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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-02-28
(45)【発行日】2022-03-08
(54)【発明の名称】Ｔ細胞応答を促進するための方法
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20220301BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220301BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220301BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220301BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220301BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20220301BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20220301BHJP
C07D 491/22 20060101ALN20220301BHJP
C07H 15/252 20060101ALN20220301BHJP
C07D 475/08 20060101ALN20220301BHJP
C07D 498/18 20060101ALN20220301BHJP
C07D 305/14 20060101ALN20220301BHJP
C07D 519/04 20060101ALN20220301BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 D ZNA
A61K39/395 N
A61K38/17
A61K31/7088
A61P35/00
A61P37/04
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61K47/68
C07K16/28
C07D491/22
C07H15/252
C07D475/08
C07D498/18 311
C07D305/14
C07D519/04
【請求項の数】
11
(21)【出願番号】P 2019521034
(86)(22)【出願日】2017-10-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-01-30
(86)【国際出願番号】 EP2017076911
(87)【国際公開番号】W WO2018073440
(87)【国際公開日】2018-04-26
【審査請求日】2020-10-20
(31)【優先権主張番号】16306381.1
(32)【優先日】2016-10-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】17305988.2
(32)【優先日】2017-07-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】507002516
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）
(73)【特許権者】
【識別番号】507421289
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ナント
(73)【特許権者】
【識別番号】517118478
【氏名又は名称】オーエスイー・イミュノセラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】エリゼ・シフォロー
(72)【発明者】
【氏名】ジェラルディーヌ・テパッツ
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・ポワリエ
(72)【発明者】
【氏名】ベルナール・ヴァンオヴ
(72)【発明者】
【氏名】ヴァネッサ・ゴーティエ
【審査官】大島 彰公
(56)【参考文献】
【文献】J. Immunol.，2009年09月01日，Vol. 183, No. 5，p.3099-3108，https://www.jimmunol.org/content/183/5/3099
【文献】International Reviews of Immunology，2013年，Volume 32, Issue 2，p.134-156，https://www.tandfonline.com/doi/full/10.3109/08830185.2013.777065
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ０７Ｋ、Ｃ０７Ｄ、Ｃ０７Ｈ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
治療有効量のヒトCLEC-1のアンタゴニストを含む、がんに罹患しているヒト対象の治療のための医薬組成物であって、ヒトCLEC-1のアンタゴニストが、－抗体又はその抗原結合性断片；
－ヒトCLEC-1の機能的同等物であって、且つヒトCLEC-1の細胞外ドメイン又はヒトCLEC-1の細胞外ドメインと90%以上の同一率を有する配列を含む、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質；及び
－ヒトCLEC-1のアプタマー
からなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項2】
ヒト対象が、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳及び中枢神経系がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭及び下咽頭がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、口腔及び口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、膣がん、外陰がん、子宮がん、肝細胞がん、癌腫、グリオーマ、白血病、リンパ腫、及び肉腫からなる群から選択されるがんに罹患している、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項3】
ヒトCLEC-1のアンタゴニストがキメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒトモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項4】
抗体又はその抗原結合性断片がヒトCLEC-1の細胞外ドメインと特異的に結合する、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
ヒトCLEC-1の機能的同等物が免疫グロブリン定常ドメインと融合している、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
【請求項6】
T細胞応答を促進することによりがんを治療する、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
従来型がん治療と併用してヒトCLEC-1のアンタゴニストを使用する、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
化学療法剤、標的化がん療法、免疫療法剤、又は放射線療法からなる群より選択される作用物質と併用してヒトCLEC-1のアンタゴニストを使用する、請求項1から7のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
作用物質が、細胞毒性剤、抗血管新生剤、抗がん剤免疫原剤、細胞周期調節/アポトーシス制御剤、抗がん剤抗体、及びホルモン制御剤からなる群より選択される、請求項8に記載の医薬組成物。
【請求項10】
ヒトCLEC-1のアンタゴニストが、作用物質と同時に、別個に、又は逐次に投与される、請求項8又は9に記載の医薬組成物。
【請求項11】
T細胞応答を促進することができるCLEC-1アンタゴニストを同定する工程を含む、がんに罹患しているヒト対象を治療するために使用する化合物を調製する方法であって、アンタゴニストが、
－抗体又はその抗原結合性断片；
－ヒトCLEC-1の機能的同等物であって、且つヒトCLEC-1の細胞外ドメイン又はヒトCLEC-1の細胞外ドメインと90%以上の同一率を有する配列を含む、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、又はタンパク質；及び
－ヒトCLEC-1のアプタマー
からなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、T細胞応答を促進するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
2012年に世界中で820万人の死を占めた主な死因であるため、がんは大きな関心事である(世界がん白書、2014年、世界保健機構)。例えば、がんは米国内では第2の最も一般的な死因であり、これを上回るのは心疾患のみであり、4つの死あたりほぼ1つを占める(がんの事実と数字2015年、米国がん協会)。数多くの既存の治療が存在するが、改良されたがんの治療方法が依然として必要とされる。
【0003】
T細胞応答は抗腫瘍免疫応答の重要な要素となる。抗腫瘍T細胞応答は依然としてあまり知られていないが、幾つかの試験は、細胞毒性CD8型及びヘルパーCD4型応答が中枢的役割を果たすことを示した(Motz、GT and Coukos、G(2013年).Deciphering and reversing tumor immune suppression.Immunity39:61～73頁)(Bos、R and Sherman、LA(2010年).CD4+T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+T lymphocytes.Cancer Res70:8368～8377頁)(Tosolini、Mら、(2011年).Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells(Th1、Th2、Treg、Th17)in patients with colorectal cancer.Cancer Res71:1263～1271頁)。更にTh17細胞は、腫瘍に免疫細胞を動員すること、エフェクターCD8+T細胞を活性化すること、又は更に直接Th1表現型に転換すること及びIFN-γを産生することによって抗腫瘍免疫応答を誘導する(Th17 Cell Plasticity and Functions in Cancer Immunity、Leslie Guery and Stephanie Hugues、BioMed Research International、Volume2015(2015年))。
【0004】
特に、治療用抗腫瘍免疫を活性化するのに最も有望な手法は、免疫チェックポイントの遮断である。免疫チェックポイントは、自己免疫寛容を維持し付随組織損傷を最少にするのに重要な免疫系に直結した阻害経路の一部分を指す。腫瘍が免疫耐性の主要機構として特にミエロイド系細胞を介して特定免疫チェックポイント経路を経ることは現在明らかである(Couzin-Frankel 2013年;De Henau、Rauschら、2016年)。
【0005】
過去数年間の蓄積した証拠は、特にミエロイド系細胞の活性化を抑制し免疫回避を促進するための創傷治癒に関与する阻害性C型レクチン受容体(CLR)の生理学的プロセスを腫瘍が使用することを実証する。CLRは、腫瘍細胞による異常なグリコシル化だけでなく、死細胞によって放出される脂質、タンパク質又はDAMP等の更に多様なリガンドも認識する特殊性を有する(Geijtenbeek and Gringhuis 2009;Yan、Kamiyaら、2015年)。幾つかの実験試験は、細胞接着又はT細胞応答形成において、CLRがそれらの機能によってがんの進行と転移蔓延に貢献することを実証する(Yan、Kamiyaら、2015年;Ding、Yaoら、2017年)。例えば、免疫調節受容体DC-SIGN、MINCLE、DCIR及びBDCA-2はミエロイド系細胞の活性化、炎症を阻害し、Foxp3+CD4+CD25+Tregの膨張的増殖を誘導するのに重要であることが示されている(Yan、Kamiyaら、2015年;Ding、Yaoら、2017年)。DC-SIGNはほぼ全てのヒト癌腫において過剰発現されるがん胎児性抗原を認識し(Nonaka、Maら、2008年)、ミエロイド系細胞による免疫抑制性サイトカインIL-10及びIL-6の分泌を促進する。その上、DC-SIGN遺伝子プロモーターにおける多型性は、結腸直腸がん患者におけるリスクの増大と関連することが分かった(Lu、Bevierら、2013年)。MINCLEは膵管腺癌における腫瘍浸潤白血球において、及び特にミエロイド抑制細胞(MSC)によって増強することが示された。死細胞から放出されたSAP130(ヒストンデアセチラーゼ複合体のサブユニット)とMINCLEの連結は、強い腫瘍周辺抑制を誘導する(Seifert、Werbaら、2016年)。同様にCLRLOX-1は、がん患者中の血液又は腫瘍浸潤好中球の細胞表面で特異的に増強し(15～50%)、一方で健常ドナーの血液中ではほぼ検出不能であることが示されている(Condamine、Dominguezら、2016年)。この試験において彼らは、小胞体ストレスがLOX-1の発現を誘導し、強い抑制機能を有するMSCに好中球を転換することを示した。
【0006】
逆に、DECTIN-1等の活性化CLRのシグナル伝達の誘発は、抗腫瘍免疫をもたらしTreg及びMSCを減少させることが示されている(Tian、Maら、2013年)。β-グルカン、DECTIN-1のリガンドの投与は、ネズミ癌腫モデル(Li、Caiら、2010年;Masuda、Inoueら、2013年;Tian、Maら、2013年)、ヒトメラノーマ、神経芽腫、リンパ腫異種移植片モデル(Modak、Koehneら、2005年)、並びにヒト卵巣及び胃がん(Inoue、Tanakaら、1993年;Oba、Kobayashiら、2009年)において腫瘍増殖を阻害する。
【0007】
したがって、この微小環境内で特に誘導される標的阻害CLRは、ミエロイド系細胞活性化及び抗腫瘍免疫を増強するための有望な治療戦略となる。
【0008】
本発明者らは過去に、げっ歯類同種移植片免疫寛容のモデル(Thebault、Lhermiteら、2009年)においてC型レクチン様受容体-1(CLEC-1)が上方制御されることを確認した。CLEC-1はC型レクチン様受容体のDECTIN-1クラスターに属し(Plato、Willmentら、2013年)、はるか昔に確認されているが、リガンド及びシグナル伝達は依然として特徴付けられていない。CLEC-1はCLEC-2、DECTIN-1、CLEC-9A、MICL、MAH及びLOX-1を含めたCTLRのDECTIN-1クラスターに属し、はるか昔に確認されているが(Colonna M、Samaridis J、Angman L.Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors、one of which is selectively expressed in human dendritic cells.Eur J Immunol.2000年;30(2):697～704頁)、そのリガンド、下流シグナル伝達及び生物学的影響は依然として特徴付けられていない。CLEC-1は、細胞質尾部中に免疫受容体チロシンベース活性化(ITAM)又は阻害(ITIM)モチーフを含有しないが、特徴付けられていないシグナル伝達配列中にチロシン残基を含有する(Flornes LM、Nylenna O、Saether PC、Daws MR、Dissen E、Fossum S.The complete inventory of receptors encoded by the rat natural killer cell gene complex.Immunogenetics.2010年;62(8)521～530頁)。しかしながら、このモチーフがリン酸化を受けているかどうか、又は他のCTLRと同様に、CLEC-1が安定的発現及びシグナル伝達用にアダプター鎖を必要とするかは知られていない。CLEC-1はデクチン-1としてDC-SIGN又はCLEC-2三酸化モチーフ[DDD]も含有する。興味深いことに、この三酸化モチーフはデクチン-1に関して、Raf-1活性を調節し、大部分のCTLRによって誘導されるカスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質9(Card9)依存性NF-kB経路を抑制して、分泌サイトカインのセット及び後のTh1とTH17細胞分化のバランスをリプログラミングすることが示されている(Gringhuis SI、den Dunnen J、Litjens Mら、Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk.Nat Immunol.2009年;10(2)203～213頁)。ヒトCLEC-1タンパク質の発現、制御及び機能に関しては、これまでほとんど記載されていない。小胞体タンパク質と似た染色パターンがある内皮細胞の細胞内でのみヒトCLEC-1を検出可能であること、及びTGF-βも炎症刺激も細胞表面への有意な転位を促進できないことを記載した、CLEC-1の発現に関する唯一の刊行物が存在する(The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment.Sattlerら、ScandJImmunol.2012年Mar;75(3):282～92頁)。したがって、hCLEC-1に関する現況技術において利用可能な唯一の情報(即ち、内皮細胞中の細胞内局在化)は、当技術分野で知られていた情報(即ち、内皮細胞及びミエロイド系細胞の表面上に局在するrCLEC-1)とは正反対である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【文献】米国特許第4,816,567号
【文献】米国特許第5,225,539号
【文献】米国特許第5,585,089号
【文献】米国特許第5,693,761号
【文献】米国特許第5,693,762号
【文献】米国特許第5,859,205号
【文献】米国特許第5,591,669号
【文献】米国特許第5,598,369号
【文献】米国特許第5,545,806号
【文献】米国特許第5,545,807号
【文献】米国特許第6,150,584号
【文献】米国特許第5,565,332号
【文献】米国特許第5,573,905号
【文献】米国特許第5,229,275号
【文献】米国特許第5,567,610号
【文献】WO96/34103
【文献】WO94/04678
【文献】米国特許公開2007/0254295
【文献】米国特許第5,618,829号
【文献】米国特許第5,639,757号
【文献】米国特許第5,728,868号
【文献】米国特許第5,804,396号
【文献】米国特許第6,100,254号
【文献】米国特許第6,127,374号
【文献】米国特許第6,245,759号
【文献】米国特許第6,306,874号
【文献】米国特許第6,313,138号
【文献】米国特許第6,316,444号
【文献】米国特許第6,329,380号
【文献】米国特許第6,344,459号
【文献】米国特許第6,420,382号
【文献】米国特許第6,479,512号
【文献】米国特許第6,498,165号
【文献】米国特許第6,544,988号
【文献】米国特許第6,562,818号
【文献】米国特許第6,586,423号
【文献】米国特許第6,586,424号
【文献】米国特許第6,740,665号
【文献】米国特許第6,794,393号
【文献】米国特許第6,875,767号
【文献】米国特許第6,927,293号
【文献】米国特許第6,958,340号
【非特許文献】
【0010】
【文献】Motz、GT and Coukos、G(2013年).Deciphering and reversing tumor immune suppression.Immunity39:61～73頁
【文献】Bos、R and Sherman、LA(2010年).CD4+T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+T lymphocytes.Cancer Res70:8368～8377頁
【文献】Tosolini、Mら、(2011年).Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells(Th1、Th2、Treg、Th17)in patients with colorectal cancer.Cancer Res71:1263～1271頁
【文献】Th17 Cell Plasticity and Functions in Cancer Immunity、Leslie Guery and Stephanie Hugues、BioMed Research International、Volume2015(2015年)
【文献】Colonna M、Samaridis J、Angman L.Molecular characterization of two novel C-type lectin-like receptors、one of which is selectively expressed in human dendritic cells.Eur J Immunol.2000年;30(2):697～704頁
【文献】Flornes LM、Nylenna O、Saether PC、Daws MR、Dissen E、Fossum S.The complete inventory of receptors encoded by the rat natural killer cell gene complex.Immunogenetics.2010年;62(8)521～530頁
【文献】Gringhuis SI、den Dunnen J、Litjens Mら、Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk.Nat Immunol.2009年;10(2)203～213頁
【文献】The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment.Sattlerら、ScandJImmunol.2012年Mar;75(3):282～92頁
【文献】Kohler and Milstein(Nature、256:495、1975年)
【文献】Coding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice:Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology、Biochemistry and Immunology、3rd edition、Academic Press、ニューヨーク、1996年
【文献】Agnew Chem Intl.Ed.Engl.33:183～186頁(1994年)
【文献】Bystrynら、Clinical Cancer Research Vol.7、1882～1887頁、2001年7月
【文献】Uto Tら、Clec4A4 is a regulatory receptor for dendritic cells that impairs inflammation and T-cell immunity.Nat Commun.2016年;7:11273
【文献】Redelinghuys Pら、MICL controls inflammation in rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis.2015年
【文献】LeibundGut-Landmann Sら、Syk-and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin17.Nat Immunol.2007年;8(6)630～638頁
【文献】Lee EJら、Mincle Activation and the Syk/Card9 Signaling Axis Are Central to the Development of Autoimmune Disease of the Eye.J Immunol.2016年;196(7):3148～3158頁
【文献】Joo Hら、Opposing Roles of Dectin-1 Expressed on Human Plasmacytoid Dendritic Cells and Myeloid Dendritic Cells in Th2 Polarization.J Jmmunol.2015年;195(4):1723～1731頁
【文献】Ariizumi Kら、Identification of a novel、dendritic cell-associated molecule、dectin-1、by subtractive cDNA cloning.J Biol Chem.2000年;275(26):20157～20167頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明者らは、従来型DC(cDC)により細胞表面で、ヒト血液中で単球とDCの小サブセットによりCLEC-1が発現され、免疫抑制性サイトカインTGFβによって増強されることを初めて示した。本発明者らは、げっ歯類とヒトの両方で、CLEC-1はミエロイド系細胞中で阻害受容体として作用し、IL12p40発現並びに下流Th1及びTH17のin vivo応答を妨げることを実証した。
【0012】
本発明者らは、ヒトT細胞増殖及びヒトIFN-γは、CLEC-1のアンタゴニストとして抗hCLEC-1抗体を使用して増加することも示した。本発明者らは、CLEC-1に欠損があるマウスは腫瘍増殖に対する耐性が優れ、肝臓癌マウスモデルにおいて高い生存率を示すことも実証した。本発明者らは、ヒトCLEC-1がM2型腫瘍随伴マクロファージによって、胸膜中皮腫由来及び卵巣腫瘍腹水由来のミエロイド系細胞によって発現されることを示した。したがって、細胞表面受容体としてのCLEC-1は、臨床の場面において抗腫瘍免疫を増強するのに有用な治療ツールとなり得る。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、T細胞応答を促進するための方法に関する。特に本発明は、特許請求の範囲によって定義される。
【発明を実施するための形態】
【0014】
驚くことに、本発明者らはヒトDCにおけるCLEC-1の発現と機能を調べ、細胞表面発現を初めて実証した。本発明者らは、M2型腫瘍随伴マクロファージによって、胸膜中皮腫由来及び卵巣腫瘍腹水由来のミエロイド系細胞によって、ヒト中でhCLEC-1が発現されることも示した。本発明者らは、T細胞応答の編成の誘発後その機能的役割を調査した。
【0015】
更に本発明者らは、CLEC-1欠損ラット及びラットCLEC-1Fc融合タンパク質を用いて、DC機能及び下流T細胞免疫に対するCLEC-1シグナル伝達の妨害の結果をin vitro 及びin vivoで調査した。CLEC-1シグナル伝達の妨害はin vitroでTh17の活性化を増強し、in vivoではT細胞プライミング及びTh17とTh1の活性化を増強する。それらの結果は、DCにおけるCLEC-1は下流Th17及びTh1細胞活性化の程度と質を阻害し、細胞表面受容体としてT細胞応答を操作するための治療ツールとなり得ることを明らかに示す。本発明者らは、ヒトT細胞増殖及びヒトIFN-γは、CLEC-1のアンタゴニストとして抗hCLEC-1抗体を使用して増加することも示した。本発明者らは、CLEC-1に欠損があるマウスは腫瘍増殖に対する耐性が優れ、肝臓癌マウスモデルにおいて高い生存率を示すことも実証した。結果は、活性化閾値を上昇させることによって、CLEC-1がミエロイド系細胞において阻害性受容体の役割を果たすことを示す。CLEC-1の不活性化は、T細胞増殖及びTh1とTh17両方の分極化を増大させる。
【0016】
したがって、本発明の第一の態様は、それを必要とする対象においてT細胞応答を促進する方法であって、治療有効量のCLEC-1のアンタゴニストを対象に投与する工程を含む方法に関する。
【0017】
対象ががんに罹患している本発明による方法。
【0018】
本発明の別の態様は組成物、特に本発明のCLEC-1アンタゴニストを含む医薬組成物に関する。
【0019】
本明細書で使用する用語「T細胞」には当技術分野におけるその一般的な意味があり、細胞表面上にT細胞受容体を有し細胞媒介性免疫において中心的役割を果たすタイプのリンパ球であるTリンパ球を指す。
【0020】
本明細書で使用する用語「T細胞応答」は、T細胞増殖及び/又はサイトカイン合成に関与する任意の生物学的プロセスを指す。
【0021】
当業者によく知られている様々な方法によって、T細胞増殖及び/又はサイトカイン合成を評価することによってT細胞応答を決定することができる。一実施形態では、末梢血から単離した精製T細胞とCLEC-1を発現する同種異系単球由来樹状細胞の混合からなる白血球混合反応(MLR)を実施することによって、T細胞応答を決定する。T細胞の増殖はカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル希釈によって評価することができ、IFNγの発現はT細胞におけるフローサイトメトリーによって、及び上清におけるELISAによって評価することができる。
【0022】
本明細書で使用する用語「対象」は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類等の哺乳動物を指す。本発明による対象は、ヒトであることが好ましい。
【0023】
用語「がん」には当技術分野におけるその一般的な意味があり、異常な細胞増殖に関与し身体の他の部分に侵入又は蔓延する可能性がある疾患群を指す。用語「がん」は、原発性がんと転移性がんの両方を更に包含する。本発明の方法及び組成物によって治療できるがんの例は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮由来のがん細胞を非制限的に含む。更に、がんは具体的には以下の組織病理型であり得るが、これら、新生物、悪性、癌腫、癌腫、未分化、巨細胞及び紡錘細胞癌、小細胞癌、乳頭癌、扁平上皮癌、リンパ上皮腫癌、基底細胞癌、毛母癌、移行上皮癌、移行上皮乳頭腫、腺癌、ガストリノーマ、悪性、胆管癌、肝細胞癌、複合肝細胞癌胆管癌、小柱腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫性ポリープ内腺癌、腺癌、家族性大腸腺腫症、固形癌、カルチノイド腫瘍、悪性、細気管支-肺胞性腺癌、乳頭腺癌、色素嫌性腺腫、好酸性癌、酸親和性腺癌、好塩基性癌、明細胞腺癌、顆粒膜細胞癌、濾胞状腺癌、乳頭及び濾胞状腺癌、非被包型硬化性癌、副腎皮質癌、子宮内膜癌、皮膚付属器癌、アポクリン腺癌、皮脂腺癌、耳道腺癌、粘膜表皮癌、嚢胞腺癌、乳頭状嚢胞腺癌、乳頭状漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、粘液性腺癌、印環細胞癌、浸潤性導管癌、髄様癌、小葉癌、炎症性癌、パジェット病、乳房、腺房細胞癌、腺扁平上皮癌、扁平上皮異形成がある腺癌、胸腺腫、悪性、卵巣胃腫瘍、悪性、テコーマ、悪性、顆粒膜細胞癌、悪性、及びロブラストーマ(roblastoma)、悪性、セルトリ細胞癌、ライディッヒ細胞腫瘍、悪性、脂質細胞腫瘍、悪性、パラガングリオーマ、悪性、乳房外パラガングリオーマ、悪性、クロム親和性細胞腫、グロムス血管肉腫、悪性メラノーマ、メラニン欠乏性メラノーマ、表在拡大型メラノーマ、巨大色素性母斑内悪性メラノーマ、類上皮細胞メラノーマ、青色母斑、悪性、肉腫、線維肉腫、線維組織球腫、悪性、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胎児型横紋筋肉腫、肺胞横紋筋肉腫、間質肉腫、混合腫瘍、悪性、ミュラー管混合腫瘍、腎芽腫、肝芽腫、癌肉腫、間葉腫、悪性、ブレンナー腫瘍、悪性、葉状腫瘍、悪性、滑膜肉腫、悪性、中皮腫、悪性、ジスゲルミノーマ、胎児性癌、奇形腫、悪性、卵巣甲状腺腫、悪性、絨毛癌、中腎腫、悪性、血管肉腫、血管内皮肉腫、悪性、カポジ肉腫、血管周囲細胞腫、悪性、リンパ管肉腫、骨肉腫、隣接骨皮質肉腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、悪性、間葉性軟骨肉腫、骨巨細胞腫、ユーイング肉腫、歯原性腫瘍、悪性、エナメル上皮腫軟骨肉腫、エナメル上皮腫、悪性、エナメル上皮線維肉腫、松果体腫、悪性、脊索腫、グリオーマ、悪性、脳室上衣腫、星状細胞腫、原形質性星細胞腫、線維性星細胞腫、星状芽細胞腫、グリオブラストーマ、乏突起膠腫、乏突起膠芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、小脳肉腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、嗅神経腫瘍、髄膜腫、悪性、神経線維肉腫、神経鞘腫、悪性、顆粒細胞腫瘍、悪性、悪性リンパ腫、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、パラグラニュローマ(paragranuloma)、悪性リンパ腫、小リンパ球性、悪性リンパ腫、巨細胞、びまん性、悪性リンパ腫、濾胞性、菌状息肉症、他の指定非ホジキンリンパ腫、悪性組織球症、多発性骨髄腫、マスト細胞肉腫、免疫増殖性小腸疾患、白血病、リンパ性白血病、形質細胞白血病、赤白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、骨髄性白血病、好塩基球性白血病、好酸球性白血病、単球性白血病、マスト細胞白血病、巨核芽球性白血病、骨髄性肉腫、及びヘアリー細胞白血病だけには限られない。
【0024】
幾つかの実施形態では、対象は胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳及び中枢神経系がん、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、胆嚢がん、胃腸カルチノイド腫瘍、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭及び下咽頭がん、肝臓がん、肺がん、中皮腫、形質細胞腫、鼻腔及び副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、口腔及び口腔咽頭がん、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体がん、前立腺がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、皮膚がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、膣がん、外陰がん、及び子宮がんからなる群から選択されるがんに罹患している。
【0025】
一実施形態では、がんは肝臓がんである。
【0026】
一実施形態では、がんは肝細胞がんである。
【0027】
一実施形態では、がんは卵巣がんである。
【0028】
一実施形態では、がんはグリオーマである。
【0029】
本明細書で使用する「治療」又は「治療する」は、臨床結果を含めた有益又は望ましい結果を得るための手法である。本発明の目的では、有益又は望ましい臨床結果には、以下の疾患が原因で生じた一つ又は複数の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の安定化(例えば、疾患の悪化の予防又は遅延)、疾患の蔓延の予防又は遅延、疾患の再発の予防又は遅延、疾患の進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善、疾患の(部分的又は完全)寛解の出現、疾患を治療するのに必要な一つ又は複数の他の医薬品の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、及び/又は生存期間の延長の一つ又は複数があるが、これらだけには限られない。用語「治療」は予防的治療を包含する。本明細書で使用する用語「予防」は、所与の状態を経験又は発症するリスクの低減を指す。
【0030】
本明細書で使用する用語「CLEC-1」には当技術分野におけるその一般的な意味があり、特に哺乳動物種由来のC型レクチン様受容体-1、より詳細にはヒトCLEC-1を指す。CLEC-1はCLEC-2、DECTIN-1、CLEC-9A、MICL、MAH及びLOX-1を含めたC型レクチン様受容体(CTLR)のDECTIN-1クラスターに属する。
【0031】
用語「ヒトCLEC-1」は、Q8NC01 Uniprot受託番号によって参照され51267NCBI受託番号によって参照されるCLEC1A遺伝子によってコードされるアミノ酸配列のタンパク質を指すことが好ましい。
【0032】
詳細には、CLEC-1アンタゴニストはヒトCLEC-1のアンタゴニストである。
【0033】
本明細書で使用する用語「CLEC-1アンタゴニスト」には当技術分野におけるその一般的な意味があり、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減する任意の天然又は合成化合物を指す。特にCLEC-1アンタゴニストは、受容体CLEC-1と少なくとも一つのそのリガンド、より詳細にはその全リガンドの間の相互作用を阻害する。より詳細にはCLEC-1アンタゴニストは、受容体CLEC-1又はそのリガンドのいずれか一つに結合することができる。CLEC-1アンタゴニストはT細胞応答を増強し、特にT細胞増殖及び/又はIFNγ等のサイトカイン合成を増大する。
【0034】
例えばCLEC-1アンタゴニストは、
a)それらの表面上でCLEC-1を発現する複数の細胞を提供する工程、
b)候補化合物と前記細胞をインキュベートする工程、
c)前記候補化合物がCLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減するかどうか、特に前記候補化合物がT細胞応答を促進するかどうか決定する工程、
及びd)CLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減して特にT細胞応答を促進する候補化合物を選択する工程
からなる工程を含む方法によって確認することができる。
a)それらの表面上でCLEC-1を発現する複数の細胞を提供する工程、
b)候補化合物と前記細胞をインキュベートする工程、
c)前記候補化合物がCLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減するかどうか、特に前記候補化合物がT細胞応答を促進するかどうか決定する工程、
及びd)CLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減して特にT細胞応答を促進する候補化合物を選択する工程
からなる工程を含む方法によって確認することができる。
【0035】
幾つかの実施形態では、CLEC-1アンタゴニストは小有機分子である。用語「小有機分子」は、製薬において一般に使用される有機分子に匹敵する大きさの分子を指す。この用語は、生物学的マクロ分子(例えばタンパク質、核酸等)は除外する。好ましい小有機分子は、最大約5000Da、より詳細には最大約2000Da、及び最も詳細には最大約1000Daの大きさの範囲にある。
【0036】
幾つかの実施形態では、CLEC-1アンタゴニストは抗体又はその抗原結合性断片である。幾つかの実施形態では、CLEC-1アンタゴニストは、CLEC-1と特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片である。
【0037】
本明細書で使用する用語「と特異的に結合する」又は「特異的に結合する」は、少なくとも約1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M又はそれ以上のアフィニティーで抗原と結合する、又は更に、及び/又は非特異的抗原に対するそのアフィニティーより少なくとも2倍大きいアフィニティーで標的と結合する抗原受容体の能力を指す。
【0038】
当業者によく知られている様々な方法によって、アフィニティーを決定することができる。これらの方法には、Biacore解析、Blitz解析及びスキャッチャードプロットがあるが、これらだけには限られない。
【0039】
一実施形態では、本発明による抗体又はその抗原結合性断片は、10-8M以下、好ましくはCLEC-1に関して、特にヒトCLEC-1に関して10-9M以下、より好ましくは1.10-10M以下のKD値を有し、これはバイオセンサー解析によって、特にBiacore解析によって決定することができる。
【0040】
幾つかの実施形態では、CLEC-1のアンタゴニスト、特に本発明による抗体又はその抗原結合性断片は、CLEC-1、特にヒトCLEC-1の細胞外ドメインと特異的に結合する。
【0041】
一実施形態では、ヒトCLEC-1の細胞外ドメインのアミノ酸配列はYYQLSNTGQDTISQMEERLGNTSQELQSLQVQNIKLAGSLQHVAEKLCRELYNKAGAHRCSPCTEQWKWHGDNCYQFYKDSKSWEDCKYFCLSENSTMLKINKQEDLEFAASQSYSEFFYSYWTGLLRPDSGKAWLWMDGTPFTSELFHIIIDVTSPRSRDCVAILNGMIFSKDCKELKRCVCERRAGMVKPESLHVPPETLGEGD(配列番号1)である。
【0042】
一実施形態では、CLEC-1のアンタゴニストによって、特に本発明の抗体又はその抗原結合性断片によって認識されるアミノ酸配列はCERRAGMVKPESLHVPPETLGEGD(配列番号2)である。
【0043】
本明細書で使用する「抗体」は、天然と非天然抗体の両方を含む。具体的には、「抗体」はポリクローナル、モノクローナル、(キメラとヒト化を含めた)組換え、二重特異性、多重特異性及び修飾抗体、並びに一価及び二価抗体、それらの抗原結合性断片を含む。更に、「抗体」はキメラ抗体、完全合成抗体、単鎖抗体、及びそれらの断片を含む。抗体はヒト又は非ヒト抗体であってよい。非ヒト抗体を組換え法によりヒト化して、人間におけるその免疫原性を低減することができる。
【0044】
本明細書で使用する「修飾抗体」は、抗体又はその抗原結合性断片を含む分子に相当し、前記抗体又はその断片は機能的に異なる分子と結合する。
【0045】
本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体はキメラ抗体である。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体の軽鎖を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体の重鎖を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体のFab部分を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体のF(ab')2部分を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体のFc部分を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体のaFv部分を含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体の可変ドメインを含む。本明細書に記載する抗体又はその一部分の一実施形態では、抗体の一部分は抗体の一つ又は複数のCDRドメインを含む。
【0046】
抗体は従来の方法に従い調製される。Kohler and Milstein(Nature、256:495、1975年)の方法を使用してモノクローナル抗体を作製することができる。本発明中で有用なモノクローナル抗体を調製するため、マウス又は他の適切な宿主動物に、抗原型のCLEC-1を用いて(例えば1週間に2回、1週間に1回、1ヶ月に2回又は1ヶ月に1回)適切な間隔で免疫処置する。屠殺1週間以内に、動物に抗原の最終「ブースト」を施すことができる。免疫処置中に免疫原性アジュバントを使用することが望ましい場合が多い。適切な免疫原性アジュバントには、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン、Ribiアジュバント、Hunter's Titermax、QS21若しくはQuilA等のサポニンアジュバント、又はCpG含有免疫刺激性オリゴヌクレオチドがある。他の適切なアジュバントは当技術分野でよく知られている。皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、鼻腔内又は他の経路によって動物に免疫処置することができる。多数の経路により多数の型の抗原を用いて、所与の動物に免疫処置することができる。簡単に言うと、組換え細胞株での発現によって、組換えCLEC-1を提供することができる。特に、その表面上でCLEC-1を発現するヒト細胞の型でCLEC-1を提供することができる。免疫処置レジメンに従い、動物の脾臓、リンパ節又は他の器官からリンパ球を単離し、ポリエチレングリコール等の作用物質を使用し適切なミエローマ細胞株と融合させてハイブリドーマを形成する。融合後、記載されたように(Coding、Monoclonal Antibodies:Principles and Practice:Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology、Biochemistry and Immunology、3rd edition、Academic Press、ニューヨーク、1996年)、標準的な方法を使用して、融合パートナーではなくハイブリドーマの増殖を許容する培地中に細胞を配置する。ハイブリドーマの培養後、所望の特異性の抗体、即ち抗原に特異的に結合する抗体の存在に関して細胞上清を分析する。適切な分析技法には、ELISA、フローサイトメトリー、免疫沈降法、及びウエスタンブロッティングがある。他のスクリーニング技法は当技術分野でよく知られている。好ましい技法は、非変性ELISA、フローサイトメトリー、及び免疫沈降法等の、立体配座が完全で、原型フォールディング状態の抗原と抗体の結合を確認する技法である。
【0047】
一実施形態では、CLEC-1のアンタゴニストはキメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒトモノクローナル抗体からなる群から選択される。
【0048】
一実施形態では、本発明の抗体はキメラ抗体、特にキメラマウス/ヒト抗体である。本発明によれば、用語「キメラ抗体」は、非ヒト抗体のVHドメインとVLドメイン、及びヒト抗体のCHドメインとCLドメインを含む抗体を指す。
【0049】
幾つかの実施形態では、抗体はヒト化抗体、特にヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用する「ヒト化」は、そのタンパク質配列が修飾されヒト中で自然に生じた抗体変異体とのその同一率が増大した、非ヒト種から産生された抗体を記載する。動物中、特にげっ歯類及び詳細にはラット中で元来得られているので、動物の免疫処置及び抗体、特にハイブリドーマからモノクローナル抗体の産生後、フレームワーク中、及び任意選択で更にCDR配列中のアミノ酸残基の置換により、それらのVH及び/又はVL配列において次いで抗体を修飾してヒト化抗体を得る。特に、前記ヒト化抗体は、原型CDR領域に関して個別に考慮したCDR領域中に、10%未満の突然変異アミノ酸残基、好ましくは1個又はゼロ個のアミノ酸残基を有する。ヒト化の方法には、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第4,816,567号、米国特許第5,225,539号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、米国特許第5,693,762号及び米国特許第5,859,205号中に記載された方法があるが、これらだけには限られない。
【0050】
幾つかの実施形態では、抗体は完全ヒト抗体、特に完全ヒトモノクローナル抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分がトランスジェニックであるマウスを免疫処置することによって調製することもできる。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第5,591,669号、米国特許第5,598,369号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,545,807号、米国特許第6,150,584号、及びこれらの中で引用された参照文献を参照。これらの動物は、内在(例えば、ネズミ)抗体の産生に機能的欠失があるように遺伝子改変されている。これらの動物の免疫処置が目的の抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすように、これらの動物を更に修飾して、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子座の全体又は一部分を含有させる。これらのマウス(例えば、XenoMouse(Abgenix)、HuMAbマウス(Medarex/GenPharm))の免疫処置後、標準ハイブリドーマ技術に従いモノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトへの投与時にヒト抗マウス抗体(KAMA)応答を誘発しない。ヒト抗体を産生するためのin vitro法も存在する。これらはファージディスプレイ技術(米国特許第5,565,332号及び米国特許第5,573,905号)、及びヒトB細胞のin vitro刺激(米国特許第5,229,275号及び米国特許第5,567,610号)を含む。これらの特許の内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【0051】
様々な抗体分子及び断片は、IgA、分泌型IgA、IgE、IgG及びIgMを非制限的に含めた一般に知られている免疫グロブリンクラスのいずれかに由来し得る。IgGのサブクラスも当業者にはよく知られており、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を非制限的に含む。
【0052】
別の実施形態では、本発明による抗体は単一ドメイン抗体である。用語「単一ドメイン抗体」(sdAb)又は「VHH」は、軽鎖を元来欠きラクダ科の哺乳動物において見ることができる、一つの重鎖可変ドメインタイプの抗体を指す。このようなVHHは「ナノボディ(登録商標)」とも呼ばれる。
【0053】
幾つかの実施形態では、本発明の抗体は抗体依存性細胞介在性細胞障害作用を媒介せず、したがって抗体依存性細胞性細胞障害作用(ADCC)を誘導するFc部分は含まない。幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、CLEC-1を発現する細胞の枯渇を直接的又は間接的にもたらさない(例えば、CLEC-1を発現する細胞数の10%、20%、50%、60%又はそれより大きな排除又は減少をもたらさない)。幾つかの実施形態では、本発明の抗体はFcドメインを欠いており(例えば、CH2及び/又はCH3ドメインを欠いており)、又はIgG2若しくはIgG4アイソタイプのFcドメインを含む。
【0054】
本明細書で使用する用語「抗体依存性細胞介在性細胞障害作用」又は「ADCC」は、非特異的細胞毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上に結合した抗体を認識し後に標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在性反応を指す。何らかの特定の作用機構によって拘束されたくないが、ADCCを介在するこれらの細胞毒性細胞はFc受容体(FcR)を一般的に発現する。
【0055】
本明細書で使用する用語、CLEC-1を発現する細胞に関する「枯渇」は、試料若しくは対象中に存在するCLEC-1発現細胞の数に負の影響を与えるような、殺傷、排除、溶解が可能である、又はこのような殺傷、排除若しくは溶解が可能である、プロセス、方法、又は化合物を意味する。
【0056】
一実施形態では、CLEC-1アンタゴニストは抗原結合性抗体模倣体である。
【0057】
本明細書で使用する用語「抗原結合性抗体模倣体」は、抗体のそれと似た抗原と結合する能力がある人工タンパク質、ペプチド、及び任意の化学化合物を指す。
【0058】
このような模倣体は、アフィチン及びアンチカリン並びにアプタマー(ペプチドアプタマー及びオリゴヌクレオチドアプタマー)を含む。
【0059】
一実施形態では、CLEC-1アンタゴニストはアプタマーである。アプタマーは、分子認識の点で抗体の代替となるクラスの分子である。アプタマーは、高いアフィニティーと特異性でほぼ任意のクラスの標的分子を認識する能力がある、オリゴヌクレオチド又はオリゴペプチド配列である。このようなリガンドは、ランダム配列ライブラリーのSystematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment(SELEX)によって単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、DNAのコンビナトリアルケミストリー合成によって得られる。このライブラリー中、それぞれのメンバーは、最終的に化学修飾される独自配列の直鎖状オリゴマーである。ペプチドアプタマーは、2ハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーから選択される、大腸菌チオレドキシンA等のプラットフォームタンパク質によって示される立体配座が制約された抗体可変領域からなる。
【0060】
幾つかの実施形態では、CLEC-1アンタゴニストはポリペプチドである。
【0061】
本明細書において用語「ポリペプチド」は、具体的な長さを有さないアミノ酸のポリマーを意味する。したがって、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質が「ポリペプチド」の定義内に含まれ、これらの用語は本明細書全体、及び特許請求の範囲において同義で使用する。用語「ポリペプチド」は、リン酸化、アセチル化、グリコシル化等を非制限的に含む翻訳後修飾を除外するわけではない。
【0062】
一実施形態では、本発明のポリペプチドは2～200アミノ酸で構成される長さを有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、2～190、詳細には10～180、10～170、10～160、10～150、10～140、10～130、10～120、10～110アミノ酸で構成される長さを有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、10～100アミノ酸で構成される長さを有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、50～100アミノ酸で構成される長さを有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99又は100アミノ酸の長さを有する。
【0063】
詳細な実施形態では、ポリペプチドはCLEC-1の機能的同等物である。本明細書で使用するCLEC-1の「機能的同等物」は、少なくとも一つのCLEC-1リガンドと結合し、それによってCLEC-1とのその相互作用を防止できる化合物である。用語「機能的同等物」は、CLEC-1の断片、突然変異体、及びムテインを含む。したがって用語「機能的同等物」は、タンパク質アナログがそのリガンドに結合する能力を保持するようなアミノ酸配列の改変によって、例えば一つ又は複数のアミノ酸欠失、置換又は付加によって得られるCLEC-1の任意の同等物を含む。例えばそのアミノ酸配列をコードするDNAの点突然変異によって、アミノ酸置換を行うことができる。
【0064】
機能的同等物は、CLEC-1のリガンドを捕捉できる可溶性受容体を形成するように、CLEC-1のリガンドと結合しCLEC-1の細胞外ドメインの全体又は一部分を含む分子を非制限的に含む。したがって、機能的同等物は可溶型のCLEC-1を含む。適切な可溶型のこれらのタンパク質、又はその機能的同等物は、例えば化学的、タンパク質分解又は組換え法によりそこから膜貫通ドメインが除去された切断型のタンパク質を含み得る。特に、対応するタンパク質の全長にわたりその対応するタンパク質と、少なくとも80%の同一率、より詳細には少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%及び更により詳細には少なくとも99%の同一率を有する配列からなる機能的同等物。本明細書で使用する用語「対応するタンパク質」は、本発明の機能的同等物が同様の機能を有するタンパク質を指す。本発明の提示において言及する同一率は、例えばNeedleman and Wunsch 1970のアルゴリズムを使用して、比較する配列の全体アライメントに基づいて、即ちその全長にわたる配列のアライメントに基づいて決定する。この配列比較は、例えば10.0に等しいパラメーター「Gap open」、0.5に等しいパラメーター「Gap Extend」、及びマトリックス「BLOSUM62」の使用によりニードルソフトウエアを使用して行うことができる。ニードル等のソフトウエアは、「ニードル」の名称の下、世界規模のウエブサイトebi.ac.uk上で利用可能である。本明細書で使用する用語「機能的に同等な断片」は、CLEC-1のリガンドと結合するCLEC-1の任意の断片又は断片のアセンブリーも意味し得る。したがって本発明は、少なくとも一つのCLEC-1のリガンドとCLEC-1の結合を阻害することができるポリペプチド、特に機能的同等物を提供し、このポリペプチドは、CLEC-1のリガンドと結合するCLEC-1の細胞外ドメインの少なくとも一部分の配列に対応する配列を有する連続アミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、ポリペプチド、特に機能的同等物はCLEC-1の細胞外ドメインに対応する。
【0065】
幾つかの実施形態では、CLEC-1の機能的同等物を異種ポリペプチドと融合させて融合タンパク質を形成する。本明細書で使用する「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド(即ち、同一ポリペプチド以外のポリペプチド)に作動可能に連結した本発明の(典型的には生物活性)機能的同等物の全体又は一部分を含む。融合タンパク質内で、用語「～に作動可能に連結した」は、本発明の機能的同等物と異種ポリペプチドが互いにインフレームで融合したことを示すものとする。異種ポリペプチドは、本発明の機能的同等物のN末端又はC末端に融合することができる。
【0066】
幾つかの実施形態では、CLEC-1の機能的同等物を免疫グロブリン定常ドメイン(Fc領域)と融合させてイムノアドヘシンを形成する。イムノアドヘシンは、ヒト抗体の多くの重要な化学的及び生物学的性質を有し得る。イムノアドヘシンは、適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン(Fc)配列と連結し所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、目的の結合特異性は完全ヒト成分を使用して得ることができる。このようなイムノアドヘシンは患者に対する免疫原性が最小であり、慢性的又は反復使用するのに安全である。幾つかの実施形態では、Fc領域は原型配列Fc領域である。幾つかの実施形態では、Fc領域は変異体Fc領域である。更に別の実施形態では、Fc領域は機能性Fc領域である。本明細書で使用する用語「Fc領域」は、原型配列Fc領域及び変異体Fc領域を含めた、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用する。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変わり得るが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、位置Cys226におけるアミノ酸残基から、又はPro230から、そのカルボキシ末端に延長すると通常定義される。イムノアドヘシンの接着部分と免疫グロブリン配列部分は、最小リンカーによって連結することができる。免疫グロブリン配列は典型的には、必ずではないが免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラ中の免疫グロブリン部分は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブタイプ、IgA、IgE、IgD又はIgM、ただし典型的にはIgG1又はIgG4から得ることができる。幾つかの実施形態では、CLEC-1の機能的同等物とイムノアドヘシンの免疫グロブリン配列部分を最小リンカーによって連結させる。本明細書で使用する用語「リンカー」は、本発明のポリペプチドと免疫グロブリン配列部分を連結する少なくとも一つのアミノ酸の配列を指す。このようなリンカーは立体障害を予防するのに有用であり得る。幾つかの実施形態では、リンカーは4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18;19;20;21;22;23;24;25;26;27;28;29;30アミノ酸残基を有する。しかしながら、上限は重要ではなく、ただし例えばこのようなポリペプチドの生物学的薬剤生産に関して便宜上選択される。リンカー配列は、天然配列又は非天然配列であってよい。治療目的で使用する場合、イムノアドヘシンを投与する対象において、リンカーは典型的には非免疫原性である。一つの有用なリンカー配列群は、WO96/34103及びWO94/04678中に記載された重鎖抗体のヒンジ領域由来のリンカーである。他の例はポリ-アラニンリンカー配列である。
【0067】
本発明のポリペプチドは、当業者には明らかであるように、任意の適切な手段によって生成することができる。本発明に従い使用するのに充分な量のポリペプチドを生成するため、本発明のポリペプチドを含有する組換え宿主細胞を適切な条件下で培養することにより、好都合に発現を行うことができる。詳細には、組換え手段によって、コード核酸分子からの発現によってポリペプチドを生成する。様々な異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニング及び発現用の系はよく知られている。組換え型で発現されるとき、ポリペプチドは詳細には、宿主細胞中のコード核酸からの発現によって生成する。特定系の個々の要件に応じて、任意の宿主細胞を使用することができる。適切な宿主細胞には、細菌哺乳動物細胞、植物細胞、酵母及びバキュロウイルス系がある。異種ポリペプチドの発現用の当技術分野で利用可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞及び多くの他の細胞株がある。細菌は容易に操作及び増殖することができるので、細菌も組換えタンパク質を生成するのに好ましい宿主である。一般的な、好ましい細菌宿主は大腸菌である。
【0068】
本発明による本発明のポリペプチド、その断片及び融合タンパク質は、グリコシル化、(例えば、N結合型又はO結合型グリコシル化)、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化及びリン酸化(例えば、セリン/スレオニン又はチロシン)だけには限られないが、これらを含めた翻訳後修飾を示し得る。
【0069】
幾つかの実施形態では、本発明の治療方法において使用するポリペプチドを修飾して、それらの治療有効性を改善することができると企図される。治療用化合物のこのような修飾を使用して、毒性を低減する、循環時間を増大する、又は生体内分布を改変することができる。例えば、おそらく重要である治療用化合物の毒性を、生体内分布を改変する様々な薬物担体賦形剤との併用によって有意に低減することができる。
【0070】
本発明の更なる態様は、それを必要とする対象において特にT細胞応答を促進することによりがんを治療する方法であって、治療有効量のCLEC-1のアンタゴニストを対象に投与する工程を含む方法に関する。
【0071】
したがって本発明は、特にT細胞応答を促進することによるがんの治療において使用するためのCLEC-1のアンタゴニストに関する。
【0072】
したがって本発明は、特にT細胞応答を促進することによるがんの治療用の医薬品を製造するための、CLEC-1のアンタゴニストの使用に関する。
【0073】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを対象に治療有効量投与する。
【0074】
用語「投与する」又は「投与」は、物質(例えば、本発明のCLEC-1アンタゴニスト)が体外に存在するとき、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内、関節内送達、及び/又は、本明細書に記載する若しくは当技術分野で知られる任意の他の物理的送達法等により、対象にその物質を注射又は他の場合物理的に送達する作用を指す。疾患、又はその症状を治療するとき、典型的には、物質の投与は疾患又はその症状の発症後に行う。疾患、又はその症状を予防するとき、典型的には、物質の投与は疾患又はその症状の発症前に行う。
【0075】
「治療有効量」とは、任意の医学的治療に適用可能な妥当なベネフィット/リスク比で、がんの治療方法において使用するのに充分なCLEC-1アンタゴニストの量を意味する。本発明の化合物及び組成物の日々の全体的使用が、正常な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることは理解されよう。任意の特定対象に関する具体的な治療有効用量レベルは、がんの重症度、対象の年齢、体重、一般的健康状態、性別及び食生活、投与の時間、投与の経路、及び利用する具体的化合物の排出率、治療の期間、及び医療分野でよく知られている同様の要因を含めた様々な要因に依存する。例えば、所望の治療効果を得るのに必要なレベルより低いレベルの化合物用量で開始すること、及び所望の効果を得るまで用量を徐々に増大することは当技術分野内ではよく知られている。しかしながら、製品の1日あたりの用量は、1日あたり成人あたり0.01～1,000mgの広範囲にわたり変わる可能性がある。典型的には、組成物は治療対象に対する対症的用量調節のため0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250及び500mgの活性成分を含有する。典型的には医薬品は、約0.01mg～約500mgの活性成分、典型的には1mg～約100mgの活性成分を含有する。有効量の薬物は1日あたり体重1kgあたり0.0002mg～約20mg、特に1日あたり体重1kgあたり約0.001mg～7mgの用量レベルで通常供給される。
【0076】
本発明による組成物は、非経口、経皮、経口、直腸、皮下、舌下、局所又は鼻腔内投与用に製剤化する。
【0077】
適切な単位投与型は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁液又は溶液等の経口経路型、舌下及び口腔投与型、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮膚下、経皮、クモ膜下、及び鼻腔内投与型、及び直腸投与型を含む。
【0078】
一実施形態では、本発明による組成物、特に医薬組成物を非経口投与用に製剤化する。医薬組成物は、薬学的に許容される注射可能な製剤用の賦形剤を含有する。これらは特に、等張、滅菌、食塩水溶液(リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウム等、又はこのような塩の混合物)、又は添加時に場合に応じて注射溶液を構成し得る、乾燥、特に滅菌水若しくは生理食塩水の凍結-乾燥組成物であってよい。
【0079】
好ましい実施形態では、本発明による組成物を静脈内投与用に製剤化する。別の実施形態では、本発明による組成物を経口投与用に製剤化する。
【0080】
典型的には、本発明の活性成分(即ち、CLEC-1アンタゴニスト)を薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択で生分解性ポリマー等の徐放性マトリックスと併用して、医薬組成物を形成する。
【0081】
用語「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適切に投与したとき、有害、アレルギー又は他の面倒な反応を引き起こさない分子体及び組成物を指す。
【0082】
薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意のタイプの非毒性固体、半固体又は液状充填剤、希釈剤、被包材料又は製剤助剤を指す。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液状ポリエチレングリコール等)、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えばレシチン等のコーティングを使用すること、分散の場合は必要な粒径を維持すること、及び界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チロメサール等によって行うことができる。多くの場合、等張剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物中での使用によって、注射用組成物の長時間吸収をもたらすことができる。
【0083】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを、第2の活性成分と併用して対象に投与する。
【0084】
前記第2の活性成分には、以下に記載するプロバイオティクス及び治療剤があるが、これらだけには限られない。
【0085】
したがって本発明は、がんの治療において使用するための、第2の活性成分とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0086】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを、標準(従来型)治療剤と併用して対象に投与する。したがって本発明は、がんの治療において使用するための、従来型治療剤とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0087】
本明細書で使用する用語「標準又は従来型治療」は、通常がんに罹患した対象に施す任意のがん治療(薬物、放射線療法等)を指す。
【0088】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを、例えばがん治療用の少なくとも一つの更なる治療剤と併用して対象に投与する。このような投与は同時、別個又は逐次であってよい。同時投与に関しては、一つの組成物として、又は別個の組成物として、適切に作用物質を投与することができる。更なる治療剤は、典型的には治療する障害に妥当なものである。例示的治療剤には、他の抗がん剤抗体、細胞毒性剤、化学療法剤、抗血管新生剤、抗がん剤免疫原、細胞周期調節/アポトーシス制御剤、ホルモン制御剤、及び以下に記載する他の作用物質がある。
【0089】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを、化学療法剤、標的化がん療法剤、免疫療法剤又は放射線療法と併用して使用する。
【0090】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを化学療法剤と併用して使用する。したがって本発明は、がんの治療において使用するための、化学療法剤とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0091】
用語「化学療法剤」は、腫瘍増殖を阻害する際に有効な化学化合物を指す。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド等のアルキル化剤、ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン等のアルキルスルホネート、ベンゾドーパ、カルボクオン、メトゥレドーパ、及びウレドーパ等のアジリジン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミンを含めたエチレンイミン及びメチラメラミン、アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)、カンプトテシン(合成アナログトポテカン含む)、ビロスタチン、カリスタチン、CC-1065(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びバイゼレシン合成アナログ含む)、クリプトフィシン(特にクリプトフィシン1及びクリプトフィシン8)、ドラスタチン、デュオカルマイシン(合成アナログ、KW-2189及びCBI-TMI含む)、エレウセロビン、パンクラチスタチン、サルコディクチン、スポンジスタチン、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラルヌスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムバイシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソウレア、エネディエン抗生物質等の抗生物質(例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン11及びカリケアマイシン211、例えばAgnew Chem Intl.Ed.Engl.33:183～186頁(1994年)参照、ダイネマイシンAを含めたダイネマイシン、エスペラマイシン、並びにネオカルジノスタチン発色団及び関連クロモプロテインエネディエン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ベロマイシン、カクチノマイシン、カラバイシン、カンニオマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン含む)、エピル
ビシン、エソルビシン、イダンルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトムグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU)等の代謝拮抗薬、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸アナログ、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリンアナログ、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、フロックスウリジン、5-FU等のピリミジンアナログ、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン、アミノグルテチミド、マイトタン、トリロスタン等の抗アドレナリン作動薬、フロリン酸等の葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ディアジクオン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダミン、メイタンシン及びアンサミトシン等のメイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSK(登録商標)、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲンナニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、2,2',2''-トリクロロトリエチルアラニン、トリコテセン(特にT-2トキシン、ベルラクリンA、ロリジンA及びアングイジン)、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロムトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガサイトシン、アラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、タクソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.].)及びドセタキセル(
TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer、Antony、フランス)、クロラムブシル、ゲムシタビン、6-チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シスプラチン及びカルボプラチン等のプラチナアナログ、ビンブラスチン、プラチナ、エトポシド(VP-16)、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ、イバンドロネート、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000、ジフロロメチルオルニチン(DMFO)、レチノイン酸、カペシタビン、並びに前述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体がある。更に、この定義中に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御又は阻害するために作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びトレミフェン(Fareston)を含めた抗エストロゲン剤、及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン剤等、並びに前述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体である。
ビシン、エソルビシン、イダンルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラルニシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトムグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン、メトトレキサート及び5-フルオロウラシル(5-FU)等の代謝拮抗薬、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート等の葉酸アナログ、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリンアナログ、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルウリジン、エノシタビン、フロックスウリジン、5-FU等のピリミジンアナログ、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン、アミノグルテチミド、マイトタン、トリロスタン等の抗アドレナリン作動薬、フロリン酸等の葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ディアジクオン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダミン、メイタンシン及びアンサミトシン等のメイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ポドフィリン酸、2-エチルヒドラジド、プロカルバジン、PSK(登録商標)、ラゾキサン、リゾキシン、シゾフィラン、スピロゲンナニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、2,2',2''-トリクロロトリエチルアラニン、トリコテセン(特にT-2トキシン、ベルラクリンA、ロリジンA及びアングイジン)、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロムトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガサイトシン、アラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、タクソイド、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology、Princeton、N.].)及びドセタキセル(
TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer、Antony、フランス)、クロラムブシル、ゲムシタビン、6-チオグアニン、メルカプトプリン、メトトレキサート、シスプラチン及びカルボプラチン等のプラチナアナログ、ビンブラスチン、プラチナ、エトポシド(VP-16)、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ナベルビン、ノバントロン、テニポシド、ダウノマイシン、アミノプテリン、キセローダ、イバンドロネート、CPT-11、トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000、ジフロロメチルオルニチン(DMFO)、レチノイン酸、カペシタビン、並びに前述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体がある。更に、この定義中に含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御又は阻害するために作用する抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、及びトレミフェン(Fareston)を含めた抗エストロゲン剤、及びフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン等の抗アンドロゲン剤等、並びに前述のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体である。
【0092】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを標的化がん療法剤と併用して使用する。したがって本発明は、がんの治療において使用するための、標的化がん療法剤とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0093】
標的化がん療法剤は、がんの増殖、進行、及び蔓延に関与する特定分子(「分子標的」)に干渉することによって、がんの増殖及び蔓延を遮断する薬物又は他の物質である。標的化がん療法剤は、時折「分子標的薬」、「分子標的療法剤」、「高精度薬」、又は同様の名称で呼ばれる。幾つかの実施形態では、標的化療法は対象へのチロシンキナーゼ阻害剤の投与からなる。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体及び/又は非受容体チロシンキナーゼの選択的又は非選択的阻害剤として作用する、任意の様々な治療剤又は薬物を指す。チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は当技術分野でよく知られており、その全容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許公開2007/0254295中に記載されている。チロシンキナーゼ阻害剤と関連した化合物がチロシンキナーゼ阻害剤の効果を再現し得ること、例えば、関連化合物がチロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用して、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果をもたらし得ることは、当業者によって理解され得る。本発明の実施形態の方法中で使用するのに適した、チロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物の例には、ダサチニブ(BMS-354825)、PP2、BEZ235、サラカチニブ、ゲフィチニブ(イレッサ)、スニチニブ(スーテント;SU11248)、エルロチニブ(タルセバ;OSI-1774)、ラパチニブ(GW572016;GW2016)、カネルチニブ(CI1033)、セマキシニブ(SU5416)、バタラニブ(PTK787/ZK222584)、ソラフェニブ(BAY43-9006)、イマチニブ(グリベック;STI571)、レフルノマイド(SU101)、バンデタニブ(ザクティマ;ZD6474)、MK-2206(8-[4-アミノシクロブチル)フェニル]-9-フェニル-1,2,4-トリアゾロ[3,4-f][1,6]ナフチリジン-3(2H)-オン-ヒドロクロリド)、これらの誘導体、これらのアナログ、及びこれらの組合せがあるが、これらだけには限られない。本発明中で使用するのに適した他のチロシンキナーゼ阻害剤及び関連化合物は、例えば米国特許公開2007/0254295、米国特許第5,618,829号、米国特許第5,639,757号、米国特許第5,728,868号、米国特許第5,804,396号、米国特許第6,100,254号、米国特許第6,127,374号、米国特許第6,245,759号、米国特許第6,306,874号、米国特許第6,313,138号、米国特許第6,316,444号、米国特許第6,329,380号、米国特許第6,344,459号、米国特許第6,420,382号、米国特許第6,479,512号、米国特許第6,498,165号、米国特許第6,544,988号、米国特許第6,562,818号、米国特許第6,586,423号、米国特許第6,586,424号、米国特許第6,740,665号、米国特許第6,794,393号、米国特許第6,875,767号、米国特許第6,927,293号、及び米国特許第6,958,340号中に記載されており、これらは全てその全容が参照により本明細書に組み込まれている。幾つかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与され、少なくとも一つのフェーズI臨床試験、より好ましくは少なくとも一つのフェーズII臨床試験、更により好ましくは少なくとも一つのフェーズIII臨床試験、及び最も好ましくは少なくとも一つの血液学的又は腫瘍学的指標に関してFDAに承認された臨床試験の対象となっている低分子キナーゼ阻害剤である。このような阻害剤の例には、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、BMS-599626(AC-480)、ネラチニブ、KRN-633、CEP-11981、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、AZM-475271、CP-724714、TAK-165、スニチニブ、バタラニブ、CP-547632、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンデゥチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、AEE-788、パゾパニブ、アキシチニブ、モタセニブ、OSI-930、セディラニブ、KRN-951、ドヴィチニブ、セリシクリブ、SNS-032、PD-0332991、MKC-I(Ro-317453;R-440)、ソラフェニブ、ABT-869、ブリバニブ(BMS-582664)、SU-14813、テラチニブ、SU-6668、(TSU-68)、L-21649、MLN-8054、AEW-541、及びPD-0325901があるが、これらだけには限られない。
【0094】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを免疫療法剤と併用して使用する。したがって本発明は、がんの治療において使用するための、免疫療法剤とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0095】
本明細書で使用する用語「免疫療法剤」は、間接的又は直接的に、がん細胞に対する身体の免疫応答を増強し、刺激し又は増大させる、及び/又は他の抗がん療法の副作用を減らす化合物、組成物又は治療を指す。したがって免疫療法は、直接的又は間接的に、がん細胞に対する免疫系の応答を刺激するか又は増強し、及び/又は他の抗がん剤によって引き起こされた可能性がある副作用を減らす療法である。免疫療法は、当技術分野では、免疫学的療法、生物学的療法、生物学的反応修飾物質療法及びバイオセラピーとも呼ばれる。当技術分野で知られている一般的な免疫療法剤の例には、サイトカイン、がんワクチン、モノクローナル抗体及び非サイトカインアジュバントがあるが、これらだけには限られない。或いは、免疫療法治療は、対象への一定量の免疫細胞(T細胞、NK細胞、樹状細胞、B細胞…)の投与からなる可能性がある。免疫療法剤は非特異的であってよく、即ち一般に免疫系を追加抗原刺激して、がん細胞の増殖及び/又は蔓延と闘う際にヒトの身体をより有効にすることができ、又は免疫療法剤は特異的であってよく、即ちがん細胞自体を標的化することができる。免疫療法レジメンは、非特異的免疫療法剤と特異的免疫療法剤の使用を組合せることができる。非特異的免疫療法剤は、免疫系を刺激又は間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法剤は、がん治療のメイン療法として単独で、及びメイン療法に加えて使用されており、その場合非特異的免疫療法剤は、アジュバントとして働き他の療法剤(例えば、がんワクチン)の有効性を増強する。この後者の状況において、非特異的免疫療法剤は、他の療法剤の副作用、例えば特定化学療法剤によって誘導される骨髄抑制を低減するためにも働き得る。非特異的免疫療法剤は主要免疫系細胞に作用して、サイトカイン及び免疫グロブリンの産生増大等の二次反応を引き起こす可能性がある。或いは、作用物質自体がサイトカインを含む可能性がある。一般に非特異的免疫療法剤は、サイトカイン又は非サイトカインアジュバントとして分類される。幾つかのサイトカインは、免疫系を追加抗原刺激するよう設計された一般的な非特異的免疫療法剤として、又は他の療法剤と共に提供されるアジュバントとして、がんの治療において用途が見出されている。適切なサイトカインには、インターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子があるが、これらだけには限られない。本発明によって企図されるインターフェロン(IFN)には、一般タイプのIFN、IFN-アルファ(IFN-α)、IFN-ベータ(IFN-β)及びIFN-ガンマ(IFN-γ)がある。IFNは、例えばがん細胞の増殖を遅らせ、より正常に挙動する細胞へのその発生を促進し、及び/又はそれらの抗原産生を増大させることによってがん細胞に直接作用し、それによって免疫系ががん細胞を容易に認識し破壊することができる。IFNは、例えば血管新生を遅らせ、免疫系を追加抗原刺激し、及び/又はナチュラルキラー(NK)細胞、T細胞及びマクロファージを刺激することによって、がん細胞に間接的に作用することもできる。組換えIFN-アルファは、Roferon(Roche Pharmaceuticals社)及びIntron A(Schering Corporation社)として市販されている。本発明によって企図されるインターロイキンには、IL-2、IL-4、IL-11及びIL-12がある。市販の組換えインターロイキンの例には、Proleukin(登録商標)(IL-2;Chiron Corporation社)及びNeumega(登録商標)(IL-12;Wyeth Pharmaceuticals社)がある。Zymogenetics、Inc社(Seattle,Wash.)は組換え型のIL-21を現在試験しており、これも本発明の併用における使用に企図される。本発明によって企図されるコロニー刺激因子(CSF)には、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF又はフィルグラスチム)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF又はサルグラモスチム)及びエリスロポエチン(エポエチンアルファ、ダルベポイエチン)がある。一つ又は複数の増殖因子を用いた治療は、従来の化学療法を受けた対象における新たな血球細胞の生成の刺激を助長し得る。したがって、CSFを用いた治療は、化学療法に付随する副作用を減らす際に有用である可能性があり、より高用量の化学療法剤の使用を可能にし得る。様々な組換えコロニー刺激因子、例えばNeupogen(登録商標)(G-CSF;Amgen社)、Neulasta(ペルフィルグラスチム;Amgen社)、Leukine(GM-CSF;Berlex社)、Procrit(エリスロポエチン;Ortho Biotech社)、Epogen(エリスロポエチン;Amgen社)、Arnesp(エリスロポエチン)が市販されている。本発明の併用組成物及び併用投与法は、「完全細胞」及び「養子」免疫療法も含み得る。例えば、このような方法は、免疫系細胞(例えば、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)、CC2+及び/又はCD8+T細胞等(例えば、腫瘍特異的抗原及び/又は遺伝子増強で膨張増殖させたT細胞)、抗体発現B細胞又は他の抗体産生若しくは提示細胞、樹状細胞(例えば、GM-CSF及び/又はFlt3-L等のDC膨張増殖剤と培養した樹状細胞、及び/又は腫瘍関連抗原充填樹状細胞)、抗腫瘍NK細胞、いわゆるハイブリッド細胞、又はこれらの組合せの注入又は再注入を含むことができる。細胞溶解物も、このような方法及び組成物中で有用であり得る。このような態様において有用であり得る臨床試験中の細胞性「ワクチン」には、Canvaxin(商標)、APC-8015(Dendreon社)、HSPPC-96(Antigenics社)、及びMelacine(登録商標)細胞溶解物がある。ミョウバン等のアジュバントと任意選択で混合した、がん細胞から生じた抗原、及びその混合物も、このような方法及び併用組成物における成分であり得る(例えばBystrynら、Clinical Cancer Research Vol.7、1882～1887頁、2001年7月を参照)。
【0096】
幾つかの実施形態では、本発明のCLEC-1アンタゴニストを放射線療法と併用して使用する。したがって本発明は、がんの治療において使用するための、放射線療法とCLEC-1のアンタゴニストの組合せに関する。
【0097】
放射線療法は、患者への放射性医薬品の放射線又は関連投与を含み得る。放射線源は治療する患者の内部又は外部のいずれかに存在してよい(例えば放射線治療は、外部ビーム放射線療法(EBRT)又はブラッチセラピー(BT)の形であってよい)。このような方法を実施する際に使用することができる放射性元素には、例えばラジウム、セシウム-137、イリジウム-192、アメリシウム-241、金-198、コバルト-57、銅-67、テクネチウム-99、ヨウ素-123、ヨウ素-131、及びインジウム-111がある。
【0098】
一実施形態では、本発明は、
a)それらの表面上でCLEC-1を発現する複数の細胞を提供する工程、
b)候補化合物と前記細胞をインキュベートする工程、
c)前記候補化合物がCLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減する化合物と結合するかどうか、及び前記候補化合物がT細胞応答を促進するかどうか決定する工程、
及びd)CLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減し、T細胞応答を促進する候補化合物を選択する工程
からなる工程を含む、CLEC-1アンタゴニストをスクリーニングする方法に関する。
a)それらの表面上でCLEC-1を発現する複数の細胞を提供する工程、
b)候補化合物と前記細胞をインキュベートする工程、
c)前記候補化合物がCLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減する化合物と結合するかどうか、及び前記候補化合物がT細胞応答を促進するかどうか決定する工程、
及びd)CLEC-1に結合し、CLEC-1の生物学的活性を遮断、抑制、又は低減し、T細胞応答を促進する候補化合物を選択する工程
からなる工程を含む、CLEC-1アンタゴニストをスクリーニングする方法に関する。
【0099】
詳細な実施形態では、本発明のスクリーニング方法は、動物モデルに工程d)で選択した候補化合物を投与して前記化合物の予防及び/又は治療効果を確認する工程からなる工程を更に含むことができる。
【0100】
一般に、このようなスクリーニング方法は、それらの表面上でCLEC-1を発現する適切な細胞を提供する工程を含む。詳細には、CLEC-1をコードする核酸を利用して細胞をトランスフェクトし、それによって本発明の受容体を発現させることが可能である。このようなトランスフェクションは、当技術分野でよく知られている方法によって実施することができる。
【0101】
本発明は更に、がんの治療に使用する化合物の調製方法に関するものであり、前記方法はT細胞応答を促進することができるCLEC-1アンタゴニストを確認する工程を含む。
【0102】
以下の図面と実施例によって本発明を更に例証する。しかしながら、これらの実施例と図面は、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1A】ヒトの臓器と細胞におけるCLEC-1のmRNA及びタンパク質の発現及び制御の図である。 A)CLEC-1のmRNA発現を、末梢血内白血球(PBL)、好中球(neutro)、単球(mono)、単球由来樹状細胞(moDC)、ヒト大動脈内皮細胞(HAEC)、T細胞及びB細胞における定量RT-PCRによって評価した。
【図1B-1】B)ヒト血液に関するフローサイトメトリーによって評価したIgG1アイソタイプ又はCLEC-1染色の代表的ドット及びヒストグラムプロット。i)CD45+CD14-CD11c+HLA-DR高DC。
【図1B-2】ii)CD45+CD14+単球、iii)表面及び内部のSSC高CD16+好中球、及びiiii)HAEC(細胞外及び細胞内)、及びモノクローナル抗体抗hCLEC-1。CLEC-1のオーバーレイイメージを有するヒストグラムプロットは、対照アイソタイプCLEC-1で染色した細胞のヒストグラムプロットとマッチした。
【図1C-1】C)ヒト単球由来樹状細胞におけるCLEC-1の発現。i)モノクローナル抗体抗hCLEC-1を用いた材料及び方法中に記載したような非刺激(US)細胞及びLPS(TLR4-R)、ポリI:C(TLR3-R)、R848(TLR7-L)及びTGF-βで刺激した細胞に関するフローサイトメトリーによって評価した、細胞表面CLEC-1(APC)及びHLA-DR(FITC)を発現する単球由来樹状細胞の%の代表的ドットプロット。IgG1アイソタイプは対照として働いた。
【図1C-2】ii)ヒストグラムは、6回の独立実験におけるCLEC-1染色の平均蛍光強度(MFI)±SEMを表す。CLEC-1MFI染色の統計解析は、非刺激細胞と刺激細胞の間で実施した。
【図2A】ヒト単球由来樹状細胞成熟及び下流T細胞活性化に対するCLEC-1誘発の影響の図である。 A)単独又はプレート結合抗CLEC-1モノクローナル抗体若しくはIgG1アイソタイプ対照とインキュベートしたヒト単球由来樹状細胞を、24時間LPS(1μg/ml)で同時に交互に刺激し、採取して、CD80、CD86、CD83及びHLA-DRをフローサイトメトリーによって評価した。
【図2B】B)ELISAにより上清中のTNF-α、IL-12p70、IL-6、IL-23及びIL-10を評価した。
【図2C】C)次いで、細胞を洗浄し、同種異系T細胞を含むMLRに5日間施した。同種異系T細胞におけるCFSE希釈によりフローサイトメトリーにより増殖を評価し、ELISAにより上清中のIL-17及びIFN-γを評価した。
【図3-1】ラットBMDC成熟、サイトカイン分泌及びT細胞活性化性に対するCLEC-1欠損の影響の図である(CLEC-1ノックアウトラット)。 材料及び方法中に記載ように8日間で野生型又はノックアウトラットからBMDCを生成し、非投薬ラット由来の同種異系精製CD4+T細胞とMLRで4日間インキュベートした。i)増殖のヒストグラム及び代表的染色をCFSE希釈によりフローサイトメトリーによりCD4+T細胞において評価した。
【図3-2】ii)ゲート(gated)CD4+T細胞中のIL-17+及びIFN-γ+細胞の割合のヒストグラム及び代表的ドットプロットをフローサイトメトリーにより評価した。ヒストグラム中のデータは4回の独立実験の平均±SEMとして表した。
【図4-1】ラットBMDC媒介T細胞活性化に対するCLEC-1Fc融合タンパク質を用いたCLEC-1シグナル伝達遮断の影響の図である。 野生型ラット由来のBMDCを、(同じ条件下で産生及び精製した)CLEC-1Fc又は無関係なhSEAP-Fc融合タンパク質(10μg/ml)と共に、非投薬ラット由来の同種異系精製CD4+T細胞とMLRで4日間インキュベートした。i)Foxp3+及びFoxp3-細胞の増殖を、CFSE希釈によりフローサイトメトリーによりCD4+T細胞において評価した。
【図4-2】ii)IL-17及びIFN-γサイトカイン産生を、ELISAによりMLRの上清において評価した。ヒストグラム中のデータは4回の独立実験の平均±SEMとして表した。
【図5A】in vivo樹状細胞媒介CD4+T細胞プライミング及びTh分極化の運命に対するCLEC-1欠損の影響の図である(CLEC-1ノックアウトラット)。 A)CLEC-1のmRNA発現を、二次リンパ器官(SLO)由来ラットCD103+CD4-(交差提示)及びCD4+(非交差提示)従来型樹状細胞の異なる細胞サブタイプにおける定量RT-PCRによって評価した(n=5 *p<0.05)。
【図5B-1】B)野生型及びCLEC-1ノックアウトラットを、CFA及びKLHタンパク質(100μg/ml)を用いてフットパッドで皮下免疫処置した。免疫処置後10日で、膝窩リンパ節を採取し、KLH又は対照OVA(25μg/ml)の存在下で3日間培養した。i)CFSE希釈により評価したCD4+T細胞における増殖。
【図5B-2】ii)フローサイトメトリーにより評価したゲートCD4+T細胞中のIL-17+、IL-17+とIFN-γ+、及びIFN-γ+細胞の割合のヒストグラム及び代表的プロット。ヒストグラム中のデータは4回の独立実験の平均±SEMとして表した。
【図6A-1】MLR活性化に対するCLEC-1の潜在的アンタゴニスト(単球由来樹状細胞+同種異系T細胞)の影響の図である。 MLRは、高レベルのCLEC-1を発現する同種異系単球由来樹状細胞(12.5×103)と混合した、末梢血(5×104)から単離した精製T細胞からなっていた。アイソタイプ対照(IgG1)又は抗ヒトCLEC-1抗体を0.5～10μg/mlの用量で5日間加えた。次いでT細胞の増殖をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル希釈により評価し、IFN-γ発現の発現はT細胞ではフローサイトメトリーにより、上清ではELISAにより評価した(図6A、B及びC、ヒストグラム及び代表的プロット)。
【図7ABC】がんにおける阻害チェックポイントCLEC-1(げっ歯類における概念実証)の図である。 a)げっ歯類における固形腫瘍中のCLEC-1の急速で持続的な発現(b6マウスの肝臓門脈内にhepa1.6肝臓癌腫瘍細胞を注射した、Cleclaの発現はQ-PCRによって評価した)。 b)CLEC-1欠損げっ歯類は野生型動物マウスほど腫瘍に対して苦しまない。b6野生型又はClecla欠損マウスの肝臓門脈内にhepa1.6肝臓癌腫瘍細胞を注射した、データはウィルコクソン検定においてマウスの生存%で表す、***p<0.001 c)ラット:C6グリオーム細胞(100万個)をsprague dawley(spd)野生型又はClecla欠損ラットの脇腹に皮下注射し、腫瘍体積を35日までモニタリングした。
【図7D】d)C6グリオーム細胞(100万個)をsprague dawley(spd)野生型又はClecla欠損ラットの脇腹に皮下注射し、腫瘍及びリンパ節を第18日に採取し、inos、ifng及びtnfaに関してQ-PCRに施した。データはhprtに対するinos、ifng及びtnfaの発現のヒストグラムを表し、腫瘍に関して任意単位(同腹子野生型ラットにおける発現と比較した倍率変化、1の値)(n=3)、又はリンパ節に関して転写比率で表した(n=6、*p<0.05)。
【図8AB】CLEC-1はM2型腫瘍随伴マクロファージによって発現され、胸膜中皮腫由来及び卵巣腫瘍腹水由来のミエロイド系細胞によって発現されることを示す図である。 ヒト単球を、(Zajac、Blood、2013年)によって記載されたように、M-CSFと培養してM0マクロファージを生成し、次いでIFNγ、LPS又はIL-4と培養してM1又はM2マクロファージを生成した。CLEC-1の発現はQ-PCRによって(a)、及びフローサイトメトリーによって(b)評価した、n=4*p<0.05。中皮腫由来の胸膜を回収し、フローサイトメトリーを施して、FcBlock及びヒトAB陽性血清(アイソタイプ対照)でのFc受容体の遮断後の、CD45+HLADR+CD16+ミエロイド系細胞におけるCLEC-1の発現を評価した(c)。卵巣がん患者の通常ケア中に腹水を回収し、Ficoll勾配後に単核細胞を単離する。ヒトCD14+細胞は、CD14マイクロビーズ及びAutoMACSを用いた陽性選択を使用して単離する。FcBlock及びヒトAB陽性血清でのFc受容体の遮断後、CD14+細胞を、アイソタイプ対照モノクローナル抗体又は抗ヒトCLEC-1のいずれかで染色した(d)。
【実施例1】
【0104】
材料及び方法
動物
ラットは「Centre d'ElevageJanvier」(Genest社、Saint-Isle、フランス)から購入し、Pays de la Loireの動物実験倫理委員会(the Committee on the Ethics of Animal Experiments)によって承認されフランス政府のフランス研究高等教育評価機構(Ministry of Higher Education and Research)によって認可されたプロトコールに厳密に従い実験手順を実施した。Clec-1ノックアウト(KO)は、同系交配RT1a Lewisバックグラウンドでジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術を用いてthe Transgenic Rats and Immunophenomics Platform facility(SFR-Sante-Nantes社)によって作製された。32kDaの予想サイズでのCLEC-1タンパク質の不在を、ウエスタンブロットにより確認した。
動物
ラットは「Centre d'ElevageJanvier」(Genest社、Saint-Isle、フランス)から購入し、Pays de la Loireの動物実験倫理委員会(the Committee on the Ethics of Animal Experiments)によって承認されフランス政府のフランス研究高等教育評価機構(Ministry of Higher Education and Research)によって認可されたプロトコールに厳密に従い実験手順を実施した。Clec-1ノックアウト(KO)は、同系交配RT1a Lewisバックグラウンドでジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術を用いてthe Transgenic Rats and Immunophenomics Platform facility(SFR-Sante-Nantes社)によって作製された。32kDaの予想サイズでのCLEC-1タンパク質の不在を、ウエスタンブロットにより確認した。
【0105】
抗体
抗ヒトCLEC-1モノクローナル抗体(mAb)は、リンパ球体細胞ハイブリダイゼーション(Biotem社、Apprieu、フランス)によって、hCLEC-1の細胞外ドメインをコードするペプチドを用いたBalb/cマウスの免疫処置によって作製し、ELISAによる組換えヒトCLEC-1タンパク質(RD system社)でのスクリーニングによって選択し、次いでプロテインAでのクロマトグラフィーにより精製した。抗ヒトCLEC1モノクローナル抗体(IgG-D6)はSanta Cruz Biotechnologies社(Dallas、CA)からのものであった。精製抗ラットβ-アクチン、CD3(G4.18);抗ラットTCRαβ-A647又は-A488(R73)、CD4-PECy7(OX35)、CD8-A488(Ox8)、IL-17-APC(ebio17B7)、Foxp3-APC、IFNγ-FITC、CD11b-PerCP-Cy5.5(WT.5)、CD103(αEインテグリン)-FITC及び抗ヒトホスホチロシン(p-Tyr)(4G10)、CD4-PE、CD3-APC、CD45-PercP、CD3-FITC、CD19-PE、CD16-PE、CD14-FITCHLA-DR-APC/Cy7、HLA-DR-FITC、CD11c-PECy7、CD11b-FITC CD80-FITC、CD86-FITC、CD83-FITC及びIgG1アイソタイプ対照はBD Biosciences社(Franklin Lakes)からのものであった。
抗ヒトCLEC-1モノクローナル抗体(mAb)は、リンパ球体細胞ハイブリダイゼーション(Biotem社、Apprieu、フランス)によって、hCLEC-1の細胞外ドメインをコードするペプチドを用いたBalb/cマウスの免疫処置によって作製し、ELISAによる組換えヒトCLEC-1タンパク質(RD system社)でのスクリーニングによって選択し、次いでプロテインAでのクロマトグラフィーにより精製した。抗ヒトCLEC1モノクローナル抗体(IgG-D6)はSanta Cruz Biotechnologies社(Dallas、CA)からのものであった。精製抗ラットβ-アクチン、CD3(G4.18);抗ラットTCRαβ-A647又は-A488(R73)、CD4-PECy7(OX35)、CD8-A488(Ox8)、IL-17-APC(ebio17B7)、Foxp3-APC、IFNγ-FITC、CD11b-PerCP-Cy5.5(WT.5)、CD103(αEインテグリン)-FITC及び抗ヒトホスホチロシン(p-Tyr)(4G10)、CD4-PE、CD3-APC、CD45-PercP、CD3-FITC、CD19-PE、CD16-PE、CD14-FITCHLA-DR-APC/Cy7、HLA-DR-FITC、CD11c-PECy7、CD11b-FITC CD80-FITC、CD86-FITC、CD83-FITC及びIgG1アイソタイプ対照はBD Biosciences社(Franklin Lakes)からのものであった。
【0106】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)技術によるclec-1-/-ノックアウト(KO)ラットの作製。
ラットclec-1に特異的なin vitro転写mRNAコードZFN標的化配列(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO)を、以前に記載されたように受精卵単細胞段階の胚にマイクロインジェクションした。新生児の突然変異はPCRによって検出した。発起人ら(founders)の一人は、7塩基対の欠失が、大部分の細胞外ドメインを欠くCLEC-1の114アミノ酸で未成熟終止コドンをもたらすことを示した。ヘテロ接合体を交配させてKO及び野生型(WT)同腹子を生成した。
ラットclec-1に特異的なin vitro転写mRNAコードZFN標的化配列(Sigma-Aldrich社、St Louis、MO)を、以前に記載されたように受精卵単細胞段階の胚にマイクロインジェクションした。新生児の突然変異はPCRによって検出した。発起人ら(founders)の一人は、7塩基対の欠失が、大部分の細胞外ドメインを欠くCLEC-1の114アミノ酸で未成熟終止コドンをもたらすことを示した。ヘテロ接合体を交配させてKO及び野生型(WT)同腹子を生成した。
【0107】
ラットCLEC-1Fc融合タンパク質の作製
CLEC-1の細胞外ドメイン(ADK94891アミノ酸74～261)をコードするcDNAをPCRによって増幅し、5'末端と3'末端をそれぞれECORIBglII制限部位でタグ化した。消化後、cDNA産物をクローニングし、3アミノ酸が突然変異したIgG2aFc断片を含有するpFUSE-mIgG2Ael-Fc2v10[Fab](Invivogen社、サンディエゴ、CA)ベクターにインフレームで挿入してFcγRI結合を妨げた。製造者の説明書(ThermoFisher社)に従いリポフェクタミンを用いて、真核生物細胞においてプラスミドをトランスフェクトした。CLEC-1FcはHiTrapgアフィニティーカラム(GE Healthcare Bio-sciences社、Pittsburgh、PA)で上清から精製し、Slide-A-Lyzer透析カセット(ThermoFisher社)を使用して透析し、BCAタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce社)を使用して定量化した。純度とタンパク質構造は、SDS-PAGE、次にクーマシー染色、及び補足的な材料及び方法のウエスタンブロットの段落中に記載したような、抗マウスIgG又は抗ラットCLEC-1抗体を用いたウエスタンブロット分析によって確認した。対照である組換え分泌切断型のヒト胎児アルカリホスファターゼ(hSEAPFc)を作製し(pFUSE-SEAP-hFc、Invivogen社)、CLEC-1Fcと同じ条件下で精製した。
CLEC-1の細胞外ドメイン(ADK94891アミノ酸74～261)をコードするcDNAをPCRによって増幅し、5'末端と3'末端をそれぞれECORIBglII制限部位でタグ化した。消化後、cDNA産物をクローニングし、3アミノ酸が突然変異したIgG2aFc断片を含有するpFUSE-mIgG2Ael-Fc2v10[Fab](Invivogen社、サンディエゴ、CA)ベクターにインフレームで挿入してFcγRI結合を妨げた。製造者の説明書(ThermoFisher社)に従いリポフェクタミンを用いて、真核生物細胞においてプラスミドをトランスフェクトした。CLEC-1FcはHiTrapgアフィニティーカラム(GE Healthcare Bio-sciences社、Pittsburgh、PA)で上清から精製し、Slide-A-Lyzer透析カセット(ThermoFisher社)を使用して透析し、BCAタンパク質アッセイ試薬キット(Pierce社)を使用して定量化した。純度とタンパク質構造は、SDS-PAGE、次にクーマシー染色、及び補足的な材料及び方法のウエスタンブロットの段落中に記載したような、抗マウスIgG又は抗ラットCLEC-1抗体を用いたウエスタンブロット分析によって確認した。対照である組換え分泌切断型のヒト胎児アルカリホスファターゼ(hSEAPFc)を作製し(pFUSE-SEAP-hFc、Invivogen社)、CLEC-1Fcと同じ条件下で精製した。
【0108】
KLH免疫処置
100μl完全フロイントアジュバント(CFA)(Difco社)中に乳化した(v:v)キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)タンパク質(Sigma社)(100μg)を用いてフットパッドでラットを皮下免疫処置し、免疫処置後10日で膝窩リンパ節を採取した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)(Molecular Probes社/Invitrogen社)標識した非投薬野生型ラット由来の(5μM)全細胞(1×105)又は精製CD4+T細胞(1×105)及びT細胞枯渇脾細胞(1×105)に、KLH又は無関係なタンパク質OVA(25μg/ml)を用いたin vitro二次刺激を3日間施した。
100μl完全フロイントアジュバント(CFA)(Difco社)中に乳化した(v:v)キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)タンパク質(Sigma社)(100μg)を用いてフットパッドでラットを皮下免疫処置し、免疫処置後10日で膝窩リンパ節を採取した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)(Molecular Probes社/Invitrogen社)標識した非投薬野生型ラット由来の(5μM)全細胞(1×105)又は精製CD4+T細胞(1×105)及びT細胞枯渇脾細胞(1×105)に、KLH又は無関係なタンパク質OVA(25μg/ml)を用いたin vitro二次刺激を3日間施した。
【0109】
フローサイトメトリー及び細胞選別
染色前に、製造者の説明書によって記載されたように細胞をFcブロック(BD Biosciences社)に施した。細胞内サイトカイン染色用に、タンパク質輸送阻害剤GolgiStop(2μl/ウエル)の存在下でPMA及びイオノマイシン(それぞれ50ng/ml及び1μg/ml)を用いて細胞を4時間刺激し、固定及び浸透処理を施した(Facs浸透剤溶液)(全ての試薬はBD Biosciences社から)。染色細胞(2.5μg/ml)の蛍光標識はFACSLSRII(BD Biosciences社)を使用して測定し、FlowJo(登録商標)ソフトウエア(Tree Star、Inc社、Ashland)を用いて分析した。
染色前に、製造者の説明書によって記載されたように細胞をFcブロック(BD Biosciences社)に施した。細胞内サイトカイン染色用に、タンパク質輸送阻害剤GolgiStop(2μl/ウエル)の存在下でPMA及びイオノマイシン(それぞれ50ng/ml及び1μg/ml)を用いて細胞を4時間刺激し、固定及び浸透処理を施した(Facs浸透剤溶液)(全ての試薬はBD Biosciences社から)。染色細胞(2.5μg/ml)の蛍光標識はFACSLSRII(BD Biosciences社)を使用して測定し、FlowJo(登録商標)ソフトウエア(Tree Star、Inc社、Ashland)を用いて分析した。
【0110】
細胞選別用に、ラットCD4+T細胞及びCD11b+CD103+CD4-及びCD11b+CD103+CD4+樹状細胞を、TCR+及びCD4+により、ヒト細胞に関してそれぞれCD11b、CD103及びCD4染色により、T細胞及びB細胞に関してそれぞれSSC低CD45+CD3+又はCD19+により、好中球に関してSSC高CD45+CD16+により、単核細胞に関してSSC低CD45+CD14+により、及びcDCに関してSSC低CD45+HLA-DR+CD11c+により、FACSAriaフローサイトメーター(BD Biosciences社)を使用し陽性選択によって非投薬ラットの脾臓から精製した。純度は>99%であった。
【0111】
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)-陰性細胞でのゲーティングによって死細胞は除外した。
【0112】
細胞作製、in vitro刺激及び白血球混合反応(MLR)
- ヒト単球由来樹状細胞(moDC)を、IL-4(40ng/ml;AbCys社、パリ、フランス)及びGM-CSF(1000IU/ml;AbCys社)を補充した、完全RPMI1640培地(10%エンドトキシンフリーFSC(Perbio Sciences社)、2mMのL-グルタミン(Sigma社)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Sigma社)、1mMのHepes(Sigma社)、及び5×10-5Mの2-メルカプトエタノール(Sigma社))中で7日間培養した洗浄単球から作製した。次いで、LPS(0.5μg/ml)(Sigma社)、ポリI:C(2μg/ml)(Invivogen社、サンディエゴ、CA)、R848(2.5μg/ml)(Invivogen社)、組換えヒトTGFβ1(20ng/ml)(R and D systems社)を用いて、或いは事前にプレートにコーティングした10μg/mlの抗CLEC-1モノクローナル抗体又はIgG1アイソタイプ対照の存在下で24時間細胞を刺激し(1×106個ml)、フローサイトメトリーに施し、又は5日間(MLR)5×104個の同種異系ヒトT細胞(Pan T細胞単離キット(Mylteni社))と培養した(12.5×103個)。組換えCLEC-1-Hisタグ(R and D systems社)又は無関係な組換えブタα1,3GT-6-Hisタンパク質をMLRにおいて10μg/mlで加えた。増殖はCD3+CD4+細胞におけるCFSEプロファイルによりフローサイトメトリーにより測定し、ELISAにより上清中のIL-17及びIFN-γサイトカインを評価した。
- ヒト単球由来樹状細胞(moDC)を、IL-4(40ng/ml;AbCys社、パリ、フランス)及びGM-CSF(1000IU/ml;AbCys社)を補充した、完全RPMI1640培地(10%エンドトキシンフリーFSC(Perbio Sciences社)、2mMのL-グルタミン(Sigma社)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Sigma社)、1mMのHepes(Sigma社)、及び5×10-5Mの2-メルカプトエタノール(Sigma社))中で7日間培養した洗浄単球から作製した。次いで、LPS(0.5μg/ml)(Sigma社)、ポリI:C(2μg/ml)(Invivogen社、サンディエゴ、CA)、R848(2.5μg/ml)(Invivogen社)、組換えヒトTGFβ1(20ng/ml)(R and D systems社)を用いて、或いは事前にプレートにコーティングした10μg/mlの抗CLEC-1モノクローナル抗体又はIgG1アイソタイプ対照の存在下で24時間細胞を刺激し(1×106個ml)、フローサイトメトリーに施し、又は5日間(MLR)5×104個の同種異系ヒトT細胞(Pan T細胞単離キット(Mylteni社))と培養した(12.5×103個)。組換えCLEC-1-Hisタグ(R and D systems社)又は無関係な組換えブタα1,3GT-6-Hisタンパク質をMLRにおいて10μg/mlで加えた。増殖はCD3+CD4+細胞におけるCFSEプロファイルによりフローサイトメトリーにより測定し、ELISAにより上清中のIL-17及びIFN-γサイトカインを評価した。
【0113】
- 大動脈から(HAEC)又は臍帯静脈から(HUVEC)ヒト内皮細胞(EC)を単離し、培養して、1000単位/mlの組換えヒトTNFα(eBiosciences社)で12時間交互に刺激した。
【0114】
- ヒト単球を、(Zajac、Blood、2013年)によって記載されたように、M-CSFと培養してM0マクロファージを生成し、次いでIFNγ、LPS又はIL-4と培養してM1又はM2マクロファージを生成した。
【0115】
- 中皮腫がある患者から胸膜を回収しフローサイトメトリーを施した。
【0116】
- 卵巣がん患者の通常ケア中に腹水を回収し、Ficoll勾配後に単核細胞を単離する。ヒトCD14+細胞は、CD14マイクロビーズ及びAutoMACSを用いた陽性選択を使用して単離する。
【0117】
- ラットCD4+T細胞を、プレート結合抗CD3(クローンG4.18)(5μg/ml)で刺激した。ラットIL-4(4ng/ml)及びネズミGM-CFS(1.5ng/ml)を補充した完全RPMI培地において8日間細胞を培養することによって、非投薬、CLEC-1野生型及びノックアウトLEW.1A(RT1a)同腹子ラットから骨髄由来樹状細胞(BMDC)を得た。次いでBMDCを、転写産物解析用にLPS(1μg/ml)(Sigma社)又はザイモザン(20μg/ml)(Invivogen社)で6時間、並びに成熟度マーカーの発現用及びMLR用に24時間刺激した(5μMのCFSEで標識したLEW.1W(RT1u)非投薬ラットの腸間膜リンパ節由来の精製同種異系CD4+T細胞と5日間の同時培養)。或いは、ラットCLEC-1Fc融合タンパク質及び対照hSEAP-Ec(10μg/ml)を、エンドトキシン阻害剤ポリミキシンB(10μg/ml)(Invivogen社)の存在下においてMLRで加えた。
【0118】
RNA抽出及びリアルタイム定量RT-PCR
組織、腫瘍又は細胞由来の全てのRNAを、製造者の説明書に従いTrizol(Invitrogen社)を使用して調製した。プールしたヒト臓器由来のcDNAは、カフカス人男性又は女性由来のHuman Immune System and MTC PanelI(Clontech Mountain View社)からのcDNAであった。
組織、腫瘍又は細胞由来の全てのRNAを、製造者の説明書に従いTrizol(Invitrogen社)を使用して調製した。プールしたヒト臓器由来のcDNAは、カフカス人男性又は女性由来のHuman Immune System and MTC PanelI(Clontech Mountain View社)からのcDNAであった。
【0119】
リアルタイム定量PCRを、ViiA7リアルタイムPCR System及びSYBR(登録商標)Green PCRマスター混合物(Applied Biosystems社)を使用して実施した。ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を、出発量のRNAの変動を標準化するための内在対照遺伝子として使用した。2-ΔΔCt法を使用して相対的発現を計算し任意単位で表した。
【0120】
免疫沈降法及びウエスタンブロット
ヒト単球由来樹状細胞を、抗CLEC-1又は対照IgG1アイソタイプ(Invitrogen社)モノクローナル抗体コーティングプレート(10μg/ml)上、ザイモザン(20μg/ml)有り又は無しの培地中に5又は20分間平板培養した。ヒト単球由来樹状細胞、HAEC、HUVEC及びHEKは、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むNonidet P-40 1%溶解バッファー(Sigma Aldrich社)中で溶解した。CLEC-1の免疫沈降法は、4μgの抗ヒトCLEC1モノクローナル抗体(D6)、次にプロテインG-Sepharoseビーズとのインキュベーションで実施した。次いでタンパク質をPNGase F(Sigma Aldrich社)で一晩処理し、溶出し、Laemmli試料バッファー中での5分間の煮沸によって溶かした。タンパク質濃度は、BCアッセイキット及び標準としてBSA(Interchim社、San Pedro)を使用して決定した。ニトロセルロース膜はTween-20-Tris緩衝生理食塩水及び5%ミルクでブロッキング処理し、0.5μg/mlの抗ホスホチロシン(4G10)又は2μg/mlの抗CLEC1モノクローナル抗体、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Jackson immunoresearch社、West Grove、PA.)とインキュベートした。Proteome ProfilerヒトNF-kB経路アレイキットを製造者の説明書(R and D Systems社)により記載されたように実施した。化学発光による検出はWest Pico化学発光基質(Thermofisher scientific社、Waltham、MA)を使用して実施し、タンパク質発現はLas4000(Fuji社)によって評価した。
ヒト単球由来樹状細胞を、抗CLEC-1又は対照IgG1アイソタイプ(Invitrogen社)モノクローナル抗体コーティングプレート(10μg/ml)上、ザイモザン(20μg/ml)有り又は無しの培地中に5又は20分間平板培養した。ヒト単球由来樹状細胞、HAEC、HUVEC及びHEKは、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むNonidet P-40 1%溶解バッファー(Sigma Aldrich社)中で溶解した。CLEC-1の免疫沈降法は、4μgの抗ヒトCLEC1モノクローナル抗体(D6)、次にプロテインG-Sepharoseビーズとのインキュベーションで実施した。次いでタンパク質をPNGase F(Sigma Aldrich社)で一晩処理し、溶出し、Laemmli試料バッファー中での5分間の煮沸によって溶かした。タンパク質濃度は、BCアッセイキット及び標準としてBSA(Interchim社、San Pedro)を使用して決定した。ニトロセルロース膜はTween-20-Tris緩衝生理食塩水及び5%ミルクでブロッキング処理し、0.5μg/mlの抗ホスホチロシン(4G10)又は2μg/mlの抗CLEC1モノクローナル抗体、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体(Jackson immunoresearch社、West Grove、PA.)とインキュベートした。Proteome ProfilerヒトNF-kB経路アレイキットを製造者の説明書(R and D Systems社)により記載されたように実施した。化学発光による検出はWest Pico化学発光基質(Thermofisher scientific社、Waltham、MA)を使用して実施し、タンパク質発現はLas4000(Fuji社)によって評価した。
【0121】
免疫組織化学
(カバーガラス上で一晩培養した)好中球、単球由来樹状細胞、接着性トランスフェクトHEK293T細胞及びHUVEC細胞を4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science社、Hatfield、PA、USA)中に固定し、単球由来樹状細胞以外TritonX100(0.1%)で浸透処理した。室温において1時間、単球由来樹状細胞用PBS1%FCS、1%BSA及びFcBlock中で、抗CLEC1モノクローナル抗体(D6)又はIgG1アイソタイプ対照(Invitrogen社)(4μg/ml)で、次いで二次Alexa Fluor488又はAlexa Fluor568抗マウスIgG1抗体で1時間細胞を染色した。1%DAPI含有PBS中での10分間のインキュベーション後、Prolong Antifade Reagent(Invitrogen社)を使用してスライドを取り付け、蛍光顕微鏡(NikonA1RSi共焦点顕微鏡)によって観察した。連続的にイメージを得て(X60Plan ApoN.A:1.4、ズーム2)、ImageJプログラムを使用することによって解析した。
(カバーガラス上で一晩培養した)好中球、単球由来樹状細胞、接着性トランスフェクトHEK293T細胞及びHUVEC細胞を4%パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Science社、Hatfield、PA、USA)中に固定し、単球由来樹状細胞以外TritonX100(0.1%)で浸透処理した。室温において1時間、単球由来樹状細胞用PBS1%FCS、1%BSA及びFcBlock中で、抗CLEC1モノクローナル抗体(D6)又はIgG1アイソタイプ対照(Invitrogen社)(4μg/ml)で、次いで二次Alexa Fluor488又はAlexa Fluor568抗マウスIgG1抗体で1時間細胞を染色した。1%DAPI含有PBS中での10分間のインキュベーション後、Prolong Antifade Reagent(Invitrogen社)を使用してスライドを取り付け、蛍光顕微鏡(NikonA1RSi共焦点顕微鏡)によって観察した。連続的にイメージを得て(X60Plan ApoN.A:1.4、ズーム2)、ImageJプログラムを使用することによって解析した。
【0122】
In vivo腫瘍モデル
b6野生型又はClecla欠損マウスの肝臓門脈内にhepa1.6肝臓癌腫瘍細胞を注射した。C6グリオーム細胞(100万個)をsprague dawley(spd)野生型又はClecla欠損ラットの脇腹に皮下注射した。
b6野生型又はClecla欠損マウスの肝臓門脈内にhepa1.6肝臓癌腫瘍細胞を注射した。C6グリオーム細胞(100万個)をsprague dawley(spd)野生型又はClecla欠損ラットの脇腹に皮下注射した。
【0123】
統計解析
全ての統計解析は、Graphpad Prismソフトウエア(La Jolla社)及び両側非対ノンパラメトリックスチュ-デントt検定(マン-ホイットニー)を使用して実施した。p値が0.05未満であった場合に結果は有意であると考えた。
全ての統計解析は、Graphpad Prismソフトウエア(La Jolla社)及び両側非対ノンパラメトリックスチュ-デントt検定(マン-ホイットニー)を使用して実施した。p値が0.05未満であった場合に結果は有意であると考えた。
【0124】
結果
ヒトミエロイド系樹状細胞は細胞表面でCLEC-1を発現する。
ヒトにおけるCLEC-1発現に関して、これまで限られた情報のみが公開されている。ヒトCLEC-1タンパク質の発現、制御及び機能に関しては、これまでほとんど記載されていない。小胞体タンパク質と似た染色パターンがある内皮細胞の細胞内でのみヒトCLEC-1を検出可能であること、及びTGF-βも炎症刺激も細胞表面への有意な転位を促進できないことを開示した、CLEC-1の発現に関する唯一の刊行物が存在する(The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment.Sattlerら、ScandJImmunol.2012年Mar;75(3):282～92頁)。したがって、hCLEC-1に関する現況技術において利用可能な唯一の情報(即ち、内皮細胞中の細胞内局在化)は、当技術分野で知られていた情報(即ち、内皮細胞及びミエロイド系細胞の表面上に局在するrCLEC-1)とは正反対である。
ヒトミエロイド系樹状細胞は細胞表面でCLEC-1を発現する。
ヒトにおけるCLEC-1発現に関して、これまで限られた情報のみが公開されている。ヒトCLEC-1タンパク質の発現、制御及び機能に関しては、これまでほとんど記載されていない。小胞体タンパク質と似た染色パターンがある内皮細胞の細胞内でのみヒトCLEC-1を検出可能であること、及びTGF-βも炎症刺激も細胞表面への有意な転位を促進できないことを開示した、CLEC-1の発現に関する唯一の刊行物が存在する(The human C-type lectin-like receptor CLEC-1 is upregulated by TGF-β and primarily localized in the endoplasmic membrane compartment.Sattlerら、ScandJImmunol.2012年Mar;75(3):282～92頁)。したがって、hCLEC-1に関する現況技術において利用可能な唯一の情報(即ち、内皮細胞中の細胞内局在化)は、当技術分野で知られていた情報(即ち、内皮細胞及びミエロイド系細胞の表面上に局在するrCLEC-1)とは正反対である。
【0125】
本発明者らは、定量RT-PCRによって、肺と胎盤においてCLEC-1転写産物の強い発現、及び胸腺、リンパ節、脾臓及び扁桃等のリンパ系器官においてより適度な発現を観察した(データ示さず)。ヒト細胞亜型では、好中球、単球、単球由来樹状細胞及びHAECにおいて多量のCLEC-1転写産物を発見し(図1A)、T細胞及びB細胞では転写産物は検出しなかった。単球由来樹状細胞及びEC中のCLEC-1タンパク質の存在を、CLEC-1免疫沈降、次にウエスタンブロットによって確認し(データ示さず)、これは上皮HEK細胞中で観察した少量と対照をなす。本発明者らは、細胞外ドメインを対象とするマウス抗ヒトCLEC-1モノクローナル抗体を作製し、トランスフェクトHEK細胞の細胞表面でCLEC-1の低異所性発現を観察し、文献中に以前に記載されていたことを立証した(データ示さず)。他のCLRと同様に、CLEC-1は他のアダプター鎖、他のPRR、又は有効な発現、輸送及び細胞表面安定性に充分なグリコシル化を必要とし得る。CLEC-1タンパク質の細胞表面発現は、トランスフェクト細胞において免疫組織化学法によって確認した(データ示さず)。
【0126】
作製したモノクローナル抗体を用いて、本発明者らは、自身が知る限り初めて、ヒト血中循環ミエロイド系CD16-樹状細胞(CD45+CD14-HLA-DR高CD11c+)の亜集団、及びCD14+CD16+単球(CD45+CD14+CD16+)におけるCLEC-1の細胞表面発現をフローサイトメトリーにより実証した。BDCA3+ミエロイド系樹状細胞亜集団(BDCA3+CD45+HLA-DR高CD11c低)上でも、CD123+形質細胞様樹状細胞(CD123+CD11c-HLA-DR高)上でも細胞表面発現は観察しなかった(データ示さず)。CLEC-1の低発現は好中球又はHAECの細胞表面で観察し、その発現は大部分が以前細胞内で報告されたものと同様である(図1B)。CLEC-1タンパク質の同じ局在化、及び樹状細胞上の細胞表面発現を、ヒト好中球及びECにおける細胞内CLEC-1染色を用いた免疫組織化学法によって観察した(データ示さず)。重要なことに、本発明者らがラットにおいて以前記載したことと同様に、本発明者らは、ヒトにおけるCLEC-1発現は樹状細胞においてTLRリガンド等の炎症刺激により下方制御され、TGFβにより上方制御されることを観察した(代表的ドットプロット及びMFIヒストグラム、それぞれ図1C)。
【0127】
ヒト単球由来樹状細胞におけるCLEC-1誘発はin vitro下流同種異系Th17活性化を抑制する。
CLEC-1天然リガンドは依然として確認されていないので、本発明者らは抗ヒトCLEC-1モノクローナル抗体を使用して、ヒト単球由来樹状細胞の細胞表面におけるリガンド及び交差結合CLEC-1を模倣した。低ストリンジェント条件でのCLEC-1免疫沈降後、本発明者らは、ウエスタンブロットによって、CLEC-1誘発後に予想サイズのCLEC-1(32kDa)でチロシンリン酸化を観察せず、細胞質尾部中のチロシンモチーフは直接リン酸化されないことを示唆した(データ示さず)。それにもかかわらず本発明者らは、40～50kDaサイズ近辺での数本のバンドのリン酸化の増強又は低下を伴うチロシンリン酸化パターンの幾つかの変化を観察し、CLEC-1が依然未確認の結合パートナーを介してシグナル伝達する機能的受容体であることを強く示唆した。
CLEC-1天然リガンドは依然として確認されていないので、本発明者らは抗ヒトCLEC-1モノクローナル抗体を使用して、ヒト単球由来樹状細胞の細胞表面におけるリガンド及び交差結合CLEC-1を模倣した。低ストリンジェント条件でのCLEC-1免疫沈降後、本発明者らは、ウエスタンブロットによって、CLEC-1誘発後に予想サイズのCLEC-1(32kDa)でチロシンリン酸化を観察せず、細胞質尾部中のチロシンモチーフは直接リン酸化されないことを示唆した(データ示さず)。それにもかかわらず本発明者らは、40～50kDaサイズ近辺での数本のバンドのリン酸化の増強又は低下を伴うチロシンリン酸化パターンの幾つかの変化を観察し、CLEC-1が依然未確認の結合パートナーを介してシグナル伝達する機能的受容体であることを強く示唆した。
【0128】
次いで本発明者らは、CLEC-1誘発がヒト単球由来樹状細胞のTLR誘導型成熟を調節するかどうか調査した。他の活性化又は阻害CLRに関してそれが記載されているからである。本発明者らは、CLEC-1誘発自体は、活性化マーカーCD80、CD86、CD83及びHLA-DRの発現(図2A)及びTNF-α、IL-12、IL-6、IL-23又はIL-10の産生(図2B)により、ヒト単球由来樹状細胞のLPS誘導型成熟状態を誘導せず、増大させず又は抑制することもないことを観察した。他のTLRリガンドで同様の結果を観察した(データ示さず)。
【0129】
次いで本発明者らは、下流同種異系T細胞応答を分極させるヒト単球由来樹状細胞の能力に対するCLEC-1誘発の影響を評価した。CLEC-1誘発単独(図2C)又はTLRとの併用後、後続の同種異系T細胞増殖の差は観察しなかった(データ示さず)。しかしながら、本発明者らは同種異系T細胞により分泌された有意に少ないIL-17及び多量のIFNγを示し、ヒト単球由来樹状細胞におけるCLEC-1誘発は後続の同種異系Th17活性化を低減し、Th1活性化に対する応答を歪めたことを示唆した(図2C)。
【0130】
CLRシグナル伝達がNF-kBの活性化をもたらしたと仮定して、本発明者らは、ザイモザン、DECTIN-1とTLR両方のシグナル伝達経路のアゴニスト単独又はこれと共に、CLEC-1誘発後Proteome ProfilerによりNF-kB経路関連タンパク質のレベルと活性化を調査した。本発明者らは、ザイモザンと対照的に、CLEC-1誘発自体は、NF-kB阻害剤、IkBαの劣化、及びRelAp65(Ser529)サブユニットのリン酸化によって評価されるNF-kB経路の活性化を誘導しないことを観察した(データ示さず)。しかしながら本発明者らは、CLEC-1誘発の関連はザイモザンによって誘導されるIkBαの劣化を低減したことを示した。しかしながら、p65サブユニットのリン酸化に関する有意な低減は観察しなかった。Ser529におけるリン酸化はIKKβとは無関係なので、これらのデータは、CLEC-1はIKKβ活性化経路を特に阻害し得ることを示唆する。一括すると、これらのデータは、ヒト単球由来樹状細胞におけるCLEC-1誘発は機能的に活性があること、及び本発明者らはサイトカイン産生に対する有意な影響を観察していないが、CLEC-1誘発がPRRにより誘導されるNF-kBシグナル伝達経路を制御して、それらの活性化状態を微調整し下流Th17応答を抑制し得ることを示唆する。
【0131】
ラットBMDCにおけるCLEC-1シグナル伝達の妨害によってin vitro T細胞応答が増強する。
CLEC-1の機能を洞察するため、本発明者らはCLEC-1欠損ラットを作製した。CLEC-1欠損ラットは生命力があり、健康であり、予想メンデル頻度でヘテロ接合体交配から生まれた。定常状態で、CLEC-1欠損ラットは、血中及び末梢リンパ系器官中で正常なミエロイド系及びリンパ系免疫細胞区画を示した(データ示さず)。
CLEC-1の機能を洞察するため、本発明者らはCLEC-1欠損ラットを作製した。CLEC-1欠損ラットは生命力があり、健康であり、予想メンデル頻度でヘテロ接合体交配から生まれた。定常状態で、CLEC-1欠損ラットは、血中及び末梢リンパ系器官中で正常なミエロイド系及びリンパ系免疫細胞区画を示した(データ示さず)。
【0132】
本発明者らはCLEC-1欠損ラットからBMDCを作製し、これらの細胞がLPS刺激(CD80、CD86、クラスI及びIIMHC)に応じて正常に分化し成熟することを観察した(データ示さず)。興味深いことに本発明者らは、LPS又はザイモザンによる活性化後、CLEC-1欠損BMDCが野生型ラット由来のBMDCより高レベルのIL-12p40転写産物を発現したことを観察した(データ示さず)。IL-6、IL-23、TGFβ及びIL-10発現に関して有意な差は観察しなかった。しかしながら印象的に、CLEC-1欠損BMDCは、Th17T細胞活性化の増大と関連した同種異系CD4+T細胞の増殖の増強を誘導した(図3)。
【0133】
これらのデータを更に確認するため、本発明者らはラットCLEC-1Fc融合タンパク質を作製した(データ示さず)。FcγRI結合を防止するため3アミノ酸が突然変異したIgGFc断片と融合したラットCLEC-1の細胞外ドメインからなるこの融合タンパク質は、BMDCにおけるその推定リガンドとCLEC-1の相互作用を遮断し、したがってCLEC-1欠損を模倣するはずである。同様に本発明者らは、in vitroでのMLR中CLEC-1Fc融合タンパク質の存在下で、非Foxp3同種異系エフェクターT細胞の更に顕著な増殖と更なるTh17活性化を観察した(図4)。重要なことに、抗CD3ポリクローナル活性化後、精製T細胞におけるCLEC-1FcでTh-17の誘導は観察せず(データ示さず)、この影響はBMDCにおけるCLEC-1シグナル伝達妨害に特異的であり、CLEC-1Fcの連結及びT細胞上での推定リガンドに対するアゴニスト効果によるものではなかったことを実証した。
【0134】
一括して考えると、これらのデータは、ミエロイド系細胞、特に樹状細胞におけるCLEC-1シグナル伝達の不在によって、in vitroでの有効なT細胞増殖及び活性化に必要な、それらの活性化状態が増強したことを示唆する。
【0135】
CLEC-1欠損によってin vivo樹状細胞媒介T細胞応答が増強する。
次いで本発明者らは、外来抗原キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及び完全フロイントアジュバントの皮下注射による免疫処置後の、in vivo樹状細胞媒介Th分化におけるCLEC-1の考えられる機能を調査した。最初に本発明者らは、リンパ節中の異なる亜型のcDCCD103+CD11b+におけるCLEC-1転写産物発現を評価した。興味深いことに本発明者らは、CLEC-1の発現は死細胞のファゴサイトーシスに特化したマウス中のCD8α+樹状細胞に相当するCD4-樹状細胞に限られること、及び細胞毒性活性を示すことを観察した(図5A)。
次いで本発明者らは、外来抗原キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)及び完全フロイントアジュバントの皮下注射による免疫処置後の、in vivo樹状細胞媒介Th分化におけるCLEC-1の考えられる機能を調査した。最初に本発明者らは、リンパ節中の異なる亜型のcDCCD103+CD11b+におけるCLEC-1転写産物発現を評価した。興味深いことに本発明者らは、CLEC-1の発現は死細胞のファゴサイトーシスに特化したマウス中のCD8α+樹状細胞に相当するCD4-樹状細胞に限られること、及び細胞毒性活性を示すことを観察した(図5A)。
【0136】
免疫処置後、本発明者らは、腋窩リンパ節のin vitro二次刺激後に、多数のIL-17+、IL-17+IFNγ+及びIFNγ+CD4+T細胞が付随した免疫処置したCLEC-1欠損ラットからのKLH特異的CD4+T細胞の増殖の増大を観察した(ヒストグラム及び代表的ドットプロット、図5B)。重要なことに、KLHに対する回想応答の増強も、野生型ラット由来の樹状細胞の存在下において、免疫処置したCLEC-1欠損ラット由来の精製CD4+T細胞で観察し、in vivoでのCLEC-1不在下T細胞プライミングの特異的増大を実証した(データ示さず)。
【0137】
これらのデータは、in vivoではcDCにおけるCLEC-1シグナル伝達の欠損は、下流T細胞媒介免疫応答を悪化させることを実証する。
【0138】
考察
この試験において本発明者らは、自身が知る限り初めて、ヒトCLEC-1は、後続のエフェクターTh17応答を抑制する機能的樹状細胞表面制御受容体であることを実証した。更にCLEC-1欠損ラットによって、過剰な樹状細胞媒介CD4+T細胞プライミングを予防する際のin vivoでのCLEC-1の役割が明らかになった。ラット中と同様に、本発明者らは、ヒト単球由来樹状細胞中でのCLEC-1発現は炎症刺激によって低下し、TGFβによって上方制御されることを観察した。炎症刺激後に低下を伴う樹状細胞におけるこの発現プロファイルは、in vivoでT細胞応答及び炎症を抑制することも示されている、MICL又はDCIR等の他の阻害性受容体に関して観察された古典的応答を表す(Uto Tら、Clec4A4 is a regulatory receptor for dendritic cells that impairs inflammation and T-cell immunity.Nat Commun.2016年;7:11273)(Redelinghuys Pら、MICL controls inflammation in rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis.2015年)。興味深いことに本発明者らは、ラットでは、リンパ系器官内のcDCのCD4+亜集団によってCLEC-1が発現されることを発見した。樹状細胞のこの亜集団は、細胞毒性活性及び死細胞のファゴサイトーシスに関与し、IL-12の主要産生体であり腫瘍抗原の交差提示に関与することが記載されている、マウスのCD8α+樹状細胞相当物に相当する。この発現パターンは、CD8α-cDCに限定されることが示されている阻害性受容体DCIR-2とは対照的である。それにもかかわらず、ヒト血中では、BDCA3+樹状細胞、ヒトのCD8α+樹状細胞相当物ではなく、CD16-CD14-ミエロイド系樹状細胞の亜集団における細胞表面でCLEC-1が発現されることを観察した。ヒトとげっ歯類の間のこの不一致は更なる調査が必要である。本発明者らは、CLEC-1シグナル伝達の妨害によって特にin vitroでの樹状細胞媒介Th17活性化は高まるが、Th1応答とTh17応答の両方がin vivo免疫処置後に増強することを観察した。これはCLEC-1が、PRRの同時係合によりTh1及びTh17応答を異なる形式で抑制し得ることを示唆する。逆に、樹状細胞における活性化受容体として作用するDECTIN-1は、分極化サイトカインIL-12及びIL-23の分泌を微調整することにより、リガンドとPRRの同時係合によりTh17/Th1バランスを異なる形式で促進する(Gringhuis SIら、Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk.Nat Immunol.2009年;10(2)203～213頁)(LeibundGut-Landmann Sら、Syk-and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin17.Nat Immunol.2007年;8(6)630～638頁)(Lee EJら、Mincle Activation and the Syk/Card9 Signaling Axis Are Central to the Development of Autoimmune Disease of the Eye.J Immunol.2016年;196(7):3148～3158頁)。例えば、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus Fumigatus)の刺激に応答し、マウス中でDECTIN-1は、IFN-γとIL12p40の発現を低減させそれによりTh1分極を低減することによって、特にTh17分化を増強することが示された。興味深いことに本発明者らは、樹状細胞におけるCLEC-1シグナル伝達がTh17分極化サイトカインのPRR誘導型発現を抑制することは観察せず、ノックアウトラットBMDCにおけるIL-12p40産生に対する影響のみを示した。これらの結果は、樹状細胞中でCLEC-1は、分極化サイトカインの発現以外のメカニズムによって、Th17/Th1バランスを整えることができることを示唆する。例えばDECTIN-1シグナル伝達は、樹状細胞における同時刺激分子Ox40リガンドの発現を調節することによっても、T細胞分極化の運命に影響を与えることが示されている(Joo Hら、Opposing Roles of Dectin-1 Expressed on Human Plasmacytoid Dendritic Cells and Myeloid Dendritic Cells in Th2 Polarization.J Jmmunol.2015年;195(4):1723～1731頁)。興味深いことに本発明者らは、ヒト樹状細胞におけるCLEC-1誘発が、DECTIN-1シグナル伝達によって誘導されるIkBαの劣化を妨げることを観察した。したがってCLEC-1は、活性化CLRにより媒介されTh17応答を特異的に持続することが知られるCard9シグナル伝達経路も妨げる可能性がある。
この試験において本発明者らは、自身が知る限り初めて、ヒトCLEC-1は、後続のエフェクターTh17応答を抑制する機能的樹状細胞表面制御受容体であることを実証した。更にCLEC-1欠損ラットによって、過剰な樹状細胞媒介CD4+T細胞プライミングを予防する際のin vivoでのCLEC-1の役割が明らかになった。ラット中と同様に、本発明者らは、ヒト単球由来樹状細胞中でのCLEC-1発現は炎症刺激によって低下し、TGFβによって上方制御されることを観察した。炎症刺激後に低下を伴う樹状細胞におけるこの発現プロファイルは、in vivoでT細胞応答及び炎症を抑制することも示されている、MICL又はDCIR等の他の阻害性受容体に関して観察された古典的応答を表す(Uto Tら、Clec4A4 is a regulatory receptor for dendritic cells that impairs inflammation and T-cell immunity.Nat Commun.2016年;7:11273)(Redelinghuys Pら、MICL controls inflammation in rheumatoid arthritis.Ann Rheum Dis.2015年)。興味深いことに本発明者らは、ラットでは、リンパ系器官内のcDCのCD4+亜集団によってCLEC-1が発現されることを発見した。樹状細胞のこの亜集団は、細胞毒性活性及び死細胞のファゴサイトーシスに関与し、IL-12の主要産生体であり腫瘍抗原の交差提示に関与することが記載されている、マウスのCD8α+樹状細胞相当物に相当する。この発現パターンは、CD8α-cDCに限定されることが示されている阻害性受容体DCIR-2とは対照的である。それにもかかわらず、ヒト血中では、BDCA3+樹状細胞、ヒトのCD8α+樹状細胞相当物ではなく、CD16-CD14-ミエロイド系樹状細胞の亜集団における細胞表面でCLEC-1が発現されることを観察した。ヒトとげっ歯類の間のこの不一致は更なる調査が必要である。本発明者らは、CLEC-1シグナル伝達の妨害によって特にin vitroでの樹状細胞媒介Th17活性化は高まるが、Th1応答とTh17応答の両方がin vivo免疫処置後に増強することを観察した。これはCLEC-1が、PRRの同時係合によりTh1及びTh17応答を異なる形式で抑制し得ることを示唆する。逆に、樹状細胞における活性化受容体として作用するDECTIN-1は、分極化サイトカインIL-12及びIL-23の分泌を微調整することにより、リガンドとPRRの同時係合によりTh17/Th1バランスを異なる形式で促進する(Gringhuis SIら、Dectin-1 directs T helper cell differentiation by controlling noncanonical NF-kappaB activation through Raf-1 and Syk.Nat Immunol.2009年;10(2)203～213頁)(LeibundGut-Landmann Sら、Syk-and CARD9-dependent coupling of innate immunity to the induction of T helper cells that produce interleukin17.Nat Immunol.2007年;8(6)630～638頁)(Lee EJら、Mincle Activation and the Syk/Card9 Signaling Axis Are Central to the Development of Autoimmune Disease of the Eye.J Immunol.2016年;196(7):3148～3158頁)。例えば、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus Fumigatus)の刺激に応答し、マウス中でDECTIN-1は、IFN-γとIL12p40の発現を低減させそれによりTh1分極を低減することによって、特にTh17分化を増強することが示された。興味深いことに本発明者らは、樹状細胞におけるCLEC-1シグナル伝達がTh17分極化サイトカインのPRR誘導型発現を抑制することは観察せず、ノックアウトラットBMDCにおけるIL-12p40産生に対する影響のみを示した。これらの結果は、樹状細胞中でCLEC-1は、分極化サイトカインの発現以外のメカニズムによって、Th17/Th1バランスを整えることができることを示唆する。例えばDECTIN-1シグナル伝達は、樹状細胞における同時刺激分子Ox40リガンドの発現を調節することによっても、T細胞分極化の運命に影響を与えることが示されている(Joo Hら、Opposing Roles of Dectin-1 Expressed on Human Plasmacytoid Dendritic Cells and Myeloid Dendritic Cells in Th2 Polarization.J Jmmunol.2015年;195(4):1723～1731頁)。興味深いことに本発明者らは、ヒト樹状細胞におけるCLEC-1誘発が、DECTIN-1シグナル伝達によって誘導されるIkBαの劣化を妨げることを観察した。したがってCLEC-1は、活性化CLRにより媒介されTh17応答を特異的に持続することが知られるCard9シグナル伝達経路も妨げる可能性がある。
【0139】
本発明者らは、CLEC-1Fc融合タンパク質を用いて、内在性リガンドを発現する細胞を検出することができていない。それにもかかわらず、本発明者らのデータは、CLEC-1リガンドは造血細胞によって発現される可能性があり、又は「自然に」又は特定組織若しくは細胞損傷の状況で放出される可能性があることを示唆する。DCIR-2又は代替的にT細胞上での場合と同様に、CLEC-1発現細胞自体によってリガンドが発現される可能性がある。内在性DECTIN-1シグナル伝達はT細胞によって発現され、CLEC-1とは対照的にT細胞増殖を増強する同時刺激分子として作用することが報告されている(Ariizumi Kら、Identification of a novel、dendritic cell-associated molecule、dectin-1、by subtractive cDNA cloning.J Biol Chem.2000年;275(26):20157～20167頁)。
【0140】
これらの発見は、樹状細胞中での下流T細胞活性化の程度及び質の厳密な制御におけるCLEC-1の妥当性を立証し、細胞表面受容体としてT細胞応答を操作するための治療ツールをもたらし得る。
【0141】
したがってCLEC-1は、ミエロイド系細胞中で細胞表面阻害受容体として、がんにおける治療介入及び新たな治療範例の潜在的標的を強調表示する。
【0142】
幾つかの実験研究は、細胞接着又はT細胞応答形成において、CLRがそれらの機能によってがんの進行と転移蔓延に貢献することを実証する(Yan、Kamiyaら、2015年;Ding、Yaoら、2017年)。例えば、免疫調節受容体DC-SIGN、MINCLE、DCIR及びBDCA-2はミエロイド系細胞の活性化、炎症を阻害し、Foxp3+CD4+CD25+Tregの膨張的増殖を誘導するのに重要であることが示されている(Yan、Kamiyaら、2015年;Ding、Yaoら、2017年)。DC-SIGNはほぼ全てのヒト癌腫において過剰発現されるがん胎児性抗原を認識し(Nonaka、Maら、2008年)、ミエロイド系細胞による免疫抑制性サイトカインIL-10及びIL-6の分泌を促進する。その上、DC-SIGN遺伝子プロモーターにおける多型性は、結腸直腸がん患者におけるリスクの増大と関連することが分かった(Lu、Bevierら、2013年)。MINCLEは膵管腺癌における腫瘍浸潤白血球において、及び特にミエロイド抑制細胞(MSC)によって増強することが示された。死細胞から放出されたSAP130(ヒストンデアセチラーゼ複合体のサブユニット)とMINCLEの連結は、強い腫瘍周辺抑制を誘導する(Seifert、Werbaら、2016年)。同様にCLRLOX-1は、がん患者中の血液又は腫瘍浸潤好中球の細胞表面で特異的に増強し(15～50%)、一方で健常ドナーの血液中ではほぼ検出不能であることが示されている(Condamine、Dominguezら、2016年)。この試験において彼らは、小胞体ストレスがLOX-1の発現を誘導し、強い抑制機能を有するMSCに好中球を転換することを示した。
【0143】
逆に、DECTIN-1等の活性化CLRのシグナル伝達の誘発は、抗腫瘍免疫をもたらしTreg及びMSCを減少させることが示されている(Tian、Maら、2013年)。β-グルカン、DECTIN-1のリガンドの投与は、ネズミ癌腫モデル(Li、Caiら、2010年;Masuda、Inoueら、2013年;Tian、Maら、2013年)、ヒトメラノーマ、神経芽腫、リンパ腫異種移植片モデル(Modak、Koehneら、2005年)、並びにヒト卵巣及び胃がん(Inoue、Tanakaら、1993年;Oba、Kobayashiら、2009年)において腫瘍増殖を阻害する。
【0144】
したがって、CLEC-1アンタゴニストによる樹状細胞の増強又はより広範囲のミエロイド系細胞活性化は、免疫チェックポイント標的を表し、がんにおいて重要な臨床的意義を有し得る下流エフェクターT細胞免疫を調節することができる。
【実施例2】
【0145】
本発明者らは、CLEC-1Fc融合タンパク質を用いたCLEC-1の遮断によって、白血球混合反応(MLR)においてT細胞増殖が増強することをラットにおいて以前に示した(実施例1参照)。本発明者らは、ヒトCLEC-1の細胞外部分を対象とする幾つかのモノクローナル抗体を作製し、本発明者らは、1つのモノクローナル抗体はCLEC-1シグナル伝達のアンタゴニストである可能性があり、したがって白血球混合反応(MLR)においてT細胞増殖及びIFN-γ産生を増強することを示す。MLRは、高レベルのCLEC-1を発現する同種異系単球由来樹状細胞(12.5×103)と混合した、末梢血(5×104)から単離した精製T細胞からなっていた。アイソタイプ対照(IgG1)又は抗ヒトCLEC-1抗体を0.5～10μg/mlの用量で5日間加えた。次いでT細胞の増殖をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル希釈により評価し、IFN-γ発現の発現はT細胞ではフローサイトメトリーにより、上清ではELISAにより評価した(図6A及び6B、6Cのヒストグラム及び代表的プロット)。
【実施例3】
【0146】
CLEC-1は腫瘍中で高度に発現され腫瘍免疫において機能的役割を果たす
(hepa1.6腫瘍細胞を肝臓門脈内に注射した)マウス肝臓癌モデルにおいて、本発明者らは腫瘍中のCLEC-1の増大した持続的発現を観察した(図7a)。重要なことに、このモデルでは、(親切にもDerrick J.Rossi、Harvard Stem Cell Institute社、Cambridgeにより寄贈された)CLEC-1に欠損があるマウスは腫瘍増殖に対して優れた耐性があり高い生存率を示した(ノックアウトマウスで平均生存日数28日及び野生型マウスで21日)(図7b)。同様に、皮下注射(sc.)ラットグリオームモデル(C6)において、本発明者らは、(本発明者らの研究室中でZFN技術により作製した)5匹のCLEC-1欠損ラットの3匹において腫瘍の完全な退行を観察した(図7c)。重要なことに、Q-PCRにより、腫瘍細胞接種後第18日に採取した腫瘍において、inos、tnfa及びifngの高いmRNA発現をCLEC-1欠損ラット由来の腫瘍中で評価した(図7d)。更に、ifngの高いmRNA発現をリンパ節中で検出した(図7d)。これらのデータはCLEC-1欠損ラットにおけるより良い抗腫瘍応答を実証し、CLEC1の不在によってより抗腫瘍的なM1マクロファージ及びより細胞毒性的且つTh1的T細胞が誘導されたことを示唆する。
(hepa1.6腫瘍細胞を肝臓門脈内に注射した)マウス肝臓癌モデルにおいて、本発明者らは腫瘍中のCLEC-1の増大した持続的発現を観察した(図7a)。重要なことに、このモデルでは、(親切にもDerrick J.Rossi、Harvard Stem Cell Institute社、Cambridgeにより寄贈された)CLEC-1に欠損があるマウスは腫瘍増殖に対して優れた耐性があり高い生存率を示した(ノックアウトマウスで平均生存日数28日及び野生型マウスで21日)(図7b)。同様に、皮下注射(sc.)ラットグリオームモデル(C6)において、本発明者らは、(本発明者らの研究室中でZFN技術により作製した)5匹のCLEC-1欠損ラットの3匹において腫瘍の完全な退行を観察した(図7c)。重要なことに、Q-PCRにより、腫瘍細胞接種後第18日に採取した腫瘍において、inos、tnfa及びifngの高いmRNA発現をCLEC-1欠損ラット由来の腫瘍中で評価した(図7d)。更に、ifngの高いmRNA発現をリンパ節中で検出した(図7d)。これらのデータはCLEC-1欠損ラットにおけるより良い抗腫瘍応答を実証し、CLEC1の不在によってより抗腫瘍的なM1マクロファージ及びより細胞毒性的且つTh1的T細胞が誘導されたことを示唆する。
【0147】
CLEC-1の発現は交差提示に特化したcDCに限られる
興味深いことに本発明者らは、ラットとマウスの両方において、二次リンパ器官由来cDCによるCLEC-1の発現は、抗原(ラットではCD4+、マウスではCD8+)の交差提示に特化した樹状細胞の特定サブセットに限られることを観察した(図5A)。これらの細胞は高レベルのIL-12を分泌し、抗腫瘍細胞毒性CD8+Tリンパ球(CTL)応答の活性化を担うことが示された。したがって、樹状細胞の特定サブセットにおける阻害受容体として作用することにより、CLEC-1誘発はIL-12産生、有効な交差提示及び腫瘍抗原に対するCTL応答を妨げる可能性がある。
興味深いことに本発明者らは、ラットとマウスの両方において、二次リンパ器官由来cDCによるCLEC-1の発現は、抗原(ラットではCD4+、マウスではCD8+)の交差提示に特化した樹状細胞の特定サブセットに限られることを観察した(図5A)。これらの細胞は高レベルのIL-12を分泌し、抗腫瘍細胞毒性CD8+Tリンパ球(CTL)応答の活性化を担うことが示された。したがって、樹状細胞の特定サブセットにおける阻害受容体として作用することにより、CLEC-1誘発はIL-12産生、有効な交差提示及び腫瘍抗原に対するCTL応答を妨げる可能性がある。
【0148】
CLEC-1はM2型腫瘍随伴マクロファージによって発現され、胸膜中皮腫由来及び卵巣腫瘍腹水由来のミエロイド系細胞によって発現される。
本発明者らは、M1型抗腫瘍マクロファージと比較して、又はM0マクロファージと比較して、ヒトM2型腫瘍随伴マクロファージにおいて転写産物レベル(a)とタンパク質レベル(b)の両方で高度なCLEC-1発現を観察した(図8)。更に本発明者らは、対照アイソタイプと比較して、胸膜中皮腫由来のヒトミエロイド系CD45+HLADR+CD16+細胞上(c)、及び卵巣腫瘍腹水由来のCD14+ミエロイド系細胞上(d)で、CLEC-1細胞表面タンパク質の発現を観察した(図8)。これらのデータは、CLEC-1の発現は腫瘍微小環境中ミエロイド系細胞上で増強し、腫瘍免疫回避において重要な役割を果たし得ることを実証する。
本発明者らは、M1型抗腫瘍マクロファージと比較して、又はM0マクロファージと比較して、ヒトM2型腫瘍随伴マクロファージにおいて転写産物レベル(a)とタンパク質レベル(b)の両方で高度なCLEC-1発現を観察した(図8)。更に本発明者らは、対照アイソタイプと比較して、胸膜中皮腫由来のヒトミエロイド系CD45+HLADR+CD16+細胞上(c)、及び卵巣腫瘍腹水由来のCD14+ミエロイド系細胞上(d)で、CLEC-1細胞表面タンパク質の発現を観察した(図8)。これらのデータは、CLEC-1の発現は腫瘍微小環境中ミエロイド系細胞上で増強し、腫瘍免疫回避において重要な役割を果たし得ることを実証する。
【0149】
結論として、前述の結果(特に、CLEC-1Fc融合タンパク質とヒトCLEC-1の細胞外部分を対象とする抗体が、T細胞増殖を増強することを示す結果)を鑑みると、がんの治療にCLEC-1アンタゴニストを使用できることは確かなようである。
【0150】
参照文献:
本出願を通じて、様々な参照文献が、本発明が属する技術分野の現況を記載する。これらの参照文献の開示は、参照により本開示に組み込まれている。
本出願を通じて、様々な参照文献が、本発明が属する技術分野の現況を記載する。これらの参照文献の開示は、参照により本開示に組み込まれている。
【図1A】
【図1B-1】
【図1B-2】
【図1C-1】
【図1C-2】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5A】
【図5B-1】
【図5B-2】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6B】
【図6C】
【図7ABC】
【図7D】
【図8AB】
【図8C】
【図8D】
【配列表】