特許 7031814 アフィニティークロマトグラフィー工程を含む、百日咳菌由来タンパク質を取得する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-02-28

(45)【発行日】2022-03-08

(54)【発明の名称】アフィニティークロマトグラフィー工程を含む、百日咳菌由来タンパク質を取得する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/22 20060101AFI20220301BHJP

   C07K 14/235 20060101ALI20220301BHJP

   C07K 1/20 20060101ALI20220301BHJP

【ＦＩ】

C07K1/22

C07K14/235

C07K1/20

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2020549752

(86)(22)【出願日】2019-03-15

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2021-07-15

(86)【国際出願番号】 KR2019003051

(87)【国際公開番号】W WO2019190092

(87)【国際公開日】2019-10-03

【審査請求日】2020-11-10

(31)【優先権主張番号】10-2018-0035046

(32)【優先日】2018-03-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】506379781

【氏名又は名称】グリーン・クロス・コーポレイション

【氏名又は名称原語表記】ＧＲＥＥＮ ＣＲＯＳＳ ＣＯＲＰ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】パク， ジョン クワン

(72)【発明者】

【氏名】ムン， ジェ フン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ジ ソブ

(72)【発明者】

【氏名】アン， ドン ホ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン， ヒョン ジン

(72)【発明者】

【氏名】キム， ヘ リョン

(72)【発明者】

【氏名】チョイ， ボ ミ

【審査官】西垣 歩美

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第１９９６／０３１５３５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１３－５３５２０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０５１７５５１７（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１５－５３３１４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許第０４７０５６８６（ＵＳ，Ａ）

【文献】特開平０３－１６９８９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５２５２６０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡＰＬＵＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＲＥＳＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、百日咳菌培養物を含む試料からＰＴ（百日咳毒素）タンパク質及びＦＨＡ（繊維状赤血球凝集素）タンパク質を単離するステップを含む、ＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質を取得する方法であって、
前記アフィニティークロマトグラフィー工程のための溶出バッファーが、リン酸ナトリウム溶液を含み、
前記溶出バッファーが、ＮａＣｌ溶液をさらに含み、
前記ＮａＣｌ溶液の濃度が、０Ｍ～３Ｍに徐々に増加し、
前記アフィニティークロマトグラフィー工程が、式１

【化1】

の構造を有する化合物が結合している樹脂を使用することを含む、方法。

【請求項2】

前記リン酸ナトリウム溶液が、６．５～８．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記リン酸ナトリウム溶液が、５０ｍＭ～２００ｍＭの濃度を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記溶出バッファーが、１５ＣＶ～３５ＣＶの量である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記アフィニティークロマトグラフィー工程の前に、以下のステップ：
１）百日咳菌培養物を遠心分離するステップと、
２）ステップ１）で得られた上清をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーによって精製するステップと、
３）ステップ２）で精製された上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製するステップ
がさらに含まれる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

メンブレンクロマトグラフィー（ＭＣ）工程によって、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法により得られたＰＴタンパク質からエンドトキシンを除去するステップを含む、ＰＴタンパク質を精製する方法。

【請求項7】

前記メンブレンクロマトグラフィー工程において、０．６μｍ～１．０μｍの孔径が使用される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

メンブレンクロマトグラフィー（ＭＣ）工程によって、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法により得られたＦＨＡタンパク質からエンドトキシンを除去するステップを含む、ＦＨＡタンパク質を精製する方法。

【請求項9】

前記メンブレンクロマトグラフィー工程において、０．６μｍ～１．０μｍの孔径が使用される、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アフィニティークロマトグラフィー工程を含む、百日咳菌（BordetellaPertussis）由来タンパク質を取得する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

百日咳は、主に乳幼児に起こる急性呼吸器疾患であり、２週間以上にわたる咳を特徴とする。グラム陰性で好気性の短球桿菌である百日咳菌は、百日咳を引き起こすことが報告されている。百日咳菌はその唯一の宿主としてヒトを使い、主に気道を介してヒトに感染する。さらに、百日咳菌は気道粘膜に生息し、人体に疾患を引き起こす。１９３０年代に、細胞性百日咳ワクチンが開発され、百日咳に対して予防効果を有することが証明された。さらに、百日咳ワクチンは１９４０年代に破傷風及びジフテリアの不活化死菌ワクチンと組み合わせて使用されたが、全細胞性百日咳ワクチンの副作用（発作、浮腫、発熱等）が報告されている。したがって、安全性を有する百日咳ワクチンを開発することが求められていた。

【0003】

１９５０年代には、百日咳菌の病因についての研究が行われ、百日咳毒素（ＰＴ）、線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、パータクチン（ＰＲＮ）及び線毛（ＦＩＭ）等の成分が抗原として報告された。その後、これらのタンパク質の単離及び精製を含む無細胞性百日咳ワクチンの開発が進められてきた。１９８０年代以降、精製百日咳ワクチンが日本で初めて開発され、予防接種された。

【0004】

百日咳ワクチンの精製の目的は、ＰＴ、ＦＨＡ及びＰＲＮ等の特定のタンパク質が豊富で、エンドトキシンを含まない製品を生産することである。従来、硫酸アンモニウム沈殿と密度勾配遠心分離を繰り返すことにより、同時に抗原が精製されていた。しかしながら、このような方法は、不純物が多く発生し、精製工程の制御が難しいという欠点を有する。別の方法は、物理的方法と化学的方法の組み合わせを使用して、各抗原を個別に精製することである。韓国特許出願公開第２０１５－０１２４９７３号は、ＰＴ、ＦＨＡ並びにＦＩＭ２型及び３型を含む無細胞性百日咳ワクチン組成物を開示している。

【0005】

百日咳菌の主要タンパク質であるＰＴ及びＦＨＡを精製する既存の方法は、一般的なワクチンの調製に使用される方法であるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、培養上清に存在するＰＴ及びＦＨＡを単離することである。しかしながら、この方法は規模拡大が難しく、プロセス収率が低い。さらに、３種又は４種の成分を混合することを含む百日咳ワクチンの製造方法では、１種の成分の生産性の低下でさえも、全体の製造期間を長くするという問題だけでなく、生産バッチ数の増加により引き起こされる経済的な問題が生じる場合がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

これに関して、本発明者らは、ＳＥＣ工程にまつわる問題を解決し、百日咳菌由来タンパク質であるＰＴ及びＦＨＡの効率的な生産を可能にする方法を見出す研究の間に、特定の化合物が結合している樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィーによってＰＴ及びＦＨＡタンパク質を単離する場合に、方法に必要とされる時間及び費用が大幅に削減されるだけでなく、標的タンパク質の生産が増加することを見出した。この知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成させた。

【0007】

したがって、本発明の目的は、百日咳菌由来タンパク質であるＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質を、アフィニティーカラムを使用して単離する方法を提供することである。

【0008】

本発明の別の目的は、百日咳菌由来タンパク質であるＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質を精製する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記目的を実現するために、本発明は、前処理された百日咳菌培養物中のＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー工程によって単離する方法を提供する。

【0010】

上記目的を実現するために、本発明は、メンブレンクロマトグラフィー（ＭＣ）工程によって、アフィニティークロマトグラフィー工程で単離されたＰＴタンパク質からエンドトキシンを除去するステップを含む、ＰＴタンパク質を精製する方法を提供する。

【0011】

さらに、本発明は、メンブレンクロマトグラフィー工程によって、アフィニティークロマトグラフィー工程で単離されたＦＨＡタンパク質からエンドトキシンを除去するステップを含む、ＦＨＡタンパク質を精製する方法を提供する。

【発明の効果】

【0012】

本発明では、百日咳菌のＰＴ及びＦＨＡタンパク質は、特定の化合物が結合している樹脂で充填されたアフィニティーカラムを使用する精製工程によって単離されるため、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質の生産効率が増加する。ＰＴ及びＦＨＡタンパク質が精製工程によって単離される場合に、ＳＥＣ工程を用いた単離方法と比較して、ＰＴタンパク質の生産が著しく増加した。アフィニティーカラムを使用するＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質の単離方法は、樹脂費用、プロセス時間、バッファー使用量及び生産費用を削減するため、ＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質の大量生産に効率的に利用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＰＴ及びＦＨＡタンパク質についての方法全体のフローチャートを示す。

【図2a】ブルーアフィニティーカラム工程における勾配溶出を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離工程のクロマトグラムを示す。

【図2b】ＳＤＳ－ＰＡＧＥで示された、勾配溶出を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離の可能性を示す。

【図3a】ブルーアフィニティーカラム工程における段階溶出（３００ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌ）を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離工程のクロマトグラムを示す。

【図3b】ＳＤＳ－ＰＡＧＥで示された、段階溶出（３００ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌ）を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離の可能性を示す。

【図4a】ブルーアフィニティーカラム工程における段階溶出（３００ｍＭ、４００ｍＭ、８５０ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌ）を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離工程のクロマトグラムを示す。

【図4b】ＳＤＳ－ＰＡＧＥで示された、段階溶出（３００ｍＭ、４００ｍＭ、８５０ｍＭ及び１ＭのＮａＣｌ）を使用するＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離の可能性を示す。

【図5a】ブルーアフィニティーカラム工程を表１の実験計画（ＤＯＥ）で実施することによって確立された、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離に最適な条件を使用する単離工程のクロマトグラムを示す。

【図5b】ＳＤＳ－ＰＡＧＥで示された、表１のＤＯＥで確立されたＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離に最適な条件下で方法を実施することにより得られる結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明の一態様では、アフィニティークロマトグラフィー工程を使用して、前処理された百日咳菌培養物中のＰＴ及びＦＨＡタンパク質を単離するステップを含む、ＰＴタンパク質又はＦＨＡタンパク質を精製する方法が提供される。
本明細書では、クロマトグラフィー工程は、式１

【0015】

【化1】

の構造を有する化合物が結合している樹脂を使用することを含み得る。

【0016】

上記化合物は、Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ－Ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）でもよい。本発明では、該化合物が結合している樹脂でカラムが充填されるアフィニティーカラム工程を、「ブルーアフィニティーカラム工程」又は「ブルーアフィニティークロマトグラフィー工程」とも称する。

【0017】

本発明の一実施形態では、ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質の単離に従来から使用されている方法であるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の代わりに、固定相として化合物Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ－Ａを使用するアフィニティークロマトグラフィー工程を実施して、培養上清に存在するＰＴ及びＦＨＡタンパク質を単離した。

【0018】

さらに、アフィニティークロマトグラフィー工程は、段階溶出又は勾配溶出により行うことができる。特に、勾配溶出を使用することができる。本発明の一実施形態では、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質の単離工程を、段階溶出及び勾配溶出のそれぞれによって実施することで、ブルーアフィニティークロマトグラフィー工程においてＰＴ及びＦＨＡタンパク質を単離する効率的な処理方法が確立された。結果として、勾配溶出により処理が行われる場合に、ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質がＳＤＳ－ＰＡＧＥで申し分なく単離されることが確認された。

【0019】

本明細書では、「勾配溶出」は、移動相の組成を連続的に変化させながら溶出を行う方法を指す。さらに、本明細書で使用される場合に、「段階溶出」という用語は、クロマトグラフィーにおいてカラム中を流れる溶媒の濃度又は組成を変化させることにより溶出能を高めた後に行われる断続的な切り換えによって溶出を行う方法である。

【0020】

勾配溶出方法で使用される溶出バッファーは、リン酸ナトリウム溶液でもよい。さらに、溶出バッファーは、ＮａＣｌ溶液をさらに含んでもよく、ブルーアフィニティークロマトグラフィー工程は、ＮａＣｌ溶液の濃度を変化させることによって実施してもよい。

【0021】

リン酸ナトリウム溶液は、１０ｍＭ～５００ｍＭ、２０ｍＭ～３５０ｍＭ、５０ｍＭ～２００ｍＭ、又は１００ｍＭ～１５０ｍＭの濃度を有してもよく、特に１００ｍＭの濃度を有してもよい。さらに、ＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液は、６．５～８．５、６．８～８．２、７．２～７．８又は７．４～７．７のｐＨを有してもよく、特に７．６のｐＨを有してもよい。さらに、溶出バッファーは、１５ＣＶ～３５ＣＶ、２０ＣＶ～３３ＣＶ又は２３ＣＶ～３０ＣＶの量でもよく、特に２５ＣＶの量でもよい。さらに、クロマトグラフィー工程では、ＮａＣｌ溶液の濃度を０Ｍ～３Ｍに、０Ｍ～２Ｍに、又は０Ｍ～１Ｍに徐々に増加させることによって、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を個別に溶出させ得る。

【0022】

本発明の一実施形態では、２５ＣＶで１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．６）を、ＮａＣｌの濃度を１Ｍまで徐々に高めつつ流すことによって、標的タンパク質ＰＴ及びＦＨＡが個別に溶出され、この場合に、ＰＴが最初に溶出されて、その後にＦＨＡが溶出された。

【0023】

アフィニティークロマトグラフィーを使用する精製工程は、勾配溶出を使用する溶出ステップの前に前処理工程に供し得る。前処理工程は、ｉ）洗浄するステップと、ｉｉ）平衡化バッファーを使用してカラムを平衡化するステップと、ｉｉｉ）標的タンパク質を含む溶液をカラムに吸着させるステップと、ｉｖ）再平衡化バッファーを使用してカラムを再平衡化させるステップと、ｖ）洗浄バッファーを使用してカラムを洗浄するステップとによって行い得る。

【0024】

樹脂で充填されたカラムは、ＮａＣｌ溶液で洗浄し得る。さらに、平衡化バッファー、再平衡化バッファー、又は洗浄バッファーは、リン酸ナトリウム溶液でもよい。本発明の一実施形態では、カラムを３ＭのＮａＣｌ溶液で洗浄し、そのカラムを、平衡化バッファー及び再平衡化バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用して平衡化及び再平衡化した。さらに、そのカラムを、洗浄バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用して洗浄した。

【0025】

さらに、本発明では、「前処理された百日咳培養物」は、１）百日咳菌培養物を遠心分離するステップと、２）得られた上清をヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーによって精製するステップと、３）精製された上清を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって精製するステップによって得ることができる。

【0026】

１番目に、百日咳菌培養物を遠心分離するステップを行うことができる。

【0027】

本発明では、「百日咳菌」は、パラ百日咳菌とも呼ばれ、約０．３μｍ～１μｍほどの大きさのグラム陰性球桿菌である。百日咳菌の主要なタンパク質の中で、ＰＴは百日咳毒素の略称である。ＰＴタンパク質は、百日咳菌によって産生され、生体内又は細胞内で機能障害を引き起こすか、又は致死作用を示す毒性物質である。さらに、ＦＨＡは、繊維状赤血球凝集素アドヘシンの略称であり、百日咳を引き起こす百日咳菌の病原性因子である。ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質は、気管上皮細胞に付着する外膜タンパク質であり、百日咳菌から取得され、百日咳ワクチンの重要な成分である。

【0028】

本発明の一実施形態では、百日咳菌株を、改変Ｓｔａｉｎｅｒ ｓｃｈｏｌｔｅ（ＭＳＳ）培地において３５℃の温度で培養し、得られた細胞培養物を、室温で２時間遠心分離にかけた。次いで、細胞が除去された培養上清をそこから分離及び取得した。

【0029】

２番目に、得られた上清をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって精製するステップを行うことができる。

【0030】

細胞溶解液又は細胞培養物の遠心分離後に、様々なカラムクロマトグラフィー等を使用して不要な細胞破片等を除去し得る。カラムクロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー（ブルーアフィニティークロマトグラフィー）等でもよい。本発明の一実施形態では、百日咳菌培養物の前処理のための第１の精製工程として、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを実施した。

【0031】

本明細書で使用される場合に、「ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー」という用語は、分離用の担体としてリン酸カルシウムの結晶性粒子を使用するカラムクロマトグラフィーである。負に荷電したリン酸イオン及び正に荷電したカルシウム原子が結晶表面に規則的に配置されている。これらの原子とのイオン性相互作用を適切に有することができる分子表面を有するタンパク質は、カラム内の樹脂に吸着され得る。さらに、吸着されたタンパク質は、リン酸バッファー等で溶出させ得る。

【0032】

本発明の一実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいて、平衡化バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用し、洗浄バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用し、かつ溶出バッファーとしてＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液を使用して、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を溶出させた。

【0033】

３番目に、精製された上清を疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製するステップを行うことができる。

【0034】

本発明の一実施形態では、百日咳菌培養物の前処理のための第２の精製工程として、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。

【0035】

本明細書で使用される場合に、「疎水性相互作用クロマトグラフィー」という用語は、疎水性官能基を有するマトリックスと分子との間の疎水性相互作用を使用する分離方法を指す。該マトリックスは、親水性で不活性なアガロースの変性によって疎水性機能を有することが可能となる。アルキルアミンとＣＮＢｒ活性化アガロースとの反応によって得られる変性アガロースを使用してもよい。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーはタンパク質単離のために広く使用されている。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、タンパク質溶出のために、イオン強度を低下させてもよく、又はｐＨを高めてもよい。

【0036】

本発明の一実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーにおいて、平衡化バッファーとしてＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液を使用し、洗浄バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用し、かつ溶出バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用して、ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質を含む溶液を溶出させた。

【0037】

本発明の別の態様では、メンブレンクロマトグラフィー（ＭＣ）工程によって、アフィニティークロマトグラフィー工程で単離されたＰＴタンパク質からエンドトキシンを除去するステップを含む、ＰＴタンパク質を精製する方法が提供される。

【0038】

百日咳菌由来タンパク質であるＰＴ及びＦＨＡは、細菌内に存在する毒素であるエンドトキシンを含む。したがって、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を精製して、これらのタンパク質をワクチンとして利用するためには、エンドトキシン除去工程を実施せねばならない。

【0039】

エンドトキシン除去は、アフィニティークロマトグラフィー工程又はメンブレンクロマトグラフィー工程によって実施してもよく、特にメンブレンクロマトグラフィー工程によって行うことができる。

【0040】

本明細書で使用される場合に、「メンブレンクロマトグラフィー」という用語は、対流が拡散よりも割合的に多くなり、溶液の分離効率が比較的高いようにマクロ多孔質平膜が使用されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）及び他の生体分子を精製するために使用される工程を指す。したがって、メンブレンクロマトグラフィーにより、ウイルス、プラスミド、巨大タンパク質複合体等が膜に容易に到達し、容易に単離されることが可能となる。商業的に利用可能なメンブレンクロマトグラフィーは、限定されるものではないが、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）、Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ Ｑ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ社）等を含み得る。

【0041】

本発明の一実施形態では、ＰＴタンパク質からエンドトキシンを除去するためのメンブレンクロマトグラフィー工程として、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ工程を実施した。Ｍｕｓｔａｎｇ－Ｑは、架橋された第四級アミン基に基づく高分子コーティングを介したイオン交換によって、負に荷電したエンドトキシンを除去する疎水性ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜ベースのカプセルである。Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑメンブレンクロマトグラフィーでは、０．６μｍ～１．０μｍ、特に０．７μｍ～０．９μｍ、さらに特に０．８μｍの孔径を使用することができる。

【0042】

本発明のさらに別の態様では、メンブレンクロマトグラフィー工程によって、ブルーアフィニティークロマトグラフィー工程で単離されたＦＨＡタンパク質からエンドトキシンを除去する工程を含む、ＦＨＡタンパク質を精製する方法が提供される。

【0043】

本発明の一実施形態では、ＦＨＡタンパク質からエンドトキシンを除去するためのメンブレンクロマトグラフィー工程として、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ工程を実施した。

【0044】

Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑメンブレンクロマトグラフィーでは、０．６μｍ～１．０μｍ、特に０．７μｍ～０．９μｍ、さらに特に０．８μｍの孔径を使用してもよい。

【0045】

ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を単離及び精製する工程を図１に示す。

【実施例】

【0046】

以下で、本発明を実施例によってより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明を例示するのみであって、本発明の範囲を実施例に限定するものではない。

【0047】

実施例１．百日咳菌の培養物
百日咳菌（国立衛生研究所）を、ＭＳＳ培地で３５℃の温度で４日間培養した。培養期間について、詳細には、種培養のために１日かかり、一次濃縮培養のために１日かかり、二次濃縮培養のために１日かかり、本培養のために１日かかった。

【0048】

実施例２．遠心分離工程
９５００ｒｐｍの条件下で１００ｌ／ｈの流入速度により室温で２時間連続的に遠心分離することによって、細胞培養物を培養上清とスラリーとに分離した。

【0049】

実施例３．ＨＡ精製
蒸留水を使用して、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）樹脂のための保存液を除去した後に、１ＭのＮａＯＨ溶液との反応によって、洗浄を１時間行った。平衡化バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用して、平衡化を行った。次に、遠心分離工程により得られた培養上清をＨＡ樹脂に吸着させ、平衡化バッファーを使用して、残りの培養上清を除去した。その後に、洗浄バッファーとしてリン酸ナトリウム溶液を使用して洗浄を完了させ、次いで、溶出バッファーとして、ＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液を使用して、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を溶出させた。

【0050】

実施例４．ＨＩＣカラムでの精製
ＨＩＣ樹脂で充填されたカラムに、蒸留水を３ＣＶで１２０ｃｍ／時間で流して、保存液を除去した。次に、１ＭのＮａＯＨ溶液を４ＣＶで４０ｃｍ／時間でカラムに流して、洗浄を行った。平衡化バッファーとしてＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶでカラムに流して、平衡化を行った。平衡化の完了後に、ＨＡ精製工程により得られた溶出液をＨＩＣカラムに流して吸着させた。平衡化バッファーを５ＣＶでカラムに流して、カラム内に残留している溶液を除去した。その後に、洗浄バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶでカラムに流して、洗浄を行った。洗浄が完了した後に、リン酸ナトリウム溶液を１０ＣＶでカラムに流して、ＰＴ及びＦＨＡタンパク質を溶出させた。

【0051】

実施例５．ブルーアフィニティーカラムでの精製
実施例５．１．勾配溶出による精製
Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ－Ａ樹脂で充填されたカラムに、蒸留水を３ＣＶで６０ｃｍ／時間で流して、保存液を除去した。次に、３ＭのＮａＣｌ溶液を３ＣＶで６０ｃｍ／時間でカラムに流して、使用前に洗浄を行った。平衡化バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶで流して、平衡化を行った。平衡化の完了後に、実施例１．４のＨＩＣ溶出液と蒸留水とを１：１で混合することによって得られた溶液をカラムに流して吸着させた。平衡化バッファーを５ＣＶでカラムに流して、カラム内に残留している溶液を除去した。その後に、洗浄バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶでカラムに流して、洗浄を行った。

【0052】

洗浄の完了後に、ＮａＣｌ溶液を含むリン酸ナトリウム溶液を溶出バッファーとして使用する勾配溶出を実施した。ここで、ＮａＣｌ溶液を１０ＣＶで、１００ｍＭ～５００ｍＭへと濃度を高めつつ流して、ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質を単離した。ここで、樹脂との結合能の違いにより、ＰＴタンパク質が最初に溶出されて、その後にＦＨＡタンパク質が溶出された。結果は図２ａ及び図２ｂに示されている。

【0053】

実施例５．２．段階溶出による精製
Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ－Ａ樹脂で充填されたカラムに、蒸留水を３ＣＶで６０ｃｍ／時間で流して、保存液を除去した。次に、３ＭのＮａＣｌ溶液を３ＣＶで６０ｃｍ／時間でカラムに流して、使用前に洗浄を行った。平衡化バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶで流して、平衡化を行った。平衡化の完了後に、実施例１．４のＨＩＣ溶出液と蒸留水とを１：１で混合することによって得られた溶液をカラムに流して吸着させた。平衡化バッファーを５ＣＶでカラムに流して、カラム内に残留している溶液を除去した。その後に、洗浄バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶでカラムに流して、洗浄を行った。

【0054】

洗浄の完了後に、５段階を含む段階溶出を行った。各段階の溶出バッファーとして、ＮａＣｌ溶液を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．６）を使用した。この場合に、それぞれの段階で３００ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ及び１Ｍの濃度でＮａＣｌ溶液を使用し、この溶液を１０ＣＶで流して、ＰＴタンパク質及びＦＨＡタンパク質を単離した。結果は図３ａ及び図３ｂに示されている。図３ａ及び図３ｂに示されるように、結合能の違いにより、ＰＴタンパク質は、３００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出され、ＦＨＡタンパク質は、４００ｍＭから開始して溶出されることが確認された。

【0055】

ＦＨＡタンパク質が溶出される正確な時点を特定するために、ＮａＣｌ溶液の濃度を変動させることによって、４段階を含む段階溶出を行った。それぞれの段階で３００ｍＭ、４００ｍＭ、８５０ｍＭ及び１Ｍの濃度でＮａＣｌ溶液を使用し、後続の手順は上記と同じであった。結果は図４ａ及び図４ｂに示されている。図４ａ及び図４ｂに示されるように、ＰＴタンパク質は、依然として３００ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出され、ＦＨＡタンパク質は、８５０ｍＭのＮａＣｌ濃度で溶出された。
実施例６．ＰＴ及びＦＨＡの単離に最適な条件の確立
勾配溶出を使用するＰＴ及びＦＨＡの単離に最適な条件を確立するために、表１の実験計画（ＤＯＥ）を定めることによって、精製工程を小規模で行った。

【0056】

【表1】

【0057】

Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３Ｇ－Ａ樹脂で充填されたカラムに、蒸留水を３ＣＶで６０ｃｍ／時間で流して、保存液を除去した。次に、３ＭのＮａＣｌ溶液を３ＣＶで６０ｃｍ／時間でカラムに流して、使用前に洗浄を行った。平衡化バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶで流して、平衡化を行った。平衡化の完了後に、実施例１．４のＨＩＣ溶出液と蒸留水とを１：１で混合することによって得られた溶液をカラムに流して吸着させた。平衡化バッファーを５ＣＶでカラムに流して、カラム内に残留している溶液を除去した。その後に、洗浄バッファーとしてのリン酸ナトリウム溶液を５ＣＶでカラムに流して、洗浄を行った。

【0058】

洗浄の完了後に、溶出バッファーとして１ＭのＮａＣｌ溶液を含む１００ｍＭのリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．６）を２５ＣＶで使用する勾配溶出を実施することによって、ＰＴ及びＦＨＡを単離した。この場合に、樹脂との結合能の違いにより、ＰＴが最初に溶出されて、その後にＦＨＡが溶出された。結果は図５ａ及び図５ｂに示されている。

【0059】

単離工程を、それぞれの条件に従って実施した。結果として、ＰＴ及びＦＨＡは、９、１０及び１１の条件下で最も効率的に単離された。このことから、条件９、１０及び１１は、勾配溶出を使用するＰＴ及びＦＨＡの単離に最適な条件であることが確認された。

【0060】

実験例１．確立された単離条件の規模拡大の可能性の確認
実施例６で小規模で確立されたＰＴ及びＦＨＡの単離に最適な条件が規模拡大した場合でも適用されるかどうかを確認するために、これらの条件を大規模で適用することによって、単離工程を実施した。結果を表２及び表３に示す。

【0061】

【表2】

【0062】

【表3】

【0063】

表２及び表３に示されるように、小規模で確立されたＰＴ及びＦＨＡの単離のための条件を大規模で適用した場合に、ＰＴ生産は、ＰＴ及びＦＨＡがＳＥＣ工程によって単離された場合と比較して約８０％だけ増加した。これは、小規模で確立されたＰＴ及びＦＨＡの単離のための条件が大規模にも適用可能であることを示し、本発明によるブルーアフィニティーカラム工程が、従来から使用されていたＰＴ及びＦＨＡの単離方法であるＳＥＣ工程よりも、規模拡大及びプロセス収率の点でより効果的であることを意味する。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】