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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-24
(45)【発行日】2022-03-04
(54)【発明の名称】３－オキソアジピン酸の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/50 20060101AFI20220225BHJP
【ＦＩ】
C12P7/50
【請求項の数】
25
(21)【出願番号】P 2016573623
(86)(22)【出願日】2016-12-09
(86)【国際出願番号】 JP2016086668
(87)【国際公開番号】W WO2017099209
(87)【国際公開日】2017-06-15
【審査請求日】2019-12-04
(31)【優先権主張番号】P 2015241996
(32)【優先日】2015-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110001656
【氏名又は名称】特許業務法人谷川国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】磯部 匡平
(72)【発明者】
【氏名】河村 健司
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 正照
(72)【発明者】
【氏名】山田 勝成
【審査官】野村 英雄
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－００００５９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特公昭５１－０２８７１０（ＪＰ，Ｂ１）
【文献】国際公開第２００９／１５１７２８（ＷＯ，Ａ２）
【文献】西村圭、ほか，「微生物代謝を用いたリグニン由来低分子化合物からのβ－ケトアジピン酸（ＫＡ）の生産」，日本農芸化学会大会講演要旨集，2012年03月05日，Vol.2012，P.3C23a04，ISSN 2186-7976
【文献】西村圭、ほか，「リグニン低分子化合物からの発酵法による新規なポリマー原料の生産」，日本農芸化学会大会講演要旨集，2011年03月05日，Vol.2011，P.3C29p19，ISSN 2186-7976
【文献】SONG, Y.-J.，"Characterization of aromatic hydrocarbon degrading bacteria isolated from pine litter."，KOR. J. MICROBIOL. BIOTECHNOL.，2009年12月，Vol.37, No.4，pp.333-339，ISSN 1598-642X
【文献】POLEN, T. et al.，"Toward biotechnological production of adipic acid and precursors from biorenewables."，J. BIOTECHNOL.，2013年08月20日，Vol.167, No.2，pp.75-84，ISSN 0168-1656
【文献】HARWOOD, C.S. et al.，"The beta-ketoadipate pathway and the biology of self-identity."，ANNU. REV. MICROBIOL.，1996年，Vol.50，pp.553-590，ISSN 0066-4227
【文献】TADASA, K.，"Degradation of eugenol by a microorganism."，AGRIC. BIOL. CHEM.，1977年，Vol.41, No.6，pp.925-929，ISSN 0002-1369
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属微生物、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物、シムウェリア（Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ）属微生物、プラノミクロビウム（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属微生物、ノカーディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、ヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物、キュプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属微生物、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属微生物からなる群から選択される、脂肪族化合物を代謝して３－オキソアジピン酸を生産する能力を有する少なくとも１種の微生物を培養する工程を含む、３－オキソアジピン酸の製造方法であって、前記少なくとも１種の微生物を培養する培地が、該微生物が単一炭素源として生育に利用可能な脂肪族化合物を含む、製造方法。
【請求項2】
セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属微生物、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物、シムウェリア（Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ）属微生物、プラノミクロビウム（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属微生物、ノカーディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、ヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物、キュプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属微生物、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、プラノミクロビウム（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属微生物、及びロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属微生物からなる群から選択される、３－オキソアジピン酸の生産能を有する少なくとも１種の微生物を培養する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物が、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）またはセラチア・ネマトジフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物が、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・グリメシイ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ）またはセラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）またはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項6】
前記ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属微生物がハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項7】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物が、バチルス・マガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）またはバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項8】
前記バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物が、バチルス・マガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ）またはバチルス・バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物が、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはエシェリシア・ファーグソニー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項10】
前記シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物が、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・レプチリボラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ）、またはシュードモナス・アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項11】
前記アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物がアシネトバクター・ラジオレジステンス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項12】
前記アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物がアルカリゲネス・ファエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項13】
前記シムウェリア（Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ）属微生物がシムウェリア・ブラッタエ（Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項14】
前記プラノミクロビウム（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属微生物がプラノミクロビウム・オケアノコイテス（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項15】
前記ノカーディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物がノカーディオイデス・アルバス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ａｌｂｕｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項16】
前記ヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物がヤローウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項17】
前記キュプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物がキュプリアビダス・ネカトル（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項18】
前記ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属微生物がロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項19】
前記ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物がストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項20】
前記ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物がミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属微生物がエルシニア・ルッケリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記微生物を培養する培地が脂肪族化合物を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２－オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記微生物を、フェルラ酸、ｐ－クマル酸からなる群から選択される少なくとも１種の誘導物質を含む培地で培養する、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微生物を利用した３－オキソアジピン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
３－オキソアジピン酸（別名：β－ケトアジピン酸、ＩＵＰＡＣ名：３－ｏｘｏｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）は、炭素数６、分子量１６０．１２のジカルボン酸である。３－オキソアジピン酸は多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、３－オキソアジピン酸の末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。
【0003】
３－オキソアジピン酸は、土壌細菌や真菌などの微生物がカテコールやプロトカテク酸を始めとする芳香族化合物を、より炭素数の少ない化合物へと酵素的に分解する過程で生成する。この分解経路は一般的にβ－ケトアジピン酸経路（β－ｋｅｔｏａｄｉｐａｔｅ
ｐａｔｈｗａｙ）として知られている。
ｐａｔｈｗａｙ）として知られている。
【0004】
微生物を利用した３－オキソアジピン酸の製造方法に関連する報告としては、遺伝子破壊により３－オキソアジピン酸の分解能を消失させたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０を用いて芳香族化合物であるバニリン酸及び／又はプロトカテク酸から３－オキソアジピン酸を発酵生産する方法が開示されている（特許文献１）。また、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡを出発原料とした天然には存在しない微生物によるアジピン酸を製造する方法の過程で、アジピン酸生合成経路の中間体として３－オキソアジピン酸（３－オキソアジペート）が生成しうるとの報告がある（特許文献２、図３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２０１２－００００５９号公報
【文献】ＷＯ２００９／１５１７２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１ではリグニンの分解で生じ得る芳香族化合物である、バニリン酸及び／またはプロトカテク酸を原料として３－オキソアジピン酸を発酵生産する方法が開示されているが、脂肪族化合物を原料とした３－オキソアジピン酸の発酵生産については開示されていない。また、一般的に化学分解で得られるリグニン分解物中には多種多様な芳香族化合物が混在しており、リグニン分解物を原料として３－オキソアジピン酸を製造する場合には、バニリン酸及び／またはプロトカテク酸以外の微生物が代謝できない成分が培養液中に大量に残留してしまう。そのため３－オキソアジピン酸の分離が困難となるだけでなく、原料の利用効率も低いことが課題であった。
【0007】
特許文献２には、アジピン酸を製造できるように人為的に改良した微生物において、製造対象であるアジピン酸の中間体として３－オキソアジピン酸（３－オキソアジペート）が生成しうることについての記載はあるが、一方で、実際に微生物の代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされておらず、特許文献２の記載に従ってスクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡを出発原料として３－オキソアジピン酸を製造できるかどうかは定かでなかった。
【0008】
そこで本発明では、糖などの微生物が利用しやすい脂肪族化合物から微生物の代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、代謝経路を利用して脂肪族化合物から３－オキソアジピン酸を製造することができる微生物が自然界に存在することを見出し、以下の本発明に到達した。
【0010】
すなわち、本発明は、次の（１）～（２９）を提供する。
【0011】
（１） セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属微生物、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属微生物、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属微生物、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属微生物、シムウェリア（Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ）属微生物、プラノミクロビウム（Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）属微生物、ノカーディオイデス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、ヤローウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属微生物、キュプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属微生物、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属微生物、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物およびエルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属微生物からなる群から選択される、脂肪族化合物を代謝して３－オキソアジピン酸を生産する能力を有する少なくとも１種の微生物を培養する工程を含む、３－オキソアジピン酸の製造方法であって、前記少なくとも１種の微生物を培養する培地が、該微生物が単一炭素源として生育に利用可能な脂肪族化合物を含む、製造方法。
【0012】
（２） Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｈａｆｎｉａ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｙａｒｒｏｗｉａ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物、及びＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物からなる群から選択される、３－オキソアジピン酸の生産能を有する少なくとも１種の微生物を培養する工程を含む、（１）に記載の方法。
【0013】
（３） 前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａである、（１）または（２）に記載の方法。
【0014】
（４） 前記Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、である、（３）に記載の方法。
【0015】
（５） 前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0016】
（６） 前記Ｈａｆｎｉａ属微生物がＨａｆｎｉａ ａｌｖｅｉである、（１）または（２）に記載の方法。
【0017】
（７） 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである、（１）または（２）に記載の方法。
【0018】
（８） 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓである、（７）に記載の方法。
【0019】
（９） 前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉである、（１）または（２）に記載の方法。
【0020】
（１０） 前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0021】
（１１） 前記Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物がＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0022】
（１２） 前記Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0023】
（１３） 前記Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物がＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅである、（１）または（２）に記載の方法。
【0024】
（１４） 前記Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物がＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ
ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0025】
（１５） 前記Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物がＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ａｌｂｕｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0026】
（１６） 前記Ｙａｒｒｏｗｉａ属微生物がＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである、（１）または（２）に記載の方法。
【0027】
（１７） 前記Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物がＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒである、（１）または（２）に記載の方法。
【0028】
（１８） 前記Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物がＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ
ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0029】
（１９） 前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物がＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0030】
（２０） 前記Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍである、（１）に記載の方法。
ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍである、（１）に記載の方法。
【0031】
（２１） 前記Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物がＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ
ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。。
ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。。
【0032】
（２２） 前記Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物がＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ
ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓである、（１）または（２）に記載の方法。
【0033】
（２３） 前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、（１）に記載の方法。
【0034】
（２４） 前記Ｙｅｒｓｉｎｉａ属微生物がＹｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉである、（１）に記載の方法。
【0035】
（２５） 前記微生物を培養する培地が脂肪族化合物を含む、（１）～（２４）のいずれか１項に記載の方法。
【0036】
（２６） 前記微生物を培養する培地が、該微生物が単一炭素源として生育に利用可能な脂肪族化合物を含む、（１）～（２５）のいずれか１項に記載の方法。
【0037】
（２７） 前記微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２－オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種の炭素源を含む、（１）～（２６）のいずれか１項に記載の方法。
【0038】
（２８） 前記微生物を、フェルラ酸、ｐ－クマル酸からなる群から選択される少なくとも１種の誘導物質を含む培地で培養する、（１）～（２７）のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【0039】
本発明により、微生物の代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本発明の３－オキソアジピン酸の製造方法は、３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物を培養する工程を含むことを特徴とする。より詳しくは、３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物を培養することによって、該微生物の代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造することを特徴とする。
【0041】
本発明の方法で用いられる、３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物としては、以下の微生物から選択される。
・Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物
・Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物
・Ｈａｆｎｉａ属微生物
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物
・Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物
・Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物
・Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物
・Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物
・Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物
・Ｙａｒｒｏｗｉａ属微生物
・Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物
・Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物
・Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物
・Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物
・Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物
・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物
・Ｙｅｒｓｉｎｉａ属微生物。
・Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物
・Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物
・Ｈａｆｎｉａ属微生物
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物
・Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物
・Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物
・Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物
・Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物
・Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物
・Ｙａｒｒｏｗｉａ属微生物
・Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物
・Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物
・Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物
・Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物
・Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物
・Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物
・Ｙｅｒｓｉｎｉａ属微生物。
【0042】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＳｅｒｒａｔｉａ属微生物の具体例としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａが挙げられる。Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについては明らかではないが、Ｓｅｒｒａｔｉａ属微生物は排出する余剰汚泥を低減させた排水処理方法に利用されていることもあり（特開２００２－１８４６９号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0043】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓが挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物は排出する余剰汚泥を低減させた排水処理方法に利用されていることもあり（特開２００２－１８４６９号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物ではあるものの通常の物質生産での代謝経路とは異なった複雑な代謝経路も併せて有しており、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0044】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物の具体例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｐｔｉｌｉｖｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓが挙げられる。Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物は芳香族炭化水素系溶剤、石油系炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、アルコール系溶剤などを分解することが知られていることもあり（特開２０１０－１３０９５０号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0045】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物の具体例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物は有機性廃棄物の発酵時に発生する悪臭物質の脱臭に利用されていることもあり（特開２００１－１２０９４５）、物質生産に一般的に利用される微生物ではあるものの通常の物質生産での代謝経路とは異なった複雑な代謝経路も併せて有しており、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0046】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＨａｆｎｉａ属微生物の具体例としては、Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉが挙げられる。Ｈａｆｎｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｈａｆｎｉａ属微生物はテレフタル酸含有廃液の分解微生物のテレフタル酸分解速度向上に利用されていることもあり（特開平１０－５２２５６号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0047】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉが挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属は炭化水素分解能や重金属耐性を有することが知られていることもあり（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２，１９，９２９１－９２９５参照）、物質生産に一般的に利用される微生物ではあるものの通常の物質生産での代謝経路とは異なった複雑な代謝経路も併せて有しており、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0048】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物の具体例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓが挙げられる。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属はベンゼンや燃料油、潤滑油などの鉱物油類を分解し環境浄化に用いられることが知られていることもあり（特開２０１３－１２３４１８号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0049】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物の具体例としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓが挙げられる。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属はピレンなどの多環芳香族化合物の分解に用いられることが知られていることもあり（特開２００３－７０４６３号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0050】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物の具体例としては、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅが挙げられる。Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属は放射性ラドン濃度の高い場所でも生息していることもあり（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１４，３７，１，２１－２４参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0051】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓが挙げられる。Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属はディーゼル油を分解することが知られていることもあり（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ５３， Ｉｓｓｕｅ ９， ｐａｇｅｓ ７２３-７３２）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0052】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物の具体例としては、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ａｌｂｕｓが挙げられる。Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属は難分解性の芳香族化合物の分解に用いられていることもあり（特開２００３－２５０５２９号公報参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0053】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＹａｒｒｏｗｉａ属微生物の具体例としては、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。Ｙａｒｒｏｗｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｙａｒｒｏｗｉａ属は油脂及び脂肪酸の分解に用いられていることもあり（特開２０１５－１９２６１１）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0054】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物の具体例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒが挙げられる。Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについては明らかではないが、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属はベンゼン、トルエン、キシレン等の石油製品由来の炭化水素類を分解することや（特開２００７－２５２２８５号公報参照）、金属耐性を有することが知られていることもあり（Ａｎｔｏｎｉｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，２００９，９６，２，１１５－１３９）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物は、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0055】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓが挙げられる。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属はディーゼル油を分解することが知られていることもあり（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｉｇｙ ５ （６）： ３６９－３７７， ２０１１）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0056】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物の具体例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓが挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属はポリヒドロアルカノエート系樹脂の分解に用いられていることもあり（ＷＯ０５／０４５０１７）、物質生産に一般的に利用される微生物ではあるものの通常の物質生産での代謝経路とは異なった複雑な代謝経路も併せて有しており、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0057】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍが挙げられる。Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属はリグニン含有廃液の処理方法に用いられていることもあり（特開２００９－７２１６２）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0058】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＰｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓが挙げられる。Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｐｌａｎｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属はベンゼンやその誘導体の生分解に用いられていることもあり（Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００６ Ｓｅｐ；１５７（７）：６２９－３６）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0059】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓが挙げられる。Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属はディーゼルオイルの生分解に用いられていることもあり（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ５．６ （Ｎｏｖ／Ｄｅｃ ２０１１）： ３６９－３７７）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0060】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物の具体例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが挙げられる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属はアゾ染料であるメチルレッドを分解することもあり（Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ． ２００７ Ｊｕｎ；６８（２）：３９４－４００）、物質生産に一般的に利用される微生物ではあるものの通常の物質生産での代謝経路とは異なった複雑な代謝経路も併せて有しており、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0061】
３－オキソアジピン酸の生産能を有するＹｅｒｓｉｎｉａ属微生物の具体例としては、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉが挙げられる。Ｙｅｒｓｉｎｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－オキソアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｙｅｒｓｉｎｉａ属は農薬の生分解に関わっていることもあり（Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｔｅｒｎａｃｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｏｎｔａｍｉｎａｃｉｏｎ Ａｍｂｉｅｎｔａｌ； Ｖｏｌ ２６， Ｎｏ １ （２０１０）； ２７－３８）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－オキソアジピン酸を生成することが推定される。
【0062】
前記微生物は、いずれも自然界に存在する微生物として公知のものであり、土壌等の自然環境から単離することができる。また、ＡＴＣＣ等の微生物分与機関から購入することもできる。
【0063】
前記微生物は、３－オキソアジピン酸の生産性が増大するように公知の手法にしたがって遺伝子を組換えたものであってもよく、また、人為的変異手段により変異させたものであってもよい。
【0064】
前記微生物が３－オキソアジピン酸の生産能を有することの確認は、培養液の上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）などを用いて培養液上清に含まれる３－オキソアジピン酸を検出することで確認することができる。そして本発明では、２０時間培養して得られる培養液上清中に１．０ｍｇ／Ｌ以上の３－オキソアジピン酸を生産できる微生物を、３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物として使用することが好ましい。
【0065】
本発明では、前記微生物を、用いる微生物に好適な培地、例えば、通常の微生物が代謝し得る脂肪族化合物を炭素源として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。ここで、本発明における「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。使用される微生物が代謝しうる炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。なお、前記微生物は公知であり、培養方法も、用いる培地も公知であるので、各微生物についての公知の培地及び培養方法を用いて培養することができる。
【0066】
前記微生物が炭素源として代謝しうる脂肪族化合物としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液、更には酢酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸等の有機酸、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコール類、およびグリセリン、エチレングリコール、プロパンジオールなどの多価アルコール類、炭化水素、脂肪酸、油脂などが挙げられる。微生物が代謝しうる脂肪族化合物であれば上記化合物のいずれでもよいが、微生物が単一炭素源として生育に利用可能な脂肪族化合物が好ましい。このような脂肪族化合物の例としては、例えばグルコース、キシロース、グリセロール、コハク酸、酢酸が挙げられる。さらに好ましくは、有機酸と糖類、あるいは有機酸とアルコール類、あるいは２種類以上の有機酸を併せて代謝させることで効率よく３－オキソアジピン酸を製造することができる。この場合、代謝される脂肪族化合物のどちらか一方は微生物が細胞外から取り入れたものでもよく、細胞内で別の化学物質より生じたものでもよい。このような組み合わせにおける有機酸と糖類の例としては、例えばコハク酸とグルコースやコハク酸とキシロースが挙げられ、有機酸とアルコール類の例としては、例えばコハク酸とグリセロールが挙げられ、２種類以上の有機酸の例としては、例えばコハク酸と酢酸が挙げられる。なお、代謝し得る脂肪族化合物の濃度としては、培養する微生物を維持可能な濃度であれば特に限定されず、各微生物について公知の濃度を採用し得るが、通常、培地全体に対して、通常、５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌ程度、特に１０ｇ／Ｌ～１５０ｇ／Ｌ程度である（２種類以上の脂肪族化合物が含まれる場合には合計濃度）。
【0067】
前記微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。窒素源は、単独で用いることも２種以上を組み合わせて用いることも可能であり、無機窒素源と有機窒素源を組み合わせて用いることも可能である。なお、窒素源の濃度としては、培養する微生物を維持可能な濃度であれば特に限定されず、各微生物について公知の濃度を採用し得るが、通常、０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ程度、特に０．５ｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ程度である（２種類以上の窒素源が含まれる場合には合計濃度）。
【0068】
前記微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。これらの無機塩類の濃度としては、なお、無機塩類の濃度としては、培養する微生物を維持可能な濃度であれば特に限定されず、各微生物について公知の濃度を採用し得るが、各無機塩類のそれぞれについて、通常、１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ程度、特に５ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌ程度である。
【0069】
３－オキソアジピン酸を製造するための前記微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量、培養時間などを、使用する生産菌の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定することができる。培養温度としては、１０℃～５０℃程度、特に２０℃～４０℃程度、ｐＨとしては、３～９程度、特に、５～７程度、培養時間としては、１時間～２００時間程度、特に２４時間～１５０時間程度を例示することができるが、もちろんこれらに限定されるものではない。また、液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
【0070】
上記に示した培地および培養条件であれば、前記微生物を用いた培養により３－オキソアジピン酸を製造することができるが、３－オキソアジピン酸を製造するために必要な代謝経路を活性化した状態で前記微生物を培養することで、より効率的に３－オキソアジピン酸を製造することができる。前記代謝経路を活性化する方法は特に限定されないが、例えば、培地に誘導物質を添加することで３－オキソアジピン酸を製造するための代謝経路中の酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法、遺伝子改変技術により酵素遺伝子（群）のコーディング領域および／またはその周辺の機能性領域を改変する方法、酵素遺伝子（群）のコピー数を増加させる方法、副生成物の生合成経路中の酵素遺伝子機能を破壊する方法などが挙げられるが、誘導物質により３－オキソアジピン酸を製造するための代謝経路中の酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法が好ましい。
【0071】
本発明に用いる誘導物質としては、３－オキソアジピン酸の製造に必要な代謝経路が活性化される物質であれば特に限定されないが、例えば、通常３‐オキソアジピル－ＣｏＡを中間体としてより炭素数の少ない化合物へと代謝される、芳香族化合物あるいは炭素数６以上の脂肪族化合物を用いることができる。炭素数６以上の脂肪族化合物として好ましくは、炭素数６以上のジカルボン酸を用いることができる。このような化合物の例は、例えばＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのデータベースを用いて知ることができるが、具体的には、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、テレフタル酸、プロトカテク酸、カテコール、バニリン、クマル酸、フェルラ酸、アジピン酸、フェニルアラニン、フェネチルアミンなどが挙げられ、好ましい例としては、安息香酸、カテコール、プロトカテク酸、アジピン酸が挙げられる。
【0072】
上記の誘導物質は３－オキソアジピン酸製造に用いる微生物に応じて単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。誘導物質の濃度は、特に限定されず、適宜設定可能であるが、通常、１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ程度、特に３ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌ程度である（２種以上の誘導物質が用いられる場合にはその合計濃度）。
【0073】
前記微生物の培養物中に生産された３－オキソアジピン酸の単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、例えば、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、３－オキソアジピン酸を培養物から単離することができる。より具体的には、好ましい回収方法として、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して３－オキソアジピン酸の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により３－オキソアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより３－オキソアジピン酸および／または３－オキソアジピン酸の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して３－オキソアジピン酸エステルとした後、蒸留操作により３－オキソアジピン酸エステルを回収後、加水分解により３－オキソアジピン酸を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。３－オキソアジピン酸の塩は、たとえばＮａ塩、Ｋ塩、Ｃａ塩、Ｍｇ塩またはアンモニウム塩などが挙げられる。
【実施例】
【0074】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0075】
参考例１ ３－オキソアジピン酸の準備
微生物が生産した３－オキソアジピン酸の定量分析に使用する当該物質の標品は化学合成により準備した。
微生物が生産した３－オキソアジピン酸の定量分析に使用する当該物質の標品は化学合成により準備した。
【0076】
まず、コハク酸モノメチルエステル１３．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）に超脱水テトラヒドロフラン１．５Ｌ（和光純薬株式会社製）を加え、攪拌しながらカルボニルジイミダゾール１６．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した。この懸濁液にマロン酸モノメチルエステルカリウム塩１５．６ｇ（０．１ｍｏｌ）および塩化マグネシウム９．５ｇ（０．１ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した後、４０℃で１２時間攪拌した。反応終了後、室温下、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を０．０５Ｌ加え、酢酸エチルにより抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：５）で分離精製することで、純粋な３－オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル１３．１ｇを得た。収率７０％。
【0077】
得られた３－オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル５ｇ（０．０２６ｍｏｌ）にメタノール２６ｍＬ（国産化学株式会社製）を加え、攪拌しながら５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液１２ｍＬを添加し、室温で一晩攪拌した。反応終了後、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸１２ｍＬを添加し、酢酸エチル１００ｍＬ（和光純薬株式会社製）により抽出した。ロータリーエバポレーターで濃縮後、アセトン／石油エーテルで再結晶することで、純粋な３－オキソアジピン酸２ｇを得た。収率４７％。
【0078】
３－オキソアジピン酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル：
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ２．６２（ｔ、２Ｈ）、δ２．８８（ｔ、２Ｈ）、δ３．７３（ｓ、１Ｈ）。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ２．６２（ｔ、２Ｈ）、δ２．８８（ｔ、２Ｈ）、δ３．７３（ｓ、１Ｈ）。
【0079】
実施例１ 脂肪族化合物を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
［微生物培養］
以下の表１に示した微生物（いずれの微生物も微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）の３－オキソアジピン酸の生産能を調べた。トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌに誘導物質として安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、テレフタル酸、プロトカテク酸、カテコール、アジピン酸、フェニルアラニンおよびフェネチルアミンをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加しｐＨ７に調製した培地５ｍＬに、それぞれの微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。その培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離したのち上清を完全に取り除くことで菌体を洗浄する操作を３回行ったのち、菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液０．５ｍＬを、脂肪族化合物を炭素源とする以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。
［微生物培養］
以下の表１に示した微生物（いずれの微生物も微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）の３－オキソアジピン酸の生産能を調べた。トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌに誘導物質として安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、テレフタル酸、プロトカテク酸、カテコール、アジピン酸、フェニルアラニンおよびフェネチルアミンをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加しｐＨ７に調製した培地５ｍＬに、それぞれの微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。その培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離したのち上清を完全に取り除くことで菌体を洗浄する操作を３回行ったのち、菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液０．５ｍＬを、脂肪族化合物を炭素源とする以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。
【0080】
本培養の培地組成：
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
グリセロール１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
グリセロール１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0081】
［３－オキソアジピン酸の定量分析］
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－オキソアジピン酸の定量分析は以下の条件で行った。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－オキソアジピン酸の定量分析は以下の条件で行った。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。
【0082】
培養上清中に蓄積した３－オキソアジピン酸の濃度は表１のとおりで、いずれの微生物も３－オキソアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
【0083】
【表1】
【0084】
実施例２ 単一の脂肪族化合物を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、本培養における単一炭素源としてコハク酸、グルコース、グリセロールのいずれか１つを１０ｇ／Ｌ含む他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。微生物３株についての結果をそれぞれ表２から４に示す。
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、本培養における単一炭素源としてコハク酸、グルコース、グリセロールのいずれか１つを１０ｇ／Ｌ含む他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。微生物３株についての結果をそれぞれ表２から４に示す。
【0085】
【表2】
【0086】
【表3】
【0087】
【表4】
【0088】
参考例２ 単一の脂肪族化合物を用いた生育試験
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、培養における単一炭素源として表５から７に示す脂肪族化合物のいずれか１つを１０ｇ/Ｌ含む生育試験用培地に一白金耳植菌し、３０℃で振とう培養した。培養開始から２日後に培養液の濁度（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｕｎｉｔｓ）をデンシトメーターＤＥＮ－１Ｂ（ワケンビーテック株式会社製）を用いて測定した。同時にコントロールとして炭素源を添加しない培養を行い、コントロールの濁度との差分を求めた。微生物３株についての結果をそれぞれ表５から７に示す。
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、培養における単一炭素源として表５から７に示す脂肪族化合物のいずれか１つを１０ｇ/Ｌ含む生育試験用培地に一白金耳植菌し、３０℃で振とう培養した。培養開始から２日後に培養液の濁度（ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｕｎｉｔｓ）をデンシトメーターＤＥＮ－１Ｂ（ワケンビーテック株式会社製）を用いて測定した。同時にコントロールとして炭素源を添加しない培養を行い、コントロールの濁度との差分を求めた。微生物３株についての結果をそれぞれ表５から７に示す。
【0089】
生育試験用培地組成(Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａおよびＰ．ｆｒａｇｉ)：
炭素源１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
炭素源１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0090】
生育試験用培地組成(Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)：
炭素源１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
ビオチン０．０３ｍｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩１ｍｇ／Ｌ
プロトカテク酸１ｍｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
炭素源１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
ビオチン０．０３ｍｇ／Ｌ
チアミン塩酸塩１ｍｇ／Ｌ
プロトカテク酸１ｍｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0091】
【表5】
【0092】
【表6】
【0093】
【表7】
【0094】
実施例３ ２種類の脂肪族化合物を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、本培養における炭素源として表８から１０に示す脂肪族化合物２種をそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。同時にコントロールとしてコハク酸のみを炭素源とした培養を行い、コントロールの３－オキソアジピン酸蓄積濃度との差分を求めた。微生物３株についての結果をそれぞれ表８から１０に示す。
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、本培養における炭素源として表８から１０に示す脂肪族化合物２種をそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。同時にコントロールとしてコハク酸のみを炭素源とした培養を行い、コントロールの３－オキソアジピン酸蓄積濃度との差分を求めた。微生物３株についての結果をそれぞれ表８から１０に示す。
【0095】
【表8】
【0096】
【表9】
【0097】
【表10】
【0098】
実施例４ 単一の誘導物質を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、表１１から１３に示す化合物を誘導物質として２．５ｍＭ含む培地、もしくは誘導物質を含まない培地を用いて前培養を行い、本培養において炭素源としてコハク酸およびグルコースをそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む培地を用いた他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。微生物３株についての結果をそれぞれ表１１から１３に示す。
Ｓ．ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３８２６およびＰ．ｆｒａｇｉ ＮＢＲＣ３４５８それぞれを、表１１から１３に示す化合物を誘導物質として２．５ｍＭ含む培地、もしくは誘導物質を含まない培地を用いて前培養を行い、本培養において炭素源としてコハク酸およびグルコースをそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む培地を用いた他は実施例１と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。微生物３株についての結果をそれぞれ表１１から１３に示す。
【0099】
【表11】
【0100】
【表12】
【0101】
【表13】
【0102】
実施例５ ３－オキソアジピン酸の製造例
実施例１で３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物であることが確認できたＳｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９を、ＬＢ培地５ｍＬに一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液２ｍＬをトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、安息香酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、テレフタル酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルアラニン２．５ｍＭ、フェネチルアミン２．５ｍＭ、ｐＨ７からなる培地１００ｍＬに添加し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。前培養液を２００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムで実施例１と同様に３回洗浄したのち、菌体を１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液１０ｍＬを実施例１と同様の本培養の培地１００ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、実施例１と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した結果、培養上清中に蓄積した３－オキソアジピン酸の濃度は２６０ｍｇ／Ｌであった。
実施例１で３－オキソアジピン酸の生産能を有する微生物であることが確認できたＳｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９を、ＬＢ培地５ｍＬに一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液２ｍＬをトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、安息香酸２．５ｍＭ、カテコール２．５ｍＭ、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸２．５ｍＭ、テレフタル酸２．５ｍＭ、プロトカテク酸２．５ｍＭ、アジピン酸２．５ｍＭ、フェニルアラニン２．５ｍＭ、フェネチルアミン２．５ｍＭ、ｐＨ７からなる培地１００ｍＬに添加し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。前培養液を２００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムで実施例１と同様に３回洗浄したのち、菌体を１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液１０ｍＬを実施例１と同様の本培養の培地１００ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、実施例１と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した結果、培養上清中に蓄積した３－オキソアジピン酸の濃度は２６０ｍｇ／Ｌであった。
【0103】
次に本培養の上清を減圧濃縮し、３－オキソアジピン酸の濃度が２２００ｍｇ／Ｌの濃縮液を１２ｍＬ得た。この濃縮液を、分取装置を連結したＨＰＬＣに注入し、３－オキソアジピン酸の標品と一致する溶出時間の画分を採取した。この作業を１０回繰り返し、培養液中の不純物が除去された３－オキソアジピン酸水溶液を得た。なお、３－オキソアジピン酸の採取に用いた分取ＨＰＬＣは以下の条件にて行った。
【0104】
ＨＰＬＣ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ ２０Ａ（株式会社島津製作所製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ２５０ｍｍ、内径１０ｍｍ、粒径４μｍ
移動相：５ｍＭ ギ酸水溶液／アセトニトリル＝９８／２
流速：４ｍＬ／分
注入量：１ｍＬ
カラム温度：４５℃
検出器：ＵＶ－ＶＩＳ（２１０ｎｍ）
分取装置：ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ社製）。
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ２５０ｍｍ、内径１０ｍｍ、粒径４μｍ
移動相：５ｍＭ ギ酸水溶液／アセトニトリル＝９８／２
流速：４ｍＬ／分
注入量：１ｍＬ
カラム温度：４５℃
検出器：ＵＶ－ＶＩＳ（２１０ｎｍ）
分取装置：ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ社製）。
【0105】
続いて３－オキソアジピン酸水溶液を減圧濃縮し、２２ｍｇの結晶を得た。結晶を１Ｈ－ＮＭＲで分析した結果、得られた結晶が３－オキソアジピン酸であることを確認できた。
【0106】
比較例１ ３－オキソアジピン酸の生産能を有さない微生物
表１４に示した微生物の３－オキソアジピン酸の生産能を確認するべく、実施例１と同様の条件で微生物培養し、３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－オキソアジピン酸は検出されなかった。
表１４に示した微生物の３－オキソアジピン酸の生産能を確認するべく、実施例１と同様の条件で微生物培養し、３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－オキソアジピン酸は検出されなかった。
【0107】
【表14】
【0108】
比較例２ 炭素源を添加しない培養
表１に示した微生物を、脂肪族化合物（コハク酸、グルコース、グリセロール）を炭素源として含まない組成の培地を用いた他は実施例１と同様の条件で培養し、３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－オキソアジピン酸は検出されなかった。本結果より、実施例１で定量できた３－オキソアジピン酸は脂肪族化合物が微生物により代謝された結果生成したものであることを確認できた。
表１に示した微生物を、脂肪族化合物（コハク酸、グルコース、グリセロール）を炭素源として含まない組成の培地を用いた他は実施例１と同様の条件で培養し、３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－オキソアジピン酸は検出されなかった。本結果より、実施例１で定量できた３－オキソアジピン酸は脂肪族化合物が微生物により代謝された結果生成したものであることを確認できた。
【0109】
実施例６ 様々な微生物を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表１５に示した微生物（いずれも微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）を対象に、誘導物質として、前培養培地にフェルラ酸、ｐ－クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例１と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
表１５に示した微生物（いずれも微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）を対象に、誘導物質として、前培養培地にフェルラ酸、ｐ－クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例１と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
【0110】
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
グリセロール１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
グルコース１０ｇ／Ｌ
グリセロール１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0111】
培養上清中に蓄積した３－オキソアジピン酸酸の定量分析を行った結果をそれぞれ表１５に示す。これらの結果から、いずれの微生物も３－オキソアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
【0112】
【表15】
【0113】
実施例７ 誘導物質を添加しない３－オキソアジピン酸生産試験
表１６に示した微生物を対象に、実施例６で用いた誘導物質を添加しなかった以外は実施例６と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
表１６に示した微生物を対象に、実施例６で用いた誘導物質を添加しなかった以外は実施例６と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
【0114】
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
グルコース１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0115】
培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果をそれぞれ表１６に示す。
【0116】
これらの結果から、表１６に示した微生物は誘導物質を添加せずに前培養を行った場合でも３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
【0117】
【表16】
【0118】
実施例８ ｐ－クマル酸又はフェルラ酸を誘導物質として用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表１７に示した微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸をそれぞれ０．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例６と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを実施例７に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果をそれぞれ表１７に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、添加しなかった場合と比べて、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
表１７に示した微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸をそれぞれ０．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例６と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを実施例７に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果をそれぞれ表１７に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、添加しなかった場合と比べて、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
【0119】
【表17】
【0120】
実施例９ 様々な濃度のフェルラ酸を誘導物質として用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表１８に示した属微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、フェルラ酸を表１８に示した濃度になるよう実施例７の前培養培地に添加し、前培養を行った。実施例７と同様の条件で本培養を行い、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表１８に示す。これらの結果から、フェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
表１８に示した属微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、フェルラ酸を表１８に示した濃度になるよう実施例７の前培養培地に添加し、前培養を行った。実施例７と同様の条件で本培養を行い、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表１８に示す。これらの結果から、フェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
【0121】
【表18】
【0122】
実施例１０ 様々な濃度のｐ－クマル酸を誘導物質として用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表１９に示した微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ－クマル酸を表１９に示した濃度になるよう実施例７の前培養培地に添加し、前培養を行った。実施例７と同様の条件で本培養を行い、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表１９に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合も、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
表１９に示した微生物を対象に、実施例６で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ－クマル酸を表１９に示した濃度になるよう実施例７の前培養培地に添加し、前培養を行った。実施例７と同様の条件で本培養を行い、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表１９に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合も、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
【0123】
【表19】
【0124】
参考例３ 糸状菌由来セルラーゼ（培養液）の調製方法
糸状菌由来セルラーゼ（培養液）は、次の方法で調製した。
糸状菌由来セルラーゼ（培養液）は、次の方法で調製した。
【0125】
［前培養］
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃の温度で７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ－ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ－４０ＬＦ）。
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、１００ｍＬを５００ｍＬバッフル付き三角フラスコに張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）添加した。この前培養培地に、トリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を１×１０５個／ｍＬになるように植菌し、２８℃の温度で７２時間、１８０ｒｐｍで振とう培養し、前培養とした（振とう装置：ＴＡＩＴＥＣ社製 ＢＩＯ－ＳＨＡＫＥＲ ＢＲ－４０ＬＦ）。
【0126】
［本培養］
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（旭化成ケミカルズ社製、商品名：アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製、ＤＰＣ－２Ａ）容器に張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法で液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃の温度で８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で振とう培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製の“ステリカップ－ＧＶ”、材質：ＰＶＤＦ）した。この前述の条件で調整した培養液を糸状菌由来セルラーゼとして、以下の参考例に使用した。
コーンスティープリカー（ＣＳＬ）５％（ｗ／ｖｏｌ）、グルコース２％（ｗ／ｖｏｌ）、セルロース（旭化成ケミカルズ社製、商品名：アビセル）１０％（ｗ／ｖｏｌ）、酒石酸アンモニウム０．３７％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸アンモニウム０．１４％（ｗ／ｖｏｌ）、リン酸二水素カリウム０．２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化カルシウム二水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０３％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化亜鉛０．０２％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物０．０１％（ｗ／ｖｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００４％（ｗ／ｖｏｌ）、塩化マンガン四水和物０．０００８％（ｗ／ｖｏｌ）、ホウ酸０．０００６％（ｗ／ｖｏｌ）、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２６％（ｗ／ｖｏｌ）となるように蒸留水に添加し、２．５Ｌを５Ｌ容撹拌ジャー（ＡＢＬＥ社製、ＤＰＣ－２Ａ）容器に張り込み、１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、これとは別に、それぞれ１２１℃の温度で１５分間オートクレーブ滅菌したＰＥ－ＭとＴｗｅｅｎ８０を、それぞれ０．１％添加し、あらかじめ前記の方法で液体培地で前培養したトリコデルマ・リーセイＡＴＣＣ６６５８９を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃の温度で８７時間、３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で振とう培養を行い、遠心分離後、上清を膜ろ過（ミリポア社製の“ステリカップ－ＧＶ”、材質：ＰＶＤＦ）した。この前述の条件で調整した培養液を糸状菌由来セルラーゼとして、以下の参考例に使用した。
【0127】
参考例４ セルラーゼ濃度の測定
水溶液中のセルラーゼ濃度はブラッドフォード法によって測定した酵素液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）の値を基準とした。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード法による測定キット（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して測定した。
水溶液中のセルラーゼ濃度はブラッドフォード法によって測定した酵素液中のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）の値を基準とした。タンパク質の濃度は、ブラッドフォード法による測定キット（Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を使用して測定した。
【0128】
参考例５ セルロース含有バイオマス由来糖化液の作製
バガス乾燥重量１ｋｇに対し、バイオマス仕込み量５％で３０ｇの苛性ソーダを混合し、９０℃、３時間反応させアルカリ処理バガスを作製した。アルカリ処理バガスをスクリュープレスで固液分離し、含水率６０％の固液分離固体を得た。
バガス乾燥重量１ｋｇに対し、バイオマス仕込み量５％で３０ｇの苛性ソーダを混合し、９０℃、３時間反応させアルカリ処理バガスを作製した。アルカリ処理バガスをスクリュープレスで固液分離し、含水率６０％の固液分離固体を得た。
【0129】
得られた固液分離固体を固形分濃度５％で再度懸濁し、参考例３で作製した糸状菌由来セルラーゼを参考例４で示す測定によりタンパク量８ｍｇ／ｇ－バガスで加水分解を行い、糖化液を得た。加水分解条件としては、４０℃、ｐＨ７．０、反応時間２４時間とした。得られた糖化液をスクリューデカンタで固形分を除去し、回収した糖化液を、孔径０．２２μｍの精密ろ過膜を用いて全量濾過後、さらに得られた透過液を限外ろ過膜によるろ過処理を行った。限外ろ過膜は、ＴＭＵＳ１０ｋ（Ｔｏｒａｙ Ｍｅｍｂｒａｎｅ ＵＳＡ社製、材質：ポリビニリデンフルオライド、分画分子量:１０，０００）を用いた。限外ろ過は、平膜ろ過ユニット“ＳＥＰＡ－ＩＩ”（ＧＥオスモニクス製）を用い、膜面線速度２０ｃｍ／秒、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側から回収される液量が０．６Ｌになるまでろ過処理を行い、透過側に糖化液を得た。
【0130】
得られた糖化液を分離膜（Ｓｙｎｄｅｒ社製、ＮＦＷ（材質：ピペラジンポリアミド、分画分子量３００～５００））による濾過処理を行った。濾過処理は膜面線速度２０ｃｍ／秒、ろ過圧３ＭＰａの条件下で非透過側の濃縮倍率が１２倍までろ過処理を行い、透過側に糖化液を得た。
【0131】
得られた糖化液をエバポレーターで濃縮し、グルコース１００ｇ／Ｌ、キシロース２２．３ｇ／Ｌ、クマル酸０．５ｇ／Ｌ、フェルラ酸０．０６ｇ／Ｌの糖化液を作製した。また、糖化液は最終ｐＨが７となるように、６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて調整した。
【0132】
実施例１１ セルロース含有バイオマス由来糖化液を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表２０に示した微生物を対象に、参考例５で作製したセルロース含有バイオマス由来糖化液を炭素源として用いた３－オキソアジピン酸生産試験を行った。
表２０に示した微生物を対象に、参考例５で作製したセルロース含有バイオマス由来糖化液を炭素源として用いた３－オキソアジピン酸生産試験を行った。
【0133】
セルロース含有バイオマス由来糖化液を用いて以下に示した組成となるように調整した前培養培地５ｍＬに、それぞれの微生物を十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。続いて実施例６と同様の条件で菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを、セルロース含有バイオマス由来糖化液を用いて以下に示した組成となるように調整した本培養培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。比較として、ｐ－クマル酸およびフェルラ酸を含まない炭素源を前培養および本培養に用いた他は、上記と同様の条件で培養を行った。培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした結果を表２０に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸およびフェルラ酸を含むセルロース含有バイオマス由来糖化液を用いて培養した場合でも、p-クマル酸およびフェルラ酸を含まない炭素源を用いた場合と比較して、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
【0134】
前培養の培地組成
グルコース５ｇ／Ｌ
キシロース１．１ｇ／Ｌ
ｐ－クマル酸２５ｍｇ／Ｌ
フェルラ酸３ｍｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
グルコース５ｇ／Ｌ
キシロース１．１ｇ／Ｌ
ｐ－クマル酸２５ｍｇ／Ｌ
フェルラ酸３ｍｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0135】
本培養の培地組成
グルコース５０ｇ／Ｌ
キシロース１１ｇ／Ｌ
ｐ－クマル酸２５０ｍｇ／Ｌ
フェルラ酸３０ｍｇ／Ｌ
コハク酸１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
グルコース５０ｇ／Ｌ
キシロース１１ｇ／Ｌ
ｐ－クマル酸２５０ｍｇ／Ｌ
フェルラ酸３０ｍｇ／Ｌ
コハク酸１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
【0136】
【表20】
【0137】
実施例１２ ２種類の炭素源を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表２１および表２２に示した微生物を対象に、実施例６と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表２１および表２２に示した化合物をそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例６と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２１および表２２に示す。これらの結果から、２種類の炭素原を用いて培養しても、３－オキソアジピン酸を効率よく生産できることがわかった。
表２１および表２２に示した微生物を対象に、実施例６と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表２１および表２２に示した化合物をそれぞれ１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例６と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２１および表２２に示す。これらの結果から、２種類の炭素原を用いて培養しても、３－オキソアジピン酸を効率よく生産できることがわかった。
【0138】
【表21】
【0139】
【表22】
【0140】
実施例１３ 様々な濃度の２種類の炭素源を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表２３および表２４に示した微生物を対象に、実施例６と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表２３および表２４に示した濃度の化合物をそれぞれ含む培地にて実施例６と同様の条件にて４８～１２０時間培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２３および表２４に示す。これらの結果から、炭素源の添加割合を変更しても、３－オキソアジピン酸を生産できることがわかった。
表２３および表２４に示した微生物を対象に、実施例６と同様の培地を用いて前培養を行ったのち、炭素源として表２３および表２４に示した濃度の化合物をそれぞれ含む培地にて実施例６と同様の条件にて４８～１２０時間培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２３および表２４に示す。これらの結果から、炭素源の添加割合を変更しても、３－オキソアジピン酸を生産できることがわかった。
【0141】
【表23】
【0142】
実施例１４ 単一の炭素源を用いた３－オキソアジピン酸生産試験
表２４および表２５に示した微生物を対象に、実施例７と同様の培地を用いて誘導物質を添加しない前培養を行ったのち、炭素源としてコハク酸、グルコース、グリセロールのいずれか１種類を１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例７と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２４に示す。さらに、同様の実験について、前培養培地のみ誘導物質を添加した実施例６の条件に変更して行った。３－オキソアジピン酸の生産量について表２５に示す。これらの結果から、単一の炭素源を用いた場合でも、３－オキソアジピン酸を生産できること、また、単一の炭素源を用いた場合も、誘導物質を前培養培地に添加することで、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
表２４および表２５に示した微生物を対象に、実施例７と同様の培地を用いて誘導物質を添加しない前培養を行ったのち、炭素源としてコハク酸、グルコース、グリセロールのいずれか１種類を１０ｇ／Ｌ含む培地にて実施例７と同様の条件にて培養し、培養上清中の３－オキソアジピン酸の定量分析をした。結果をそれぞれ表２４に示す。さらに、同様の実験について、前培養培地のみ誘導物質を添加した実施例６の条件に変更して行った。３－オキソアジピン酸の生産量について表２５に示す。これらの結果から、単一の炭素源を用いた場合でも、３－オキソアジピン酸を生産できること、また、単一の炭素源を用いた場合も、誘導物質を前培養培地に添加することで、３－オキソアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
【0143】
【表24】
【0144】
【表25】
【産業上の利用可能性】
【0145】
本発明によれば、微生物を利用して３－オキソアジピン酸を製造することができる。得られた３－オキソアジピン酸は各種ポリマー原料として利用することができる。