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▶ バイオマーク キャンサー システムズ インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-09
(45)【発行日】2022-03-17
(54)【発明の名称】肺癌を検出するためのバイオマーカーパネル
(51)【国際特許分類】
G01N 33/574 20060101AFI20220310BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220310BHJP
【ＦＩ】
G01N33/574 A
G01N33/68
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2018518760
(86)(22)【出願日】2016-06-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2018-08-16
(86)【国際出願番号】 CA2016050758
(87)【国際公開番号】W WO2016205960
(87)【国際公開日】2016-12-29
【審査請求日】2019-06-24
(31)【優先権主張番号】62/185,213
(32)【優先日】2015-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】517452707
【氏名又は名称】バイオマーク キャンサー システムズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＡＲＫ ＣＡＮＣＥＲ ＳＹＳＴＥＭＳ ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ １６５ － １０５５１ Ｓｈｅｌｌｂｒｉｄｇｅ Ｗａｙ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ
(74)【代理人】
【識別番号】100130111
【弁理士】
【氏名又は名称】新保 斉
(72)【発明者】
【氏名】ブクス、ラシド
(72)【発明者】
【氏名】シター、ダニエル
【審査官】三好 貴大
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１２－２３３９０２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００４／０８１５６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１２／１２７９８４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】DUARTE, F. I. et al.，Metabolic profiling of biofluids: potential in lung cancer screening and diagnosis，Expert Review of Molecular Diagnostics，2013年，13, 7，737-748
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
肺癌を検出するための尿検査のためのバイオマーカーパネルであって、前記バイオマーカーパネルが、ＤＭＡを含む第１のバイオマーカー、およびＣ５：１、Ｃ１０：１、ＡＤＭＡ、Ｃ５－ＯＨ、ＳＤＭＡ、およびキヌレニン、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択される少なくとも第２のバイオマーカーを検出する、バイオマーカーパネル。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ポリアミン代謝産物およびその他の代謝産物を測定することにより、癌を検出する方法、特に、肺癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ポリアミン経路は、癌細胞において有意に上方制御されていることが実証されている。スペルミジン／スペルミンＮ1－アセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）は、この経路における重要な酵素として認識されており、すべての哺乳類細胞において高度に制御されている。ＳＳＡＴは、正常組織においては非常に低濃度で存在しているが、癌細胞においてはかなりより高いレベルで存在している。それゆえ、ＳＳＡＴの細胞レベルが上昇すると、その酵素活性の測定値は、癌の存在および重症度と相関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0003】
尿および血清におけるポリアミン代謝産物およびその他の代謝産物を測定することにより、肺癌を検出する方法が提供される。
【0004】
肺癌を検出するための尿検査のためのバイオマーカーパネルもまた提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、ＤＭＡ、Ｃ５：１、Ｃ１０：１、ＡＤＭＡ、Ｃ５－ＯＨ、ＳＤＭＡ、およびキヌレニン、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【0005】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルがさらに提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、Ｃ１０：２、ＰＣ ａａ Ｃ３２：２、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０、およびＰＣ ａｅ Ｃ４４：５；ならびにｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【0006】
肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルがさらにまた提供され、ここで、バイオマーカーパネルは、バリン、Ｃ１０：２、ＰＣ ａａ Ｃ３２：２、ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０、ＰＣ ａｅ Ｃ４４：５、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【0007】
後期肺癌を検出するための血清検査のためのパネルがさらにまた提供され、バイオマーカーパネルは、バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、Ｃ１０：２、およびｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、またはそれらの組合せからなるバイオマーカーの群から選択されるバイオマーカーを検出する。バイオマーカーパネルは、肺癌を診断するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌のステージを決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についてスクリーニングするために用いることができる。バイオマーカーパネルは、肺癌についての治療予後を決定するために用いることができる。バイオマーカーパネルは、開発または臨床段階の間の薬物の有効性を決定するために用いることができる。
【0008】
本発明は、以下の、添付の図面を参照して単に例示的にのみ与えられるその実施形態の記載からより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
対照患者、初期癌患者、および後期癌患者からの血清試料を、ダイレクトインジェクション質量分析および逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの組合せを用いて分析した。オーストリア６０２０、インスブルック、エドゥアルト・ボーデム・ガッセ８（Ｅｄｕａｒｄ－Ｂｏｄｅｍ－Ｇａｓｓｅ ８ ６０２０，Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ，Ａｕｓｔｒｉａ）のＢｉｏｃｒａｔｅｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＧから得たＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットを、アメリカ合衆国９４４０４、カリフォルニア州、フォスターシティー、リンカーンセンタードライブ８５０（８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｒｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，９４４０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘから得たＡＰＩ４０００ ＱＴｒａｐ（登録商標）タンデム質量分析装置と組合せて用いて、アミノ酸、アシルカルニチン、生体アミン、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質および糖を含む１８０種類もの異なる内因性代謝産物の標的化同定および定量を行った。
【0011】
使用した方法は、分析物の誘導体化および抽出と、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）ペアを用いる選択的質量分析検出とを組み合わせるものである。同位体ラベルされた内部標準およびその他の内部標準は、代謝産物定量のためのＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットのプレートフィルターに組み込まれている。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットは、シーリングテープを備えたフィルタープレートを有する９６ディープウェルプレートならびにプレートアッセイの準備に用いられる試薬および溶媒を含む。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットにおける最初の１４のウェルは、１つのブランク、３つのゼロ試料、各ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットに備えられている、７つの標準および３つのクオリティコントロール試料用に使用した。すべての血清試料を、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットのユーザーマニュアルに記載されているプロトコールを使用して、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットによって分析した。
【0012】
血清試料を氷上で解凍し、ボルテックスにかけ、２７５０×ｇで５分間４℃で遠心分離した。各血清試料の１０μＬを９６ウェルキットプレートの上側のフィルターの中央に載せ、窒素流中で乾燥させた。２０μＬの５％フェニルイソチオシアナート溶液を次いで誘導体化のために添加した。フィルタースポットを次いで再度エバポレーターを用いて乾燥させた。代謝産物の抽出を次いで５ｍＭの酢酸アンモニウムを含有する３００μＬのメタノールを添加することによって達成した。抽出液を９６ディープウェルプレートの下側へと遠心分離することによって得た。この後、ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットからのＭＳランニング溶媒による希釈工程を行った。
【0013】
質量分析を、溶媒送達系を装備したＡＰＩ４０００ ＱＴｒａｐ（登録商標）タンデム質量分析装置にて行った。血清試料を質量分析装置へとダイレクトインジェクション（ＤＩ）方法または液体クロマトグラフィー方法のいずれかによって送達した。ＡｂｓｏｌｕｔｅＩＤＱ（登録商標）ｐ１８０キットに同梱のＢｉｏｃｒａｔｅｓ ＭｅｔＩＱ（商標）ソフトウェアを用いて、試料登録から代謝産物濃度の自動化計算までのアッセーワークフロー全体を管理し、他のデータ分析プログラムへとデータをエクスポートした。標的化プロファイリングスキームを用いて、多重反応モニタリング、ニュートラルロス、およびプレカーサーイオンスキャンを使用して、定量的に既知の低分子代謝産物についてスクリーニングした。
【0014】
第１研究
代謝産物を、１０名の対照患者および化学療法治療を受けている１２名の肺癌患者から採取した尿試料においてＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて検出し、定量した。特に、以下の尿試料中のポリアミン経路代謝産物を検出し、定量した：スペルミジン、スペルミン、メチオニン、プトレシン、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭｅ）、オルニチン、アルギニン、Ｎ－アセチルスペルミン、およびＮ－アセチルスペルミジン。
代謝産物を、１０名の対照患者および化学療法治療を受けている１２名の肺癌患者から採取した尿試料においてＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースのアッセイを用いて検出し、定量した。特に、以下の尿試料中のポリアミン経路代謝産物を検出し、定量した：スペルミジン、スペルミン、メチオニン、プトレシン、メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭｅ）、オルニチン、アルギニン、Ｎ－アセチルスペルミン、およびＮ－アセチルスペルミジン。
【0015】
図１に示されるこの研究の結果は、４つの代謝産物、即ち、スペルミジン、オルニチン、アルギニンおよびメチオニンが、癌についての推定バイオマーカーとして同定されたことを示す。この研究からの結果は、癌患者および健康対象におけるポリアミンメタボロームの予備像を明らかにした。
【0016】
第２研究
代謝産物を、１５名の対照患者および３１名の肺癌患者（７名の初期癌患者を含む）から採取した尿および血清試料において検出した。試料を、上記のようにダイレクトインジェクション質量分析（ＭＳ）および逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを組み合わせて用いて分析した。統計分析を、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃｏｍ）およびＲＯＣＣＥＴ（ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ）を用いて行った。
代謝産物を、１５名の対照患者および３１名の肺癌患者（７名の初期癌患者を含む）から採取した尿および血清試料において検出した。試料を、上記のようにダイレクトインジェクション質量分析（ＭＳ）および逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを組み合わせて用いて分析した。統計分析を、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃｏｍ）およびＲＯＣＣＥＴ（ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ）を用いて行った。
【0017】
以下の代謝産物を、Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｐｌ８０ＩＤＱ（商標）キットを用いて同定し、定量した：
【0018】
【表1】
【0019】
【0020】
非対称性および対称性形態における全ジメチルアルギニン（ＤＭＡ）、チグリルカルニチン（Ｃ５：１）、デセノイルカルニチン（Ｃ１０：１）、非対称性ジメチルアルギニン（ＡＤＭＡ）、ヒドロキシバレリルカルニチン（Ｃ５－ＯＨ）、対称性ジメチルアルギニン（ＳＤＭＡ）、およびキヌレニンが、図３に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて肺癌を識別するための７つの最も重要な尿中代謝産物であるようである。尿試料のＶＩＰ分析からの７つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を、図４に示す。
【0021】
バリン、デカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）、グリセロリン脂質（ＰＣ ａａ Ｃ３２：２；ＰＣ ａｅ Ｃ３６：０、およびＰＣ ａｅ Ｃ４４：５）が、図６に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を、図７に示す。
【0022】
したがって、７つの推定尿中バイオマーカーおよび５つの推定血清バイオマーカーが肺癌の診断のために同定され、肺癌を検出するための尿検査または血清検査のためのバイオマーカーパネルにおいて使用され得る。
【0023】
第３研究
代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２において２６名の後期肺癌患者および１５名の対照患者から採取した血清試料において検出した。特に、以下のポリアミン経路代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２における血清試料において検出し、定量した：バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、デカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）、グリセロリン脂質（ＰＣ ａａ Ｃ３２：２およびＰＣ ａｅ Ｃ３６：０）、ｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、メチルチオアデノシン、およびプトレシン。
代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２において２６名の後期肺癌患者および１５名の対照患者から採取した血清試料において検出した。特に、以下のポリアミン経路代謝産物を、時間Ｔ１およびＴ２における血清試料において検出し、定量した：バリン、アルギニン、オルニチン、メチオニン、スペルミジン、スペルミン、ジアセチルスペルミン、デカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）、グリセロリン脂質（ＰＣ ａａ Ｃ３２：２およびＰＣ ａｅ Ｃ３６：０）、ｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、メチルチオアデノシン、およびプトレシン。
【0024】
試料を、上記のようにダイレクトインジェクション質量分析（ＭＳ）および逆相ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを組み合わせて用いて分析した。統計分析を、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃｏｍ）およびＲＯＣＣＥＴ（ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ）を用いて行った。しかし、メチルチオアデノシンおよびプトレシンは、欠測率が５０％より高かったために分析から除外した。図８および図９は、残りの個々の代謝産物の時間（Ｔ１）および（Ｔ２）における一変量分析の結果をそれぞれ示す。
【0025】
時間Ｔ１における主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）の結果、図１０から図１３に示されるように、血清における１１の代謝産物に基づいた、肺癌患者と対照患者との検出可能な分離がもたらされた。
【0026】
全バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、ｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、およびデカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）が、図１４に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて後期肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を図１５に示す。
【0027】
時間Ｔ２における主成分分析（ＰＣＡ）および部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）の結果、図１６から図１９に示されるように、血清における１１の代謝産物に基づいた、肺癌患者と対照患者との検出可能な分離がもたらされた。
【0028】
全バリン、ジアセチルスペルミン、スペルミン、ｌｙｓｏＰＣ ａ Ｃ１８：２、およびデカジエニルカルニチン（Ｃ１０：２）がまた、図２０に示されるように、投影における変数重要性（ＶＩＰ）分析に基づいて後期肺癌を識別するための５つの最も重要な血清代謝産物であるようである。血清試料のＶＩＰ分析からの５つの最も重要な代謝産物を含む受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を図２１に示す。
【0029】
したがって１１の推定血清バイオマーカーが、後期肺癌の診断のために同定され、肺癌を検出するための血清検査のためのバイオマーカーパネルにおいて用いられ得る。
【0030】
上記に提供された詳細の多くは単に例示的なものであり、以下の特許請求の範囲を参照して決定されるべき本発明の範囲を限定する意図のものではないことが、当業者により理解されるであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】