特許 7030813 前立腺癌の処置のためのシロリムスの腫瘍内投与

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-25

(45)【発行日】2022-03-07

(54)【発明の名称】前立腺癌の処置のためのシロリムスの腫瘍内投与

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/436 20060101AFI20220228BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20220228BHJP

   A61K 47/10 20060101ALI20220228BHJP

   A61P 13/08 20060101ALI20220228BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220228BHJP

【ＦＩ】

A61K31/436

A61K9/08

A61K47/10

A61P13/08

A61P35/00

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2019534904

(86)(22)【出願日】2017-12-29

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-02-06

(86)【国際出願番号】 JP2017047408

(87)【国際公開番号】W WO2018128173

(87)【国際公開日】2018-07-12

【審査請求日】2020-11-09

(31)【優先権主張番号】62/443,599

(32)【優先日】2017-01-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】000177634

【氏名又は名称】参天製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】クンドゥ アイシュワリヤ

(72)【発明者】

【氏名】エスクデロ セシル

(72)【発明者】

【氏名】ムドゥンバ スリーニバス

【審査官】梅田 隆志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２００７／０９２６２０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】ARMSTRONG, A.J., et al.，Clinical Cancer Research，2010年，Vol.16, No.11，pp.3057-3066.

【文献】AMATAO, R.J., et al.，Clinical Genitourinary Cancer，2008年，Vol.6, No.2，pp.97-102.

【文献】MORIKAWA, Y. et al.，Biochemical and Biophysical Research Communications，2012年，Vol.419, No.3，pp.584-589.

【文献】IMRALI, A., et al.，American Journal of Cancer Research，2016年，Vol.6, No.8，pp.1772-1784.

【文献】FAGONE, P. et al.，Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology，2013年，Vol.112, No.1，pp.63-69.

【文献】GOLDBERG, E.P., et al.，Journal of Pharmacy and Pharmacology，2002年，Vol.54, No.2，pp.159-180.

【文献】SHIKANOV, S., et al.，Journal of Pharmaceutical Sciences，2009年，Vol.98, No.3，pp.1005-1014.

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／４３６

Ａ６１Ｋ ９／０８

Ａ６１Ｋ ４７／１０

Ａ６１Ｐ １３／０８

Ａ６１Ｐ ３５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

５ｍｇ／ｍｌ～５００ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む、哺乳動物の対象における前立腺癌を処置するための液体製剤であって、前記対象の前立腺に局所的に投与され、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびエタノールを含むことを特徴とする液体製剤。

【請求項2】

シロリムスの投与が、処置前の前立腺癌の体積と比較して、前立腺癌の体積の減少をもたらす、請求項１に記載の液体製剤。

【請求項3】

腫瘍内注射されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の液体製剤。

【請求項4】

前記対象の血液中の前立腺血清抗原（ＰＳＡ）レベルが、シロリムスの投与の前において４ｎｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌである、請求項１～３のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項5】

シロリムスの投与の前に前立腺癌の生検が行われることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項6】

前記前立腺癌の細胞がｍＴＯＲを発現する及び／又は前記前立腺癌がホルモン不応性前立腺癌である、請求項１～５のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項7】

前記前立腺癌が５～１０のグリーソンスコアを有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項8】

前記前立腺癌が、限局期の癌、局所期の癌又は遠隔転移期の癌である、請求項１～７のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項9】

シロリムスの投与が、前立腺癌に対する放射線療法、アンドロゲン除去療法、及び／又は化学療法に加えて行われる、請求項１～８のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項10】

シロリムスの投与が、（ｉ）放射線療法若しくはアンドロゲン除去療法後、又は（ｉｉ）ドセタキセルを含む化学療法レジメンの後に前立腺癌が再発した後に開始される、請求項１～９のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項11】

週１回または週２回の頻度で繰り返し投与されることを特徴とする、請求項１～１０のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項12】

１年あたり２～５２週間繰り返し投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の液体製剤。

【請求項13】

１０ｍｇ／ｍｌ～２５ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項14】

０．５重量％～３５重量％のシロリムスを含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項15】

２．０％（ｗ／ｗ）のシロリムス、９４％（ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４００、４％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の液体製剤。

【請求項16】

前記哺乳動物の対象がヒトである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の液体製剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，５９９号の利益を主張し、参照によりその全文が本明細書に援用される。

【0002】

〔技術分野〕
本開示は、効果的な量のシロリムスを、それを必要とする対象の前立腺に局所的に投与することによって、前立腺癌を処置する方法に関する。特に、本開示はシロリムスを含む液体製剤の腫瘍内注射によって前立腺癌を処置する方法を提供し、ここで、投与されるシロリムスの量は、移植拒絶反応を防ぐために使用される投薬量を十分に超える。

【背景技術】

【0003】

前立腺癌の大部分は、前立腺の腺癌である。National Cancer Instituteによると、前立腺癌診断時の年齢中央値は６６歳であり、２０１６年には１８万人を超える男性が診断されると予測されている。限局性または局所性の疾患の男性では５年生存率は非常に高いが、転移性前立腺癌の男性では生存率は３０％未満に低下する。現在、前立腺癌は、米国人男性における癌による死亡の第２の主要な原因である。

【0004】

多くの前立腺癌は、日常的な検査の間に見出される。処置の選択肢は、診断時の癌の病期、患者の年齢、併存疾患の有無によって異なる。前立腺の外科的除去（前立腺切除術）は、癌が転移していない場合に前立腺癌を治癒するために一般に行われる。しかし、不完全な腫瘍除去および結果として生じる再発など、大手術に関連する重大なリスクが存在する。さらに、尿失禁のような前立腺手術の副作用は、衰弱させることがある。他の処置の選択肢には、放射線、凍結療法、ホルモン療法および化学療法が挙げられる。いずれも理想的ではなく、長期にわたると、患者の癌はホルモン療法に対して不応性になり、標準的な化学療法剤に対して抵抗性になることがある。

【0005】

したがって、単独または標準治療の補助として、追加の局所処置の選択肢が必要である。

【発明の概要】

【0006】

本開示は、哺乳動物の対象（例えば、ヒト男性）における前立腺癌を処置する方法であって、前立腺癌を処置するために効果的な量のシロリムスを含む液体製剤を前記対象の前立腺に局所的に投与する工程を含み、前記液体製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記液体製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、処置前の前立腺癌の体積と比較して、前立腺癌の体積の減少をもたらす。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、処置を行わない場合に予想される前立腺癌の成長と比較して、前立腺癌の成長を阻害する。いくつかの実施形態において、局所的に投与する工程は、液体製剤の腫瘍内注射を含む。いくつかの実施形態において、前記対象の血液中の前立腺血清抗原（ＰＳＡ）レベルは、シロリムスの投与の前において４ｎｇ／ｍｌ未満である。他の実施形態において、前記対象の血液中の前立腺血清抗原（ＰＳＡ）レベルは、シロリムスの投与の前において４ｎｇ／ｍｌ以上である。これらの実施形態のサブセットにおいて、前記対象の血液中のＰＳＡレベルは、４ｎｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌである。あるいは、前記対象の血液中のＰＳＡレベルは、１０ｍｇ／ｍｌを超える。いくつかの好ましい実施形態において、シロリムスの投与は、シロリムスの投与の前のＰＳＡレベルと比較して、被験体の血液中のＰＳＡレベルの減少をもたらす。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌は、シロリムスの投与の前に前記対象の直腸指診によって検出可能である。いくつかの実施形態において、前記対象は前立腺全摘出術の候補ではないが、他の実施形態において、前記対象は前立腺全摘出術の候補である。本開示は、シロリムスの投与の前に前立腺癌の生検を行う工程をさらに含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌の細胞はｍＴＯＲを発現する。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌の細胞はアンドロゲン受容体を発現する。別の実施形態において、前記前立腺癌の細胞はアンドロゲン受容体を発現しない。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌は５～７のグリーソンスコアを有する。他の実施形態において、前記前立腺癌は８～１０のグリーソンスコアを有する。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌は限局期または局所期の癌である。他の実施形態において、前記前立腺癌は遠隔転移期の癌である。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、前立腺癌に対する放射線療法に加えて行われる。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、放射線療法後に前立腺癌が再発した後に開始される。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、前立腺癌に対するアンドロゲン除去療法に加えて行われる。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、アンドロゲン除去療法後に前立腺癌が再発した後に開始される。いくつかの実施形態において、前記前立腺癌は、ホルモン不応性前立腺癌である。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、前立腺癌に対する化学療法に加えて行われる。これらの実施形態のサブセットにおいて、化学療法薬は、ドセタキセル、カバジタキセル、ミトキサントロン、エストラムスチン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、シロリムスの投与は、ドセタキセルを含む化学療法レジメンの後に前立腺癌が戻った後に開始される。いくつかの実施形態において、液体製剤は、週１回または週２回の頻度で繰り返し投与される。特に、液体製剤は、１年あたり２～５２週間繰り返し投与され得る。

【0007】

哺乳動物の対象（例えば、ヒト男性）における前立腺癌を、当該対象の前立腺への局所投与によって処置するための液体製剤は、約５ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌのシロリムス、または約５ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌのシロリムス、または約１０ｍｇ／ｍｌ～約２５ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む。この段落の液体製剤は、前段落の方法に関連して使用するのに適している。いくつかの実施形態において、液体製剤は、約１重量％～約３５重量％のシロリムスを含む。いくつかの実施形態において、液体製剤は、０．５重量％～８．０重量％のシロリムスを含む。いくつかの好ましい実施形態において、液体製剤は、１．０重量％～４．０重量％のシロリムスを含む。いくつかの好ましい実施形態において、シロリムスの投与は、全身免疫抑制をもたらさない。いくつかの実施形態において、液体製剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ３００またはＰＥＧ４００である。いくつかの実施形態において、液体製剤は、エタノールをさらに含む。いくつかの好ましい実施形態において、液体製剤は、約２．０％（ｗ／ｗ）のシロリムス、約９４％（ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール４００、約４％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む。他の実施形態において、液体製剤は、表２－１に記載の製剤である。いくつかの実施形態において、液体製剤はＰＬＡを含む。いくつかの実施形態において、液体製剤はＤＭＳＯまたはＤＭＡを含む。いくつかの実施形態において、液体製剤はＰＬＡを含む。いくつかの好ましい実施において、哺乳動物の対象はヒトである。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１は、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける皮下ヒト前立腺癌異種移植片の処置における被験物質の効力を比較するために実施された、実施例１に記載の研究デザインを示す。

【図2】図２は、実施例１に記載の研究における投薬およびデータ収集のスケジュールを示す。

【図3】図３Ａは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ－３腫瘍異種移植片のサイズに対する被験物質の効果を示す。図３Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける２２Ｒｖ１腫瘍異種移植片のサイズに対する被験物質の効果を示す。

【図4】図４Ａは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ－３腫瘍異種移植片の成長に対する被験物質の効果を示す。図４Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける２２Ｒｖ１腫瘍異種移植片の成長に対する被験物質の効果を示す。

【図5】図５は、腫瘍内送達によって週２回投与された２％シロリムス製剤で処置されたＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおけるＰＣ－３腫瘍異種移植片の退縮を示す。

【図6】図６は、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植片を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける血漿前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）レベルを示す。

【図7】図７Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞のｍＴＯＲレベルに対する被験物質の効果を示す。図７Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞のｍＴＯＲレベルに対する被験物質の効果を示す。

【図8】図８Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞のリン酸化４Ｅ－Ｐ１レベルに対する被験物質の効果を示す。図８Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞のリン酸化４Ｅ－ＢＰ１レベルに対する被験物質の効果を示す。

【図9】図９Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞のリン酸化Ｓ６Ｋ１レベルに対する被験物質の効果を示す。図９Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞のリン酸化Ｓ６Ｋ１レベルに対する被験物質の効果を示す。

【図10】図１０Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞におけるＫｉ６７発現に対する被験物質の効果を示す。図１０Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞におけるＫｉ６７発現に対する被験物質の効果を示す。

【図11】図１１Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞の切断されたカスパーゼ－３のレベルに対する被験物質の効果を示す。図１１Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞の切断されたカスパーゼ－３のレベルに対する被験物質の効果を示す。

【図12】図１２Ａは、ＰＣ－３腫瘍異種移植細胞におけるＥ－カドヘリン発現に対する被験物質の効果を示す。図１２Ｂは、２２Ｒｖ１腫瘍異種移植細胞におけるＥ－カドヘリン発現に対する被験物質の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0009】

ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバーである。ｍＴＯＲは、細胞の成長、増殖および生存に関与するシグナル伝達経路において重要な役割を果たす、２つの異なるタンパク質複合体の構成要素である。ラパマイシン（シロリムスとしても知られる）は、免疫抑制剤として開発される前に抗真菌剤として最初に同定された。ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）（Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PAにより市販されている経口投与用シロリムス）は腎移植レシピエントにおける器官拒絶反応を防ぐために、１９９９年に米国食品医薬品局により承認された。

【0010】

ラパマイシンはまた、ヒト癌細胞株に対して抗癌活性を有することが見出された（Douros and Suffnes, Cancer Treat Rev, 8:63-87, 1981）。続いて、ラパマイシンおよびそのアナログ（ラパログ）は種々の臨床試験において抗癌剤として評価されている（Yuan et al., J Hematol Oncol, 2:45, 2009;およびDufour et al., Cancers, 3:2478-2500, 2011）。経口ラパマイシン製剤の薬物動態プロファイルは、化学療法剤に対して望ましくないと決定された。したがって、いくつかのラパログは、化学療法レジメンにおいてより広範に評価されている。ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）（Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PAにより市販されている注射用テムシロリムスキット）は、進行腎細胞癌（ＲＣＣ）を処置するために承認されている。ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）（Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJにより市販されている経口投与用エベロリムス）も、スニチニブまたはソラフェニブによる処置の失敗後に進行ＲＣＣを処置するために承認されており、いくつかの他の癌に対して単独で、または異なるクラスの化学療法剤と組み合わせて承認されている。

【0011】

抗ｍＴＯＲ抗体を用いた免疫組織化学法により測定したところ、前立腺癌の８０％までが中程度から高レベルのｍＴＯＲ発現を有することが報告された。対照的に、通常の前立腺癌組織は、低レベルのｍＴＯＲ発現しか有さなかった。この表現型は、ｍＴＯＲが前立腺癌の良好な薬物標的であることを示唆する。ホルモン不応性前立腺癌の男性に経口投与されたラパマイシンの小規模なパイロット研究において、１２人の男性のうちの１人のみが放射線学的応答を示した（Amato et al, Clin Genitourin Cancer, 6:97-102, 2008）。今日まで、ラパマイシン、テムシロリムスおよびエベロリムスは、前立腺癌を処置するために承認されていない。

【0012】

本開示の開発の間、シロリムスは経口送達とは対照的に、腫瘍内注射によって投与される場合、はるかに強力な抗癌剤であることが見出された。ヒト前立腺癌の２つの異なるマウスモデルにおける２つの研究の詳細を実施例１に提供する。

【0013】

理論に束縛されるものではないが、全身投与時のシロリムスの組織利用能が低いため、シロリムスの局所投与は有利であると考えられる。実際、シロリムスの経口での生物学的利用能は、Ｍｅｄｓｃａｐｅによればわずか１４％である。従って、シロリムスの局所投与はより高い組織利用能のために、シロリムスの全身投与よりも有効であると考えられる。さらに、シロリムスの局所投与は有害な全身作用（例えば、免疫抑制、肝毒性、腎毒性など）を最小限にすると予想される。具体的には、シロリムスの腫瘍内注射が感染に対する感受性の増加をもたらすとは予想されないが、一方、所望の前立腺組織の利用能を達成するためのシロリムスの経口投与の増加は免疫抑制を引き起こす可能性が高い。８～１０ｎｇ／ｍＬの、血液中のシロリムスのレベルは、腎移植拒絶反応を防ぐための免疫抑制を達成するのに有効である。従って、好ましい実施形態において、前立腺へのシロリムスの局所投与は、８～１０ｎｇ／ｍＬを下回る血液中のシロリムスのレベルをもたらす。

【0014】

具体的には、本開示は、哺乳動物の対象（例えば、ヒト男性）における前立腺癌を処置する方法であって、前立腺癌を処置するために効果的な量のシロリムスを含む液体製剤を前記対象の前立腺に局所投与する工程を含み、液体製剤は約５ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌのシロリムス、または約５ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌのシロリムスを含む方法を提供する。本明細書で「ＳＲＬ」と呼ばれる例示的な液体製剤は、約２．０％（ｗ／ｗ）のシロリムス、約９４％（ｗ／ｗ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００および約４％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む溶液である。しかし、本開示は、例示的な液体製剤に限定されない。

【0015】

シロリムスは、本開示の液体製剤中に約５ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌ、または約５ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌの量で存在する。いくつかの実施形態において、シロリムスは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ｍｇ／ｍｌを超える量（下限）で存在する。いくつかの実施形態において、シロリムスは、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０ｍｇ／ｍｌ未満の量（上限）で存在する。すなわち、シロリムスは、独立して選択される上限と下限との間の範囲の量で存在する。

【0016】

重量パーセントとして表される場合、シロリムスは、本開示の液体製剤中に１％～３５％（ｗ／ｗ）または０．５％～８．０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。いくつかの実施形態において、シロリムスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％（ｗ／ｗ）を超える濃度（下限）で存在する。他の実施形態において、シロリムスは、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９または２．０％（ｗ／ｗ）を超える濃度（下限）で存在する。いくつかの実施形態において、シロリムスは、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％または１０％（ｗ／ｗ）未満の濃度（上限）で存在する。他の実施形態において、シロリムスは、８．０、７．５、７．０、６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５、３．０または２．５％（ｗ／ｗ）未満の濃度（上限）で存在する。すなわち、シロリムスは、独立して選択される上限と下限との間の範囲の濃度で存在する。

【0017】

約５ｍｇ／ｍｌ～約５００ｍｇ／ｍｌのシロリムスまたは約５ｍｇ／ｍｌ～約５０ｍｇ／ｍｌのシロリムスの範囲の濃度のシロリムスを含む種々の製剤もまた、本明細書に記載の方法における使用に適している。ＰＥＧ４００およびエタノールの一方または両方に加えて、またはその代わりに、溶媒が、代替の製剤において使用され得る。さらに、液体製剤は、安定性を増大させるために酸化防止剤などの賦形剤を含み得る。さらに、本開示の液体製剤は、溶液に限定されない。いくつかの実施形態において、液体製剤は、懸濁液またはｉｎ ｓｉｔｕゲル形成系である。

【0018】

シロリムスのための適切な溶媒としてはＰＥＧ４００、プロピレングリコール、グリセリン、トリアセチン、ジアセチン、クエン酸アセチルトリエチル、乳酸エチル、ポリグリコール化カプリルグリセリド、エタノール、Ｎ－メチル－２－ピロリドン、ガンマ－ブチロラクトン、ジメチルイソソルビド、トリエチレングリコールジメチルエーテル、エトキシジグリコール、グリセロール、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ベンジルアルコール、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない（例えばSimamora et al., Int J Pharmaceutics, 213:25-29, 2001等参照）。水、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水も存在し得る。さらなる態様において、液体製剤はポリメタクリレートベースのコポリマー（例えばThakral et al., Expert Opin Drug Deliv, 10:131-149, 2013等参照）およびポリビニルピロリドンの一方または両方を含み得る。生分解性ポリマーも、シロリムスの局所投与のためのビヒクルに含まれ得る。いくつかの態様では、生分解性ポリマーはポリエステル化合物である。適切な生分解性ポリマーとしてはポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）共重合体、ポリカプロラクトン、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、液体製剤がＤＭＳＯ、ＤＭＡ、ＤＯＰＣ、ＰＬＡ、トレハロース、ゲランガム、および水からなる群より選択される１つ以上の成分を含む。

【0019】

〔定義〕
本明細書中で使用される場合、用語「アンドロゲン受容体」は、テストステロンまたはジヒドロテストステロン（アンドロゲンホルモン）を結合することによって活性化される受容体を指す。アンドロゲン受容体は、「核受容体サブファミリー３、グループＣ、メンバー４」および「ＮＲ３Ｃ４」としても知られている。ヒトアンドロゲン受容体のアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００００３５（アイソフォーム１）として示され、ヒトアンドロゲン受容体の核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００００４４（変異体１）として示される。

【0020】

本明細書中で使用される場合、用語「ラパマイシンの機構的標的」および「ｍＴＯＲ」は、種々の細胞プロセスに関与するｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２の触媒サブユニットであるタンパク質キナーゼを指す。ｍＴＯＲはまた、「ラパマイシンの哺乳動物標的」、「ＦＫ５０６結合タンパク質１２－ラパマイシン関連タンパク質１」および「ＦＲＡＰ１」としても知られている。ヒトｍＴＯＲのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４９４９として示され、ヒトｍＴＯＲ ｍＲＮＡの核酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４９５８として示される。

【0021】

１つ以上のさらなる治療剤と「組み合わせて」または「加えて」の投与は、任意の順序での同時（並行）および連続の投与を含む。

【0022】

本明細書中で使用される場合、用語「処置する」および「処置」は、臨床結果を含む、有益な、または所望の結果を得るためのアプローチを指す。有益な、または所望の臨床結果には、検出可能であろうと検出不可能であろうと、１つ以上の症状の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の安定化された（すなわち、悪化していない）状態、疾患の拡大の防止、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的であろうと完全であろうと）が含まれるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される寿命よりも寿命を延長することを意味し得る。したがって、本明細書で使用される用語「処置する」および「処置」は、徴候または症状の完全な軽減を必要とせず、治癒を必要とせず、特に個々に対して適度な効果を有するプロトコルを含む。

【0023】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は文脈が他に示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「賦形剤(an excipient)」は、１つ以上の賦形剤を含む。

【0024】

本明細書で「含む」として説明される態様および実施形態は、「からなる」および／または「実質的に～からなる」態様および実施形態を含むことが理解される。

【0025】

本明細書において値に関して使用される用語「約」は、その値の９０％～１１０％を表す。例えば、約２％（ｗ／ｗ）のシロリムスは１．８％～２．２％（ｗ／ｗ）のシロリムスを記載し、２．０％（ｗ／ｗ）のシロリムスを含む。

【実施例】

【0026】

略語：ＢＩＷ（週２回）；ＨＲＰＣ（ホルモン不応性前立腺癌）；ＩＴまたはｉ．ｔ．（腫瘍内）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＰＯまたはｐ．ｏ．（経口）；ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）；ＱＤ（１日１回）；ＱＷ（週１回）；ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）（Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PAにより市販されている経口シロリムス溶液）；およびＳＲＬ（Santen Inc., Emeryville, CAにより市販されている注射用シロリムス溶液）。

【0027】

＜実施例１：皮下ヒト前立腺癌異種移植片の処置＞
本実施例では、全身（経口）および局所（腫瘍内注射）に投与されたシロリムスの効果を試験するためにＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおいて実施された２つの研究を記載する。マウスは６～８週齢の雄であり、研究開始時の体重は１８～２２グラムの範囲であった。異種移植片形成のために、２つの表現型的に異なるヒト前立腺癌細胞株を選択した。ＰＣ－３および２２Ｒｖ１は、ＡＴＣＣ（登録商標）（American Type Culture Collection, Manassas, VA）から入手可能である。研究デザインを図１に示す。

【0028】

【表1】

ＰＣ－３および２２Ｒｖ１腫瘍細胞を、標準的な細胞培養条件下で、単層培養にて維持した。指数期で増殖する細胞を、腫瘍接種のために回収した。それぞれのマウスに対して、腫瘍発達のためにマトリゲルと混合した０．１ｍＬのＰＢＳ（１：１）中の腫瘍細胞（１×１０^７）を左右両方の側腹部領域に接種した。左側腹部または右側腹部の平均腫瘍サイズが約１００～１５０ｍｍ^３に達したときに処置を開始した。

【0029】

群分けおよび処置の前に、全ての動物の体重を測定し、そして、カリパスを用いて１日おきに腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、任意の所定の処置の有効性に影響を及ぼし得るので、腫瘍体積を数値パラメータとして使用して、選択された動物を特定の群に無作為化した。群分けは、ＳｔｕｄｙＤｉｒｅｃｔｏｒ^ＴＭソフトウェア（Studylog Systems, Inc. CA, USA）を用いて行った。

【0030】

乱塊法を用いて４つの試験群のうちの１つに実験動物を割り当てた。第１に、最初の範囲内の左右の腫瘍を有するマウスを選択し、それらの右側の腫瘍体積に応じて均質なブロックに配置した。第２に、各ブロック内で、無作為化様式でマウスを試験群に配置した。乱塊法を用いてマウスを試験群に割り当てることにより、系統誤差が最小限に抑えられた。０日目に群分けした後、即座に処置を開始した。

【0031】

試験される製剤（被験物質）には、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）（Wyeth Pharmaceuticals Inc., Philadelphia, PAにより市販されている経口投与用シロリムス溶液）、ＳＲＬ（注射用シロリムス溶液）、およびビヒクル（活性成分なし）が挙げられる。ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）は、１ｍｇ／ｍｌのシロリムスと、不活性成分であるホスファチジルコリン、プロピレングリコール、モノグリセリドおよびジグリセリド、エタノール、大豆脂肪酸、アスコルビルパルミテート、ポリソルベート９０およびエタノールを含む。ＳＲＬは、２２ｍｇ／ｍｌのシロリムス、ポリエチレングリコールおよびエタノール（２％シロリムス、４％エタノールおよび９４％ＰＥＧ４００）を含む。ビヒクルは、ＳＲＬの溶媒（シロリムスを含まないエタノールおよびＰＥＧ４００）を含む。

【0032】

ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）は、使用前に４℃に維持した。負荷用量を調製するために、１８０μｌのＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）を２．８２ｍｌの滅菌水の添加により希釈し、１日用量を調製するために、６０μｌのＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）を２．９４ｍｌの滅菌水の添加により希釈した。ＳＲＬおよびビヒクルは、使用前に－２０^ｏＣで凍結保存した。解凍後、ＳＲＬおよびビヒクルをそのまま（希釈せずに）使用した。

【0033】

図２に示すように、４つの試験群があった。各試験群は、以下の５匹のマウスを含んでいた：１）ビヒクル － ０日目に腫瘍内注射により５μｌ／腫瘍を投与され、その後５μｌ／腫瘍ＱＷ；２）ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標） － ０日目に３０μｌ／マウス（負荷用量）を経口投与され、その後１０μｌ／マウスＱＤ（１日用量または試験用量）；３）ＳＲＬ週１回 － ０日目に腫瘍内注射により５μｌ／腫瘍を投与され、その後５μｌ／腫瘍ＱＷ；および４）ＳＲＬ週２回 － ０日目に腫瘍内注射により５μｌ／腫瘍を投与され、その後５μｌ／腫瘍ＢＩＷ。ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）の投与レジメンにより、ラパマイシン１．８μｇを負荷用量として経口投与し、その後、ラパマイシン０．２μｇを１日用量として各マウスに経口投与した。ＳＲＬ投与レジメンでは、各マウスへの負荷用量と週１回または週２回のいずれかの用量との両方として、右側および左側の腫瘍へ腫瘍あたりラパマイシン１１０μｇの用量を投与した。

【0034】

腫瘍細胞を接種した後、マウスの罹病率および死亡率を毎日チェックした。体重および腫瘍体積を週２回測定した。血中ＰＳＡレベルを０、１２および２２日目に測定した。

【0035】

腫瘍体積を、カリパスを用いて二次元で測定し、体積を、式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ^２を用いて立方ミリメートル（ｍｍ^３）で表した。ここで、ａおよびｂは、それぞれ、腫瘍の長径および短径であった。腫瘍重量を研究終了時に測定した。研究は、各群の平均腫瘍量（左＋右）が２０００ｍｍ^３に達した時点で、または最終投与から１週間後（２７日目）に終了した。図３Ａ～Ｂに示すように、週１回または週２回の頻度でのＳＲＬの腫瘍内投与は、毎日のＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）の経口投与で観察されたよりもはるかにＰＣ－３および２２Ｒｖ１異種移植片の成長を遅延させた。重要なことに、週２回の頻度でのＳＲＬの腫瘍内投与は、ＰＣ－３異種移植片の体積の減少さえももたらした（図５）。

【0036】

処置レジメンの有効性の指標である腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を、以下の式を用いて決定した：
ＴＧＩ（％）＝１００×（１－Ｔ_ＲＴＶ／Ｃ_ＲＴＶ）
ここで、Ｔ_ＲＴＶおよびＣ_ＲＴＶは、それぞれ、所定の日における処置群およびコントロール群の平均相対腫瘍体積である。

【0037】

ＲＴＶ（相対腫瘍体積）を、以下の式を用いて計算した：
ＲＴＶ＝Ｖ_ｔ／Ｖ_０
ここで、Ｖ_ｔ＝研究の所定の日における薬物処置群の腫瘍体積、およびＶ_０＝投薬の最初の日（０日）における薬物処置群の腫瘍体積である。図４Ａ～Ｂに示されるように、週１回または週２回の頻度でのＳＲＬの腫瘍内投与は、毎日ベースでのＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）の経口投与で観察されたよりも、ＰＣ－３および２２Ｒｖ１異種移植片の成長において、より大きな阻害をもたらした。

【0038】

２２Ｒｖ１異種移植片を有するマウスへのシロリムスの投与は、ＰＳＡレベルの減少をもたらした。ＰＳＡレベルの減少は、毎日ベースでＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）を受けたマウスと比較して、腫瘍内投与により週１回または週２回の頻度でＳＲＬを受けたマウスでより迅速に起こった（図６）。

【0039】

結論として、局所投与されたＳＲＬは、ヌードマウスにおけるＰＣ３および２２ＲＶ１異種移植ヒト前立腺癌において腫瘍体積を減少させた。腫瘍体積の減少は、同じモデルにおいて経口投与されたＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）で達成されたものより有意に大きかった。さらに、局所投与されたＳＲＬは、２２ＲＶ１異種移植マウスにおける血中ＰＳＡレベルを有意に低下させ、ＰＣ３腫瘍の退縮を引き起こした。

【0040】

その後、残存腫瘍の表現型を免疫組織化学法によって評価した。具体的には、３群のマウス（ビヒクル送達ＱＷ ＩＴ、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）送達ＱＤ ＰＯ、および２％ＳＲＬ送達ＢＩＷ ＩＴ）からの腫瘍を、研究の終わりに屠殺した際に回収し、液体窒素中で凍結した。凍結した腫瘍を切片化し、発色団または酵素に結合した抗体で染色して、標準的な染色プロトコルによる抗体結合の可視化を可能にした。染色（褐色）は非特異的バックグラウンドノイズを除外するために、核（青色）を含む細胞において評価した。種々の群間の差異の統計分析を、対応のないｔ検定を用いて行った。すべての群のＰ値をビヒクル群に対して計算し、ｐ値＜０．０５の差を統計学的に有意とみなした：＊ ｐ＜０．０５、＊＊ ｐ＜０．０１、＊＊＊ ｐ＜０．００１。

【0041】

予想されるように、ラパマイシンはｍＴＯＲのキナーゼ活性を阻害するが、その分解を引き起こさないので、腫瘍細胞内のｍＴＯＲタンパク質のレベルはＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）および２％ＳＲＬでの処置によって変化しないままであった（図７Ａ～Ｂ）。対照的に、ｍＴＯＲのリン酸化された下流の標的のレベルは、ラパマイシン処置群の腫瘍において減少した。特に、リン酸化真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（ｐ－４Ｅ－ＢＰ１）のレベルは、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）処置マウスおよびビヒクル処置マウス由来の腫瘍よりも、２％ＳＲＬ処置マウス由来の腫瘍においてかなり低かった（図８Ａ～Ｂ）。リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼβ－１（ｐ－Ｓ６Ｋ１）のレベルもまた、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）処置マウスおよびビヒクル処置マウス由来の腫瘍よりも、２％ＳＲＬ処置マウス由来の腫瘍において低かった（図９Ａ～Ｂ）。興味深いことに、２％ＳＲＬ処置の効果は、アンドロゲン受容体陽性腫瘍（２２ＲＶ１）を有するマウスよりも、アンドロゲン受容体陰性腫瘍（ＰＣ－３）を有するマウスにおいてより顕著であった。

【0042】

さらに、腫瘍細胞機能の分子マーカーに対するラパマイシンの影響を評価した。腫瘍細胞の増殖を評価するために、Ｋｉ－６７のレベルを測定した。Ｋｉ－６７は増殖細胞（Ｇ_１、Ｓ、Ｇ_２、および有糸分裂）の間で普遍的に発現されるが、静止細胞（Ｇ_０）には存在しない核タンパク質である。Ｋｉ－６７のレベルは、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）処置マウスおよびビヒクル処置マウス由来の腫瘍よりも、２％ＳＲＬ処置マウス由来の腫瘍において低かった（図１０Ａ～Ｂ）。Ｋｉ－６７発現に対する２％ＳＲＬ処置の効果は、アンドロゲン受容体陽性腫瘍（２２ＲＶ１）よりもアンドロゲン受容体陰性腫瘍（ＰＣ－３）においてより顕著であったことに注目することは興味深い。

【0043】

腫瘍細胞のアポトーシスを評価するために、切断されたカスパーゼ－３（ＣＡＳＰ３）のレベルを測定した。ＣＡＳＰ３は、システイン－アスパラギン酸プロテアーゼファミリーのメンバーである。ＣＡＳＰ３は、イニシエーターカスパーゼによる切断の際にアポトーシス細胞において活性化されるチモーゲンである。切断されたＣＡＳＰ３のレベルは、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）処置マウスおよびビヒクル処置マウス由来の腫瘍よりも、２％ＳＲＬ処置マウス由来の腫瘍において高かった（図１１Ａ～Ｂ）。

【0044】

腫瘍細胞の転移を評価するために、上皮カドヘリン（Ｅ－カドヘリン）のレベルを測定した。Ｅ－カドヘリンは、カルシウム依存性の細胞－細胞接着糖タンパク質である。Ｅ－カドヘリンの下方制御は、細胞運動性および転移の増加に関連する、組織における細胞接着を減少させる。Ｅ－カドヘリンのレベルは、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）処置マウスおよびビヒクル処置マウス由来の腫瘍よりも、２％ＳＲＬ処置マウス由来の腫瘍において高かった（図１２Ａ～Ｂ）。Ｅ－カドヘリン発現に対する２％ＳＲＬ処置の効果は、高い転移能を有するグレードＩＶ後期ホルモン不応性細胞株であるＰＣ－３において顕著であった。これは、２％ＳＲＬでの処置がＥ－カドヘリン発現を増加させることによって、損傷した細胞構造を再確立できたことを示す。はるかに低い転移能を有し、それゆえにより無傷の細胞構造を有する２２Ｒｖ１細胞株では、このような効果は観察されなかった。

【0045】

結論としては、ＳＲＬの局所投与の結果として、腫瘍の細胞において下流のｍＴＯＲシグナル伝達のレベルの減少が観察された。下流のｍＴＯＲシグナル伝達の減少は、細胞増殖の減少、アポトーシスの増加、および転移の減少を示す分子マーカーのレベルと関連していた。下流のｍＴＯＲシグナル伝達および腫瘍細胞機能の有益な減少は、同じモデルにおいて経口投与されたＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）で達成されたものより有意に大きかった。

【0046】

＜実施例２：シロリムス製剤＞
本実施例では、固形腫瘍への局所投与（腫瘍内注射）のための追加のシロリムス製剤を記載する。表２－１の製剤中のポリ乳酸（ＰＬＡ）は、Evonik Industries AG (Darmstadt, Germany)によってＲＥＳＯＭＥＲ（登録商標）Ｒ２０２Ｈとして市販されているポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）である。

【表2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】