特許 7036510 ポリ（環状イミノエーテル）

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-07

(45)【発行日】2022-03-15

(54)【発明の名称】ポリ（環状イミノエーテル）

(51)【国際特許分類】

   C08G 73/02 20060101AFI20220308BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20220308BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220308BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220308BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20220308BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20220308BHJP

【ＦＩ】

C08G73/02

A61K31/7088

A61K48/00

A61K45/00

A61K38/02

A61K47/34

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2018566217

(86)(22)【出願日】2017-07-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-07-25

(86)【国際出願番号】 EP2017066489

(87)【国際公開番号】W WO2018002382

(87)【国際公開日】2018-01-04

【審査請求日】2020-06-10

(31)【優先権主張番号】16177411.2

(32)【優先日】2016-07-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513008731

【氏名又は名称】ユニヴェルシテイト ヘント

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＧＥＮＴ

【住所又は居所原語表記】Ｓｉｎｔ－Ｐｉｅｔｅｒｓｎｉｅｕｗｓｔｒａａｔ ２５， Ｂ－９０００ Ｇｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ホーヘンボーム， リシャルト

(72)【発明者】

【氏名】フェルブラーケン， バルト

【審査官】久保 道弘

(56)【参考文献】

【文献】特開平０２－１８２７２４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０８Ｇ ７３／００－７３／２６

Ａ６１Ｋ ３１／００－４８／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の式（Ｉ）：
Ｉｎｉ－［Ｏｘ］_ｍ－［Ｏｚ］_ｎ－Ｎｕｃ （Ｉ）
｛式中：
Ｉｎｉはカチオン性重合の開始剤の残基を表し、
Ｎｕｃは求核剤の残基を表し、
ＯｘはＮ（Ｒ^１）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^１は独立してＨ又はＣ（Ｏ）Ｒ^１１を表し；Ｒ^１１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
ＯｚはＮ（Ｒ^２）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^２は独立してＣ（Ｏ）Ｒ^２１又はＨを表し；Ｒ^２１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
各Ｒ^ａは独立してＨ、直鎖状又は分枝状Ｃ_１～３アルキルを表し；
ｍ≧５；
ｎ≧５；
ｍ＋ｎ≧２０；
３：９７≦ｍ：ｎ≦９７：３｝
によって表されるグラジエントコポリマーであって、
等しいサイズの３つの断片、Ｉｎｉ隣接断片（Ｉｎｉ断片）、Ｎｕｃ隣接断片（Ｎｕｃ断片）、及びＩｎｉ断片とＮｕｃ断片を分ける中心断片を含み、
前記コポリマーのＩｎｉ断片のモノマー比［Ｏｚ］／［Ｏｘ］が前記コポリマーのＮｕｃ断片の同じ比よりも少なくとも２倍高い又は低い、グラジエントコポリマー。

【請求項2】

Ｒ^ａがＨを表す、請求項１に記載のグラジエントコポリマー。

【請求項3】

１０≦ｍ≦２５０である、請求項１又は２に記載のグラジエントコポリマー。

【請求項4】

１０≦ｎ≦２５０である、請求項１～３のいずれか一項に記載のグラジエントコポリマー。

【請求項5】

各Ｒ^２１が独立して、任意選択で置換されたＣ_１～９アルキルを表す、請求項１～４のいずれか一項に記載のグラジエントコポリマー。

【請求項6】

各Ｒ^１１が独立して、任意選択で置換されたＣ_１～９アルキル又はシクロプロピルを表す、請求項１～５のいずれか一項に記載のグラジエントコポリマー。

【請求項7】

請求項１に記載のグラジエントコポリマーを調製する方法であって、前記方法が、２位が置換されていてもよい２－オキサゾリン及び２位が置換されていてもよい２－オキサジンを３：９７～９７：３の範囲のモル比で含むモノマー反応混合物のカチオン性開環重合を含み、前記２－オキサゾリンの２位の任意選択の置換基が、請求項１に規定されたＲ ^１１ であり、前記２－オキサジンの２位の任意選択の置換基が、請求項１に規定されたＲ ^２１ である、方法。

【請求項8】

カチオン性開環重合が、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、ハロゲン化アシル、オキサゾリニウム塩又はスルホン酸から選択されるカチオン性重合開始剤の存在下で行われる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

反応混合物中で形成されるグラジエントコポリマーがペンダントアシル残基の少なくとも５０％を除去することによって加水分解される、請求項７又は８に記載の方法。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか一項に記載のグラジエントコポリマー及び前記コポリマーに非共有結合される薬物を含むミセル薬物送達システム。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の技術分野］
本発明は、ポリ（環状イミノエーテル）に関する。より詳細には、本発明は、２－オキサゾリンモノマー及び２－オキサジンモノマーの統計コポリマーに関する。

【0002】

本発明のコポリマーは、医療分野、特にミセル型薬物送達システム及びポリプレックスなどのポリマー治療剤において用いられ得る有用な特性を示す。

【0003】

本発明はまた、任意選択で２－置換２－オキサゾリン及び任意選択で２－置換２－オキサジンを含むモノマー反応混合物のカチオン性開環重合による統計コポリマーを調製する方法も提供する。

【0004】

［発明の背景］
ポリマー治療剤は、合理的に設計された高分子薬物、ポリマー－薬物及びポリマー－タンパク質複合体、共有結合型又は非共有結合型薬物を含有するポリマーミセル、並びにＤＮＡ送達のためのポリプレックスを含む。

【0005】

ポリマーミセルは、様々な治療薬の送達に広く使用されている。両親媒性ブロックコポリマーからなるポリマーミセルは疎水性コアを形成し、脂溶性薬物が物理的に取り込まれ得る。親水性ブロック又はセグメントは、親水性の冠を生成し、疎水性コアをカプセル化する。この方法で、難溶性の薬物は、水性媒体中にうまく可溶化され得る。

【0006】

遺伝子治療は、遺伝性障害、がん疾患及びいくつかの網膜疾患など、現在は不治のいくつかの疾患を処置する有望な新しい手段である。遺伝子治療の基本概念は単純である：欠損遺伝子によってコードされたいくつかのタンパク質の産生の失敗を、新しい無傷の遺伝子を細胞の核に送達することにより克服する。ネイキッドＤＮＡ自体は細胞によって通常効率的に取り込まれないため、遺伝子送達には担体システム（ベクター）が必要とされる。送達方法としては、組換えウイルス及び合成材料、特にカチオン性ポリマーの使用が挙げられる。ウイルスは現在利用可能な最も効率的な送達ビヒクルであるが、ポリマーは、非常にフレキシブルな化学的性質、生体適合性の能力、簡単、及び安価な合成を含むいくつかの特性を示し、遺伝子送達ビヒクルの優れた候補になる。

【0007】

刺激応答性ポリマー（又はインテリジェントポリマー）は、非ウイルスベクターとして部位、タイミング及び期間特異的な遺伝子発現を得る大きな可能性を有する。刺激応答性ポリマーは、温度、ｐＨ、光、イオン強度、電場及び磁場などの環境条件の小さな変化に急な及び可逆的な応答を示し、「スマート」材料として公知の材料のクラスとして出現した。ｐＨ及び温度応答性ポリマーは、インテリジェントポリマーシステムの２つの最も一般的なメンバーである。ｐＨ応答特性を有するポリマーは通常、疎水性モノマー及びより親水性のイオン化コモノマーからなる。ｐＨ、したがって正味電荷の変化は、コポリマーの疎水性と親水性のバランスに依存する相変化を引き起こす。典型的な例は、メタクリル酸（ＭＡｃ）又はメタクリル酸ジメチルアミノエチル（ＤＭＡＥＭＡ）とのメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のコポリマーである。ＭＭＡは疎水性部分であるが、ＭＡｃは鎖の親水性部分である。ＭＡｃは、ＣＯＯＨ基が脱プロトン化される場合、高いｐＨで親水性であるが、－ＣＯＯＨ基がプロトン化される場合、より疎水性になる。ＤＭＡＥＭＡとのＭＭＡのコポリマーは、アミノ基がプロトン化される場合、低いｐＨで親水性であるが、アミノ基が脱プロトン化される場合より疎水性である。これらのコポリマーは低いｐＨで可溶性であるが、わずかにアルカリ条件下では沈殿する。

【0008】

様々な構造及び化学官能性のポリ（環状イミノエーテル）がリビング、したがってカチオン性開環重合（ＣＲＯＰ）によって制御される方法で調製され得る。２－オキサゾリンは、カチオン性開環重合メカニズム及び生じるポリマー特性が熱心に研究された５員環イミノエーテルである。しかしながら、６員環イミノエーテル（２－オキサジン）及び７員環イミノエーテル（２－オキサゼピン）もまたＣＲＯＰによって重合され得る。

【0009】

ポリオキサゾリンは、顔料分散剤のコーティングに渡る幅広い適用が見出されている。さらに、いくつかのポリオキサゾリンが水溶性又は両親媒性であり、比較的非毒性であるため、生体材料として興味深い。

【0010】

ポリオキサゾリンのホモポリマーだけでなく、ポリオキサゾリンのブロックコポリマー及び統計コポリマーも、当技術分野で公知である。

【0011】

Ｈｒｕｂｙら（Ｐｏｌｙｏｘａｚｏｌｉｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ Ｍｉｃｅｌｌｅｓ ａｓ Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ２０１０、１０（８）、９１６～９２４）は、ＡＢＡトリブロックコポリマー、ポリ［２－メチル－２－オキサゾリン－ブロック－（２－イソプロピル－２－オキサゾリン－ｃｏ－２－ブチル－２－オキサゾリン）－ブロック－２－メチル－２－オキサゾリン］の合成を記載している。コポリマーに導入されたフェノール部分は、モデル条件下での十分なｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性により好収率で進行するヨウ素１２５による放射線核種標識を可能にする。

【0012】

国際公開第２００９／１５６１８０号は、
ａ）［Ｎ（ＣＯ）（Ｒ^Ａ）ＣＨ_２ＣＨ_２］－｛式中、Ｒ^Ａは、任意選択で－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＲ’_２、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＲ’、－ＣＨＯによって置換される炭化水素基であり、Ｒ’はＨ又はＣ_１～３アルキルを表し、Ｒ^Ａは、第１の繰返し単位が親水性であるように選択される｝
によって表される第１の繰返し単位、及び
－「Ｎ（ＣＯ）（ＲＢ）ＣＨ_２ＣＨ_２］－｛式中、Ｒ^Ｂは、任意選択でハロゲン、－ＯＨ、－ＳＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＲ”_２、－ＣＯＯＲ”、－ＣＯＮＲ”、－ＣＨＯによって置換される炭化水素基であり、Ｒ”はＨ、アルキル又はアルケニルを表し、Ｒ^Ｂは、第２の繰返し単位が第１の繰返し単位より疎水性であるように選択される｝
によって表される第２の繰返し単位
を含む少なくとも１つのコポリマー、並びに
ｂ）１つ又は複数の活性剤
を含む活性剤のポリマー送達システムを記載している。

【0013】

国際公開第２０１３／１０３２９７号はポリ（２－オキサゾリン）ポリマーに関する。実施例４は、統計コポリマーを産生する２－エチル－２－オキサゾリン又は２－メチル－２－オキサゾリンとの（２－メトキシカルボニルエチル）－２－オキサゾリンの共重合を記載している。

【0014】

Ｓｃｈｕｌｔｚら（Ｄｒｕｇ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ Ｓｗｉｔｃｈ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｏｌｙ（２－ｏｘａｚｏｌｉｎｅ）ｓ、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０１４ Ｍａｒ ２５、８（３）：２６８６～９６）は、パクリタキセルを両親媒性ＡＢＡポリ（２－オキサゾリン）トリブロックコポリマーへ組み込んだ。親水性ブロックＡはポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）を含むが、中間ブロックＢはかろうじて疎水性のポリ（２－ｎ－ブチル－２－オキサゾリン）又は高疎水性のポリ（２－ｎ－ノニル－２－オキサゾリン）のいずれかであった。

【0015】

Ｌａｍｂｅｒｍｏｎｔ－Ｔｈｉｊｓら（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｒｉｎｇ－Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｙｃｌｉｃ Ｉｍｉｎｏ Ｅｔｈｅｒｓ：Ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１１、４４、４３２０～４３２５）は、２－メチル－２－オキサゾリン及び／又は２－フェニル－２－オキサゾリンとの４－エチル－２－ブチル－２－オキサゾリンの共重合を記載している。この共重合の動態解析により、２－メチル－２－オキサゾリンリッチドメインから始まり、４－エチル－２－ブチル－２－オキサゾリンリッチドメインを介して、重合の最終段階で２－フェニル－２－オキサゾリンリッチドメインへのグラジエントコポリマー構造の形成が明らかになった。

【0016】

Ｊａｋｓｃｈら（Ｔｈｅ ｃｏｌｌａｐｓｅ ａｎｄ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙ（２－ｏｘａｚｏｌｉｎｅ） ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：ａ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ＳＡＮＳ ｓｔｕｄｙ、Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ （２０１４） ２９２：２４１３～２４２５）は、イソ－プロピル－２－オキサゾリンとｎ－ノニル－２－オキサゾリンのグラジエントコポリマーの合成を記載している。

【0017】

オキサゾリンとオキサジンのブロックコポリマーも公知である。

【0018】

Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ ｆｒｏｍ ｃｙｃｌｉｃ ｉｍｉｎｏ ｅｔｈｅｒｓ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｎｏｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． １９８６、ｖ． １９、ｎ． １５、５３５～５４１）は、連続的なモノマー付加プロトコールを使用する無置換又は２－置換５，６－ジヒドロ－４Ｈ－１，３－オキサジンと組合せた２－置換２－オキサゾリンのカチオン性開環重合を利用することによって調製された環状イミノエーテルから形成されるブロックコポリマーを記載している。

【0019】

Ｂｌｏｋｓｍａら（Ｐｏｌｙ（ｃｙｃｌｉｃ ｉｍｉｎｏ ｅｔｈｅｒ）ｓ Ｂｅｙｏｎｄ ２－Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ－２－ｏｘａｚｏｌｉｎｅｓ、Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１１、３２、１４１９～１４４１）は、２－オキサジン（２－ＯＺＩ）並びにキラル４－及び５－置換２－オキサゾリン（２－ＯＺＯ）の重合について、並びに生じるポリマーの選択された特性の概要を提供する。筆者らは、２－メチル－２－ＯＺＯと２－フェニル－２－ＯＺＩのブロックコポリマー、２－フェニル－２－ＯＺＯと２－メチル－２－ＯＺＩのブロックコポリマー、及び２－フェニル－２－ＯＺＯと２－無置換－２－ＯＺＩのブロックコポリマーの調製について記載している。

【0020】

米国特許第５８５４３３１号は、顔料分散剤としてのオキサゾリンとオキサジンのブロックコポリマー及びインクジェットインクでのそれらの使用を記載している。ブロックポリマー分散剤はＡＢ、ＡＢＡ，及びＢＡＢブロックコポリマーからなる群から選択され、Ａブロックが疎水性であり、Ｂブロックが親水性であり、前記ブロックポリマー分散剤は２－置換オキサゾリンモノマー、２－置換オキサジンモノマー、及びそれらの混合物からなる群から選択されるモノマーから構成される。

【0021】

［発明の概要］
本発明者らは、所望の特性を有するポリ（環状イミノエーテル）が２－オキサゾリンモノマー並びに２－オキサジンモノマーを含有するモノマー反応混合物の統計重合によって大きな困難なく産生され得ることを発見した。

【0022】

したがって、本発明の一態様は、以下の式（Ｉ）：
Ｉｎｉ－［Ｏｘ］_ｍ－［Ｏｚ］_ｎ－Ｎｕｃ （Ｉ）
｛式中：
Ｉｎｉはカチオン性重合の開始剤の残基を表し、
Ｎｕｃは求核剤の残基を表し、
ＯｘはＮ（Ｒ^１）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^１は独立してＨ又はＣ（Ｏ）Ｒ^１１を表し；Ｒ^１１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
ＯｚはＮ（Ｒ^２）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^２は独立してＣ（Ｏ）Ｒ^２１又はＨを表し；Ｒ^２１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
各Ｒ^ａは独立してＨ、直鎖状又は分枝状Ｃ_１～３アルキルを表し；
ｍ≧５；
ｎ≧５；
ｍ＋ｎ≧２０；
３：９７≦ｍ：ｎ≦９７：３｝
によって表される統計コポリマーに関する。

【0023】

本発明の統計コポリマーは医学分野、特に薬物送達のポリマーミセル及びＤＮＡ送達のポリプレックスで利用され得る有用な特性を示す。

【0024】

本発明はまた、統計コポリマーを調製する方法も提供し、前記方法は任意選択でモル比３：９７～９７：３の範囲の２－置換２－オキサゾリン及び任意選択で２－置換２－オキサジンを含むモノマー反応混合物のカチオン性開環重合を含み、各２－置換－２－オキサゾリン及び２－置換－２－オキサジンの２位の任意選択の置換基は独立してＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールから選択される。

【0025】

本発明者らは、統計コポリマーのモノマー組成物及び結果的なコポリマーの特性は、任意選択で２－置換２－オキサゾリン及び任意選択で２－置換２－オキサジンの異なる組合せを選択することによって容易に操作され得ることを見出した。２－オキサゾリンの２位の置換基と２－オキサジンの２位の置換基の両方は、共重合反応におけるこれらのモノマーの参加に有意な効果を持つ。したがって、ランダムコポリマーは、例えば、共重合化中に等しく反応性の２－置換－２－オキサゾリン及び２－置換－２－オキサジンを選択することによって産生され得る。ランダムコポリマーは、特にコポリマーがポリカチオン性ポリマーである場合にポリプレックス形成に特に好適である。

【0026】

一方、グラジエントポリマーは、共重合化反応中にはっきりと異なる反応性を示す２－オキサゾリン及び２－オキサジンを選択することによって産生され得る。反応性の違いが比較的少ない２－オキサゾリン／２－オキサジン組合せを選択することにより、鎖に渡ってモノマー組成物のゆっくりとした徐変を示すグラジエントコポリマーが産生され得る。反応性が実質的に異なる２－オキサゾリン／２－オキサジン組合せを選択することにより、鎖に渡ってモノマー組成物のより急な変化を示すグラジエントコポリマーが産生され得る。

【0027】

グラジエントコポリマーの組成物の徐変は、ブロックコポリマーと比較して鎖間反発作用の低下をもたらす。理論研究は、グラジエントコポリマーの組成物変動の程度はモノマー分布によって変更され、ブロックコポリマーに見られる段状のプロファイルよりもシヌソイド組成物プロファイルへと組織化するであろうと予測した。これは、ランダム及びブロックコポリマーに見られる１つ又は２つよりも広範囲の可能な局所環境をもたらす。

【0028】

本発明はまた、ミセル薬物送達システム又はポリプレックスにおける本発明の統計コポリマーの適用にも関する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】カイネティックプロット

【図2】グラジエント分析

【図3】カイネティックプロット

【図4】グラジエント分析

【図5】カイネティックプロット

【図6】グラジエント分析

【図7】カイネティックプロット

【図8】グラジエント分析

【図9】カイネティックプロット

【図10】グラジエント分析

【図11】カイネティックプロット

【図12】グラジエント分析

【図13】カイネティックプロット

【図14】グラジエント分析

【0030】

［発明の詳細な説明］
したがって、本発明の第１の態様は、以下の式（Ｉ）：
Ｉｎｉ－「Ｏｘ］_ｍ－「Ｏｚ］_ｎ－Ｎｕｃ （Ｉ）
｛式中、
Ｉｎｉはカチオン性重合の開始剤の残基を表し、
Ｎｕｃは求核剤の残基を表し、
ＯｘはＮ（Ｒ^１）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^１は独立してＨ又はＣ（Ｏ）Ｒ^１１を表し；Ｒ^１１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
ＯｚはＮ（Ｒ^２）ＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａＣＨＲ^ａを表し；各Ｒ^２は独立してＣ（Ｏ）Ｒ^２１又はＨを表し；Ｒ^２１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～１２アルキル、任意選択で置換されたシクロアルキル、任意選択で置換されたアラルキル又は任意選択で置換されたアリールを表し；
各Ｒ^ａは独立してＨ、直鎖状又は分枝状Ｃ_１～３アルキルを表し；
ｍ≧５；
ｎ≧５；
ｍ＋ｎ≧２０；
３：９７≦ｍ：ｎ≦９７：３｝
によって表される統計コポリマーに関する。

【0031】

本明細書で使用する場合、用語「統計コポリマー」は、モノマー残基の配列が統計的法則に従うコポリマーを指す。

【0032】

本明細書で使用する場合、用語「ランダムコポリマー」は、鎖の特定の点で所与の型のモノマー残基を見出す可能性が鎖のモノマー残基のモル分率に類似している統計コポリマーを指す。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語「グラジエントコポリマー」は、鎖に沿ってモノマー組成物の徐変を示す統計ポリマーを指す。この配置は、鎖に沿って一定の平均組成物を維持するランダムコポリマー及び鎖に沿って急変するブロックコポリマーとは異なる。

【0034】

本発明の統計コポリマーは、コポリマーの異なる断片のモノマー組成物と比較して好適に特徴付けられ得る。この目的のため、コポリマーは３つの等しい断片、すなわちＩｎｉ隣接断片（Ｉｎｉ断片）、Ｎｕｃ隣接断片（Ｎｕｃ断片）、及びＩｎｉ断片とＮｕｃ断片を分ける中心断片に分割される。モノマー単位の総数が３の倍数ではない場合、中心断片のサイズはＩｎｉ断片とＮｕｃ断片が等しいサイズになるように選ばれる。以下の表は、いくつかの計算値の例を示す。

【0035】

【表1】

【0036】

ランダムコポリマーの場合、Ｉｎｉ断片とＮｕｃ断片のモノマー組成物は非常に類似しているが、グラジエントコポリマーの場合、これらの断片のモノマー組成物は類似していない。

【0037】

前述の式（Ｉ）では、各Ｒ^ａが独立してＨ又はメチルを表すことが好ましく、Ｈを表すことが最も好ましい。

【0038】

本発明の一実施形態では、Ｒ^１残基の少なくとも５０％がＣ（Ｏ）Ｒ^１１であり、Ｒ^１残基の少なくとも７０％がＣ（Ｏ）Ｒ^１１であることが好ましく、Ｒ^１残基の少なくとも９０％がＣ（Ｏ）Ｒ^１１であることがより好ましい。

【0039】

本発明の代替えの実施形態では、Ｒ^１残基の５０％より多くがＨである。Ｒ^１残基の７０％より多くがＨであることが好ましく、Ｒ^１残基の９０％より多くがＨであることがより好ましい。以下に説明されるように、Ｒ^１残基の大部分がＨである本発明のコポリマーは、オキサゾリンモノマーを含有するモノマー反応混合物を重合し、続いてコポリマーのオキサゾリン単位からペンダントアシル基を加水分解除去することによって合成され得る。

【0040】

さらなる実施形態では、Ｒ^２残基の少なくとも５０％がＣ（Ｏ）Ｒ^２１であり、Ｒ^２残基の少なくとも７０％がＣ（Ｏ）Ｒ^２１であることが好ましく、Ｒ^２残基の少なくとも９０％がＣ（Ｏ）Ｒ^２１であることがより好ましい。

【0041】

代替えの実施形態では、Ｒ^２残基の５０％より多くがＨであり、Ｒ^２残基の７０％より多くがＨであることが好ましく、Ｒ^２残基の９０％より多くがＨであることが最も好ましい。Ｒ^２残基の大部分がＨである本発明のコポリマーは、オキサジンモノマーを含有するモノマー反応混合物を重合し、続いてコポリマーのオキサジン単位からペンダントアシル基を加水分解除去することによって合成され得る。

【0042】

本発明のコポリマーは、典型的には少なくとも５つのオキサゾリン単位（［Ｏｘ］）を含有する。したがって、好ましい実施形態では、式（Ｉ）の整数ｍは少なくとも５であり、少なくとも１０であることがより好ましく、少なくとも２０であることが最も好ましい。典型的には、整数ｍは２５０を超えない。

【0043】

本コポリマーのオキサジン単位（［Ｏｚ］）の数は、典型的には少なくとも５である。言い換えると、式（Ｉ）の整数ｎは少なくとも５であることが好ましい。整数ｎは少なくとも１０であることがより好ましく、ｎは少なくとも２０であることが最も好ましい。典型的には、整数ｎは２５０を超えない。

【0044】

本発明のコポリマーのオキサゾリン単位とオキサジン単位の組合せは、典型的には少なくとも２０である（ｍ＋ｎ≧２０）。ｍ＋ｎ≧３０がより好ましく、ｍ＋ｎ≧５０が最も好ましい。本発明のコポリマーのオキサゾリン単位とオキサジン単位の組合せは、典型的には５００を超えない（ｍ＋ｎ≦５００）。

【0045】

本明細書に定義したオキサゾリン単位及びオキサジン単位は、典型的には、本発明の統計コポリマーに５：９５～９５：５の比で存在し、１０：９０～９０：１０の比がより好ましく、２０：８０～８０：２０の比が最も好ましい。

【0046】

本発明のコポリマーは、本明細書に定義したオキサゾリン単位及びオキサジン単位以外に他のモノマー単位を含有し得る。オキサゾリン単位及びオキサジン単位はともに、コポリマーに存在する全てのモノマー単位のバルクを表すことが好ましい。言い換えると、コポリマーのモノマー単位の総数が整数ｔで表される場合、コポリマーは以下の条件を満たす：（ｍ＋ｎ）／ｔ＞０．５。（ｍ＋ｎ）／ｔ＞０．７がより好ましく、（ｍ＋ｎ）／ｔ＞０．９が最も好ましい。

【0047】

本発明の一実施形態は、ランダムコポリマーの形態の統計コポリマーに関する。本発明者らは、ランダムコポリマーが実質的に異なる個々の重合比を有するオキサゾリンとオキサジンモノマーの組合せから産生され得ることを、驚くべきことにこれらの組合せのいくつかは共重合中に等しく反応性であるため、予期せず見出した。

【0048】

典型的には、ランダムコポリマーの場合には、Ｉｎｉ断片とＮｕｃ断片のモノマー比［Ｏｚ］／［Ｏｘ］は、２倍以下異なる。ランダムコポリマーの場合、これらの比は１．７５倍以下異なることがより好ましく、１．５倍以下異なることが最も好ましい。

【0049】

本発明のランダムコポリマーでは、各Ｒ^１１は独立して、メチル、エチル、シクロプロピル、ｎ－プロピル又はｎ－ブチルを表すことが好ましい。各Ｒ^１１は独立して、メチル、エチル又はシクロプロピルを表すことがより好ましい。各Ｒ^１１は独立して、メチル又はエチルを表すことが最も好ましい。

【0050】

本発明のランダム共重合体の各Ｒ^２１は独立して、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル若しくはシクロプロピル、ｎ－ブチル又はｎ－ノニルを表すことが好ましい。各Ｒ^２１は独立して、エチル、ｎ－プロピル又はイソプロピルを表すことがより好ましい。各Ｒ^２１は独立して、エチル又はイソプロピルを表すことが最も好ましい。

【0051】

本発明の特に好ましい実施形態により、統計コポリマーはランダムコポリマーであり、
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がメチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がイソ－プロピルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がエチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がイソ－プロピルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がシクロプロピルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がメチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がシクロプロピルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がエチルである。

【0052】

本発明の別の有利な実施形態により、統計コポリマーはグラジエントコポリマーであり、Ｉｎｉ断片のモノマー比［Ｏｚ］／［Ｏｘ］が、コポリマーのＮｕｃ断片の同じ比よりも少なくとも２倍高い又は低い。グラジエントポリマーの場合、これらの２つの比は、少なくとも３倍異なることがより好ましく、少なくとも５倍異なることが最も好ましい。典型的には、これらの２つの比は、本発明のグラジエントポリマーでは２０倍より多く異ならない。

【0053】

本発明者らは、オキサジンモノマーの重合反応性は、典型的には、オキサゾリンモノマーの重合反応性よりも著しく低い事実にもかかわらず、コポリマーのＮｕｃ断片に対してコポリマーのＩｎｉ断片ではオキサジンモノマー単位が大きな比率を占めるグラジエントポリマーを調製できることを予期せず発見した。したがって、特に好ましい実施形態では、本発明の統計コポリマーはグラジエントコポリマーであり、コポリマーのＩｎｉ断片のモノマー比［Ｏｚ］／［Ｏｘ］は、コポリマーのＮｕｃ断片の同じ比よりも少なくとも２倍高く、少なくとも３倍高いことがより好ましく、５～１０倍高いことが最も好ましい。

【0054】

本発明のグラジエントコポリマーの各Ｒ^１１は独立して任意選択で置換されたＣ_１～９アルキルを表すことが好ましい。グラジエントの各Ｒ^１１は独立して…を表すことがより好ましく、各Ｒ^１１は独立して…を表すことが最も好ましい。

【0055】

本発明のグラジエントコポリマーでは、典型的には、各Ｒ^２１は独立して、任意選択で置換されたＣ_１～９アルキルを表すことが好ましく、各Ｒ^２１は独立してエチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル又はｎ－ノニルを表すことがより好ましく、各Ｒ^２１は独立してｎ－プロピル、ｎ－ブチル又はｎ－ノニルを表すことが最も好ましい。

【0056】

本発明の特定の好ましい実施形態により、統計コポリマーはグラジエントコポリマーであり、
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がメチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がメチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がエチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がエチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がｎ－プロピルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がｎ－プロピルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がｎ－プロピルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がエチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がｎ－プロピルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がメチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がエチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がメチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がｎ－ブチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がメチルである；又は
Ｒ^１１残基の少なくとも８０％がｎ－ブチルであり、Ｒ^２１残基の少なくとも８０％がエチルである。

【0057】

本発明の別の態様は、統計コポリマーを調製する方法であって、前記方法が、任意選択で２－置換２－オキサゾリン及び任意選択で２－置換２－オキサジンを３：９７～９７：３の範囲のモル比で含むモノマー反応混合物のカチオン性開環重合を含み、２－置換－２－オキサゾリンの２位の任意選択の置換基が、本明細書に先に規定されたＲ^１１残基であり、２－置換－２－オキサジンの２位の任意選択の置換基が、本明細書に先に規定されたＲ^２１残基である、方法に関する。

【0058】

好ましい実施形態により、モノマー反応混合物は、任意選択で２－置換 ２－オキサゾリン及び任意選択で２－置換２－オキサジンを５：９５～９５：５の範囲のモル比で含み、２０：８０～８０：２０の範囲のモル比がより好ましい。

【0059】

モノマー反応混合物は、２－置換２－オキサゾリン及び／又は２－置換２－オキサジンを含有することが好ましい。反応混合物は、２－置換２－オキサゾリン及び２－置換２－オキサジンを含有することがより好ましい。

【0060】

カチオン性開環重合は、カチオン性重合開始剤、特に当技術分野で公知のように求電子剤の存在下で行われることが好ましい。好適なカチオン性重合開始剤の例としては、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、ハロゲン化アシル、スルホン酸及びオキサゾリニウム塩が挙げられる。

【0061】

本方法では、共重合反応は、当技術分野で一般的に使用されるように、コポリマーを求核剤と反応させるステップによって終結されることが好ましい。例としては、水、アミン（アンモニア、一級、二級、三級）、カルボン酸、チオール酸、アルコキシド、アジドフタルイミド及び水酸化物が挙げられる。反応混合物が依然としてモノマー反応物質を含有する場合に、求核剤が添加され得る。

【0062】

モノマー反応混合物は少なくとも２０重量％の一般に適用される溶媒、例えばアセトニトリル、ブチロニトリル、クロロベンゼン、ジクロロメタン、クロロホルム、スルホラン、ニトロメタン、ニトロベンゼン、アニソール及びそれらの混合物を含有することが好ましい。反応混合物は、アセトニトリル、クロロベンゼン及びそれらの混合物から選択される少なくとも４０重量％の溶媒を含有することがより好ましい。

【0063】

本方法におけるオキサゾリンとオキサジンモノマーの共重合は、４０℃～２００℃の範囲の温度で行われることが好ましく、８０℃～１６０℃の範囲の温度がより好ましい。

【0064】

本方法の特定の好ましい実施形態により、反応混合物中で形成される統計コポリマーは、ペンダントアシル残基の少なくとも５０％を除去することにより加水分解され、ペンダントアシル残基の少なくとも７０％がより好ましく、ペンダントアシル残基の少なくとも９０％が最も好ましい。アシル残基の加水分解は、ポリプレックスでの使用に理想的に適したポリカチオン性ポリマーを産生する。

【0065】

本発明のさらなる態様は、本明細書に先に規定されたランダムコポリマー及び前記コポリマーに非共有結合される治療剤を含む送達システムであって、治療剤が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ、ａｇＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、核酸、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、疎水性薬剤、及び小分子薬剤からなる群から選択される、送達システムに関する。ランダムコポリマーへの治療剤の結合により、細胞毒性が低い細胞への治療剤の効果的な輸送が可能になる。

【0066】

治療剤は６．５～８の範囲の既定のｐＨで電荷を有し、ランダムコポリマーポリマーは既定のｐＨで治療剤と反対の電荷を有し、既定のｐＨで治療剤とランダムコポリマーの間に静電結合が形成されることが好ましい。治療剤は前述の既定のｐＨで陰性電荷を有し、一方コポリマーは同じ既定のｐＨで陽性電荷を有することが好ましい。

【0067】

好ましい実施形態では、ランダムコポリマーに結合される治療剤は、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｉｓＲＮＡ、ａｇＲＮＡ及びｓｍＲＮＡから選択される。

【0068】

ランダムコポリマーと治療剤を含有する送達システムは、治療処置に好適に使用することができ、前記処置は送達システムの非経口投与を含むことが好ましい。

【0069】

さらに別の態様では、ミセル薬物送達システムは、本明細書に先に規定されたグラジエントコポリマー及び前記コポリマーに非共有結合される薬物を含む。

【0070】

水中で形成される場合、ポリマーミセルはナノ粒子であり、典型的には殻として親水性ポリマー鎖及びコアとして疎水性ポリマー鎖を有する。したがって、本発明のグラジエントコポリマーは疎水性部分並びに親水性部分を含むことが好ましい。ミセル薬物送達システムの薬物は、ミセルのコアにおいて疎水性ポリマー鎖に非共有結合される薬物であることが好ましい。

【0071】

グラジエントコポリマー及び薬物を含有する送達システムは、治療処置に好適に使用され、前記処置は薬物送達システムの経口投与を含むことが好ましい。

【0072】

本発明のミセル薬物送達システムに組み込まれ得る薬物の例としては、エキセメスタン（Ｅｘｅｍｅｓｔａｎｃｅ）（アロマシン）、カンプトサル（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（イリノテカン）、エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（エピルビシン）、フェマーラ（Ｆｅｍａｒａ）（レトロゾール）、グリーバック（Ｇｌｅｅｖａｃ）（メシル酸イマチニブ）、レンタロン（Ｌｅｎｔａｒｏｎ）（ホルメスタン）、シタドレン（Ｃｙｔａｄｒｅｎ）／オリメテン（Ｏｒｉｍｅｔｅｎ）（アミノグルテチミド）、テモダール（Ｔｅｍｏｄａｒ）、プロスカー（Ｐｒｏｓｃａｒ）（フィナステリド）、ビアズル（Ｖｉａｄｕｒ）（リュープロリド）、ネクサバール（Ｎｅｘａｖａｒ）（ソラフェニブ）、カイトリル（Ｋｙｔｒｉｌ）（グラニセトロン）、タキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）（ドセタキセル）、タキソール（Ｔａｘｏｌ）（パクリタキセル）、カイトリル（Ｋｙｔｒｉｌ）（グラニセトロン）、ベサノイド（Ｖｅｓａｎｏｉｄ）（トレチノイン）（レチンＡ）、ゼローダ（ＸＥＬＯＤＡ）（カペシタビン）、アリミデックス（Ａｒｉｍｉｄｅｘ）（アナストロゾール）、カソデックス（Ｃａｓｏｄｅｘ）／コスデックス（Ｃｏｓｕｄｅｘ）（ビカルタミド）、ファソロデックス（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）（フルベストラント）、イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（ゲフィチニブ）、ノルバデックス（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）、イスツバル（Ｉｓｔｕｂａｌ）、バロデクス（Ｖａｌｏｄｅｘ）（タモキシフェンクエン酸塩）、トムデックス（Ｔｏｍｕｄｅｘ）（ラルチトレキセド）、ゾラデックス（Ｚｏｌａｄｅｘ）（ゴセレリン酢酸塩）、ロイスタチン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ）（クラドリビン）、ベルケイド（Ｖｅｌｃａｄｅ）（ボルテゾミブ）、マイロターグ（Ｍｙｌｏｔａｒｇ）（ゲムツズマブオゾガマイシン）、アリムタ（Ａｌｉｍｔａ）（ペメトレキセド）、ジェムザール（Ｇｅｍｚａｒ）（ゲムシタビン塩酸塩）、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（リツキシマブ）、レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（レナリドミド）、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（サリドマイド）、アルケラン（Ａｌｋｅｒａｎ）（メルファラン）、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（ドキソルビシン）、セルビジン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）（ダウノルビシン）、パクリタキセル、クルクミン及びそれらの誘導体が挙げられる。

【0073】

本発明は以下の非限定的な実施例によってさらに示される。

【実施例】

【0074】

（材料）
マイクロ波バイアルのキャッピングまでの重合混合物の調製に関する全ての操作は、水分濃度≦０．１ｐｐｍでＶＩＧＯＲ Ｓｃｉ－Ｌａｂ ＳＧ １２００／７５０ Ｇｌｏｖｅｂｏｘ Ｓｙｓｔｅｍにおいて行われた。

【0075】

重合のため、Ｒｏｂｏｔ Ｓｉｘｔｙを備えたＢｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ＥＸＰ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ Ｓｙｓｔｅｍが使用された。重合の間、マイクロ波合成装置は一定の設定温度（１４０℃）で操作され、ＩＲセンサーによってモニターされた。

【0076】

ＧＣは、ＶＷＲ Ｃａｒｒｉｅｒ－１６０水素生成器並びに長さ３０ｍ及び直径０．３２０ｍｍのＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰ－５カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０Ａシステムにおいて実施された。ＦＩＤ検出器が使用され、注入口は２４０℃に設定され、スプリット注入比は２５：１であった。水素がキャリアガスとして使用され、流速は２ｍＬ／分であった。オーブン温度は２０℃／分で５０℃から１２０℃に昇温され、続いて５０℃／分の勾配で２４０℃まで昇温された。

【0077】

（共重合動態を決定する一般手順）
ストック溶液は、両方のモノマー（総モノマー濃度４Ｍ、個々のモノマー当たり２Ｍ）、開始剤（トシル酸メチル、ＤＰ１００で全面変換又は各モノマーの５０個の繰返し単位を狙う）及び溶媒（乾燥アセトニトリル）を含有して作成された。

【0078】

この混合物は、三角形の撹拌子を含む０．５～２ｍｌのバイオタージバイアルに等しく（７００μＬ）分けられ、フタをしてマイクロ波中で１４０℃まで加熱された。異なる時間間隔の後にバイアルを冷却して重合は停止された。

【0079】

試料はクロロホルムによって希釈され、ＧＣ分析のための試料を採取する前に少なくとも１時間撹拌された。変換は、内部標準としてアセトニトリル溶媒でのＧＣによって、及び比較のため時間ゼロとしてストック溶液の試料の溶媒に対するモノマーの比を使用して決定された。

【0080】

カイネティックプロットの傾きから、２つの個々のモノマーの重合速度定数が算出され、次いでこれらの重合速度定数が使用され、モノマー変換に基づいてＯｚ繰返し単位のＯｘを割り当てるステップによって１００個の繰返し単位の鎖の組成物が算出された。次いで１００個の繰返し球によって表されるポリマーのこれらの図式的なプロットが使用され、Ｉｎｔ断片とＮｕｃ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比が算出された。この計算方法は、Ｌｏｂｅｒｔら（Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ ２－ｐｈｅｎｙｌ－２－ｏｘａｚｏｌｉｎｅｓ；Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｎｅ－ｐｏｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｗａｔｅｒ、Ｊ Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ、Ｐａｒｔ Ａ、Ｐｏｌｙｍ Ｃｈｅｍ ２００８、４６、５８５９～５８６８）に記載されている。

【0081】

〔実施例１〕
２－メチル－２－オキサゾリン（ＭｅＯｘ）及び２－メチル－２－オキサジン（ＭｅＯＺｉ）は、一般方法に記載されるように重合された。この重合の分析は、図１に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0082】

図２に図示したグラジエント分析は、ポリマーのｉｎｉ断片が１９単位のＭｅＯＺｉ（黒）及び１４単位のＭｅＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は１２単位のＭｅＯＺＩ及び２１単位のＭｅＯｘを含有することを明らかにした。したがって、Ｎｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比は、グラジエントモノマー分布を示す２．３７５に等しい。

【0083】

〔実施例２〕
２－エチル－２－オキサゾリン（ＥｔＯｘ）及び２－メチル－２－オキサジン（ＭｅＯＺｉ）は、一般方法に記載されるように重合された。この重合の分析は、図３に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0084】

図４に図示したグラジエント分析は、ポリマーのＩｎｉ断片が２２単位のＭｅＯＺｉ（黒）及び１１単位のＥｔＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は９単位のＭｅＯＺＩ及び２４単位のＥｔＯｘを有することを明らかにした。これは、グラジエントモノマー分布を示す５．３３のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0085】

〔実施例３〕
２－メチル－２－オキサゾリン（ＭｅＯｘ）及び２－イソ－プロピル－２－オキサジン（ｉｐｒｏｐＯＺｉ）は、一般方法に記載されるように重合された。この共重合の分析は、図５に示したカイネティックプロットをもたらした。

【0086】

図６に図示したグラジエント分析は、コポリマーのＩｎｉ断片が１４単位のｉｐｒｏｐＯＺｉ（白）及び１９単位のＭｅＯｘ（黒）を含有するが、Ｎｕｃ断片は１９単位のｉｐｒｏｐＯＺｉ及び１４単位のＭｅＯｘを有することを明らかにした。これは、ランダムモノマー分布を示す０．５４のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0087】

〔実施例４〕
２－エチル－２－オキサゾリン（ＥｔＯｘ）及び２－イソ－プロピル－２－オキサジン（ｉｐｒｏｐＯＺｉ））は、一般方法に記載されるように重合された。この共重合の分析は、図７に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0088】

図８に図示したグラジエント分析は、コポリマーのＩｎｉ断片が１８単位のｉｐｒｏｐＯＺｉ（黒）及び１５単位のＥｔＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は１５単位のｉｐｒｏｐＯＺＩ及び１８単位のＥｔＯｘを有することを明らかにした。これは、ランダム様モノマー分布を示す１．４４のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0089】

〔実施例５〕
２－ブチル－２－オキサゾリン（ＢｕｔＯｘ）及び２－メチル－２－オキサジン（ＭｅＯＺｉ）は、一般方法と比較してわずかに改変された手順で重合された。モノマーの１：１比の代わりに、２：８（ＢｕｔＯｘ：ＭｅＯＺｉ）が使用された。この共重合の分析は、図９に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0090】

図１０に図示したグラジエント分析は、コポリマーのＩｎｉ断片は３１単位のＭｅＯＺｉ（黒）及び２単位のＢｕｔＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は１９単位のＭｅＯＺＩ及び１４単位のＢｕｔＯｘを有することを明らかにした。これは、グラジエントモノマー分布を示す１１．４２のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0091】

〔実施例６〕
２－ブチル－２－オキサゾリン（ＢｕｔＯｘ）及び２－メチル－２－オキサジン（ＭｅＯＺｉ）は、一般方法に記載されるように重合された。この共重合の分析は、図１１に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0092】

図１２に図示したグラジエント分析は、コポリマーのＩｎｉ断片は２２単位のＭｅＯＺｉ（黒）及び１１単位のＢｕｔＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は８単位のＭｅＯＺＩ及び２５単位のＢｕｔＯｘを有することを明らかにした。これは、グラジエントモノマー分布を示す６．２５のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0093】

〔実施例７〕
２－ブチル－２－オキサゾリン（ＢｕｔＯｘ）及び２－メチル－２－オキサジン（ＭｅＯＺｉ）は、一般方法と比較してわずかに改変された手順で重合された。モノマーの１：１比の代わりに、８：２（ＢｕｔＯｘ：ＭｅＯＺｉ）が使用された。この共重合の分析は、図１３に示したカイネティックプロットをもたらし、予期しない逆の共重合挙動を示している。

【0094】

図１４に図示したグラジエント分析は、コポリマーのＩｎｉ断片は１５単位のＭｅＯＺｉ（黒）及び１８単位のＢｕｔＯｘ（白）を含有するが、Ｎｕｃ断片は１単位のＭｅＯＺＩ及び３２単位のＢｕｔＯｘを有することを明らかにした。これは、グラジエントモノマー分布を示す２６．６７のＮｕｃ断片に対するＩｎｉ断片の［Ｏｚ］／［Ｏｘ］比を与える。

【0095】

〔実施例８〕
実施例５及び６のグラジエントコポリマーを使用して、ローダミンオクタデシルエステル（色素）がロードされた。したがって、ポリマーミセルは、水中への直接溶解によって（実施例５のポリマー）又はまずエタノールへのポリマーの溶解、続いて水の添加及び透析による溶媒の置換によって（実施例６のポリマー）、水中（１０ｍｇ／ｍＬ）で調製された。色素は、エタノール（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解され、１００μＬの色素溶液は１ｍＬのポリマー溶液に添加され、続いて透析によりエタノールを除去された。

【0096】

コポリマー粒子への色素の取り込みは、ロードした粒子を脱塩水中に分散して総色素濃度２．５０μｇ／ｍｌを用意し、５６１ｎｍでの吸収を測定することによって決定された。この吸収は、同じ色素含量であるが、コポリマーを含有しない参照溶液の吸収と比較された。このデータから、色素ローディングの％が算出された。

【0097】

これらの測定の結果は表１に示される。

【0098】

【表2】

【0099】

〔実施例９〕
実施例４の（加水分解）ランダムコポリマーを使用してｐＤＮＡのポリプレックスが調製され、このポリプレックスを使用してヒト卵巣がん細胞は形質転換された。

【0100】

コポリマーは、７．５ｍＬの脱イオン水及び７．５ｍＬの塩酸（ＨＣｌ；濃縮ＨＣｌ溶液）に１グラムのポリマーを溶解し、続いてＢｉｏｔａｇｅ（登録商標）マイクロ波で９時間１４０℃で、密封したバイアル中で加熱することにより加水分解された。この後、ポリマーは脱イオン水で希釈され、ＨＣｌ及び脱イオン水は減圧により蒸発された。試料は２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液で中和され、凍結乾燥された。ＮＭＲ分析により、ほぼ定量的加水分解を確認した。

【0101】

１ｍｇ／ｍＬのポリマー溶液は、脱イオン水中で調製された。ポリマー溶液は、０．２２μｍフィルターによる濾過によって滅菌され、ＤＰＢＳ中に０．１ｍｇ／ｍＬに希釈された。

【0102】

ポリプレックスは、ｐＤＮＡにポリマー溶液を添加することによって調製された。異なるＮ／Ｐ比のポリプレックスが調製された：２．５、５、１０、２５、及び５０。対照のポリプレックス溶液は、Ｎ／Ｐ比１０でＢ－ＰＥＩによって調製された。ポリプレックスは、１０分間置き安定化された。

【0103】

１０％ ＦＢＳを含有する培地中、８．０×１０^４個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液が調製された。２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に、４００μｌの細胞懸濁液が播種された。プレートは、５％ＣＯ_２を含有する空気中で２４時間、３７℃でインキュベートされた。

【0104】

次に、１５０μＬのポリプレックス溶液は、ＦＢＳを含む又は含まない１５０μＬの新鮮な培地と共にウェルに添加された。ウェルの２列は、対照として、ポリプレックスの代わりに１５０μＬのＤＰＢＳで満たされた。１時間後、培地は１０％ ＦＢＳを含有する新鮮な培地で交換された。細胞は５％ＣＯ_２を含有する空気中で、３７℃でインキュベートされた。４８時間後、形質転換効率がＦＡＣＳによって分析され、蛍光顕微鏡を使用して画像化された。

【0105】

ＦＡＣＳ分析のため、ウェル当たり３００μＬの０．２５％トリプシンで細胞はトリプシン処理された。トリプシンは、ウェル当たり１０％ ＦＢＳを含有する２ｍＬの培地で不活性化された。細胞はＦＡＣＳチューブに移され、６００ｒｃｆで５分間遠心分離された。上澄み液はデカントされた。細胞ペレットは金属グリッドで擦り取ることによってほぐされ、２００μＬのＤＰＢＳがＦＡＣＳチューブに添加された。蛍光強度が、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して測定された。得られたデータはＦｌｏｗｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して分析された。

【0106】

結果は、２－エチル－２－オキサゾリンと２－イソ－プロピル－オキサジン（ＰＥＩ－ＰＰＩ）の加水分解コポリマーの形質転換効率が、分枝状ポリエチレンイミン（Ｂ－ＰＥＩ）の形質転換効率と等しい又は超えることを示した。さらに、Ｂ－ＰＥＩとは対照的にＦＢＳの存在下で、高い形質転換効率がこれらのコポリマーについて観察された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】