｓｓＤＮＡの自由末端は、ｓｓＤＮＡの他方の末端(アンカー側の固定末端)に近づくべきである。しかし、上記のように、ＲＮＡＰのスキャニング能力と引張力がリンカー長を伸ばし、これにより自由端とプロモーター領域が高分子量ポリマーのモデル(例えば、ＷＬＣモデル)から予測される領域より広い領域にアクセスできると考えられた。そこで、実験によって単純化した経験則を決定した。

【0097】

ｍｉＲＮＡ結合に際して、リンカーのｍｉＲＮＡ結合部位はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド二本鎖（ｄｓＤ／ＲＮＡ）を形成した(図１８Ａ参照)。ｄｓＤ／ＲＮＡがｄｓＤＮＡと類似した物理的性質を有すると仮定すると、ｄｓＤＮＡの持続長(１５０ｂｐ)よりも短い、２１～２２ｂｐのｄｓＤ／ＲＮＡは、剛体棒とみなすことができる。簡略化のため、以下の仮定を用いた：先ず、実際にはｓｓＤＮＡはｄｓＤ／ＲＮＡの両末端に位置するが、ｓｓＤＮＡが一方の末端にのみ存在するものと仮定した。加えて、リンカーの二本鎖部分が剛体棒であり、且つ、ＲＮＡＰによって伸長される一本鎖部分がヌクレオチド当たり一定の平均長を有すると仮定した。

【0098】

上記仮定全てを考慮すると、センサーアームの有効長（アンカー位置から始まり、プロモーター配列で終わるリンカー部分として定義される）は、ＯＮ及びＯＦＦ状態に関し、以下のとおり定義される:

【0099】

【数2】

【0100】

【数3】

【0101】

（式中：Ｃ_{ｄｓＤＮＡ}＝定数 ここでは０．３４（ｎｍ／ｂｐ）
Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}：ｏｆｆ状態におけるｓｓＤＮＡに対する未決定の定数
Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｎ}：(ＲＮＡＰによって伸ばされた)ｏｎ状態のｓｓＤＮＡにおける未決定の定数
Ｎ_{ｄｓＤＮＡ}：センサーのｄｓＤＮＡ部分における塩基数
Ｎ_{ｄｓＤ／ＲＮＡ}：ｄｓＤ／ＲＮＡの塩基数 ここではＮｘ（２１－２２）
（Ｎ：ｍｉＲＮＡ結合部位の数)
Ｎ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}：ｏｆｆ状態のセンサーにおけるｓｓＤＮＡ部位の塩基数
Ｎ_{ｓｓＤＮＡｏｎ}：ｏｎ状態のセンサーにおけるｓｓＤＮＡ部位の塩基数。）

【0102】

有効なセンサーアーム長を予測するために、未決定の定数：Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}とＣ_{ｓｓＤＮＡｏｎ}を決定した。先ず、Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}を検討した。テンションがなければ、Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}値は小さくなる。しかしながら、ＲＮＡＰにより引っ張られた場合、Ｃ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}値は大きくなり得る。効果的なセンサーアーム長を予測するために、最大アーム長を見積もる必要がある。それ故、テンションが働く状況下のＣ_{ｓｓＤＮＡｏｎ}に近似することができる、テンションが働く状況下のＣ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}の決定を試みた。これにより、テンションが働く状況下のＣ_{ｓｓＤＮＡｏｆｆ}及びＣ_{ｓｓＤＮＡｏｎ}と同等である、新しい定数Ｃ_{ｓｓＤＮＡ}を導入した。ｓｓＤＮＡ(０－６０ｎｔ)及びｄｓＤＮＡ(２５－８５ｂｐ)を含むリンカーの長さを変えながら、酵素と基質間の固定された分子間距離(５０ｎｍ、図１７Ｃ)でチップ活性を測定した。同一のｄｓＤＮＡリンカー長を用いた場合、短いｓｓＤＮＡリンカーを有するセンサーアームは短すぎてチップ活性を活性化することができず、一方、長いｓｓＤＮＡリンカーを有するセンサーアームは活性化に対して十分な距離を有する(図１７Ｃ)。ＯＦＦからＯＮへの切り替わる転換点のアーム長を仮定した場合、異なるｓｓＤＮＡ／ｄｓＤＮＡの組み合わせを用いて得られたデータセットは、推定されるセンサーアーム長に従って、類似の活性プロファイルを示し得る。この仮定を用いることにより、テンションが働く状況下でのＣ_{ｓｓＤＮＡ}値は、本実験の実験条件下において約０．２３ｎｍ／ｎｔと推定された(図１７Ｄ)。該データは、センサー活性のリークがない場合、ＯＮ／ＯＦＦ比が数百にまで達することも示唆している。

【0103】

以後、センサーを設計する上で、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡについて、それぞれ０．２３ｎｍ／ｎｔ及び０．３４ｎｍ／ｂｐを用いて、センサーアーム長を推定した。

【0104】

センサー設計に関しては、ナノチップの長所を活かし、酵素及び遺伝子の分子間距離を制御することで、遺伝子発現プラットフォームを合理的に設計した。例えば、シグナル(例、ｍｉＲＮＡ)がない場合は、ステムとループから構成される「ＯＮスイッチ」のプロモーター配列はＲＮＡＰに届かなかったが、シグナルのハイブリダイズ時は、トーホールド（Ｔｏｅ－ｈｏｌｄ）の変形が起こり、転写を開始するに十分な到達距離まで「ＯＮスイッチ」アームを伸長させた(図４Ａ、図１８－２１)。分子間距離を制御する類似アプローチを逆方向の調節に用いることで、「ＯＦＦスイッチ」を製造することができる(図２２)。「ＯＮスイッチ」には直交性があることから、２つ又は３つの異なる「ＯＮスイッチ」を単純に直列に接続することで、「ＡＮＤスイッチ」を構築することができ(図４Ｂ、Ｃ、図２３、図２４)、当該ＡＮＤスイッチは、単一チップでも作動した(図２３、図２４)。合成遺伝子回路において３入力ＡＮＤスイッチは６つのサブスイッチ及び計４７の因子を必要とし（文献Nielsen et al., Science. 352, aac7341, 2016）、多数の分子を含むため、かかる構成要素をさらに組み合わせての演算回路の作成には困難を伴う。入力シグナルと動作環境はかなり異なるが、単一のナノチップ分子は論理的には４７の因子からなる複雑な遺伝子回路と同等の機能を有し、これは合成遺伝子回路が、さらに簡易化できる可能性を示唆している。

【0105】

＜ＯＮスイッチの構造＞
有効なセンサーアーム差を最大化するために、ステムループ構造を使用した(図１８Ａ)。ステムループ構造では、ＯＦＦ状態においてセンサーアームの末端間距離は短く(数ｎｍ程度)、ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションにより誘導される展開時には、その末端間距離は転写を活性化するのに十分な長さとなる。ステムループは、トーホールド(Ｔ)、ハイブリダイゼーション(Ｈ)、ループ(Ｌ)、アンチハイブリダイゼーション(Ｈ^*)、及びステムループとリンカーの他の部分との間のスペーサーの５つのドメインを有する。トーホールドドメイン及びハイブリダイゼーションドメイン(図１８Ｂ)に結合するｍｉＲＮＡは、先ずトーホールドドメインに結合し、次にステム構造に侵入し、最後にステムループを展開する。ポリＴ配列を含むループドメインは、ＯＦＦ／折畳み状態(ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション前)におけるｍｉＲＮＡに対する親和性の向上に寄与するとともに、ＯＮ／展開状態(ハイブリダイゼーション後)におけるセンサーアームの到達距離の延長に寄与している。安定したハイブリダイゼーションをサポートするために、ステム構造の根元に「サポートハイブリダイゼーション（ｓｕｐｐｏｒｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」をさらに導入した。スペーサーは、ｍｉＲＮＡのセンサーへの結合に影響する立体障害を防ぐために導入した。

【0106】

＜ＯＮスイッチ設計における主な要素＞
ＯＮスイッチの設計にステムループ構造を使用したことにより、スイッチのＯＮ／ＯＦＦ状態それぞれに対して重要な因子が存在する。センサーアームがｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションによって伸張するＯＮ状態では、プロモーター配列のＲＮＡＰへの効率的な衝突を保証するためにセンサーアームを十分に伸長させることが極めて重要である。従って、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡリンカードメインを含むセンサーアーム(図１７Ｂ)の到達距離(有効な末端間距離)が重要な要因である。ｓｓＤＮＡリンカードメインはｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションによって変形し展開するが、短いｄｓＤＮＡは一定の長さを有する剛体棒とみなし得ることから、ｓｓＤＮＡリンカードメインの有効長が重要となる。ステムループ構造が折畳み形態をとるＯＦＦ状態では、ステム構造の安定性が、リーク活性の阻止及びｍｉＲＮＡ結合のためのループ部分の自由度を十分な程度に維持するために極めて重要である。従って、センサーの二次構造形成における自由エネルギー変化ΔＧ、及びループ長が重要な要因となる。

【0107】

＜センサーアーム長＞
ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡのリンカードメインを含むセンサーアーム長を検討した。上述した通り、ｓｓＤＮＡリンカードメインはｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションの際に展開されるが、短いｄｓＤＮＡリンカードメインは一定の長さを有する剛体棒とみなし得る。それ故、ＯＦＦからＯＮ状態への切り替えにおける有効センサーアーム長の違いは、主に、ｓｓＤＮＡリンカードメインの変化に起因する（図１８Ｃ）。したがって、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡのリンカーの最初の試行におけるリンカー長を決定する目的で、先ず、ｓｓＤＮＡリンカードメインについて検討した。

【0108】

ｓｓＤＮＡリンカードメイン長に関しては、２つの限界点（必要な長さの最小値及び利用可能な長さの最大値）を検討することができたが、ｄｓＤＮＡリンカードメインを長く（又は短く）することによって、有効センサーアーム長の不足（又は過剰）を相殺できることから（図１７Ｄ）、ここでは利用可能な最大長について検討した。実験的に利用可能なヌクレオチド長は、１）市販のＤＮＡ合成サービスの最大ヌクレオチド長(Ｎ_{ｓｅｒｖｉｃｅ}、ＯＮスイッチについて９０ｎｔ)、及び、２）センサー結合基質遺伝子に対するＰＣＲプライマーの最大ヌクレオチド長(Ｎ_{ｍａｘ－ｐｒｉｍｅｒ}、ＯＮスイッチについて３１ｎｔ)が限界である。従って、本実施例において利用可能な最大のｓｓＤＮＡリンカードメイン長は、５９ｎｔ(＝９０－３１)であった。

【0109】

ｓｓＤＮＡリンカードメインについて最初に試行する長さを５９ｎｔと設定し、次に、センサーアーム長の残りの部分であるｄｓＤＮＡリンカードメインについて検討した(図１７Ｂ)。ｓｓＤＮＡリンカーとしてポリＴ配列を用いた実験結果(図１７Ｄ)を考慮し、６５ｎｔのｄｓＤＮＡリンカーのデータ(図１７Ｄ)が、ｓｓＤＮＡリンカーが展開時に大部分のＯＦＦからＯＮへの切り替えをカバーしたことから、最初の試行長として４５ｎｔのｄｓＤＮＡリンカーを選択した。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション後のセンサーアームの二本鎖部分の塩基数は、４５ｎｔのｄｓＤＮＡリンカーを有することから、６７ｎｔであった(Ｎ_{ｄｓＤＮＡ}＋Ｎ_{ｄｓＤ／ＲＮＡ}＝４５＋２２＝６７ｎｔ)。

【0110】

ＯＮスイッチに関する他の実施例では、５９ｎｔのｓｓＤＮＡと４５ｎｔのｄｓＤＮＡリンカードメインを含むセンサーアーム長を用いた。

【0111】

＜各センサードメイン長の最適化＞
次に、５９ｎｔのｓｓＤＮＡリンカードメインを用いて、５つのドメイン(トーホールド(Ｔ)、ハイブリダイゼーション(Ｈ)、ループ(Ｌ)、アンチハイブリダイゼーション(Ｈ^*)及びスペーサー)の長さを最適化した。ステム構造の安定性とトーホールドの変化の動態はセンサーの二次構造形成における自由エネルギー変化ΔＧ及び有効ループ長(Ｔ＋Ｌ≡Ｌ')に大きく依存するため、主にハイブリダイゼーション長(Ｈ)と有効ループ長(Ｌ')を検討した。さらに、できるだけ長いトーホールド長を維持するために、ステムの根元にサポートハイブリダイゼーションを１ｂｐ導入し(図１８Ｂ)、有効なハイブリダイゼーション長Ｈ'(＝Ｈ＋１)を変化させてチップ活性を評価した。このＨ'と有効ループ長Ｌ'(＝Ｔ＋Ｌ)を使用して、プライマーを命名した(表１～７)。例えば、Ｈ１２Ｌ３１は１２ｎｔのＨ'及び３１ｎｔのＬ'を有する(Ｈ＝Ｈ'－１＝１２－１＝１１ｎｔ、Ｔ＝（Ｔ＋Ｈ）－Ｈ＝２１－１１＝１０ｎｔ(備考：ｌｅｔ－７は２１ｎｔ)、Ｌ＝Ｌ'－Ｔ＝３１－１０＝２１ｎｔ)。

【0112】

ＮＵＰＡＣＫソフトウェア(http://www.nupack.org/)を用いてΔＧを計算したところ、Ｈ'が長くなるほどに、負のΔＧ値がより大きくなることが判明した(図１８Ｄ)。チップ活性はΔＧに依存した(図１８Ｄ)。特に、ΔＧ値が比較的大きな（すなわち、ΔＧ値がゼロに近い）ステムループ及び比較的安定性に乏しいステムループに対して、ｍｉＲＮＡシグナルの存在下又は非存在下でチップ活性は近い値を示した。チップのリーク(ＯＦＦ)活性は、ΔＧが小さくなるほど(負の値が大きくなるほど)減少し、ΔＧ＜－６ｋｃａｌ／ｍｏｌでリーク活性は一定となった。対照的に、チップのＯＮ活性は、大部分のΔＧ値に対して一定であり、低ΔＧ（約－１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）においてわずかに減少した。これは、大きな負のΔＧ値では、ステムの安定性が高すぎるため、ｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションが妨げられることを示唆している。概して、ＯＮ／ＯＦＦ比は－１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ＜ΔＧ＜－８ｋｃａｌ／ｍｏｌ周辺でピーク値を示し(ＤＮＡモードにおけるＮＵＰＡＣＫ及び１Ｍ Ｎａ^＋濃度)、その際の有効なハイブリダイゼーションＨ'(＝Ｈ＋１)は１２ｂｐ～１４ｂｐであった。ここで、ΔＧが約－５ｋｃａｌ／ｍｏｌであってもリーク活性はＯＮ活性の約半分あり、これはＲＮＡＰの引張力がステム構造を広げ得ることを示す。

【0113】

ＲＮＡＰの引張力を克服するために、サポートハイブリダイゼーションを導入した(図１８Ｅ、Ｆ)。サポートハイブリダイゼーションにより、高いｍｉＲＮＡ親和性を得るための長いトーホールド長を維持しつつ、ＲＮＡＰの引張力に対してステム構造を安定化できると予想された。ステムの根元にＧＣ対を導入した。様々な数のＧＣ対を用いて検討したところ、２及び３のサポートハイブリダイゼーション長(乃ち、ＧＣ対)に対して、リーク活性の減少が観察され、ＯＮ／ＯＦＦ比が増加した。しかし、ＯＮ状態での絶対活性が減少するので、１ｂｐのサポートハイブリダイゼーション長を有するセンサーを使用した。

【0114】

次に、有効ループ長Ｌを評価した（図１８Ｇ、Ｈ）。様々なループ長Ｌ（１～２１ｎｔ)を有する、有効ハイブリダイゼーションＨ'＝１２ｂｐのチップ活性を比較した。ループが短くなるにつれて、チップの活性の低下が観察された。この結果は２つの要因（有効センサーアームの短縮及びｍｉＲＮＡに対する親和性の低下）によって説明され得る。従って、２１ｎｔのループを有するセンサーを使用した。

【0115】

概して、ｌｅｔ－７(このｍｉＲＮＡは２１ｎｔ)センサーでは、以下条件を有するセンサーを用いた：Ｈ'＝Ｈ＋サポートハイブリダイゼーション＝１１＋１＝１２ｎｔ、Ｔ＝（Ｔ＋Ｈ）－Ｈ＝２１－Ｈ＝１０ｎｔ、Ｌ'＝Ｌ＋Ｔ＝２１＋１０＝３１ｎｔ(１Ｍ ＮａＣｌ^＋でΔＧ＝－８．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５０ｍＭ Ｎａ^＋及び１８ｍＭ Ｍｇ^２＋（ＰＵＲＥシステムの条件)でΔＧ＝－７．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。次に、このｌｅｔ－７センサーの動態パラメーターを測定した。ゲルシフトアッセイによって、ｍｉＲＮＡ結合定数(Ｋｏｎ)約３×１０^５／Ｍ／ｓを得た(図１９Ａ、Ｂ)。また、活性測定から、見かけのミカエリス定数(Ｋｍ)約１９ｎＭを得た(図１９Ｃ)。

【0116】

＜ＯＮスイッチの直交性＞
遺伝子回路でセンサーを使用するために、他のｍｉＲＮＡに対する直交性を確認することは重要である。センサーの直交性の分子基盤を調べるために、ｍｉＲＮＡセンサー対にミスマッチを導入した(図２０Ａ)。２連続のミスマッチを有し(例えば、「ｍｍ１－２」は、第１及び第２のヌクレオチドにミスマッチを有する)、低い二次構造形成能(ΔＧ 約０)を有する２０種のミスマッチｍｉＲＮＡを調製した。ＮＵＰＡＣＫによって計算された結合比を比較することにより、チップ活性は１５％の結合比まで直線的に増加し、１５％を上回ると、ミスマッチｍｉＲＮＡはセンサーを完全に活性化した(図２０Ｂ)。チップ活性に影響を及ぼすミスマッチ位置は、トーホールドドメイン、及びトーホールド－ステム間のヒンジ領域に位置していた(図２０Ｃ)。反対に、ステムの根元のミスマッチはチップ活性に影響を与えなかった。これらの結果は、第１番目のヌクレオチドから１５番目ヌクレオチドまでの配列内部の配列の違いは検出可能であるが、第１６番目のヌクレオチド～第２１番目のヌクレオチドまでの配列内部の配列の違いは検出できないことを示唆する(位置はｍｉＲＮＡの５'末端からの順)。

【0117】

ミスマッチｍｉＲＮＡに対するチップの直交性を確認後、二次構造形成能が低い、ＨｅＬａ細胞で発現している７つのｍｉＲＮＡを選択した(図２１Ａ)。ｌｅｔ－７センサーは、ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡにのみ応答した(図２１Ｂ)。また、他のセンサーも、各センサーと同種配列のｍｉＲＮＡにのみ応答したことから、これらのセンサーが直交性であることが実証された(図２１Ｃ)。直交性の程度を評価するために、ｍｉＲ－２０６の５'末端の１０塩基と同一の配列を有するｍｉＲ－１－３ｐに注目した(図２１Ｃ、Ｄ)。ミスマッチ実験(図２０)からも予想されるように、ｍｉＲ－１－３ｐセンサーは、ほんのわずかしかｍｉＲ－２０６に応答しなかった。これは、設計されたセンサーが類似配列を区別し得ることを示唆している。なお、ｍｉＲＮＡ濃度を２５ｎＭから１００ｎＭに増加させたにもかかわらず、ｍｉＲ－２２４－５ｐセンサーが他のセンサーよりも、同種配列を有するｍｉＲＮＡ（乃ち、ｍｉＲ－２２４－５ｐ）に対する応答性が低かった理由は、ｍｉＲ－２２４－５ｐの自己二量体化に起因すると推測される(図２１Ｅ)。従って、本発明のアプローチは、自己二量体化したｍｉＲＮＡを検出するのには不向きである可能性がある。

【0118】

＜ＯＦＦスイッチ設計＞
ＯＦＦスイッチの設計は、ＯＮスイッチ設計の逆であった。乃ち、折り畳まれていないセンサー構造にｍｉＲＮＡが結合し、短い有効なセンサーアームでセンサーがステムループ構造へと折り畳まれるように誘導し、チップの活性を低下させる(図２２Ａ)。ＯＦＦセンサーは、ｍｉＲＮＡがハイブリダイズし得るアンチｍｉＲＮＡドメイン、ポリＴドメイン、及びかかる２つの間に、サポートハイブリダイゼーションドメインを有する(図２２Ｂ)。サポートハイブリダイゼーションドメインを有さないセンサーは、低いＯＮ／ＯＦＦ比を示し(図２２Ｃ、Ｄ)、また、サポートハイブリダイゼーションドメインを有するセンサーであっても、３７℃では低いＯＮ／ＯＦＦ比を示すことを見出した。そこで、２３℃において、サポートハイブリダイゼーションドメインを有するセンサーからデータを得た。隔てられたｍｉＲＮＡ標的ドメイン(それぞれ約１１ｎｔ)とＲＮＡＰ引張り力は、共に、ｍｉＲＮＡのアンチｍｉＲＮＡドメインへのハイブリダイゼーションの安定性を低下させるためである。動態分析により、６ｂｐのサポートハイブリダイゼーションドメインを有するセンサーでは、阻害定数(Ｋｉ)は４６ｎＭであることが明らかになった(図２２Ｅ)。

【0119】

＜２入力ＡＮＤスイッチの設計(図２３に関連)＞
２入力ＡＮＤスイッチを設計するために、２つのＯＮスイッチをシンプルにタンデムに連結した(図２３Ａ)。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションにより、活性化のための有効なセンサーアーム長が十分に増加する(図２３Ｂ)。ｌｅｔ－７とｍｉＲ－１９７－３ｐのＯＮスイッチをタンデムに接続したとき(図２３Ｃ)、結果として生じるＡＮＤスイッチは、両方のｍｉＲＮＡが存在したときのみ、活性を示した(図２３Ｄ)。さらに、油中水(Ｗ／Ｏ)滴実験を用いて、当該ＡＮＤスイッチの単一チップでの演算を確認した(図２３Ｅ)。

【0120】

２入力ＡＮＤスイッチには、８７ｎｔのｓｓＤＮＡを用いた(＝ＤＮＡ合成サービスで得られる最大ＤＮＡ長(Ｌ_{ｓｅｒｖｉｃｅ}、ここでは１００ｎｔ)－プライマー長(Ｌ_{ｐｒｉｍｅｒ}、ここでは１３ｎｔ))。ＮＵＰＡＣＫで予測されたｍｉＲＮＡとセンサーの結合比を用いて、各ＯＮスイッチのポリＴ長とステムループ長を調整した。また、ｄｓＤＮＡリンカー長も最適化した。活性化状態では、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡのヌクレオチド数は、それぞれ、２２ｎｔ（１つのｍｉＲＮＡ長)及び６ｎｔ（＝８７－５９－２２）増加し、従って、その差は、ｄｓＤＮＡの約２６ｎｔ（２２＋６×０．２３／０．３４)に等しかった。ＯＮスイッチのｄｓＤＮＡは４５ｎｔ長であるため、１９ｎｔ前後(１３、１９又は２５ｎｔ)へｄｓＤＮＡリンカーを調整し、ｌｅｔ－７／ｍｉＲ－１９７－３ｐＡＮＤスイッチでは、１９ｎｔが最適であることを見出した。

【0121】

＜３入力ＡＮＤスイッチの設計(図２４に関連)＞
３入力ＡＮＤスイッチを設計するために、３つのＯＮスイッチをシンプルにタンデムに繋げた(図２４Ａ)。ｌｅｔ－７ ＯＮスイッチ、ｍｉＲ－２０６ ＯＮスイッチ、及びｍｉＲ－９２ａ－３ｐ ＯＮスイッチをタンデムに繋げた場合(図２４Ｂ)、結果として生じるＡＮＤスイッチは、３つのｍｉＲＮＡが存在するときにのみ活性を示した(図２４Ｃ)。ｌｅｔ－７／ｍｉＲ－２０６／ｍｉＲ１９７－３ｐ及びｌｅｔ－７／ｍｉＲ３６５ａ－３ｐ／ｍｉＲ１８３に対する３入力ＡＮＤスイッチにおいても同様の挙動が観察された(図２４Ｃ)。さらに、油中水（ｗ／ｏ）滴実験を用いて、当該ＡＮＤスイッチの単一チップでの演算も確認された(図２４Ｄ)。

【0122】

詳細な設計アプローチは、２入力ＡＮＤスイッチと同様であった。簡潔には、１）２入力ＡＮＤスイッチと３入力ＡＮＤスイッチの違い、又は２)ＯＮスイッチと３入力ＡＮＤスイッチの違いを考慮して、ｓｓＤＮＡリンカー長を１３３ｎｔ(約４４ｎｔ×３＋スペーサー)として、ｄｓＤＮＡリンカー長(４５ｎｔ)及び分子間距離(７０ｎｍ)を調節した。

【0123】

分子間距離を調節するとのアプローチにより、異なる構造のナノチップにおける論理機能の変更が可能となった。本アプローチを用いることにより、３入力ＡＮＤゲートは、分子配置(アンカー部位)の変更又はリンカー長の変更によって、それぞれ、３入力「ＯＲゲート」又は「ＭＡＪＯＲＩＴＹ（多数決）ゲート」に変換することができた（図４Ｄ、Ｅ、図２５）。これは、同一のセンサー配列を用いて論理回路を繰り返し再プログラムし得ることを示唆している。

【0124】

＜同一の遺伝子・基質を用いての異なる論理機能(図２５に関連)＞
分子間距離とリンカー長の調節を用いて、酵素(ＲＮＡＰ)と酵素結合ドメイン(プロモーター)の衝突頻度、及びそれに続く環境シグナルに対する応答を変化させた(図１６Ｅ)。また、３入力ＡＮＤスイッチについて、アンカー位置及びｄｓＤＮＡリンカー長も変更した(図２５)。その結果、分子間距離を７０ｎｍから５０ｎｍに変更することで、３入力ＯＲスイッチに変換し得ること、及びｄｓＤＮＡリンカーを４５ｎｔから８５ｎｔへ伸長させることで、３入力多数決スイッチに変換し得ることが示された。かかる結果は、同一のセンサー配列を有する論理回路を再プログラムすることが可能であることを示唆する。

【0125】

詳細な設計原理は次のとおりである:
１)ＯＲスイッチ：３入力ＡＮＤスイッチにおいては３つの同時入力が必要であるが、ＯＲスイッチでは、１つの入力のみあればよい。そこで、分子間距離を７０ｎｍから５０ｎｍへ変更した。この差は、２つの入力から２つのステム構造の厚さを差し引いたものに相当する(２２ｎｔ×２×０．３４ｎｍ／ｎｔ＋２２ｎｔ×２×０．２３ｎｍ／ｎｔ－４～２１ｎｍ。図２５Ａ)。

【0126】

２）多数決スイッチ：多数決スイッチにおいては、２つの同時入力がスイッチを活性化し得る。それ故、ｄｓＤＮＡリンカー長を４５ｂｐから８５ｂｐに変更した。この差は、１つの入力から１つのステム構造の厚さを差し引いた引いたものに相当する(２２ｎｔ×１×０．３４ｎｍ／ｎｔ＋２２ｎｔ×１×０．２３ｎｍ／ｎｔ－３１ｎｔ ｄｓＤＮＡ分の長さ２～１１ｎｍ。図２５Ｂ)。

【0127】

［実施例９］ナノチップを用いた遺伝子回路の構築
ナノチップを用いて遺伝子回路を構築した。溶液中において３つのｍｉＲＮＡに応答する２つの「ＡＮＤスイッチ」を接続した(図４Ｆ、図２６－２８)。第１の「ＡＮＤスイッチ」は２種類のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ－２０６及びｍｉＲ－９２ａ－３ｐ）に応答し、伝達シグナル（出力）としてｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡを産生する。第２の「ＡＮＤスイッチ」は、ｍｉＲＮＡ－１９７－３ｐと前記伝達シグナルに応答する。これにより、ナノチップで構築された全回路は、ｍｉＲＮＡプロファイルを演算し、ｓｆＧＦＰのｍＲＮＡを出力する(図４Ｆ)。分子配置、ＲＮＡＰ活性及び遺伝子基質配列の更なる最適化により、該スイッチ活性が改善されると考えられる。特に、ＲＮＡＰのスキャニング活性に起因するスイッチのリークを抑制する必要がある（図１８）。

【0128】

＜ナノチップを用いたカスケード応答(チップ間コミュニケーション;図２６～２８に関連)＞
複雑なタスクを実行するためには、論理演算の効率的なカスケード応答(コミュニケーション)が重要である。従って、１）高伝達流、２）(入力/伝達/出力)流れの直交性、及び、３）低リーク流が重要な要因となる。高い直交性、及び低リーク流については検討済であることから、本実施例では、高伝達流に着目し、資源(例えば、エネルギー)限界、ｍｉＲＮＡ阻害、及びその両者の組み合わせによる影響について調べた。

【0129】

先ず、資源限界の影響を調べた。論理チップのカスケード応答(コミュニケーション)が反応拡散系に基づいている第１世代の集積ナノチップを用いた場合、伝達率は論理チップの出力流量に依存した。出力流量を増加させ伝達率を促進する簡単な方法は、論理チップの濃度を増加させることである。しかしながら、人工細胞や試験管においては現時点において代謝系が完全に再構成されていないことから、資源(例えば、エネルギー)の限界が問題となり得る。例えば、多段階遺伝子回路では、最後尾のチップは最先のチップの活性化と比較してかなり遅れて活性化され、系全体の演算を保証するためには、全てのチップが各段階において資源が枯渇する前に活性化される必要がある。それ故、第一にチップ濃度の最適化を検討した(図２６Ａ)。０．０３２～１ｎＭの間の代表的な値である０．５２ｎＭのチップ濃度において、反応開始後１８０分で活性が最大となることが観察された。対照的に、ｓｆＧＦＰの蛍光強度は１ｎＭチップ濃度において約９０分で飽和しており、これは資源消費を示している。従って、基礎条件として０．５ｎＭ以下のチップ濃度を選択した。

【0130】

次に、いくつかのＲＮＡがＴ７ ＲＮＡＰ活性を阻害することが報告されていることから、遺伝子回路上のｍｉＲＮＡ、シグナル及びトランスミッターの阻害効果を測定した(図２６Ｂ)。５００ｎＭのｍｉＲＮＡでは、０～５００ｎＭ間の他の濃度と同様に、ｓｆＧＦＰ蛍光強度(チップ活性の指標)は６０分で約８６％、１８０分で８１％であり、ｍｉＲＮＡが転写や翻訳にはほとんど影響しなかった。多入力実験用に１つの反応に複数種のｍｉＲＮＡを添加する場合、転写翻訳系に影響を与えることなくチップの活性化を保証するために、１００ｎＭ以下のｍｉＲＮＡ濃度を基礎条件として選択した。

【0131】

チップ及びｍｉＲＮＡの濃度を最適化した後、活性化タイミングの影響を確認した(図２６Ｃ)。アイドリング反応が資源を消費する場合、活性化後のチップ活性は減少する可能性がある。そこで、３７℃に昇温後、－３０分、０分、＋３０分及び＋６０分の時点でｍｉＲＮＡを加え、アイドリング反応を開始させたところ、－３０分及び０分の時点でｍｉＲＮＡを添加した場合に、類似する初期増加が観察された。この実験で使用された５０ｎＭのｍｉＲＮＡがセンサーに結合するためには１分しか要しない(５０ｎＭ×３×１０^５／Ｍ／ｓ＝０．０１５／ｓ；従って、τ＝６７ｓ（約１分)）ことから、この結果はセンサーへのｍｉＲＮＡのＫｏｎにより説明し得る(３×１０^５／Ｍ／ｓ、図１９)。また、＋６０分の時点でｍｉＲＮＡを添加したときの該添加後９０分及び１８０分の時点におけるｓｆＧＦＰ蛍光強度が、－３０分の時点でｍｉＲＮＡを添加した場合の当該数値と比較して９６％であったことから、ｍｉＲＮＡの添加タイミングはほとんど影響を与えないことが示された。次に、他のチップ（ｍＣｈｅｒｒｙ(ｓｆＣｈｅｒｒｙ)のｍＲＮＡを生成するセンサーレスのナノチップ）がアイドリング反応中に機能している条件下、すなわち、転写翻訳系が常時バックグランドで動作しているという条件下で、センサーチップの活性を調べた。＋３０分及び＋６０分の時点でｍｉＲＮＡを添加する条件下、ｍｉＲＮＡ添加から９０分の時点における活性は、－３０分の時点でｍｉＲＮＡを添加したときの活性に対して、それぞれ９１％及び６０％であったことから、本条件の場合においては、ｍｉＲＮＡ添加のタイミングが重要であることが示された(図２６Ｄ)。

【0132】

資源限界、ｍｉＲＮＡによる阻害、及び反応開始点の各影響を評価した後、遺伝子カスケード応答の活性を測定した。２つのＯＮスイッチ(図２７Ａ、Ｂ)、２つのＡＮＤスイッチ(図２７Ｃ、Ｄ)を含む応答を観察した。カスケード応答の動態をより詳細に理解するために、先ず各ステップ上の出力流の影響を調べた。第１チップの濃度が０．０４～１．８ｎＭの範囲では、全体的出力（すなわちｓｆＧＦＰの産生）が促進した(図２７Ｅ)。遺伝子回路の動態において異なる遺伝子・基質の影響を比較するため、１）集積ナノチップ、２）ＤＮＡ開始型の拡散反応系、及び３）ｍＲＮＡ開始型の拡散反応系の遺伝子発現活性を試験管内で測定した(図２７Ｆ)。無細胞転写翻訳ＰＵＲＥシステムにおいては、ｍＲＮＡ開始型の条件が最も早くｓｆＧＦＰを産生した。しかしながら、効率は非常に低く、ナノチップ及びＤＮＡ開始型において産生されるｓｆＧＦＰ産生量と同等のｓｆＧＦＰ量を産生させるためには、２００倍の濃度を要した(ｍＲＮＡ開始型では１００ｎＭ、ナノチップ及びＤＮＡ開始型では０．５ｎＭ)。ナノチップ開始型とＤＮＡ開始型(ＲＮＡＰ 約３０ｎＭ)反応とを比較することにより、チップ開始型反応がより速いことが示された。この結果は、ナノチップの基質・遺伝子の有効濃度が２μＭを超えるとの事実によって説明され得る。ナノチップに基づく遺伝子回路の動態を定量的に分析するため、Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｒｋｕｐ Ｌａｎｇｕａｇｅ(ＳＢＭＬ)シミュレーターを用いてこのデータをフィッティングした(図２７Ｇ)。見積もられたＲＮＡ産生速度は、ナノチップ開始型反応(ＲＮＡＰは、ナノチップのときと同じである。例えば、０．５ｎＭ。図２７Ｆ)、及びＤＮＡ開始型反応(ＲＮＡＰは約３０ｎＭ、図２７Ｆのナノチップ濃度の６０倍)で、それぞれ０．０３４及び０．０２／秒／分子であった。この違いは、これらの実験条件下では大きくはないものの、特に、ＲＮＡＰ及び基質・遺伝子が低濃度での多段階カスケード反応に影響し得る。かかる状況は、資源消費を防止できる閉鎖された反応容積(例えば、人工細胞)に複雑な遺伝子回路を封入する場合に生じ得る場合がある。

【0133】

全体として、油中水（ｗ／ｏ）滴中において２つのＡＮＤチップを含む遺伝子回路をモニターした(図２８)。迅速且つ効率的なコミュニケーションのために、第１のＡＮＤチップ濃度を１ｎＭ(約１０００チップ／滴)に増やし、翻訳による資源消費を低減するために、第２のＡＮＤチップの濃度を０．０８ｎＭ(約８０チップ／滴)に減らした。かかる条件下において、液滴中のｍｉＲＮＡプロファイルの自律的検出が達成された。

【0134】

［実施例１０］ＬａｃＩ／ＩＰＴＧセンサー
統合法を用いれば、センサーは物質的制約を受けないため、センサーを多様なシグナルに応答させることは可能であり得る。例えば、センサー材料としてｄｓＤＮＡを使用し、ＬａｃＩ－ＬａｃＯ対を用いたＯＮ及びＯＦＦスイッチを調製した(図２９)。四量体を形成するｄｓＤＮＡ結合タンパク質であるＬａｃＩは、２つのＬａｃＯ配列に結合できる(図２９Ａ)。プロモーター配列の上流の２つのＬａｃＯ配列を特徴とするＬａｃＩセンサーを構築した。これらのセンサーを異なる部位に固定することにより、反対の機能(ＯＮ及びＯＦＦ)を構築することができた(図２９Ｂ)。ＯＮスイッチに対するリンカーは、ＲＮＡＰがプロモーターに結合するのには長すぎるが、ＬａｃＩの結合により、リンカーが短縮され転写に適した有効なリンカー長となる(図２９Ｃ)。さらにイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド(ＩＰＴＧ)添加により、ＬａｃＯ配列からＬａｃＩの離脱が誘導され、その結果「ＯＮスイッチ」を無効化された(図２９Ｄ)。逆に、ＯＦＦスイッチでは、ＬａｃＩの非存在下においては転写に適したリンカー長であり、ＬａｃＩの存在下で短縮され、これにより転写活性を停止させる(図２９Ｅ、Ｆ)。

【0135】

［実施例１１］Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐ）スイッチの設計
低分子化合物を結合させる事が可能なアプタマーセンサーを用いたスイッチを作製した。例えば、センサー材料としてｓｓＤＮＡを使用し、Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（Ａｍｐ）に応答するＯＦＦスイッチを調製した（図３０）。Ａｍｐアプタマーは、ステムループ構造をしている（図３０Ａ）。プロモーター配列の上流の３つアプタマー配列を特徴とするＡｍｐセンサーを構築した。Ａｍｐの結合の際、センサーアームの到達距離が短くなるので、ナノチップの活性が低下する（図３０Ｂ）。Ａｍｐ存在下（ｗ／Ａｍｐ）で、転写活性と引き続く翻訳活性の低下が観察された（図３０Ｃ）。

【0136】

［実施例１２］ＮＡＮＤスイッチの設計
ｍｉＲＮＡセンサーを利用したＮＡＮＤスイッチを調製した(図３１)。２入力ＮＡＮＤスイッチを設計するために、２つのＯＮスイッチをタンデムに連結した（図３１Ａ）。ｍｉＲＮＡハイブリダイゼーションにより、有効なセンサーアーム長が増加し、スイッチは不活性化される(図３１Ｂ)。ｍｉＲＮＡ存在下で活性の低下を確認した(図３１Ｃ)。

【0137】

［実施例１３］実効固定端の変更によるスイッチング及び論理変更
実効固定端の変更によるスイッチング、及び論理変更を設計するために、ベース部材にセンサーと結合可能な第二固定点を導入した。例えば、センサー材料としてｄｓＤＮＡを使用し、第二固定点として、ＬａｃＩをベース部材に固定し、ＬａｃＩ－ＬａｃＯ対を用いたＯＮ及びＯＦＦスイッチを調製した（図３２）。ＩＰＴＧが元の固定点（第二固定点：ＬａｃＩ）と結合する際、センサーアームの到達距離の長さが伸び、ナノチップは活性化される(図３２Ａ)。ＩＰＴＧが元の固定点（第二固定点：ＬａｃＩ）と結合する際、センサーアームの到達距離の長さが短くなり、ナノチップは不活性化される（図３２Ｂ）。

【0138】

これらの結果は、有効なセンサーアーム長を調節することによって可能となる論理機能を介して、様々なシグナルを検出するための統合法の可能性を示唆している。さらに、同一の固定された基質・遺伝子を有するセンサーが反対の論理機能を示したことから、有効リンカー長の調節、センサーの配置変更及び足場の変形を介して、遺伝子回路において反復可能な再プログラミングが可能であることを示唆している。

【0139】

［実施例１４］ＵＶ照射によるＯＮ/ＯＦＦスイッチング
光応答性人工核酸塩基ｃｎｖＫを用いた架橋及び乖離（開裂）を利用して、ＵＶに反応してナノチップの機能をＯＮ/ＯＦＦスイッチングできるチップを設計した。３６６ｎｍのＵＶを５分間照射した際（Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ１）、ｃｎｖＫが架橋し、センサーアームの到達距離が短くなるので、ナノチップの活性が低下した（図３３Ａ、Ｂ）。該活性が低下した状態において、さらに３１２ｎｍのＵＶを１０分間照射した場合(Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ２)、ｃｎｖＫが乖離し、センサーアームの到達距離の長さが伸び、ナノチップは活性化された（図３３Ａ、Ｂ）。
図３４Ｂに示す結果からも明らかなように、本発明のデバイスは、実際にＯＮ/ＯＦＦ切り替えスイッチとして設計することが可能である。

【0140】

［実施例１５］ＵＶ照射（入力）とｍｉＲＮＡプロファイルに応答する回路構築
ＵＶを活性化源とするセンサー（を有するデバイス１（チップ１））とｍｉＲＮＡを活性化源とするセンサー（を有するデバイス２（チップ２））を用いて遺伝子回路を構築した。溶液中においてＵＶ（入力）に応答する「ＮＯＴスイッチ」（チップ１）と、３つのｍｉＲＮＡ（入力）に応答する「ＡＮＤスイッチ」（チップ２）を接続した(図３４Ａ)。「ＮＯＴスイッチ」は、ＵＶ照射を行わない場合に伝達シグナル（出力）としてｍｉＲ－２０６を産生する。「ＡＮＤスイッチ」は、ｌｅｔ－７ ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ－１９７－３ｐと前記伝達シグナルに応答する。これにより、ナノチップで構築された全回路は、ＵＶ照射とｍｉＲＮＡプロファイルを演算し、ｓｆＧＦＰのｍＲＮＡを出力する(図３４Ａ)。
構築した遺伝子回路において、ＵＶ照射とｍｉＲＮＡプロファイルに応じたｓｆＧＦＰの蛍光強度の経時的変化が確認でき、従って、実際に本発明のデバイスを用いて、種々の論理演算が行われるように構成された論理回路を有する遺伝子回路の構築が可能であることが理解される（図３４Ｂ）。

【0141】

［実施例１６］細胞内・個体（生体）内での機能の確認
ゼブラフィッシュの初期胚にチップ（Ｃａｇｅ）を導入し、ＲＮＡ産生をリアルタイムＰＣＲ装置で確認した（図３５Ａ－Ｃ）。該結果より、本発明の遺伝子発現用デバイスを用いて、細胞内や個体（生体）内での遺伝子発現制御が可能である事が理解される(図３５Ｃ)。

【産業上の利用可能性】

【0142】

本発明の遺伝子回路用デバイス、及び該デバイスを含む遺伝子回路は、十分にクロストークが抑えられた制御された遺伝子発現を行うことができる、環境を感知するセンサーの材料的制約が極めて低減された遺伝子回路であるため、例えば、遺伝子疾患の治療や、バイオマーカー検出、バイオ医薬の効率的合成のために利用することが可能であり、従って、十分に産業上の利用可能性がある。

【0143】

本出願は、日本で出願された特願２０１７－２３２１９３（出願日：平成２９年１２月１日）及び特願２０１８－１３５３５８（出願日：平成３０年７月１８日）を基礎としており、その内容は本明細書に包含されるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【配列表】

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