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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-07
(45)【発行日】2022-03-15
(54)【発明の名称】免疫誘導剤
(51)【国際特許分類】
A61K 38/17 20060101AFI20220308BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220308BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220308BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20220308BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20220308BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220308BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20220308BHJP
A61K 38/20 20060101ALI20220308BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20220308BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20220308BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220308BHJP
【ＦＩ】
A61K38/17 ZNA
A61K48/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P37/04
A61K45/00
A61K31/7088
A61K38/20
A61K38/21
C12N5/0783
C07K14/705
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2017539040
(86)(22)【出願日】2017-03-27
(86)【国際出願番号】 JP2017012334
(87)【国際公開番号】W WO2017170365
(87)【国際公開日】2017-10-05
【審査請求日】2020-03-17
(31)【優先権主張番号】P 2016064034
(32)【優先日】2016-03-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】藤田 貴之
(72)【発明者】
【氏名】岡野 文義
【審査官】佐々木 大輔
(56)【参考文献】
【文献】特表２００５－５２８０８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００３－５１３６１０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１１／１４４７１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特開２０１２－１１０３２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５２２２７６（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３８／００－３８／５８
Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｋ ４８／００
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能である組換えベクター、を有効成分として含有する、ＭＣＥＭＰ１を発現する癌の治療及び／又は予防のための免疫誘導剤。（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列の全長アミノ酸から成るポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＭＣＥＭＰ１を発現する癌に対する免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＭＣＥＭＰ１を発現する癌に対する免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｄ）前記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、かつＭＣＥＭＰ１を発現する癌に対する免疫誘導活性を有するポリペプチド
【請求項2】
前記癌が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌である、請求項１に記載の免疫誘導剤。
【請求項3】
免疫増強剤をさらに含む、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
【請求項4】
前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、請求項３記載の免疫誘導剤。
【請求項5】
請求項１に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
【請求項6】
前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
請求項５又は６に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。
【背景技術】
【0002】
癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原、癌抗原をコードする遺伝子などが同定されており、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。
【0003】
Ｍａｓｔ Ｃｅｌｌ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＭＣＥＭＰ１）は２型の膜貫通タンパク質であり、肥満細胞特異的に細胞膜に発現していることが報告されており、肥満細胞の分化、免疫反応、アレルギー反応に関与する可能性が示唆されている（非特許文献１）。しかし、ＭＣＥＭＰ１タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】Ｋａｎｇ Ｌｉ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，８６：６８－７５（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤への使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと白血病患犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するイヌＭａｓｔ Ｃｅｌｌ－Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １（以下、ＭＣＥＭＰ１と記載する）のポリペプチドを作製した。また、取得したイヌ遺伝子のヒト、ネコ及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号２、６、８で示されるアミノ酸配列を有するヒト、ネコ及びマウスＭＣＥＭＰ１ポリペプチドを作製した。そしてこれらＭＣＥＭＰ１ポリペプチドが白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫、及び肛門周囲腺癌に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＭＣＥＭＰ１を生体に投与することによって、生体内にＭＣＥＭＰ１に対する免疫細胞を誘導することができること、及びＭＣＥＭＰ１を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＭＣＥＭＰ１のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＭＣＥＭＰ１を発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。
【0007】
さらにまた、ＭＣＥＭＰ１のポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（「免疫誘導活性」とも称する。）を有すること、このため、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ポリペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。
【0008】
従って、本発明は、以下の（１）～（１１）の特徴を包含する。
（１）以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能である組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（２）抗原提示細胞の処理剤である、上記（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）癌の治療及び／又は予防剤の有効成分である、上記（１）に記載の免疫誘導剤。
（４）上記癌がＭＣＥＭＰ１を発現する癌である、上記（３）に記載の免疫誘導剤。
（５）上記癌が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌である、上記（３）又は（４）に記載の免疫誘導剤。
（６）免疫増強剤をさらに含む、上記（１）～（５）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（７）上記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、及びＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、上記（６）に記載の免疫誘導剤。
（８）（１）に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
（９）上記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記（８）又は（９）に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記（１）に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
（１１）以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能である組換えベクター、を被験体に投与することを含む、免疫誘導方法。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを被験体に投与すると、生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。
（１）以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかのポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能である組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（２）抗原提示細胞の処理剤である、上記（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）癌の治療及び／又は予防剤の有効成分である、上記（１）に記載の免疫誘導剤。
（４）上記癌がＭＣＥＭＰ１を発現する癌である、上記（３）に記載の免疫誘導剤。
（５）上記癌が白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌である、上記（３）又は（４）に記載の免疫誘導剤。
（６）免疫増強剤をさらに含む、上記（１）～（５）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（７）上記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、及びＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、上記（６）に記載の免疫誘導剤。
（８）（１）に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
（９）上記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、上記（８）に記載の方法。
（１０）上記（８）又は（９）に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記（１）に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
（１１）以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドから選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能である組換えベクター、を被験体に投与することを含む、免疫誘導方法。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチドを被験体に投与すると、生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチドは癌の治療や予防に有用である。
【0009】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号２０１６－０６４０３４号の開示内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】同定したＭＣＥＭＰ１遺伝子の、イヌの腫瘍組織での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＭＣＥＭＰ１遺伝子の、図示したイヌの各腫瘍組織での発現パターンを示す。
【図2】同定したＭＣＥＭＰ１遺伝子の、ヒトの各組織及び癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号２；ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の、図示したヒトの各正常組織での発現パターンを示す。参照番号３；ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子の、図示したヒトの各癌細胞株での発現パターンを示す。図中、ＰＢＭＣは末梢血単核球を指す。
【図3】同定したＭＣＥＭＰ１遺伝子の、マウスの各癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号４；マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子の、図示したマウスの各癌細胞株での発現パターンを示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明をさらに詳細に説明する。
１．ポリペプチド
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドが挙げられる。なお、本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含される。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなり、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド。
１．ポリペプチド
本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれるポリペプチドとしては、以下の（ａ）～（ｄ）のポリペプチドが挙げられる。なお、本明細書において、「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含される。
（ａ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上から全長以下のアミノ酸からなり、免疫誘導活性を有するポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド。
（ｃ）配列表の配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、かつ免疫誘導活性を有するポリペプチド。
【0012】
なお、本発明において、「アミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸残基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号８に示されるＭｅｔ，Ｈｉｓ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ａｌａ・・(中略)・・Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒのアミノ酸配列を持つ、１８３アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号８のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。この場合、「有する」という用語は、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
【0013】
ここで、「免疫誘導活性」とは、生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
【0014】
上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ等を用いて確認することができる。具体的には、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドを投与した生体から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
【0015】
また、後述の実施例に記載されるように、上記（ａ）～（ｄ）の組換えポリペプチドを担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることもできる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌生体に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。また、該ポリペプチドを担癌生体に投与して誘導された細胞障害性Ｔ細胞が、腫瘍に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによってポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。生体内におけるＴ細胞の細胞障害活性の測定は、例えばＴ細胞を生体内から除去する抗体を投与することで腫瘍が増大等されるか否かを調べることよって確認することができるがこれに限定されない。
【0016】
あるいは、該ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、該ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばＩｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：ｐ３１７，１９９４に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
【0017】
本発明が開示する配列表の配列番号２、４、６、又は８にそれぞれ示されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に特異的に存在する抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト、ネコ、及びマウス相同因子として単離された、ＭＣＥＭＰ１のアミノ酸配列である（実施例１参照）。イヌＭＣＥＭＰ１のヒト相同因子であるヒトＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列７０％、アミノ酸配列５１％であり、ネコ相同因子であるネコＭＣＥＭＰ１では配列同一性は塩基配列８３％、アミノ酸配列６４％であり、マウス相同因子であるマウスＭＣＥＭＰ１では配列同一性は塩基配列６５％、アミノ酸配列４７％である。
【0018】
上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸から成るポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号２、４、６、又は８のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基（７個）以上から全アミノ酸残基（全長）以下のアミノ酸からなるポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【0019】
また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に殺していくということが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７～３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記（ａ）のポリペプチドとしては、配列番号２、４、６、又は８に示されるアミノ酸配列中の連続する７～３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８～３０もしくは９～３０程度のアミノ酸から成るものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
【0020】
また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号２、４、６、又は８の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは配列番号２、４、６、又は８の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
【0021】
上記(ｃ)のポリペプチドは、上記(a)のポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであって、元の配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され又は挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記(ｃ)のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記(ｂ)のポリペプチドは、配列番号２、４、６、又は８で示されるアミノ酸配列のうち、１個～数個のアミノ酸残基が置換し、欠失し及び／又は挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２～１０の整数、好ましくは２～６の整数、さらに好ましくは２～４の整数を表す。
【0022】
ここで、アミノ酸配列又は塩基配列の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のアルゴリズムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
【0023】
なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ,Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、本発明の上記(a)のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループの間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。
【0024】
上記(ｄ)のポリペプチドは、上記(ａ)～(ｃ)のいずれかのポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、(a)又は(b)のポリペプチドの一端又は両端に他のアミノ酸又はポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
【0025】
上記のポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（t－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
【0026】
上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号３に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することで同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表の配列番号１、３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてヒトやイヌなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記のプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラークロニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記(a)のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記の(ｂ)～(ｄ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
【0027】
上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0028】
宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
【0029】
宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３.１、ｐＳｅｃＴａｇ（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、上記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
【0030】
発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
【0031】
宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0032】
以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）やＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記の(ｄ)のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
【0033】
２．免疫誘導剤
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。また、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
後述の実施例に具体的に記載される通り、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌生体に投与すると、腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防剤として用いることができる。また、上記の免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
【0034】
ここで、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
【0035】
この場合、対象となる癌としては、ＭＣＥＭＰ１を発現する癌であれば特に限定されないが、好ましくは正常細胞よりも有意に多くＭＣＥＭＰ１を発現している癌であり、具体的には白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫又は肛門周囲腺癌であり、これらの特定の癌には、例えば、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、無白血病性白血病、白血球血症性白血病（ｌｅｕｋｏｃｙｔｈｅｍｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胎生細胞性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、リーダー細胞性白血病、シリング白血病、幹細胞性白血病、亜白血性白血病、未分化細胞性白血病、有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、血球芽細胞性白血病（ｈｅｍｏｃｙｔｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病、単球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、不応性貧血（ＲＡ）、鉄芽球を伴う不応性貧血（ＲＡＲＳ）、芽球増加を伴う不応性貧血（ＲＡＥＢ）、移行期ＲＡＥＢ（ＲＡＥＢ－Ｔ）、前白血病及び慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、骨内通常型骨肉腫と亜系骨肉腫（骨内高分化型骨肉腫、円形細胞骨肉腫、表在骨肉腫、傍骨骨肉腫、骨膜骨肉腫又は表在高悪性骨肉腫）、胸腺腫、肥満細胞腫、肛門周囲腺腫、肛門周囲腺癌が包含されるが、これらに限定されない。
【0036】
また、対象となる被験体（動物）は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、、動物園等で飼育されている動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。
【0037】
本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１～１０００μｇ、好ましくは０．００１～１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
【0038】
本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、薬理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
【0039】
本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
【0040】
上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分である上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ ５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ－２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６/３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８及びＱＳ－Ｌ１（ソ（So）、外１０名、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８－１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）、外７名、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６－５４９）を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０～１０：１、好ましくは約１：５～５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著,「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
【0041】
また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
【0042】
３．抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞
本発明はさらに、上記のポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法を提供する。
本発明はさらに、上記のポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法を提供する。
【0043】
本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞を提供する。
【0044】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記(a)～(ｄ)のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理剤として利用し得る。本明細書中、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ０２０４、ＨＬＡ－Ａ０２０５、ＨＬＡ－Ａ０２０６、ＨＬＡ－Ａ０２０７、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ３１、ＨＬＡ－Ａ６８０１、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ８、ＨＬＡ－Ｂ２７０５、ＨＬＡ－Ｂ３７、ＨＬＡ－Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ－Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。
【0045】
ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）とＩＬ－３（あるいはＩＬ－４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
【0046】
この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０～１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０～５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日～２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
【0047】
上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１～１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３～１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５ｘ１０４～５ｘ１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
【0048】
上記ポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、ペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又はｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
【0049】
本発明はさらに、上記の抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記のポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法を提供する。
【0050】
本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞を提供する。
【0051】
上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とｅｘ ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で１：１～１：１００程度、好ましくは１：５～１：２０程度である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、１００～１０００万細胞／ｍｌ程度、好ましくは１００００～１００万細胞／ｍｌ程度である。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培養時間は、特に限定されないが、通常、２日～３週間、好ましくは４日～２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７及びＩＬ－１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ－２及びＩＬ－７の濃度は、通常５～２０Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ－６の濃度は通常５００～２０００Ｕ／ｍｌ程度、ＩＬ－１２の濃度は通常５～２０ｎｇ／ｍｌ程度であるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
【0052】
上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体に選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
【0053】
後述の実施例に記載される通り、ＭＣＥＭＰ１遺伝子は、白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫、胸腺腫、肥満細胞腫もしくは肛門周囲腺癌に特異的に発現している。従って、これらの癌種においては、ＭＣＥＭＰ１が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。したがって、癌細胞内に存在するＭＣＥＭＰ１のポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示されるよう、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、ＭＣＥＭＰ１のポリペプチドの一部を提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防剤として有用である。
【0054】
上記の単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記（ａ）～(ｄ)のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
【0055】
抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個～１０兆個、好ましくは１００万個～１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
【0056】
４．ＤＮＡワクチン
上記（ａ）～(ｄ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記（ａ）～(ｄ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、ＤＮＡワクチンとも呼ばれる。
上記（ａ）～(ｄ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、ポリペプチドを投与するのと同等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記（ａ）～(ｄ)のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、ＤＮＡワクチンとも呼ばれる。
【0057】
ＤＮＡワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、ＤＮＡワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
【0058】
ＤＮＡワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、ＤＮＡワクチンの重量で０．１μｇ～１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ～１０ｍｇ程度である。
【0059】
ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連（「アデノ随伴」とも称する。）ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
【0060】
その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
【0061】
本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ方法があるが（日経サイエンス，１９９４年４月，ｐ２０－４５、月刊薬事，１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３－４８、実験医学増刊，１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）、ｉｎ ｖｉｖｏ方法がより好ましい。
【0062】
ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することが出来る。ｉｎ ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、慣用の担体を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
【0063】
なお、本明細書において、例えば「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、例えば「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
【実施例】
【0064】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。
[実施例１] ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
犬の精巣から酸－グアニジウム－フェノール－クロロフォルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。
[実施例１] ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
犬の精巣から酸－グアニジウム－フェノール－クロロフォルム法（Ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造株式会社製）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ ＲＮＡを精製した。
【0065】
この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ，Ｚａｐ－ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ，ＺＡＰ－ｃＤＮＡ ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
【0066】
（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに約２５００クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ:ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに約２５００クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｃ Ｅｘｔｒａ:ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｃｅ社製）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
【0067】
上記患犬血清としては、白血病の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－ＢＬｕｅ ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３ ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
【0068】
かかる処理血清とタンパク質をブロットした上記メンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ ａｎｔｉ Ｄｏｇ ＩｇＧ－ｈ＋Ｌ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ:ＢＥＴＨＹＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を、室温1時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％ ゼラチン ｐＨ７．５）５００μlに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する約１００００個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。
【0069】
（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ （ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μlと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μlをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ(キアゲン社製）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
【0070】
精製したプラスミドは、配列番号９に記載のＴ３プライマーと配列番号１０に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号３に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＭＣＥＭＰ１遺伝子であることが判明した。イヌＭＣＥＭＰ１のヒト相同因子であるヒトＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列７０％、アミノ酸配列５１％であり、ネコＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列８３％、アミノ酸配列６４％であり、マウス相同因子であるマウスＭＣＥＭＰ１では、配列同一性が塩基配列６５％、アミノ酸配列４７％であった。ヒトＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に、ネコＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号５、アミノ酸配列を配列番号６にマウスＭＣＥＭＰ１の塩基配列を配列番号７、アミノ酸配列を配列番号８に示す。
【0071】
（４）各組織での遺伝子発現解析
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種正常組織、各種腫瘍組織及び各種癌細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行った。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＱＵＩＣＫ－Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ－Ｉｎｓｅｒｔ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテク社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１１及び１２、ヒトプライマーは配列番号１３及び１４、マウスプライマーは配列番号１５及び１６に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃－３０秒、５５℃－３０秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返して行った。その結果、図１に示すように、イヌＭＣＥＭＰ１遺伝子は、イヌ腫瘍組織では肥満細胞腫、肛門周囲腺癌で強い発現が見られた（図１）。ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子発現においては、健常なヒト組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方ヒト癌細胞では白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫の細胞株で強い発現が見られた（図２）。さらに、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現は、白血病、胸腺腫の細胞株で発現が検出された（図３）。
上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種正常組織、各種腫瘍組織及び各種癌細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行った。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ－ＰＣＲ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＱＵＩＣＫ－Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（クロンテック社製）及びＬａｒｇｅ－Ｉｎｓｅｒｔ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテク社製）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１１及び１２、ヒトプライマーは配列番号１３及び１４、マウスプライマーは配列番号１５及び１６に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ(ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９４℃－３０秒、５５℃－３０秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返して行った。その結果、図１に示すように、イヌＭＣＥＭＰ１遺伝子は、イヌ腫瘍組織では肥満細胞腫、肛門周囲腺癌で強い発現が見られた（図１）。ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子発現においては、健常なヒト組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方ヒト癌細胞では白血病、骨髄異形成症候群、骨肉腫の細胞株で強い発現が見られた（図２）。さらに、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現は、白血病、胸腺腫の細胞株で発現が検出された（図３）。
【0072】
[実施例２] ＭＣＥＭＰ１の生体内での癌抗原性の解析
（１）生体内でマウスＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターの作製
配列番号７の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でマウスＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１７及び１８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号８のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
（１）生体内でマウスＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターの作製
配列番号７の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でマウスＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１７及び１８に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号８のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【0073】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（以下、マウスＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１）。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でマウスＭＣＥＭＰ１タンパクが産生される。
【0074】
上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ ＣａＣｌ２ １００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後金-ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％ エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金－ＤＮＡ粒子に１００％ エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金－ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金－ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした（以下、マウスＭＣＥＭＰ１／チューブ）。
【0075】
（２）ＤＮＡワクチン法によるマウスＭＣＥＭＰ１の抗腫瘍効果－１
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１においてＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１においてＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＬ４細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
【0076】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びマウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群で、それぞれ、１１５３ｍｍ３、４８０ｍｍ３となり、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後５９日で全例死亡したのに対し、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
【0077】
（３）ＤＮＡワクチン法によるマウスＭＣＥＭＰ１の抗腫瘍効果－２
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１においてＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＧ７細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（マウスＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）実施例１においてＭＣＥＭＰ１遺伝子の発現の見られたマウス白血病細胞株ＥＧ７細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、マウスＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
【0078】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びマウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群で、それぞれ、９８２ｍｍ３、５２１ｍｍ３となり、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後６８日で全例死亡したのに対し、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、マウスＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
【0079】
（４）生体内でヒトＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターの作製
配列番号１の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でヒトＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１９及び２０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
配列番号１の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でヒトＭＣＥＭＰ１を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号１９及び２０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を５０μlとし、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号２のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて約５５０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
【0080】
精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した（以下、ヒトＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１）。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でヒトＭＣＥＭＰ１タンパクが産生される。
【0081】
上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）、１Ｍ ＣａＣｌ２ １００μｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後金-ＤＮＡ粒子と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％エタノール（ＷＡＫＯ社製）によって３回洗浄した。金－ＤＮＡ粒子に１００％エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金－ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）に流し込み、壁面に沈殿させた。金－ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした（以下、ヒトＭＣＥＭＰ１／チューブ）。
【0082】
（５）全長ヒトＭＣＥＭＰ１定常発現細胞の樹立
上記で作製したヒトＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１をマウス神経芽細胞腫細胞株Ｎ２ａ細胞（ＡＴＣＣ社）へリポフェクション法により導入し、５００μｇ/ｍｌのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＭＣＥＭＰ１を定常的に発現するＮ２ａ細胞株を樹立した（Ｎ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１）。また、ヒトＭＣＥＭＰ１をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、Ｎ２ａ－ｅｍｐ）。
上記で作製したヒトＭＣＥＭＰ１／ｐｃＤＮＡ３．１をマウス神経芽細胞腫細胞株Ｎ２ａ細胞（ＡＴＣＣ社）へリポフェクション法により導入し、５００μｇ/ｍｌのＧ４１８（ナカライ社）による選抜により、全長ヒトＭＣＥＭＰ１を定常的に発現するＮ２ａ細胞株を樹立した（Ｎ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１）。また、ヒトＭＣＥＭＰ１をコードするｃＤＮＡが挿入されていない発現ベクター（以下、ｅｍｐ/ｐｃＤＮＡ３．１）を上記と同様に導入して選抜した細胞をコントロール細胞とした（以下、Ｎ２ａ－ｅｍｐ）。
【0083】
（６）ＤＮＡワクチン法によるヒトＭＣＥＭＰ１の抗腫瘍効果
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（ヒトＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）上記で作製したＮ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１を、またコントロール細胞としてＮ２ａ－ｅｍｐをそれぞれ移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
５匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブ（ヒトＭＣＥＭＰ１／チューブ）を遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）上記で作製したＮ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１を、またコントロール細胞としてＮ２ａ－ｅｍｐをそれぞれ移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ヒトＭＣＥＭＰ１遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを予防モデルで５匹投与した。
【0084】
抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、Ｎ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１の予防モデルにおいて、２８日後には、コントロール群及びヒトＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群で、それぞれ、１３７９ｍｍ３、５１３ｍｍ３となり、ヒトＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後６１日で全例死亡したのに対し、ヒトＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、Ｎ２ａ－ヒトＭＣＥＭＰ１の予防モデルにおいて、ヒトＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。一方、Ｎ２ａ－ｅｍｐの予防モデルにおいては、ヒトＭＣＥＭＰ１プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【0085】
本発明は、各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療及び／又は予防に有用である。
【0086】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】