▶ ニューラクル ジェネティクス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-03
(45)【発行日】2022-03-11
(54)【発明の名称】ＰＤ－Ｌ１結合力が増大したＰＤ－１変異体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20220304BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220304BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220304BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220304BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220304BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20220304BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20220304BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220304BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220304BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220304BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/705 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
A61K38/17
A61P37/04
A61P35/00
A61P31/00
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020563883
(86)(22)【出願日】2019-01-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-05-20
(86)【国際出願番号】 KR2019001290
(87)【国際公開番号】W WO2019151771
(87)【国際公開日】2019-08-08
【審査請求日】2020-07-31
(31)【優先権主張番号】10-2018-0013381
(32)【優先日】2018-02-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2019-0011181
(32)【優先日】2019-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】520288331
【氏名又は名称】ニューラクル ジェネティクス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ジュン，サン テク
(72)【発明者】
【氏名】チュン，クァン－ジン
(72)【発明者】
【氏名】ハ，ジ ヨン
【審査官】大久保 智之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－１５７３５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１７／０５３１７０（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／１６４４２８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１０６５９２（ＷＯ，Ａ２）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－９０
Ｃ１２Ｎ １／００－３８
Ｃ０７Ｋ １４／００－１６／４６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）結合力が増大したＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）変異体であって、前記ＰＤ－１変異体は、１以上のアミノ酸置換を有している配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記１以上のアミノ酸置換が、Ｃ６９Ｔ、Ｃ６９Ｙ、Ｃ６９Ｇ又はＣ６９Ａを含む、ＰＤ－１変異体。
【請求項2】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｓ３６Ｐをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項3】
ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）結合力が増大したＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）変異体であって、前記ＰＤ－１変異体は、複数のアミノ酸置換を有している配列番号６１のアミノ酸配列を含み、前記複数のアミノ酸置換が、ｉ）Ｆ１３Ｌ、Ｎ２５Ｄ、Ｃ６９Ｓ及びＮ９２Ｓ；又は
ｉｉ）Ｓ３６Ｐ、Ｃ６９Ｓ及びＬ１１４Ｐ
を含む、ＰＤ－１変異体。
【請求項4】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｌ１１４Ｐをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項5】
前記１以上又は複数のアミノ酸置換が、Ｔ１２Ｓ、Ｎ３４Ｔ、Ｋ１０７Ｎ、Ｈ１３１Ｒ、Ｐ１３２Ｌ及びＦ１４２Ｌから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項１又は３に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項6】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｆ１３Ｉ及びＭ４６Ｉをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項7】
前記１以上のアミノ酸置換が、Ｎ１Ｓ、Ｌ１７Ｍ、Ｓ３６Ｐ、Ｎ５０Ｓ、Ｇ７９Ｒ、Ｇ１００Ｖ、Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１２７Ａ及びＡ１３９Ｌから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項６に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項8】
前記複数のアミノ酸置換が、Ｒ８８Ｋ、Ａ１２５Ｓ及びＲ１３７Ｋから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含むことを特徴とする、請求項３に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項9】
前記ＰＤ－１変異体は無糖化ＰＤ－１変異体であることを特徴とする、請求項１又は３に記載のＰＤ－１変異体。
【請求項10】
請求項１又は３のＰＤ－１変異体をコードする核酸分子。
【請求項11】
請求項１０の核酸分子を含むベクター。
【請求項12】
請求項１１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項13】
前記宿主細胞は細菌細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項14】
請求項１若しくは３のＰＤ－１変異体、請求項１０の核酸分子又は請求項１１のベクターを有効成分として含む野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合抑制剤。
【請求項15】
請求項１若しくは３のＰＤ－１変異体、請求項１０の核酸分子又は請求項１１のベクターを有効成分として含む組成物。
【請求項16】
前記組成物は癌疾患又は感染性疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
下記の段階を含むＰＤ－１変異体の製造方法：ａ）請求項１又は３のＰＤ－１変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及びｂ）前記宿主細胞によって発現したＰＤ－１変異体を回収する段階。
【請求項18】
下記の段階を含む、Ｃ６９Ｔ、Ｃ６９Ｙ、Ｃ６９Ｇ又はＣ６９Ａを維持しているＰＤ－１変異体のスクリーニング方法：ａ）請求項１のＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子にさらに無作為的な点突然変異を加えたＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子のライブラリーを構築する段階；及びｂ）前記ライブラリーから野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合を抑制するＰＤ－１変異体を選別する段階。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＰＤ－Ｌ１結合力が増大して野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合を効果的に抑制するＰＤ－１変異体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
癌治療のための医薬品は低分子医薬品と高分子医薬品とに大別され、特異性がないため副作用が相対的に大きい低分子医薬品に比べて、特異性のある高分子医薬品が治療剤として脚光を浴びている。
【0003】
近年、癌を治療するための方法として、免疫関門抑制タンパク質のうち、特にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合の遮断が癌治療に大きな効果があり、他の免疫関門抑制タンパク質に比べて副作用が少ないという結果が学界に報告された（Ｊ．Ｎａｉｄｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｌｕｃｉａ Ｇｅｌａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｔｏｘｉｎｓ，Ｇｏｒｇｅ Ｋ．Ｐｈｉｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）。
【0004】
Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂなどの大手製薬企業がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１免疫関門抑制を用いた治療用医薬品の開発のために努力しており、ＹＥＲＶＯＹ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、ＯＰＤＩＶＯ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）のような抗癌目的の医薬品を抗体フォーマットを用いて開発中である。
【0005】
また、腫瘍とＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合中であるＴＩＬｓ（Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の結合を除去するためには細胞浸透力に優れた治療剤が必要であるが、抗体は１５０ｋＤａの非常に大きい巨大分子タンパク質であり、浸透するのに不利な点がある。
【0006】
効果的な免疫関門抑制を用いた癌治療のためには、サイズがＰＤ－Ｌ１に比べて小さくて細胞浸透力に優れたＰＤ－１がより適していると見なされるが、既存のＰＤ－１エンジニアリングは酵母ディスプレイ（ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ）を用いたスクリーニングを行っており、グリカンの非均質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙ）及び多くの突然変異の誘発による免疫原性存在の可能性がある。
【0007】
一方、無糖化形態のタンパク質医薬品はバクテリアでも安価な大量生産が容易であり、また、細胞株、培養工程及び精製工程による糖化非均質性（ｇｌｙｃａｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｔｙ）の問題が全くないので、生物医薬品の製造に大きなメリットがある。
【0008】
したがって、少ない突然変異を持つ無糖化形態のＰＤ－１として、ＰＤ－Ｌ１との結合力が高い変異体の発掘が必要である。
【0009】
上記の背景技術として説明された事項は、本発明の背景に対する理解増進のためのものに過ぎず、この技術分野における通常の知識を有する者に既に知られた従来技術に該当することを認めるものとして理解してはならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１との結合力が高くて野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合を効果的に抑制できるとともに、免疫原性発生の可能性を最小化できるＰＤ－１変異体を見つけようと鋭意努力をした。その結果、野生型ＰＤ－１の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによってＰＤ－Ｌ１との結合力が大きくに向上し、突然変異位置の最小化及び／又は無糖化ＰＤ－１の具現によって免疫原性発生の可能性を減少させることができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【0011】
したがって、本発明の目的は、ＰＤ－Ｌ１結合力が増大したＰＤ－１変異体を提供することにある。
【0012】
本発明の他の目的は、前記ＰＤ－１変異体をコードする核酸分子を提供することにある。
【0013】
本発明のさらに他の目的は、前記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【0014】
本発明のさらに他の目的は、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することにある。
【0015】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを含む組成物を提供することにある。
【0016】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体の製造方法を提供することにある。
【0017】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを有効成分として含む野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合抑制剤を提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを対象体に有効量投与する段階を含む野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合抑制方法を提供することにある。
【0019】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを対象体に治療学的有効量投与する段階を含む癌疾患又は感染性疾患の治療方法を提供することにある。
【0020】
本発明のさらに他の目的は、前記ＰＤ－１変異体のスクリーニング方法を提供することにある。
【0021】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【0022】
本発明の一態様によれば、本発明は、ＰＤ－Ｌ１結合力が増大したＰＤ－１変異体を提供する。
【0023】
本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１との結合力が高くて野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合を効果的に抑制できるとともに、免疫原性発生の可能性を最小化できるＰＤ－１変異体を見つけようと鋭意努力をした。その結果、野生型ＰＤ－１の一部のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによってＰＤ－Ｌ１との結合力が大きく向上し、突然変異位置の最小化及び／又は無糖化ＰＤ－１の具現によって免疫原性発生の可能性を減少させることができることを確認した。
【0024】
本明細書において用語“ＰＤ－１変異体”又は“プログラム細胞死タンパク質（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）－１変異体”は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が置換、欠失又は付加された形態の変異を含む変異体を意味する。
【0025】
本発明の好ましい具現例によれば、前記野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列は、配列目録第６１配列のアミノ酸配列を含む。
【0026】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）結合力が増大したＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）変異体は、野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１のアミノ酸配列の一部を含み、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の６９番目のアミノ酸が野生型のアミノ酸と異なる配列に置換されたものを含む。
【0027】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、前記６９番目のアミノ酸がＣ６９Ｓ、Ｃ６９Ｔ、Ｃ６９Ｙ、Ｃ６９Ｇ又はＣ６９Ａに置換されたものを含む。
【0028】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の３６番目のアミノ酸がＳ３６Ｐに置換されたものをさらに含む。
【0029】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の１１４番目のアミノ酸がＬ１１４Ｐに置換されたものをさらに含む。
【0030】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の１２番目、３４番目、９２番目、１０７番目、１３１番目、１３２番目及び１４２番目のアミノ酸から構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸が野生型のアミノ酸と異なる配列に置換されたものをさらに含む。
【0031】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、Ｔ１２Ｓ、Ｎ３４Ｔ、Ｎ９２Ｋ、又はＮ９２Ｓ、Ｋ１０７Ｎ、Ｈ１３１Ｒ、Ｐ１３２Ｌ及びＦ１４２Ｌから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含む。
【0032】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の１３番目のアミノ酸がＦ１３Ｉ又はＦ１３Ｌに、４６番目のアミノ酸がＭ４６Ｉに置換されたものをさらに含む。
【0033】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の１番目、１７番目、３６番目、５０番目、７９番目、１００番目、１１４番目、１２７番目及び１３９番目のアミノ酸から構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸が野生型のアミノ酸と異なる配列に置換されたものをさらに含む。
【0034】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、Ｎ１Ｓ、Ｌ１７Ｍ、Ｓ３６Ｐ、Ｎ５０Ｓ、Ｇ７９Ｒ、Ｇ１００Ｖ、Ｌ１１４Ｐ、Ｖ１２７Ａ及びＡ１３９Ｌから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含む。
【0035】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の２５番目のアミノ酸がＮ２５Ｄに、９２番目のアミノ酸がＮ９２Ｓ又はＮ９２Ｋに置換されたものをさらに含む。
【0036】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の１３番目のアミノ酸がＦ１３Ｉ又はＦ１３Ｌに置換されたものをさらに含む。
【0037】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、配列目録第６１配列の野生型ＰＤ－１のアミノ酸配列中の９番目、８８番目、１０１番目、１２５番目及び１３７番目のアミノ酸から構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸が野生型のアミノ酸と異なる配列に置換されたものをさらに含む。
【0038】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、Ｎ９Ｄ、Ｒ８８Ｋ、Ａ１０１Ｖ、Ａ１２５Ｓ及びＲ１３７Ｋから構成された群から選ばれる１以上のアミノ酸置換を含む。
【0039】
本発明の好ましい具現例によれば、前記ＰＤ－１変異体は、無糖化ＰＤ－１変異体である。
【0040】
現在商用化している大部分の治療用タンパク質は動物細胞培養によって製造されているが、タンパク質を生産する時、様々な糖（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）変異体がタンパク質に修飾され、これによる糖化非均質性（ｇｌｙｃａｎ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｅｔｙ）は治療用タンパク質の効能及び安定性に変異を誘発し、抗体製造工程において精製、分析、ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）に高費用が要求される。
【0041】
高価の動物細胞培養システムが要求される前記糖化タンパク質に比べて無糖化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）タンパク質はバクテリアで大量生産が可能であり、且つ速度及び費用の面において非常に優れる。
【0042】
本発明の他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体をコードする核酸分子、これを含むベクター又は該ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【0043】
本発明の好ましい具現例によれば、前記宿主細胞は細菌細胞である。
【0044】
本発明の核酸分子は単離したもの又は組み換えられたものであり得、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡ及びＲＮＡだけでなく、対応する相補性配列が含まれる。“単離した核酸”は、天然生成源泉から単離した核酸の場合、核酸が単離した個体のゲノムに存在する周辺遺伝配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に又は化学的に合成された核酸、例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドの場合、当該手順から生成された核酸が単離した核酸分子として理解され得る。単離した核酸分子は、別個断片の形態又はより大きい核酸構築物の成分としての核酸分子を表す。核酸は他の核酸配列と機能的関係で配置されるとき、“作動可能に連結”される。例えば、前配列又は分泌リーダー（ｌｅａｄｅｒ）のＤＮＡは、ポリペプチドが分泌される前の形態である前タンパク質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーター又はエンハンサーは、ポリペプチド配列の転写に影響を与える場合、コーディング配列に作動可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されるとき、コーディング配列に作動可能に連結される。一般に、“作動可能に連結された”とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接して位置することを意味し、分泌リーダーの場合、隣接して同一のリーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは隣接して位置する必要はない。連結は、便利な制限酵素部位でライゲーションにより達成される。このような部位が存在していない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを通常の方法によって使用する。
【0045】
本明細書において用語“ベクター”は、核酸配列を複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入できる伝達体を意味する。核酸配列は外生（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）又は異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であり得る。ベクターとしてはプラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）を挙げることができるが、これに制限されない。当業者は標準的な組換え技術によってベクターを構築することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ，ＮＹ，１９９４など）。
【0046】
本明細書において用語“発現ベクター”は、転写される遺伝子産物のうち少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターを意味する。一部の場合には、その後、ＲＮＡ分子がタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドに翻訳される。発現ベクターには様々な調節配列を含めることができる。転写及び翻訳を調節する調節配列の他に、ベクター及び発現ベクターには他の機能も提供する核酸配列が含まれ得る。
【0047】
本明細書において用語“宿主細胞”は真核生物及び原核生物を含み、前記ベクターを複製できるか或いはベクターによってコードされる遺伝子を発現させ得る任意の形質転換可能な生物を意味する。宿主細胞は前記ベクターによって形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）又は形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）可能であり、これは、外生の核酸分子が宿主細胞内に伝達又は導入される過程を意味する。
【0048】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の宿主細胞は、細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）細胞、好ましくはグラム陰性細菌細胞である。前記細胞は内膜と外膜との間に原形質膜周囲空間領域（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）を有する点で本発明の実施に適する。本発明の好ましい宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ヘモフィルスインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉ）、エルウィニアアミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）などが含まれるが、これに制限されるものではない。
【0049】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを有効成分として含む野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合抑制剤を提供する。
【0050】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを有効成分として含む組成物を提供する。
【0051】
前記組成物は、好ましくは薬剤学的組成物、より好ましくは癌疾患又は感染性疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物である。
【0052】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを対象体に有効量投与する段階を含む野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合抑制方法を提供する。
【0053】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを対象体に有効量投与する段階を含む免疫反応増加方法を提供する。
【0054】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクターを対象体に治療学的有効量投与する段階を含む癌疾患又は感染性疾患の治療方法を提供する。
【0055】
本発明の薬剤学的組成物は、（ａ）前記ＰＤ－１変異体、核酸分子又はベクター；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことができる。
【0056】
本発明が予防又は治療しようとする癌の種類は制限されず、白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）及び急性リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性非リンパ球白血病（ａｃｕｔｅ ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）、慢性リンパ球白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）、非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）及び多発骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ）などのようなリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、網膜芽細胞腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ Ｔｕｍｏｒ）、骨腫瘍（ｂｏｎｅ ｔｕｍｏｒｓ）及び軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ－ｔｉｓｓｕｅ ｓａｒｃｏｍａｓ）などのような小児固形腫瘍（ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、尿路癌（ｕｒｉｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒｓ）、子宮癌（ｕｔｅｒｉｎｅ ｃａｎｃｅｒｓ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒｓ）、膵癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、黒色腫（ｍｅｌａｎｏｍａ）及びその他皮膚癌（ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒｓ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ）、肝癌（ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、喉頭癌（ｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺癌（ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）及び精巣癌（ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃａｎｃｅｒ）などのような成人の通常の固形腫瘍（ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ）を含めて多数の癌を治療するように投与され得る。
【0057】
本発明が予防又は治療しようとする感染性疾患の種類は制限されず、ウイルスによる感染、インフルエンザによる感染、細菌による感染及び真菌による感染を含む。
【0058】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。適切な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
【0059】
本発明の薬剤学的組成物は対象体に経口又は非経口で投与でき、好ましくは非経口投与であり、例えば、静脈内注入、局所注入及び腹腔注入などで投与することができる。
【0060】
本明細書において用語“対象体”又は“ｓｕｂｊｅｃｔ”とは、前記ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合抑制によって前記疾患を予防又は治療しようとする客体を意味し、好ましくは人間及び動物を含む。
【0061】
本発明の薬剤学的組成物の適度の投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、普通の熟練した医師は所望する治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。本発明の好ましい具現例によれば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。
【0062】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されたり或いは多回容量容器内に内入させて製造され得る。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
【0063】
本発明の薬剤学的組成物は単独の療法で用いられてもよいが、他の通常の生物学的療法、化学療法又は放射療法と共に用いられてもよく、このような併行療法を実施する場合にはより効果よく癌又は感染性疾患を治療することができる。本発明を癌の予防及び治療に用いる場合、前記組成物と共に利用可能な化学療法剤は、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、ビスルファン（ｂｉｓｕｌｆａｎ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、タキソール（ｔａｘｏｌ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５-フルオロウラシル（５-ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）、及びメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）などを含む。本発明の組成物と共に利用可能な放射療法は、Ｘ線照射及びγ線照射などである。
【0064】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＰＤ－１変異体の製造方法を提供する：
ａ）前記ＰＤ－１変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び
ｂ）前記宿主細胞によって発現されたＰＤ－１変異体を回収する段階。
ａ）前記ＰＤ－１変異体をコードする核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を培養する段階；及び
ｂ）前記宿主細胞によって発現されたＰＤ－１変異体を回収する段階。
【0065】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、下記の段階を含むＰＤ－１変異体のスクリーニング方法を提供する：
ａ）前記ＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子にさらに無作為的な点突然変異を加えたＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子のライブラリーを構築する段階；及び
ｂ）前記ライブラリーから野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合を抑制するＰＤ－１変異体を選別する段階。
ａ）前記ＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子にさらに無作為的な点突然変異を加えたＰＤ－１変異体又はこれをコードする核酸分子のライブラリーを構築する段階；及び
ｂ）前記ライブラリーから野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）及びＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）間の結合を抑制するＰＤ－１変異体を選別する段階。
【0066】
本発明のスクリーニング方法は、蛍光標識細胞分離（ＦＡＣＳ）スクリーニング、又は他の自動化された流細胞分析技術を用いることができる。流細胞分析を実施するための機器は当業者に公知である。当該機器の例としては、ＦＡＣＳＡｒｉａ、ＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ及びＦＡＣＳｏｒｔ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｅｐｉｃｓ Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）、ＭＯＦＬＯ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏ．）、ＭＯＦＬＯ－ＸＤＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を挙げることができる。一般に、流細胞分析技術には液体試料中の細胞又は他の粒子の分離が含まれる。典型的には、流細胞分析の目的は分離された粒子をそれらの一つ以上の特性（例えば、標識されたリガンド又は他の分子の存在）に対して分析することである。粒子はセンサーによって一つずつ通過し、サイズ、屈折、光散乱、不透明度、粗度、形状、蛍光などに基づいて分類される。
【発明の効果】
【0067】
本発明の特徴及び利点を要約すれば次の通りである：
（ｉ）本発明は、ＰＤ－Ｌ１結合力が増大したＰＤ－１変異体を提供する。
（ｉ）本発明は、ＰＤ－Ｌ１結合力が増大したＰＤ－１変異体を提供する。
【0068】
（ｉｉ）また、本発明は、前記ＰＤ－１変異体の製造方法及びスクリーニング方法を提供する。
【0069】
（ｉｉｉ）本発明のＰＤ－１変異体は、野生型ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１間の結合を効果的に抑制して、既存の免疫関門抑制治療剤に比べて著しく高い透過力及び免疫細胞の癌死滅効果又は感染性疾患の治療効果を期待することができ、且つ免疫原性発生の可能性を最小化することができる。しかも、無糖化の具現による生物医薬品開発の便宜性を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0070】
【図1】動物細胞で生産されて精製された野生型ＰＤ－１と４つの糖鎖変異体ＰＤ－１のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真である。
【図2】野生型ＰＤ－１と４つの変異体ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１に対する結合力検証結果を示す。
【図3】四量体（Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）ＰＤ－Ｌ１の製造、蛍光標識化及び活性検証結果を示す。
【図4】Ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを使用した大腸菌で無糖化ＰＤ－１の発現分析結果を示す。
【図5】無糖化ＰＤ－１の活性化検証結果を示す。
【図6】作られた初期ライブラリーのＤＮＡ塩基配列分析データを示す。
【図7】流細胞分析機を用いたライブラリーエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）テスト結果を示す。
【図8】無糖化ＰＤ－１変異体をディスプレイしている大腸菌細胞のＰＤ－Ｌ１結合力分析結果を示す。
【図9】無糖化ＰＤ－１変異体をディスプレイしている大腸菌細胞のａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを使用したタンパク質発現量分析結果を示す。
【図10】無糖化ＰＤ－１変異体をディスプレイしている大腸菌細胞のＰＤ－Ｌ１結合力分析結果を示す。
【図11】無糖化ＰＤ－１変異体をディスプレイしている大腸菌細胞のａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを使用したタンパク質発現量分析結果を示す。
【図12】ＣＫＪ４１をベースにした新規な突然変異を持つ変異体探索結果を示す。
【図13】ＣＫＪ４１Ｔを鋳型として作られた２次ライブラリーのＤＮＡ塩基配列分析データを示す。
【図14】流細胞分析機を用いたライブラリーエンリッチメントテスト結果を示す。
【図15】２次スクリーニングによって見出した無糖化ＰＤ－１変異体をディスプレイしている大腸菌細胞のＰＤ－Ｌ１結合力分析結果を示す。
【図16】ＰＤ－１変異体と共通塩基配列変異体のＰＤ－Ｌ１結合力比較検証結果を示す。
【図17】精製された対照群ＨＡＣ－Ｖと２つのＰＤ－１変異体タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ写真を示す。
【図18】野生型ＰＤ－１とＨＡＣ－Ｖ、２つのＰＤ－１変異体のＰＤ－Ｌ１に対する結合力検証結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0071】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないということは当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。
【0072】
実施例
実施例１：ヒトＰＤ－Ｌ１結合に影響を与えるＮ－結合型糖化部位（Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）検証
ヒトＰＤ－１の糖化の存在が実際にＰＤ－Ｌ１との結合力に重要な役割を担うということを検証するために、ＰＤ－１に存在する４個の糖化を無糖化し、それぞれの糖化が結合力に及ぼす影響をテストした。ＰＤ－１には４ケ所のＮ－糖化部位が存在するので、４ケ所にあるアスパラギンをそれぞれアラニンに置換した４つの遺伝体（Ｎ２５Ａ、Ｎ３４Ａ、Ｎ５０Ａ、Ｎ９２Ａ）を作ることを決定した。ＰＤ－１（Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：ＨＧ１０３７７－Ｍ）の遺伝子とプライマー（ＣＫＪ＃１、ＣＫＪ＃２）を用いてＰＤ－１の外膜部位（アミノ酸配列Ｌ２５－Ｑ１６７）の遺伝体をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＰＣＲ技法で増幅した。増幅された遺伝体はＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ酵素を用いて処理し、同様に同酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭａｚベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドは、Ｊｕｄｅ１（（Ｆ－ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）
実施例１：ヒトＰＤ－Ｌ１結合に影響を与えるＮ－結合型糖化部位（Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）検証
ヒトＰＤ－１の糖化の存在が実際にＰＤ－Ｌ１との結合力に重要な役割を担うということを検証するために、ＰＤ－１に存在する４個の糖化を無糖化し、それぞれの糖化が結合力に及ぼす影響をテストした。ＰＤ－１には４ケ所のＮ－糖化部位が存在するので、４ケ所にあるアスパラギンをそれぞれアラニンに置換した４つの遺伝体（Ｎ２５Ａ、Ｎ３４Ａ、Ｎ５０Ａ、Ｎ９２Ａ）を作ることを決定した。ＰＤ－１（Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：ＨＧ１０３７７－Ｍ）の遺伝子とプライマー（ＣＫＪ＃１、ＣＫＪ＃２）を用いてＰＤ－１の外膜部位（アミノ酸配列Ｌ２５－Ｑ１６７）の遺伝体をベントポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＰＣＲ技法で増幅した。増幅された遺伝体はＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ酵素を用いて処理し、同様に同酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭａｚベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドは、Ｊｕｄｅ１（（Ｆ－ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ）
【0073】
【化1】
【0074】
【表1】
実施例２：ＰＤ－１エンジニアリングのための四量体（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）ヒトＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－Ｌ１－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）クローニング
ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子ｃＤＮＡをＳｉｎｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：ＨＧ１００８４－Ｍ）社から購入後、ＰＤ－Ｌ１細胞外膜部分（アミノ酸配列Ｆ１９－Ｒ２３８）の遺伝子をプライマー（ＨＷ＃１、ＨＷ＃２）とベントポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅した。野生型ＰＤ－１と野生型ＰＤ－Ｌ１の結合解離定数が低いため（平衡解離定数ＫＤ＝約８．７μＭ）、効率的な無糖化ＰＤ－１変異体スクリーニングの進行のために四量化（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）によってアビディティ効果（ａｖｉｄｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔ）を誘導することにした。四量化を誘導するためにＰＤ－Ｌ１のＣ末端部分にストレプトアビジンを発現させてテトラマーを誘導することにし、ストレプトアビジンとＰＤ－Ｌ１との間にはＧＳリンカーを入れてそれぞれのタンパク質の流動性を確保した。ストレプトアビジンをプライマー（ＨＷ＃３、ＨＷ＃４）とベントポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いて遺伝子増幅後、前に増幅されたＰＤ－Ｌ１遺伝体とベントポリメラーゼを用いてアセンブリーＰＣＲを行った。作られた遺伝子はＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）を用いて制限酵素処理した。制限酵素処理されたＰＤ－Ｌ１－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｈｉｓ ｔａｇ遺伝子は、同一の制限酵素処理された動物細胞用ベクターであるｐＭａｚベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドはＪｕｄｅ１大腸菌に形質転換させた後、単一クローン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｌｏｎｅ）を確保し、塩基配列分析によってＰＤ－Ｌ１－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ｈｉｓ ｔａｇがｐＭａｚベクターに成功的に挿入されたことを確認した。
【0075】
実施例３：四量体（Ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）ＰＤ－Ｌ１－ストレプトアビジンの動物細胞発現、精製及び蛍光物質ラベリング
作られた四量体ＰＤ－Ｌ１発現用ベクターを動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）に形質感染した後、６日間培養して細胞培養液を６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過した上澄液は４℃で１６時間Ｎｉ－ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌに結合誘導した。結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ）したレジンは、レジンの１０ＣＶの１０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）が含まれたＰＢＳ溶液で洗浄後、１０ＣＶの２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液でさらに洗浄した。最後に、２５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液で溶出液を回収した。精製されたＰＤ－Ｌ１テトラマーはＡｌｅｘａ－４８８ラベリングキットを用いて蛍光標識化した。蛍光標識した四量体ＰＤ－Ｌ１は、ＥＬＩＳＡ分析の結果、優れたＰＤ－１結合力を示すことを確認した（図３）。
作られた四量体ＰＤ－Ｌ１発現用ベクターを動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）に形質感染した後、６日間培養して細胞培養液を６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過した上澄液は４℃で１６時間Ｎｉ－ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌに結合誘導した。結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ）したレジンは、レジンの１０ＣＶの１０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）が含まれたＰＢＳ溶液で洗浄後、１０ＣＶの２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液でさらに洗浄した。最後に、２５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液で溶出液を回収した。精製されたＰＤ－Ｌ１テトラマーはＡｌｅｘａ－４８８ラベリングキットを用いて蛍光標識化した。蛍光標識した四量体ＰＤ－Ｌ１は、ＥＬＩＳＡ分析の結果、優れたＰＤ－１結合力を示すことを確認した（図３）。
【0076】
実施例４：バクテリア細胞内膜でヒトＰＤ－１をディスプレイするためのクローニング（野生型ＰＤ－１、ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１）
ＰＤ－１の外膜部位をディスプレイするためにプライマー（ＪＹ＃１、ＪＹ＃２）を用いてＰＤ－１のアミノ酸（アミノ酸配列Ｌ２５－Ｑ１６７）のＤＮＡをベントポリメラーゼを用いてＰＣＲで遺伝子増幅させた後、ＳｆｉＩ制限酵素処理した。ＳｆｉＩ処理されたＤＮＡは、タンパク質を大腸菌ペリプラスム領域（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）側に分泌下に細胞内膜に固定化させるシグナルペプチドであるＮｌｐＡシグナルペプチドを使用するために、同様にＳｆｉＩ処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションしてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＷＴＰＤ－１－ＦＬＡＧベクターを製造した。対照群として用いるためのＨＡＣ－Ｖ変異体は遺伝子合成によって進行し、同様に、ＮｌｐＡシグナルペプチドを使用するために、ＳｆｉＩ処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションしてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１－ＦＬＡＧプラスミドを準備した。その後、大腸菌Ｊｕｄｅ１に形質転換して単一クローンを確保した後、塩基配列分析によって、野生型ＰＤ－１とＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１がｐＭｏｐａｃ－１２ベクターに成功的に挿入されたことを確認した。
ＰＤ－１の外膜部位をディスプレイするためにプライマー（ＪＹ＃１、ＪＹ＃２）を用いてＰＤ－１のアミノ酸（アミノ酸配列Ｌ２５－Ｑ１６７）のＤＮＡをベントポリメラーゼを用いてＰＣＲで遺伝子増幅させた後、ＳｆｉＩ制限酵素処理した。ＳｆｉＩ処理されたＤＮＡは、タンパク質を大腸菌ペリプラスム領域（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）側に分泌下に細胞内膜に固定化させるシグナルペプチドであるＮｌｐＡシグナルペプチドを使用するために、同様にＳｆｉＩ処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションしてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＷＴＰＤ－１－ＦＬＡＧベクターを製造した。対照群として用いるためのＨＡＣ－Ｖ変異体は遺伝子合成によって進行し、同様に、ＮｌｐＡシグナルペプチドを使用するために、ＳｆｉＩ処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションしてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１－ＦＬＡＧプラスミドを準備した。その後、大腸菌Ｊｕｄｅ１に形質転換して単一クローンを確保した後、塩基配列分析によって、野生型ＰＤ－１とＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１がｐＭｏｐａｃ－１２ベクターに成功的に挿入されたことを確認した。
【0077】
実施例５：流細胞分析機を用いたＰＤ－１及びＰＤ－１変異体（野生型ＰＤ－１、ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１）の大腸菌での発現有無及びＰＤ－Ｌ１との結合力検証
クローニングで用意したプラスミド（ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１－ＦＬＡＧ、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１－ＦＬＡＧ、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－Ｆｃ－ＦＬＡＧ）をそれぞれＪｕｄｅ１細胞に形質転換した。用意したサンプルをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：５０の比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。タンパク質が過発現した大腸菌をＯＤ６００正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後に３００μｌを取って、７００μｌのＰＢＳ、１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブ、及び３３ｎＭのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＴＩＣ（ＳＩＧＭＡ）をそれぞれ入れ、常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブでラベリングした。ラベリング過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、Ｇｕａｖａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いて分析した。分析の結果、無糖化ＰＤ－１は大腸菌でよく発現するが（図４）、ＰＤ－Ｌ１との結合力は示さないことが確認でき、また、無糖化ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１は弱いＰＤ－Ｌ１結合力があることが確認された（図５）。
クローニングで用意したプラスミド（ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１－ＦＬＡＧ、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１－ＦＬＡＧ、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－Ｆｃ－ＦＬＡＧ）をそれぞれＪｕｄｅ１細胞に形質転換した。用意したサンプルをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地で３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：５０の比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。タンパク質が過発現した大腸菌をＯＤ６００正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転（ｒｏｔａｔｉｏｎ）によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後に３００μｌを取って、７００μｌのＰＢＳ、１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブ、及び３３ｎＭのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＴＩＣ（ＳＩＧＭＡ）をそれぞれ入れ、常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブでラベリングした。ラベリング過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離した。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、Ｇｕａｖａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いて分析した。分析の結果、無糖化ＰＤ－１は大腸菌でよく発現するが（図４）、ＰＤ－Ｌ１との結合力は示さないことが確認でき、また、無糖化ＨＡＣ－Ｖ ＰＤ－１は弱いＰＤ－Ｌ１結合力があることが確認された（図５）。
【0078】
実施例６：超高速スクリーニング技法を用いるための巨大ＰＤ－１エラープローンライブラリー（ＰＤ－１ ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ ｌｉｂｒａｒｙ）の作製
ＰＤ－Ｌ１との高い結合力を示す無糖化ＰＤ－１を高速で探索するために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１－ＦＬＡＧをベースに用いてＰＤ－１の全部位にエラーが入るように両側のＳｆｉＩ部位を含むプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）をデザインした。デザインしたプライマーとＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）とｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）を用いてライブラリーを作製するためにインサ－ト（ｉｎｓｅｒｔ）をエラープローンＰＣＲ技法を用いて遺伝体を増幅させた。増幅された遺伝体は、含むＳｆｉＩ酵素処理され、同様にＳｆｉＩ酵素処理されているｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターに挿入してライゲーション後、Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換した。形質転換された大腸菌はスクエアプレート（ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ）にスプレッドして３７℃で１６時間培養した後、グルコースが２％含まれているＴＢで大腸菌を回収して初期ライブラリーを確保した（図６）。
ＰＤ－Ｌ１との高い結合力を示す無糖化ＰＤ－１を高速で探索するために、ｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１－ＦＬＡＧをベースに用いてＰＤ－１の全部位にエラーが入るように両側のＳｆｉＩ部位を含むプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）をデザインした。デザインしたプライマーとＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）とｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）を用いてライブラリーを作製するためにインサ－ト（ｉｎｓｅｒｔ）をエラープローンＰＣＲ技法を用いて遺伝体を増幅させた。増幅された遺伝体は、含むＳｆｉＩ酵素処理され、同様にＳｆｉＩ酵素処理されているｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターに挿入してライゲーション後、Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換した。形質転換された大腸菌はスクエアプレート（ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ）にスプレッドして３７℃で１６時間培養した後、グルコースが２％含まれているＴＢで大腸菌を回収して初期ライブラリーを確保した（図６）。
【0079】
実施例７：流細胞分離器を用いたＰＤ－１変異体スクリーニング
グルコースが２％含まれているＴＢ培地２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、作製されたライブラリーを２５０ｍＬフラスコに接種して３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養し、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれているＴＢ培地１００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００の比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現し、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ＲＰＭで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後に３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転し、スフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌ ＰＢＳで再懸濁後、Ｓ３ソーター（ｓｏｒｔｅｒ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１に高い結合力を持つ大腸菌を回収した。回収された大腸菌は、プライマー（ＪＹ＃１、ＪＹ＃２）を用いたＰＣＲ増幅で遺伝子を確保し、遺伝体はｓｆｉＩ制限酵素処理され、同様に制限酵素処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションした。プラスミドをＪｕｄｅ１に形質転換した後、大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃で１６時間インキュベーションした後に回収して急速冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）に冷凍保管した。このようなスクリーニング過程を５回さらに反復した。
グルコースが２％含まれているＴＢ培地２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、作製されたライブラリーを２５０ｍＬフラスコに接種して３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養し、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれているＴＢ培地１００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００の比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現し、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ＲＰＭで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後に３００μｌを取り、７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転し、スフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌ ＰＢＳで再懸濁後、Ｓ３ソーター（ｓｏｒｔｅｒ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１に高い結合力を持つ大腸菌を回収した。回収された大腸菌は、プライマー（ＪＹ＃１、ＪＹ＃２）を用いたＰＣＲ増幅で遺伝子を確保し、遺伝体はｓｆｉＩ制限酵素処理され、同様に制限酵素処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションした。プラスミドをＪｕｄｅ１に形質転換した後、大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃で１６時間インキュベーションした後に回収して急速冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）に冷凍保管した。このようなスクリーニング過程を５回さらに反復した。
【0080】
実施例８：ＰＤ－Ｌ１親和度増加ＰＤ－１変異体のエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）確認のための大腸菌培養
グルコースが２％含まれているＴＢ ２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、初期ライブラリー（Ｉｎｉｔｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）、１ラウンドライブラリー（１ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、２ラウンドライブラリー（２ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、３ラウンドライブラリー（３ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、４ラウンドライブラリー（４ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、５ラウンドライブラリー（５ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、６ラウンドライブラリー（６ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を２５０ｍＬフラスコに入れた。３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養後、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ １００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。また、対照群として使用するために、グルコースが２％含まれているＴＢ培地４ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加し、野生型ＰＤ－１とＨＡＣ－Ｖ－ＰＤ－１細胞をそれぞれ接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地６ｍｌに１：５０接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。
グルコースが２％含まれているＴＢ ２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、初期ライブラリー（Ｉｎｉｔｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）、１ラウンドライブラリー（１ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、２ラウンドライブラリー（２ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、３ラウンドライブラリー（３ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、４ラウンドライブラリー（４ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、５ラウンドライブラリー（５ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、６ラウンドライブラリー（６ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を２５０ｍＬフラスコに入れた。３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養後、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ １００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。また、対照群として使用するために、グルコースが２％含まれているＴＢ培地４ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加し、野生型ＰＤ－１とＨＡＣ－Ｖ－ＰＤ－１細胞をそれぞれ接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地６ｍｌに１：５０接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。
【0081】
実施例９：流細胞分析機を用いたＰＤ－Ｌ１親和度増加ＰＤ－１変異体のエンリッチメント確認
残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）測定を用いて分析した。スクリーニングが進行されるほど、ＰＤ－Ｌ１に結合力が高い変異体がライブラリーで増幅されることが分析できた（図７）。
残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）測定を用いて分析した。スクリーニングが進行されるほど、ＰＤ－Ｌ１に結合力が高い変異体がライブラリーで増幅されることが分析できた（図７）。
【0082】
実施例１０：流細胞分析機の分析を用いたＰＤ－Ｌ１結合力の向上したＰＤ－１変異体確保
最後のラウンドの単一コロニーを、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：５０希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図８）。また、大腸菌がディスプレイしているＰＤ－１タンパク質の発現量が蛍光強度に影響を及ぼし得るので、発現量を確認するために、ＰＢＳで再懸濁した後に残った残余大腸菌から３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１μｌのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを共に入れて常温で回転し、スフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機を用いてａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣとの結合力によるタンパク質の発現量を、蛍光信号値測定を用いて間接的に分析した（図９）。
最後のラウンドの単一コロニーを、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：５０希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。残余培地を除去するために、ｅ－ｔｕｂｅに入れた細胞を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて再懸濁し、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離によって行う洗浄過程を２回反復した。細胞を１ｍｌのＳＴＥ［０．５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］溶液を用いて再懸濁し、３７℃、３０分間回転によって細胞外膜を除去した。１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離して大腸菌を集めた後、上澄液を除去した。遠心分離された大腸菌は１ｍｌの溶液Ａ［０．５Ｍスクロース、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ６．８］を用いて再懸濁後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。１ｍｌの溶液Ａと５０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２０μｌを混合した溶液を１ｍｌ添加して遠心分離された大腸菌を再懸濁した後、３７℃、１５分間回転してペプチドグリカン層を除去した。遠心分離後に上澄液を除去し、１ｍｌのＰＢＳで再懸濁した後、３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図８）。また、大腸菌がディスプレイしているＰＤ－１タンパク質の発現量が蛍光強度に影響を及ぼし得るので、発現量を確認するために、ＰＢＳで再懸濁した後に残った残余大腸菌から３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１μｌのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを共に入れて常温で回転し、スフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機を用いてａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣとの結合力によるタンパク質の発現量を、蛍光信号値測定を用いて間接的に分析した（図９）。
【0083】
【表2】
実施例１１．追加の対照群であるＰＤ－１変異体との比較のためのクローニング（ＰＤ－１Ｓ．６．８．３、Ｓ．５．１Ｔ）
追加の対照群として使用するためのＳ．６．８．３とＳ．５．１Ｔ変異体は、プライマーアセンブリーＰＣＲを用いてクローニングした。まず、プライマー（Ｓ．６．８．３：ＪＹ＃５、６、７、８、９、１０、１１、１２／Ｓ．５．１Ｔ：ＪＹ＃１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）を用いてベントポリメラーゼでプライマーアセンブリーＰＣＲをした後、増幅（Ａｍｐｌｉｆｙ）ＰＣＲを用いて正しくアセンブリーされた遺伝子を増幅させた。増幅させた遺伝子をＳｆｉＩ処理した後、同様にＳｆｉＩ処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションしてｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１Ｓ．６．８．３－ＦＬＡＧ及びｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１Ｓ．５．１Ｔ－ＦＬＡＧベクターを製造した。その後、大腸菌Ｊｕｄｅ１に形質転換して単一クローンを確保した後、塩基配列分析によって成功的に挿入されたことを確認した。
【0084】
【表3】
実施例１２．流細胞分析機の分析を用いた、見出したＰＤ－１変異体と対照群とのＰＤ－Ｌ１結合力比較
結合力の高いＰＤ－１変異体と追加の対照群とのＰＤ－Ｌ１結合力を比較するために、野生型ＰＤ－１と対照群であるＰＤ－１ＨＡＣ－Ｖ、Ｓ．６．８．３、Ｓ．５．１ＴとＣＫＪ４９及びＣＫＪ５０の総６つをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図１０）。また、大腸菌がディスプレイしているＰＤ－１タンパク質の発現量が蛍光強度に影響を及ぼし得るので、発現量を確認するために、ＰＢＳで再懸濁した後に残った残余大腸菌から３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳ及び１μｌのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを共に入れて常温で回転し、スフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機を用いてａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣとの結合力によるタンパク質の発現量を、蛍光信号値の測定を用いて間接的に分析した（図１１）。
【0085】
実施例１３．新規な突然変異を持つ変異体探索のためのクローニング
見出した変異体のうち、最も新規な突然変異を持つとともに高い結合力を持つＣＫＪ４１を基準に、より新規な突然変異を持つ変異体を見出すために、ＣＫＪ４１のＣ６９Ｓを種々のアミノ酸（Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｇ）に置換した。このために、デザインしたプライマーとＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ技法で遺伝体を増幅した。増幅された遺伝子をＪｕｄｅ１に形質転換して塩基配列を確認した。
見出した変異体のうち、最も新規な突然変異を持つとともに高い結合力を持つＣＫＪ４１を基準に、より新規な突然変異を持つ変異体を見出すために、ＣＫＪ４１のＣ６９Ｓを種々のアミノ酸（Ｃ、Ｔ、Ｙ、Ａ、Ｇ）に置換した。このために、デザインしたプライマーとＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ技法で遺伝体を増幅した。増幅された遺伝子をＪｕｄｅ１に形質転換して塩基配列を確認した。
【0086】
実施例１４．流細胞分析機の分析を用いた新規な突然変異を持つ変異体探索
ＣＫＪ４１と対照群であるＨＡＣ－Ｖ変異体、ＣＫＪ４１の６９番目のアミノ酸が変わったＣＫＪ４１Ｃ、ＣＫＪ４１Ｔ、ＣＫＪ４１Ｙ、ＣＫＪ４１Ａ、ＣＫＪ４１Ｇをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図１２）。
ＣＫＪ４１と対照群であるＨＡＣ－Ｖ変異体、ＣＫＪ４１の６９番目のアミノ酸が変わったＣＫＪ４１Ｃ、ＣＫＪ４１Ｔ、ＣＫＪ４１Ｙ、ＣＫＪ４１Ａ、ＣＫＪ４１Ｇをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図１２）。
【0087】
実施例１５．結合力が増加したＰＤ－１変異体を確保するための２次ＰＤ－１エラープローンライブラリー作製
ＰＤ－Ｌ１とのより高い結合力を示すＰＤ－１を高速で探索するために、突然変異数は少ないながらも高い蛍光値を有するｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１ＣＫＪ４１Ｔ－ＦＬＡＧをベースにして全ての部位にエラーが入るようにインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を準備した。両側のＳｆｉＩ部位を含むプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）及びＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）とｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）を用いてエラープローンＰＣＲ技法を用いて遺伝体を増幅させてライブラリーを作製しようとした。増幅された遺伝体はＳｆｉＩ酵素処理され、同様にＳｆｉＩ酵素処理されているｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターに挿入してライゲーション後、Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換した。形質転換された大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃で１６時間培養した後、グルコースが２％含まれているＴＢで大腸菌を回収して初期ライブラリーを確保した（図１３）。
ＰＤ－Ｌ１とのより高い結合力を示すＰＤ－１を高速で探索するために、突然変異数は少ないながらも高い蛍光値を有するｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＰＤ－１ＣＫＪ４１Ｔ－ＦＬＡＧをベースにして全ての部位にエラーが入るようにインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を準備した。両側のＳｆｉＩ部位を含むプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）及びＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＫＡＲＡ）とｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２（ＳＩＧＭＡ）を用いてエラープローンＰＣＲ技法を用いて遺伝体を増幅させてライブラリーを作製しようとした。増幅された遺伝体はＳｆｉＩ酵素処理され、同様にＳｆｉＩ酵素処理されているｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターに挿入してライゲーション後、Ｊｕｄｅ１細胞に形質転換した。形質転換された大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃で１６時間培養した後、グルコースが２％含まれているＴＢで大腸菌を回収して初期ライブラリーを確保した（図１３）。
【0088】
実施例１６．流細胞分離器を用いたＰＤ－１変異体２次スクリーニング
グルコースが２％含まれているＴＢ培地２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、作製されたライブラリーを２５０ｍＬフラスコに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養し、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地１００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させ、１４０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌ ＰＢＳで再懸濁後、Ｓ３ソーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１へのより高い結合力を持つ大腸菌を回収した。回収された大腸菌はプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）を用いたＰＣＲ増幅で遺伝子を確保し、遺伝体はｓｆｉＩ制限酵素処理され、同様に制限酵素処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションした。プラスミドをＪｕｄｅ１に形質転換した後、大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃に１６時間インキュベーションした後に回収して急速冷凍庫に冷凍保管した。このようなスクリーニング過程を、プローブの濃度を漸次減らしながら３回さらに反復した。
グルコースが２％含まれているＴＢ培地２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、作製されたライブラリーを２５０ｍＬフラスコに接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養し、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地１００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００比率で接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させ、１４０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れて常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌ ＰＢＳで再懸濁後、Ｓ３ソーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１へのより高い結合力を持つ大腸菌を回収した。回収された大腸菌はプライマー（ＪＹ＃３、ＪＹ＃４）を用いたＰＣＲ増幅で遺伝子を確保し、遺伝体はｓｆｉＩ制限酵素処理され、同様に制限酵素処理されたｐＭｏｐａｃ１２－ＮｌｐＡ－ＦＬＡＧベクターにライゲーションした。プラスミドをＪｕｄｅ１に形質転換した後、大腸菌はスクエアプレートにスプレッドして３７℃に１６時間インキュベーションした後に回収して急速冷凍庫に冷凍保管した。このようなスクリーニング過程を、プローブの濃度を漸次減らしながら３回さらに反復した。
【0089】
実施例１７．ＰＤ－Ｌ１親和度増加２次ＰＤ－１変異体のエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）確認のための大腸菌培養
グルコースが２％含まれているＴＢ２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、初期ライブラリー（Ｉｎｉｔｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）、１ラウンドライブラリー（１ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、２ラウンドライブラリー（２ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、３ラウンドライブラリー（３ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、４ラウンドライブラリー（４ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を２５０ｍＬフラスコに入れた。３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養後、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ １００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。また、対照群として使用するために、グルコースが２％含まれているＴＢ培地４ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加し、野生型ＰＤ－１及びＨＡＣ－Ｖ－ＰＤ－１細胞をそれぞれ接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地６ｍｌに１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。
グルコースが２％含まれているＴＢ２５ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加した後、初期ライブラリー（Ｉｎｉｔｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ）、１ラウンドライブラリー（１ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、２ラウンドライブラリー（２ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、３ラウンドライブラリー（３ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）、４ラウンドライブラリー（４ ｒｏｕｎｄ ｌｉｂｒａｒｙ）を２５０ｍＬフラスコに入れた。３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養後、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ １００ｍｌに培養された大腸菌を１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。また、対照群として使用するために、グルコースが２％含まれているＴＢ培地４ｍｌに４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを添加し、野生型ＰＤ－１及びＨＡＣ－Ｖ－ＰＤ－１細胞をそれぞれ接種し、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地６ｍｌに１：１００接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。
【0090】
実施例１８．流細胞分析機を用いたＰＤ－Ｌ１親和度増加ＰＤ－１変異体のエンリッチメント確認
実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに４ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）測定を用いて分析した。スクリーニングが進行されるほど、ＰＤ－Ｌ１に結合力が高い変異体がライブラリーで増幅されることが分析できた（図１４）。
実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに４ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機（Ｇｕａｖａ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値（Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）測定を用いて分析した。スクリーニングが進行されるほど、ＰＤ－Ｌ１に結合力が高い変異体がライブラリーで増幅されることが分析できた（図１４）。
【0091】
実施例１９．流細胞分析機の分析を用いた、ＰＤ－Ｌ１結合力がより向上したＰＤ－１変異体の追加確保
最後のラウンドの単一コロニー（ＡＰＤ１－ＣＫＪ４１Ｔ：ＣＫＪ４１Ｔの無糖化形態、ＡＰＤ１－ＪＹ１０１：ＪＹ１０１の無糖化形態）と野生型ＰＤ－１、ＨＡＣ－Ｖをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに４ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定によって分析した（図１５）。
最後のラウンドの単一コロニー（ＡＰＤ１－ＣＫＪ４１Ｔ：ＣＫＪ４１Ｔの無糖化形態、ＡＰＤ１－ＪＹ１０１：ＪＹ１０１の無糖化形態）と野生型ＰＤ－１、ＨＡＣ－Ｖをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を、４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに４ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定によって分析した（図１５）。
【0092】
実施例２０．見出したＰＤ－１変異体の突然変異座の比較検証のための変異体クローニング
ＣＫＪ４９、ＣＫＪ５０の重複する突然変異を持つ変異体ＰＤ－１＿ＬＤＳＳをクローニングし、ＬＤＳＳにＣＫＪ４９、５０の新規の突然変異アミノ酸が導入された時に結合力に影響を及ぼす否かを確認しようとした。ＰＤ－１＿ＬＤＳＳを作るためにＣＫＪ４９ベクターを鋳型にしてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ技法を用いた。このために、デザインされたプライマー（ＪＹ＃２１、ＪＹ＃２２）とＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて遺伝体を増幅した。増幅された遺伝子をＪｕｄｅ１に形質転換して塩基配列を確認した。
ＣＫＪ４９、ＣＫＪ５０の重複する突然変異を持つ変異体ＰＤ－１＿ＬＤＳＳをクローニングし、ＬＤＳＳにＣＫＪ４９、５０の新規の突然変異アミノ酸が導入された時に結合力に影響を及ぼす否かを確認しようとした。ＰＤ－１＿ＬＤＳＳを作るためにＣＫＪ４９ベクターを鋳型にしてＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ ＰＣＲ技法を用いた。このために、デザインされたプライマー（ＪＹ＃２１、ＪＹ＃２２）とＰｆｕ ｔｕｒｂｏ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて遺伝体を増幅した。増幅された遺伝子をＪｕｄｅ１に形質転換して塩基配列を確認した。
【0093】
実施例２１．流細胞分析機の分析を用いたＰＤ－１変異体と共通塩基配列変異体のＰＤ－Ｌ１結合力比較検証
野生型ＰＤ－１、対照群であるＨＡＣ－Ｖ変異体、ＣＫＪ４９、ＣＫＪ５０、ＬＤＳＳをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図１６）。また、大腸菌がディスプレイしているＰＤ－１タンパク質の発現量が蛍光強度に影響を及ぼし得るので、発現量を確認するために、ＰＢＳで再懸濁した後に残った残余大腸菌から３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１μｌのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを共に入れ、常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機を用いてａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣとの結合力によるタンパク質の発現量を、蛍光信号値の測定を用いて間接的に分析した（図１６）。
野生型ＰＤ－１、対照群であるＨＡＣ－Ｖ変異体、ＣＫＪ４９、ＣＫＪ５０、ＬＤＳＳをそれぞれ、２％グルコース及び４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれたＴＢ培地に接種した後、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養した。培養された細胞を４０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれた６ｍｌのＴＢ培地に１：１００希釈して接種した。ＯＤ６００＝０．５まで培養して２０分間、２５℃、２５０ｒｐｍで冷却過程を経た後、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２５℃、２５０ｒｐｍ、５時間タンパク質を過発現させた。大腸菌はＯＤ６００正規化によって同一量ずつｅ－ｔｕｂｅに入れ、１４，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離によって細胞を回収した。実施例５で明示されたスフェロプラスト方法と同一に実験し、これによって作られたスフェロプラストに１２．５ｎＭの四量体ＰＤ－Ｌ１－Ａｌｅｘａ４８８プローブを共に入れ、常温で回転して蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、ＧＵＡＶＡ装備を用いてＰＤ－Ｌ１との結合力を蛍光信号値測定を用いて分析した（図１６）。また、大腸菌がディスプレイしているＰＤ－１タンパク質の発現量が蛍光強度に影響を及ぼし得るので、発現量を確認するために、ＰＢＳで再懸濁した後に残った残余大腸菌から３００μｌを取って７００μｌのＰＢＳと１μｌのａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣを共に入れ、常温で回転してスフェロプラストに蛍光プローブをラベリングした。ラベリングの過程を１時間経た後、１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。上澄液を捨て、遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで１回洗浄した後、さらに１３，５００ｒｐｍで１分間遠心分離をした。遠心分離された大腸菌を１ｍｌのＰＢＳで再懸濁後、流細胞分析機を用いてａｎｔｉ－ＦＬＡＧ－ＦＩＴＣとの結合力によるタンパク質の発現量を、蛍光信号値の測定を用いて間接的に分析した（図１６）。
【0094】
【表4】
実施例２２．ＰＤ－１変異体の動物細胞発現、精製及び結合力検証
ＰＤ－１変異体を動物細胞に発現、精製して結合力を検証するために、まずクローニングを行った。対照群であるＨＡＣ－Ｖ、見出した変異体であるＣＫＪ４９、ＣＫＪ５０遺伝子をプライマー（ＣＫＪ＃１、ＣＫＪ＃２）及びベントポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅した。増幅された遺伝体はＢｓｓＨＩＩとＸｂａＩ酵素を用いて処理し、同様に同一の酵素で処理された動物細胞発現用ベクターであるｐＭａｚベクターにライゲーションした。ライゲーションされたプラスミドはＪｕｄｅ１大腸菌に形質転換し、個別コロニー分析によって塩基配列を確認した。作られたＰＤ－１糖化変異体発現用ベクター（ｐＭａｚ－ＰＤ１ＨＡＣ－Ｖ－Ｈｉｓ ｔａｇ、ｐＭａｚ－ＰＤ１ＣＫＪ４９－Ｈｉｓ ｔａｇ、ｐＭａｚ－ＰＤ１ＣＫＪ５０－Ｈｉｓ ｔａｇ）を動物細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ）に形質感染して６日間培養後、細胞培養液を６，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離した後、上澄液を取って０．２２μｍフィルターで濾過した。濾過した上澄液は４゜Ｃで１６時間Ｎｉ－ＮＴＡレジン（Ｑｉａｇｅｎ）１ｍｌに結合誘導した。結合されたレジンは、レジンの１０ＣＶ（ｃｏｌｕｍｎ ｖｏｌｕｍｅ）の１０ｍＭイミダゾール（Ｓｉｇｍａ）が含まれたＰＢＳ溶液で洗浄後、１０ＣＶの２０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液でさらに洗浄した。最後に、２５０ｍＭイミダゾール含有ＰＢＳ溶液で溶出液を回収した（図１７）。ＥＬＩＳＡによって野生型ＰＤ－１と対照群、２つの変異体（ＧＰＤ１－ＣＫＪ４９：ＣＫＪ４９の糖化形態、ＧＰＤ１－ＣＫＪ５０：ＣＫＪ５０の糖化形態）間のＰＤ－Ｌ１結合力変化を検証した。高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）にそれぞれのタンパク質を０．０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ９．６（Ｊｕｎｓｅｉ）に希釈して２００ｎｇ／ｗｅｌｌの濃度で４℃で１６時間結合した。タンパク質除去後、５％スキムミルクが含まれたＰＢＳＴ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ－２０が含まれたＰＢＳ）溶液にｗ／ｖ５％となるように入れた後、それぞれの９６ウェルプレートを１時間常温でブロッキングした。この溶液を捨てた後、２００μｌのｔｗｅｅｎ２０ ０．５％含まれたＰＢＳ溶液で４回洗浄した後、ＰＤ－Ｌ１テトラマーをＰＢＳ溶液に希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合させた。その後、２００μｌのＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、ａｎｔｉ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｇｅｎｅｔｅｘ）をＰＢＳに１：２，０００の比率で希釈し、それぞれの９６ウェルプレートに１時間常温で結合した。この溶液を捨てた後、２００μｌのＰＢＳＴ ０．５％溶液で４回洗浄した後、５０μｌ ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応を進行し、２０分後４Ｎ Ｈ２ＳＯ４で反応を終結させた。反応の結果、糖化されることによってＰＤ－Ｌ１に対する結合力に変化が発生したが、ＣＫＪ４９が最も優れた結合力を有することが確認された（図１８）。
【0095】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい具現例に過ぎず、これに本発明の範囲が制限されない点は明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付の請求項とその等価物によって定義されるといえよう。
【0096】
［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］１７１１０５３５３４
［部処名］科学技術情報通信部
［研究管理専門機関］韓国研究財団
［研究事業名］新進研究支援事業
［研究課題名］抗原結合無糖化Ｆｃ変異体を用いたタンパク質治療剤及び二重抗体開発
［寄与率］１／２
［主管機関］国民大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０６．０１～２０１８．０３．３１
［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］１７１１０５８３９４
［部処名］科学技術情報通信部
［研究管理専門機関］韓国研究財団
［研究事業名］新薬開発パイプライン管理事業
［研究課題名］血中持続型ＦｃベースのエンドセリンＧＰＣＲ標的次世代抗癌抗体発掘
［寄与率］１／２
［主管機関］国民大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０６．３０～２０１８．０３．２９
［課題固有番号］１７１１０５３５３４
［部処名］科学技術情報通信部
［研究管理専門機関］韓国研究財団
［研究事業名］新進研究支援事業
［研究課題名］抗原結合無糖化Ｆｃ変異体を用いたタンパク質治療剤及び二重抗体開発
［寄与率］１／２
［主管機関］国民大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０６．０１～２０１８．０３．３１
［この発明を支援した国家研究開発事業］
［課題固有番号］１７１１０５８３９４
［部処名］科学技術情報通信部
［研究管理専門機関］韓国研究財団
［研究事業名］新薬開発パイプライン管理事業
［研究課題名］血中持続型ＦｃベースのエンドセリンＧＰＣＲ標的次世代抗癌抗体発掘
［寄与率］１／２
［主管機関］国民大学校産学協力団
［研究期間］２０１７．０６．３０～２０１８．０３．２９
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】