ホーム > 特許ランキング > 国立大学法人山口大学
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-09
(45)【発行日】2022-03-17
(54)【発明の名称】ホルボールエステルを有効成分とする軸索の伸展剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/22 20060101AFI20220310BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20220310BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20220310BHJP
【ＦＩ】
A61K31/22
A61P25/00
A61P25/28
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2018062011
(22)【出願日】2018-03-28
(65)【公開番号】P2019172604
(43)【公開日】2019-10-10
【審査請求日】2020-12-24
(73)【特許権者】
【識別番号】304020177
【氏名又は名称】国立大学法人山口大学
(72)【発明者】
【氏名】林田 直樹
【審査官】伊藤 幸司
(56)【参考文献】
【文献】特開平０７－０２５７８６（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９８／００９５２３（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００２－５０８７５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特許第６９１２０７２（ＪＰ，Ｂ２）
【文献】特表２０１３－５１０１１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】The Journal of Biological Chemistry，1994年，269(11)，pp.8376-8382
【文献】CANCER RESEARCH，1982年，42，pp.5067-5073
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／２２
Ａ６１Ｐ ２５／００
Ａ６１Ｐ ２５／２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ホルボールエステルを有効成分とする、タウタンパク質の凝集に起因する前頭側頭型認知症の予防又は治療用医薬であって、前記前頭側頭型認知症が、ＦＴＬＤ（ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｎｇｅｒａｔｉｏｎ）－ｔａｕ、ＦＴＬＤ－ＴＤＰ、又はＦＴＬＤ－ＦＵＳである、予防又は治療用医薬。
【請求項2】
前頭側頭型認知症がＦＴＬＤ－ｔａｕであって、前記ＦＴＬＤ－ｔａｕがピック病、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、神経原線維変化型老年認知症（ＳＤ－ＮＦＴ）、ＭＳＴＤ、又はＷＭＴ－ＧＧＩであることを特徴とする請求項１記載の予防又は治療用医薬。
【請求項3】
ホルボールエステルが、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート又はホルボール１２，１３－ジブチレートであることを特徴とする請求項１又は２記載の予防又は治療用医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ホルボールエステルを有効成分とする軸索の伸展剤や、かかる軸索の伸展剤を含有する、タウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬に関する。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患は多くの疾患に分類されるが、それらの疾患には認知症状を伴うものが多い。現在の日本において、認知症患者は２５０万人にも上るといわれている。その認知症患者のうち約７割はアルツハイマー病と考えられたことから、アルツハイマー病治療薬の開発競争が激しく行われきた。しかしながら、これまで開発された約４００にも達する薬剤のほとんどは十分な治療効果を示すことができていない。
【0003】
アルツハイマー病治療薬の開発が困難な原因としては諸説ある。その開発が困難な原因としては、たとえば、ヒトのアルツハイマー病の再現が非常に不十分なモデルマウスを用いていたことが挙げられる。あるいは、アルツハイマー病は他の神経変性疾患と異なり、βアミロイドによる老人斑と高度にリン酸化されたタウタンパク質による神経原線維変化の２つの特徴的な構造物が形成されるが、開発された治療薬のターゲットがもっぱらβアミロイドに偏っていたことも挙げられる。治験においては、老人斑は減少したが、認知症状は改善されない、もしくは悪化することが多くみられ、さらに、副作用として悪性黒色腫の発症などが認められてしまうことがしばしば生じていた。こうしたなか、老人斑はそもそもアルツハイマー病を発症していない高齢者や、認知症状を呈していない高齢者にも認められる構造物であることから、現在はタウ蛋白に注目した治療薬開発が増えてきている。
【0004】
発明者らは、治療薬開発研究のターゲットを最初からタウタンパク質やその他の神経細胞内に凝集体を形成するタンパク質に定め、このような凝集を抑制する薬剤の探索を行ってきた。その中で、ホルボールエステルであるＰＭＡ(ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート)が、前頭側頭型認知症培養神経細胞の実験系において凝集体形成を抑制することを見出した（特許文献１参照）。
【0005】
一方、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症などの神経変性疾患には、共通して「神経細胞死」や、「神経細胞の変性、特に神経突起の変性若しくは切断」が認められる。従って、この「神経細胞死」や、「神経細胞の変性、特に神経突起の変性若しくは切断」を防ぐことで、神経変性疾患を治療できる薬剤の開発が望まれている。
【0006】
ところで、ホルボールエステルは、ジテルペンのチグリアンファミリーの天然の植物由来有機化合物であり、東南アジア原産のトウダイグサ科の葉状灌木であるクロトンチグリウム（Ｃｒｏｔｏｎ ｔｉｇｌｉｕｍ）の種に由来するクロトン油の加水分解生成物として、１９３４年に初めて単離されたものである。ホルボールの中で、ホルボール－１２－ミリステート－１３－アセテート（ＰＭＡ）は、複数の細胞系及び初代細胞における分化及び／又はアポトーシスの誘発因子と考えられており、悪性腫瘍や白血病、ＨＩＶ、パーキンソン病等の治療剤として用いることが開示されている（特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】特願２０１６－２４２２３０号明細書
【文献】特表２０１５－５１３３１５号公報
【文献】特開２０１６－０５６１９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
日本をはじめとした先進国では高齢化社会を迎え、神経変性疾患を根治する薬剤の開発が切望されている。上述のように、これまでに神経変性疾患に対して様々な治療薬が開発されているが、実際に治療に使われているものはすべて対処療法のものであり、根治につながる治療薬の開発に成功していない。そこで本発明の課題は、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症等に大きく関与する軸索に着目し、軸索を伸展することが可能な薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ホルボールエステルであるＰＭＡ(ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート)が軸索を大幅に伸展させる効果を有することを見出した。さらにこの効果は正常神経細胞に限らず、変性タウタンパク質が細胞内に生じている異常な軸索突起も、正常神経細胞と同じレベルまで伸展させることを見出し、本発明を完成した。
【0010】
すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）ホルボールエステルを有効成分とする軸索の伸展剤。
（２）ホルボールエステルが、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート又はホルボール１２，１３－ジブチレートであることを特徴とする上記（１）記載の軸索伸展剤。
（３）上記（１）又は（２）記載の軸索の伸展剤を含有する、タウタンパク質の凝集又はベータアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬。
（４）神経変性疾患が、前頭側頭型認知症又はアルツハイマー病であることを特徴とする上記（３）記載の予防又は治療用医薬。
（１）ホルボールエステルを有効成分とする軸索の伸展剤。
（２）ホルボールエステルが、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート又はホルボール１２，１３－ジブチレートであることを特徴とする上記（１）記載の軸索伸展剤。
（３）上記（１）又は（２）記載の軸索の伸展剤を含有する、タウタンパク質の凝集又はベータアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬。
（４）神経変性疾患が、前頭側頭型認知症又はアルツハイマー病であることを特徴とする上記（３）記載の予防又は治療用医薬。
【0011】
また、本発明の他の態様としては、（１）ホルボールエステルを対象に投与することを特徴とする軸索の伸展方法や、（２）軸索の伸展剤として使用するための、ホルボールエステルや、（３）ホルボールエステルの、軸索の伸展剤の調製における使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【0012】
本発明により、軸索(axon)を伸展させることが可能となる。また、軸索を伸展させることにより、神経細胞の変性に起因する神経変性疾患の予防又は治療を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】実施例１において、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡを加えて７日間培養後の細胞の写真である。
【図2】実施例２において、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡを異なる濃度で培地に投与し、軸索が伸びる最適なＰＭＡの濃度を調べたものである。
【図3】実施例３において、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡ＋βアミロイド、又はβアミロイドを加えて４８時間培養後したアルツハイマー病培養細胞モデルにおける、典型的な細胞の状態の違いを示す図である。
【図4】実施例３において、軸索の長さが細胞体の長さの１０倍以上となっている細胞の割合を計算した結果を示すグラフである。
【図5】ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡを加えて７日間培養した後の細胞を回収してウェスタンブロット解析を行った結果である。
【図6】ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡを加えて７日間培養した後の細胞を回収してＲＴ－ＰＣＲ解析を行った結果である。
【図7】正常タウタンパク質、及び異常タウタンパク質を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後ＰＭＡを加えて７日間培養後し、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した結果を示す図である。
【図8】ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を培養し、その後、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢｕ）を加えて７日間培養後し、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の軸索の伸展剤としては、ホルボールエステルを有効成分とする軸索の伸展剤であればよく、かかる軸索の伸展剤を用いれば、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症等に大きく関与する軸索を進展させることが可能となる。
【0015】
上記ホルボールエステルは、上述のようには、ジテルペンのチグリアンファミリーの天然の植物由来有機化合物である。かかるホルボールエステルは、ホルボールの酸エステルであれば特に制限されず、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）、ホルボール１２，１３－ジブチレート（ＰＤＢｕ）、ホルボール１２，１３－ジデカノエート、ホルボール１３－ブチレート、ホルボール１２－デカノエート、ホルボール１３－デカノエート、ホルボール１２，１３－ジアセタート、ホルボール１３，２０－ジアセタート、ホルボール１２，１３－ジベンゾアート、ホルボール１２，１３－ジヘキサノエート、ホルボール１２，１３－ジプロピオネート、ホルボール１２－ミリステート、ホルボール１３－ミリステート、ホルボール１２，１３，２０－トリアセタート、１２－デオキシホルボール１３－アンゲレート、１２－デオキシホルボール１３－アンゲレート２０‐アセタート、１２－デオキシホルボール１３－イソブチレート、１２－デオキシホルボール１３－イソブチレート２０－アセタート、１２－デオキシホルボール１３－フェニルアセタート、１２－デオキシホルボール１３－フェニルアセタート２０－アセタート、１２－デオキシホルボール１３－テトラデカノエート、ホルボール１２－チグリエート１３－デカノエート、１２－デオキシホルボール１３－アセタート、ホルボール１２－アセタート、ホルボール１３－アセタート等を挙げることができ、ＰＭＡ又はＰＤＢｕを好適に挙げることができる。ＰＭＡやＰＤＢｕ等の上記ホルボールエステルは、クロトン油などの天然植物の加水分解生成物として調製することや、化学的に合成することや、市販品を購入することによって得ることが可能である。
【0016】
本発明における神経細胞としては、脳の神経細胞を挙げることができ、海馬神経細胞、大脳皮質神経細胞、中脳神経細胞、又は線条体神経細胞を好適に挙げることができる。また、神経細胞の由来は特に制限されないが、哺乳動物、鳥類、魚類、爬虫類、両生類を挙げることができ、哺乳動物を好適に挙げることができ、ヒトをより好適に挙げることができる。
【0017】
本発明における軸索とは、神経細胞から延びている細長い突起状の構造体であって、神経細胞において他の神経細胞への情報を伝達する機能を有するものである。
【0018】
軸索が伸展することによって、神経細胞同士の情報交換及び伝達物質の交換が非常に活性化されることにより、前頭側頭型認知症又はアルツハイマー病の予防又は治療が可能となる。
【0019】
本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬としては、上記本発明の軸索の伸展剤を含んでいれば特に制限されず、ここで、タウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患とは、神経細胞内においてタウタンパク質の凝集によって認知機能が低下する疾患を意味する。また、βアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患とは、神経細胞内においてβアミロイドの蓄積によって認知機能が低下する疾患を意味する。かかる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ：ｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｎｇｅｒａｔｉｏｎ）、ダウン症候群を挙げることができ、アルツハイマー病又は前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）を好適に挙げることができる。前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）は、臨床病型として主にＦＴＬＤ－ｔａｕ、ＦＴＬＤ－ＴＤＰ、及びＦＴＬＤ－ＦＵＳに分類され、ＦＴＬＤ－ｔａｕにはピック病、ＦＴＬＤ－１７、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、神経原線維変化型老年認知症（ＳＤ－ＮＦＴ）、ＭＳＴＤ、ＷＭＴ－ＧＧＩが含まれ、ＦＴＬＤ－ＴＤＰにはＦＴＤ－ＭＮＤ、ＦＴＤ－ＴＤＰが含まれ、ＦＴＬＤ－ＦＵＳにはａｔｙｐｉｃａｌ ＦＴＬＤ－Ｕ、ＢＩＢＤ、ＮＩＦＩＤが含まれる。
【0020】
本発明の軸索の伸展剤や、本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬には、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤等の固形製剤であってもよい。
【0021】
本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬の投与方法としては、所望の神経変性疾患の予防又は治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を挙げることができる。また、本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができる。１日あたりの投与量は、上記の投与方法のうちいずれを用いるかによって異なるが、感受性の違いを踏まえ、１０～５００μｇ、好ましくは２０～１００μｇ、より好ましくは４０～６０μｇを挙げることができる。さらに、本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬を他の神経変性疾患の予防又は治療医薬と併用してもよい。本発明のタウタンパク質の凝集又はβアミロイドの蓄積に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬の投与回数や投与期間等も特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター等を例示することができ、好ましくはヒトを例示することができる。なお、ＰＭＡはすでに白血病、特に急性骨髄性白血病の治療に用いられており、例えば白血病の治療においては、患者から取り出した白血球をＰＭＡ２０μＭ及びイオノマイシンで処理したのち、患者の体内に戻す治療が定着している。
【0022】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
例示に限定されるものではない。
【実施例】
【0023】
［実施例１］
（ＰＭＡによる軸索の伸展）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまいて３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えた２群に分けてさらに３７℃で７日間培養した。７日間培養後の細胞の写真を図１に示す。
（ＰＭＡによる軸索の伸展）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ （ＤＭＥＭ）培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまいて３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えた２群に分けてさらに３７℃で７日間培養した。７日間培養後の細胞の写真を図１に示す。
【0024】
図１に示すように、ＰＭＡを加えることでヒト神経芽細胞腫の軸索が２０μｍと大きく伸展していることが明らかとなった。なお、ＤＭＳＯのみで処理のヒト神経芽細胞腫の軸索は長いものでも２～１０μｍであった。かかる結果より、ＰＭＡを投与することで、軸索を伸展することが可能であることが明らかとなった。
【0025】
［実施例２］
（ＰＭＡの濃度）
上記実施例１においては１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡを用いたが、さらに０．２、０．５、１．０、２．０ｎＭの様々な濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡを用いて、実施例１と同様に軸索の伸展を調べた。結果を図２に示す。
（ＰＭＡの濃度）
上記実施例１においては１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡを用いたが、さらに０．２、０．５、１．０、２．０ｎＭの様々な濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡを用いて、実施例１と同様に軸索の伸展を調べた。結果を図２に示す。
【0026】
図２中、横軸はＰＭＡの濃度、縦軸は軸索が細胞体の長さの５倍以上になった細胞の割合を示す。なお、軸索の長さ、細胞体の長さは図１に示すように細胞の写真に基づいて測定した。図２から明らかなように、１．０ｎＭが最適なＰＭＡ濃度であることが明らかとなった。
【0027】
［実施例３］
（ＰＭＡによるアルツハイマー病培養神経細胞モデルの神経突起の伸展）
アルツハイマー病培養神経細胞モデルとしてβアミロイドを神経細胞に添加し、軸索の伸展を調べた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を２．０×１０５となるようにまき、さらに４．０ｎＭの濃度となるように神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）を加えて３７℃で４８時間培養した。その後、１）ＤＭＳＯのみ、２）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加、３）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋１．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加、４）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋５．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加、の４群に分けてさらに４８時間培養した。培養後、３）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋１．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加場合の写真を図３に示す。また、培養後、上記１）～４）それぞれにおいて、軸索の長さが細胞体の長さの１０倍以上となっている細胞の割合を計算した結果を図４に示す。図４中、横軸はＰＭＡの濃度、縦軸は神経突起の長さが細胞体の長さの１０倍以上となっている細胞の割合（％）である。
（ＰＭＡによるアルツハイマー病培養神経細胞モデルの神経突起の伸展）
アルツハイマー病培養神経細胞モデルとしてβアミロイドを神経細胞に添加し、軸索の伸展を調べた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を２．０×１０５となるようにまき、さらに４．０ｎＭの濃度となるように神経成長因子（ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ：ＮＧＦ）を加えて３７℃で４８時間培養した。その後、１）ＤＭＳＯのみ、２）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加、３）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋１．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加、４）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋５．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加、の４群に分けてさらに４８時間培養した。培養後、３）３．０ｎＭの濃度となるようにβアミロイドを添加＋１．０ｎＭの濃度となるようにＰＭＡを添加場合の写真を図３に示す。また、培養後、上記１）～４）それぞれにおいて、軸索の長さが細胞体の長さの１０倍以上となっている細胞の割合を計算した結果を図４に示す。図４中、横軸はＰＭＡの濃度、縦軸は神経突起の長さが細胞体の長さの１０倍以上となっている細胞の割合（％）である。
【0028】
図４に示すように、ＰＭＡの存在により、たとえβアミロイドが存在していたとしても、神経突起が長く維持されている細胞割合が多いことが明らかとなった。かかる結果より、ＰＭＡを用いることで、既に細胞内にβアミロイドの蓄積により神経変性疾患を発症した患者の治療も可能である。
【0029】
［実施例５］
（ＰＭＡ処理による熱ショック転写因子の発現量の変化）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０５となるようにまき、その後１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えた２群に分けてさらに３７℃で７日間培養した。７日間培養後の細胞を回収してウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析には各レーンに３０μｇのタンパク質をアプライし、電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写されたものを解析した。ＨＳＦ１とＨＳＦ２の検出には、過去に本発明者が作製した抗ＨＳＦ１抗体と抗ＨＳＦ２抗体を用い、ＨＳＰ７０の検出にはＷ２７抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を用い、内部コントロールのベータアクチンには、Ｍ１７７－３抗体（MBL社製）を用いた。結果を図５に示す。
（ＰＭＡ処理による熱ショック転写因子の発現量の変化）
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈにヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０５となるようにまき、その後１．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えた２群に分けてさらに３７℃で７日間培養した。７日間培養後の細胞を回収してウェスタンブロット解析を行った。ウェスタンブロット解析には各レーンに３０μｇのタンパク質をアプライし、電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写されたものを解析した。ＨＳＦ１とＨＳＦ２の検出には、過去に本発明者が作製した抗ＨＳＦ１抗体と抗ＨＳＦ２抗体を用い、ＨＳＰ７０の検出にはＷ２７抗体（Santa Cruz Biotechnology社製）を用い、内部コントロールのベータアクチンには、Ｍ１７７－３抗体（MBL社製）を用いた。結果を図５に示す。
【0030】
図５に示すように、ＰＭＡで処理することにより、タンパク質レベルで熱ショック転写因子であるＨＳＦ１及びＨＳＦ２、ＨＳＰ７０の発現が増加していることが明らかとなった。ＨＳＦ１及びＨＳＦ２は活性化しても発現量は変わらないというのがこの分野の研究者のコンセンサスであるが、このデータからＰＭＡによる神経細胞保護機構はこれまでに知られたものとは異なる機構であると考えられる。
【0031】
さらに、ＲＴ－ＰＣＲ解析によりＨＳＦ１及びＨＳＦ２、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡの発現を調べた。結果を図６に示す。
【0032】
図６に示すように、ＰＭＡで処理することにより、ｍＲＮＡレベルでも熱ショック転写因子であるＨＳＦ１及びＨＳＦ２、ＨＳＰ７０の発現が増加していることが明らかとなった。また、ＨＳＰ４０、タウのｍＲＮＡも増加していることも明らかとなった。上記のように、ＨＳＦ１及びＨＳＦ２は活性化しても発現量は変わらないというのがこの分野の研究者のコンセンサスであるが、このデータからＰＭＡは少なくともＨＳＦ１及びＨＳＦ２自体の転写を活性化してＨＳＦ１及びＨＳＦ２の量そのものを増加させる機構を用いて神経細胞を保護しており、この神経細胞保護機構はこれまでに知られたものとは異なる機構であると考えられる。
【0033】
［実施例６］
（ＰＭＡ処理によるタウタンパク質を発現した軸索の伸展）
正常なタウタンパク質を発現した神経細胞、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）の原因となる変異型タウタンパク質（タウタンパク質の４０６番目のアミノ酸であるアルギニンがトリプトファンに置換）を発現した神経細胞を作製し、ＰＭＡ処理を行った。
（ＰＭＡ処理によるタウタンパク質を発現した軸索の伸展）
正常なタウタンパク質を発現した神経細胞、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）の原因となる変異型タウタンパク質（タウタンパク質の４０６番目のアミノ酸であるアルギニンがトリプトファンに置換）を発現した神経細胞を作製し、ＰＭＡ処理を行った。
【0034】
（１）正常のタウタンパク質（Ｔａｕ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株の作製
配列番号１に示す塩基配列からなるヒトのタウタンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに組み込み、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕベクターを作製した。さらに、前記ｃＤＮＡのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）のｃＤＮＡをつなげ、ＧＦＰの蛍光によって可視化出来るタウタンパク質が発現するようにした。さらに上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕ－ＧＦＰベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターに組み込んだ。
配列番号１に示す塩基配列からなるヒトのタウタンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに組み込み、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕベクターを作製した。さらに、前記ｃＤＮＡのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＧＦＰ）のｃＤＮＡをつなげ、ＧＦＰの蛍光によって可視化出来るタウタンパク質が発現するようにした。さらに上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕ－ＧＦＰベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターに組み込んだ。
【0035】
次に、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を、上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕ－ＧＦＰベクターを組み込んだｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターによってトランスフェクションし、正常タウタンパク質を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を作製した。
【0036】
（２）異常タウタンパク質（ＴａｕＲ４０６Ｗ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株の作製
上記配列番号１に示す塩基配列からなるｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法を用いて、タウタンパク質の４０６番目のアミノ酸であるアルギニンがトリプトファンに置き換わるように塩基の置換を行い、ヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡを得た。置換のためのＰＣＲに用いたフォワードプライマーの塩基配列を配列番号２に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号３に示す。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、６５℃２分、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、その後７２℃５分処理し、その後４℃とした。ポリメラーゼはＥｘ－Ｔａｑ （タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡの塩基配列を調べて正しく変異が入っていることを確認した。かかるヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに組み込み、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕＲ４０６Ｗベクターを作製し、前記ｃＤＮＡのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡをつなげ、ＧＦＰの蛍光によって可視化出来るタウタンパク質が発現するようにした。さらに上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕＲ４０６Ｗ－ＧＦＰベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターに組み込んだ。なお、配列番号１における１２４０番目の塩基は正常型では「ｃ」であるが、これが「ｔ」に変わることによってタウタンパク質の４０６番目のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に変化し（Ｒ４０６Ｗ：タウタンパク質はアイソフォームが６種類知られており、慣例によりアミノ酸番号は４４１アミノ酸型最長アイソフォームに準じる）、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）の原因となることが知られている。
上記配列番号１に示す塩基配列からなるｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法を用いて、タウタンパク質の４０６番目のアミノ酸であるアルギニンがトリプトファンに置き換わるように塩基の置換を行い、ヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡを得た。置換のためのＰＣＲに用いたフォワードプライマーの塩基配列を配列番号２に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号３に示す。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、６５℃２分、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、その後７２℃５分処理し、その後４℃とした。ポリメラーゼはＥｘ－Ｔａｑ （タカラバイオ社製）を用いた。ＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡの塩基配列を調べて正しく変異が入っていることを確認した。かかるヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ－Ｎ１ベクターに組み込み、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕＲ４０６Ｗベクターを作製し、前記ｃＤＮＡのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡをつなげ、ＧＦＰの蛍光によって可視化出来るタウタンパク質が発現するようにした。さらに上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕＲ４０６Ｗ－ＧＦＰベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターに組み込んだ。なお、配列番号１における１２４０番目の塩基は正常型では「ｃ」であるが、これが「ｔ」に変わることによってタウタンパク質の４０６番目のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に変化し（Ｒ４０６Ｗ：タウタンパク質はアイソフォームが６種類知られており、慣例によりアミノ酸番号は４４１アミノ酸型最長アイソフォームに準じる）、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）の原因となることが知られている。
【0037】
次に、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を、上記ｐＥＧＦＰ－Ｎ１－ｔａｕＲ４０６Ｗ－ＧＦＰベクターを組み込んだｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＣＭＶベクターによってトランスフェクションし、異常タウタンパク質（ＴａｕＲ４０６Ｗ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を作製した。
【0038】
（３）ＰＭＡ処理による軸索の伸展
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈに、上記で作製した正常タウタンパク質を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株、及び異常タウタンパク質（ＴａｕＲ４０６Ｗ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまき、３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭ、２．０ｎＭ又は４．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えてさらに３７℃で７日間培養した。培養後、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した。結果を図７に示す。図７中、縦軸は軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合（％）である。また、白カラムは、コントロールとして等量のＤＭＳＯを加えた場合である。
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈに、上記で作製した正常タウタンパク質を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株、及び異常タウタンパク質（ＴａｕＲ４０６Ｗ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまき、３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭ、２．０ｎＭ又は４．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えてさらに３７℃で７日間培養した。培養後、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した。結果を図７に示す。図７中、縦軸は軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合（％）である。また、白カラムは、コントロールとして等量のＤＭＳＯを加えた場合である。
【0039】
図７に示すとおり、ＰＭＡは正常タウタンパク質を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株、及び異常タウタンパク質（ＴａｕＲ４０６Ｗ）を発現するヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株のいずれにおいても軸索を伸展させることが明らかとなった。したがって、ＰＭＡの投与により、前頭側頭型認知症（ＦＴＬＤ）はもちろん、タウタンパク質が関与する神経疾患の予防又は治療が可能であることが明らかとなった。
【0040】
また、軸索は、神経細胞が他の神経細胞あるいは筋肉細胞などの他の細胞に情報を伝達する際に不可欠なものであり、この軸索の伸展が不十分であったり、あるいは変性若しくは切断により機能を失えば生物個体の行動に重篤な制限をもたらす。上記により異常神経細胞の軸索の伸展レベルを正常神経の軸索の伸展と同等までに出来ることが明らかとなり、すでに神経疾患を発症した患者に投与しても脳神経の機能を回復し症状を大幅に抑制出来る可能性がある。
【0041】
［実施例７］
（ＰＤＢｕ処理による軸索の伸展）
ホルボールエステル化合物として実施例１～６ではＰＭＡを用いたが、他のホルボールエステル化合物であるＰＤＢｕでも同様な伸展効果があるかどうかを調べた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈに、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまき、３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭ、２．０ｎＭ又は４．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＤＢｕ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えてさらに３７℃で７日間培養した。培養後、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した。結果を図８に示す。図８中、縦軸は軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合（％）である。また、白カラムは、コントロールとして等量のＤＭＳＯを加えた場合である。
（ＰＤＢｕ処理による軸索の伸展）
ホルボールエステル化合物として実施例１～６ではＰＭＡを用いたが、他のホルボールエステル化合物であるＰＤＢｕでも同様な伸展効果があるかどうかを調べた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培地を加えた６ｃｍ ｄｉｓｈに、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ－ＳＹ５Ｙ株を１．０×１０４となるようにまき、３７℃で２４時間培養した。その後１．０ｎＭ、２．０ｎＭ又は４．０ｎＭの濃度となるようにＤＭＳＯで溶解したＰＤＢｕ（Sigma-Aldrich社製）、又はコントロールとして等量のＤＭＳＯのみを加えてさらに３７℃で７日間培養した。培養後、軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合を計算した。結果を図８に示す。図８中、縦軸は軸索の長さが細胞体の長さの５倍以上となっている細胞の割合（％）である。また、白カラムは、コントロールとして等量のＤＭＳＯを加えた場合である。
【0042】
図８に示すとおり、ＰＭＡだけでなく、同じホルボールエステル化合物であるＰＤＢｕも軸索を伸展させることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【0043】
神経細胞の変性によって引き起こされる神経変性疾患全般に対する治療薬として、使用できる可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】