知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特許7035050ＶＡＰポリペプチド及び腫瘍の標的診断及び治療のための薬物の調製におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-04
(45)【発行日】2022-03-14
(54)【発明の名称】ＶＡＰポリペプチド及び腫瘍の標的診断及び治療のための薬物の調製におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20220307BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220307BHJP
A61K 49/14 20060101ALI20220307BHJP
A61K 49/04 20060101ALI20220307BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20220307BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20220307BHJP
A61K 31/69 20060101ALI20220307BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20220307BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20220307BHJP
A61K 47/59 20170101ALI20220307BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20220307BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20220307BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20220307BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20220307BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220307BHJP
A61K 31/37 20060101ALI20220307BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20220307BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20220307BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C07K19/00
A61K49/14
A61K49/04
A61K47/64
A61K31/704
A61K31/69
A61K31/337
A61K47/54
A61K47/59
A61K47/60
A61K9/127
A61K9/107
A61K47/69
A61P35/00
A61K31/37
A61K47/34
A61K47/42
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2019528582
(86)(22)【出願日】2017-12-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2020-04-23
(86)【国際出願番号】 CN2017114796
(87)【国際公開番号】W WO2018103660
(87)【国際公開日】2018-06-14
【審査請求日】2020-11-13
(31)【優先権主張番号】201611115191.1
(32)【優先日】2016-12-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】518384803
【氏名又は名称】フーダン ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】ＦＵＤＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100102255
【弁理士】
【氏名又は名称】小澤 誠次
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100188352
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 一弘
(74)【代理人】
【識別番号】100113860
【弁理士】
【氏名又は名称】松橋 泰典
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100198074
【弁理士】
【氏名又は名称】山村 昭裕
(74)【代理人】
【識別番号】100096013
【氏名又は名称】富田 博行
(72)【発明者】
【氏名】ルー ウェイユエ
(72)【発明者】
【氏名】ラン ダニー
(72)【発明者】
【氏名】マオ ジアニー
(72)【発明者】
【氏名】シエ カオ
【審査官】玉井 真人
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２００８／０００３２００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１３－５１１５６３（ＪＰ，Ａ）
【文献】PNAS, 2016, Vol.113, pp.12786-12791
【文献】Chem. Rec., 2016, Vol.16, pp.1772-1786
【文献】Journal of Controlled Release, 2015, Vol.201, pp.14-21
【文献】International Journal of Cancer, 2010, Vol.127, pp.2685-2698
【文献】PNAS, 2015, Vol.112, pp.3776-3781
【文献】SCIENTIFIC REPORTS, 2016, Vol.6, No.34922
【文献】Journal of Controlled Release, 2016, Vol.240, pp.267-286
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ ７／００－７／６６
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰであり、前記ＤＶＡＰのアミノ酸配列がＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳであり、前記ＳＶＡＰのアミノ酸配列がＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰであることを特徴とする、ＧＲＰ７８に対する高い親和性を有するＤ型ペプチド。
【請求項2】
ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体であって、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体が、請求項１に記載のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰにより修飾されたマレイミド基含有造影物質であり、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体の構造がＤＶＡＰ－Ｘ及び／又はＳＶＡＰ－Ｘであり、Ｘが造影物質である、前記ペプチド複合体。
【請求項3】
Ｘが、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤、及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上である、請求項２に記載のペプチド複合体。
【請求項4】
蛍光物質がフルオレセインであり、近赤外色素がCy7、IR820、DiRであり、磁気共鳴造影剤がGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤が
99m
Tc-DTPAであることを特徴とする、請求項３に記載のペプチド複合体。
【請求項5】
ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体であって、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体が、請求項１に記載のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチドにより修飾された抗腫瘍薬であり、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体の構造がＤＶＡＰ－Ｙ及び／又はＳＶＡＰ－Ｙであり、Ｙが前記抗腫瘍薬である、前記ペプチド複合体。
【請求項6】
抗腫瘍薬が、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上である、請求項５に記載のペプチド複合体。
【請求項7】
抗腫瘍薬が、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸を含む、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬のうちの１つからなる群から選択される１つ又は２つ以上であることを特徴とする、請求項６に記載のペプチド複合体。
【請求項8】
ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体であって、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体が、請求項１に記載のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰにより修飾されたポリマー担体物質であり、前記ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体の構造がＤＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚ及び／又はＳＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚであり、Ｚが前記ポリマー担体物質である、前記ペプチド複合体。
【請求項9】
ポリマー担体物質が、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上であることを特徴とする、請求項８に記載のペプチド複合体。
【請求項10】
請求項８又は９に記載の複合体を含む薬物送達系。
【請求項11】
リポソーム送達系、ポリマーミセル送達系、ポリマーディスク送達系又はナノ粒子送達系であることを特徴とする、請求項１０に記載の薬物送達系。
【請求項12】
ＤＶＡＰ及び／又は
Ｓ
ＶＡＰペプチド複合体に加えて、薬物送達系が（１）診断薬及び／又は（２）抗腫瘍薬をさらに含む、請求項１０又は１１に記載の薬物送達系。
【請求項13】
（１）の診断薬が、蛍光物質、近赤外色素及び磁気共鳴造影剤からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上であり、並びに／又は
（２）の抗腫瘍薬が、ドキソルビシン若しくはエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソールとドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシンとイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上であることを特徴とする、請求項１２に記載の薬物送達系。
【請求項14】
蛍光物質がフルオレセインであり、近赤外色素がCy7、IR820、DiRから選択され、及び／又は磁気共鳴造影剤がGd-DTPAである、請求項１３に記載の薬物送達系。
【請求項15】
腫瘍を診断、追跡及び／又は治療するための薬物又は医薬品の製造における、請求項１に記載のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド、請求項２～９のいずれかに記載のＤＶＡＰ及び／又は
Ｓ
ＶＡＰペプチド複合体、請求項１０～１４のいずれかに記載の薬物送達系の使用であって、前記腫瘍が、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学の分野に属し、ＶＡＰペプチド及び薬物の調製におけるその使用に関し、詳細には、高度に安定でありグルコース調節タンパク質であるＧＲＰ７８を標的とすることが可能な多機能性Ｄ型ペプチド、Ｌ型ペプチド及び安定なＤ型ペプチドの薬物複合体及び修飾ナノ薬物送達系に関する。詳細には、Ｄ型ペプチドＤＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）、Ｌ型ペプチドＬＶＡＰ（アミノ酸配列ＳＮＴＲＶＡＰ）及び安定なＤ型ペプチドの診断及び治療用薬物複合体、これらにより構築されるペプチド修飾ポリマー担体物質及びナノ薬物送達系、例えばリポソーム、ポリマーミセル、ポリマーディスク、ナノ粒子等、並びに腫瘍の診断及び標的治療のための薬物の調製における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍はヒトの生命と健康を深刻に脅かす疾患であり、疾患の中でもその死亡率が最も高いものの１つであることが文献により報告されている。腫瘍薬物療法の主な手段として、従来の化学療法は、腫瘍組織に対する乏しい選択性、高い毒性、狭い治療域及び多剤耐性傾向等の欠陥を有する。したがって、このような制限を克服するために、能動的標的化が近年、腫瘍部位に対する標的化効率を向上させる重要な戦略となった。能動的標的化戦略は、腫瘍組織において高度に発現する特異的受容体又は輸送体に対するリガンドの認識及び結合能、腫瘍組織又は細胞へ媒介する薬物又はナノ薬物送達系により主に実現されることが情報により開示されている。一般に使用される対応するリガンドは、モノクローナル抗体、ペプチド、アプタマー、低分子化合物等を含み、そのため、リガンド修飾薬物又はナノ薬物送達系は、細胞表面受容体又は輸送体及びリガンドの特異的認識、結合及び内部移行により薬物を腫瘍部位及び細胞へ送達することができ、したがって、薬物の腫瘍に対する能動的標的化が実現される。
【0003】
免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）としても知られる、グルコース調節タンパク質であるＧＲＰ７８は、小胞体の主要な分子シャペロンの１つであり、タンパク質の折りたたみ及び小胞体ストレス反応において重要な役割を担っている。ＧＲＰ７８の発現が、いくつかの腫瘍細胞株、固形腫瘍及びヒトがん組織生検試料において顕著に増加するという研究が示された。ＧＲＰ７８タンパク質の過剰発現は、乳がん、肝臓がん、結腸がん及び胃がん等の種々の腫瘍において証明されており、これは、このような腫瘍の発生、進行、予後及び薬物耐性と密接に関連している。ＧＲＰ７８が腫瘍細胞の細胞膜の表面に移行し得るが、この現象は正常細胞においては認められないことが最近の研究により示されている。成体幹細胞及び腫瘍幹細胞の機能を制御するＣｒｉｐｔｏ／ＧＲＰ７８シグナル伝達経路により、ＧＲＰ７８は、がん幹細胞の制御及びその幹細胞性の維持において鍵となる役割を担うことも研究により示されている。したがって、ＧＲＰ７８受容体媒介経路による、薬物又はナノ薬物送達系の腫瘍部位への特異的送達は、薬物の腫瘍診断及び治療効果の向上において非常に大きな価値を有する。
【0004】
ＬＶＡＰ（Ｌ型アミノ酸配列ＳＮＴＲＶＡＰ）は、ファージディスプレイ法により選択されるヘプタペプチドである。ＬＶＡＰは、ＧＲＰ７８に対する高い親和性を有することが判明したが、腫瘍診断及び標的治療における適用は、未だ報告されていない。
【0005】
現行技術に基づいて、本願の発明者らは、腫瘍の診断及び標的治療におけるＶＡＰペプチドの適用を提供し、既存のペプチドの安定性をさらに最適化してインビボでより良い腫瘍標的化効果を達成することを目的とする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
先行技術の欠陥に照準を合わせて、本発明の目的は、ＶＡＰペプチド並びに腫瘍診断及び標的治療におけるその適用を提供し、既存のペプチドの安定性をさらに最適化してインビボでより良い腫瘍標的効果を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明の第１の態様は、Ｄ型ペプチドを提供し、Ｄ型ペプチドはＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰであり、ＤＶＡＰのアミノ酸配列はＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳであり、ＳＶＡＰのアミノ酸配列はＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰである。
【0008】
本発明の第２の態様は、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体は、第１の態様のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰにより修飾されたマレイミド基含有造影物質であり、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体の構造はＤＶＡＰ－Ｘ及び／又はＳＶＡＰ－Ｘであり、Ｘは造影物質であり、
好ましくは、Ｘは、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤、及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRであり、磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤は99mTc-DTPAである。
好ましくは、Ｘは、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤、及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRであり、磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤は99mTc-DTPAである。
【0009】
本発明の第３の態様では、Ｌ型ペプチドＬＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＬＶＡＰにより修飾されたマレイミド基含有造影物質であり、ＬＶＡＰペプチドのアミノ酸配列はＳＮＴＲＶＡＰであり、ＬＶＡＰペプチド複合体の構造はＬＶＡＰ－Ｘであり、Ｘは造影物質であり、
好ましくは、Ｘは、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤、及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRであり、磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤は99mTc-DTPAである。
好ましくは、Ｘは、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤、及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRであり、磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤は99mTc-DTPAである。
【0010】
本発明の第４の態様は、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体は、第１の態様のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチドにより修飾された抗腫瘍薬であり、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体の構造はＤＶＡＰ－Ｙ及び／又はＳＶＡＰ－Ｙであり、Ｙは抗腫瘍薬であり、
好ましくは、抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、抗腫瘍薬は、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ（moritinib）、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸を含む、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬のうちの１つからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
好ましくは、抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、抗腫瘍薬は、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ（moritinib）、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸を含む、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬のうちの１つからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0011】
本発明の第５の態様は、Ｌ型ペプチドＬＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＬＶＡＰにより修飾された抗腫瘍薬であり、ＬＶＡＰペプチドのアミノ酸配列はＳＮＴＲＶＡＰであり、ＬＶＡＰペプチド複合体の構造はＬＶＡＰ－Ｙであり、Ｙは抗腫瘍薬であり、
好ましくは、抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド及びメリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、抗腫瘍薬は、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸を含む、ボルテゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬のうちの１つからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
好ましくは、抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド及びメリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、
より好ましくは、抗腫瘍薬は、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸を含む、ボルテゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬のうちの１つからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0012】
本発明の第６の態様は、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体は、第１の態様のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰにより修飾されたポリマー担体物質であり、ＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド複合体の構造はＤＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚ及び／又はＳＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚであり、Ｚはポリマー担体物質であり、
好ましくは、ポリマー担体物質は、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
好ましくは、ポリマー担体物質は、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0013】
本発明の第７の態様は、Ｌ型ＬＶＡＰのペプチド複合体を提供し、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＬＶＡＰにより修飾されたポリマー担体物質であり、ＬＶＡＰペプチドのアミノ酸配列はＳＮＴＲＶＡＰであり、このＬＶＡＰペプチド複合体の構造はＬＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚであり、Ｚはポリマー担体物質であり、
好ましくは、ポリマー担体物質は、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
好ましくは、ポリマー担体物質は、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0014】
本発明の第８の態様は、第６又は第７の態様の複合体を含み、
好ましくは、リポソーム送達系、ポリマーミセル送達系、ポリマーディスク送達系又はナノ粒子送達系であることを特徴とする薬物送達系を提供する。
好ましくは、リポソーム送達系、ポリマーミセル送達系、ポリマーディスク送達系又はナノ粒子送達系であることを特徴とする薬物送達系を提供する。
【0015】
第８の態様の薬物送達系によれば、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及び／又はＬＶＡＰペプチド複合体に加えて、薬物送達系は（１）診断薬及び／又は（２）抗腫瘍薬をさらに含み、
好ましくは、（１）の診断薬は、蛍光物質、近赤外色素及び磁気共鳴造影剤からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上であり、より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRから選択され、及び／若しくは磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、並びに／又は
（２）の抗腫瘍薬は、ドキソルビシン若しくはエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上である。
好ましくは、（１）の診断薬は、蛍光物質、近赤外色素及び磁気共鳴造影剤からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上であり、より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRから選択され、及び／若しくは磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、並びに／又は
（２）の抗腫瘍薬は、ドキソルビシン若しくはエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上である。
【0016】
本発明の第９の態様は、腫瘍を診断、追跡及び／又は治療するための薬物又は医薬品の製造における、第１の態様のＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰペプチド、第２～第７の態様のうちのいずれか１つのＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及び／又はＬＶＡＰペプチド複合体、第８又は第９の態様の薬物送達系の使用を提供し、
好ましくは、腫瘍は、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
好ましくは、腫瘍は、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
【0017】
本発明の第１０の態様は、腫瘍診断及び／又は標的療法のための方法であって、それを必要とする対象に
第１の態様によるＤ型ペプチド、
第２～第７の態様のうちのいずれか１つによるＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及び／若しくはＬＶＡＰペプチド複合体、並びに／又は第８若しくは第９の態様の薬物送達系
を投与することを特徴とする方法を提供する。
第１の態様によるＤ型ペプチド、
第２～第７の態様のうちのいずれか１つによるＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及び／若しくはＬＶＡＰペプチド複合体、並びに／又は第８若しくは第９の態様の薬物送達系
を投与することを特徴とする方法を提供する。
【0018】
本発明の安定化したＤ型ＶＡＰペプチドにおいて、Ｄ型ＶＡＰペプチドはＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰであり、ＤＶＡＰのアミノ酸配列はＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳであり、ＳＶＡＰのアミノ酸配列はＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰである。
【0019】
具体的には、本発明は、Ｄ型ペプチドＤＶＡＰ及び／又はＳＶＡＰを設計及び調製する。両ペプチドは、血清に対する高い安定性及びＧＲＰ７８に対する高い親和性を有する。
【0020】
本発明におけるＤ型ペプチド又は文献に報告されているＬ型ペプチド（ＬＶＡＰ、アミノ酸配列はＳＮＴＲＶＡＰ）の複合体において、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾された造影物質であり、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体の構造はＤＶＡＰ－Ｘ、ＳＶＡＰ－Ｘ及び／又はＬＶＡＰ－Ｘであり、Ｘは造影物質である。
【0021】
好ましくは、Ｘは、蛍光物質、近赤外色素、磁気共鳴造影剤及びＸ線造影剤からなる群から選択される１つ又は２つ以上である。より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はcy7、IR820及びDiRからなる群から選択される１つ又は２つ以上であり、磁気共鳴造影剤はGd-DTPAであり、Ｘ線造影剤は99mTc-DTPAである。
【0022】
具体的には、スルフヒドリル化後、本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰは、分子中のスルフヒドリル基を利用してマレイミド官能化蛍光物質（フルオレセイン、近赤外色素cy7、IR820、DiR等）、マレイミド官能化磁気共鳴造影剤Gd-DTPA及びマレイミド官能化Ｘ線造影剤99mTc-DTPAと反応して複合体を形成することが可能である。
【0023】
本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰの複合体において、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾された抗腫瘍薬であり、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体の構造は、ＤＶＡＰ－Ｙ、ＳＶＡＰ－Ｙ及び／又はＬＶＡＰ－Ｙであり、Ｙは抗腫瘍薬である。
【0024】
好ましくは、抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0025】
より好ましくは、抗腫瘍薬は、ケトン又はアルデヒド基を含む、ドキソルビシン又はエピルビシン；ヒドロキシ又はアミノを含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン；ホウ酸基を含む、ボルテゾミブ又はカルフィルゾミブ；並びに／又はｐ５３活性化ペプチド、メリチン及びサソリ毒ペプチドのペプチド薬からなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0026】
具体的には、本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰにより修飾された薬物は、マレイミドヒドラジン誘導体の反応によりｐＨ感受性ヒドラゾン結合を形成するペプチド薬複合体（ドキソルビシン又はエピルビシン及びケトン若しくはアルデヒド基を含む他の薬物を含む）、又は３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸誘導体の反応によりジスルフィド結合を形成するペプチド薬複合体（パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン及びヒドロキシ又はアミノ基を含む他の薬物を含む）、又はドパミン及び薬物のホウ酸基の反応によりｐＨ感受性ホウ酸エステルを形成するペプチド薬複合体（ボルテゾミブ及びホウ酸を含む他の薬物を含む）、又は固相合成により直接アミド結合を形成するペプチド薬複合体（ｐ５３活性化ペプチド、抗菌ペプチド、ペプチド毒素及び他のペプチド薬を含む）を含む。
【0027】
本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰの複合体において、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体は、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾されたポリマー物質であって、このＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体の構造は、ＤＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚ、ＳＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚ及び／又はＬＶＡＰ－ポリエチレングリコール－Ｚであり、Ｚはポリマー担体物質である。
【0028】
好ましくは、ポリマー担体物質は、リン脂質、ポリ乳酸、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸、及びポリカプロラクトンからなる群から選択される１つ又は２つ以上である。
【0029】
具体的には、スルフヒドリル化後、本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰは、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスホエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール－ポリカプロラクトン（ＰＥＧ－ＰＣＬ）等のマレイミド官能基を含むポリマー担体物質を修飾することが可能であり、これらはＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰ修飾リポソーム、ポリマーミセル、ポリマーディスク、及びナノ粒子等のナノ薬物送達系の構築に使用することができる。
【0030】
本発明の薬物送達系において、薬物送達系は、上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体を含む。好ましくは、薬物送達系は、リポソーム薬物送達系、ポリマーミセル薬物送達系、ポリマーディスク薬物送達系、及びナノ粒子薬物送達系である。
【0031】
好ましい実施形態として、本発明はまた、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体に加えて（１）診断薬及び／又は（２）抗腫瘍薬を含む、上述の薬物送達系を提供する。
【0032】
好ましくは、（１）の診断薬は、蛍光物質、近赤外色素、及び磁気共鳴造影剤からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上である。より好ましくは、蛍光物質はフルオレセインであり、近赤外色素はCy7、IR820、DiRからなる群から選択される１つ若しくは２つ以上であり、及び／若しくは磁気共鳴造影剤はGd-DTPAである。並びに／又は（２）の抗腫瘍薬は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬からなる群から選択される１つ若しくは２つ以上である。
【0033】
具体的には、本発明により設計したＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾されたナノ薬物送達系は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬を被包することが可能であり、フルオレセイン、Cy7、IR820、DiR、Gd-DTPA等の蛍光物質、近赤外色素、及び磁気共鳴造影剤等を被包することも可能である。
【0034】
本発明はまた、腫瘍を診断、追跡又は治療するための薬物又は医薬品の調製における、上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰのペプチド、上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰのペプチド複合体、上述の薬物送達系の使用を提供する。
【0035】
好ましくは、
腫瘍は、ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
腫瘍は、ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
【0036】
具体的には、本発明の第１の態様のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰは、腫瘍の診断及び標的治療のための、ＧＲＰ７８を高度に発現する細胞及び組織を標的とする薬物又はナノ薬物送達系を媒介することができる。
【0037】
本発明はまた、腫瘍を診断、追跡、及び／又は治療するための併用製剤を提供し、この併用製剤は、上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体及び上述の薬物送達系からなる群から選択される１つ又は２つ以上の成分を含む。
【0038】
好ましくは、併用製剤はキットであり、及び／又は
腫瘍はＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
腫瘍はＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍である。
【0039】
腫瘍を診断、追跡、及び／又は治療する本発明の方法は、経口又は非経口経路を介して、上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰペプチド複合体、上述の薬物送達系、及び上述の組合せから選択される１つ又は２つ以上の物質を有効量、患者に投与するステップを含む。
【0040】
好ましくは、腫瘍はＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍であり、並びに／又は
好ましくは、経口若しくは非経口経路は、経口、注射、パッチ、スプレー、及び患者へ送達する他の既知の経路のうちの１つ若しくは２つ以上であり得る。有効量は、１つ又は２つ以上の症候の状態の治療、減少、緩和、軽減、除去に有効な量を含み得る。この状態は、治療されることが求められているか、或いは、状態は、回避されることが求められているか、さもなければ、臨床的に同定可能な好ましい変化が、状態又はその効果において生じるものである。
好ましくは、経口若しくは非経口経路は、経口、注射、パッチ、スプレー、及び患者へ送達する他の既知の経路のうちの１つ若しくは２つ以上であり得る。有効量は、１つ又は２つ以上の症候の状態の治療、減少、緩和、軽減、除去に有効な量を含み得る。この状態は、治療されることが求められているか、或いは、状態は、回避されることが求められているか、さもなければ、臨床的に同定可能な好ましい変化が、状態又はその効果において生じるものである。
【0041】
本発明は、腫瘍標的化製剤の調製における上述のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰのペプチドの使用を提供する。好ましくは、腫瘍標的化製剤は、ＧＲＰ７８を高度に発現する腫瘍を標的化するためのものであり、並びに／又は腫瘍標的化製剤は、腫瘍を診断、追跡及び／若しくは治療するための薬物、実験試薬及び／若しくは医薬品である。本発明は、ＬＶＡＰペプチド（ＳＮＴＲＶＡＰ）修飾薬物複合体及びナノ薬物送達系を提供し、Ｌ型ペプチドが、インビボでの安定性に乏しく血中で分解され易いため、腫瘍標的化能が低下するという課題を対象とする。本発明は、高い安定性及びＧＲＰ７８に対する高い親和性を有する、Ｄ型ペプチド標的化分子であるＤＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）を提供して、その薬物複合体及び修飾ナノ薬物送達系を構築し、これにより、腫瘍の診断及び標的治療を達成して、インビボでより良い腫瘍標的化効果を得ることが可能である。
【0042】
具体的には、本発明では、高い安定性を有する、Ｄ型ペプチド標的化分子であるＤ型ペプチドＤＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）を調製し、ＬＶＡＰ（Ｌ型アミノ酸配列ＳＮＴＲＶＡＰ）、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰにより薬物分子又はポリマー担体物質を修飾して、ＶＡＰ薬物複合体及びＶＡＰ修飾ナノ薬物送達系を構築する。
【0043】
本発明では、Ｄ型ペプチド標的化分子であるＤＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（Ｄ型アミノ酸配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）を設計し、固相ポリペプチド合成技術により調製する。両ペプチドは、血清に対する高い安定性及びＧＲＰ７８に対する高い親和性を有する。
【0044】
本発明では、システインと連結後、設計したＬＶＡＰ又はＤＶＡＰ、ＳＶＡＰは、マレイミド官能化造影物質（フルオレセイン等の蛍光物質、Cy7、IR820、DiR等の近赤外色素、Gd-DTPA等の磁気共鳴造影剤、99mTc-DTPA等のＸ線造影剤等）と分子中でスルフヒドリル反応することにより複合体を形成することができる。
【0045】
本発明では、設計したＬＶＡＰ又はＤＶＡＰ、ＳＶＡＰは、マレイミドヒドラジン誘導体の反応によりｐＨ感受性ヒドラゾン結合を形成するペプチド薬複合体（ドキソルビシン又はエピルビシン及びケトン若しくはアルデヒド基を含む他の薬物を含む）、又は３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸誘導体の反応によりジスルフィド結合を形成するペプチド薬複合体（パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、シタラビン、５－フルオロウラシル、テニポシド、モリチニブ、エポチロン、ビノレルビン、アクチノマイシンＤ、ミトキサントロン、アントラキノン、マイトマイシン、ブレオマイシン、イリノテカン及びヒドロキシ又はアミノを含む他の薬物を含む）、又はドパミン及び薬物のホウ酸基の反応によりｐＨ感受性ホウ酸エステルを形成するペプチド薬複合体（ボルテゾミブ及びホウ酸基を含む他の薬物を含む）、又は固相合成により直接アミド結合を形成するペプチド薬複合体（ｐ５３活性化ペプチド、抗菌ペプチド、ペプチド毒素及び他のペプチド薬を含む）を含む薬物を修飾することができる。
【0046】
本発明では、システインと連結後、本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ又は文献に報告されているＬＶＡＰは、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスホエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸（ＰＥＧ－ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール－ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール－ポリカプロラクトン（ＰＥＧ－ＰＣＬ）等のマレイミド官能基を含むポリマー担体物質を修飾することが可能であり、これらはＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾された、リポソーム、ポリマーミセル、ポリマーディスク、及びナノ粒子等のナノ薬物送達系の構築に使用することができる。
【0047】
本発明では、ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、ＬＶＡＰにより修飾されたナノ薬物送達系は、ドキソルビシン又はエピルビシン等のアントラサイクリン類、タキソール並びにドセタキセル及びカバジタキセル等のタキサン類、カンプトテシン及びヒドロキシカンプトテシン並びにイリノテカン等のカンプトテシン類、ビンクリスチン及びビノレルビン等のビンブラスチン類、ボルテゾミブ及びカルフィルゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、パルテノライド等のラクトン類、ｐ５３活性化ペプチド、メリチン、サソリ毒ペプチド及び抗菌ペプチド等のペプチド薬等を被包する。或いは、これはまた、フルオレセイン、Cy7、IR820、DiR等の近赤外色素、磁気共鳴造影剤Gd-DTPA等の造影物質等を被包することが可能である。
【0048】
本発明のＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰは、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８を高度に発現する細胞又は組織を標的とする、腫瘍の診断及び標的治療のための、薬物又はナノ薬物送達系を媒介することができる。
【0049】
本発明は、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの調製及び特性評価と、前述のＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰ修飾薬物複合体の物質的根拠と、腫瘍診断及び治療薬を調製するためのナノ薬物送達系とを提供し、以下を含む、インビボでのＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ、及びＳＶＡＰ媒介能動的標的化の実験を実行する。
【0050】
１．ＶＡＰ、ＶＡＰ－Ｃｙｓ及びこれらの蛍光誘導体（ＶＡＰ－フルオレセイン、ＶＡＰ－Cy7）の合成
ＬＶＡＰ、ＬＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＤＶＡＰ、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓを固相合成により調製した。ＬＶＡＰ－フルオレセイン、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－Cy7、ＤＶＡＰ－Cy7、ＳＶＡＰ－Cy7をマレイミド基のスルフヒドリル基とのマイケル付加反応により合成した。生成物の特性をＨＰＬＣ及びＭＳにより評価した。
ＬＶＡＰ、ＬＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＤＶＡＰ、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓを固相合成により調製した。ＬＶＡＰ－フルオレセイン、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－Cy7、ＤＶＡＰ－Cy7、ＳＶＡＰ－Cy7をマレイミド基のスルフヒドリル基とのマイケル付加反応により合成した。生成物の特性をＨＰＬＣ及びＭＳにより評価した。
【0051】
２．ＶＡＰ安定性及び受容体親和性の評価
ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの血清安定性、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８に対する結合能、並びにＧＲＰ７８高発現細胞による細胞取込みを検討した。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰを、マウス血清と共に３７℃でそれぞれインキュベートし、種々の時点でペプチドの濃度を測定して安定性を比較した。表面プラズモン共鳴法を使用してＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのＧＲＰ７８に対する結合能を評価し、ＧＲＰ７８高発現細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣ）及びモデル腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞、Ｕ８７）のインビトロ標的化能を比較し、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－フルオレセインについてインビトロ３Ｄ腫瘍凝集塊（tumor spheroid）モデルにおける取込み能を比較した。
ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの血清安定性、グルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８に対する結合能、並びにＧＲＰ７８高発現細胞による細胞取込みを検討した。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰを、マウス血清と共に３７℃でそれぞれインキュベートし、種々の時点でペプチドの濃度を測定して安定性を比較した。表面プラズモン共鳴法を使用してＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのＧＲＰ７８に対する結合能を評価し、ＧＲＰ７８高発現細胞（例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞、ＨＵＶＥＣ）及びモデル腫瘍細胞（例えば、神経膠腫細胞、Ｕ８７）のインビトロ標的化能を比較し、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－フルオレセインについてインビトロ３Ｄ腫瘍凝集塊（tumor spheroid）モデルにおける取込み能を比較した。
【0052】
３．ＶＡＰ薬物複合体の調製
ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、システインと連結後、薬物のマレイミドヒドラジン誘導体と反応して、ｐＨ感受性ヒドラゾン結合を含むペプチド薬物複合体を形成する。関与する薬物は、ドキソルビシン及びエピルビシン等のケトン又はアルデヒド基を含む薬物を含む。
ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、システインと連結後、薬物のマレイミドヒドラジン誘導体と反応して、ｐＨ感受性ヒドラゾン結合を含むペプチド薬物複合体を形成する。関与する薬物は、ドキソルビシン及びエピルビシン等のケトン又はアルデヒド基を含む薬物を含む。
【0053】
ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、システインと連結後、薬物の３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸誘導体と反応して、ジスルフィド結合を含むペプチド薬物複合体を形成する。関与する薬物は、ヒドロキシ基又はアミノ基を含む、パクリタキセル、ドセタキセル、カンプトテシン、ヒドロキシカンプトテシン、９－ニトロカンプトテシン、ビンクリスチン等を含む。
【0054】
ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、ドパミンと連結後、薬物のホウ酸基と反応して、ｐＨ感受性ホウ酸を含むペプチド薬物複合体を形成する。関与する薬物は、ボルテゾミブ等のホウ酸基を含む薬物を含む。
【0055】
ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、ペプチド薬を用いて固相合成により直接縮合して融合ペプチドを形成する。関与する薬物は、ｐ５３活性化ペプチド、抗菌ペプチド、ペプチド毒素等のペプチド薬を含む。
【0056】
４．ＶＡＰ－ドキソルビシン複合体のインビボ薬力学及び薬物動態
システインと連結後、ドキソルビシンマレイミドヒドラジン誘導体（ＭＡＬ－ＤＯＸ）でＤＶＡＰを縮合して、ＤＶＡＰ－ドキソルビシン複合体（ＤＶＡＰ－ＤＯＸ）を形成した。Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスモデルに尾静脈を介して薬物を投与し、腫瘍容積、腫瘍重量及び腫瘍阻害率により抗腫瘍効果を評価した。Ｕ８７頭蓋内腫瘍を移植したヌードマウスモデルに尾静脈を介して薬物を投与し、インビボでの薬物の抗腫瘍効果を評価する指標として生存期間中央値を使用した。マウスの尾に静脈内注射した後、インビボでの薬物動態曲線及び分布を蛍光法により検討した。
システインと連結後、ドキソルビシンマレイミドヒドラジン誘導体（ＭＡＬ－ＤＯＸ）でＤＶＡＰを縮合して、ＤＶＡＰ－ドキソルビシン複合体（ＤＶＡＰ－ＤＯＸ）を形成した。Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスモデルに尾静脈を介して薬物を投与し、腫瘍容積、腫瘍重量及び腫瘍阻害率により抗腫瘍効果を評価した。Ｕ８７頭蓋内腫瘍を移植したヌードマウスモデルに尾静脈を介して薬物を投与し、インビボでの薬物の抗腫瘍効果を評価する指標として生存期間中央値を使用した。マウスの尾に静脈内注射した後、インビボでの薬物動態曲線及び分布を蛍光法により検討した。
【0057】
５．ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡミセル送達系の構築及び特性評価
初めに、ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰ修飾ポリマー物質であるＬＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＤＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ及びＳＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを合成した。物質の合成は、システイン連結ペプチドの遊離スルフヒドリル基とＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ中のマレイミド基との反応により達成した。Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡをアセトニトリル中に溶解し、回転蒸発させて薄膜を形成し、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を含むペプチドを加えてＬＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＤＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ及びＳＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを調製した。
初めに、ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰ修飾ポリマー物質であるＬＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＤＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ及びＳＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを合成した。物質の合成は、システイン連結ペプチドの遊離スルフヒドリル基とＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ中のマレイミド基との反応により達成した。Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡをアセトニトリル中に溶解し、回転蒸発させて薄膜を形成し、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ８．０）を含むペプチドを加えてＬＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、ＤＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ及びＳＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを調製した。
【0058】
次に、ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰ修飾ミセル（ＬＶＡＰ－ミセル、ＤＶＡＰ－ミセル、ＳＶＡＰ－ミセル）を別々に調製した。一定量のＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、ｍＰＥＧ－ＰＬＡ及び薬物（クマリンＣ６、DiR又はパクリタキセル）を用いて製膜法によりミセルを調製し、動的光散乱法（ＤＬＳ）により特性を評価して平均サイズ及び多分散指数（ＰＤＩ）を確認した。
【0059】
６．ＶＡＰ－ミセルのインビトロ及びインビボ腫瘍標的化評価
インビトロにおけるＬＶＡＰ－ミセル／Ｃ６、ＤＶＡＰ－ミセル／Ｃ６、ＳＶＡＰ－ミセル／Ｃ６及びｍＰＥＧ－ミセル／Ｃ６のＵ８７細胞、ＨＵＶＥＣ細胞及びＵ８７腫瘍凝集塊への取込みを検討した。
インビトロにおけるＬＶＡＰ－ミセル／Ｃ６、ＤＶＡＰ－ミセル／Ｃ６、ＳＶＡＰ－ミセル／Ｃ６及びｍＰＥＧ－ミセル／Ｃ６のＵ８７細胞、ＨＵＶＥＣ細胞及びＵ８７腫瘍凝集塊への取込みを検討した。
【0060】
ＬＶＡＰ－ミセル／DiR、ＤＶＡＰ－ミセル／DiR、ＳＶＡＰ－ミセル／DiR及びｍＰＥＧ－ミセル／DiRを、Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスモデルに尾静脈を介して投与し、種々の群の腫瘍内分布を各時点で比較した。
【0061】
７．ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸのインビボ抗腫瘍効果の評価
ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、タキソールの臨床用調製物及び生理食塩水を、Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスモデルに静脈を介して投与し、種々のパクリタキセルの処方のインビボにおける抗腫瘍効果を、腫瘍容積、腫瘍重量、腫瘍細胞アポトーシス、血管新生の数及び血管擬態により評価した。
ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、タキソールの臨床用調製物及び生理食塩水を、Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスモデルに静脈を介して投与し、種々のパクリタキセルの処方のインビボにおける抗腫瘍効果を、腫瘍容積、腫瘍重量、腫瘍細胞アポトーシス、血管新生の数及び血管擬態により評価した。
【0062】
本発明は、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの調製及び特性評価と、前述のＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰ修飾薬物複合体の物質的根拠と、腫瘍診断及び治療薬を調製するためのナノ薬物送達系とを提供する。本発明の実験結果は、ＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰがすべて、インビボにおいて能動的腫瘍標的化を媒介することが可能であり、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、ＬＶＡＰと比較して、より良い安定性を有し、したがって、これらはインビボにおいて、より良い能動的腫瘍標的化効果を達成したことを示す。
【図面の簡単な説明】
【0063】
【図1】
ＤＶＡＰのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフィーの方法：カラム（ＹＭＣ、Ｃ１８）：１５０×４．６ｍｍ；移動相Ａ：水（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）、移動相Ｂ：アセトニトリル（０．１％トリフルオロ酢酸を含む）；溶出手順：５％Ｂ～６５％Ｂで０～３０分；流速：０．７ｍＬ／分；カラム温度：４０℃；検出：ＵＶ２１４ｎｍ、保持時間：１１．１分。ＥＳＩ－ＭＳ：７４３．５、理論的分子量に従う。
【図2】
ＤＶＡＰ－ＣｙｓのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１２．０分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：８４６．５、理論的分子量に従う。
【図3】
ＳＶＡＰのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１０．８分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：７４３．５、理論的分子量に従う。
【図4】
ＳＶＡＰ－ＣｙｓのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１１．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：８４６．５、理論的分子量に従う。
【図5】
ＬＶＡＰのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は９．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：７４３．５、理論的分子量に従う。
【図6】
ＬＶＡＰ－ＣｙｓのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は９．６分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：８４６．５、理論的分子量に従う。
【図7】
ＤＶＡＰ－フルオレセインのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１５．３分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１２７４．４、理論的分子量に従う。
【図8】
ＳＶＡＰ－フルオレセインのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１６．９分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１２７４．４、理論的分子量に従う。
【図9】
ＬＶＡＰ－フルオレセインのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は１６．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１２７４．４、理論的分子量に従う。
【図10】
ＤＶＡＰ－Cy7のＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は２６．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１５３５．８、理論的分子量に従う。
【図11】
ＳＶＡＰ－Cy7のＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は２６．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１５３５．８、理論的分子量に従う。
【図12】
ＬＶＡＰ－Cy7のＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は上記と同様であり、保持時間は２６．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１５３５．８、理論的分子量に従う。
【図13】
ＤＶＡＰ－ＤＯＸのＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳスペクトルを示すグラフである。クロマトグラフの方法は、移動相において０．１％のトリフルオロ酢酸を０．１％のギ酸に置き換えることを除いて上記と同様であり、保持時間は１５．５分であった。ＥＳＩ－ＭＳ：１５９９．６、理論的分子量に従う。
【図14】
ＤＶＡＰ－ＰＥＧ３０００－ＰＬＡ２０００、ＳＶＡＰ－ＰＥＧ３０００－ＰＬＡ２０００及びＬＶＡＰ－ＰＥＧ３０００－ＰＬＡ２０００の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡの核磁気共鳴スペクトルにより、マレイミドのピークが６．７ｐｐｍで示されたが、ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡの核磁気共鳴スペクトルにおいてピークは消失し、これによりＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡのマレイミド基が完全に反応したことが示された。
【図15】
ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰの血清安定性を示すグラフである。グラフの垂直の縦座標は、インタクトなポリペプチドの残留率である。５０％のマウス血清においてＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの安定性が、ＬＶＡＰのそれよりも有意に高くなることを理解することができる。インキュベーション２時間後、ＬＶＡＰは完全に分解されたが、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰは、ほとんど分解されなかった。
【図16】
ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのＧＲＰ７８に対する結合能を示すグラフである。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰは、ＧＲＰ７８に対する類似の結合能を有し、ＫＤ値はそれぞれ４．０１０μＭ及び５．２２３μＭ、２．６９６μＭであり、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰでは、ＬＶＡＰよりもわずかに弱い。３つのペプチドの解離パターンは類似しており、Ｋｄ値はそれぞれ０．０２０９１ １／ｓ、０．０２８２６ １／ｓ及び０．０１８９８ １／ｓである。
【図17】ＧＲＰ７８の細胞内分布を示す画像である。ＧＲＰ７８は、腫瘍細胞Ｕ８７及びＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞、Human Umbilical Vein Endothelial Cell）の細胞膜上及び血漿中では広範に分布するが、ＨＥＫ２９３（正常細胞）の膜上では分布せず、血漿中では分布は狭小である。
【図18】神経膠腫細胞Ｕ８７によるフルオレセイン標識ペプチドの取込みを示す図である。図Ａ及び図Ｂは、４時間、Ｕ８７細胞と相互作用する、フルオレセイン標識ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのレーザー共焦点顕微鏡写真及びフローサイトメトリー検出結果を示す。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのＵ８７による取込みが、遊離のフルオレセインの取込みよりも有意に高くなっており、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの取込みにおいて有意差はなく、これらの取込みは、ＬＶＡＰよりもわずかに弱いことを示す。
【図19】ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞）によるフルオレセイン標識ペプチドの取込みを示す図である。図Ａ及び図Ｂは、４時間、ＨＵＶＥＣ細胞と相互作用する、フルオレセイン標識ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのレーザー共焦点顕微鏡写真及びフローサイトメトリー検出結果を示す。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのＨＵＶＥＣ細胞による取込みが、遊離のフルオレセインの取込みよりも有意に高くなっており、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰの取込みにおいて有意差はなく、これらの取込みは、ＬＶＡＰよりもわずかに弱いことを示す。
【図20】Ｕ８７腫瘍凝集塊によるフルオレセイン標識ペプチド及びＶＡＰ－ミセル／Ｃ６の取込みを示す画像である。画像は、Ｕ８７腫瘍凝集塊によるフルオレセイン標識ペプチド及びＶＡＰミセルのそれぞれの取込みを示す。フルオレセイン標識ペプチド及びＶＡＰミセルのそれぞれが、Ｕ８７腫瘍凝集塊により良好に取り込まれ、これらの取込みは、ＦＡＭ及び単純なミセルとは有意に異なることが画像から理解することができる。
【図21】
ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰの競合的阻害を示すグラフである。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰが、お互いを完全に阻害し得ることが理解可能であり、３つのポリペプチドすべてが、ＧＲＰ７８タンパク質の同じ部位に結合することを証明する。
【図22】皮下移植腫瘍におけるCy7標識ペプチドの分布を示す図である。図Ａは、Ｕ８７皮下腫瘍を移植したヌードマウスにおける１時間のCy7標識ペプチド注射後の腫瘍のエクスビボ蛍光画像を示す。図Ｂは、投与後各時点での蛍光の半定量的結果を示す。図Ｃは、腫瘍及び臓器におけるエクスビボ蛍光画像を示す。図Ｄは、腫瘍における蛍光強度のエクスビボ半定量的分析である。腫瘍におけるCy7標識ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰの蓄積は、遊離のCy7の蓄積よりも有意に高かった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。腫瘍標的化効果はＤＶＡＰ≒ＳＶＡＰ＞ＬＶＡＰである。
【図23】
ＤＶＡＰ－ＤＯＸの皮下腫瘍増殖の阻害を示す図である。図Ａは、ヌードマウスにおける各群の腫瘍容積の時間による変動を示す曲線である。生理食塩水の群と比較して、投与の各群では、腫瘍の増殖が阻害された。同じＤｏｘ用量では、ＤＶＡＰ－ＤＯＸの効果は、ＤＯＸ及びＭＡＬ－ＤＯＸの効果よりも有意に良好であり、ＲＧＤ－ＤＯＸの効果よりも明白に良好であった。図Ｂは、ヌードマウスを犠死させ、腫瘍組織を採出した後の秤量の結果及び統計分析を示す。図Ｃは、エクスビボ腫瘍組織の写真である。ＤＶＡＰ－ＤＯＸ群の腫瘍サイズ及び腫瘍重量が、同じＤｏｘ用量の他の群の腫瘍サイズ及び腫瘍重量よりも有意に低かったことを理解することができる。
【図24】
ＤＶＡＰ－ＤＯＸにより処理した頭蓋内腫瘍を担持するヌードマウスモデルの生存曲線を示すグラフである。ＰＢＳ群、ＤＯＸ群、ＭＡＬ－ＤＯＸ群、ＤＶＡＰ－ＤＯＸ群（高、中、低用量）及びＤＶＡＰ群の平均生存期間はそれぞれ３６、３６、４８、５８、５２、４８．５及び４５．５日であった。結果は、他の群と比較して、ＤＶＡＰ－ＤＯＸ群の頭蓋内腫瘍を担持するヌードマウスモデルの生存期間が最も持続し、低用量のＤＶＡＰ－ＤＯＸが、４倍高用量のＭＡＬ－ＤＯＸと同じ抗脳神経膠腫効果を有したことを示した。
【図25】マウスにおけるＤＶＡＰ－ＤＯＸの薬物動態曲線及び分布を示すグラフである。図Ａは薬物動態曲線を示し、図Ｂはマウスの主要臓器における分布を示す。結果は、ＤＶＡＰ－ＤＯＸのＡＵＣが、ＭＡＬ－ＤＯＸのＡＵＣよりも有意に低くなったが、遊離のＤＯＸのＡＵＣよりも有意に高くなったことを示した。さらに、インビボの主要臓器における分布から、ＤＶＡＰ－ＤＯＸにより心臓における薬物の分布を有意に減少させることができ、これによりドキソルビシンの心臓に対する副作用が減少し得る。
【図26】皮下腫瘍におけるDiR負荷ＶＡＰミセルの分布を示す画像である。図Ａは、尾静脈注射２４時間後のインビボ蛍光画像を示す。左から右に示すのは、ＰＢＳ群、ｍＰＥＧ－ミセル／DiR群、ＬＶＡＰ－ミセル／DiR群、ＤＶＡＰ－ミセル／DiR群及びＳＶＡＰ－ミセル／DiR群である。図Ｂは、臓器の蛍光画像である。結果は、ＤＶＡＰ又はＳＶＡＰ修飾ミセルが、腫瘍部位をより効果的に標的としたことを示す。
【図27】パクリタキセル負荷ミセルの粒子サイズを示すグラフである。グラフは、各パクリタキセルミセルの処方の粒子サイズ分布を示す。グラフに示すように、種々の処方間でサイズの有意差はなかった。
【図28】パクリタキセル負荷ミセルのＵ８７及びＨＵＶＥＣ細胞に対する阻害曲線を示すグラフである。グラフＡ及びグラフＢは、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びタキソールのＵ８７細胞及びＨＵＶＥＣ細胞に対する阻害曲線をそれぞれ示す。グラフＡは、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びタキソールのＵ８７細胞に対するＩＣ５０が、４時間投与し７２時間培養した後に０．７３、０．０９、０．１２、０．５９及び０．７５μＭであることを示す。すべてのミセルにおいて、インビトロでＵ８７細胞の増殖が阻害可能である。ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの活性は、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの活性のそれぞれ６．５６及び４．９２倍であった。グラフＢは、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びタキソールのＨＵＶＥＣ細胞に対するＩＣ５０が、４時間投与し７２時間培養した後に０．５２、０．０４、０．０４、０．２３及び０．７４μＭであったことを示す。すべてのミセルにおいて、インビトロでＨＵＶＥＣ細胞の増殖が阻害可能である。ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの活性は、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの活性の５．７５倍であった。
【図29】パクリタキセル負荷ミセルによる血管新生形成のインビトロ阻害を示す画像である。画像は、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びタキソールのインビトロ血管新生モデルに対する阻害を、血管新生形成をより有意に阻害したＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸと比較して示す。
【図30】パクリタキセル負荷ミセルによる血管擬態形成のインビトロ阻害を示す画像である。画像は、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びタキソールの血管擬態モデルに対する阻害を、血管擬態形成をより有意に阻害したＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸと比較して示す。
【図31】パクリタキセル負荷ミセルの皮下腫瘍増殖の阻害を示すグラフである。グラフＡは、ヌードマウスにおける各群の腫瘍容積の経時変化を示す曲線であり、それぞれの投与群において腫瘍の増殖が阻害された。ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸでは、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸと著しく異なる（ｎ＝８、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ヌードマウスを犠死させた後、採取した腫瘍を秤量し、統計的に分析した（グラフＢ）。ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ群の腫瘍重量は、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの腫瘍重量よりも有意に小さかった（ｎ＝８、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図32】ＴＵＮＥＬ染色の結果を示す画像である。画像は、腫瘍アポトーシスを促進する、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸのＴＵＮＥＬ染色画像（バー＝５０μｍ）を示し、アポトーシス細胞は、黄褐色又は褐色の核を示した。
【図33】ＣＤ３１／ＰＡＳ二重染色結果を示す画像である。画像は、血管新生を阻害する、ｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸのＣＤ３１／ＰＡＳ染色画像（バー＝１００μｍ）を示し、新生血管細胞の核は、黄褐色又は褐色である。
【発明を実施するための形態】
【0064】
本発明は以下の実施例によりさらに理解されるが、本発明は下記の説明の範囲に制限されない。
【実施例1】
【0065】
ＶＡＰ、ＶＡＰ－フルオレセイン、ＶＡＰ－Cy7、ＶＡＰ－薬物、ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡの合成及び特性評価
１．ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ及びＬＶＡＰ－Ｃｙｓの合成及び特性評価
Ｄ型アミノ酸からなる、設計したＤＶＡＰ（配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＤＣＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰＤＣ）並びにＬ型アミノ酸からなる、ＬＶＡＰ（配列ＳＮＴＲＶＡＰ）及びＬＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＳＮＴＲＶＡＰＣ）を固相ペプチド合成により合成した。
１．ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰ、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ及びＬＶＡＰ－Ｃｙｓの合成及び特性評価
Ｄ型アミノ酸からなる、設計したＤＶＡＰ（配列ＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＤＣＤＰＤＡＤＶＤＲＤＴＤＮＤＳ）及びＳＶＡＰ（配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰ）、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＤＳＤＮＤＴＤＲＤＶＤＡＤＰＤＣ）並びにＬ型アミノ酸からなる、ＬＶＡＰ（配列ＳＮＴＲＶＡＰ）及びＬＶＡＰ－Ｃｙｓ（配列ＳＮＴＲＶＡＰＣ）を固相ペプチド合成により合成した。
【0066】
具体的方法：標準Ｂｏｃ基固相ペプチド合成方法により、アミノ酸をＰＡＭ樹脂と順次共役させ、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを縮合剤として及びＴＦＡを脱保護剤として使用して反応を実行した。すべてのアミノ酸を共役後、Ｐ－クレゾールを含むフッ化水素により樹脂を切り出し、氷浴中で１時間撹拌した。フッ化水素を減圧下で除去し、沈殿物を形成して、氷冷したジエチルエーテルで３回洗浄した。沈殿物を２０％のアセトニトリル中に再溶解し、ろ液を採取し、次いで、回転蒸発させて粗ペプチド溶液を得た。分取ＨＰＬＣによりアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む）を溶離剤として用いて粗ペプチドを精製した。ＤＶＡＰ、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＬＶＡＰ及びＬＶＡＰ－Ｃｙｓの純度及び分子量（Ｍｗ）についてＨＰＬＣ及びＥＳＩ－ＭＳにより特性を評価した。ＨＰＬＣスペクトル及び質量スペクトルを図１、２、３、４、５及び６に示す。
【0067】
２．ＶＡＰ－フルオレセイン及びＶＡＰ－Cy7の合成及び特性評価
上記のステップで得られたＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓを０．１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中に溶解し、フルオレセイン－５－マレイミドをＤＭＦ中に溶解した。混合後、反応液を磁気的に撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓが完全に反応すると反応が停止し、分取ＨＰＬＣによりアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む）を溶離剤として用いて反応液を精製、凍結乾燥してＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン又はＬＶＡＰ－フルオレセインを得た。ＨＰＬＣスペクトル及び質量スペクトルを図７、８、及び９に示す。
上記のステップで得られたＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓを０．１ＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．２）中に溶解し、フルオレセイン－５－マレイミドをＤＭＦ中に溶解した。混合後、反応液を磁気的に撹拌し、ＨＰＬＣによりモニターした。ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓが完全に反応すると反応が停止し、分取ＨＰＬＣによりアセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡを含む）を溶離剤として用いて反応液を精製、凍結乾燥してＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン又はＬＶＡＰ－フルオレセインを得た。ＨＰＬＣスペクトル及び質量スペクトルを図７、８、及び９に示す。
【0068】
ＶＡＰ－Cy7の調製方法は上記と同様である。ＨＰＬＣスペクトル及び質量スペクトルを図１０、１１、及び１２に示す。
【0069】
３．ＶＡＰ－DTPA－Gd及びＶＡＰ－DTPA－99mTcの調製
ＤＭＦ中に溶解したマレイミド－DTPAを混合し、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓ含有ＰＢＳ溶液と共に撹拌して上記のように反応させた。分取ＨＰＬＣ及び乾燥凍結を適用して純粋なＤＶＡＰ－DTPA、ＳＶＡＰ－DTPA又はＬＶＡＰ－DTPAを得、その後、Gd又は99mTcでキレート化してＶＡＰ－DTPA－Gd又はＶＡＰ－DTPA－99mTcを得た。
ＤＭＦ中に溶解したマレイミド－DTPAを混合し、ＤＶＡＰ－Ｃｙｓ、ＳＶＡＰ－Ｃｙｓ又はＬＶＡＰ－Ｃｙｓ含有ＰＢＳ溶液と共に撹拌して上記のように反応させた。分取ＨＰＬＣ及び乾燥凍結を適用して純粋なＤＶＡＰ－DTPA、ＳＶＡＰ－DTPA又はＬＶＡＰ－DTPAを得、その後、Gd又は99mTcでキレート化してＶＡＰ－DTPA－Gd又はＶＡＰ－DTPA－99mTcを得た。
【0070】
４．ＶＡＰ－薬物複合体の調製
ケトン又はアルデヒド基を含む薬物と共役するＶＡＰの例としてＶＡＰ－ドキソルビシン複合体を調製した。チオール化ＶＡＰ（ＤＶＡＰ又はＳＶＡＰ又はＬＶＡＰ）９．４ｍｇをＰＢＳ（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）３ｍＬ中に溶解し、１０倍モル量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加え、４℃で２０分間撹拌した。次いで、４倍モル量のドキソルビシンマレイミドヒドラジン誘導体（ＭＡＬ－ＤＯＸ）を加え、室温、暗所で１時間反応させた。分取ＨＰＬＣにより反応液を精製し、凍結乾燥してＬＶＡＰ又はＤＶＡＰ又はＳＶＡＰ－ドキソルビシン複合体を得た。ＨＰＬＣ及びＭＳにより複合体の特性を評価した。結果を図１３に示す。
ケトン又はアルデヒド基を含む薬物と共役するＶＡＰの例としてＶＡＰ－ドキソルビシン複合体を調製した。チオール化ＶＡＰ（ＤＶＡＰ又はＳＶＡＰ又はＬＶＡＰ）９．４ｍｇをＰＢＳ（０．１ｍＭ、ｐＨ７．０）３ｍＬ中に溶解し、１０倍モル量のトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を加え、４℃で２０分間撹拌した。次いで、４倍モル量のドキソルビシンマレイミドヒドラジン誘導体（ＭＡＬ－ＤＯＸ）を加え、室温、暗所で１時間反応させた。分取ＨＰＬＣにより反応液を精製し、凍結乾燥してＬＶＡＰ又はＤＶＡＰ又はＳＶＡＰ－ドキソルビシン複合体を得た。ＨＰＬＣ及びＭＳにより複合体の特性を評価した。結果を図１３に示す。
【0071】
ヒドロキシ又はアミノ基をジスルフィド結合により含む薬物と共役するＶＡＰの例としてＶＡＰ－パクリタキセル複合体を調製した。パクリタキセル２００ｍｇをクロロホルム１０ｍＬ中に溶解し、０～５℃まで冷却して、ＤＣＣを３９．９９ｍｇ及び３－（２－ピリジルジチオ）プロピオン酸を６０．４ｍｇ連続的に加え、次いで、反応液の温度を室温まで上昇させて一晩反応させた。反応液をろ過し、カラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ＝５０：１～１５：１、Ｖ／Ｖ溶出）により精製してパクリタキセル３－（２－ピリジニル）－プロピオン酸誘導体を得た。パクリタキセル３－（２－ピリジニル）－プロピオン酸誘導体をＤＭＦ５ｍＬ中に溶解し、１．５倍モル量のＶＡＰ－ＣｙｓをＰＢＳ／ＤＭＦ中に溶解した。パクリタキセル３－（２－ピリジニル）－プロピオン酸誘導体をチオールペプチド溶液に滴加し、溶液のｐＨを４～５に維持して室温で６時間反応させた。分取ＨＰＬＣ精製及び凍結乾燥によりＶＡＰ－パクリタキセル複合体を得た。
【0072】
ホウ酸基を含む薬物と共役するＶＡＰの例としてＶＡＰ－ボルテゾミブ複合体を調製した。ＶＡＰの合成及び窒素末端におけるトリフルオロ酢酸によるＢｏｃ脱保護に従ってアミノ酸を樹脂と順次共役後、３倍モル量の無水コハク酸をＤＭＦ中に溶解したＤＩＥＡと共に加え、室温で３０分間反応させた。樹脂を洗浄後、５倍モル量のトリメチルクロロシランを加え、室温で１時間反応させてドパミンを保護し、ＨＢＴＵ／ＤＩＥＡを縮合剤として使用した。フッ化水素により樹脂を切り出し、ＶＡＰ－ドパミン誘導体を分取ＨＰＬＣにより精製した。ＶＡＰ－ドパミン誘導体をボルテゾミブとｐＨ７．４の緩衝液中１：１のモル比で混合してＶＡＰ－ボルテゾミブ複合体を得た。
【0073】
ペプチド薬と共役するＶＡＰの例としてＶＡＰ－ＰＭＩを調製した。ＶＡＰ－薬物複合体を固相ペプチド合成方法により直接得た。具体的方法：ＶＡＰ－ＰＭＩポリペプチド配列の設計後、ＶＡＰの調製と同様の方法によりＶＡＰ－ＰＭＩのアミノ酸を樹脂と順次共役させ、フッ化水素による切出し及び精製の後にＶＡＰ－ＰＭＩ融合ペプチドを得た。
【0074】
５．ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡの合成及び特性評価
ペプチドの遊離スルフヒドリル基とＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ中のマレイミド基との反応によりポリマー物質の合成を達成した。Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ４０ｍｇをアセトニトリル５ｍＬ中に溶解し、回転蒸発させて膜を形成し、ＰＢＳ（ｐＨ８．０、０．２Ｍ）３ｍＬを加えて水和し、３７℃でミセルを形成した。次いで、８時間以内にＶＡＰ－Ｃｙｓを９．６ｍｇ加えて一晩反応させた。過剰なＶＡＰ－Ｃｙｓを透析により除去し、ＨＰＬＣにより反応を検出した。ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを凍結乾燥し、１Ｈ－ＮＭＲにより特性を評価した（図１４）。
ペプチドの遊離スルフヒドリル基とＭａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ中のマレイミド基との反応によりポリマー物質の合成を達成した。Ｍａｌ－ＰＥＧ－ＰＬＡ４０ｍｇをアセトニトリル５ｍＬ中に溶解し、回転蒸発させて膜を形成し、ＰＢＳ（ｐＨ８．０、０．２Ｍ）３ｍＬを加えて水和し、３７℃でミセルを形成した。次いで、８時間以内にＶＡＰ－Ｃｙｓを９．６ｍｇ加えて一晩反応させた。過剰なＶＡＰ－Ｃｙｓを透析により除去し、ＨＰＬＣにより反応を検出した。ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを凍結乾燥し、１Ｈ－ＮＭＲにより特性を評価した（図１４）。
【実施例2】
【0075】
ＶＡＰの血清安定性の検討
ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰそれぞれ１ｍｇ／ｍＬを蒸留水中に溶解し、次いで０．１ｍＬの各ＶＡＰ溶液を２５％のマウス血清０．９ｍＬ中に加え、３７℃でインキュベートした。０及び１５分、０．５、１、２及び４時間の時点で溶液１００μＬを採り出し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）２０μＬを沈殿した血清タンパク質に加え、４℃で２０分間静置後、溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清２０μＬを採り出してＨＰＬＣ分析を行った。血清安定性の結果（図１５）により、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰがＬＶＡＰよりも良好な血清安定性を有することが示された。
ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰそれぞれ１ｍｇ／ｍＬを蒸留水中に溶解し、次いで０．１ｍＬの各ＶＡＰ溶液を２５％のマウス血清０．９ｍＬ中に加え、３７℃でインキュベートした。０及び１５分、０．５、１、２及び４時間の時点で溶液１００μＬを採り出し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）２０μＬを沈殿した血清タンパク質に加え、４℃で２０分間静置後、溶液を１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清２０μＬを採り出してＨＰＬＣ分析を行った。血清安定性の結果（図１５）により、ＤＶＡＰ及びＳＶＡＰがＬＶＡＰよりも良好な血清安定性を有することが示された。
【実施例3】
【0076】
ＶＡＰのグルコース調節タンパク質ＧＲＰ７８に対する結合能の実験
ビアコアシステムによりプレ結合分析を実施し、ＣＭ５チップに結合するＧＲＰ７８の最適ｐＨとしてｐＨ５．０を選択した。組換えヒトＧＲＰ７８をＣＭ５チップと共役し、ＲＵ値を所定の値に到達させた。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、及びＬＶＡＰ溶液を０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０及び２０μＭの濃度でそれぞれ調製した。低濃度から高濃度で試料を注入した。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのタンパク質に対する結合能をBiacore T200 Evaluationソフトウェアにより分析し、ＫＤ値及びＫｄ値をそれぞれ算出した（図１６）。
ビアコアシステムによりプレ結合分析を実施し、ＣＭ５チップに結合するＧＲＰ７８の最適ｐＨとしてｐＨ５．０を選択した。組換えヒトＧＲＰ７８をＣＭ５チップと共役し、ＲＵ値を所定の値に到達させた。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ、及びＬＶＡＰ溶液を０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０及び２０μＭの濃度でそれぞれ調製した。低濃度から高濃度で試料を注入した。ＤＶＡＰ、ＳＶＡＰ及びＬＶＡＰのタンパク質に対する結合能をBiacore T200 Evaluationソフトウェアにより分析し、ＫＤ値及びＫｄ値をそれぞれ算出した（図１６）。
【実施例4】
【0077】
ＧＲＰ７８の細胞内分布の検討
３種の細胞（Ｕ８７、ＨＵＶＥＣ及びＨＥＫ２９３）をＧＲＰ７８分布実験用に選択し、細胞中のＧＲＰ７８の分布を膜破裂の有無により検討した。細胞を共焦点顕微鏡皿内に播種し、ＰＢＳで３回洗浄して、１０μＭのＤＩＯパラホルムアルデヒド溶液で８分間固定した。１％のＢＳＡにより３７℃で３０分間ブロッキングし、ＰＢＳで３回洗浄した後、１％のＢＳＡで希釈した抗ＧＲＰ７８抗体と共に細胞を加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡで希釈した二次抗体と共に加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回、毎回５分間洗浄した。ＤＡＰＩで１０分間染色、ＰＢＳで３回洗浄し、グリセリンで封着した後、レーザー共焦点顕微鏡で細胞を観察した。結果を図１７に示す。
３種の細胞（Ｕ８７、ＨＵＶＥＣ及びＨＥＫ２９３）をＧＲＰ７８分布実験用に選択し、細胞中のＧＲＰ７８の分布を膜破裂の有無により検討した。細胞を共焦点顕微鏡皿内に播種し、ＰＢＳで３回洗浄して、１０μＭのＤＩＯパラホルムアルデヒド溶液で８分間固定した。１％のＢＳＡにより３７℃で３０分間ブロッキングし、ＰＢＳで３回洗浄した後、１％のＢＳＡで希釈した抗ＧＲＰ７８抗体と共に細胞を加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％のＢＳＡで希釈した二次抗体と共に加え、３７℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳで２回、毎回５分間洗浄した。ＤＡＰＩで１０分間染色、ＰＢＳで３回洗浄し、グリセリンで封着した後、レーザー共焦点顕微鏡で細胞を観察した。結果を図１７に示す。
【実施例5】
【0078】
ＶＡＰアッセイにおけるインビトロ細胞標的化
１．ＶＡＰの神経膠腫細胞Ｕ８７に対するインビトロ標的化
単層培養した対数増殖期の神経膠腫細胞（Ｕ８７細胞）を０．２５％のトリプシンで消化した。１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液を使用して単一細胞懸濁液を調製する。培養プレートを二酸化炭素インキュベーターに移し、１ｍＬのウェル容積の１２ウェルプレート中に細胞を１ウェル当り１×１０５細胞の密度で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で一晩培養した。次いで、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５μＭの濃度のＦＡＭ、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン及びＬＶＡＰ－フルオレセイン溶液とＤＭＥＭ培地を交換し、３７℃で４時間インキュベートし、上清を吸引した。細胞をＰＢＳ溶液で３回洗浄し、ホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色した。共焦点レーザー顕微鏡により蛍光画像を取得した。細胞内移行の写真を図１８Ａに示す。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーにより検出した。フローサイトメトリー分析の結果を図１８Ｂに示す。
１．ＶＡＰの神経膠腫細胞Ｕ８７に対するインビトロ標的化
単層培養した対数増殖期の神経膠腫細胞（Ｕ８７細胞）を０．２５％のトリプシンで消化した。１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液を使用して単一細胞懸濁液を調製する。培養プレートを二酸化炭素インキュベーターに移し、１ｍＬのウェル容積の１２ウェルプレート中に細胞を１ウェル当り１×１０５細胞の密度で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で一晩培養した。次いで、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５μＭの濃度のＦＡＭ、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン及びＬＶＡＰ－フルオレセイン溶液とＤＭＥＭ培地を交換し、３７℃で４時間インキュベートし、上清を吸引した。細胞をＰＢＳ溶液で３回洗浄し、ホルムアルデヒドで固定し、ＤＡＰＩで染色した。共焦点レーザー顕微鏡により蛍光画像を取得した。細胞内移行の写真を図１８Ａに示す。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで、フローサイトメトリーにより検出した。フローサイトメトリー分析の結果を図１８Ｂに示す。
【0079】
２．ＶＡＰのヒト臍帯静脈内皮細胞に対するインビトロ標的化
単層培養した対数増殖期のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）を上記のように試験した。内部移行写真を図１９Ａに示し、フローサイトメトリー分析の結果を図１９Ｂに示す。
単層培養した対数増殖期のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）を上記のように試験した。内部移行写真を図１９Ａに示し、フローサイトメトリー分析の結果を図１９Ｂに示す。
【0080】
３．インビトロにおけるＶＡＰのＵ８７腫瘍凝集塊に対する標的化
２％の低分子量アガロース溶液を４８ウェルプレートに１ウェル当り１５０μＬで熱いうちに加え、室温に置いて冷却及び固化させた。次いで、Ｕ８７細胞懸濁液４００μＬを各ウェルに播種し、細胞密度を２×１０３細胞／ウェルとした。二酸化炭素インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で７日間インキュベートすることにより腫瘍凝集塊を確立した。次いで、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５μＭの濃度のＦＩＴＣ、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン及びＬＶＡＰ－フルオレセイン溶液と培養液を交換し、３７℃で４時間置き、上清を吸引した。腫瘍凝集塊をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、共焦点顕微鏡により観察した。写真を図２０Ａに示す。
２％の低分子量アガロース溶液を４８ウェルプレートに１ウェル当り１５０μＬで熱いうちに加え、室温に置いて冷却及び固化させた。次いで、Ｕ８７細胞懸濁液４００μＬを各ウェルに播種し、細胞密度を２×１０３細胞／ウェルとした。二酸化炭素インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で７日間インキュベートすることにより腫瘍凝集塊を確立した。次いで、１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５μＭの濃度のＦＩＴＣ、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン及びＬＶＡＰ－フルオレセイン溶液と培養液を交換し、３７℃で４時間置き、上清を吸引した。腫瘍凝集塊をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、共焦点顕微鏡により観察した。写真を図２０Ａに示す。
【0081】
４．ＶＡＰ相互競合阻害試験
９つの群（ブランク対照群、ＬＶＡＰ－フルオレセイン、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ））を各群につき３つのチューブを用いて設定して、ＶＡＰペプチド間の相互競合阻害を検討した。Ｕ８７細胞をトリプシンにより消化してＥＰチューブに移し、ＰＢＳで３回洗浄してトリプシンを除去し、４℃で２０分間前処理した。調製したペプチド溶液（非蛍光標識）をまた４℃に置いて低温で前処理し、次いで、ペプチド溶液を細胞と混合し、２時間刺激を与えて細胞表面の受容体タンパク質を飽和させた。次いで、蛍光物質で標識したペプチド溶液を加えた。４℃で一晩静置後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した（図２１に示す）。
９つの群（ブランク対照群、ＬＶＡＰ－フルオレセイン、ＤＶＡＰ－フルオレセイン、ＳＶＡＰ－フルオレセイン、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＬＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＤＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＬＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＤＶＡＰ）、ＳＶＡＰ－フルオレセイン（＋ＳＶＡＰ））を各群につき３つのチューブを用いて設定して、ＶＡＰペプチド間の相互競合阻害を検討した。Ｕ８７細胞をトリプシンにより消化してＥＰチューブに移し、ＰＢＳで３回洗浄してトリプシンを除去し、４℃で２０分間前処理した。調製したペプチド溶液（非蛍光標識）をまた４℃に置いて低温で前処理し、次いで、ペプチド溶液を細胞と混合し、２時間刺激を与えて細胞表面の受容体タンパク質を飽和させた。次いで、蛍光物質で標識したペプチド溶液を加えた。４℃で一晩静置後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した（図２１に示す）。
【実施例6】
【0082】
ＶＡＰアッセイにおけるインビボ腫瘍標的化
初めに、皮下腫瘍動物モデルを次のように構築した。対数増殖期のＵ８７細胞をトリプシンで消化し、次いで、３×１０７／ｍＬの濃度の細胞懸濁液１００μＬをヌードマウスの右背側に播種した。マウスをＳＰＦクラスに飼育し、腫瘍サイズを定期的に観察した。腫瘍サイズが２００ｍｍ３になると、壊死のない通常の腫瘍形状である腫瘍担持ヌードマウスを選定し、集団で試験した。Cy7並びにＤＶＡＰ－Cy7、ＳＶＡＰ－Cy7及びＬＶＡＰ－Cy7溶液を１マウス当り０．１５μｍｏｌの用量で腫瘍担持ヌードマウスモデルに尾静脈を介して注射した。２時間後、ヌードマウスを犠死させ、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳイメージングシステムによりエクスビボ蛍光造影に露光した（図２２Ａに示す）。さらに、蛍光強度の半定量分析値を算出した（図２２Ｂに示す）。
初めに、皮下腫瘍動物モデルを次のように構築した。対数増殖期のＵ８７細胞をトリプシンで消化し、次いで、３×１０７／ｍＬの濃度の細胞懸濁液１００μＬをヌードマウスの右背側に播種した。マウスをＳＰＦクラスに飼育し、腫瘍サイズを定期的に観察した。腫瘍サイズが２００ｍｍ３になると、壊死のない通常の腫瘍形状である腫瘍担持ヌードマウスを選定し、集団で試験した。Cy7並びにＤＶＡＰ－Cy7、ＳＶＡＰ－Cy7及びＬＶＡＰ－Cy7溶液を１マウス当り０．１５μｍｏｌの用量で腫瘍担持ヌードマウスモデルに尾静脈を介して注射した。２時間後、ヌードマウスを犠死させ、腫瘍を採取し、ＩＶＩＳイメージングシステムによりエクスビボ蛍光造影に露光した（図２２Ａに示す）。さらに、蛍光強度の半定量分析値を算出した（図２２Ｂに示す）。
【実施例7】
【0083】
ＤＶＡＰ－ＤＯＸの薬力学及び薬物動態の検証
１．Ｕ８７皮下腫瘍の阻害効果試験
Ｕ８７皮下腫瘍担持マウスモデルを構築し、腫瘍サイズが１００ｍｍ３になると、集団で試験した。皮下腫瘍担持モデルマウスに生理食塩水、ＤＯＸ、ＭＡＬ－ＤＯＸ（高及び低用量）及びＤＶＡＰ－ＤＯＸ（高及び低用量）並びにＲＧＤ－ＤＯＸ（インテグリンリガンドｃ（ＲＧＤｙＫ）及びＭＡＬ－ＤＯＸを用いてＶＡＰ－ＤＯＸによるものと同様の方法によって調製した薬物複合体）を５回投与し、各投与間の間隔は２日とした。ＤＯＸの総用量は、低用量の１．２５ｍｇ／ｋｇを除いて２．５ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の長径（ａ）及び短径（ｂ）をノギスにより１日おきに測定し、ヌードマウスの腫瘍容積を式により算出して腫瘍容積の経時変化曲線をプロットし、各群の統計的有意差を算出した。式：
V腫瘍容積 = 0.5 (a × b2)
により腫瘍容積を算出した。
１．Ｕ８７皮下腫瘍の阻害効果試験
Ｕ８７皮下腫瘍担持マウスモデルを構築し、腫瘍サイズが１００ｍｍ３になると、集団で試験した。皮下腫瘍担持モデルマウスに生理食塩水、ＤＯＸ、ＭＡＬ－ＤＯＸ（高及び低用量）及びＤＶＡＰ－ＤＯＸ（高及び低用量）並びにＲＧＤ－ＤＯＸ（インテグリンリガンドｃ（ＲＧＤｙＫ）及びＭＡＬ－ＤＯＸを用いてＶＡＰ－ＤＯＸによるものと同様の方法によって調製した薬物複合体）を５回投与し、各投与間の間隔は２日とした。ＤＯＸの総用量は、低用量の１．２５ｍｇ／ｋｇを除いて２．５ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の長径（ａ）及び短径（ｂ）をノギスにより１日おきに測定し、ヌードマウスの腫瘍容積を式により算出して腫瘍容積の経時変化曲線をプロットし、各群の統計的有意差を算出した。式：
V腫瘍容積 = 0.5 (a × b2)
により腫瘍容積を算出した。
【0084】
投与２１日後、すべてのヌードマウスを犠死させ、採取した皮下腫瘍を秤量し、各群の統計的有意差及び腫瘍阻害率を算出した（図２３）。
【0085】
２．頭蓋内神経膠腫の抗神経膠芽腫効果試験
ヌードマウスに麻酔し、定位固定装置で固定した後、ヌードマウスにおいて対数増殖期のＵ８７細胞（各マウスについてＰＢＳ緩衝液５μＬ中に分散した５×１０５細胞）を右線条体内（前腸骨稜の前０．６ｍｍ、横方向１．８ｍｍ、及び深さ３ｍｍ）に移植することにより頭蓋内Ｕ８７腫瘍担持モデルを確立した。裸のマウスの状態を定期的に観察した。移植１０、１３、１６、１９及び２２日後にＰＢＳ、ＤＯＸ、ＭＡＬ－ＤＯＸ、ＤＶＡＰ、ＤＶＡＰ－ＤＯＸを（高、中及び低用量で）それぞれマウスに尾静脈内投与した。ＤＯＸの総用量は、低用量の２．５ｍｇ／Ｋｇ及び中用量の５ｍｇ／ｋｇを除いて１０ｍｇ／Ｋｇであった。ＤＶＡＰの用量は、高用量のＤＶＡＰ－ＤＯＸに含まれるＤＶＡＰの量であった。マウスの生存期間を記録した（図２４）。
ヌードマウスに麻酔し、定位固定装置で固定した後、ヌードマウスにおいて対数増殖期のＵ８７細胞（各マウスについてＰＢＳ緩衝液５μＬ中に分散した５×１０５細胞）を右線条体内（前腸骨稜の前０．６ｍｍ、横方向１．８ｍｍ、及び深さ３ｍｍ）に移植することにより頭蓋内Ｕ８７腫瘍担持モデルを確立した。裸のマウスの状態を定期的に観察した。移植１０、１３、１６、１９及び２２日後にＰＢＳ、ＤＯＸ、ＭＡＬ－ＤＯＸ、ＤＶＡＰ、ＤＶＡＰ－ＤＯＸを（高、中及び低用量で）それぞれマウスに尾静脈内投与した。ＤＯＸの総用量は、低用量の２．５ｍｇ／Ｋｇ及び中用量の５ｍｇ／ｋｇを除いて１０ｍｇ／Ｋｇであった。ＤＶＡＰの用量は、高用量のＤＶＡＰ－ＤＯＸに含まれるＤＶＡＰの量であった。マウスの生存期間を記録した（図２４）。
【0086】
３．ＤＶＡＰ－ＤＯＸの薬物動態試験
２００μＬのＤＯＸ、ＤＶＡＰ－ＤＯＸ及びＭＡＬ－ＤＯＸ（１０ｍｇ／ｋｇのＤＯＸを含む）をＩＣＲマウスに尾静脈を介してそれぞれ注射した。１、５、１５、３０及び４５分、１、２、４及び６時間の時点で血液試料５０μＬを採取し、ＰＢＳで４倍に希釈した。これを蛍光物質Ex 485/Em 590により測定し、薬物濃度－時間曲線及び主組織における分布量をプロットした（図２５）。
２００μＬのＤＯＸ、ＤＶＡＰ－ＤＯＸ及びＭＡＬ－ＤＯＸ（１０ｍｇ／ｋｇのＤＯＸを含む）をＩＣＲマウスに尾静脈を介してそれぞれ注射した。１、５、１５、３０及び４５分、１、２、４及び６時間の時点で血液試料５０μＬを採取し、ＰＢＳで４倍に希釈した。これを蛍光物質Ex 485/Em 590により測定し、薬物濃度－時間曲線及び主組織における分布量をプロットした（図２５）。
【実施例8】
【0087】
ミセルのインビトロ腫瘍凝集塊標的化能の評価
１．クマリン６負荷ミセルの調製
１ｍｇのＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、９ｍｇのｍＰＥＧ－ＰＬＡ及び５μｇのクマリン６（Ｃ６）をアセトニトリル２ｍＬ中に溶解し、減圧下（約０．０８５ＭＰａ）、３７℃、水浴中で蒸発させて薄膜を形成した。これを生理食塩水２ｍＬで水和させ、ＣＬ－４Ｂカラムクロマトグラフィーにより遊離のクマリンを除去してクマリン６負荷ミセル（ＶＡＰ－ミセル／Ｃ６）を得た。
１．クマリン６負荷ミセルの調製
１ｍｇのＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡ、９ｍｇのｍＰＥＧ－ＰＬＡ及び５μｇのクマリン６（Ｃ６）をアセトニトリル２ｍＬ中に溶解し、減圧下（約０．０８５ＭＰａ）、３７℃、水浴中で蒸発させて薄膜を形成した。これを生理食塩水２ｍＬで水和させ、ＣＬ－４Ｂカラムクロマトグラフィーにより遊離のクマリンを除去してクマリン６負荷ミセル（ＶＡＰ－ミセル／Ｃ６）を得た。
【0088】
２．ＶＡＰ－ミセル／Ｃ６ミセルアッセイにおけるインビトロＵ８７腫瘍凝集塊標的化
２％の低分子量アガロース溶液を１ウェル当り１５０μＬで４８ウェルプレートに熱いうちに加え、Ｕ８７細胞を１ウェル当り２×１０３／４００μＬの密度で４８ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で７日間インキュベートした後に腫瘍凝集塊を形成した。次いで、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５ｎｇ／ｍＬの濃度のミセル／Ｃ６、ＤＶＡＰミセル／Ｃ６、ＳＶＡＰミセル／Ｃ６及びＬＶＡＰミセル／Ｃ６と培養液を交換した。３７℃で４時間インキュベートした後、上清を吸引して腫瘍凝集塊をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、共焦点顕微鏡を使用して造影した。写真を図２０Ｂに示す。
２％の低分子量アガロース溶液を１ウェル当り１５０μＬで４８ウェルプレートに熱いうちに加え、Ｕ８７細胞を１ウェル当り２×１０３／４００μＬの密度で４８ウェルプレートに播種した。二酸化炭素インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で７日間インキュベートした後に腫瘍凝集塊を形成した。次いで、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液で調製した、５ｎｇ／ｍＬの濃度のミセル／Ｃ６、ＤＶＡＰミセル／Ｃ６、ＳＶＡＰミセル／Ｃ６及びＬＶＡＰミセル／Ｃ６と培養液を交換した。３７℃で４時間インキュベートした後、上清を吸引して腫瘍凝集塊をＰＢＳで３回洗浄し、パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで、共焦点顕微鏡を使用して造影した。写真を図２０Ｂに示す。
【実施例9】
【0089】
ＶＡＰミセルのインビボ標的化の検証
１．DiR負荷ミセルの調製
ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを１ｍｇ、ｍＰＥＧ－ＰＬＡを９ｍｇ及びDiRを１ｍｇ秤量し、クマリン６負荷ミセルの方法に従ってDiR負荷ミセル（ＶＡＰ－ミセル／DiR）を調製した。
１．DiR負荷ミセルの調製
ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを１ｍｇ、ｍＰＥＧ－ＰＬＡを９ｍｇ及びDiRを１ｍｇ秤量し、クマリン６負荷ミセルの方法に従ってDiR負荷ミセル（ＶＡＰ－ミセル／DiR）を調製した。
【0090】
２．ＶＡＰ－ミセル／DiRのインビボ標的化の検証
１００μＬのＰＢＳ、ｍＰＥＧ－ミセル／DiR、ＤＶＡＰ－ミセル／DiR、ＳＶＡＰ－ミセル／DiR及びＬＶＡＰ－ミセル／DiRをそれぞれＵ８７皮下腫瘍担持モデルヌードマウスに尾静脈を介して注射した。２、４、８、１２及び２４時間の時点でヌードマウスに麻酔し、ヌードマウスにおけるDiR蛍光の分布をＩＶＩＳイメージングシステムにより記録して蛍光強度を半定量的に算出した（図２６に示す）。
１００μＬのＰＢＳ、ｍＰＥＧ－ミセル／DiR、ＤＶＡＰ－ミセル／DiR、ＳＶＡＰ－ミセル／DiR及びＬＶＡＰ－ミセル／DiRをそれぞれＵ８７皮下腫瘍担持モデルヌードマウスに尾静脈を介して注射した。２、４、８、１２及び２４時間の時点でヌードマウスに麻酔し、ヌードマウスにおけるDiR蛍光の分布をＩＶＩＳイメージングシステムにより記録して蛍光強度を半定量的に算出した（図２６に示す）。
【実施例10】
【0091】
パクリタキセル負荷ＶＡＰミセルの抗神経膠腫効果のインビトロ評価
１．パクリタキセル負荷ミセルの調製及び特性評価
ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを１ｍｇ、ｍＰＥＧ－ＰＬＡを９ｍｇ及びパクリタキセルを２ｍｇ秤量し、パクリタキセル負荷ＶＡＰミセル（ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ）をクマリン６負荷ミセルの方法に従って調製した。粒子サイズ及び分布を図２７に示す。
１．パクリタキセル負荷ミセルの調製及び特性評価
ＶＡＰ－ＰＥＧ－ＰＬＡを１ｍｇ、ｍＰＥＧ－ＰＬＡを９ｍｇ及びパクリタキセルを２ｍｇ秤量し、パクリタキセル負荷ＶＡＰミセル（ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ）をクマリン６負荷ミセルの方法に従って調製した。粒子サイズ及び分布を図２７に示す。
【0092】
２．抗神経膠腫効果のインビトロ評価
Ｕ８７細胞を９６ウェルプレートに４．０×１０３細胞／ウェルで播種した。２４時間後、２００μＬの一連の濃度のＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ並びにタキソールと培養液を交換した。７２時間後、ＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。培養液を廃棄し、ＤＭＳＯを１５０μＬ加え、紫色の粒子が溶解するまで溶液を振盪した。マイクロプレートリーダーにより５９０ｎｍで吸光度値を測定し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を判定し、細胞生存率及び半致死量を算出した（図２８に示す）。
Ｕ８７細胞を９６ウェルプレートに４．０×１０３細胞／ウェルで播種した。２４時間後、２００μＬの一連の濃度のＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸ並びにタキソールと培養液を交換した。７２時間後、ＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。培養液を廃棄し、ＤＭＳＯを１５０μＬ加え、紫色の粒子が溶解するまで溶液を振盪した。マイクロプレートリーダーにより５９０ｎｍで吸光度値を測定し、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を判定し、細胞生存率及び半致死量を算出した（図２８に示す）。
【0093】
３．ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの血管新生に対する阻害アッセイ
Matrigel基質５０μＬを２４ウェル培養プレートの各ウェル内に加え、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートして凝固させた。ＨＵＶＥＣ細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、１μＭのパクリタキセルＶＡＰミセル又は遊離のパクリタキセル薬液を含むＤＭＥＭ培地と混合して単一細胞懸濁液を調製し、１ウェル当り１×１０５細胞をプレコートした２４ウェル培養プレート上に３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で培養した。１２時間後、管形成を観察した（図２９に示す）。
Matrigel基質５０μＬを２４ウェル培養プレートの各ウェル内に加え、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートして凝固させた。ＨＵＶＥＣ細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、１μＭのパクリタキセルＶＡＰミセル又は遊離のパクリタキセル薬液を含むＤＭＥＭ培地と混合して単一細胞懸濁液を調製し、１ウェル当り１×１０５細胞をプレコートした２４ウェル培養プレート上に３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で培養した。１２時間後、管形成を観察した（図２９に示す）。
【0094】
４．ＶＡＰミセル／ＰＴＸによる血管擬態の阻害アッセイ
Matrigel基質５０μＬを２４ウェル培養プレートの各ウェル内に加え、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートして凝固させた。Ｕ８７細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、１μＭのパクリタキセルＶＡＰミセル又は遊離のパクリタキセル薬液を含むＤＭＥＭ培地と混合して単一細胞懸濁液を調製し、１ウェル当り１×１０５細胞をプレコートした２４ウェル培養プレート上に３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で培養した。１２時間後、管形成を観察した（図３０に示す）。
Matrigel基質５０μＬを２４ウェル培養プレートの各ウェル内に加え、３７℃のインキュベーター内で３０分間インキュベートして凝固させた。Ｕ８７細胞を０．２５％のトリプシンで消化し、１μＭのパクリタキセルＶＡＰミセル又は遊離のパクリタキセル薬液を含むＤＭＥＭ培地と混合して単一細胞懸濁液を調製し、１ウェル当り１×１０５細胞をプレコートした２４ウェル培養プレート上に３７℃、５％ＣＯ２及び飽和湿度で培養した。１２時間後、管形成を観察した（図３０に示す）。
【実施例11】
【0095】
ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸのインビボ抗神経膠腫効果アッセイ
１．インビボ抗神経膠腫効果アッセイ
Ｕ８７皮下腫瘍動物モデルを構築し、腫瘍サイズが１００ｍｍ３になると、集団で試験した。１００μｌの生理食塩水、タキソール、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸを皮下腫瘍担持モデルマウスに３日おきに５回注射し、各投与間の間隔は２日とした。パクリタキセル総用量は２５ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の長径（ａ）及び短径（ｂ）をノギスにより１日おきに測定し、ヌードマウスの腫瘍容積を式により算出して腫瘍容積の経時変化曲線をプロットし、各群の統計的有意差を算出した。式：
V腫瘍容積 = 0.5 (a × b2)
によりヌードマウスの各群の腫瘍容積を算出した。
１．インビボ抗神経膠腫効果アッセイ
Ｕ８７皮下腫瘍動物モデルを構築し、腫瘍サイズが１００ｍｍ３になると、集団で試験した。１００μｌの生理食塩水、タキソール、ＬＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＤＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ、ＳＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸ及びｍＰＥＧ－ミセル／ＰＴＸを皮下腫瘍担持モデルマウスに３日おきに５回注射し、各投与間の間隔は２日とした。パクリタキセル総用量は２５ｍｇ／ｋｇであった。腫瘍の長径（ａ）及び短径（ｂ）をノギスにより１日おきに測定し、ヌードマウスの腫瘍容積を式により算出して腫瘍容積の経時変化曲線をプロットし、各群の統計的有意差を算出した。式：
V腫瘍容積 = 0.5 (a × b2)
によりヌードマウスの各群の腫瘍容積を算出した。
【0096】
投与１８日後（播種２４日後）、すべてのヌードマウスを犠死させ、採取した皮下腫瘍を秤量し、各群の統計的有意差を算出した（図３１に示す）。
【0097】
２．ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸのプロアポトーシスアッセイ
投与完了後１４日目に、腫瘍担持ヌードマウスの腫瘍を採取し、固定して凍結切片とし、腫瘍アポトーシスをＴＵＮＥＬにより検定した。細胞アポトーシスを検出するために行った、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによるｄＵＴＰ切断末端標識法（ＴＵＮＥＬ）の手順を次に記載する。パラフィン切片を従来法により脱脂し、ＰＢＳで３回、毎回３分すすぎ、０．３％のＨ２Ｏ２溶液を用いて室温で２０分間処理し、２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫにより３７℃で２０分間消化し、ＰＢＳで３回、毎回３分すすぎ、各切片に３０μＬのＴＵＮＥＬ溶液（ＴＤＴ及びビオチン－ｄＮＴＰ）を加え、３７℃で６０分間置いた。陽性結果では、核が黄褐色又は褐色であり、核中の陽性の褐色粒子は、アポトーシス細胞であるとみなした。５つの拡大領域内のアポトーシス陽性細胞の数を光学顕微鏡下で連続的に計数した。領域内の陽性細胞の割合は、アポトーシス指数であり、結果を図３２に示す。
投与完了後１４日目に、腫瘍担持ヌードマウスの腫瘍を採取し、固定して凍結切片とし、腫瘍アポトーシスをＴＵＮＥＬにより検定した。細胞アポトーシスを検出するために行った、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによるｄＵＴＰ切断末端標識法（ＴＵＮＥＬ）の手順を次に記載する。パラフィン切片を従来法により脱脂し、ＰＢＳで３回、毎回３分すすぎ、０．３％のＨ２Ｏ２溶液を用いて室温で２０分間処理し、２０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫにより３７℃で２０分間消化し、ＰＢＳで３回、毎回３分すすぎ、各切片に３０μＬのＴＵＮＥＬ溶液（ＴＤＴ及びビオチン－ｄＮＴＰ）を加え、３７℃で６０分間置いた。陽性結果では、核が黄褐色又は褐色であり、核中の陽性の褐色粒子は、アポトーシス細胞であるとみなした。５つの拡大領域内のアポトーシス陽性細胞の数を光学顕微鏡下で連続的に計数した。領域内の陽性細胞の割合は、アポトーシス指数であり、結果を図３２に示す。
【0098】
３．ＶＡＰ－ミセル／ＰＴＸの血管新生アッセイにおける阻害
投与完了後１４日目に、腫瘍担持ヌードマウスの腫瘍を採取、固定し、パラフィンに包埋して薄片を作製した。ＣＤ３１免疫組織染色／過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）二重染色を実施した。５つの拡大領域内のＣＤ３１陽性血管の数を光学顕微鏡下で連続的に計数した。結果を図３３に示す。
投与完了後１４日目に、腫瘍担持ヌードマウスの腫瘍を採取、固定し、パラフィンに包埋して薄片を作製した。ＣＤ３１免疫組織染色／過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）二重染色を実施した。５つの拡大領域内のＣＤ３１陽性血管の数を光学顕微鏡下で連続的に計数した。結果を図３３に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
