ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人金沢大学
▶ 国立大学法人金沢大学の特許一覧 ▶ 国立大学法人 熊本大学の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-24
(45)【発行日】2022-03-04
(54)【発明の名称】膠芽腫マーカー及びその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20220225BHJP
C12Q 1/68 20180101ALI20220225BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
C12Q1/68
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2017233838
(22)【出願日】2017-12-05
(65)【公開番号】P2019100929
(43)【公開日】2019-06-24
【審査請求日】2020-12-02
(73)【特許権者】
【識別番号】504160781
【氏名又は名称】国立大学法人金沢大学
(73)【特許権者】
【識別番号】504159235
【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学
(74)【代理人】
【識別番号】100106909
【弁理士】
【氏名又は名称】棚井 澄雄
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100139686
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 史朗
(74)【代理人】
【識別番号】100192773
【弁理士】
【氏名又は名称】土屋 亮
(72)【発明者】
【氏名】中田 光俊
(72)【発明者】
【氏名】寺崎 哲也
(72)【発明者】
【氏名】大槻 純男
【審査官】大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５２２５５５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１０／０１６７９３９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００６０７０４（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５３２８０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】宮内英輔 ほか，網羅的定量プロテオミクスSWATH法および定量的標的プロテオミクスを用いた一次性膠芽腫の血漿診断タンパク質候補の同定，日本薬学会第137年会要旨集，2017年03月05日，第１号，p.288
【文献】中田光俊 ほか，Absolute Quantitative Proteomics-based Molecular Diagnosis for Glioblastoma，BRAIN TUMOR PATHOLOGY，2012年，vol.29, Suppl.，p.154
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８ － ３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
血液中のＣ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）の存在量、並びに、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程と、測定されたＣ９の存在量、又は、Ｃ９及びＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９、又は、Ｃ９及びＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合、並びに、
測定されたＣ９の存在量の存在量が、健常者の血液中の対応するＣ９の存在量と比較して多く、かつ、測定されたＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量において、健常者の血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中のＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量と比較して少ない場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程と、
を備える血液の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、膠芽腫マーカー及びその使用に関する。具体的には、本発明は、膠芽腫マーカー、膠芽腫診断薬、被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法、被検者が膠芽腫に罹患している可能性をモニタリングする方法、血液の判定方法、組織の判定方法及び髄液の判定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
日本国内での脳腫瘍の発生頻度は年間に約２万人と考えられ、脳腫瘍は組織学的におおよそ１５０に分類される。悪性神経膠腫治療の第一段階は腫瘍の可及的切除であるが、脳の機能温存と、神経膠腫による強い浸潤性の観点から、手術による根治は困難である。従って、悪性神経膠腫は外科療法に引き続いて化学療法、放射線療法を中心とした補助療法を行うことが不可欠と考えられ、治療効果改善の試みが続けられてきた。この４０年間に神経膠腫を含む悪性脳腫瘍の治療成績は改善したが、膠芽腫は未だあらゆる癌の中で最も予後不良である。膠芽腫の治療成績を改善するために、無症状の状態での早期発見を可能とし、再発早期に診断するためのマーカーが求められている。
【0003】
これまで、膠芽腫のバイオマーカーとしては、ｃｈｉｔｉｎａｓｅ－３－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １（例えば、非特許文献１及び２参照）、ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（例えば、非特許文献３参照）、ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９（例えば、非特許文献１参照）、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（例えば、非特許文献４参照）、 ＣＤ１４（例えば、非特許文献５参照）、ａ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ（例えば、非特許文献６参照）、及び、ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－２（例えば、非特許文献７参照）が報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Hormigo A et al., “YKL-40 and MatrixMetalloproteinase-9 as Potential Serum Biomarkers for Patients with High-Grade Gliomas.”, Clin Cancer Res, Vol. 12, Issue 19, p5699-5704, 2006.
【文献】Iwamoto F M et al., “Serum YKL-40 is a marker of prognosis and disease status in high-grade gliomas.”, Neuro Oncol, Vol. 13, Issue 11, p1244-1251, 2011.
【文献】Jung C S et al., “Serum GFAP is a diagnostic marker for glioblastoma multiforme.”, Brain, Vol. 130, Issue 12, p3336-3341, 2007.
【文献】Quaranta M et al., “Epidermal growth factor receptor serum levels and prognostic value in malignant gliomas.”, Tumori, Vol. 93, Issue 3, p275-280, 2007.
【文献】Zhou M et al., “Circulating levels of the innate and humoral immune regulators CD14 and CD23 are associated with adult glioma.”, Cancer Res, Vol. 70, Issue 19, p7534-7542, 2010.
【文献】Ilzecka J et al., “APRIL is increased in serum of patients with brain glioblastoma multiforme.”, Eur Cytokine Netw, Vol. 17, Issue 4, p276-280, 2006.
【文献】Lin Y et al., “Plasma IGFBP-2 levels predict clinical outcomes of patients with high-grade gliomas.”, Neuro Oncol, Vol. 11, Issue 5, p468-476, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかしながら、非特許文献１～７に報告されている膠芽腫のバイオマーカーは、実際に膠芽腫の診断には用いられていない。そのため、臨床診断に使用可能であり、膠芽腫の早期発見や病勢を反映する新たな膠芽腫マーカーの開発が望まれている。
【0006】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、新たな膠芽腫マーカーを提供する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係る膠芽腫マーカーは、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）からなる群より選ばれる１種以上からなる。
本発明の第１態様に係る膠芽腫マーカーは、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）からなる群より選ばれる１種以上からなる。
【0008】
本発明の第２態様に係る膠芽腫診断薬は、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４に対する特異的結合物質又はこれらの組み合わせ、安定同位体標識されたＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はこれらの組み合わせ、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はこれらの組み合わせ、及び、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ又はこれらの組み合わせ、からなる群より選ばれる１種以上を備える。
【0009】
上記第２態様に係る膠芽腫診断薬において、前記特異的結合物質がＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４に結合する抗体又は該抗体断片であってもよい。
【0010】
本発明の第３態様に係る被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法は、被検者より採取した検体中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を測定する方法である。
【0011】
上記第３態様に係る方法において、前記検体が被検者より経時的に採取した検体であってもよい。
上記第３態様に係る方法において、前記検体が血液、髄液、又は尿であってもよい。
上記第３態様に係る方法において、前記検体が血液、髄液、又は尿であってもよい。
【0012】
上記第３態様に係る方法は、以下の（１Ａ）～（２Ａ）の工程を含んでもよい。
（１Ａ）被検者から採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ａ）前記工程（１Ａ）で測定したＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い場合、並びに、前記工程（１Ａ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
（１Ａ）被検者から採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ａ）前記工程（１Ａ）で測定したＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い場合、並びに、前記工程（１Ａ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
【0013】
上記第３態様に係る方法は、以下の（１Ｂ）～（２Ｂ）の工程を含んでもよい。
（１Ｂ）被検者から採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程；
（２Ｂ）前記工程（１Ｂ）で測定したＧＳＮ濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度よりも低い場合、及び、前記工程（１Ｂ）で測定したＩＧＨＡ１濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度よりも高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度と同じ若しくは高い場合、及び、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度と同じ若しくは低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
（１Ｂ）被検者から採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程；
（２Ｂ）前記工程（１Ｂ）で測定したＧＳＮ濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度よりも低い場合、及び、前記工程（１Ｂ）で測定したＩＧＨＡ１濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度よりも高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度と同じ若しくは高い場合、及び、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度と同じ若しくは低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
【0014】
上記第３態様に係る方法において、前記工程（１Ａ）又は前記工程（１Ｂ）が免疫学的測定法又は質量分析法によって行われてもよい。
【0015】
本発明の第４態様に係る血液の判定方法は、血液中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程と、測定されたＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中のＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量と比較して少ない場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程と、を備える方法である。
【0016】
本発明の第５態様に係る組織の判定方法は、組織中のＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量を測定する工程と、測定されたＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が、健常者の組織中の、対応するＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量が、健常者の組織中の、対応するＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量と比較して少ない場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程と、を備える方法である。
【0017】
本発明の第６態様に係る髄液の判定方法は、髄液中のＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の存在量を測定する工程と、測定されたＧＳＮの存在量が、健常者の髄液中のＧＳＮの存在量と比較して少ない場合、及び、測定されたＩＧＨＡ１の存在量が、健常者の髄液中のＩＧＨＡ１の存在量と比較して多い場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程と、を備える方法である。
【発明の効果】
【0018】
上記態様によれば、新規の膠芽腫マーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】実施例１における１４例の膠芽腫症例及び１５名の健常者の血液を解析対象検体とした次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎｓ）法を用いた膠芽腫バイオマーカー探索の流れを示す工程図である。
【図2】実施例１における８種の膠芽腫バイオマーカーの膠芽腫症例の血漿中及び健常者の血漿中の濃度の絶対値を比較したグラフである。
【図3】実施例２における１４例の膠芽腫症例及び５名の健常者の髄液を解析対象検体とした次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ法を用いた膠芽腫バイオマーカー探索の流れを示す工程図である。
【図4】実施例２における１４例の膠芽腫症例の手術前及び手術後の髄液中、並びに、５名の健常者の髄液中の２種の膠芽腫バイオマーカーを質量分析計のＭＲＭモードで解析した結果（ピーク面積比）を示すグラフである。
【図5A】実施例３における膠芽腫症例の血漿中及び健常者の血漿中のＧＳＮの濃度の絶対値を比較したグラフである。
【図5B】実施例３における膠芽腫症例の詳細及び症例数、並びに健常者の症例数を示した表である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
≪膠芽腫マーカー≫
本実施形態の膠芽腫マーカーは、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）からなる群より選ばれる１種以上からなる。
本実施形態の膠芽腫マーカーは、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）、ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）からなる群より選ばれる１種以上からなる。
【0021】
実施例において後述するように、本発明者らは、膠芽腫患者の血液、手術前後の髄液及び腫瘍組織に含まれるタンパク質を次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎｓ）法により、網羅的に分析、比較し、膠芽腫患者の血液、手術前の髄液及び腫瘍組織中において、特異的に存在量が変化するタンパク質として、ＬＲＧ１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｃ９、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＰＯＢ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ－１００）、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４を同定した。
【0022】
一般に、「Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）」は、細胞溶解を引き起こす親水性の膜貫通型チャネルの構成成分の一つであり、７１ｋＤａのタンパク質である。また、Ｃ９の欠損は髄膜炎菌による反復感染と関連していることが知られている。ヒトＣ９のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０２７４８等である。
【0023】
一般に、「ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）」は、α－グロブリン糖タンパク質であり、体内で炎症反応が生じているときに誘導されることが知られている。ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０１０１１等である。
【0024】
一般に、「ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）」は、アクチンフィラメントの集合及び分解の調節を担うアクチン結合タンパク質である。ヒトＧＳＮのＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０６３９６、Ｑ５Ｔ０Ｉ１等である。
【0025】
一般に、「ＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）」は、Ｉｇα１鎖の定常（Ｃ）部位であり、粘膜における免疫機能に重要な役割を果たす抗体である。ヒトＩＧＨＡ１のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０１８７６等である。
【0026】
一般に、「ＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）」は、血漿タンパク質であり、脂質代謝、食欲及び消化管機能調節に関与することが知られている。ヒトＡＰＯＡ４のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０６７２７等である。
【0027】
一般に、「ＬＲＧ１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １）」は、ロイシンリッチな繰り返し配列を有するタンパク質であり、血管新生糖タンパク質として知られている。ヒトＬＲＧ１のＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０２７５０等である。
【0028】
一般に、「ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、体内で炎症反応、組織破壊が生じているときに血中に現れるタンパク質であり、細菌の凝集に関与している。ヒトＣＲＰのＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０２７４１等である。
【0029】
一般に、「ＡＰＯＢ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ－１００）」は、リポタンパク質と結合するタンパク質であって、４５３８アミノ酸残基よりなる大きなタンパク質である。また、ＬＤＬ受容体の主要なリガンドとして働くことが知られている。ヒトＡＰＯＢのＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースのアクセッション番号はＰ０４１１４等である。
【0030】
したがって、ＬＲＧ１、Ｃ９、ＣＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＡＰＯＢ、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４を膠芽腫マーカーとして利用することができる。これらタンパク質のうち１種単独で膠芽腫マーカーとして用いてもよく、２種以上組み合わせて膠芽腫マーカーとして用いてもよい。
【0031】
また、膠芽腫マーカーとして利用される上記タンパク質は、それらタンパク質の全アミノ酸配列からなるタンパク質であってもよく、それらタンパク質のペプチド断片であってもよい。
【0032】
上記タンパク質のペプチド断片としては、例えば、以下の（１）～（８）に例示する物等が挙げられる。
（１）ＬＲＧ１のペプチド断片：配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（２）Ｃ９のペプチド断片：配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（３）ＣＲＰのペプチド断片：配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（４）ＳＥＲＰＩＮＡ３のペプチド断片：配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（５）ＡＰＯＢのペプチド断片：配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（６）ＧＳＮのペプチド断片：配列番号６又は９に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（７）ＩＧＨＡ１のペプチド断片：配列番号７又は１０に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（８）ＡＰＯＡ４のペプチド断片：配列番号８に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（１）ＬＲＧ１のペプチド断片：配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（２）Ｃ９のペプチド断片：配列番号２に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（３）ＣＲＰのペプチド断片：配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（４）ＳＥＲＰＩＮＡ３のペプチド断片：配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（５）ＡＰＯＢのペプチド断片：配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（６）ＧＳＮのペプチド断片：配列番号６又は９に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（７）ＩＧＨＡ１のペプチド断片：配列番号７又は１０に示すアミノ酸配列からなるペプチド
（８）ＡＰＯＡ４のペプチド断片：配列番号８に示すアミノ酸配列からなるペプチド
【0033】
また、本実施形態は、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４の膠芽腫マーカーとしての使用を提供するものであるということもできる。
【0034】
≪膠芽腫診断薬≫
本実施形態の膠芽腫診断薬は、下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選ばれる１種以上を備える。
（ａ）Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４に対する特異的結合物質又はこれらの組み合わせ；
（ｂ）安定同位体標識されたＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はこれらの組み合わせ；
（ｃ）Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はこれらの組み合わせ；
（ｄ）Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ又はこれらの組み合わせ
本実施形態の膠芽腫診断薬は、下記（ａ）～（ｄ）からなる群より選ばれる１種以上を備える。
（ａ）Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４に対する特異的結合物質又はこれらの組み合わせ；
（ｂ）安定同位体標識されたＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はこれらの組み合わせ；
（ｃ）Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセット又はこれらの組み合わせ；
（ｄ）Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子若しくはＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ又はこれらの組み合わせ
【0035】
本実施形態の膠芽腫診断薬は、上記（ａ）～（ｄ）のうち１種単独で備えていてもよく、２種以上組み合わせて備えてもよい。
【0036】
本実施形態の膠芽腫診断薬は、診断用キットであるということもできる。
【0037】
＜特異的結合物質＞
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。
特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。
【0038】
［抗体］
抗体は、例えば、マウス等の動物に、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。
抗体は、例えば、マウス等の動物に、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はそれらの断片を抗原として免疫することによって作製することができる。或いは、例えば、ファージライブラリーのスクリーニングにより作製することができる。
【0039】
［抗体断片］
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。
【0040】
［アプタマー］
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
アプタマーとは、標的物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。
【0041】
標的ペプチドに特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。
【0042】
また、標的ペプチドに特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ－ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【0043】
また、本実施形態の膠芽腫診断薬は、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４に対する特異的結合物質を１種単独で備えてもよく、２種以上組み合わせて備えていてもよい。さらに、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢに対する特異的結合物質も備えていてもよい。
【0044】
本実施形態の膠芽腫診断薬は、被検者由来の血液（血清、血漿等）、髄液を含む体液、尿組織等を試料に用い、試料中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を検出するものであってもよい。特に、血液（血清、血漿等）、尿は低侵襲で採取可能な生体試料であるため、患者の負担が少なく、容易に膠芽腫に罹患しているか否かを診断することができる。
【0045】
特異的結合物質を用いたＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の検出方法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等が挙げられる。なお、逆相タンパク質アレイを用いた検出とは、試料を固相にアレイ状に固定し、検出対象物質に特異的な抗体等を反応させることにより、試料中の検出対象物質を検出する解析方法である。
【0046】
＜安定同位体標識されたタンパク質＞
安定同位体標識されたタンパク質としては、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はそれらの断片を、安定同位体を用いて標識したもの等が挙げられる。
安定同位体標識されたタンパク質としては、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はそれらの断片を、安定同位体を用いて標識したもの等が挙げられる。
【0047】
また、本実施形態の膠芽腫診断薬は、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１若しくはＡＰＯＡ４又はそれらの断片を安定同位体標識したものを１種単独で備えてもよく、２種以上組み合わせて備えていてもよい。さらに、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢ又はその断片を安定同位体標識したものも備えていてもよい。
【0048】
安定同位体標識されたタンパク質は、後述の実施例に示すように、安定同位体で標識されたアミノ酸を用いて、上述のタンパク質又はそれらの断片を合成することで得られる。
【0049】
安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏが挙げられる。
【0050】
安定同位体で標識されたアミノ酸としては、２０種類のアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、トリプトファン、システイン、アスパラギン、グルタミン）であって、上述のペプチドに含まれるアミノ酸であれば特に限定されない。また、アミノ酸はＬ体であってもＤ体であってもよく、必要に応じて適宜選択することができる。
【0051】
安定同位体標識されたタンパク質の作製方法として具体的には、上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターを安定同位体標識アミノ酸の存在する系で発現させることにより調製することができる。安定同位体標識アミノ酸の存在する系としては、例えば安定同位体標識アミノ酸の存在する無細胞ペプチド合成系や生細胞ペプチド合成系等が挙げられる。すなわち、無細胞ペプチド合成系において安定同位体標識アミノ酸に加えて安定同位体非標識アミノ酸を材料としてペプチドを合成させることや、生細胞ペプチド合成系において、上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターで形質転換した細胞を安定同位体標識アミノ酸存在下で培養することにより、上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターから安定同位体標識されたタンパク質を調製することができる。
【0052】
無細胞ペプチド合成系を用いた安定同位体標識されたタンパク質の発現は、上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターや安定同位体標識アミノ酸の他に、安定同位体標識されたタンパク質の合成のために必要な安定同位体非標識アミノ酸、無細胞ペプチド合成用細胞抽出液、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンホスフェート等の高エネルギーリン酸結合含有物）等を用いて行うことができる。温度、時間等の反応条件は、適宜最適な条件を選択して行うことができ、例えば温度は２０℃以上４０℃以下とすることができ、２３℃以上３７℃以下が好ましい。また、例えば、反応時間は１時間以上２４時間以下とすることができ、１０時間以上２０時間以下が好ましい。
【0053】
本明細書において、「無細胞ペプチド合成用細胞抽出液」とは、リボソーム、ｔＲＮＡ等のタンパク質合成に関与する翻訳系、又は、転写系及び翻訳系に必要な成分を含む植物細胞、動物細胞、真菌細胞、細菌細胞からの抽出液を意味する。具体的には、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網赤血球、マウスＬ－細胞、エールリッヒ腹水癌細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、出芽酵母等の細胞抽出液が挙げられる。かかる細胞抽出液の調製は、例えば、上記の細胞をフレンチプレス、グラスビーズ、超音波破砕装置等を用いて破砕処理し、タンパク質成分やリボソームを可溶化するための数種類の塩を含有する緩衝液を加えてホモジナイズし、遠心分離にて不溶成分を沈殿させることによって行うことができる。
【0054】
また、無細胞ペプチド合成系を用いた安定同位体標識されたタンパク質の発現は、例えば、小麦胚芽抽出液を備えたＰｒｅｍｉｕｍ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（セルフリーサイエンス社製）、大腸菌抽出液を備えたＲＴＳ １００，Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）、無細胞くんＱｕｉｃｋ（大陽日酸社製）等市販のキットを適宜使用して行ってもよい。発現させた安定同位体標識されたタンパク質が不溶性の場合、グアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質変性剤を用いて適宜可溶化させてもよい。安定同位体標識されたタンパク質は、さらに分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理や、アフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー等を用いた精製処理により調製することもできる。
【0055】
生細胞ペプチド合成系を用いた安定同位体標識されたタンパク質の発現は、生細胞に上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターを導入し、かかる生細胞を栄養分や抗生物質等の他、安定同位体標識アミノ酸、安定同位体標識ペプチドの合成のために必要な安定同位体非標識アミノ酸等を含む培養液中で培養することにより行うことができる。
【0056】
ここで、生細胞としては、上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターを発現させることができる生細胞であれば特に限定されず、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞等の生細胞が挙げられる。中でも、生細胞としては、簡便性や費用対効果の面から考慮すると、大腸菌が好ましい。
【0057】
上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターの発現は、遺伝子組換え技術により、それぞれの生細胞で発現できるように設計された発現ベクターへ組み込み、かかる発現ベクターを生細胞へ導入することにより行うことができる。また上述のタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸を含むベクターの生細胞への導入は、使用する生細胞に適した方法で行うことができる。生細胞への導入方法として具体的には、例えば、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、ウイルスを用いた方法や、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ６ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社製）等の市販のトランスフェクション試薬を用いた方法等が挙げられる。
【0058】
生細胞ペプチド合成系により発現させた安定同位体標識されたタンパク質は、安定同位体標識されたタンパク質を含む生細胞を破砕処理や抽出処理することにより調製することができる。破砕処理としては、例えば凍結融解法、フレンチプレス、グラスビーズ、ホモジナイザー、超音波破砕装置等を用いた物理的破砕処理等が挙げられる。また抽出処理としては、例えばグアニジン塩酸塩、尿素等のタンパク質変性剤を用いた抽出処理等が挙げられる。安定同位体標識されたタンパク質は、さらに分画遠心法、ショ糖密度勾配遠心法等による分画処理や、アフィニティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー等を用いた精製処理等により調製することもできる。
【0059】
安定同位体標識されたタンパク質を用いたＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の検出方法としては、例えば、質量分析法等が挙げられる。
【0060】
＜プライマーセット＞
Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。
Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセットとは、これらの遺伝子のｍＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ等により増幅することができるものであれば特に制限されない。
【0061】
また、本実施形態の膠芽腫診断薬は、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子を増幅可能なプライマーセットを１種単独で備えていてもよく、２種以上組み合わせて備えていてもよい。さらに、ＬＲＧ１遺伝子、ＣＲＰ遺伝子、ＡＰＯＢ遺伝子を増幅可能なプライマーセットも備えていてもよい。
【0062】
これらの遺伝子のｍＲＮＡは、以下の（１）～（８）に示すＩＤで特定されるＳｅｑデータベースのエントリーに記載された塩基配列を有している。なお、ｍＲＮＡにはスプライシングバリアント等が存在する場合があるため、これらの遺伝子のｍＲＮＡは以下の（１）～（８）に示すＳｅｑ ＩＤで特定されるものに限られるものではない。
（１）ヒトＬＲＧ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０５２９７２等
（２）ヒトＣ９のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１７３７等
（３）ヒトＣＲＰのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００５６７、ＮＭ＿００１３２９０５７、ＮＭ＿００１３２９０５８等
（４）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１０８５等
（５）ヒトＡＰＯＢのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００３８４
（６）ヒトＧＳＮのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００１７７、ＮＭ＿００１１２７６６２、ＮＭ＿００１１２７６６２、ＮＭ＿００１１２７６６４、ＮＭ＿００１１２７６６５等
（７）ヒトＩＧＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：Ｓｅｑ ＩＤ：ＡＦ０６７４２０．１、ＡＦ２８３６６６．１、ＡＪ２９４７２９．１、ＡＫ０２７３７９．１、ＡＫ０５８０２７．１、 ＡＫ０７４６５１．１、ＡＫ０９２３８４．１、ＡＫ０９２８０３．１、ＡＫ０９２８１９．１、ＡＫ０９３７２１．１、ＡＫ０９５２２２．１、ＡＫ０９６９８５．１、ＡＫ０９７０１７．１、ＡＫ０９７０２８．１、ＡＫ０９７０７６．１、ＡＫ０９７３０３．１、ＡＫ０９７３０５．１、ＡＫ０９７３２０．１、ＡＫ０９７３２９．１、ＡＫ０９７３４５．１、ＡＫ０９７３４８．１、ＡＫ０９７３６２．１、ＡＫ０９７９５５．１、ＡＫ１２３５４６．１、ＡＫ１２３７８３．１、ＡＫ１２５２３８．１、ＡＫ１２５５８２．１、ＡＫ１２６２７９．１、ＡＫ１２６５４３．１、ＡＫ１２７９２１．１、ＡＫ１２８４７６．１、ＡＫ１２８５６５．１、ＡＫ１２８６５２．１、ＡＫ１２８６６４．１、ＡＫ１２９５９２．１、ＡＫ１２９６２０．１、ＡＫ１３０４３３．１、ＡＫ１３０４５３．１、ＡＫ１３０４６５．１、ＡＫ１３０４６８．１、ＡＫ１３０４７６．１、ＡＫ１３０５０１．１、ＡＫ１３０５２９．１、ＡＫ１３０７９６．１、ＡＫ１３１０６５．１、ＡＹ８８５２１４．２、ＡＹ８８５２１５．２、ＢＣ００５９５１．１、ＢＣ０１６３６９．１、ＢＣ０３２２４９．１、ＢＣ０７３７７１．１、ＢＣ０８７８４１．１、ＢＣ０９２４４９．１、ＢＸ６４０６２４．１、ＢＸ６４０６２６．１、ＢＸ６４０８４７．１
（８）ヒトＡＰＯＡ４のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００４８２等
（１）ヒトＬＲＧ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０５２９７２等
（２）ヒトＣ９のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１７３７等
（３）ヒトＣＲＰのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００５６７、ＮＭ＿００１３２９０５７、ＮＭ＿００１３２９０５８等
（４）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ３のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿００１０８５等
（５）ヒトＡＰＯＢのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００３８４
（６）ヒトＧＳＮのｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００１７７、ＮＭ＿００１１２７６６２、ＮＭ＿００１１２７６６２、ＮＭ＿００１１２７６６４、ＮＭ＿００１１２７６６５等
（７）ヒトＩＧＨＡ１のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：Ｓｅｑ ＩＤ：ＡＦ０６７４２０．１、ＡＦ２８３６６６．１、ＡＪ２９４７２９．１、ＡＫ０２７３７９．１、ＡＫ０５８０２７．１、 ＡＫ０７４６５１．１、ＡＫ０９２３８４．１、ＡＫ０９２８０３．１、ＡＫ０９２８１９．１、ＡＫ０９３７２１．１、ＡＫ０９５２２２．１、ＡＫ０９６９８５．１、ＡＫ０９７０１７．１、ＡＫ０９７０２８．１、ＡＫ０９７０７６．１、ＡＫ０９７３０３．１、ＡＫ０９７３０５．１、ＡＫ０９７３２０．１、ＡＫ０９７３２９．１、ＡＫ０９７３４５．１、ＡＫ０９７３４８．１、ＡＫ０９７３６２．１、ＡＫ０９７９５５．１、ＡＫ１２３５４６．１、ＡＫ１２３７８３．１、ＡＫ１２５２３８．１、ＡＫ１２５５８２．１、ＡＫ１２６２７９．１、ＡＫ１２６５４３．１、ＡＫ１２７９２１．１、ＡＫ１２８４７６．１、ＡＫ１２８５６５．１、ＡＫ１２８６５２．１、ＡＫ１２８６６４．１、ＡＫ１２９５９２．１、ＡＫ１２９６２０．１、ＡＫ１３０４３３．１、ＡＫ１３０４５３．１、ＡＫ１３０４６５．１、ＡＫ１３０４６８．１、ＡＫ１３０４７６．１、ＡＫ１３０５０１．１、ＡＫ１３０５２９．１、ＡＫ１３０７９６．１、ＡＫ１３１０６５．１、ＡＹ８８５２１４．２、ＡＹ８８５２１５．２、ＢＣ００５９５１．１、ＢＣ０１６３６９．１、ＢＣ０３２２４９．１、ＢＣ０７３７７１．１、ＢＣ０８７８４１．１、ＢＣ０９２４４９．１、ＢＸ６４０６２４．１、ＢＸ６４０６２６．１、ＢＸ６４０８４７．１
（８）ヒトＡＰＯＡ４のｍＲＮＡのＲｅｆＳｅｑ ＩＤ：ＮＭ＿０００４８２等
【0063】
例えば、被検者由来の組織等を試料に用い、本プライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ等を行うことにより、試料中の、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上のｍＲＮＡを検出することができる。
【0064】
＜プローブ＞
プローブとしては、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。
プローブとしては、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。
【0065】
また、本実施形態の膠芽腫診断薬は、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを１種単独で備えていてもよく、２種以上組み合わせて備えていてもよい。さらに、ＬＲＧ１遺伝子、ＣＲＰ遺伝子、ＡＰＯＢ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブも備えていてもよい。
【0066】
プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。例えば、上記のＤＮＡマイクロアレイに、被検者由来の組織から抽出したｍＲＮＡを接触させ、プローブにハイブリダイズしたＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上のｍＲＮＡを検出することにより、被検者が膠芽腫に罹患しているか否かを判定することができる。
【0067】
≪被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法≫
本実施形態の被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法は、被検者より採取した検体中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を測定する方法である。
本実施形態の被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法は、被検者より採取した検体中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を測定する方法である。
【0068】
また、本実施形態の方法において、上記５種のタンパク質に加えて、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢを測定してもよい。
【0069】
本実施形態において用いられる検体としては、被検者から採取された生体試料であればよく、例えば、血液、髄液、尿、パフィーコート、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液（髄液）、涙液、痰、粘液、リンパ液、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、脳組織片等が挙げられる。血液としては、全血、血清、血漿が含まれる。中でも、検体としては、血液、髄液、又は尿であることが好ましい。
【0070】
＜第１実施形態＞
本実施形態の方法は、検体が血液である場合、以下の工程（１Ａ）～（２Ａ）を含む方法により行うことができる。
（１Ａ）被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ａ）前記工程（１Ａ）で測定したＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い場合、並びに、前記工程（１Ａ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
本実施形態の方法は、検体が血液である場合、以下の工程（１Ａ）～（２Ａ）を含む方法により行うことができる。
（１Ａ）被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ａ）前記工程（１Ａ）で測定したＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い場合、並びに、前記工程（１Ａ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
【0071】
［工程（１Ａ）］
工程（１Ａ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程である。採取された血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
工程（１Ａ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程である。採取された血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
【0072】
免疫学的測定法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。
ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0073】
［工程（２Ａ）］
工程（２Ａ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する工程である。
工程（２Ａ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する工程である。
【0074】
被検者より採取した血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ又は低い場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0075】
或いは、被検者より採取した血液中の、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ又は高い場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0076】
健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、該被検者が膠芽腫に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度を測定し、その統計から健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度を設定することができる。
【0077】
被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、公知の方法（例えば、Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等）を用いることができる。
【0078】
該解析により、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ又は低いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0079】
或いは、該解析により、被検者より採取した血液中の、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ又は高いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0080】
＜第２実施形態＞
本実施形態の方法は、検体が髄液である場合、以下の工程（１Ｂ）～（３Ｂ）を含む方法により行うことができる。
（１Ｂ）被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程；
（２Ｂ）前記被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度よりも低い場合、及び、前記工程（２Ｂ）で測定したＩＧＨＡ１濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度よりも高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度と同じ若しくは高い場合、及び、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度と同じ若しくは低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
本実施形態の方法は、検体が髄液である場合、以下の工程（１Ｂ）～（３Ｂ）を含む方法により行うことができる。
（１Ｂ）被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程；
（２Ｂ）前記被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度よりも低い場合、及び、前記工程（２Ｂ）で測定したＩＧＨＡ１濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度よりも高い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ濃度と同じ若しくは高い場合、及び、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１濃度と同じ若しくは低い場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
【0081】
［工程（１Ｂ）］
工程（１Ｂ）は、被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程である。工程（１Ｂ）で採取された髄液中の、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
工程（１Ｂ）は、被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度を測定する工程である。工程（１Ｂ）で採取された髄液中の、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
【0082】
免疫学的測定法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。
ここで、測定したＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
ここで、測定したＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0083】
［工程（２Ｂ）］
工程（２Ｂ）は、工程（１Ｂ）で得られた被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度と、健常者より採取した髄液中の、対応するＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度とを対比する工程である。
工程（２Ｂ）は、工程（１Ｂ）で得られた被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度と、健常者より採取した髄液中の、対応するＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度とを対比する工程である。
【0084】
被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮの濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮの濃度よりも低い場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、ＧＳＮの濃度と同じ又は高い場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0085】
又は、被検者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度よりも高い場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度と同じ又は低い場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0086】
健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度は、該被検者が膠芽腫に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度を測定し、その統計から健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各濃度を設定することができる。
【0087】
被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度と、健常者より採取した髄液中の、対応するＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、公知の方法（例えば、Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等）を用いることができる。
【0088】
該解析により、被検者より採取した髄液中の、ＧＳＮの濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮの濃度よりも低いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した髄液中の、ＧＳＮの濃度と同じ又は高いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0089】
或いは、該解析により、被検者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度が、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度よりも高いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した髄液中の、ＩＧＨＡ１の濃度と同じ又は低いことが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0090】
≪被検者が膠芽腫に罹患している可能性をモニタリングする方法≫
本実施形態の被検者が膠芽腫に罹患している可能性をモニタリングする方法は、被検者より経時的に採取した検体中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を測定する方法である。
本実施形態の被検者が膠芽腫に罹患している可能性をモニタリングする方法は、被検者より経時的に採取した検体中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上を測定する方法である。
【0091】
また、本実施形態の方法において、上記５種のタンパク質に加えて、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢを測定してもよい。
【0092】
本実施形態において用いられる検体としては、上記「被検者が膠芽腫に罹患している可能性を試験する方法」において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、検体としては、血液、髄液、又は尿であることが好ましい。
【0093】
本実施形態の方法は、検体が血液である場合、以下の工程（１Ｃ）～（２Ｃ）を含む方法により行うことができる。
（１Ｃ）被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ｃ）前記工程（１Ｃ）で測定したＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡの濃度よりも高い濃度で維持されている場合、並びに、前記工程（１Ｃ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い濃度で維持されている場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い濃度で維持されている場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い濃度で維持されている場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
（１Ｃ）被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程；
（２Ｃ）前記工程（１Ｃ）で測定したＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡの濃度よりも高い濃度で維持されている場合、並びに、前記工程（１Ｃ）で測定したＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い濃度で維持されている場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患していると判定し、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ若しくは低い濃度で維持されている場合、並びに、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ若しくは高い濃度で維持されている場合のうち少なくともいずれかである場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定する工程
【0094】
［工程（１Ｃ）］
工程（１Ｃ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程である。採取された血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記５種のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
工程（１Ｃ）は、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度を測定する工程である。採取された血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、例えば、上述した特異的結合物質を用いた、免疫学的測定法、又は、安定同位体で標識された上記５種のタンパク質を用いた、質量分析法によって測定することができる。
【0095】
免疫学的測定法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。
ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0096】
［工程（２Ｃ）］
工程（２Ｃ）は、工程（１Ｃ）で得られた被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する工程である。
工程（２Ｃ）は、工程（１Ｃ）で得られた被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する工程である。
【0097】
被検者より採取した血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い濃度で維持されている場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ又は低い濃度で維持されている場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0098】
或いは、被検者より採取した血液中の、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い濃度で維持されている場合には該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ又は高い濃度で維持されている場合には、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0099】
健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度は、該被検者が膠芽腫に罹患している可能性を判定するための基準値であり、複数の健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度を測定し、その統計から健常者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各濃度を設定することができる。
【0100】
被検者より採取した血液中の、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度とを対比する方法としては、特に限定はなく、公知の方法（例えば、Ｓｔｅｅｌ法、ｔ検定、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定等）を用いることができる。
【0101】
該解析により、被検者より採取した血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度よりも高い濃度で維持されていることが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の濃度と同じ又は低い濃度で維持されていることが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0102】
或いは、該解析により、被検者より採取した血液中の、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度が、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度よりも低い濃度で維持されていることが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性が高いと判定され、健常者より採取した血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の濃度と同じ又は高い濃度で維持されていることが示された場合は、該被検者は膠芽腫に罹患している可能性は低いと判定される。
【0103】
また、膠芽腫患者の手術前及び手術後において、経時的に血液を採取して、本実施形態の方法を適用することで、膠芽腫に罹患している人の病勢把握、膠芽腫患者の術後の経過状態の把握、再発診断等を簡便に判定することができる。
【0104】
≪血液の判定方法≫
本実施形態の血液の判定方法は、以下の工程（１Ｅ）及び工程（２Ｅ）を備える方法である。
（１Ｅ）血液中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程；
（２Ｅ）前記（１Ｅ）で測定されたＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中のＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量と比較して少ない場合のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
本実施形態の血液の判定方法は、以下の工程（１Ｅ）及び工程（２Ｅ）を備える方法である。
（１Ｅ）血液中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程；
（２Ｅ）前記（１Ｅ）で測定されたＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中のＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量と比較して少ない場合のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
【0105】
本実施形態の判定方法により、血液が膠芽腫患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の判定方法は、膠芽腫の診断方法であるということもできる。本実施形態の判定方法によれば、膠芽腫を特異的に検出することができる。
【0106】
また、本実施形態の判定方法において、上記５種のタンパク質の存在量に加えて、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢの存在量を測定し、膠芽腫患者由来の血液であるか否かの判定に用いてもよい。
【0107】
＜工程（１Ｅ）＞
本実施形態の判定方法において、血液としては、血清又は血漿であってもよい。血液中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた質量分析法、又は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各存在量は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
本実施形態の判定方法において、血液としては、血清又は血漿であってもよい。血液中のＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量を測定する工程は、安定同位体で標識された上記のタンパク質を用いた質量分析法、又は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＣ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各存在量は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0108】
＜工程（２Ｅ）＞
本実施形態の判定方法では、血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
本実施形態の判定方法では、血液中の、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が、健常者の血液中の、対応するＣ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量と比較して多い場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0109】
或いは、血液中の、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が、健常者の血液中の、対応するＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量と比較して少ない場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0110】
また、予め健常者由来の血液中に存在する、Ｃ９、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１又はＡＰＯＡ４の各存在量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較して、Ｃ９、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３の存在量が多い場合、並びに、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４からなる群より選ばれる１種以上の存在量が少ない場合、のうち少なくともいずれかの場合に、血液は膠芽腫患者由来のものであると判定してもよい。
【0111】
≪組織の判定方法≫
本実施形態の組織の判定方法は、以下の工程（１Ｆ）及び工程（２Ｆ）を備える方法である。
（１Ｆ）組織中のＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量を測定する工程；
（２Ｆ）測定されたＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が、健常者の組織中の、対応するＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量が、健常者の組織中の、対応するＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上と比較して少ない場合のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
本実施形態の組織の判定方法は、以下の工程（１Ｆ）及び工程（２Ｆ）を備える方法である。
（１Ｆ）組織中のＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量を測定する工程；
（２Ｆ）測定されたＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が、健常者の組織中の、対応するＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量と比較して多い場合、並びに、測定されたＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量が、健常者の組織中の、対応するＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上と比較して少ない場合のうち少なくともいずれかである場合に、前記血液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
【0112】
本実施形態の判定方法により、組織が膠芽腫患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の判定方法は、膠芽腫の診断方法であるということもできる。本実施形態の判定方法によれば、膠芽腫を特異的に検出することができる。
【0113】
また、本実施形態の判定方法において、上記５種の遺伝子の発現量に加えて、ＬＲＧ１遺伝子、ＣＲＰ遺伝子、ＡＰＯＢ遺伝子の発現量を測定し、膠芽腫患者由来の組織であるか否かの判定に用いてもよい。
【0114】
＜工程（１Ｆ）＞
本実施形態の判定方法において、組織は、被検者由来の腫瘍組織等であってもよい。組織中の、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子の各発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。
本実施形態の判定方法において、組織は、被検者由来の腫瘍組織等であってもよい。組織中の、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子の各発現量を測定する工程は、上述したプライマーセットを用いたＲＴ－ＰＣＲ、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により行うことができる。
【0115】
或いは、上述したプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイ解析、ノーザンブロッティング等により、Ｃ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子の各発現量を測定してもよい。ここで、測定したＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子の各発現量は、段階希釈した既知濃度の各遺伝子の断片等を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0116】
＜工程（２Ｆ）＞
また、本実施形態の判定方法では、組織中の、Ｃ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が、健常者の組織中の、対応する上記遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記組織は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
また、本実施形態の判定方法では、組織中の、Ｃ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が、健常者の組織中の、対応する上記遺伝子の発現量と比較して多い場合に、前記組織は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0117】
或いは、組織中のＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量が、健常者の組織中の、対応する上記遺伝子の発現量と比較して少ない場合に、前記組織は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0118】
また、予め健常者由来の組織におけるＣ９遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子又はＡＰＯＡ４遺伝子の各発現量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＣ９遺伝子、及び／又はＳＥＲＰＩＮＡ３遺伝子の発現量が多い場合、並びに、ＧＳＮ遺伝子、ＩＧＨＡ１遺伝子及びＡＰＯＡ４遺伝子からなる群より選ばれる１種以上の発現量が少ない場合、のうち少なくともいずれかの場合に、組織は膠芽腫患者由来のものであると判定してもよい。
【0119】
≪髄液の判定方法≫
本実施形態の髄液の判定方法は、以下の工程（１Ｇ）及び工程（２Ｇ）を備える方法である。
（１Ｇ）髄液中のＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の存在量を測定する工程；
（２Ｇ）測定されたＧＳＮの存在量が、健常者の髄液中のＧＳＮの存在量と比較して少ない場合、及び、測定されたＩＧＨＡ１の存在量が、健常者の髄液中のＩＧＨＡ１の存在量と比較して多い場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
本実施形態の髄液の判定方法は、以下の工程（１Ｇ）及び工程（２Ｇ）を備える方法である。
（１Ｇ）髄液中のＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の存在量を測定する工程；
（２Ｇ）測定されたＧＳＮの存在量が、健常者の髄液中のＧＳＮの存在量と比較して少ない場合、及び、測定されたＩＧＨＡ１の存在量が、健常者の髄液中のＩＧＨＡ１の存在量と比較して多い場合、のうち少なくともいずれかである場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する工程
【0120】
本実施形態の判定方法により、髄液が膠芽腫患者由来のものであるか否かを判定することができる。すなわち、本実施形態の判定方法は、膠芽腫の診断方法であるということもできる。本実施形態の判定方法によれば、膠芽腫を特異的に検出することができる。
【0121】
また、本実施形態の判定方法において、上記５種のタンパク質の存在量に加えて、ＬＲＧ１、ＣＲＰ、ＡＰＯＢの存在量を測定し、膠芽腫患者由来の髄液であるか否かの判定に用いてもよい。
【0122】
＜工程（１Ｇ）＞
髄液中のＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の存在量を測定する工程は、安定同位体で標識された上記２種のタンパク質を用いた質量分析法、又は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各存在量は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
髄液中のＧＳＮ及び／又はＩＧＨＡ１の存在量を測定する工程は、安定同位体で標識された上記２種のタンパク質を用いた質量分析法、又は、上述した特異的結合物質を用いた、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、逆相タンパク質アレイを用いた検出、免疫組織化学染色等により行うことができる。ここで、測定したＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各存在量は、段階希釈した既知濃度の上記タンパク質を基準に用いて定量値に換算してもよい。
【0123】
＜工程（２Ｇ）＞
本実施形態の判定方法では、髄液中のＧＳＮの存在量が、健常者の髄液中のＧＳＮの存在量と比較して少ない場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
本実施形態の判定方法では、髄液中のＧＳＮの存在量が、健常者の髄液中のＧＳＮの存在量と比較して少ない場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0124】
或いは、髄液中のＩＧＨＡ１の存在量が、健常者の髄液中のＩＧＨＡ１の存在量と比較して多い場合に、前記髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定する。
【0125】
また、予め健常者由来の髄液中に存在する、ＧＳＮ又はＩＧＨＡ１の各存在量に基づいて基準値を設定しておき、当該基準値と比較してＧＳＮの量が多い場合、及び、ＩＧＨＡ１の量が少ない場合、のうち少なくともいずれかの場合に、髄液は膠芽腫患者由来のものであると判定してもよい。
【実施例】
【0126】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0127】
［実施例１］血液中の膠芽腫バイオマーカーの探索
次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎｓ）法（例えば、「参考文献１：特開２０１５－０２１７３９号公報」、「参考文献２：国際公開第２０１５／００８４５３号」等参照）を用いて、血漿中の膠芽腫バイオマーカー探索を行った（図１参照）。
次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｗｉｎｄｏｗｅｄ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｏｎｓ）法（例えば、「参考文献１：特開２０１５－０２１７３９号公報」、「参考文献２：国際公開第２０１５／００８４５３号」等参照）を用いて、血漿中の膠芽腫バイオマーカー探索を行った（図１参照）。
【0128】
１．試料の準備
本発明者らは、膠芽腫患者の血漿中のバイオマーカータンパク質は、膠芽腫組織で産生され、嚢胞液（髄液）及び血漿中に放出されると仮定した。そのため、スペクトルライブラリー構築のための試料として、腫瘍組織、嚢胞液（髄液）及び血漿を用いた。
本発明者らは、膠芽腫患者の血漿中のバイオマーカータンパク質は、膠芽腫組織で産生され、嚢胞液（髄液）及び血漿中に放出されると仮定した。そのため、スペクトルライブラリー構築のための試料として、腫瘍組織、嚢胞液（髄液）及び血漿を用いた。
【0129】
まず、１４名の膠芽腫患者の手術前血清及び腫瘍組織、並びに、１５名の健常者の血清を採取した。また、１４名中３名の膠芽腫患者の手術前後の嚢胞液（髄液）を採取した。
【0130】
次いで、各腫瘍組織は、緩衝液Ａを加えて、Ｐｏｔｔｅｒ－Ｅｌｖｅｈｊｅｍホモジナイザーを用いて、ホモジナイズした。なお、緩衝液Ａの組成は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）、１０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）である。次いで、得られたホモジネートを緩衝液Ａ中で窒素キャビテーション（４℃で１５分間、４５０ｐｓｉ）し、一部のホモジネート溶液を腫瘍組織溶解物として－８０℃で保存した。
【0131】
一方、残りのホモジネート溶液を４℃、１００００ｇで１０分間遠心分離し、上清を得た。次いで、得られた上清をさらに４℃、１００００ｇで４０分間投遠心分離して、上清を得た。得られた上清を細胞質画分として－８０℃で保存した。
【0132】
次いで、得られたペレットを緩衝液Ｂに懸濁して、懸濁液を得た。なお、緩衝液Ｂの組成は、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．４）及び２５０ｍＭのスクロースである。得られた懸濁液の一部をミクロソーム画分として－８０℃で保存した。
【0133】
次いで、残りの懸濁液を３８（ｗ／ｖ）％スクロース溶液上に重層し、４℃、１００００ｇで４０分間遠心分離した。遠心分離後、界面の濁った層を回収し、緩衝液Ｂに懸濁した。得られた懸濁液を４℃、１００００ｇで４０分間遠心分離した。次いで、得られたペレットを原形質膜画分とし、緩衝液Ｂに懸濁した。
【0134】
次いで、得られた血漿、嚢胞液、腫瘍組織溶解物、細胞質画分及びミクロソーム画分を１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（８Ｍの尿素含有）に可溶化し、ジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてＳ－カルボモイルメチル化した。
【0135】
次いで、Ｓ－カルバモイルメチル化した試料を５倍希釈したプロテアーゼＭＡＸ界面活性剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、終濃度：０．０５％）及び１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を用いて洗浄した。次いで、基質に対する酵素の含有比が１／１００（血漿及び嚢胞液）、１／２０（腫瘍組織溶解物及びミクロソーム画分）、又は、１／１０（細胞質画分）となるように、リジンエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）を用いて、３０℃で３時間処理した。
【0136】
次いで、処理後の試料を、基質に対する酵素の含有比１／１００（血漿及び嚢胞液）、１／２０（腫瘍組織溶解物及びミクロソーム画分）、又は、１／１０（細胞質画分）となるように、配列グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３７℃で１６時間消化した。
【0137】
次いで、血漿膜画分を変性緩衝液に可溶化し、溶液中のタンパク質をジチオトレイトール及びヨードアセトアミドを用いてＳ－カルボモイルメチル化した。なお、変性緩衝液の組成は、７Ｍの塩酸グアニジン、５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）及び１０ｍＭのＥＤＴＡである。また、アルキル化タンパク質をメタノール、クロロホルム及び水の混合液を用いて、沈殿させた。
【0138】
次いで、沈殿物を１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（６Ｍの尿素含有）に溶解した。次いで、溶解した試料を、５倍希釈したプロテアーゼＭＡＸ界面活性剤（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、終濃度：０．０５％）及び１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を用いて洗浄した。次いで、基質に対する酵素の含有比が１／１００となるように、リジンエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製）を用いて、３０℃で３時間処理した。
【0139】
次いで、処理後の試料を、基質に対する酵素の含有比１／１００となるように、配列グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、３７℃で１６時間消化した。
【0140】
次いで、各トリプシン消化物をＳＤＢ－Ｔｉｐ及びＧＣ－Ｔｉｐ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、脱塩した。
【0141】
次いで、スペクトルライブラリー構築のために、等電点に基づくペプチド分離を行った。
【0142】
次いで、いくつかの脱塩試料（血漿試料のうち１つ及び嚢胞液試料のうち１つ）を３１００ ＯＦＦＧＥＬ分画器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、線形ｐＨグラジエント範囲（ｐＨ３～１０）で、１２画分に分画した。次いで、分画した試料をＳＤＢ－Ｔｉｐ及びＧＣ－Ｔｉｐ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて、脱塩した。
【0143】
２．質量分析
次いで、スペクトルライブラリー構築のために、「１．」で脱塩したペプチド試料をエレクトロスプレーイオン化トリプルＴＯＦ５６００質量分析計（ＳＣＩＥＸ社製）と連結したナノＬＣウルトラ２Ｄプラス（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に注入した。
次いで、スペクトルライブラリー構築のために、「１．」で脱塩したペプチド試料をエレクトロスプレーイオン化トリプルＴＯＦ５６００質量分析計（ＳＣＩＥＸ社製）と連結したナノＬＣウルトラ２Ｄプラス（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に注入した。
【0144】
ナノＬＣを有するｃＨｉＰＬＣナノフレックスシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、注入したペプチド試料（注入量；５μＬ、試料中０．０２μＬの血漿又は０．２μｇタンパク質／μＬ含有）はトラップカラム（２００μｍ×６ｍｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ３μｍ、Ｃ１８ （Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））にロードされて、分析カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ３μｍ、Ｃ１８‐ＡＱ１２０Ａ°（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））で分離された。
【0145】
流速は、トラップカラムへのロードでは２μＬ／分（６分間の可動時間）であり、分析カラムでの分離では３００ｎＬ／分であった。
【0146】
また、注入されたペプチド試料の溶出条件は以下に示すとおりである。また、溶離液の組成は、Ａ液が０．１％のギ酸含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ、Ｂ液が０．１のギ酸含有１００％アセトニトリルである。
０～６０分：０→２０％のＢ液（上昇）
６０～７５分：２０％のＢ液→４０％のＢ液（上昇）
７５～７７分：４０％のＢ液→１００％のＢ液（上昇）
７７～８２分：１００％のＢ液（維持）
８２～８４分：１００％のＢ液→０％のＢ液（下降）
８４～１１５分：０％のＢ液（維持）
０～６０分：０→２０％のＢ液（上昇）
６０～７５分：２０％のＢ液→４０％のＢ液（上昇）
７５～７７分：４０％のＢ液→１００％のＢ液（上昇）
７７～８２分：１００％のＢ液（維持）
８２～８４分：１００％のＢ液→０％のＢ液（下降）
８４～１１５分：０％のＢ液（維持）
【0147】
また、データを取得するために、３００～１００８の質量範囲（ｍ／ｚ）を有する全てのＭＳスペクトル（全走査型）を正のイオン化モードでデータ依存的分析（ｄａｔａ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ；ＤＤＡ）を用いて記録した。
【0148】
また、ペプチド試料を断片化するために、１サイクルあたり２＋～５＋の間の電荷状態を有する最大２０の強力な前駆イオンを選択した。衝突エネルギー核酸は５ｅＶに設定した。その結果、１００～１６００ｍ／ｚの範囲の生成物イオン又はＭＳ／ＭＳ断片が収集された。
【0149】
最適化された断片化効率を達成するために、ＤＤＡを使用して、以下の式（Ｉ）に基づいて、衝突エネルギー（ＣＥ）を自動的に制御した。
ＣＥ＝０．０４４×（前駆イオン［ｍ／ｚ］）＋４ ・・・（Ｉ）
ＣＥ＝０．０４４×（前駆イオン［ｍ／ｚ］）＋４ ・・・（Ｉ）
【0150】
また、高感度モードを使用し、断片イオン質量の正確な抽出を行った。
【0151】
３．スペクトルライブラリーの構築
次いで、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．５（ＳＣＩＥＸ社製）のＰａｒａｇｏｎアルゴリズムを用いてＤＤＡデータを分析し、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｕｍａｎプロテオームデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ２０１６＿０２、ｅｎｔｒｉｅｓ）を検索した。
次いで、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．５（ＳＣＩＥＸ社製）のＰａｒａｇｏｎアルゴリズムを用いてＤＤＡデータを分析し、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｕｍａｎプロテオームデータベース（ｒｅｌｅａｓｅ２０１６＿０２、ｅｎｔｒｉｅｓ）を検索した。
【0152】
重複したペプチド又はタンパク質を除いた結果、２００６６個のペプチド及び２９３０個のタンパク質を含むスペクトルライブラリーが構築された。
【0153】
４．ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析
次いで、構築されたスペクトルライブラリーを使用して、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿について、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析を行った。なお、スペクトルアラインメント及び標的データ抽出は、ＰｅａｋｖｉｅｗのＳＷＡＴＨ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ Ａｐｐ（バージョン２．０、ＳＣＩＥＸ社製）で行った。
次いで、構築されたスペクトルライブラリーを使用して、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿について、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析を行った。なお、スペクトルアラインメント及び標的データ抽出は、ＰｅａｋｖｉｅｗのＳＷＡＴＨ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ Ａｐｐ（バージョン２．０、ＳＣＩＥＸ社製）で行った。
【0154】
その結果、少なくとも１つの試料において、ペプチドの偽陽性率（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ；ＦＤＲ）＜１％で、７８０１個のペプチド（９６２個のタンパク質）を同定した（図１の「Ｓｔｅｐ １」参照）。
【0155】
次いで、膠芽腫患者の血漿中において発現量が増加又は減少するタンパク質を選択するために、より高いピーク面積を示す上位３つの遷移を選択した。
【0156】
５．Ｃｏｈｅｎのｄ効果量による分析
次いで、同定されたタンパク質の中から臨床的に有意な発生率であるタンパク質を選択することが重要であるため、試料の大きさに影響されない２群間の差の指標として、Ｃｏｈｅｎのｄ効果量（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ ｅｆｆｅｃｔ ｓｉｚｅ）を採用した。
次いで、同定されたタンパク質の中から臨床的に有意な発生率であるタンパク質を選択することが重要であるため、試料の大きさに影響されない２群間の差の指標として、Ｃｏｈｅｎのｄ効果量（Ｃｏｈｅｎ’ｓ ｄ ｅｆｆｅｃｔ ｓｉｚｅ）を採用した。
【0157】
全ての上位３つの遷移において、０．５以上の効果量を有するペプチド断片として、１８１３個のペプチド（１５８個のタンパク質）が得られた（図１の「Ｓｔｅｐ ２」参照）。
【0158】
６．平均ピーク面積比の算出
次いで、上位３つの遷移から、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿の間のピーク面積比の平均値を得た。これにより、１２８９個のペプチド（１２４個の発現量が増加するタンパク質）は、全ての上位３つの遷移において、１．０より大きい平均ピーク面積比であった。一方、５０６個のペプチド（８０個の発現量が減少するタンパク質）は、全ての上位３つの遷移において、１．０未満の平均ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ３」参照）。
次いで、上位３つの遷移から、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿の間のピーク面積比の平均値を得た。これにより、１２８９個のペプチド（１２４個の発現量が増加するタンパク質）は、全ての上位３つの遷移において、１．０より大きい平均ピーク面積比であった。一方、５０６個のペプチド（８０個の発現量が減少するタンパク質）は、全ての上位３つの遷移において、１．０未満の平均ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ３」参照）。
【0159】
次いで、これらのタンパク質の中で、同じタンパク質の異なるペプチド断片であるものを判断したところ、４８個のタンパク質が、発現量が増加及び減少するタンパク質として同定された。
【0160】
７．最大ピーク面積比及び最低ピーク面積比の選択
さらに、最も高いピーク面積を有する上位単一遷移から、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿の間のピーク面積比を得た。これにより、１６５個のペプチド（５０個の発現量が増加するタンパク質）は、２．０以上の最大ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ４ａ」参照）。一方、１１４個のペプチド（２９個の発現量が減少するタンパク質）は、０．５以下の最低ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ４ｂ」参照）。
さらに、最も高いピーク面積を有する上位単一遷移から、膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿の間のピーク面積比を得た。これにより、１６５個のペプチド（５０個の発現量が増加するタンパク質）は、２．０以上の最大ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ４ａ」参照）。一方、１１４個のペプチド（２９個の発現量が減少するタンパク質）は、０．５以下の最低ピーク面積比であった（図１の「Ｓｔｅｐ ４ｂ」参照）。
【0161】
８．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準によるペプチドの選択
次いで、信頼性の低いペプチド候補を排除するために、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準を用いて、全てのペプチド候補の配列を検証した（図１の「Ｓｔｅｐ ５」参照）。これにより、３０個のペプチド（１５個の発現量が増加するタンパク質）及び１９個のペプチド（１３個の発現量が減少するタンパク質）が選択された。また、そのうち１つのタンパク質は、同じタンパク質の異なるペプチド断片として、発現量が増加するタンパク質及び発現量が減少するタンパク質のいずれにも含まれていた。
次いで、信頼性の低いペプチド候補を排除するために、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準を用いて、全てのペプチド候補の配列を検証した（図１の「Ｓｔｅｐ ５」参照）。これにより、３０個のペプチド（１５個の発現量が増加するタンパク質）及び１９個のペプチド（１３個の発現量が減少するタンパク質）が選択された。また、そのうち１つのタンパク質は、同じタンパク質の異なるペプチド断片として、発現量が増加するタンパク質及び発現量が減少するタンパク質のいずれにも含まれていた。
【0162】
９．手動検査
次いで、ピーク形状に焦点を当てた上位３つの遷移のＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムについて、手動検査を実施した。これにより、５個の発現量が増加するタンパク質、及び、３個の発現量が減少するタンパク質がそれぞれ同定された（図１の「Ｓｔｅｐ ６」参照）。
次いで、ピーク形状に焦点を当てた上位３つの遷移のＬＣ－ＭＳ／ＭＳクロマトグラムについて、手動検査を実施した。これにより、５個の発現量が増加するタンパク質、及び、３個の発現量が減少するタンパク質がそれぞれ同定された（図１の「Ｓｔｅｐ ６」参照）。
【0163】
１０．ＲＯＣ解析
次いで、上記８個の候補タンパク質のＲＯＣ解析を行った。各候補タンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）の値を算出した結果、ＬＲＧ１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）及びＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）のＡＵＣ値は、０．８０より大きく、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＡＰＯＢ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ－１００）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）のＡＵＣ値は０．７０より大きかった（図１の「Ｓｔｅｐ ７」参照）。
次いで、上記８個の候補タンパク質のＲＯＣ解析を行った。各候補タンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）の値を算出した結果、ＬＲＧ１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｌｐｈａ－２－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ １）、Ｃ９（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ９）、ＧＳＮ（ｇｅｌｓｏｌｉｎ）及びＩＧＨＡ１（Ｉｇ ａｌｐｈａ－１ ｃｈａｉｎ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ）のＡＵＣ値は、０．８０より大きく、ＣＲＰ（Ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（ａｌｐｈａ－１－ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ）、ＡＰＯＢ（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ－１００）及びＡＰＯＡ４（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ＩＶ）のＡＵＣ値は０．７０より大きかった（図１の「Ｓｔｅｐ ７」参照）。
【0164】
１１．ＱＴＡＰ分析
次いで、ＭＳ／ＭＳ分析における試料依存性イオン抑制に起因する偽陽性の可能性を排除することができないため、ＱＴＡＰ分析によって、上記ＡＵＣ値を確認した。
次いで、ＭＳ／ＭＳ分析における試料依存性イオン抑制に起因する偽陽性の可能性を排除することができないため、ＱＴＡＰ分析によって、上記ＡＵＣ値を確認した。
【0165】
（１）安定同位体標識ペプチドの作製
各ペプチドを同定するための安定同位体標識ペプチドを準備した。まず、Ｎ末端Ｓｔｒｅｐタグ、Ｃ末端ＨＡＴタグ、Ｎ及びＣ末端標準ペプチド、及び、膠芽腫バイオマーカー候補の８個のペプチド（配列番号１～８）をタンデムに結合したペプチドをコードするｃＤＮＡをそれぞれ合成し、ｐＥＴ－１７ｂにサブクローニングした。
各ペプチドを同定するための安定同位体標識ペプチドを準備した。まず、Ｎ末端Ｓｔｒｅｐタグ、Ｃ末端ＨＡＴタグ、Ｎ及びＣ末端標準ペプチド、及び、膠芽腫バイオマーカー候補の８個のペプチド（配列番号１～８）をタンデムに結合したペプチドをコードするｃＤＮＡをそれぞれ合成し、ｐＥＴ－１７ｂにサブクローニングした。
【0166】
次いで、無細胞発現系（大陽日酸社製）を用いて、組換えタンパク質を発現させた。具体的には、まず、プラスミド及び希釈標準溶液を混合し、３０℃で１６時間インキュベートした。次いで、安定同位体標識のために、リジン（Ｌｙｓ）及びアルギニン（Ａｒｇ）の１３Ｃ及び１５Ｎを含有するアミノ酸混合物を発現系と共にインキュベートした。次いで、発現の反応終了後、溶液を４℃、１７８００ｇで５分間遠心分離した。次いで、ペレットを取集し、ＰＢＳ緩衝液に懸濁した。次いで、懸濁液を変性緩衝液に可溶化した。なお、変性緩衝液の組成は、７Ｍのグアニジン塩酸塩及び１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）である。次いで、溶液を４℃、１７８００ｇで１０分間遠心分離した。
【0167】
次いで、得られた上清を洗浄緩衝液Ａで１０倍に希釈した。なお、洗浄緩衝液Ａの組成は、１５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌである。次いで、希釈溶液を４℃、１００００ｇで１０分間遠心分離した。
【0168】
次いで、得られた上清をＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＩＢＳ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にロードした。なお、カラムは、上清のロード前に、２カラム容量の洗浄緩衝液Ａで３回洗浄しておいた。
【0169】
次いで、０．５カラム容量の溶出緩衝液Ｂを６回ロードして、組換えタンパク質を溶出した。なお、溶出緩衝液Ｂの組成は、７Ｍの塩酸グアニジン、１５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１００ｍＭのＮａＣｌである。次いで、組換えタンパク質を含む溶出溶液の一部を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより組換えタンパク質が含まれることを確認した。
【0170】
次いで、組換えタンパク質を含む溶出溶液をＨｉｓＰｕｒコバルトスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）にロードし、ミキサーを用いて、４℃で３０分間転倒混和した。次いで、カラムを４℃、７００ｇで２分間遠心分離した。
【0171】
次いで、２カラム容量の洗浄緩衝液Ｃで洗浄した。なお、洗浄緩衝液Ｃの組成は、６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び３００ｍＭのＮａＣｌである。次いで、カラムを４℃、７００ｇで２分間遠心分離した。この洗浄及び遠心分離をさらに２回行った。
【0172】
次いで、１カラム容量の溶出緩衝液Ｄを５回ロードして、組換えタンパク質を溶出した。なお、溶出緩衝液Ｄの組成は、６Ｍの塩酸グアニジン、１５０ｍＭのイミダゾール、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び３００ｍＭのＮａＣｌである。また、溶出緩衝液Ｄをロードした後、その都度４℃、７００ｇで２分間遠心分離を行った。次いで、組換えタンパク質を含む溶出の一部を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより組換えタンパク質が含まれることを確認した。
【0173】
次いで、組換えタンパク質を含む溶出溶液を透析チューブ（ＭＷＣＯ＝１００００）に入れて、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して、４℃で一晩透析した。次いで、３回の外部緩衝液交換を行い、凍結乾燥して組換えタンパク質を粉末にした。
【0174】
次いで、凍結乾燥した組換えタンパク質を４８ｍＭのラウロイルサルコシン酸ナトリウムに可溶化した。次いで、可溶化した組換えタンパク質を相転移界面活性剤の取り扱い説明書に従い、リシルエンドペプチダーゼ及びトリプシンを用いて消化した。
【0175】
Ｎ末端及びＣ末端の標準ペプチドを用いて、組換えタンパク質に由来するペプチドの濃度を推定するために、トリプシン消化物を内部標準ペプチドとして標準ペプチドと混合し、ＳＤＢ－Ｔｉｐ及びＧＣ－Ｔｉｐ（ＧＬ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）で脱塩した。次いで、組換えタンパク質に由来するペプチドの濃度を、ＱＴＡＰ分析によるＮ末端及びＣ末端の標準ペプチドから得られた定量値の平均として計算した。
【0176】
（２）ＱＴＡＰ分析
膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿を（１）で作製した各安定同位体標識ペプチドの存在下で、並列反応モニタリング（ＰＡＲＡＬＬＥＬ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＰＲＭ）モードでｎａｎｏＬＣ－Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００によって分析した。これにより、血漿中の各候補タンパク質の絶対値を測定することができた。
膠芽腫患者由来の血漿及び健常者由来の血漿を（１）で作製した各安定同位体標識ペプチドの存在下で、並列反応モニタリング（ＰＡＲＡＬＬＥＬ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ；ＰＲＭ）モードでｎａｎｏＬＣ－Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ５６００によって分析した。これにより、血漿中の各候補タンパク質の絶対値を測定することができた。
【0177】
ナノＬＣを有するｃＨｉＰＬＣナノフレックスシステム（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して、注入したペプチド試料（注入量；５μＬ、試料中０．０２μＬの血漿又は０．２μｇタンパク質／μＬ含有）はトラップカラム（２００μｍ×６ｍｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ３μｍ、Ｃ１８ （Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））にロードされて、分析カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、ＲｅｐｒｏＳｉｌ－Ｐｕｒ３μｍ、Ｃ１８‐ＡＱ１２０Ａ°（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））で分離された。
【0178】
流速は、トラップカラムへのロードでは２μＬ／分（６分間の可動時間）であり、分析カラムでの分離では３００ｎＬ／分であった。
【0179】
また、注入されたペプチド試料の溶出条件は以下に示すとおりである。また、溶離液の組成は、Ａ液が０．１％のギ酸含有Ｍｉｌｌｉ－Ｑ、Ｂ液が０．１のギ酸含有１００％アセトニトリルである。
０～４０分：０→４０％のＢ液（上昇）
４０～４１分：４０％のＢ液→１００％のＢ液（上昇）
４１～５０分：１００％のＢ液（維持）
５０～５０．１分：１００％のＢ液→０％のＢ液（下降）
５０．１～８０分：０％のＢ液（維持）
０～４０分：０→４０％のＢ液（上昇）
４０～４１分：４０％のＢ液→１００％のＢ液（上昇）
４１～５０分：１００％のＢ液（維持）
５０～５０．１分：１００％のＢ液→０％のＢ液（下降）
５０．１～８０分：０％のＢ液（維持）
【0180】
クロマトグラム中のイオン数は、自動分析システムを用いて決定した。また、非標識ペプチドが対応する標識ペプチドと同一の保持時間を示し、ナノＬＣ分析を用いたＬＣ－ＭＳ／ＭＳのピーク面積数が１０００より大きいことに基づいて、ピークを同定した。
【0181】
膠芽腫患者由来の血漿中及び健常者患者由来の血漿中の膠芽腫バイオマーカー候補タンパク質の濃度の絶対値を比較したグラフを図２に示す。
【0182】
図２から、膠芽腫患者由来の血漿中のＬＲＧ１、Ｃ９、ＣＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＡＰＯＢのタンパク質濃度は、健常者由来の血漿中のそれらタンパク質濃度よりも有意に高かった。また、膠芽腫患者由来の血漿中のＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４のタンパク質濃度は健常者由来の血漿中のそれらタンパク質濃度のよりも有意に低かった。
【0183】
また、ＱＴＡＰ分析により得られた膠芽腫患者由来の血漿中及び健常者由来の血漿中の８種の膠芽腫バイオマーカー候補タンパク質の濃度の絶対値を用いて、ＲＯＣ分析を行った。その結果を以下の表１に示す。
【0184】
【表1】
【0185】
表１から、ＬＲＧ１、Ｃ９、ＣＲＰ、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４のＡＵＣ値は０．８０より大きかった。また、８種の候補タンパク質のオッズ比はそれぞれ５．０より大きかった。
【0186】
以上のことから、膠芽腫バイオマーカーの候補タンパク質のうち、発現量が増加するタンパク質として、ＬＲＧ１、Ｃ９、ＣＲＰ、ＳＥＲＰＩＮＡ３及びＡＰＯＢを選択し、発現量が減少するタンパク質として、ＧＳＮ、ＩＧＨＡ１及びＡＰＯＡ４を選択した（図１の「Ｓｔｅｐ ８」参照）。
【0187】
［実施例２］髄液中の膠芽腫バイオマーカーの探索
次いで、次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ法を用いて、髄液中の膠芽腫バイオマーカー探索を行った（図３参照）。
次いで、次世代プロテオミクスＳＷＡＴＨ法を用いて、髄液中の膠芽腫バイオマーカー探索を行った（図３参照）。
【0188】
１．ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析
実施例１の「３．」で構築されたスペクトルライブラリーを使用して、膠芽腫患者由来の手術前後の髄液並びに健常者由来の髄液について、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析を行った。なお、スペクトルアラインメント及び標的データ抽出は、ＰｅａｋｖｉｅｗのＳＷＡＴＨ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ Ａｐｐ（バージョン２．０、ＳＣＩＥＸ社製）で行った。
実施例１の「３．」で構築されたスペクトルライブラリーを使用して、膠芽腫患者由来の手術前後の髄液並びに健常者由来の髄液について、ＳＷＡＴＨ－ＭＳ分析を行った。なお、スペクトルアラインメント及び標的データ抽出は、ＰｅａｋｖｉｅｗのＳＷＡＴＨ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ Ａｐｐ（バージョン２．０、ＳＣＩＥＸ社製）で行った。
【0189】
その結果、５６６５個のペプチド（３３１個のタンパク質）を同定した（図３の「Ｓｔｅｐ １」参照）。
【0190】
２．Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準によるペプチドの選択
次いで、信頼性の低いペプチド候補を排除するために、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準を用いて、全てのペプチド候補の配列を検証した（図３の「Ｓｔｅｐ ２」参照）。これにより、４２６個のペプチドが選択された（図３の「Ｓｔｅｐ ２」参照）。
次いで、信頼性の低いペプチド候補を排除するために、Ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏ選択基準を用いて、全てのペプチド候補の配列を検証した（図３の「Ｓｔｅｐ ２」参照）。これにより、４２６個のペプチドが選択された（図３の「Ｓｔｅｐ ２」参照）。
【0191】
３．対応のあるｔ検定
次いで、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間において、対応のあるｔ検定を実施した。これにより、有意差（ｐ＜０．０５）があるタンパク質として、８２個のペプチドが選択された（図３の「Ｓｔｅｐ ３」参照）。
次いで、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間において、対応のあるｔ検定を実施した。これにより、有意差（ｐ＜０．０５）があるタンパク質として、８２個のペプチドが選択された（図３の「Ｓｔｅｐ ３」参照）。
【0192】
４．倍率変化による評価
次いで、上記８２個のペプチドについて、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間で、倍率変化が１．５以上又は０．６６以下のものを選択した。その結果、７個のペプチドが選択された。このうち、６個のペプチドは発現量が増加するタンパク質であり、１個のペプチドは（１個のタンパク質）は発現量が減少するタンパク質であった（図３の「Ｓｔｅｐ ４ａ」参照）。
次いで、上記８２個のペプチドについて、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間で、倍率変化が１．５以上又は０．６６以下のものを選択した。その結果、７個のペプチドが選択された。このうち、６個のペプチドは発現量が増加するタンパク質であり、１個のペプチドは（１個のタンパク質）は発現量が減少するタンパク質であった（図３の「Ｓｔｅｐ ４ａ」参照）。
【0193】
５．ＲＯＣ解析
次いで、上記８２個のペプチドについて、ＲＯＣ解析を行った。各候補タンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）の値を算出した結果、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間で、ＡＵＣが０．８以上であるタンパク質として、１７個のペプチドが選択された。そのうち、１６個のペプチドは、発現量が増加するタンパク質であり、１個のペプチドは（１個のタンパク質）は発現量が減少するタンパク質であった（図３の「Ｓｔｅｐ ４ｂ」参照）。
次いで、上記８２個のペプチドについて、ＲＯＣ解析を行った。各候補タンパク質の曲線下面積（ＡＵＣ）の値を算出した結果、手術前後の膠芽腫患者由来の髄液間で、ＡＵＣが０．８以上であるタンパク質として、１７個のペプチドが選択された。そのうち、１６個のペプチドは、発現量が増加するタンパク質であり、１個のペプチドは（１個のタンパク質）は発現量が減少するタンパク質であった（図３の「Ｓｔｅｐ ４ｂ」参照）。
【0194】
なお、「４．」の倍率変化による評価で選択された候補ペプチドと、「５．」のＲＯＣ解析で選択された候補ペプチドのうち、６個のペプチドが共通していた。
【0195】
次いで、ＭＲＭモードにて各候補ペプチドのピーク面積比を解析した。その結果、発現量が増加するタンパク質としてＩＧＨＡ１（断片ペプチドのアミノ酸配列：ＳＡＶＱＧＰＰＥＲ（配列番号１０））が同定され、発現量が減少するタンパク質としてＧＳＮ（断片ペプチドのアミノ酸配列：ＴＥＡＬＴＳＡＫ（配列番号９））が同定された（図３の「Ｓｔｅｐ ５」参照）。
【0196】
また、図４は、１４例の膠芽腫症例の手術前及び手術後の髄液中、並びに、５名の健常者の髄液中の上記２種の膠芽腫バイオマーカーを質量分析計のＭＲＭモードで解析した結果（ピーク面積比）を示すグラフである。
【0197】
図４から、膠芽腫患者由来の手術前の髄液中のＧＳＮのピーク面積比は、健常者由来の髄液及び膠芽腫患者由来の手術後の髄液中のＧＳＮのピーク面積比よりも有意に高かった。また、膠芽腫患者由来の手術前の髄液中のＩＧＨＡ１のピーク面積比は健常者由来の髄液及び膠芽腫患者由来の手術後の髄液中のＩＧＨＡ１のピーク面積比のよりも有意に低かった。
【0198】
［実施例３］膠芽腫患者の血漿中のＧＳＮの発現レベルの評価
実施例１と同様の手法で、ＧｒａｄｅＩ～ＩＩＩの膠芽腫患者由来の血漿中のＧＳＮの発現レベルを定量した。コントロールとして、健常者由来の血漿中のＧＳＮの発現レベルも定量した。結果を図５Ａに示す。
尚、膠芽腫患者の詳細な内訳を図５Ｂに示す。図５Ｂ中、ＭＧＭは、髄膜腫を示し、ＯＤは、乏突起膠細胞系腫瘍を示し、ＯＡは、乏突起星細胞を示し、ＤＡは、びまん性星細胞腫を示し、ＡＯＡは、退形成性乏突起星細胞腫を示し、ＡＡは、退形成性星細胞腫を示し、ＡＰＡは、退形成性毛様細胞性星細胞腫を示す。
図５Ａに示すように、健常者と比較して、膠芽腫患者において、Ｇｒａｄｅが初期の段階で、血漿中のＧＳＮの発現レベルが顕著に下がっていることが確認された。
これらの結果から、膠芽腫マーカーとして上記タンパク質が有用であることが明らかとなった。
実施例１と同様の手法で、ＧｒａｄｅＩ～ＩＩＩの膠芽腫患者由来の血漿中のＧＳＮの発現レベルを定量した。コントロールとして、健常者由来の血漿中のＧＳＮの発現レベルも定量した。結果を図５Ａに示す。
尚、膠芽腫患者の詳細な内訳を図５Ｂに示す。図５Ｂ中、ＭＧＭは、髄膜腫を示し、ＯＤは、乏突起膠細胞系腫瘍を示し、ＯＡは、乏突起星細胞を示し、ＤＡは、びまん性星細胞腫を示し、ＡＯＡは、退形成性乏突起星細胞腫を示し、ＡＡは、退形成性星細胞腫を示し、ＡＰＡは、退形成性毛様細胞性星細胞腫を示す。
図５Ａに示すように、健常者と比較して、膠芽腫患者において、Ｇｒａｄｅが初期の段階で、血漿中のＧＳＮの発現レベルが顕著に下がっていることが確認された。
これらの結果から、膠芽腫マーカーとして上記タンパク質が有用であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0199】
本実施形態の膠芽腫マーカーは、臨床診断に使用可能であり、膠芽腫の早期発見や病勢を反映することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【配列表】