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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-28
(45)【発行日】2022-03-08
(54)【発明の名称】嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20220301BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20220301BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20220301BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20220301BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20220301BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20220301BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20220301BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20220301BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220301BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20220301BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220301BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/713
A61K31/7105
A61K31/7115
A61K31/712
A61K31/7125
A61K35/761
A61K48/00
A61P11/00
A61P43/00 105
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2017567701
(86)(22)【出願日】2016-07-01
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-07-26
(86)【国際出願番号】 EP2016065565
(87)【国際公開番号】W WO2017005646
(87)【国際公開日】2017-01-12
【審査請求日】2019-05-27
(31)【優先権主張番号】PCT/IB2015/001253
(32)【優先日】2015-07-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IB
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(73)【特許権者】
【識別番号】518059934
【氏名又は名称】ソルボンヌ・ユニヴェルシテ
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＲＢＯＮＮＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】特許業務法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】タバリー，オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】ソンヌヴィル，フロランス
【審査官】長谷川 茜
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０３９４８９２６（ＣＮ，Ａ）
【文献】Biochimica et Biophysica Acta，2013年，Vol.1832，pp.2340-2351
【文献】Journal of Cystic Fibrosis，2015年06月，Vol.14, Suppl.1，p.S11, WS06.4
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号３の核酸配列を含む核酸ｍｉＲ－９インヒビターであって、前記核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ｍｉＲ－９に直接結合しないが、代わりにＡＮＯ１核酸配列のｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に結合する、嚢胞性線維症を処置するための核酸ｍｉＲ－９インヒビター。
【請求項2】
配列番号３の核酸配列を含む核酸ｍｉＲ－９インヒビターをコードする嚢胞性線維症を処置するためのウイルスベクターであって、前記核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ｍｉＲ－９に直接結合しないが、代わりにＡＮＯ１核酸配列のｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に結合する、ウイルスベクター。
【請求項3】
配列番号３の核酸配列を含む核酸ｍｉＲ－９インヒビターを含む嚢胞性線維症を処置するための医薬組成物であって、前記核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ｍｉＲ－９に直接結合しないが、代わりにＡＮＯ１核酸配列のｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に結合する、医薬組成物。
【請求項4】
ｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位が、ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲに局在する、請求項１記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター、請求項２記載のウイルスベクター、又は請求項３記載の医薬組成物。
【請求項5】
核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ターゲット部位ブロッカー（ＴＳＢ）である、請求項１記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター、請求項２記載のウイルスベクター、又は請求項３記載の医薬組成物。
【請求項6】
核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ＬＮＡヌクレオチド、又はモルホリノヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチルで修飾されたヌクレオチド、又は２’－０－メトキシエチルで修飾されたヌクレオチド、又は２’－フルオロで修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター、請求項２記載のウイルスベクター、又は請求項３記載の医薬組成物。
【請求項7】
核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ウイルスベクターを用いて送達される、請求項１記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター。
【請求項8】
ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項７記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター。
【請求項9】
核酸ｍｉＲ－９インヒビターを、被検者に、核酸ｍｉＲ－９インヒビターが肺に到達することを可能とする任意の好適な方法を用いて投与するための、請求項１記載の核酸ｍｉＲ－９インヒビター、請求項２記載のウイルスベクター、又は請求項３記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、ＣＦＴＲ Ｃｌ－チャネルをコードする遺伝子における変異によって引き起こされる遺伝性疾患である（Riordan, 1989）。ＣＦは、いくつかの器官に影響を及ぼすが、最も重篤な被害は肺で観察される。ＣＦにおける肺疾患の病変形成は未だ完全には理解されていない。ＣＦにおけるＣＦＴＲチャネル機能の喪失は、病原性の高い細菌による気道表面のコロニー形成に有利に働く。しかしながら、これが起こる機構については今なお議論の余地がある。ＣＦＴＲチャネル活性は確実に、粘液線毛クリアランスへの重要な寄与要因である。ＥＮａＣチャネルによる、ＣＦＴＲ依存的なＣｌ－分泌とＮａ＋吸収との微妙なバランスは、線毛周囲液（periciliary fluid、ＰＣＦ）の濃さを制御する。機能性ＣＦＴＲの非存在下では、液体吸収は分泌を凌ぐ。このアンバランスは気道表面を脱水させ、これにより線毛運動が損なわれる。不動化された粘液は次いで、細菌の生存及び増殖のためのニッチになる。代替的な塩素イオンチャネル（クロライドチャネル）の活性化は、嚢胞性線維症における興味深い治療的手法であり得る。この手法は、あらゆる患者にその遺伝子型に関わらず適用されることもあり得よう。その代わりに、ＣＦＴＲを対象とする治療は突然変異特有であることが必要であり、変異のあらゆるクラスに適用可能でないかもしれない手法でなければならない。ＣＦ気道における代替的な塩素イオンチャネルの活性化は、粘液線毛クリアランスを改善して且つ抗微生物活性を回復させるのに必要なクロライド及びビカーボナート（重炭酸イオン）分泌のための経路を提供することにより有益となり得よう。２０年よりさらに前に、気道上皮細胞は第二のタイプのＣｌ－分泌経路を持つということが見出された。ＣＦＴＲはｃＡＭＰによってレギュレーションされるが、前記第二の経路はサイトゾルのＣａ２＋濃度の増加によって活性化される。ＡＴＰ又はＵＴＰなどのプリン作動性アゴニストで気道上皮を刺激することは、強いが一過性の、経上皮Ｃｌ－輸送の破壊を引き起こす。この効果は、細胞内備蓄からのＣａ２＋の遊離と、細胞膜を通るＣａ２＋の流入との両者に依存する。ＣＦ患者でＣＦＴＲに欠陥がないので、Ｃａ２＋で活性化されるＣｌ－分泌はＣＦＴＲに非依存的である。興味深いことに、Ｃａ２＋依存性Ｃｌ－分泌の刺激は、ＰＣＦの濃さに対して陽性の効果を有する。この効果は、Ｃａ２＋依存性経路の刺激が、ＣＦＴＲ欠陥を補い得ることを示唆する。オーファンタンパク質ＴＭＥＭ１６Ａは、Ｃａ２＋で活性化される塩素イオンチャネル（ＣａＣＣ）の成分として同定された。ＴＭＥＭ１６Ａは、アノクタミン－１（ＡＮＯ１）としても公知であるが、それらの一次配列及び予測構造（８つの膜貫通型ドメイン）が他のアニオンチャネルのものと類似性のない１０のメンバーからなるタンパク質ファミリーに属する。しかしながら、ＴＭＥＭ１６Ａ活性及び発現は、未知の機構によってＣＦコンテクストで低減されたことが以前の研究により示されている。
【発明の概要】
【0003】
［課題を解決するための手段］
本発明は、嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。詳細には、本発明は請求項によって定義される。
本発明は、嚢胞性線維症の処置のための方法及び医薬組成物に関する。詳細には、本発明は請求項によって定義される。
【0004】
［発明を実施するための形態］
本発明者らの目的は、遺伝子発現を負にレギュレーションするｍｉＲＮＡの役割を研究することによって、ＣＦにおけるＡＮＯ１の発現の低下の原因を理解することであった。したがって、本発明者らは、生物情報学的研究方法を実施し、ＡＮＯ１をターゲッティングし得るｍｉＲＮＡを調べて、気管支上皮細胞株におけるＲＴ－ｑＰＣＲによりｍｉＲＮＡ候補の発現レベルを評定した。本発明者らは、相関性実験を実施し、ＡＮＯ１を過剰発現しているｍｉＲＮＡの３’ＵＴＲに結合しているｍｉＲＮＡ候補を調べて、これらの条件でのＡＮＯ１の発現を定量化した。本発明者らはまた、細胞遊走率（cell migration rate）、及びＡＮＯ１をレギュレーションするｍｉＲＮＡをモデュレーションしているＡＮＯ１クロライド活性も評定した。本発明者らは、ＡＮＯ１の潜在的レギュレーターとして、ｍｉＲ－９を含む異なるｍｉＲＮＡを同定している。本発明者らは、ｍｉＲ－９がＣＦ細胞において過剰発現されていること、並びにＣＦ及び非ＣＦ細胞においてｍｉＲ－９が過剰発現されるとＡＮＯ１発現及びルシフェラーゼ活性が低減することを観察した。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ－９が過剰発現されると、細胞遊走率及びＡＮＯ１クロライド活性が低減することを観察した。結論として、これらの結果はｍｉＲ－９がその３’ＵＴＲに対合することによってＡＮＯ１を直接レギュレーションすること、並びにｍｉＲ－９のモデュレーションが、細胞遊走率及びＡＮＯ１クロライド活性を変化させることを示した。
本発明者らの目的は、遺伝子発現を負にレギュレーションするｍｉＲＮＡの役割を研究することによって、ＣＦにおけるＡＮＯ１の発現の低下の原因を理解することであった。したがって、本発明者らは、生物情報学的研究方法を実施し、ＡＮＯ１をターゲッティングし得るｍｉＲＮＡを調べて、気管支上皮細胞株におけるＲＴ－ｑＰＣＲによりｍｉＲＮＡ候補の発現レベルを評定した。本発明者らは、相関性実験を実施し、ＡＮＯ１を過剰発現しているｍｉＲＮＡの３’ＵＴＲに結合しているｍｉＲＮＡ候補を調べて、これらの条件でのＡＮＯ１の発現を定量化した。本発明者らはまた、細胞遊走率（cell migration rate）、及びＡＮＯ１をレギュレーションするｍｉＲＮＡをモデュレーションしているＡＮＯ１クロライド活性も評定した。本発明者らは、ＡＮＯ１の潜在的レギュレーターとして、ｍｉＲ－９を含む異なるｍｉＲＮＡを同定している。本発明者らは、ｍｉＲ－９がＣＦ細胞において過剰発現されていること、並びにＣＦ及び非ＣＦ細胞においてｍｉＲ－９が過剰発現されるとＡＮＯ１発現及びルシフェラーゼ活性が低減することを観察した。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ－９が過剰発現されると、細胞遊走率及びＡＮＯ１クロライド活性が低減することを観察した。結論として、これらの結果はｍｉＲ－９がその３’ＵＴＲに対合することによってＡＮＯ１を直接レギュレーションすること、並びにｍｉＲ－９のモデュレーションが、細胞遊走率及びＡＮＯ１クロライド活性を変化させることを示した。
【0005】
したがって本発明の第一の目的は、それを必要とする被検者において嚢胞性線維症を処置する方法であって、その被検者に治療上有効量の核酸ｍｉＲ－９インヒビターを投与することを含む方法に関する。
【0006】
本願明細書で使用する場合、「被検者」の用語は、哺乳動物を意味する。本発明に係る被検者とは、嚢胞性線維症に苦しむか又は嚢胞性線維症に苦しむリスクのある、任意の被検者（好ましくはヒト）をいう。本発明の方法は、World Health Organisation Classificationに概説され、Ｅ８４群：ムコビシドーシス、肺の症状を伴う嚢胞性線維症、腸内症状を伴う嚢胞性線維症、及び他の症状を伴う嚢胞性線維症から選択されるような任意のタイプの嚢胞性線維症に対して実施され得る。
【0007】
本願明細書で使用する場合、「ＡＮＯ１」の用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＴＭＥＭ１６Ａとしても公知であるアノクタミン－１タンパク質をいう。ＡＮＯ１は、それらの一次配列及び予測構造（８つの膜貫通型ドメイン）が他のアニオンチャネルのものと類似性のない１０のメンバーからなるタンパク質ファミリーに属する。例示的なヒト核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列NM_018043.5（配列番号：１）である。
【0008】
【化1】
【0009】
「ｍｉＲＮＡ」の用語は、一般的に２１～２２ヌクレオチドの長さの成熟マイクロＲＮＡ（非コーディング小ＲＮＡ）分子をいい、１９から２３までのヌクレオチドの長さも報告されている。ｍｉＲＮＡは各々、もっと長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」：プリｍｉＲＮＡ及びプレｍｉＲＮＡ）からプロセッシングされる。プリｍｉＲＮＡは、非タンパク質－コード遺伝子から転写されるか、又はタンパク質－コーディング遺伝子に埋設される（イントロン又は非コーディングエクソン内）かのいずれかである。「前駆体ｍｉＲＮＡ」は、不完全に塩基対合された幹を含むヘアピン構造に折り畳まれて、Ｄｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒと呼ばれる２つのリボヌクレアーゼＩＩＩ型エンドヌクレアーゼにより動物において触媒される二工程でプロセッシングされる。プロセッシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、翻訳を抑制するためにそれらのターゲットｍＲＮＡとそれらを会合させることのできる大きなリボヌクレオタンパク質複合体（ＲＩＳＣ）を構築する。本発明に関する全てのｍｉＲＮＡは自体公知であり、それらの配列はデータベースhttp://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?org=hsaから公に入手できる。本願明細書で使用する場合、「ｍｉＲ－９」マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－７９に相同）は、遺伝子レギュレーションに関わる短い非コーディングＲＮＡ遺伝子である。２１ヌクレオチド以下の成熟ｍｉＲＮＡ（~21nt miRNA）は、Ｄｉｃｅｒ酵素によってヘアピン前駆体配列からプロセッシングされる。顕性成熟ｍｉＲＮＡ配列は、ｍｉＲ－９前駆体の５’腕から、及びｍｉｒ－７９前駆体の３’腕からプロセッシングされる。成熟生成物は、ｍＲＮＡとの相補性によりレギュレーションの役割を有すると考えられる。ｍｉＲ－９の例示的な配列は、ＭｉＲＢａｓｅ参照配列MIMAT0000441（UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA＝配列番号：２）に見出される。
【0010】
本願明細書に記載される場合、「核酸ｍｉＲ－９インヒビター」（すなわち、ｍｉＲ－９を阻害する核酸）は、ｍｉＲ－９の生物活性を低減する（すなわち、阻害する）、任意の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ－９自体又はｍｉＲ－９のターゲットｍＲＮＡ配列のいずれかの核酸配列の少なくとも一部分に相補的核酸配列を含み、ｍｉＲ－９の阻害はそれゆえ、ｍｉＲ－９への、又はそのターゲットｍＲＮＡへのインヒビターの結合によって引き起こされる。両方の場合で、ｍｉＲ－９はそのターゲット配列の認識及び結合が妨げられ、したがって、遺伝子サイレンシングを誘導できない。本発明の核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、一本鎖の、二本鎖の、部分的に二本鎖の、又は本質的にヘアピンの構造を含み得る。
【0011】
いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９に結合して隔離させ、そのターゲットｍＲＮＡ配列にそれが結合することを妨げる。結合は、核酸ｍｉＲ－９インヒビターに存在する少なくとも１つのヌクレオチドと、ｍｉＲ－９に存在する対応ヌクレオチドとの間の相補的塩基対を介して、核酸ｍｉＲ－９インヒビター及びｍｉＲ－９の少なくとも一部分が共に、塩基対合された核酸二本鎖を確定するように生じる。前記相補的塩基対合（したがって、二本鎖形成）は、ｍｉＲ－９の２以上の連続するヌクレオチド（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１の連続するヌクレオチド）の領域に亘って生じることができる。核酸ｍｉＲ－９インヒビターが（先に記載したような）ｍｉＲ－９に結合する際に形成される塩基対合された核酸二本鎖は、一以上のミスマッチ対合を含み得る。いくつかの実施形態では、相補的塩基対合された核酸二本鎖の２以上の領域（例えば３、４、５又は６）が形成され、ここで各領域は一以上のミスマッチ対合により次の領域から分離されている。本願明細書で使用する場合、「相補的」の用語は、Watson-Crick塩基対合で別の核酸分子と水素結合を形成する核酸分子をいう。Watson-Crick塩基対合とは、以下の水素結合されたヌクレオチド対合、すなわちＡ：Ｔ及びＣ：Ｇ（ＤＮＡの場合）；並びにＡ：Ｕ及びＣ：Ｇ（ＲＮＡの場合）をいう。例えば、２以上の相補的核酸分子鎖は、同数のヌクレオチドを有する（すなわち、同じ長さを有し、オーバーハングを伴って又は伴わずに１つの二本鎖領域を形成する）か、又は異なる数のヌクレオチドを有する（例えば、一本の鎖が別の鎖よりも短いがその鎖内に完全に含まれ得るか、又は一本の鎖が他の鎖をオーバーハングし得る）ことができる。ミスマッチ対合は、Ａ：Ｕ（ＲＮＡにおいて）、Ａ：Ｔ（ＤＮＡにおいて）及びＣ：Ｇ（ＲＮＡ及びＤＮＡ両方において）の水素結合された標準Watson-Crick塩基対の１つを共に形成しない任意の２つのヌクレオチド塩基の間で形成される。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ－９配列の少なくとも一部分に相補的な核酸配列を含む。核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ－９の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１の連続するヌクレオチドに相補的な核酸配列を含み得る。
【0012】
いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ－９の相補的（すなわち、アンチセンス）配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸配列を含む。本発明によれば、第二の核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する第一の核酸配列とは、第一の配列が第二の核酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９又は１００％の同一性を有することを意味する。配列同一性は、百分率同一性（又は類似性若しくは相同性）に換算して測定されることが多く、その百分率が高いほど、それら２つの配列はより類似している。比較のための配列のアライメントの方法は当技術分野において周知である。種々のプログラム及びアライメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992; and Pearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994に報告されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アライメント方法及び相同性計算の詳細な考察を提示している。例として、アライメントツールＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して配列比較を実施してもよい（Internet Program（登録商標）1996, W. R. Pearson及びUniversity of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63、１９９６年１２月リリース）。ＡＬＩＧＮは互いに照らして全体の配列を比較するが、ＬＦＡＳＴＡは局所的類似性の領域を比較する。これらのアライメントツール及びそれらそれぞれのチュートリアルは、インターネット上、例えばＮＣＳＡウェブサイトにて入手可能である。あるいは、およそ３０アミノ酸を上回るアミノ酸配列の比較のためには、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトBLOSUM62マトリックス(１１のギャップ存在コスト（gap existence cost）、及び１の残基当たりギャップコスト（gap cost））を用いたＢｌａｓｔ ２配列機能を採用することができる。短いペプチド（およそ３０アミノ酸を下回る）をアラインメントする際、Ｂｌａｓｔ ２配列機能を用い、デフォルトパラメータに設定されたＰＡＭ３０マトリックス（開始ギャップ（open gap）９、伸長ギャップ（extension gap）１ペナルティー）を採用してアラインメントを実施するべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えばＮＣＢＩウェブサイトから入手可能であるが、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997;及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ－９に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ９の相補的（すなわち、アンチセンス）配列と最大でも１０（例えば最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１）のヌクレオチド位置で異なる核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ｍｉＲ９の相補的（すなわち、アンチセンス）配列と最大でも５（例えば最大で４、３、２、又は１）のヌクレオチド位置で異なる核酸配列を含む。したがって、前記核酸配列は、限られた数のヌクレオチド位置で以外はｍｉＲ９の相補的（すなわち、アンチセンス）配列と同一である。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、先に記載したように、６０（例えば５５、５０、４５、４０、３５、３０、又は２５）ヌクレオチドの最高長を有する。
【0013】
いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９antagomirである。本願明細書で使用する場合、「antagomir」は、（例えば、先に記載したように）相補的塩基対合を介して特有のターゲットマイクロＲＮＡに結合するように設計されている核酸オリゴマーである。antagomirは、マイクロＲＮＡターゲット配列に全体的又は部分的に相補的な配列を有し得る。antagomirは、一本鎖の、二本鎖の、部分的に二本鎖の、又はヘアピンの構造を有し得る。antagomirはさらに、（例えば、後に記載するように）化学的に修飾されたヌクレオチドをさらに含み得る。antagomirを設計及び生成するための方法は、当技術分野において公知である。
【0014】
いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９マイクロＲＮＡ－スポンジである。本願明細書で使用する場合、用語「マイクロＲＮＡ－スポンジ」は、特有のターゲットマイクロＲＮＡに対する複数（例えば少なくとも２、３、４、５又は６）の結合部位を含む核酸である。したがって、マイクロＲＮＡ－スポンジは、複数のターゲットマイクロＲＮＡ分子を結合して隔離させることができる。マイクロＲＮＡ スポンジは、ベクター（例えばウイルスベクター又はプラスミドベクター）から発現されるｍＲＮＡを含み得る。マイクロＲＮＡ－スポンジにおける、ターゲットマイクロＲＮＡに対する複数の結合部位の存在により、スポンジが水を吸い上げると同じようにマイクロＲＮＡが吸収されることが可能になる。マイクロＲＮＡ－スポンジは、（例えば、先に記載したように）相補的塩基対合を介してターゲットマイクロＲＮＡを結合し得る。したがって、マイクロＲＮＡ－スポンジは複数（例えば少なくとも２、３、４、５又は６）の核酸配列を含み得、各配列はマイクロＲＮＡターゲット配列の少なくとも一部分に相補的である。マイクロＲＮＡ－スポンジは複数（例えば少なくとも２、３、４、５又は６）の核酸配列を含み得、各配列はマイクロＲＮＡターゲット配列に相補的である。マイクロＲＮＡ－スポンジを設計及び生成するための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、２以上の核酸配列を含み、当該２以上の核酸配列の各々がｍｉＲ９の相補的（すなわち、アンチセンス）配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、ｍｉＲ－９マイクロＲＮＡ スポンジである。
【0015】
したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９に直接結合しないが、代わりにＡＮＯ１核酸配列のｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に結合する。これは、（例えば、立体障害により）前記ターゲット部位をブロッキングする効果、ｍｉＲ－９によるその認識及び結合を妨げる効果、並びに、したがってｍｉＲ－９及びその作用を阻害する効果を有する。ｍＲＮＡターゲット部位へのｍｉＲ－９の結合とは対照的に、本発明の核酸ｍｉＲ－９インヒビターのｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位への結合は（例えばｍＲＮＡ分解又は翻訳抑制による）前記ターゲットｍＲＮＡの遺伝子サイレンシングを誘導しない。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位はＡＮＯ１ ３’ＵＴＲに局在する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ－９インヒビターはターゲット部位ブロッカー（ＴＳＢ）である。核酸ｍｉＲ－９インヒビターのｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位への結合は、先に記載したように相補的塩基対合を介して生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターとｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位との間の結合は、核酸ｍｉＲ－９インヒビターに存在する少なくとも１つのヌクレオチドと、ｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に存在する対応ヌクレオチドとの間の相補的塩基対を介して、核酸ｍｉＲ－９インヒビター及びｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位の少なくとも一部分が共に、塩基対合された核酸二本鎖を確定するように生じる。前記相補的塩基対合（したがって、二本鎖形成）は、ｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位の２以上の連続するヌクレオチド（例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１の連続するヌクレオチド）の領域に亘って生じることができる。核酸ｍｉＲ－９インヒビターが（先に記載したような）ｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲットに結合する際に形成される塩基対合された核酸二本鎖は、一以上のミスマッチ対合を含み得る。いくつかの実施形態では、相補的塩基対合された核酸二本鎖の２以上の領域（例えば３、４、５又は６）が形成され、ここで各領域は一以上のミスマッチ対合により次の領域から分離されている。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡターゲット部位はターゲットＡＮＯ１ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に局在する。核酸ｍｉＲ－９インヒビターがｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位への結合についてｍｉＲ－９と競合するいくつかの実施形態では、核酸は核酸配列TTTTCTCCGTCTTTGGGACCT（配列番号：３）を含む。したがって、前記核酸配列は、ｍｉＲ－９の種（seed）領域によってターゲッティングされる場所で相補的結合を介してＡＮＯ１のｍｉＲ－９ｍＲＮＡターゲット部位に結合することとなり、したがって、ｍｉＲ－９が結合するのを妨げる。
【0016】
いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターはｍｉＲ－９に対してターゲッティングされる小干渉（small interfering）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。本願明細書で使用する場合、「ｓｉＲＮＡ」の用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、二本鎖干渉ＲＮＡをいう。本発明の方法において有効なｓｉＲＮＡは、およそ１７ヌクレオチドからおよそ２９ヌクレオチドまでの長さ、好ましくはおよそ１９からおよそ２５ヌクレオチドの長さの、短い二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、センスＲＮＡ鎖、及び標準Watson-Crick塩基対合相互作用（以下、「塩基対合」）により一緒にアニーリングされた相補的アンチセンスＲＮＡ鎖を含む。センス鎖は、ターゲットｍｉＲＮＡ内に含まれる核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。本願明細書で使用する場合、ターゲットｍＲＮＡ内に含まれるターゲット配列と「実質的に同一である」ｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、そのターゲット配列である同一である核酸配列であるか、又はターゲット配列と１若しくは２つのヌクレオチドが異なる核酸配列である。ｓｉＲＮＡのセンス及びアンチセンス鎖は、２本の相補的一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、又は２つの相補的部分が塩基対合されて一本鎖の「ヘアピン」区域により共有結合された単一分子を含み得る。ｓｉＲＮＡは、１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変によって天然のＲＮＡと異なる改変ＲＮＡでもあり得る。このような改変としては、ｓｉＲＮＡの末端へ、若しくはｓｉＲＮＡの１以上の内部ヌクレオチドへ、などの非ヌクレオチド材料の付加、又はｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に耐性とする修飾、又はｓｉＲＮＡ中の１以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドでの置換を挙げることができる。ｓｉＲＮＡの１本又は両方の鎖は、３’オーバーハングも含み得る。本願明細書で使用する場合、「３’オーバーハング」とは、二本鎖形成ＲＮＡ鎖の３’端から伸張している少なくとも１つの否対合ヌクレオチドをいう。したがって、１つの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１からおよそ６ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを包含する）の長さ、好ましくは１からおよそ５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは１からおよそ４ヌクレオチドの長さ、特に好ましくはおよそ２からおよそ４ヌクレオチドの長さの、少なくとも１つの３’オーバーハングを含む。好ましい実施形態では、３’オーバーハングはｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを含み得る。
【0017】
本発明の核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、リボ核酸（ＲＮＡ）若しくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であっても、又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含んでいてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ＤＮＡを含む。別段に示さない限り、本明細書における核酸配列は５’－３’方向に記載されている。当業者により理解されるであろうように、ＲＮＡとして記載されヌクレオチドＵを含んでいる核酸配列は、ＵをＴで置換することにより同様にＤＮＡとして記載され得る。核酸（１または複数）及び／又はヌクレオチド（１または複数）に含まれるものとして、修飾された核酸（１または複数）及び修飾されたヌクレオチド（１または複数）が挙げられる。例えば、核酸又はヌクレオチドは、当該核酸又はヌクレオチドの安定性を高めるために、例えばヌクレアーゼ分解への抵抗性を改善することにより修飾され得る。いくつかの実施形態では、修飾された核酸は、ロックド（locked）核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。より詳細には、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と及び４’炭素とを繋ぐ余分な架橋で修飾される。架橋は、３’－エンド（North）コンフォメーションにおけるリボースを「ロックする」が、これは多くの場合Ａフォーム核酸二本鎖に見出される。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡ残基と所望の時点で混合されることができる。ロックされたリボースコンフォメーションは、塩基スタッキング及び骨格プレ－組織化を増強する。これは有意に、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融点）を高める。修飾されたヌクレオチドの他の例として、２’－メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’－メチル－チオ－エチル、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロヌクレオチド、２’－アジドヌクレオチド、及び２’－０－メチルヌクレオチドが挙げられる。本発明の核酸分子は１以上のコレステロール部分にコンジュゲーションされてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、又は４）のコレステロール部分にコンジュゲーションされる。本発明の核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、そのヌクレオチド全てが修飾されたヌクレオチドであるように構築され得る。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、修飾されたヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、前記修飾されたヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチド、又は２’－Ｏ－メチルで修飾されたヌクレオチド、又は２’－０－メトキシエチルで修飾されたヌクレオチド、又は２’－フルオロで修飾されたヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは合成２’－Ｏ－メチルＲＮＡオリゴヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡが会合した遺伝子サイレンシング複合体へのより強い結合でｍｉＲ－９ターゲットｍＲＮＡと競合する。核酸類似体は、３つの部分：ホスファート骨格、パッカー形状の（pucker-shaped）ペントース糖、リボース又はデオキシリボースの片方、及び４種のヌクレオベースのうちの１つからなる。類似体は、改変されたこれらの何れを有してもよい。典型的には、類似体ヌクレオ塩基はとりわけ、異なる塩基対合及び塩基スタッキング妥当性を与える。例としては、ユニバーサル塩基で、全ての４種の基準塩基と対合できるもの、及びＰＮＡなどのホスファート－糖骨格類似体で、鎖の特性に影響を及ぼすものが挙げられる。人工的核酸としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びＬＮＡ、さらにはグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられる。これらの各々は、分子の骨格への変化により天然のＤＮＡ又はＲＮＡから識別される。したがって、いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、及びモルホリノから選択される核酸類似体である。（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、少なくとも１つ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８又は２０）の修飾されたホスホジエステル結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたホスホジエステル結合はホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、全てのホスホジエステル結合は修飾されたホスホジエステル結合である。
【0018】
本発明の核酸分子は、当技術分野において公知の任意の好適なプロセスを用いて作成され得る。したがって、核酸分子は化学合成技術を用いて作成され得る。あるいは、本発明の核酸分子は分子生物学技術を用いて生成され得る。
【0019】
一つの態様では、本発明は先に記載したように核酸ｍｉＲ－９インヒビターをコードする核酸配列を含む核酸ベクターを提供する。例えば、本発明の核酸分子は、ウイルスベクターを用いてターゲット細胞内へと送達され得る。ウイルスベクターは、ウイルスベクターとして働くことのできる任意のウイルスであり得る。好適なウイルスは、ターゲット細胞に感染させ、インビトロで増殖させることができ、また当技術分野において公知のリコンビナントヌクレオチド技術により修飾されることができるものである。したがって、一つの態様では、本発明は（先に記載したような）ｍｉＲ－９の核酸インヒビターをコードしている核酸配列を含むウイルスベクターであって、被検者において嚢胞性線維症の予防又は治療で使用するためのウイルスベクターを提供する。本発明での使用に好適なウイルスベクターとしては、ポックスウイルスベクター（非複製ポックスウイルスベクターなど）、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。本願明細書で使用する場合、「非複製ウイルスベクター」は、ターゲット細胞の感染後に生産的に複製する能力を欠くウイルスベクターである。したがって、非複製ウイルスベクターがターゲット細胞（非複製ウイルスベクターを用いてワクチン接種を受けている個体中のヒトターゲット細胞など）の感染後にそれ自体のコピーを生成する能力は、極めて低減されるか又は存在しない。このようなウイルスベクターは、弱毒性又は複製欠損とも呼ばれ得る。その原因は、ターゲット細胞において複製に必須の遺伝子の欠損／欠失である可能性がある。したがって、非複製ウイルスベクターはターゲット細胞の感染後にそれ自体のコピーを事実上生成することができない。非複製ウイルスベクターはそれゆえ、有利なことに複製能のあるウイルスベクターと比べて向上した安全性プロファイルを有し得る。非複製ウイルスベクターは、ターゲット細胞でない細胞において複製する能力を保持し得、ウイルスベクター生成が可能となる。例として、非複製ウイルスベクター（例えば、非複製ポックスウイルスベクター）は、哺乳類細胞（例えば、ヒト細胞）などのターゲット細胞において生産的に複製する能力を欠くかもしれないが、鳥細胞（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞、すなわちＣＥＦ細胞）において複製する能力を保持し得る（このためベクター生成が可能となる）。いくつかの実施形態では、非複製ポックスウイルスベクターは、修飾された牛痘ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）ベクター、ＮＹＶＡＣ牛痘ウイルスベクター、カナリア痘（ＡＬＶＡＣ）ベクター、及び鶏痘（ＦＰＶ）ベクターから選択される。ＭＶＡ及びＮＹＶＡＣは両方とも牛痘ウイルスの弱毒性誘導体である。牛痘ウイルスと比較して、ＭＶＡはおよそ２００のオープンリーディングフレームのおよそ２６を欠いている。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは非複製アデノウイルスベクター（非複製は先に定義したとおり）である。アデノウイルスは、Ｅｌ、又は両Ｅｌ及びＥ３遺伝子領域の欠失により非複製とされることができる。いくつかの実施形態では、アデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスベクター、サルアデノウイルスベクター、Ｂ群アデノウイルスベクター、Ｃ群アデノウイルスベクター、Ｅ群アデノウイルスベクター、アデノウイルス６ベクター、ＰａｎＡｄ３ベクター、アデノウイルスＣ３ベクター、ＣｈＡｄＹ２５ベクター、ＡｄＣ６８ベクター、及びＡｄ５ベクターから選択される。
【0020】
本発明によれば、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは被検者に、核酸ｍｉＲ－９インヒビターが肺に到達することを可能とする任意の好適な方法を用いて投与される。（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、当技術分野において公知の任意の好適な手段によって被検者に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、被検者に全身に投与される（すなわち、全身投与を介する）。したがって、いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターが循環系に入って身体の至るところに分布させられるように、被検者に投与される。いくつかの実施形態では、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビターが、局所投与により、例えば肺に局所投与により被検者に投与される。
【0021】
いくつかの実施形態では、１以上の治療的組成物を上気道及び／又は下気道内に導入するように適合された任意のデバイスによって核酸ｍｉＲ－９インヒビターが送達される。デバイスは、液体の微細分散ミスト、泡、又は粉末の形態で本発明の治療的組成物を送達するように適合され得る。デバイスは、吸入に好適なミストを生成するためにテープなどの表面に付着された粉末を取り除く圧電効果又は超音波振動を使用し得る。デバイスは、ポンプ、液化ガス、圧縮ガスなどが挙げられる（これらに限定されない）当業者に公知の任意の推進（propellant）システムを使用し得る。本発明のデバイスは、典型的には治療的組成物の流れが通過する１つ以上のバルブと、その流れを制御するためのアクチュエータとを備えた容器を含む。本発明の構築体を投与するのに好適なデバイスとしては、吸入器及びネブライザーが挙げられる。種々のデザインの吸入器が市販されており、本発明の医薬を送達するのに採用され得る。これらとして、Accuhaler、Aerohaler、Aerolizer、Airmax、Autohaler、Clickhaler、Diskhaler、Easi-breathe吸入器、Fisonair、Integra、Jet吸入器、Miat-haler、Novolizer吸入器、Pulvinal吸入器、Rotahaler、Spacehaler、Spinhaler、Syncroner吸入器及びTurbohalerデバイスが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、核酸ｍｉＲ－９インヒビターの完全性が維持されるという条件で、送達はネブライザー又は他のエアロゾル適用デバイスによって行なわれる。
【0022】
核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、ボーラス送達などの単一送達にて被検者に投与されてもよい。あるいは、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、定時注入などの継続送達技術を用いて被検者に投与されてもよい。核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、反復送達処方計画を用い、例えば時間ごと、日ごと、又は週ごとの基準で投与されてもよい。核酸ｍｉＲ－９インヒビター投薬は、単回又は複数回投与により成し遂げられてもよい。例として、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、単回投与からなる処方計画にて被検者に投与されてもよい。あるいは、核酸ｍｉＲ－９インヒビターは、複数回投与を含む処方計画にて被検者に投与されてもよい。例えば、投与処方計画は、１日あたり複数回投与、又は毎日、毎週、隔週、又は毎月の投与を含み得る。処方計画例は、最初の投与と、毎週又は隔週間隔でそれに続く複数回の後投与を含む。別の処方計画例は、最初の投与と、毎月又は隔月間隔でそれに続く複数回の後投与を含む。あるいは、核酸ｍｉＲ－９インヒビターの投与は、被検者におけるＣＦ症候のモニタリングによってガイドされることができる。したがって、処方計画の例は、最初の投与と、被検者におけるＣＦ症候のモニタリングによって決定されるような不規則なベースで実施される、それに続く複数回の後投与を含む。核酸を送達するための方法は、当技術分野において公知であり、当業者には珍しくないものであろう。例として、好適な核酸送達方法は、イオン泳動、ミクロスフェア（例えば、生体接着性ミクロスフェア）、ナノ粒子、樹状ポリマー、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、及びタンパク質性のベクターを含む。
【0023】
先に記載したような「治療上有効量」の核酸ｍｉＲ－９インヒビターが意味するのは、治療効果に達するのに十分な量の当該インヒビターである。しかしながら、本発明の化合物及び組成物の毎日の総使用量は、信頼できる医学的判断の範囲内で担当医により決定されることになる点は理解されるであろう。誰か特定の被検者に対する具体的な、治療上有効な用量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；採用される具体的な化合物の活性；採用される具体的な組成物；被検者の年齢、体重、総体的な健康、被検者の性別及び食事；採用される具体的な化合物の投与の時間、投与経路、及び排泄速度；処置の継続期間；用いられる具体的なインヒビターと組み合わせて、又は同時に用いられる薬物；その他同種類の、医学分野において周知の因子を含む、様々な因子に依存するものであろう。例えば、所望の治療効果を成し遂げるのに必要とされるよりも低いレベルで化合物の用量を始めて、及び所望の効果が成し遂げられるまで投薬量を徐々に増加することは、充分に当技術分野の技術の範囲内である。しかしながら、生成物の毎日の投薬量は、成人一人１日あたり０．０１から１、０００mgまでの広い範囲に亘って変動され得る。典型的には、処置すべき被検者への投薬量の対症調整（symptomatic adjustment）のために、組成物は０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgの有効成分を含有する。医薬は、典型的にはおよそ０．０１mgからおよそ５００mg有効成分、好ましくは１mgからおよそ１００mgの有効成分を含有する。有効量の薬物は通常、１日あたり０．０００２mg/kgからおよそ２０mg/kg体重までの、とりわけ１日あたりおよそ０．００１mg/kgから７mg/kg体重までの投薬量レベルで供給される。
【0024】
被検者への投与のために、核酸ｍｉＲ－９インヒビター（又は当該核酸ｍｉＲ－９インヒビターをコードするウイルスベクター）は、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビター又は（先に記載したような）ウイルスベクターを（有効成分として）含む医薬組成物として製剤化され得る。このような医薬組成物は、核酸ｍｉＲ－９インヒビター又はウイルスベクターを薬学的に許容し得る担体と組み合わせることによるなど、医薬組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化されることができる。薬学的に許容し得る担体の限定を意図しない例としては、水、生理食塩水及びホスファート緩衝生理食塩水が挙げられる。薬学的に許容し得る担体に加えて、医薬組成物はさらに１種以上の塩、賦形剤、希釈剤、アルブミン、免疫調節剤及び／又は抗菌性化合物と組み合わせられることができる。薬学的に許容し得る塩は、例えば塩化水素酸若しくはリン酸などの無機酸で、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基や、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来するものでもよい。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びこれらの組み合わせである。加えて、必要に応じ、医薬組成物は、湿潤又は乳化剤、及び／又はｐＨ緩衝剤などの助剤物質を少量含有し得る。緩衝剤の例としては、コハク酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ６．５及び７．５）が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一つの態様では、本発明は、（先に記載したような）核酸ｍｉＲ－９インヒビター又は（先に記載したような）ウイルスベクター及び薬学的に許容し得る担体を含有する医薬組成物を提供する。医薬組成物は、５％～９５％の核酸ｍｉＲ－９インヒビター又はウイルスベクターを、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０、５５、６０、７０若しくは７５％など含有し得る。
【0025】
本発明は、以下の図面及び実施例によりさらに例証される。しかしながら、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を何ら限定するよう解釈されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】ＡＮＯ１ ｍＲＮＡのダウンレギュレーションとｍｉＲ－９のアップレギュレーションは、ヒト気管支上皮細胞株において相関している。ａ／非ＣＦ（１６ＨＢＥ１４ｏ－；ｎ＝５）及びＣＦ（ＣＦＢＥ４１ｏ－；ｎ＝６）ヒト気管支上皮細胞におけるＡＮＯ１ ｍＲＮＡの相対的発現レベル。データは、ｑＲＴ－ＰＣＲにより定量化され、標準化されたコントロールと比較した変化倍数として表す。ｂ／ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定される、非ＣＦ及びＣＦ気管支上皮細胞株におけるｍｉＲ－９発現。相対的発現レベルは、ＲＮＵ６Ｂに標準化された。データは平均±ＳＤとして表され、ｔ検定により比較された。全てのｑＲＴ－ＰＣＲ実験は、三重に実施された。ｃ／非ＣＦ及びＣＦ気管支上皮細胞株における、ｍｉＲ－９とＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現レベルとの間の負の相関（ピアソンの相関分析ｐ＝０．０１２）。
【図2】ｍｉＲ－９は、ＡＮＯ１発現、ＡＮＯ１クロライド活性及び非ＣＦ細胞の遊走率をレギュレーションする。非ＣＦ細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ－）を４８時間、ｍｉＲ－９の擬似物（３０nM）又は負のコントロールでトランスフェクションした。ａ／ＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲで分析してＧＡＰＤＨ（ｎ＝３）に標準化した。ｂ／ＡＮＯ１タンパク質発現を抗ＡＮＯ１抗体及びβ－アクチンに標準化された（ｎ＝３）を用いたウェスタンブロットによって分析した。ｃ／ハロゲン化物感受性ＹＦＰ－Ｈ１４８ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質のＩ－クエンチングによって評価されたＡＮＯ１塩素イオンチャネル活性。ｍｉｒ－９の擬似物又は負のコントロール（ｎ＝８、三重）でトランスフェクションした非ＣＦ細胞のＡＮＯ１クロライド活性の代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。ｄ／ｍｉＲ－９の擬似物又は負のコントロール（左）でトランスフェクションした非ＣＦ細胞の創傷閉鎖を４時間撮った代表的な画像、及び修復中の遊走率の定量化結果（ｎ＝５）。
【図3】非ＣＦ及びＣＦ細胞においてｍｉＲ－９は直接、ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲをターゲティングする。ａ／ｍｉＲ－９の擬似物（擬似ｍｉＲ－９）又は負のコントロール（コントロール）でコトランスフェクションされた、ルシフェラーゼ－３’ＵＴＲ ＡＮＯ１ベクターで、又はｍｉＲ－９結合部位に対して突然変異されたルシフェラーゼ－３’ＵＴＲ ＡＮＯ１ベクターで、一過性にトランスフェクションされた非ＣＦ細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ－）における相対的ルシフェラーゼ活性。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化された（ｎ＝３、８の複製物）。ｂ／ｍｉＲ－９のインヒビター（ｉｎｈ ｍｉＲ－９）又は負のコントロール（コントロール）でコトランスフェクションされた、ルシフェラーゼ－３’ＵＴＲ ＡＮＯ１ベクターで、又はｍｉＲ－９結合部位に対して突然変異されたルシフェラーゼ－３’ＵＴＲ ＡＮＯ１ベクターで、一過性にトランスフェクションされた非ＣＦ細胞（ＣＦＢＥ４１ｏ－）における相対的ルシフェラーゼ活性。ホタルルシフェラーゼ活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化された（ｎ＝３、８の複製物）。ヒストグラムは平均値±ＳＤを表し、及びｔ検定によって比較された。
【図4】特有のＴＳＢは、ＣＦ細胞のＡＮＯ１発現、クロライド活性及び遊走率を増加させる。ＣＦ細胞（ＣＦＢＥ４１ｏ－）を２４時間、コントロールＬＮＡ（コントロール）又はＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションした。ａ／抗ＡＮＯ１抗体を用いてウェスタンブロットによりＡＮＯ１タンパク質発現を分析及び定量化して、β－アクチン（ｎ＝４）に標準化した。ｂ／培地にＩ－を注入した後のＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質クエンチングの動態。ＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌでトランスフェクションして２４時間後に、画像に示すようにプラスミド細胞をコントロール又はＡＮＯ１ ＴＳＢで選択的にミクロインジェクションする。ｃ／ＡＮＯ１ ＴＳＢ又は負のコントロール（ｎ＝８、三重）でトランスフェクションし、そして非ＣＦ細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ－）と比較したＣＦ気管支上皮細胞のＡＮＯ１クロライド活性の、代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。ｄ／ＣＦ細胞の修復中の遊走率。ＣＦ細胞の創傷閉鎖を４時間撮った代表的な画像（左）、及び定量化結果（右）（ｎ＝５）。スケールバー１０μm。ヒストグラムは平均値±ＳＤを表し、ｔ検定によって比較された。
【図5】特有のＴＳＢは、初代ＣＦ細胞のＡＮＯ１発現、クロライド活性及び遊走率を増加させる。初代ヒト気管支上皮細胞（ｈＡＥＣＢ）、及びＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）患者からの気管支生検より単離され、完全に分化したヒト気管支の気液インターフェース培養物を、コントロールＬＮＡ（コントロール）又はＡＮＯ１ ＴＳＢで３日間毎日トランスフェクションした。ａ／ＣＦ患者より単離されたヒト気管支の細胞においてトランスフェクションされた、フルオレセインがコンジュケーションされたＴＳＢの共焦点顕微鏡分析（緑色）。核をＤＡＰＩ（青色）で染色し、マージされた画像を示す。スケールバー１０μm。ｂ／抗ＡＮＯ１抗体を用いてウェスタンブロットによりＡＮＯ１タンパク質発現を分析及び定量化して、β－アクチン（ｎ＝６）に標準化した。ｃ／ＡＮＯ１ ＴＳＢ又は負のコントロール（ｎ＝４）でトランスフェクションしたｈＡＥＣＢＣＦ細胞のＡＮＯ１クロライド活性の、代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。ｄ／初代ＣＦ細胞の修復中の遊走率。ＣＦ細胞の創傷閉鎖を４時間撮った代表的な写真（左）、及び定量化結果（右）（ｎ＝４）。スケールバー２０μm。ｅ／トランスフェクションから３０日後の、粘液動力学に対するコントロール又はＡＮＯ１ ＴＳＢの効果。１００ビーズの動きを各条件につき定量化し、平均速度をμm/msで求めた。スケールバー４０μm。ヒストグラムは平均値±ＳＤを表し、ｔ検定によって比較された。
【図6】特有のＴＳＢの使用は、マウスにおいて良好に寛容化されており、ＣＦマウスにおけるＡＮＯ１クロライド活性を増加させる。ａ／コントロールＬＮＡ（コントロール）又はＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションされたＭＬＥ１５細胞の、ＡＮＯ１クロライド活性の代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。ｂ／ＣＦマウスについての実験の計画。コントロール又はＡＮＯ１ ＴＳＢの鼻腔内滴下注入をマウス収容後７日及び１４日に行い、第２１日に殺処分した。ｃ／収容の日からのマウスの成長曲線。矢印は、鼻腔内滴下注入を表す。ｄ／ＡＮＯ１ ＴＳＢ又は負のコントロールを滴下注入されたＣＦマウスより単離された細胞のＡＮＯ１クロライド活性の、代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。
【図7】特有のＴＳＢは、ヒト嚢胞性線維症気管支の腺細胞のＡＮＯ１クロライド活性を増加させる。ヒト嚢胞性線維症気管支の腺細胞（ＫＭ４）を２４時間、コントロールＬＮＡ（コントロール）又はＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションした。ＣＦ気管支の腺細胞のＡＮＯ１クロライド活性の、代表的トレース及び元のトレース（左）、並びに定量化結果（右）。定量化結果は、２４ウェル/実験/条件で、３回の異なる実験から得られた。
【実施例】
【0027】
材料及び方法
ｍｉＲＮＡターゲット遺伝子のバイオインフォーマティクス分析
ＡＮＯ１発現のレギュレーションにおけるｍｉＲＮＡの役割は、コンピューターでの研究を用いて検討されており、ＡＮＯ１の３’ＵＴＲが様々なｍｉＲＮＡによって認識される数多くの種領域を含むと予測されることが示されている。ＡＮＯ１ ｍＲＮＡに対して予測される推定上のｍｉＲが同定され、オンラインターゲット予測アルゴリズム：Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ（http://www.targetscan.org）、Ｐｉｃｔａｒ（http://pictar.mdc-berlin.de）、ｍｉＲＤＢ（http://mirdb.org/miRDB）及びｍｉＲＡＮＤＡ（http://www.microrna.org）を用いて比較された。ＮＣＢＩ及びＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（http://www.ensembl.org/index.html）は、ヒトＡＮＯ１遺伝子の情報（NM_018043；ENST00000355303）を提供していた。
ｍｉＲＮＡターゲット遺伝子のバイオインフォーマティクス分析
ＡＮＯ１発現のレギュレーションにおけるｍｉＲＮＡの役割は、コンピューターでの研究を用いて検討されており、ＡＮＯ１の３’ＵＴＲが様々なｍｉＲＮＡによって認識される数多くの種領域を含むと予測されることが示されている。ＡＮＯ１ ｍＲＮＡに対して予測される推定上のｍｉＲが同定され、オンラインターゲット予測アルゴリズム：Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ（http://www.targetscan.org）、Ｐｉｃｔａｒ（http://pictar.mdc-berlin.de）、ｍｉＲＤＢ（http://mirdb.org/miRDB）及びｍｉＲＡＮＤＡ（http://www.microrna.org）を用いて比較された。ＮＣＢＩ及びＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザ（http://www.ensembl.org/index.html）は、ヒトＡＮＯ１遺伝子の情報（NM_018043；ENST00000355303）を提供していた。
【0028】
細胞培養
ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ１４ｏ－（非ＣＦ）及びＣＦＢＥ４１ｏ－（ＣＦ）は、Dr. D.C. Gruenert（San Francisco, CA, USA）からの贈与により得られ、１０％ウシ成長血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＭＥＭにおいて培養された。細胞培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃生育及び維持した。初代ヒト気管支上皮細胞（ｈＡＥＣＢ）は、完全に分化したヒト気管支の気液インターフェース培養物（MucilAir（商標名）であり、ＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）患者からの気管支生検より単離されて、Epithelix SARL（Geneva, Switzerland）から購入され提供者の指示に従って培養された。
ヒト気管支上皮細胞株１６ＨＢＥ１４ｏ－（非ＣＦ）及びＣＦＢＥ４１ｏ－（ＣＦ）は、Dr. D.C. Gruenert（San Francisco, CA, USA）からの贈与により得られ、１０％ウシ成長血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＭＥＭにおいて培養された。細胞培養物を５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３７℃生育及び維持した。初代ヒト気管支上皮細胞（ｈＡＥＣＢ）は、完全に分化したヒト気管支の気液インターフェース培養物（MucilAir（商標名）であり、ＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）患者からの気管支生検より単離されて、Epithelix SARL（Geneva, Switzerland）から購入され提供者の指示に従って培養された。
【0029】
細胞トランスフェクション：擬似、インヒビター及びターゲット部位ブロッカー
HiPerfect（Qiagen, France）を３０nMで用い、製造業者の指示に従ってｍｉＲ－９擬似、ｍｉＲ－９インヒビター又は負のコントロール（Thermo Fischer Scientific、フランス）で非ＣＦ及びＣＦ細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に、ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡ抽出、又はタンパク質抽出のために細胞を溶解させた。ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲ（ＡＮＯ１ ＴＳＢ）においてｍｉＲ－９ターゲット部位と重なるように設計されたＬＮＡ－増強オリゴヌクレオチド（LNA-enhanced oligonucleotide）で、又はｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ（ロックド核酸）マイクロＲＮＡインヒビター負コントロール（ＬＮＡコントロール）（Exiqon, Denmark）で、Interferin（Polyplus, Ozyme, France）を用いてＣＦ細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、タンパク質抽出のために細胞を溶解し、又はクロライド活性若しくは遊走アッセイ法のための実験を実施した。ＬＮＡコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１を含有し何らトランスフェクション試薬を含有しない培地を、ＡＬＩ（気液インターフェース）細胞の上部区画（upper compartment）に添加してｈＡＥＣＢ細胞をトランスフェクションした。２時間後に３７℃で、上部区画から培地を除去してＡＬＩ条件を復活させた。新たに調製したＬＮＡコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１を３日間、毎日添加して、ＡＮＯ１発現、ＡＮＯ１クロライド活性及び遊走を処置後２４時間で評価した。
HiPerfect（Qiagen, France）を３０nMで用い、製造業者の指示に従ってｍｉＲ－９擬似、ｍｉＲ－９インヒビター又は負のコントロール（Thermo Fischer Scientific、フランス）で非ＣＦ及びＣＦ細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションから４８時間後に、ｍｉＲＮＡ及びＲＮＡ抽出、又はタンパク質抽出のために細胞を溶解させた。ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲ（ＡＮＯ１ ＴＳＢ）においてｍｉＲ－９ターゲット部位と重なるように設計されたＬＮＡ－増強オリゴヌクレオチド（LNA-enhanced oligonucleotide）で、又はｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ（ロックド核酸）マイクロＲＮＡインヒビター負コントロール（ＬＮＡコントロール）（Exiqon, Denmark）で、Interferin（Polyplus, Ozyme, France）を用いてＣＦ細胞株をトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、タンパク質抽出のために細胞を溶解し、又はクロライド活性若しくは遊走アッセイ法のための実験を実施した。ＬＮＡコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１を含有し何らトランスフェクション試薬を含有しない培地を、ＡＬＩ（気液インターフェース）細胞の上部区画（upper compartment）に添加してｈＡＥＣＢ細胞をトランスフェクションした。２時間後に３７℃で、上部区画から培地を除去してＡＬＩ条件を復活させた。新たに調製したＬＮＡコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１を３日間、毎日添加して、ＡＮＯ１発現、ＡＮＯ１クロライド活性及び遊走を処置後２４時間で評価した。
【0030】
ルシフェラーゼアッセイ法
これらの実験のために、本発明者らはANO1-3’UTR-pMirTargetベクタールシフェラーゼプラスミド（Origene Technologies, Rockville, USA）、及びｍｉＲ－９（MIMAT0000441）の種領域で突然変異誘発された、突然変異ANO1 3’UTR-pMirベクターを用いた。ＣＦ及び非ＣＦ細胞を２４ウェルプレートに播種して、Exgen 500（Euromedex, France）を用いて０．５μg pMirベクター及び０．１μgウミシイタケルシフェラーゼベクターを翌日にトランスフェクションした。細胞を３０nMのｍｉＲ－９擬似物、ｍｉＲ－９のインヒビター又は負のコントロール（Thermo Fischer Scientific, France）でコトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で溶解液を調製し、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, France）を用いてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの両方をアッセイした。ホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化された。
これらの実験のために、本発明者らはANO1-3’UTR-pMirTargetベクタールシフェラーゼプラスミド（Origene Technologies, Rockville, USA）、及びｍｉＲ－９（MIMAT0000441）の種領域で突然変異誘発された、突然変異ANO1 3’UTR-pMirベクターを用いた。ＣＦ及び非ＣＦ細胞を２４ウェルプレートに播種して、Exgen 500（Euromedex, France）を用いて０．５μg pMirベクター及び０．１μgウミシイタケルシフェラーゼベクターを翌日にトランスフェクションした。細胞を３０nMのｍｉＲ－９擬似物、ｍｉＲ－９のインヒビター又は負のコントロール（Thermo Fischer Scientific, France）でコトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で溶解液を調製し、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, France）を用いてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼの両方をアッセイした。ホタルルシフェラーゼ活性はウミシイタケルシフェラーゼ活性に標準化された。
【0031】
ＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ抽出及び定量的ＲＴ－ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析
Macherey-Nagelキット（Dueren, Germany）を用いてＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを抽出した。２０ng ｍｉＲＮＡ試料を用いて、TaqMan MicroRNA Assayキット（Thermo Fischer Scientific）でヒトｍｉＲ－９及びＲＮＵ６Ｂに対して逆転写（ＲＴ）を実施した。１μgのＲＮＡ試料を用いて、High Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット（Thermo Fischer Scientific）でＡＮＯ１及びＧＡＰＤＨに対するＲＴを行った。ABI StepOnePlus（商標名）（Thermo Fischer Scientific）及びＴａｑＭａｎ技術を用いて定量的ＰＣＲを実施した。相対的定量化のため、２－ΔΔＣｔ法を用いて算出されたＡＮＯ１ ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ、及びそれぞれの非ＣＦモデルの発現レベルに標準化され、ｍｉＲ－９レベルはＲＮＵ６Ｂに対して標準化された。各試料は三重に評価され、実験の質を裏付けた。
Macherey-Nagelキット（Dueren, Germany）を用いてＲＮＡ及びｍｉＲＮＡを抽出した。２０ng ｍｉＲＮＡ試料を用いて、TaqMan MicroRNA Assayキット（Thermo Fischer Scientific）でヒトｍｉＲ－９及びＲＮＵ６Ｂに対して逆転写（ＲＴ）を実施した。１μgのＲＮＡ試料を用いて、High Capacity cDNA Reverse Transcriptionキット（Thermo Fischer Scientific）でＡＮＯ１及びＧＡＰＤＨに対するＲＴを行った。ABI StepOnePlus（商標名）（Thermo Fischer Scientific）及びＴａｑＭａｎ技術を用いて定量的ＰＣＲを実施した。相対的定量化のため、２－ΔΔＣｔ法を用いて算出されたＡＮＯ１ ｍＲＮＡレベルは、ＧＡＰＤＨ、及びそれぞれの非ＣＦモデルの発現レベルに標準化され、ｍｉＲ－９レベルはＲＮＵ６Ｂに対して標準化された。各試料は三重に評価され、実験の質を裏付けた。
【0032】
ウェスタンブロット分析
以前に詳説されるように、２０μg総タンパク質抽出物を還元して８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにてサイズで分離し、その後ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France）に転写して、５％ＢＳＡ（PAA, Les Mureaux, France）中でブロッキングした。次に、その膜をＡＮＯ１に対する特異的一次抗体（Abcam, Paris, France）及びβ－アクチン（Sigma, Saint Quentin Fallavier, France）とインキュベーションした。関心対象のタンパク質を検出し、画像化してれまでに報告されたように定量化した。
以前に詳説されるように、２０μg総タンパク質抽出物を還元して８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにてサイズで分離し、その後ＰＶＤＦ膜（Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France）に転写して、５％ＢＳＡ（PAA, Les Mureaux, France）中でブロッキングした。次に、その膜をＡＮＯ１に対する特異的一次抗体（Abcam, Paris, France）及びβ－アクチン（Sigma, Saint Quentin Fallavier, France）とインキュベーションした。関心対象のタンパク質を検出し、画像化してれまでに報告されたように定量化した。
【0033】
遊走アッセイ法
遊走アッセイ法は、２つの単層間に均一な創傷を提供する特有の創傷アッセイチャンバ（Ibidi, Biovalley, Marne la Vallee, France）を用いて実施された。７２時間以内でコンフルエント層を生成する一定数の細胞が、Ibidi（登録商標）シリコーン培養インサートの各ウェルに播種された。細胞を３７℃で５％ＣＯ２にてインキュベーションした。２４時間後、細胞をｍｉＲ－９の擬似物又は負のコントロール（Life Technologies, Saint Aubin, France）又はＴＳＢ ＡＮＯ１/ＬＮＡコントロール（Exiqon）でトランスフェクションした。培養インサートを４８時間後に除去し、細胞コロニー形成用の無細胞ギャップ（すなわち創傷）を残した。ｈＡＥＣＢ細胞については、創傷は液体窒素中に浸漬されたチップを用いて施された。３７℃で５％ＣＯ２にて維持するためチャンバで４時間、Axiovert 200顕微鏡下に創傷閉鎖を観察した。創傷閉鎖中の平均遊走率をギャップの３つの区域において評価した。各時点で、及び各視野にて、AxioVision Relソフトウェア（Zeiss）を用いて５つの長さを測定した。
遊走アッセイ法は、２つの単層間に均一な創傷を提供する特有の創傷アッセイチャンバ（Ibidi, Biovalley, Marne la Vallee, France）を用いて実施された。７２時間以内でコンフルエント層を生成する一定数の細胞が、Ibidi（登録商標）シリコーン培養インサートの各ウェルに播種された。細胞を３７℃で５％ＣＯ２にてインキュベーションした。２４時間後、細胞をｍｉＲ－９の擬似物又は負のコントロール（Life Technologies, Saint Aubin, France）又はＴＳＢ ＡＮＯ１/ＬＮＡコントロール（Exiqon）でトランスフェクションした。培養インサートを４８時間後に除去し、細胞コロニー形成用の無細胞ギャップ（すなわち創傷）を残した。ｈＡＥＣＢ細胞については、創傷は液体窒素中に浸漬されたチップを用いて施された。３７℃で５％ＣＯ２にて維持するためチャンバで４時間、Axiovert 200顕微鏡下に創傷閉鎖を観察した。創傷閉鎖中の平均遊走率をギャップの３つの区域において評価した。各時点で、及び各視野にて、AxioVision Relソフトウェア（Zeiss）を用いて５つの長さを測定した。
【0034】
ＡＮＯ１クロライド活性
ハロゲン化物感受性ＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質（Thermo Fischer Scientific）のＩ－クエンチングによって、ＡＮＯ１ Ｃｌ－活性を評価した。プローブを細胞内にトランスフェクションし、４８時間の培養の後にコンダクタンスをＵＴＰ（１０μμM）で刺激した。Ｉ－溶液（１４０mM）を添加し、以前に報告されたようにプレートリーダーに蛍光を記録した。各溶液の添加後、初発のＩ－流入速度を、非線形回帰を用いてＹＦＰ蛍光データの変化から算定して、元のトレース及び代表的なトレースを表した。定量分析のために、線形回帰を用いて蛍光クエンチングに対する勾配付けを実施して、クロライドコンダクタンス（Ｉ－取り込み）のサイズと関連付ける。棒グラフ表示のために、変化速度（ΔF/分）を用いる。
ハロゲン化物感受性ＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質（Thermo Fischer Scientific）のＩ－クエンチングによって、ＡＮＯ１ Ｃｌ－活性を評価した。プローブを細胞内にトランスフェクションし、４８時間の培養の後にコンダクタンスをＵＴＰ（１０μμM）で刺激した。Ｉ－溶液（１４０mM）を添加し、以前に報告されたようにプレートリーダーに蛍光を記録した。各溶液の添加後、初発のＩ－流入速度を、非線形回帰を用いてＹＦＰ蛍光データの変化から算定して、元のトレース及び代表的なトレースを表した。定量分析のために、線形回帰を用いて蛍光クエンチングに対する勾配付けを実施して、クロライドコンダクタンス（Ｉ－取り込み）のサイズと関連付ける。棒グラフ表示のために、変化速度（ΔF/分）を用いる。
【0035】
微量注入（ミクロインジェクション）実験
ハロゲン化物感受性ＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質によるトランスフェクションから２４時間後に、ガラス底のIbidi Dishに細胞を播種し、Xenowork極微操作装置（ミクロマニピュレータ）及びデジタルミクロインジェクタ（Sutter本発明者らにInstrument, CA, USA）を用いてＡＮＯ１ ＴＳＢ又はコントロールＴＳＢをＣＦ細胞中に微量注入した。異なるトランスフェクションを識別するために、ＡＮＯ１ ＴＳＢはDextran Texas Red neutral（Thermo Fischer Scientific）を用いて微量注入された。微量注入の４時間後に微小灌流システム（Valvelink、Automate Scientific, CA, USA）によって、Ｉ－による細胞の活性化を実施し、Axiovert 200顕微鏡（Zeiss）で６３倍対物レンズを用いて記録した。定量化は、ImageJソフトウェア（US National Institutes of Health, ML, USA）で実施された。
ハロゲン化物感受性ＹＦＰ－Ｈ１４８Ｑ／Ｉ１５２Ｌタンパク質によるトランスフェクションから２４時間後に、ガラス底のIbidi Dishに細胞を播種し、Xenowork極微操作装置（ミクロマニピュレータ）及びデジタルミクロインジェクタ（Sutter本発明者らにInstrument, CA, USA）を用いてＡＮＯ１ ＴＳＢ又はコントロールＴＳＢをＣＦ細胞中に微量注入した。異なるトランスフェクションを識別するために、ＡＮＯ１ ＴＳＢはDextran Texas Red neutral（Thermo Fischer Scientific）を用いて微量注入された。微量注入の４時間後に微小灌流システム（Valvelink、Automate Scientific, CA, USA）によって、Ｉ－による細胞の活性化を実施し、Axiovert 200顕微鏡（Zeiss）で６３倍対物レンズを用いて記録した。定量化は、ImageJソフトウェア（US National Institutes of Health, ML, USA）で実施された。
【0036】
動物
本発明者らのInstitutional Animal Care and Use Department（Ethical Committee for Laboratory Animal Care Charles Darwin Franceの承認20150511145844v3）に従って全ての実験を実施した。１２９／ＦＶＢ異種交配バックグラウンドＦ５０８ｄｅｌ－ＣＦＴＲにおけるＦ５０５８ｄｅｌ突然変異のためのＣＦ雄性マウスモデルＣｆｔｒｔｍ１Ｅｕｒマウスホモ接合、及びそれらの正常な同腹仔にについて研究を行なった。動物は、Specific Pathogen Free mouse facility of Paris 6に、食餌及び水を自由に摂取できるように維持され、重量を毎日記録した。マウスは、CDTA-CNRS（Orleaans, France）から、離乳後の８週齢で得られた。腸閉塞を最小限に抑えるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－３３５０）及び電解質（Movicol（登録商標））を含有する市販の浸透圧緩下薬を、連続的に飲料水中６％で供給した１０。滴下注入の前に、マウスはＯ２（２L/分）に送達された２．５％イソフルランで麻酔された。マウスの各鼻孔の外端部上への溶液のピペット操作によって、各チャレンジ用量（２週間の間、週一回）のＴＳＢ（１０mg/kg）の鼻腔内投与を実施した。イソフルラン麻酔を受けたマウスを誘導チャンバから取り出し、直ちに滴下注入を実施した。最後のチャレンジから７日後に、致死量のＣＯ２によってマウスを殺処分した。全採血の後、胸壁を切開して気管を単離した。気管の切片に対し、Premo Halideセンサを製造業者の指示に従って実行し、以前に報告されたようにクロライド活性を記録した。
本発明者らのInstitutional Animal Care and Use Department（Ethical Committee for Laboratory Animal Care Charles Darwin Franceの承認20150511145844v3）に従って全ての実験を実施した。１２９／ＦＶＢ異種交配バックグラウンドＦ５０８ｄｅｌ－ＣＦＴＲにおけるＦ５０５８ｄｅｌ突然変異のためのＣＦ雄性マウスモデルＣｆｔｒｔｍ１Ｅｕｒマウスホモ接合、及びそれらの正常な同腹仔にについて研究を行なった。動物は、Specific Pathogen Free mouse facility of Paris 6に、食餌及び水を自由に摂取できるように維持され、重量を毎日記録した。マウスは、CDTA-CNRS（Orleaans, France）から、離乳後の８週齢で得られた。腸閉塞を最小限に抑えるために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ－３３５０）及び電解質（Movicol（登録商標））を含有する市販の浸透圧緩下薬を、連続的に飲料水中６％で供給した１０。滴下注入の前に、マウスはＯ２（２L/分）に送達された２．５％イソフルランで麻酔された。マウスの各鼻孔の外端部上への溶液のピペット操作によって、各チャレンジ用量（２週間の間、週一回）のＴＳＢ（１０mg/kg）の鼻腔内投与を実施した。イソフルラン麻酔を受けたマウスを誘導チャンバから取り出し、直ちに滴下注入を実施した。最後のチャレンジから７日後に、致死量のＣＯ２によってマウスを殺処分した。全採血の後、胸壁を切開して気管を単離した。気管の切片に対し、Premo Halideセンサを製造業者の指示に従って実行し、以前に報告されたようにクロライド活性を記録した。
【0037】
統計解析
全てのデータは、平均±ＳＤとして記載される。図面の凡例において、ｎは反復された実験の数を示す。グループ間の差は、スチューデントｔ検定を用いて検定された。０．０５よりも低いｐの値を有意と考え、図面では、統計的有意差をｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、及びｐ＜０．００１（＊＊＊）で示す。
全てのデータは、平均±ＳＤとして記載される。図面の凡例において、ｎは反復された実験の数を示す。グループ間の差は、スチューデントｔ検定を用いて検定された。０．０５よりも低いｐの値を有意と考え、図面では、統計的有意差をｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、及びｐ＜０．００１（＊＊＊）で示す。
【0038】
結果
ＡＮＯ１のダウンレギュレーションとｍｉＲ－９のアップレギュレーションとはヒト気管支上皮細胞株において相関している
本発明者らは以前、ＡＮＯ１発現及び活性が非ＣＦと比較してＣＦコンテクストで減少したことを示したが、これらの減少に関与する機構は未だにわかっていない。本発明者らは、遺伝子発現を転写後にレギュレーションしている小さな非コーディングＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関心を抱いている。そこで、本発明者らは、異なるアルゴリズムのいくつかのデータベース：Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲＤＢ、ｍｉＲＡＮＤＡ及びＰｉｃｔａｒを用いてＡＮＯ１をターゲッティングし得たｍｉＲＮＡを予測し、そして本発明者らは、４種のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１９ａ；ｍｉＲ－１９ｂ及びｍｉＲ－１４４がＡＮＯ１をターゲッティングすると予測されることを見出した。予備実験後に、本発明者らはｍｉＲ－９に着目し、その他の結果は論文の補足データに入れられた。ｍｉＲ－９の発現は、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイ法を用いｑＲＴ－ＰＣＲによって研究され、非ＣＦと比較して（ＣＦＢＥ４１ｏ－対１６ＨＢＥ１４ｏ－）、ＡＮＯ１発現とは対照的にＣＦ気管支上皮細胞株において増加することが見出された（図１ａ及び１ｂ）。興味深いことに、本発明者らはピアソンの相関試験を用いて、ＡＮＯ１転写物はｍｉＲ－９発現レベルに有意に関連している（ｐ＝０．０１２）ことを立証した（図１ｃ）。
ＡＮＯ１のダウンレギュレーションとｍｉＲ－９のアップレギュレーションとはヒト気管支上皮細胞株において相関している
本発明者らは以前、ＡＮＯ１発現及び活性が非ＣＦと比較してＣＦコンテクストで減少したことを示したが、これらの減少に関与する機構は未だにわかっていない。本発明者らは、遺伝子発現を転写後にレギュレーションしている小さな非コーディングＲＮＡであるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に関心を抱いている。そこで、本発明者らは、異なるアルゴリズムのいくつかのデータベース：Ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ、ｍｉＲＤＢ、ｍｉＲＡＮＤＡ及びＰｉｃｔａｒを用いてＡＮＯ１をターゲッティングし得たｍｉＲＮＡを予測し、そして本発明者らは、４種のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１９ａ；ｍｉＲ－１９ｂ及びｍｉＲ－１４４がＡＮＯ１をターゲッティングすると予測されることを見出した。予備実験後に、本発明者らはｍｉＲ－９に着目し、その他の結果は論文の補足データに入れられた。ｍｉＲ－９の発現は、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡアッセイ法を用いｑＲＴ－ＰＣＲによって研究され、非ＣＦと比較して（ＣＦＢＥ４１ｏ－対１６ＨＢＥ１４ｏ－）、ＡＮＯ１発現とは対照的にＣＦ気管支上皮細胞株において増加することが見出された（図１ａ及び１ｂ）。興味深いことに、本発明者らはピアソンの相関試験を用いて、ＡＮＯ１転写物はｍｉＲ－９発現レベルに有意に関連している（ｐ＝０．０１２）ことを立証した（図１ｃ）。
【0039】
ｍｉＲ－９はＡＮＯ１をレギュレーションする
ＣＦ細胞におけるｍｉＲ－９の発現増加により本発明者らは、ＡＮＯ１がｍｉＲ－９の直接的なターゲットであるという仮説を立てることになった。そこで本発明者らは、非ＣＦ細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ－）をｍｉＲ－９の擬似物でトランスフェクションし、ｍｉＲ発現にSmartflare法を用いてＲＴ－ＰＣＲによりトランスフェクション効率を確かめている（論文の補足データ参照）。本発明者らはまた、ｍｉＲ－９の擬似物をトランスフェクションした後のｍｉＲ－９過剰発現は、他のｍｉＲの定量化に対して特有であることも確かめた（ｍｉＲ－１９ａ、例えば、補足データ）。次に、ＡＮＯ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質に対するｍｉＲ－９過剰発現の効果を評価した。非ＣＦ細胞をｍｉＲ－９擬似又は負のコントロールでトランスフェクションした。トランスフェクションの結果として、図２ａにｍｉＲ－９過剰発現（擬似ｍｉＲ－９）は、１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞において平均６０％まで、ＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させたことを示す。ウエスタンブロット及び免疫細胞化学によって調べたＡＮＯ１タンパク質発現もまた、ｍｉＲ－９擬似のトランスフェクション後に有意に減少していた（図２ｂ）。本発明者らはしたがって、ｍｉＲ－９はＡＮＯ１発現をレギュレーションすると結論付けた。
ＣＦ細胞におけるｍｉＲ－９の発現増加により本発明者らは、ＡＮＯ１がｍｉＲ－９の直接的なターゲットであるという仮説を立てることになった。そこで本発明者らは、非ＣＦ細胞（１６ＨＢＥ１４ｏ－）をｍｉＲ－９の擬似物でトランスフェクションし、ｍｉＲ発現にSmartflare法を用いてＲＴ－ＰＣＲによりトランスフェクション効率を確かめている（論文の補足データ参照）。本発明者らはまた、ｍｉＲ－９の擬似物をトランスフェクションした後のｍｉＲ－９過剰発現は、他のｍｉＲの定量化に対して特有であることも確かめた（ｍｉＲ－１９ａ、例えば、補足データ）。次に、ＡＮＯ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質に対するｍｉＲ－９過剰発現の効果を評価した。非ＣＦ細胞をｍｉＲ－９擬似又は負のコントロールでトランスフェクションした。トランスフェクションの結果として、図２ａにｍｉＲ－９過剰発現（擬似ｍｉＲ－９）は、１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞において平均６０％まで、ＡＮＯ１ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させたことを示す。ウエスタンブロット及び免疫細胞化学によって調べたＡＮＯ１タンパク質発現もまた、ｍｉＲ－９擬似のトランスフェクション後に有意に減少していた（図２ｂ）。本発明者らはしたがって、ｍｉＲ－９はＡＮＯ１発現をレギュレーションすると結論付けた。
【0040】
ｍｉＲ－９は細胞のＡＮＯ１クロライド活性及び遊走率をレギュレーションする
引き続き本発明者らは、ＡＮＯ１クロライド活性に対するｍｉＲ－９過剰発現の効果を評価しようとした。図２ｃは、ｍｉＲ－９過剰発現がＡＮＯ１クロライド活性の減少をもたらすことを示す。本発明者らのグループにより以前、ＡＮＯ１が細胞遊走に関与することが立証されているので、本発明者らはまた、ｍｉＲ－９存在の遊走率に対する効果も研究した。図２ｄは、ｍｉＲ－９過剰発現が非ＣＦ細胞の遊走率を有意に減少させることを示す。これらの結果は、ｍｉＲ－９が細胞のＡＮＯ１クロライド活性及び遊走率を変化させることを示す。
引き続き本発明者らは、ＡＮＯ１クロライド活性に対するｍｉＲ－９過剰発現の効果を評価しようとした。図２ｃは、ｍｉＲ－９過剰発現がＡＮＯ１クロライド活性の減少をもたらすことを示す。本発明者らのグループにより以前、ＡＮＯ１が細胞遊走に関与することが立証されているので、本発明者らはまた、ｍｉＲ－９存在の遊走率に対する効果も研究した。図２ｄは、ｍｉＲ－９過剰発現が非ＣＦ細胞の遊走率を有意に減少させることを示す。これらの結果は、ｍｉＲ－９が細胞のＡＮＯ１クロライド活性及び遊走率を変化させることを示す。
【0041】
ｍｉＲ－９はＡＮＯ１を直接レギュレーションする
ｍｉＲ－９がＡＮＯ１発現を、その３’ＵＴＲに結合することにより抑制するかどうかを調べるために、WT ANO1 3’UTRを含むルシフェラーゼレポーターベクター（WT-ANO1-3’UTR）又はｍｉＲ－９に対する予測結合部位での変異がある負のコントロールレポーター（mut-ANO1-3’UTR）で、１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞をトランスフェクションした。ｍｉＲ－９擬似でのコトランスフェクションの結果、mut-ANO1-3’UTRと比較してWT-ANO1-3’UTRからルシフェラーゼ遺伝子発現の有意な減少が起こり、非ＣＦ細胞における直接的なｉＲ－９-ＡＮＯ１相互作用を立証していた（図３ａ）。本発明者らは、ＣＦＢＥ４１ｏ－細胞においてｍｉＲ－９のインヒビターを用いて同じ実験を行っており（図３ｂ）、ＣＦ細胞をｍｉＲ－９のインヒビターでトランスフェクションする場合にコントロールと比較してルシフェラーゼ活性が有意に増加することを観察したが、突然変異されたプラスミドでは有意差は観察されなかった。本発明者らはしたがって、ｍｉＲ－９はＣＦ細胞においてＡＮＯ１を直接レギュレーションすると結論付けた。
ｍｉＲ－９がＡＮＯ１発現を、その３’ＵＴＲに結合することにより抑制するかどうかを調べるために、WT ANO1 3’UTRを含むルシフェラーゼレポーターベクター（WT-ANO1-3’UTR）又はｍｉＲ－９に対する予測結合部位での変異がある負のコントロールレポーター（mut-ANO1-3’UTR）で、１６ＨＢＥ１４ｏ－細胞をトランスフェクションした。ｍｉＲ－９擬似でのコトランスフェクションの結果、mut-ANO1-3’UTRと比較してWT-ANO1-3’UTRからルシフェラーゼ遺伝子発現の有意な減少が起こり、非ＣＦ細胞における直接的なｉＲ－９-ＡＮＯ１相互作用を立証していた（図３ａ）。本発明者らは、ＣＦＢＥ４１ｏ－細胞においてｍｉＲ－９のインヒビターを用いて同じ実験を行っており（図３ｂ）、ＣＦ細胞をｍｉＲ－９のインヒビターでトランスフェクションする場合にコントロールと比較してルシフェラーゼ活性が有意に増加することを観察したが、突然変異されたプラスミドでは有意差は観察されなかった。本発明者らはしたがって、ｍｉＲ－９はＣＦ細胞においてＡＮＯ１を直接レギュレーションすると結論付けた。
【0042】
特有のＴＳＢの使用は、ＣＦ細胞のＡＮＯ１発現、クロライド活性及び遊走率を増加させる
ＣＦのコンテクストにおいて、ＡＮＯ１発現を増加させてＡＮＯ１クロライド活性を増加させることは興味深いはずである。ｍｉＲ－９は細胞中に多くのターゲットを有しているためｍｉＲ－９のインヒビターは特異的でないので、本発明者らは、ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲに結合してｍｉＲ－９固定を妨げる特有のターゲット部位ブロッカー（ＴＳＢ ＡＮＯ１）を設計した。本発明者らは、ＣＦ細胞をコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１で２４時間トランスフェクションし、ＡＮＯ１タンパク質発現を定量化した後に本発明者らは、
細胞をＴＳＢ ＡＮＯ１でトランスフェクションするとＡＮＯ１タンパク質発現が有意に増加することを観察している（図４ａ）。鏡検法を併用した微量注入実験により、本発明者らは、ＴＳＢコントロールで微量注入した単一細胞と、ＡＮＯ１ ＴＳＢで微量注入した別の細胞とをを同じ視野に観察できる（図４ｂ）。この手法において、クロライド流出に伴う蛍光の減少は２つの細胞で完全に異なる。さらに、より古典的な方法によって、本発明者らはPremoハロゲン化物センサ法を用いてＡＮＯ１クロライド活性も定量化したが、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると明らかに、ＡＮＯ１クロライド活性が有意に増加することを観察した（図４ｃ）。この場合、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、本発明者らは非ＣＦ細胞と同じクロライド活性を観察したことが認められるのは興味深い。最後に、本発明者らは遊走を調べ、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションするとコントロールと比較して細胞の遊走率が有意に増加することを見出した。
ＣＦのコンテクストにおいて、ＡＮＯ１発現を増加させてＡＮＯ１クロライド活性を増加させることは興味深いはずである。ｍｉＲ－９は細胞中に多くのターゲットを有しているためｍｉＲ－９のインヒビターは特異的でないので、本発明者らは、ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲに結合してｍｉＲ－９固定を妨げる特有のターゲット部位ブロッカー（ＴＳＢ ＡＮＯ１）を設計した。本発明者らは、ＣＦ細胞をコントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１で２４時間トランスフェクションし、ＡＮＯ１タンパク質発現を定量化した後に本発明者らは、
細胞をＴＳＢ ＡＮＯ１でトランスフェクションするとＡＮＯ１タンパク質発現が有意に増加することを観察している（図４ａ）。鏡検法を併用した微量注入実験により、本発明者らは、ＴＳＢコントロールで微量注入した単一細胞と、ＡＮＯ１ ＴＳＢで微量注入した別の細胞とをを同じ視野に観察できる（図４ｂ）。この手法において、クロライド流出に伴う蛍光の減少は２つの細胞で完全に異なる。さらに、より古典的な方法によって、本発明者らはPremoハロゲン化物センサ法を用いてＡＮＯ１クロライド活性も定量化したが、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると明らかに、ＡＮＯ１クロライド活性が有意に増加することを観察した（図４ｃ）。この場合、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、本発明者らは非ＣＦ細胞と同じクロライド活性を観察したことが認められるのは興味深い。最後に、本発明者らは遊走を調べ、細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションするとコントロールと比較して細胞の遊走率が有意に増加することを見出した。
【0043】
特有のＴＳＢの使用は、初代ＣＦ細胞のＡＮＯ１発現、クロライド活性及び遊走率を増加させる
インビボ上皮を模倣するために、本発明者らは初代ヒト気管支上皮細胞（ｈＡＥＣＢ）、及び患者からの気管支生検より単離され、完全に分化したヒト気管支の気液インターフェース（ＡＬＩ）培養物ＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）を、コントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１でトランスフェクションすることにした。本発明者らは、ＴＳＢ ＡＮＯ１又はコントロールを含有し、何らトランスフェクション試薬を含有しない培地をＡＬＩ細胞の頂端面に添加して、首尾良く細胞をトランスフェクションした（図５ａ）。２時間後に３７℃で、頂端面から培地を除去してＡＬＩ条件を復活させた。新たに調製したコントロールオリゴヌクレオチド又はＴＳＢ ＡＮＯ１を３日間添加して、トランスフェクションの効果を処置後２４時間で観察した。ウエスタンブロットの結果は、本発明者らが初代細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、コントロールと比較してＡＮＯ１発現が有意に増加することを示した（図５ｂ）。さらに、トランスフェクション後に、本発明者らはＡＮＯ１ ＴＳＢで初代ＣＦ細胞のＡＮＯ１クロライド活性（図５）及び遊走率（図５ｄ）が有意に増加することを観察した。本発明者らはまた、線毛運動頻度も蛍光性ビーズを用いて調べており、興味深いことにはＡＮＯ１ ＴＳＢでビーズの平均速度が増加することを観察している。初代細胞におけるＴＳＢ ＡＮＯ１の利用は、細胞のＡＮＯ１クロライド活性、遊走率及び線毛運動頻度を改善することによりＣＦ細胞の欠損パラメータをモデュレーションさせる。
インビボ上皮を模倣するために、本発明者らは初代ヒト気管支上皮細胞（ｈＡＥＣＢ）、及び患者からの気管支生検より単離され、完全に分化したヒト気管支の気液インターフェース（ＡＬＩ）培養物ＣＦ（Ｆ５０８ｄｅｌ／Ｆ５０８ｄｅｌ）を、コントロール又はＴＳＢ ＡＮＯ１でトランスフェクションすることにした。本発明者らは、ＴＳＢ ＡＮＯ１又はコントロールを含有し、何らトランスフェクション試薬を含有しない培地をＡＬＩ細胞の頂端面に添加して、首尾良く細胞をトランスフェクションした（図５ａ）。２時間後に３７℃で、頂端面から培地を除去してＡＬＩ条件を復活させた。新たに調製したコントロールオリゴヌクレオチド又はＴＳＢ ＡＮＯ１を３日間添加して、トランスフェクションの効果を処置後２４時間で観察した。ウエスタンブロットの結果は、本発明者らが初代細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、コントロールと比較してＡＮＯ１発現が有意に増加することを示した（図５ｂ）。さらに、トランスフェクション後に、本発明者らはＡＮＯ１ ＴＳＢで初代ＣＦ細胞のＡＮＯ１クロライド活性（図５）及び遊走率（図５ｄ）が有意に増加することを観察した。本発明者らはまた、線毛運動頻度も蛍光性ビーズを用いて調べており、興味深いことにはＡＮＯ１ ＴＳＢでビーズの平均速度が増加することを観察している。初代細胞におけるＴＳＢ ＡＮＯ１の利用は、細胞のＡＮＯ１クロライド活性、遊走率及び線毛運動頻度を改善することによりＣＦ細胞の欠損パラメータをモデュレーションさせる。
【0044】
議論
本願において、本発明者らは知る限りで、とりわけＣＦにおける、ｍｉＲＮＡ及びＡＮＯ１発現の間の直接的な相関についての第１の報告を開示する。このように、本発明者らはＣＦ気管支上皮細胞においてｍｉＲ－９が有意に過剰発現されること、及びｍｉＲ－９はＡＮＯ１を直接レギュレーションすることを見出した。ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲ ｍＲＮＡへのｍｉＲ－９固定を妨げるように特に設計された、ターゲット部位ブロッカー（ＡＮＯ１ ＴＳＢ）を用いて本発明者らは、ＣＦ細胞株において、気液インターフェースで培養されたＣＦ初代細胞において、またＣＦマウスにおいても、ＡＮＯ１発現及びＡＮＯ１クロライド活性を増加できることを示している。細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、非ＣＦ細胞におけると同じレベルのクロライド活性があることが認められるのは興味深い。本発明者らは、インシリコの分析に基づき候補遺伝子手法を用いて、ｍｉＲ－９によるＡＮＯ１レギュレーションを研究している。本発明者らは、いくつかのｍｉＲＮＡ－ターゲット相互作用アルゴリズムからの予測を調べており、それらの共通部分に着目している。４種のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１９ａ；ｍｉＲ－１９ｂ及びｍｉＲ－１４４が、ターゲットＡＮＯ１ ｍＲＮＡをターゲッティングすると強く予測された。予備実験後に、ｍｉＲ－１９ａ及びｍｉＲ－１９ｂはＡＮＯ１をレギュレーションしないこと、そしてｍｉＲ－１４４はＡＮＯ１をレギュレーションするが直接的でないことを本発明者らは観察した（論文の補足データ）。例えば、本発明者らはｍｉＲ－１４４がＣＦＴＲ相互作用を介してＡＮＯ１活性をレギュレーションし得るという仮説を立てたが、この結果はさらに精査する必要がある。実際に、いくつかの研究でｍｉＲ－１４４はＣＦＴＲをレギュレーションすることが既に示されており、別の研究ではＣＦＴＲとＡＮＯ１との相互作用は未だ明らかでないとしてもそれらの共局在が有ることが示されている。本願では、本発明者らは非ＣＦと比較してＣＦ細胞においてｍｉＲ－９が過剰発現していることを見抜き、そしてさらに、本発明者らはｍｉＲ－９及びＡＮＯ１の発現レベルが、ＣＦ及び非ＣＦ細胞において相関していることを立証している。本発明者らはしたがって、一意の手法を用い、ＡＮＯ１をｍｉＲ－９のターゲットとして確証し、ＣＦ細胞におけるＡＮＯ１発現の減少はｍｉＲ－９によるＡＮＯ１抑制によって引き起こされることを立証したがＣＦＴＲでの突然変異がどのようにＣＦにおけるｍｉＲ－９脱レギュレーションを誘導するかはわからないままである。Galiettaらは以前に、ＡＮＯ１発現がＩＬ－４によって刺激されることを示しており１１、そこで本発明者らは本願にかかる細胞をＩＬ－４によって刺激してｍｉＲ－９発現が変化するかを調べたが、刺激なしとＩＬ－４刺激の条件の間で差は無い（データ図示せず）。
本願において、本発明者らは知る限りで、とりわけＣＦにおける、ｍｉＲＮＡ及びＡＮＯ１発現の間の直接的な相関についての第１の報告を開示する。このように、本発明者らはＣＦ気管支上皮細胞においてｍｉＲ－９が有意に過剰発現されること、及びｍｉＲ－９はＡＮＯ１を直接レギュレーションすることを見出した。ＡＮＯ１ ３’ＵＴＲ ｍＲＮＡへのｍｉＲ－９固定を妨げるように特に設計された、ターゲット部位ブロッカー（ＡＮＯ１ ＴＳＢ）を用いて本発明者らは、ＣＦ細胞株において、気液インターフェースで培養されたＣＦ初代細胞において、またＣＦマウスにおいても、ＡＮＯ１発現及びＡＮＯ１クロライド活性を増加できることを示している。細胞をＡＮＯ１ ＴＳＢでトランスフェクションすると、非ＣＦ細胞におけると同じレベルのクロライド活性があることが認められるのは興味深い。本発明者らは、インシリコの分析に基づき候補遺伝子手法を用いて、ｍｉＲ－９によるＡＮＯ１レギュレーションを研究している。本発明者らは、いくつかのｍｉＲＮＡ－ターゲット相互作用アルゴリズムからの予測を調べており、それらの共通部分に着目している。４種のｍｉＲＮＡ：ｍｉＲ－９；ｍｉＲ－１９ａ；ｍｉＲ－１９ｂ及びｍｉＲ－１４４が、ターゲットＡＮＯ１ ｍＲＮＡをターゲッティングすると強く予測された。予備実験後に、ｍｉＲ－１９ａ及びｍｉＲ－１９ｂはＡＮＯ１をレギュレーションしないこと、そしてｍｉＲ－１４４はＡＮＯ１をレギュレーションするが直接的でないことを本発明者らは観察した（論文の補足データ）。例えば、本発明者らはｍｉＲ－１４４がＣＦＴＲ相互作用を介してＡＮＯ１活性をレギュレーションし得るという仮説を立てたが、この結果はさらに精査する必要がある。実際に、いくつかの研究でｍｉＲ－１４４はＣＦＴＲをレギュレーションすることが既に示されており、別の研究ではＣＦＴＲとＡＮＯ１との相互作用は未だ明らかでないとしてもそれらの共局在が有ることが示されている。本願では、本発明者らは非ＣＦと比較してＣＦ細胞においてｍｉＲ－９が過剰発現していることを見抜き、そしてさらに、本発明者らはｍｉＲ－９及びＡＮＯ１の発現レベルが、ＣＦ及び非ＣＦ細胞において相関していることを立証している。本発明者らはしたがって、一意の手法を用い、ＡＮＯ１をｍｉＲ－９のターゲットとして確証し、ＣＦ細胞におけるＡＮＯ１発現の減少はｍｉＲ－９によるＡＮＯ１抑制によって引き起こされることを立証したがＣＦＴＲでの突然変異がどのようにＣＦにおけるｍｉＲ－９脱レギュレーションを誘導するかはわからないままである。Galiettaらは以前に、ＡＮＯ１発現がＩＬ－４によって刺激されることを示しており１１、そこで本発明者らは本願にかかる細胞をＩＬ－４によって刺激してｍｉＲ－９発現が変化するかを調べたが、刺激なしとＩＬ－４刺激の条件の間で差は無い（データ図示せず）。
【0045】
まとめると、本発明者らの結果は、ＡＮＯ１ ｍＲＮＡをターゲティングするｍｉＲＮＡをＣＦにおける潜在的な治療ターゲットとして、またＴＳＢを実際の選択肢として考えることができる、というエビデンスを提供する。ＡＮＯ１は２００８年に発見されていたので、このタンパク質はＣＦにおける治療ターゲットとして考えられるが１２、これは塩素イオンチャネルとして定義されるからだけでなく、ＡＮＯ１がＨＣＯ３－分泌、遊走、及び増殖のような、ＣＦにおける他の脱レギュレーションされるパラメータに関わるからでもある７。さらに、ＡＮＯ１をターゲティングすることはＣＦＴＲ変異と無関係であるから、有望なターゲットであるらしいが、今までのところ利用可能又は示唆されている効率的な薬物療法はない。１９９１年に、ウリジン－５’－三リン酸がＣＦ呼吸上皮におけるクロライド分泌を刺激できることをいくつかのがグループ発見した１３。このヌクレオチドはプリン作動性レセプターに結合することによるシグナルを活性化して細胞内カルシウムを遊離させ、ＣＦＴＲと異なる未定義のＣａＣＣsを活性化する１４。インビトロのＣＦ組織培養研究によって、ＵＴＰは液体輸送を復活させ、期間粘液粘度、線毛運動頻度を高め、ナトリウム吸収を阻害し、またＣＦの処置に有益なはずである気道の水和を増加させるこことができることが立証されている１５、１６。これらの有望な結果から、ＩＮＳ３６５及びＩＮＳ３７２１７と呼ばれる新しい薬物（後にdenufosol（登録商標）と命名）の開発が可能となっている。これらの薬物は、ＵＴＰよりも酵素による分解への耐性が強い１７。これらのデータに基づき、denufosol（Inspire Pharmaceuticals）は送達手法に噴霧を用いた臨床試験に移された。第一の臨床試験で得られたいくつかの有望な結果の後に、国際的な第３相臨床試験が４６６名の患者を対象にして完遂された。この試験はＣＦ患者に対する何らかの利点を立証できず、会社に１日で＄４００，０００，０００の損失をもたらした。この成り行きを踏まえて、多くの点からこの結果を説明できるはずであり、Stanford University School of MedicineからのPr. Mossによる論文に充分に詳説された１８。先ず、ＣａＣＣの分子同一性が第３相試験の後に突き止められ、denufosolの正確な効果は経験的なものに過ぎず、且つ非常に一過性であった。したがって、上皮の頂端表面へのＵＴＰの投与でＰ２Ｙ２レセプターへの結合が生じ、１秒から数分以内にクロライド流出の上昇に伴ってサイトゾルの遊離カルシウム濃度の迅速な増加を引き起こすことが充分に認められている１１。第２に、ＣＦのコンテクストにおいて、この薬物の安定性は非常に問題のあるままで、半減期が鼻内上皮では３時間から、ＣＦ患者の肺では１７分から、そしてヌクレオシダーゼに起因して血液中では３０秒からと非常に短かった１７、１９。第三に、薬物の有効性を確証するための、ＦＥＶ１の適用可能なベースライン機能障害が穏やかに過ぎないか存在しない（予測の９２％）若いＣＦ患者（年齢平均１４．２歳）に対する重要な選択基準が議論できよう。この場合、多くの薬物が、ＦＥＶ１を改善しない患者に対する臨床的に有益な終点を明示した２０、２１。しかしながら、ＣａＣＣをターゲティングすることは期待できるものの、臨床的利点は未だ成し遂げられておらず、それが本発明者らがなぜ、より客観的な薬物手法についての本発明者らの研究に焦点を当てているかの理由である。
【0046】
事実、ｍｉＲＮＡをサイレンシングする、antagomiＲ又はＲＮＡスポンジ手法よりもさらに正確にするために、本発明者らは、ＡＮＯ１の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲＮＡ（１または複数）のターゲット部位（１または複数）をブロッキングするターゲット部位ブロッカー（ＴＳＢ）を、ｍｉＲＮＡ阻害を回避するために使用している９。本発明者らは、inＣＦ細胞株、及び世界中で最も流行している突然変異のＦ５０８ｄｅｌホモ接合の患者から得られた初代培養物における、ｍｉＲ－９によるＡＮＯ１レギュレーションを研究した。これらの細胞においてＴＳＢ ＡＮＯ１で、本発明者らはＡＮＯ１発現、クロライド活性、及び細胞遊走を増加させるのに成功している。興味深いことに、本発明者らがＣＦ細胞株及び気液インターフェースで分化された初代培養をＴＳＢ ＡＮＯ１でトランスフェクションすると、細胞の遊走率の増加が観察された。遊走は、修復プロセスの一部であり、そこで本発明者らは、ＴＳＢ ＡＮＯ１でのＣＦ患者の処置が気管支上皮の修復を改善し得るという仮説を立てた。本発明者らのデータは、嚢胞性線維症の処置のために本発明者らのターゲット部位ブロッカーを使用することの治療的潜在性を明示している。この手法の基本は、ＣＦ患者に提案される療法に関連して、何をするか、又はどのようにするか、のいずれかにつき革新的である。denufosolと対照的に、本発明者らはその分子生物学の知識を用いて新しく特有の手法を設計し、ｍｉＲＮＡを用いて１つの特有のターゲットタンパク質の発現を増加させている。そのチャレンジは、ＣＦのような複雑なシステムにおいてでもＡＮＯ１の強い活性を誘導できる、非常に特有の分子を生成させることであった。さらに熟考した後、本発明者らは安定性及び特異性のためにＬＮＡで修飾されたＴＳＢを使用して遺伝子発現をコントロールすることを決定している。そのため、本手法はＣＦＴＲ－突然変異非依存的であり、人工的なｍｉＲＮＡターゲット部位の使用が現状では新規（emerging）である。ＣＦが１９００を上回る異なる変異によって引き起こされることを考慮し、本発明者らはＡＮＯ１などのＣＦＴＲから独立した新しいターゲットを決定する試みを行っている。ｍｉＲＮＡが人体中の種々の液体につき安定であるとしても２２、２３、denufosolの手法は失敗に終わったので、ＣＦコンテクストの場合に薬物の分解はやはり決定的なポイントである。ｍｉＲＮＡツールへの価値ある追加はＬＮＡ（ロックド核酸）から来ており、これはリボース環がＮ型（Ｃ３’－エンド）コンフォメーションで化学的にロックされた、二環式の高親和性ＲＮＡ類似体である。ＬＮＡで修飾されたオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡターゲットとハイブリダイズすると高い熱安定性を持つので、この修飾は必須である２４、２５。ロックド核酸（ＬＮＡ）ベースのｍｉＲ－１２２のインヒビターである、MiravirsenはＣ型肝炎ウイルス感染の処置に対する臨床試験を現在受けているところである。肝臓特有のｍｉＲ－１２２の役割は、若干異常であり、；３’ＵＴＲをターゲティングしてシグナル抑制を引き起こす代わりに、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの５’ＵＴＲに結合してその複製を促進する。Miravirsenの効果はチンパンジーで試験されており、ＬＮＡで修飾された抗ｍｉＲＮＡは処置が終了した後８週間、２５週まで検出されているので、正確で無毒、且つ非常に安定であることが示されている。さらに、ＨＣＶ ＲＮＡレベルに対するMiravirsenの効果もまた、処置の終了時に長期化した２６。本発明者らの研究にとって、Miravirsenの成功はＣＦの場合に潜在的な臨床的手法を提案する例及び着想として役立つ。本発明者らの場合、ＴＳＢはマウスモデルにおいてでも気道で分析される異なるパラメータを補正することができる。本発明者らの条件では、最後の滴下注入の後７日、クロライド流出の活性化を観察することができる。安定性及び生理学的活性は本発明者らの薬物の主要ポイントである。当然、気道での薬物の投与の方法は、ＣＦ患者での使用に至適化されるべきである。
【0047】
嚢胞性線維症病態の処置のためにクロライド流出を活性化する薬物を開発する努力は進行中であるが、ＣＦ患者に存在する異なるＣＦＴＲ突然変異によって限定されている。本発明者らの知る限りでは、ＡＮＯ１のように代替的な塩素イオンチャネルを正確に補正する代替的な療法が提案されるのは、本願の実証が最初である。本願では、ｍｉＲ－９の種領域をターゲッティングするＴＳＢの使用は、嚢胞性線維症患者の処置のためのＡＮＯ１療法の潜在的利点を実証する。本願研究の他の主要な結果は、ＡＮＯ１をターゲッティングする短期間の処置が、嚢胞性線維症患者の上皮においてレギュレーション不全の異なる表現型因子を補正できることである。本発明者らは、ＡＮＯ１をターゲッティングするＴＳＢを用いた本手法には、ＣＦ患者のための代替的処置を提供する潜在性があると信じる。したがって、これらの結果は生理学をより理解することが患者にとって必須であることを明示する。
【0048】
参考文献：
本願の至るところで、種々の参考文献が本発明の属する技術分野の到達水準を表している。これらの参考文献の開示は、参照により本願明細書の開示に援用する。
本願の至るところで、種々の参考文献が本発明の属する技術分野の到達水準を表している。これらの参考文献の開示は、参照により本願明細書の開示に援用する。
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図4c】
【図4d】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8】
【配列表】