特許 7037940 特発性肺線維症の治療方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-09

(45)【発行日】2022-03-17

(54)【発明の名称】特発性肺線維症の治療方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20220310BHJP

   C12N 5/12 20060101ALI20220310BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220310BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220310BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220310BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20220310BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20220310BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220310BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C12N5/12

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P43/00 111

A61P11/00

A61P29/00

C12P21/08

C12N15/13

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2017549593

(86)(22)【出願日】2015-12-11

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2018-02-01

(86)【国際出願番号】 EP2015079443

(87)【国際公開番号】W WO2016092082

(87)【国際公開日】2016-06-16

【審査請求日】2018-12-11

(31)【優先権主張番号】14197374.3

(32)【優先日】2014-12-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【微生物の受託番号】DSMZ  DSM ACC3031

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】521480709

【氏名又は名称】シトリル べー．フェー．

【氏名又は名称原語表記】Ｃｉｔｒｙｌｌ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｋｌｏｏｓｔｅｒｓｔｒａａｔ ９ ＲＥ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ５３４９ ＡＢ Ｏｓｓ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100075557

【弁理士】

【氏名又は名称】西教 圭一郎

(72)【発明者】

【氏名】シーリフィ，レナート ヘラルデュス シルファーノ

(72)【発明者】

【氏名】ラーツ，ヨーゼフ マリア ヘンドリック

【審査官】山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５１３３７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５１７２９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】石神昭人，日本老年医学会雑誌，2014年07月，Vol.51, No.4，p.314-320

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

Ａ６１Ｐ ２９／００－２９／０２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＤＷＰＩ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体を含み、
前記シトルリン化エピトープは、配列番号１または配列番号２で表わされる配列を含むペプチドに存在し、
前記抗体は、配列番号５で表わされるポリペプチドを含む重鎖ＣＤＲ１ドメインと、配列番号６で表わされるポリペプチドを含む重鎖ＣＤＲ２ドメインと、配列番号７で表わされるポリペプチドを含む重鎖ＣＤＲ３ドメインと、配列番号８で表わされるポリペプチドを含む軽鎖ＣＤＲ１ドメインと、配列番号９で表わされるポリペプチドを含む軽鎖ＣＤＲ２ドメインと、配列番号１０で表わされるポリペプチドを含む軽鎖ＣＤＲ３ドメインとを含むことを特徴とする、特発性線維症の、予防または治療における使用のための組成物。

【請求項2】

脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体を含み、
前記シトルリン化エピトープは、配列番号１または配列番号２で表わされる配列を含むペプチドに存在し、
前記抗体は、受入番号ＡＣＣ３０３１としてＤＳＭＺに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体RmmAb22.101に含まれる、重鎖および軽鎖を含むことを特徴とする、特発性線維症の、予防または治療における使用のための組成物。

【請求項3】

脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体を含み、
前記シトルリン化エピトープは、配列番号１または配列番号２で表わされる配列を含むペプチドに存在し、
前記抗体は、配列番号１または配列番号２で表わされるペプチドに対する結合について、モノクローナル抗体RmmAb22.101に競合することを特徴とする、特発性線維症の、予防または治療における使用のための組成物。

【請求項4】

前記抗体は、モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医療、特に特発性線維症（ＩＰＦ）の治療のための方法および製剤の分野に属する。本発明は、選択されたシトルリン化エピトープに反応する、抗体またはそのフラグメントが、ＩＰＦの治療において使用される方法を提供する。ヒストンポリペプチドＨ２ＡおよびヒストンポリペプチドＨ４のアミノ末端に位置するシトルリン化エピトープに対する抗体は、特に有用であることが見出された。

【背景技術】

【0002】

特発性線維症（ＩＰＦ）は、病因が知られていない複合的な慢性線維増殖性肺疾患であり、発生率が上昇している。この疾患は、間質内における細胞外マトリックスの進行性蓄積によって特徴付けられる。この疾患は、３６カ月しかない推定生存期間中央値を有する進行性の不可逆性疾患である。歴史的には、免疫抑制剤（たとえば、アザチオプリン）および／またはＮ－アセチルシステインと組み合わせたコルチコステロイド（たとえば、プレドニゾロン）が妥当であると提唱されたが、ＩＰＦについての治療方法は、実証されていなかった。日本、欧州、インド、およびカナダにおいて、ＩＰＦの治療について承認された別の薬剤は、ピルフェニドンである。ピルフェニドンは、肺線維症の実験モデルにおいて、抗炎症性作用、抗酸化作用、および抗線維化作用を有する経口投与されるピリジンであるが、詳細な作用機序は知られていない。ピルフェニドンは、向上した無増悪生存期間が観察される唯一の薬剤である。現時点では、現行の治療方法がＩＰＦにおける線維化を元に戻すことが可能であることを示唆する科学的な証拠は存在しない。研究中の治療の現実的な目標は、疾患の進行速度を安定化または低下させることである。

【0003】

ＩＰＦについて良好でより効果的な治療方法が早急に必要とされていることは明らかである。

【発明の概要】

【0004】

我々は、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端に由来するペプチドにおけるシトルリン化エピトープに対する抗体が、そのような治療を必要とする患者に投与されたとき、ＩＰＦの症状を、防ぎ、回復し、または消失させることができる証拠を本明細書において提供する。同一の効果は、シトルリン残基を含む、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４に由来するＮ末端ペプチドを用いて免疫化することによって得ることができる。

【発明を実施するための形態】

【0005】

本発明に通じる実験において、我々は、ＩＰＦについて受け入れられたマウスモデルを使用した。そのモデルにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肺における線維症は、実施例１に詳述されるようにブレオマイシンの咽頭滴下によって誘導された。コントロール動物は、ＰＢＳの咽頭滴下を受けた。

【0006】

脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体は、ブレオマイシン処置された動物に投与され、ＩＰＦの症状の治療において効果的であることが示された。そのような抗体は、本明細書において、抗シトルリンタンパク質抗体と名付けられ、ＡＣＰＡと省略して記載される。

【0007】

ＡＣＰＡは、それ自体が当業者に知られたいくつもの様々な方法で得ることができる。たとえば、ＡＣＰＡは、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを含むペプチドなどの好適な抗原を用いて実験動物を免疫することによって作製され得る。そのようなペプチドの代表例は、以下の表１のアミノ酸配列、SGCitGKQGGKARA（配列番号１）、およびSGCitGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR（配列番号２）を含み得る。

【0008】

得られた抗体は、したがって、ヒストンＨ２ＡまたはヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに対するそれらの特異的な結合について試験され得る。このことは、配列番号１または配列番号２で表わされるペプチドに対する抗体の結合を、ヒストンＨ２ＡまたはヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを保持していないコントロールペプチドに対する結合と比べることによって有利に実施可能である。ヒストンＨ２ＡまたはヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを含まないペプチドの代表例は、たとえば、表１における、アミノ酸配列SGRGKQGGKARA（配列番号３）、およびアミノ酸配列SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR（配列番号４）を含むペプチドである。

【表1】

【0009】

脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに対する抗体の結合は、当該抗体が、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに結合するが、ヒストンＨ２ＡまたはヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを含まないコントロールペプチドに対して低い親和性で結合する場合、特異的であると考えられる。本明細書において、低い親和性は、たとえば、７５％、９０％、９５％、または９５％よりも低い、少なくとも５０％よりも低い結合を意味する。より好ましくは、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに対する抗体の結合は、容易に検出可能であるのに対して、シトルリン残基が、アルギニン残基によって置換される、同一アミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体の結合は、検出できない。

【0010】

本明細書に開示された特異的反応性抗体（RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102、およびMQ22.101b/d）は全て、配列番号１または配列番号２で表わされるペプチドに反応し、それらは、配列番号３または配列番号４のペプチドに結合しないことが見出された。これらの抗体は、ＷＯ２０１１／０７０１７２、およびＷＯ２００９／１４７２０１にも開示された。

【0011】

マウルモノクローナル抗体Rmmab22.101（本明細書において、MQ22.101と省略して記載される）は、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に結合する抗体のクラスを表すモデル抗体として選択された。

【0012】

MQ22.101抗体の治療活性は、以下のように評価された。ブレオマイシン処置マウスは、１ｍｇのモノクローナル抗体MQ22.101、またはModiQuest Research社から得た１ｍｇのアイソタイプ同一コントロール抗体MQ20.101（カタログ番号MQ20.101）を含む腹腔内注入を受けた。

【0013】

モノクローナル抗体は、０日目、２日目、および５日目に動物に投与された。全ての動物の体重は、０日目から１４日目まで一日おきに評価された。動物の体重減少は、疾患の重症度の尺度として扱われた。

【0014】

我々は、ブレオマイシン＋MQ20.101を用いて処置されたマウスが、全期間にわたって徐々に体重を減らし、全く体重が減少しなかったＰＢＳ処置コントロール動物と比べて、１４日目において体重が３２％減少したことを観察した（図１）。MQ22.101処置群において、我々は、動物が、大幅な体重減少から保護され、６日目において最大１７％の体重減少であり、その後、全期間にわたって体重が徐々に増加することを見出した（０日目に比べて１４日目において１０％体重減少）。

【0015】

ブレオマイシン滴下後またはＰＢＳ滴下後、２週間、または３週間で、マウスは、イソフルラン麻酔下における頸椎脱臼によって屠殺され、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液が収集された。肺は、固定され、パラフィン包埋され、切片は、炎症／線維症の量を評価するためにマッソン染色された（図２）。

【0016】

我々は、ブレオマイシン＋MQ20.101処置マウスが、線維症の徴候を全く示さなかったコントロールマウス（ＰＢＳ処置）の肺と比べて、肺に存在する大量の線維化組織を有することを観察した。MQ22.101は、肺における炎症応答、したがって線維化からブレオマイシン処置マウスを保護することができた（図２）。

【0017】

ＢＡＬにおける総タンパク質量は、肺損傷の尺度である。ブレオマイシン＋MQ20.101処置マウスに由来するＢＬＡ液は、生理食塩水、およびMQ22.101処置マウスと比べて、それぞれ４倍および２倍多いタンパク質を含んでいた（図３Ａ）。また、総細胞数、および細胞百分率（好中球、マクロファージ、およびリンパ球）が、ＢＡＬ液中で測定された。細胞の総数は、生理食塩水処置マウスおよびMQ22.101処置マウスに比べて、ブレオマイシン＋MQ20.101処置マウスにおいて顕著に増加した（図３Ｂ）。細胞百分率を見ると（図３Ｃ～図３Ｅ）、最も著しい相違は、好中球で見出され、ブレオマイシン＋MQ20.101処置マウスは、２０％好中球を含んでいたのに対して、生理食塩水処置され、MQ22.101処置されたマウスに由来するＢＡＬにおける好中球の割合は、０％に近かった（図３Ｃ）。

【0018】

上述の実験は、実施例２に記載されたようにいくらか軽度に修正され、MQ22.101のヒト化バージョンを用いて繰り返された。MQ22.101のヒト化バージョン、MQ22.101b/dの作製は、実施例７に記載されている。MQ22.101の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）フラグメントは、ヒトＩｇＧ１カッパ主鎖にクローン化された。ＶＨおよびＶＬドメインは、その後、ＣＤＲ移植法によってヒト化された。表２は、ＩＭＧＴ（http://www.imgt.org/）に従って、ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３ポリペプチド（配列番号５、６、および７）、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２、および３ポリペプチド（配列番号８、９、および１０）を示す。

【0019】

実施例２に記載された実験において、肺における炎症および線維症の組織病理学的分析は、Madtesスコアリング（Madtes DK et al., A J Respir Cell Mol Biol 20, 924-934, 1999）を用いて評価された。MQ22.101抗体と、そのヒト化対応物MQ22.101b/dのみが、コントロール抗体MQ20.101およびMQR2.101に比べて、肺における炎症および線維症を減少させた（図４）。ModiQuest Research社から得られたMQR2.101（カタログ番号MQ20.101）は、MQ22.101b/dについてのアイソタイプ同一コントロール抗体である。

【表2】

【0020】

ＡＣＰＡ、および特にMQ22.101、およびそのヒト化対応物MQ22.101b/dは、肺における、炎症および線維症からマウスを保護すると結論付けられた。

【0021】

本明細書において選択されたモデルシステムは、ＩＰＦのヒトバージョンを表すので、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープに特異的に反応する抗体は、特発性肺線維症の、予防または治療において使用することができると結論付けられる。

【0022】

上述されたような受動療法的ワクチン投与（抗体の投与）における使用に次いで、本発明は、それを必要とする患者におけるｉｎ ｖｉｖｏの免疫応答を誘導することによっても実施可能である。その目的のために、我々は、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａまたは脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを含むペプチドを使用した。そのようなペプチドは、マウスに皮下投与（能動療法的ワクチン投与）され、受動的に免疫されたマウスにおいて見出された力価と同じ、マウスにおける特異的ＡＣＰＡ力価を得た。そのようなマウスは、もはやブレオマイシン滴下に応答せず、それらの受動的免疫対応物と同じ症状の消失を示した。

【0023】

本明細書において、用語「シトルリンに特異的に反応する」、または「シトルリン化エピトープに反応する」、または「シトルリンエピトープに特異的に反応する」は、シトルリン残基を含むペプチドなどの構造に反応するが、シトルリン残基の代わりにアルギニン残基を含む同一構造に、あまり反応しないか、または好ましくは全く反応しない、抗体または抗体フラグメントを表す。ペプチドとの用語は、本明細書において、本明細書に記載されたような抗体との免疫応答性の適切な文脈において、好ましくは、人体または動物体において現れるような同一の文脈において、好ましくは、天然ポリペプチドの文脈において、シトルリン残基を有することができる構造として解釈されるべきである。天然抗体（イムノグロブリンとしても知られている）は、血中、または脊椎動物の他の体液に見出され得る、ガンマグロブリンタンパク質であり、細菌およびウイルスなどの外来物を、特定および中和するための免疫システムによって使用される。

【0024】

天然抗体は、典型的には基本的構造ユニットからなっており、２つの大きな重鎖と２つの小さな軽鎖とを有し、たとえば、１つのユニットを有するモノマー、２つのユニットを有するダイマー、または５つのユニットを有するペンタマーを形成する。抗体は、Ｂ細胞と称される白血球によって産生される。様々な種類の重鎖が存在し、様々な種類の抗体をもたらす。抗体は、それらが保持する重鎖に基づいて異なるアイソタイプに分類することができる。５つの異なる抗体アイソタイプが哺乳類において知られており、それらは異なる役割を果たし、それらが遭遇する様々な種類の各外来物に適した免疫応答を直接に補助する。ラクダ（たとえば、リャマ）、およびサメなどのいくつかの動物種は、異常な抗体構造を有し得る。

【0025】

全ての抗体の一般的な構造は、非常に似通っているが、タンパク質の先端における小さな領域は、非常に変わりやすく、わずかに異なる先端構造を有する数百万の抗体が存在することを可能にする。この領域は、高頻度可変領域として知られている。これらの各変異体は、抗原として知られる異なる標的に結合することができる。抗体のこの広範な多様性は、免疫系が、抗原の等しく広い多様性を認識することを可能にする。

【0026】

抗体によって認識される抗原の特有部分は、エピトープと称される。これらのエピトープは、抗体が、生物体を構成する数百万の様々な分子の中でそれらの特有の抗原のみを特定し結合することを可能にする高度に特異的な相互作用でそれらの抗体に結合する。抗体による抗原の認識は、免疫系の他の部分による攻撃のために抗原を標識する。抗体は、たとえば、感染をもたらすために必要な、病原体の一部に結合することによって標的を直接に中和することもできる。

【0027】

抗体の多くの多種多様な集団は、様々な抗原結合部位（またはパラトープ）をコードする遺伝子セグメントのセットのランダムな組み合わせ、それに続いてさらなる多様性をもたらす抗体遺伝子のこの領域のランダム変異によって生じる。抗体遺伝子は、重鎖の基礎を別のものに変化させるクラススイッチングと称される処理において再編成され、抗原特異的可変領域を保持する抗体の様々なアイソタイプをもたらす。このことは、単一の抗体が、免疫系のいくつかの異なる部分によっていくつかの異なるアイソタイプで使用されることを可能にする。

【0028】

本明細書において使用されるような「複数の抗体」または「抗体」との用語は、構造、好ましくはタンパク質またはポリペプチド構造であって、多くの場合に「抗原」と表わされる標的分子に特異的に結合することができる構造をいう。

【0029】

抗体は、一本鎖抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）、フラグメント抗原結合領域（Ｆａｂｓ）、組み換え抗体、モノクローナル抗体、天然抗体もしくはアプタマーの抗原結合ドメインを含む融合タンパク質、ＶＨＨ抗体、ナノボディ（ラクダ由来のシングルドメイン抗体）、およびＶＮＡＲと称されるシングルドメイン抗体フラグメントに由来するサメＩｇＮＡＲとしても知られているシングルドメイン抗体（ｓｄａｂｓ）、またはそれらのフラグメント、もしくはそれらの一部からなる群から選択され得る。

【0030】

別の好ましい実施形態において、抗体は、天然抗体の抗原結合ドメインを含む融合タンパク質である。

【0031】

抗体または他の特異的結合分子との関連で「またはそれらの一部」または「それらのフラグメント」との用語は、抗体、または特異的結合分子の特異的結合部位を構成する、抗体または特異的結合分子の一部を表すことを意図されており、抗体全体、または特異的結合分子全体と同一のエピトープと反応することができる、抗体、または特異的結合分子の一部と解釈されてもよい。

【0032】

それらのヒト抗体、またはそれらのフラグメントは、本発明の好ましい実施形態である。好ましくは、ＩｇＧ１重鎖と、ラムダ軽鎖またはカッパ軽鎖とを有するＩｇＧ１抗体は、有利に使用可能である。しかしながら、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖と組み合わせた、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、およびＩｇＥなどの他のヒト抗体アイソタイプも、本発明に包含される。また、様々なアイソタイプの全ての動物由来の抗体が、本発明において使用可能である。抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖Ｆｖフラグメント、またはシングルドメインＶＨＨ、ＶＨ、もしくはＶＬシングルドメインなどの、全長抗体、または抗体の抗原結合フラグメントであってもよい。

【0033】

「シトルリン化エピトープに反応する抗体」との用語は、ペプチド、またはペプチド核酸、またはペプチド模倣構造体などの大きな構造との関連において、シトルリン残基に特異的に反応する抗体として解釈されるべきである。

【0034】

シトルリンは、通常の翻訳の間にタンパク質に組み込まれないが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によるアルギニン残基の翻訳後修飾によって生じ得るアミノ酸である。

【0035】

シトルリン化は、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）によって触媒される、シトルリン残基へのアルギニン残基の翻訳後変換である。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ；ＥＣ３．５．３．１５）酵素は、タンパク質において、シトルリン残基へのアルギニン残基の変換を触媒する。ｔＲＮＡはシトルリンに存在せず、タンパク質中のシトルリン残基の存在は、もっぱら翻訳後修飾の結果である。哺乳類（ヒト、マウス、およびラット）において、それぞれ異なる遺伝子によってコードされる５つのＰＡＤアイソタイプ（ＰＡＤ１～ＰＡＤ６；「ＰＡＤ４」および「ＰＡＤ５」は、同一アイソタイプに使用される）が同定された（Vossenaar et al, Bioessays 25, 1106-1118, 2003）。全てのこれらの酵素は、活性についてＣａ２＋の存在に強く依存し、遊離のＬ－アルギニンを遊離Ｌ－シトルリンに変換することができない。遊離のＬ－アルギニンは、真核生物において一酸化窒素合成酵素（ＥＣ１．１４．１３．３９）によって、または細菌においてアルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）によって、遊離のＬ－シトルリンに変換可能である。これらの酵素は、Ｃａ２＋依存的ではない。

【0036】

高度に相同的なＰＡＤ酵素の間における最も顕著な相違点は、それらの組織特異的発現である。表皮において、ＰＡＤ１（同義語：ＰＡＤ Ｉ、ＰＡＤ Ｉ型）は、ケラチノサイト分化の最終段階の間におけるケラチンフィラメントのシトルリン化に関与し、これは、角化膜の再構築に重要である。表皮におけるシトルリン化の別の部位は、ＰＡＤ３（同義語 ＰＡＤ ＩＩＩ、ＰＡＤ ＩＩＩ型）と、その天然基質のトリコヒアリン（ＴＨＨ）とを含む毛包である。ＴＨＨは、内毛根鞘細胞と毛包の髄質層との主な構造タンパク質であり、それほどではないが、他の特定上皮の主な構造タンパク質である。ごく最近特定されたＰＡＤアイソタイプである、ＰＡＤ６（同義語：ｅＰＡＤ）は、初期の胚形成において重要な役割を果たす、マウス卵母細胞の細胞質シートにおいて見出された。そのヒトオルソログの発現は、卵巣、精巣、および末梢血白血球細胞に限定されることが見出された（Chavanas et al., Gene 330; 19-27, 2004）。元来、このＰＡＤアイソタイプは、ｅＰＡＤと命名されたが、他のＰＡＤの体系的な番号付けに基づいて、このアイソタイプは、ＰＡＤ６に改名された（Vossenaar et al., Bioessays 25 1106-1118, 2003）。最も広く発現されるアイソタイプであるＰＡＤ２（同義語 ＰＡＤ ＩＩ、ＰＡＤ ＩＩ型、ＰＡＤ－Ｈ１９）は、骨格筋、脳、脾臓、分泌腺、およびマクロファージなどの多くの様々な組織に存在する。この広い発現パターンにもかかわらず、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびビメンチンのみが、天然の基質として同定された。多発性硬化症（ＭＳ）において、患者は、ＭＢＰに対する自己免疫応答を生じる。ＭＢＰは、ミエリン鞘の豊富なタンパク質であり、そのシトルリン化は、中枢神経系の発生の間に生じる。ビメンチンのシトルリン化は、上述されたように、ヒトマクロファージおよびマウスマクロファージのカルシウムイオノフォア誘導アポトーシスの間に観察され、シトルリン化ビメンチンは、ＲＡ特異的な抗Ｓａ自己抗体の標的であることが示された。細胞の細胞質に主に局在する上述のＰＡＤに対して、ＰＡＤ４アイソタイプ（同義語： ＰＡＤ ＩＶ、ＰＡＤ ＩＶ型、ＨＬ－６０ ＰＡＤ、ＰＡＤ Ｖ、ＰＡＤ Ｖ型、ＰＡＤＩ４）は、核に局在する。ＰＡＤ４の核局在シグナルは、タンパク質のＮ末端領域に見出された。ＰＡＤ４は、末梢血中の、顆粒球および単核球において主に発現される。核内におけるＰＡＤ４の基質は、ヒストンコアタンパク質（Ｈ２Ａ、Ｈ３、およびＨ４）、ならびにリボソームアセンブリ、核細胞質間輸送、および中心体複製において機能する核小体タンパク質であるヌクレオフォスミン／Ｂ２３である。

【0037】

また、本明細書に開示されたようなモノクローナル抗体と競合する抗体は、本発明において有利に使用可能である。そのような競合抗体は、標準的な手順によって選択されてもよい。要するに、脱イミノ化ヒストンＨ２Ａ、または脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端におけるシトルリン化エピトープを含むペプチドが、固体支持体に固定化されるＥＬＩＳＡのような結合アッセイが開発されてもよい。本明細書に開示されたようなモノクローナル抗体は、標識されてもよく、固定化された抗原に対するそれらの結合との干渉は、通常の分析によって容易に決定可能である。これらのような、より洗練された方法は、当業者に周知であり、通常の実験室条件において規定通りに実施可能である。

【0038】

特に、アッセイは、固体支持体上に固定化された、配列番号１または配列番号２で表わされる抗原ペプチドのいずれかを用いて容易に開発することができる。RhmAb2.102、RhmAb2.108、RhmAb2.109、RhmAb2.110、RhmAb2.111、RhmAb2.112、MQ22.101、MQ22.102、およびMQ22.101b/dからなる群から選択されたモノクローナル抗体は、試験抗体の有無に関わらず、標識され、固定化抗原に接触可能である。試験抗体が、結合に干渉する、すなわち、標識化抗体のいずれかを用いて得られるシグナルを低下させる場合、試験抗体は、標識化抗体の結合に競合すると結論付けることができる。そのような競合抗体は、当該競合抗体が、シトルリン残基がアルギニン残基によって置き換えられた同一配列を有するペプチドと反応しないとすれば、本発明の方法における使用に適したものであろう。

【0039】

本発明に係る使用のための抗体は、実質的に２つの方法で作製可能である。第１に、それらは、上述の抗体、および本明細書に示されたようなその配列に由来してもよい。抗体の反応性は、部位特異的突然変異誘発、Chainシャフリング、セクシャルＰＣＲによって、または当業者に公知の抗体誘導および最適化のための他の手段によってさらに向上されてもよい。また、抗体は、本明細書に記載されたような任意の特異的反応性エピトープ、特に、脱イミノ化ヒストン２Ａ、配列番号１または配列番号２で表わされる配列を含むペプチド、および他の特異的反応性ペプチドを用いてパニングすることによって得ることが可能である。

【0040】

当業者は、たとえば、以下の実施例に記載されたような、ｃＤＮＡまたはゲノム配列をクローンまたは作製するために本明細書に記載された配列を使用可能である。ｐｃＤＮＡ３（In Vitrogen社）のような好適な真核生物発現ベクター、またはそれらの誘導体へのこれらの配列のクローニングと、それに続く好適な軽鎖と重鎖との組み合わせを含むベクターを用いる哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞など）のトランスフェクションとは、必要な抗体の発現および分泌をもたらすであろう。

【0041】

マウスモノクローナル抗体MQ22.101は、寄託されたそれらの各ハイブリドーマ細胞株（DSMZ番号 ACC 3031）によって、直接に発現および分泌されてもよい。

【0042】

当業者は、抗体配列の特異的結合ドメインを用いることによって、本明細書に記載されたような特異的結合分子のアナログを作製し、融合タンパク質などのポリペプチドのような異なる状況でそれらを発現させることも可能である。このことは、当該分野において周知である。

【0043】

本明細書および特許請求の範囲において、動詞「含む」と、その語形変化とは、その語句に続く事項が含まれることを意味するようにその非限定的な意味で使用されるが、特に言及されない事項は、除外されない。また、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、前後の文脈が、１およびただ１つの要素が存在することを明確に要求しない限り、１以上の要素が存在する可能性を除外するものではない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、したがって、通常「少なくとも１つ」を意味する。

【0044】

理論に束縛されることを望むものではないが、我々は、MQ22.101と、そのヒト対応物とが、好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）において脱イミノ化ヒストンを標的とし、それによって活性を抑制することによって炎症経路を阻害することができるので、炎症性好中球の流入を阻害することができると仮説を立てた。ＮＥＴは、炎症に関与するだけではなく、繊維芽細胞分化におけるそれらの影響によって後の線維症に関与するので、本発明に係る抗体治療のための魅力的な標的となることが、Chrysanthopoulouらによって示された（J Pathol 233, 294-307, 2014）。本発明に係る抗体治療は、重大な有害作用を有さないので、免疫系、または他の一般的なハウスホールディング経路を妨害しない。

【実施例】

【0045】

実施例１：線維症のための実験動物モデル
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～８週齢）は、Jackson Laboratory社から購入された。全てのマウスは、病原菌フリー条件下で維持され、自由に飼料および水を与えられた。肺損傷は、マウスが８～１０週齢（体重１９～２１ｇ）のとき、０日目において、ブレオマイシンの咽頭滴下（０．０４５ユニット／マウス）によって誘導された。コントロール動物は、ＰＢＳの咽頭滴下を受けた。０日目、２日目、および５日目において、１ｍｇのMQ22.101、または１ｍｇのコントロール抗体MQ20.101を含む咽頭滴下を受けた（無関係のアイソタイプ同一コントロール抗体）。全ての動物の体重は、０日目から１４日目まで一日おきに評価された（図１）。

【0046】

ブレオマイシン滴下またはＰＢＳ滴下の２週間後および３週間後、マウスは、イソフルラン麻酔下における頸椎脱臼によって屠殺され、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液が集められた。肺は、固定化され、パラフィン包埋され、切片は、炎症／線維症の量を評価するためにマッソン染色された。タンパク質含有量と、総細胞数、および細胞百分率（好中球、マクロファージ、およびリンパ球）とは、ＢＡＬにおいて測定された。タンパク質含有量が測定され、総細胞数および細胞百分率は、ＢＡＬ液を用いてサイトスピンを実施し、細胞を染色し、それらの形態に基づいて異なる細胞種を計数および特定することによって評価された（図３）。

【0047】

実施例２：確認実験
実施例１において得られた結果は、わずかに変更された実験設定の別の独立した実験で確かめられた。

【0048】

雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（到着時１９～２１グラム）は、Charles River社から購入された。全てのマウスは、病原体フリー条件下において維持され、飼料および水を自由に与えられた。肺損傷は、マウスが８～１０週齢（体重１９～２１ｇ）のとき、０日目において、ブレオマイシンの鼻腔内投与によって誘導された。ブレオマイシン硫酸塩は、ブレオマイシンの０．４ｍｇ／ｍＬの濃度に達するために０．９％ＮａＣｌ溶液に溶解され（１０ｍｇ／２５ｍｌ）、続いて１ｍｌの一定分量に分けられ、－２０℃において保存された。投与のためのブレオマイシン溶液の用量は、５０μｌ／マウスである。コントロール動物は、ＰＢＳの鼻腔内投与を受けた。ピルフェニドンは、ブレオマイシン誘導肺線維症動物モデルにおいて、肺線維症に対する確立した治療として使用されてきた。毎朝、ピルフェニドンの一日量は、ピルフェニドンの適量を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩に溶かすことによって作製された。投与量は、体重あたり１０ｍＬ／ｋｇである。ピルフェニドンは、２回の投与間において７．５時間間隔で１日２回経口投与された。週末の間、マウスは、朝に一日量の全てを受けた。

【0049】

処置：０日目、２日目、および５日目において、ブレオマイシン処置群は、１ｍｇのマウス抗体MQ22.101、１ｍｇのマウス抗体「MQ20.101」（無関係のアイソタイプ同一コントロール抗体）、またはＰＢＳを含む腹腔内注入を受けた。２群のさらなるブレオマイシン処置群は、２日目および５日目において、１ｍｇのヒト化MQ22.101（MQ22.101b/d)、または１ｍｇのヒト「MQR2.101」（ヒトコントロール抗体）を受けた。MQR2.101は、コントロール抗体である。ピルフェニドンは、０日目～１３日目まで毎日投与された。ブレオマイシン滴下またはＰＢＳ滴下の２週間後、マウスは、ケタミン塩酸塩（Narketan）およびキシラジン塩酸塩（Rompun）の過剰量投与によって安楽死させられた。肺は、組織病理学的分析のために１０％緩衝ホルマリンを用いて固定された（Ｍａｄｔｅスコア：表３および表４）。

【0050】

組織病理学的評価のために、肺全体は、パラフィン包埋され、マロリーに従って染色された。肺の組織学的な変化は、Ｍａｄｔｅスコアリング法を用いて評価された（Madtes DK et al. Am J Respir Cell Mol Biol 20: 924-934, 1999）。Ｍａｄｔｅスコアシステムは、線維化パラメータおよび炎症パラメータを取り入れている（表３および表４；図４）。１０の弱拡大視野（ＬＰＦ、すなわち、５０×拡大率）は、炎症スコアスキームに従って炎症について調べられ（表３を参照）、線維症スコアスキームに従って線維症について調べられた（表４を参照）。スクリーニング領域は、左右の肺葉を覆った：左肺（４×ＬＰＦ）、および右肺（前葉 ２×ＬＰＦ、後葉 ２×ＬＰＦ、中葉 １×ＬＰＦ、および副葉 １×ＬＰＦ）。各動物について、最終スコアは、１０のＬＰＦの中央値として計算された。

【表3】

【表4】

【0051】

実施例３：ＡＣＰＡの作製
脱イミノ化ヒストンＨ２Ａ、または脱イミノ化ヒストンＨ４のＮ末端のシトルリン化エピトープを含むペプチドに対する抗体は、ＷＯ２０１１／０７０１７２に以前記載されたように、ＤＢＡ／Ｊ１マウスにおいて、配列番号１および配列番号２で表わされるペプチドを用いてマウスを免疫することによって産生された。

【0052】

簡潔には、免疫処理の開始後１２５日目において、血清試料が採取され、シトルリン特定抗原応答について分析された。これは、配列番号１で表わされるペプチドを抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて得られたシグナルを、配列番号３で表わされるペプチドを抗原として用いるＥＬＩＳＡと比較することによって実施された。全てのマウスは、試験された時点において特異的抗原に特異的な血清力価を示した。

【0053】

ハイブリドーマ細胞株を作製するために、脾臓は、最後の追加免疫後に解剖され、脾細胞は、脾臓から採取され、標準的な手順に従ってマウスミエローマ細胞株（ＮＳ－１）と融合された。ハイブリドーマ上清に特異的な抗体は、シトルリン含有抗原と非シトルリン化等価物とにおいて選別された。

【0054】

このことは、MQ22.101を産生するハイブリドーマクローンをもたらした（ＤＳＭＺ受入番号ＡＣＣ３０３１）。それぞれ配列番号１１および配列番号１２で表わされる重鎖および軽鎖の後続のシークエンシング。

【0055】

実施例４：ＡＣＰＡのエピトープマッピング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩ニュートラアビジン（０．１μｇ／ウェル）を用いて被覆された。ウェルは、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ－Ｔ）を用いて５回洗浄され、ＰＢＳ－Ｔ ＋ １％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間インキュベートすることによってブロックされた。ＰＢＳ－Ｔを用いてさらに５回洗浄後、ウェルは、シトルリン由来のヒストンＨ２Ａと、ビオチンを含む配列番号１および配列番号２で表わされるペプチド（０．３μｇ／ウェル）を用いてＲＴで１時間インキュベートされた。全ての使用されたペプチドは、遊離のＮ末端ＮＨ２基を含むものであった。ＰＢＳ－Ｔを用いてさらに５回洗浄後、ウェルは、１０μｇ／ウェルの濃度で始まる、ＰＢＳ－Ｔ ＋ １％ＢＳＡ中のMQ22.101またはMQ22.101b/dの連続希釈を用いてＲＴで１時間インキュベートされた。ウェルは、ＰＢＳ－Ｔを用いて５回洗浄され、ＲＴで１時間にわたってウサギ抗ヒトＨＲＰ（１：２０００）とともにインキュベートされ、ＰＢＳ－Ｔを用いて５回洗浄され、ＰＢＳを用いる３回洗浄工程を行われた。ウェルは、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止する前に、ＴＭＢ基質を用いて５分間インキュベートされた。光学密度は、４５０ｎｍで測定され、使用された抗体の親和性の尺度とされた。

【0056】

MQ22.101およびMQ22.101b/dは、ヒストンＨ２ＡのＮ末端シトルリン化ペプチド（配列番号１）に結合したが、アルギニンを含むペプチドには結合しなかった（配列番号３）。ヒストンＨ４のＮ末端シトルリン化ペプチド（配列番号２）へのMQ22.101およびMQ22.101b/dの結合は、同様の結果を示した。

【0057】

実施例５：シトルリン含有ペプチドを用いるワクチン投与は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて防御免疫応答を生じる。
免疫応答は、配列番号１または配列番号２のシトルリン残基を含む合成ヒストンペプチドに対して、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス（到着時１９～２１グラム）において誘導された（表１）。５７日目と８０日目との間において、免疫処理の開始後、血清試料は、採取され、シトルリン含有ペプチド特異的な抗原応答について分析された。シトルリンを含む配列番号１および／または配列番号２で表わされるペプチドに反応するが、アルギニンを含む配列番号３および配列番号４で表わされるペプチドには反応しない特異的抗原血清力価を示すマウスは、実施例１に説明されたようにブレオマイシンの咽頭滴下によって肺損傷を誘導するために使用された。全ての動物の体重は、０日目から始まり２１日目まで一日おきに評価された。

【0058】

ブレオマイシン滴下またはＰＢＳ滴下の２週間後、および３週間後、マウスは、イソフルラン麻酔下における頸椎脱臼によって屠殺され、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液が集められた。肺は、固定化され、パラフィン包埋され、切片は、炎症／線維症の量を評価するためにマッソン染色された。タンパク質含有量と、総細胞数および細胞百分率（好中球、マクロファージ、およびリンパ球）は、ＢＡＬにおいて測定された。タンパク質含有量が測定され、総細胞数および細胞百分率は、ＢＡＬ液を用いてサイトスピンを実施し、細胞を染色し、それらの形態に基づいて様々な細胞種を計数および特定することによって評価された。

【0059】

これらのマウスの臨床パラメータの結果は、ＡＣＰＡ抗体MQ22.101を用いて受動的に免疫されたマウスと同一でない場合、同等であった。

【0060】

実施例６：ＡＣＰＡの検出アッセイ
治療特性を有する複数の抗体を識別するアッセイは、固体支持体上に固定化された、配列番号１または配列番号２で表わされる抗原タンパク質を用いて容易に開発可能である。たとえば、MQ22.101（または治療特性を有する他のＡＣＰＡ）は、標識され、試験抗体の有無に関わらず固定化抗原に接触させることができる。試験抗体が、結合を阻害する、つまり標識化M Q22.101によって得られるシグナルを低下させる場合、試験抗体は、標識化MQ22.101の結合と競合すると結論付けることができる。そのような競合抗体は、したがって、当該競合抗体が、シトルリン残基がアルギニン残基に置き換えられた同一配列（配列番号３、および配列番号４）を有するペプチドに反応しないとすれば、本発明の方法における使用に好適である。

【0061】

実施例７：MQ22.101b/dの作製
ハイブリドーマMQ22.101に由来する可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）フラグメントは、ＲＴ－ＰＣＲによって得られ、ヒトＩｇＧ１とヒトカッパ定常ドメインとを含む発現ベクターにクローン化された。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、続いて、ＣＤＲグラフティングによって、ヒト化および生殖系列化（germlined）された。表２は、ＶＨ ＣＤＲ１、２、および３ポリペプチド（配列番号５、６、および７）と、MQ22.101b/dに由来する、ＶＬ ＣＤＲ１、２、および３ポリペプチド（配列番号８、９、および１０）を示す。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】誘導肺線維症モデルは、MQ22.101の体重減少における影響を試験するために使用された。０日目において、マウスは、ＰＢＳ（菱形）、またはブレオマイシン（０．０４５ユニット／マウス）（三角および四角）の咽頭滴下を受けた。０日目、２日目、５日目において、マウスは、１ｍｇのMQ22.101（三角）、１ｍｇのコントロール抗体MQ20.101（四角）、またはＰＢＳ（菱形）を用いて腹腔内処置された。動物は、０日目から始まって１４日目まで一日おきに体重を測定された。

【図2】ブレオマイシン誘導肺線維症モデルは、肺炎症／線維症の予防におけるMQ22.101の効果を試験するために使用された。 図２ａおよび図２ｂに示される実験において使用されたマウスは、０日目においてＰＢＳの咽頭滴下を受けたが、図２ｃ～図２ｆに示される実験において使用されたマウスは、ブレオマイシンの咽頭滴下を受けた（０．０４５ユニット／マウス）。０日目、２日目、および５日目において、図２ｃ～図２ｄのマウスは、１ｍｇのMQ22.101を用いて腹腔内処理され、図２ｅ～図２ｆのマウスは、１ｍｇのコントロール抗体MQ20.101を用いて腹腔内処理された。マウスは、１４日後（図２ａ、図２ｃ、および図２ｅ）、または２１日後（図２ｂ、図２ｄ、および図２ｆ）に屠殺され、肺は固定され、パラフィン包埋され、切片は、炎症／線維症の量を評価するためにマッソン染色された。

【図3】各実験群の２匹のマウスに由来するＢＡＬ液は、タンパク質含有量（図３ａ）、および細胞含有量（図３ｂ～図３ｅ）を測定するために得られた。ＢＡＬ液を集めるために、カニューレは、肺が３倍体積のＰＢＳ（総体積１ｍＬ）を用いて洗浄された後、予め準備された気管に挿入された。タンパク質含有量が測定され、総細胞数、および細胞百分率は、ＢＡＬ液を用いてサイトスピンを実施し、細胞を染色し、計数し、それらの形態に基づいて細胞の種類を特定することによって評価された。

【図4】ブレオマイシン誘導性肺線維症モデルは、肺における炎症および線維症に対するMQ22.101およびMQ22.101b/dの影響を試験するために使用された。０日目において、マウスは、ブレオマイシンの咽頭滴下を受けた。０日目、２日目、および５日目において、ブレオマイシン処置群は、１ｍｇのマウス抗体MQ22.101、１ｍｇのマウス抗体MQ2 0.101（無関係のアイソタイプ同一コントロール抗体）、またはＰＢＳを含む咽頭滴下を受けた。さらなる２群のブレオマイシン処置群は、１ｍｇのヒト化MQ22.101（MQ22.101b/d）、または１ｍｇのヒト抗体MQR2.101（ヒトコントロール抗体）を２日目および５日目に受けた。MQR2.101は、コントロール抗体である。ピルフェニドンは、０日目から１３日目まで毎日投与された。ブレオマイシン滴下、またはＰＢＳ滴下の２週間後、マウスは、ケタミン塩酸塩（Narketan）、およびキシラジン塩酸塩（Rompun）の過剰量投与によって安楽死させられた。肺は、計量され、病理組織学的分析のために１０％緩衝ホルマリンを用いて固定された。Madtesスコアリングは、表３および表４に従って実施された。スコア：０～１０。 ^*p<0.05 ベヒクルに対して、マン・ホイットニー検定。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4】

【配列表】

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