特許 7038094 治療用として改善された特性を有するβ－ラクタマーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-09

(45)【発行日】2022-03-17

(54)【発明の名称】治療用として改善された特性を有するβ－ラクタマーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/86 20060101AFI20220310BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20220310BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20220310BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220310BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20220310BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20220310BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20220310BHJP

【ＦＩ】

C12N9/86 ZNA

C12N15/55

A61K38/46

A61P31/04

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

【請求項の数】 29

(21)【出願番号】P 2019220462

(22)【出願日】2019-12-05

(62)【分割の表示】P 2016562248の分割

【原出願日】2015-04-17

(65)【公開番号】P2020054368

(43)【公開日】2020-04-09

【審査請求日】2019-12-26

(31)【優先権主張番号】62/046,627

(32)【優先日】2014-09-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/980,844

(32)【優先日】2014-04-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516302328

【氏名又は名称】シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】カレコ，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】コネリー，シーラ

【審査官】川合 理恵

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１３－５２９９０５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ ９／８６

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってＡｍｂｌｅｒ分類によるＡ２３８Ｔ変異を有するアミノ酸配列を含む、β－ラクタマーゼ。

【請求項2】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置２７６にアスパラギン酸（Ｄ）以外の極性で中性電荷の親水性残基という変異をさらに有する、請求項１に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項3】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置３３にフェニルアラニン（Ｆ）以外の芳香族疎水性残基という変異をさらに有する、請求項２に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項4】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置１５６にグリシン（Ｇ）以外の極性で正電荷の親水性残基という変異をさらに有する、請求項１に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項5】

前記極性で中性電荷の親水性残基が、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）およびシステイン（Ｃ）から選択される、請求項２に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項6】

前記芳香族疎水性残基が、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）から選択される、請求項３に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項7】

前記極性で正電荷の親水性残基が、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）から選択される、請求項４に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項8】

ペニシリンおよびセファロスポリンの内の１種または複数種を加水分解する、請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項9】

前記ペニシリンがアンピシリンである、請求項８に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項10】

前記セファロスポリンが、セフトリアキソン、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフェピム、セフロキシムおよびセフタジジムから選択される、請求項８に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項11】

配列番号１と比較して改善されたセファロスポリンに対する触媒効率を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項12】

配列番号１と比較して１０倍～１０００倍改善されたセファロスポリンに対する触媒効率を有する、請求項１１に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項13】

前記セファロスポリンが、セフトリアキソン、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフェピム、セフロキシムおよびセフタジジムから選択される、請求項１２に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項14】

Ｄ２７６Ｎの変異を有する配列番号１と比較して改善されたセファロスポリンに対する触媒効率を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項15】

前記セファロスポリンが、セフォタキシム、セフェピムおよびセフトリアキソンから選択される、請求項１４に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項16】

ＧＩ管中で活性である、請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項17】

小腸中で安定である、請求項１６に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項18】

請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。

【請求項19】

請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。

【請求項20】

請求項１～７のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼと、薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤と、を含む医薬組成物。

【請求項21】

経口投与用に処方される、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

抗生物質療法を受ける患者における抗生物質誘発性クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の予防に使用するためのβ－ラクタマーゼであって、
配列番号１と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であってＡｍｂｌｅｒ分類によるＡ２３８Ｔ変異を有するアミノ酸配列
を含むβ－ラクタマーゼ。

【請求項23】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置２７６にアスパラギン酸（Ｄ）以外の極性で中性電荷の親水性残基という変異をさらに有する、請求項２２に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項24】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置３３にフェニルアラニン（Ｆ）以外の芳香族疎水性残基という変異をさらに有する、請求項２３に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項25】

Ａｍｂｌｅｒ分類による位置１５６にグリシン（Ｇ）以外の極性で正電荷の親水性残基という変異をさらに有する、請求項２２に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項26】

前記極性で中性電荷の親水性残基が、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）およびシステイン（Ｃ）から選択される、請求項２３に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項27】

前記芳香族疎水性残基が、トリプトファン（Ｗ）およびチロシン（Ｙ）から選択される、請求項２４に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項28】

前記極性で正電荷の親水性残基が、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）から選択される、請求項２５に記載のβ－ラクタマーゼ。

【請求項29】

前記クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患が抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）である、請求項２２～２８のいずれか１項に記載のβ－ラクタマーゼ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１４年４月１７日に出願された米国特許仮出願第６１／９８０，８４４号、および２０１４年９月５日に出願された米国特許仮出願第６２／０４６，６２７号の利益を主張する。これら両仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野

【0002】

本発明は、一部は、β－ラクタマーゼの組成物および、例えば、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）などの消化管（ＧＩ管）障害においてこれらの酵素を使う方法に関する。

【背景技術】

【0003】

ヒトは、哺乳類細胞および微生物細胞の集合体である超個体と見なすことができ、後者の方が前者より１０：１の比率で数が多い。この微生物成分およびその微生物の遺伝的レパートリーであるマイクロバイオームは、ヒト宿主のものよりおよそ１００倍大きい。際立っているのは、この外来生物の巨大な多様性にもかかわらず、ヒト免疫系は通常、相助関係の状態を維持している。このことは、１０００にもなる異なる細菌種および１ｘ１０^１４を超える微生物を住まわせ、ヒト宿主の健康状態の決定に最も重要であるように見える遠位のＧＩ管にとって特に重要である。特に、ＧＩ管でのマイクロバイオームの正確なバランスの低下は、種々の疾患に繋がる場合がある。

【0004】

しかし、疾患の特定の状況を処置するために必要な抗生物質による医学的処置は、ＧＩ管中を含むマイクロバイオームの破壊を引き起こし、さらなる疾患に繋がる場合がある。例えば、アンピシリン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、およびピペラシリンのような特定の非経口投与のベータラクタム系薬は、一部が、胆汁排出を介して、小腸の近位部分（十二指腸）中に排出される。腸管中に残っている非吸収ベータラクタム系薬は、正常な腸の微生物叢の生態学的均衡に望ましくない影響を引き起こし、例えば、ＣＤＩ、抗生物質関連下痢、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、広域性β－ラクタマーゼ産生グラム陰性桿菌（ＥＳＢＬ）、および真菌、などの病原菌の異常増殖、ならびに正常な腸微生物叢および潜在的病原菌に抗生物質耐性株の淘汰が生ずる場合がある。

【0005】

正常な腸微生物叢の生態学的均衡を回避するまたは均衡を回復する１つの手法は、例えば、排出されたまたは非吸収のＧＩ管中の抗生物質を不活化し、それにより、正常な腸微生物叢を維持し、潜在的に病原性微生物を伴うその異常増殖を防止することによるβ－ラクタマーゼの治療的使用である。

【0006】

クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）などの消化管（ＧＩ管）障害の処置のための、これらの使用に最適な酵素特性を有する薬剤および薬物に対する必要性が残されている。

【発明の概要】

【0007】

したがって、本発明は、例えば、基質特異性および／または活性を変えるなどの有利な変異を含む、Ｐ１Ａβ－ラクタマーゼを基準にしたアミノ酸配列を含むβ－ラクタマーゼを提供し、また、治療上の利点を提供する。例えば、このような変異体は配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有することができ、Ａｍｂｌｅｒ分類によるＦ３３、Ｑ１３５、Ｇ１５６、Ａ２３２、Ａ２３７、Ａ２３８、Ｓ２４０、Ｔ２４３、Ｒ２４４、Ｓ２６６、およびＤ２７６の位置に１つまたは複数の変異を有することができる。このようなβ－ラクタマーゼは、ペニシリンおよびセファロスポリンの両方を加水分解する能力を有し、これは、抗生物質基質を選択するための低Ｋ_Ｍおよび／または高Ｖ_ｍａｘなどの酵素的に望ましい特性を使って実現することができる。

【0008】

これらの改善されたβ－ラクタマーゼは、ＧＩ管のＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患または抗生物質誘発性有害作用の予防および処置を含む多くの治療に使用される。例えば、β－ラクタマーゼは患者が抗生物質療法を受けるのを可能とし、同時に、マイクロバイオームに悪影響を与える過剰抗生物質に起因する可能性のある疾患に対し保護する。このような用途は、抗生物質の全身的な有用性と干渉しない。むしろ、β－ラクタマーゼは、ＧＩ管の一部に定着する場合がある過剰の抗生物質を除去し、それにより、本明細書で記載の種々の疾患状態と関連する微生物叢の破壊を防ぐ。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、１０ｇ／ｌのグルコース枯草菌増殖由来の濃縮試料（ゲルの右側の試料ラベル参照）の１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）ゲルを示す。ＭＷＭ＝分子量マーカーＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）、ＲＳ３１０＝Ｐ１Ａ枯草菌株、およびＰ１Ａ Ａ１８Ｋ３１＝Ｐ１Ａ基準試料。「Ｐ１Ａ→」はＰ１Ａおよび変異タンパク質の正確なサイズを意味する。

【図2】図２は、５ｇ／ｌのグルコース枯草菌増殖由来の上清試料（ゲルの右側の試料ラベル参照）の１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ）ゲルを示す。１４μｌのそれぞれの上清をゲルにアプライした。ＭＷＭ＝分子量マーカーＰｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ（ＢｉｏＲａｄ）、ＲＳ３１０＝Ｐ１Ａ枯草菌株であり、「Ｐ１Ａ→」はＰ１Ａおよび変異タンパク質の正確なサイズを意味する。

【図3】図３は、ＨＩＣを実行した場合の溶出曲線を示す。収集溶出画分の位置を矢印と黒色破線（右端の破線）で標識している。これらの矢印と破線はいずれもＸ軸に垂直である。通過画分Ａ７－Ｂ８は、図から容易に認めることができる。Ａ_２８０のグラフは実線（最上線）で表され、溶出溶液の伝導率は実線（上から２番目の線）で表される。試料注入を破線（左端の破線）で、および画分を複数の実線で標識している。これらの破線と実線はいずれもＸ軸に垂直である。

【図4】図４は、ＨＩＣを実行した場合の溶出曲線を示す。収集溶出画分の位置を矢印と黒色破線（右端の破線）で標識している。これらの矢印と破線はいずれもＸ軸に垂直である。通過画分Ａ１－Ａ８は、図から容易に認めることができる。Ａ_２８０のグラフは実線（上から２番目の線）で表され、溶出溶液の伝導率は実線（最上線）で表される。試料注入を破線（左端の破線）で、および画分を複数の実線で標識している。これらの破線と実線はいずれもＸ軸に垂直である。

【図5】図５は、ＨＩＣを実行した場合の溶出曲線を示す。収集溶出画分の位置を矢印と黒色破線（右端の破線）で標識している。これらの矢印と破線はいずれもＸ軸に垂直である。通過画分Ａ１－Ｂ１は、図から容易に認めることができる。Ａ_２８０のグラフは実線（上から２番目の線）で表され、溶出溶液の伝導率は実線（最上線）で表される。試料注入を破線（左端の破線）で、および画分を複数の実線で標識している。これらの破線と実線はいずれもＸ軸に垂直である。Ｘ軸のゼロの前の部分は、緩衝液Ａと平衡状態にあるカラムを表す。

【図6】図６は、図３～５に示す３つのＨＩＣ精製画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを示す。ＡＳ－ｓｕｐ＝特定の精製で使用される硫酸アンモニウム濾液、すなわち、精製用の出発材料である。Ｂ１ １６１００８、Ｂ７ １６１００８、Ｂ８ １６１００８、Ａ２ ０４１１０８、Ａ７ ０４１１０８、およびＢ１ １２１１０８：それぞれの精製の通過画分。Ｃ３－Ｃ８ １６１００８、Ｃ９－Ｄ１ １６１００８、Ｄ２－Ｄ８ １６１００８、Ｂ２－Ｂ１０ ０４１１０８、およびＢ８－Ｃ３ １２１１０８：溶出タンパク質ピーク画分、プール画分。Ａ１８Ｋ３１ Ｐ１Ａ：基準試料、０．６４μｇ／レーン。

【図7】図７は、ＳＯＥ（スプライス重複伸長）技術を示す。標的アミノ酸のＰ１ＡのＢ３β鎖が非常に相互に近接しているために４個全てのアミノ酸をＳＯＥ技術を使って交換することができる。交換を含む領域は、２４ヌクレオチド（８個のアミノ酸コドン）を含み、２つのＰＣＲプライマーの重複伸張部分中に含まれる。変異ｐｅｎＰ遺伝子は、プライマーＡ＋ＢおよびＣ＋Ｄを使って、最初に２つの部分でＰＣＲにより増幅される。その後、２つのＰＣＲ産物は合わされ、ｐｅｎＰ遺伝子の５’および３’部分に相補的な、プライマーＡおよびＤを使って増幅される。クローニング部位はプライマーＡおよびＤに含まれる。構築物の準備ができると、Ｍｕｌｔｉキットを使って、さらなる変異を加えることができる。重複プライマー（ＢおよびＣ）にコードされるアミノ酸配列が示されている。

【図8】図８は、Ｐ１Ａ（左側バー）およびＰ４Ａ（右側バー）の抗生物質分解活性を示す。示した抗生物質に対して、１０または１００ｎｇ／ｍｌの酵素濃度を使用している。データは、示したβ－ラクタマーゼ（１０、１００、または１０００μｇ／ｍｌの抗生物質濃度を使用した）により分解された最高抗生物質濃度としてプロットされている。

【発明を実施するための形態】

【0010】

本発明は、一部は、例えば、１種または複数種のペニシリンおよびセファロスポリンを加水分解する能力を含む、治療での使用に望ましい特性を有する特定の変異β－ラクタマーゼ酵素の発見に基づいている。

【0011】

いくつかの態様では、本発明はβ－ラクタマーゼ、およびこれらのβ－ラクタマーゼの医薬組成物を提供する。種々の態様では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物は配列番号１（バチルス・リケニフォルミス ＰｅｎＰ、すなわちＰ１Ａ）からの変異に由来する。したがって、いくつかの態様では、本発明はβ－ラクタマーゼ、およびＰ１Ａ誘導体である医薬組成物を提供する。

【0012】

Ｐ１Ａは、胆管系を介して排出されるβ－ラクタマーゼ阻害剤（例えば、タゾバクタム、スルバクタム、クラブラン酸）を含む、または含まない、非経口的に投与されたペニシリングループのβ－ラクタム（例えば、ペニシリン、アモキシシリン、アンピシリン、およびピペラシリン）を、不活化するように設計された（国際公開第１９９３／０１３７９５号および同ＷＯ２００８／０６５２４７号；Ｔａｒｋｋａｎｅｎ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５３：２４５５、参照。これらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｐ１Ａ酵素は、バチルス・リケニフォルミス７４９／Ｃの小型エキソβ－ラクタマーゼの組換え型であり（国際公開第ＷＯ２００８／０６５２４７号）、これは、クラスＡに属し、機能分類におけるサブグループ２ａにグループ化される。バチルス・リケニフォルミスのβ－ラクタマーゼおよびそのＰ１Ａ誘導体は、例えばペニシリン、アンピシリン、アモキシシリン、またはピペラシリンを分解する高い加水分解能力を有するペニシリナーゼであると考えられ、それらは通常、クラブラン酸、スルバクタム、またはタゾバクタムなどの活性部位特異的β－ラクタマーゼ阻害剤によって阻害される。しかし、Ｐ１Ａ酵素は、セファロスポリングループまたはカルバペネムグループに属するβ－ラクタム抗生物質を不活化するための非常に限られた能力しか有さない。採用されるβ－ラクタマーゼはセファロスポリンに対して低い活性しか有さないため、これらは、小腸管内の非吸収β－ラクタムを不活化するために、非経口セファロスポリン療法と組み合わせて利用することができない。したがって、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または本発明の医薬組成物は、本明細書で記載のように、Ｐ１Ａの性質を改善する。

【0013】

種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、例えば、広範囲の抗生物質を効率的に標的とする能力を含む、望ましい特性を有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、望ましい酵素動力学的特性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、例えば、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ（１００ｎＭ）、または約０．０１μＭ（１０ｎＭ）、または約１ｎＭ未満などの低いＫ_Ｍを有する。例えば、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、例えば、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ（１００ｎＭ）、または約０．０１μＭ（１０ｎＭ）、または約１ｎＭ未満などの低いＫ_Ｍを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、例えば、約１００ｓ－１、または約１０００ｓ－１、または約１００００ｓ－１、または約１０００００ｓ－１、または約１００００００ｓ－１を超えるＶ_ｍａｘなどの高いＶ_ｍａｘを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、例えば、約１００ｓ－１、または約１０００ｓ－１、または約１００００ｓ－１、または約１０００００ｓ－１、または約１００００００ｓ－１を超えるＶ_ｍａｘなどの高いＶ_ｍａｘを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、約１０^６Ｍ^－１ｓ^－１より大きい触媒効率を有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、約１０^６Ｍ^－１ｓ^－１より大きい触媒効率を有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、セファロスポリンおよびペニシリンのいずれかまたは両方の内の少なくとも１種に対して、望ましい酵素動力学的特性を有する。種々の実施形態では、具体的な抗生物質（例えば、セファロスポリンおよびペニシリン）が本明細書で記載される。

【0014】

本明細書で提供されるのは、Ｐ１Ａ酵素の２６３個のアミノ酸配列（３１個のアミノ酸シグナル配列およびＮ末端のＱＡＳＫＴ（Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ）ペンタペプチドの除去後の配列；配列番号３を参照されたい）である。本明細書で記載のように、この配列に対して変異を加えて、本発明のβ－ラクタマーゼを生成することができる。
配列番号：１
Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ．

【0015】

いくつかの実施形態では、配列番号１は、配列の最初の残基の直前にＭｅｔおよび／またはＴｈｒを有することができる。種々の実施形態では、Ｍｅｔを切断することができる。本明細書で記載のように、最初の残基の直前のＭｅｔおよび／またはＴｈｒを含む配列に対し変異を加えて本発明のβ－ラクタマーゼを生成することができる。

【0016】

また、本明細書で提供されるのは、３１個のアミノ酸シグナル配列およびＮ末端のＱＡＳＫＴ（Ｇｌｎ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ）ペンタペプチドの除去前のＰ１Ａ酵素の、配列番号３としての２９９個のアミノ酸配列である。
配列番号：３
Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｌｙｓ

【0017】

さらに、本発明は追加の、配列番号１の最初の残基の上流の残基（例えば、ＪＢＣ ２５８（１８）：１１２１１，１９８３を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる－エキソラージおよびエキソスモールバージョンのｐｅｎＰおよびｐｅｎＰ１を含む）も提供する。さらに、本発明は追加の、配列番号１の最後の残基の下流の残基も提供する。

【0018】

Ｐ１Ａのポリヌクレオチド配列（３１個のアミノ酸シグナル配列およびＮ末端のＱＡＳＫＴペンタペプチドの除去後）も配列番号２として提供される。本明細書で記載のように、この配列に対して変異を加えて、本発明のβ－ラクタマーゼを生成することができる（遺伝子コードの縮退の考慮を含む）。
配列番号：２
ｇａｇａｔｇａａａｇａｔｇａｔｔｔｔｇｃａａａａｃｔｔｇａｇｇａａｃａａｔｔｔｇａｔｇｃａａａａｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｔｔｇｃａｔｔｇｇａｔａｃａｇｇｔａｃａａａｃｃｇｇａｃｇｇｔａｇｃｇｔａｔｃｇｇｃｃｇｇａｔｇａｇｃｇｔｔｔｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｃｇａｔｔａａｇｇｃｔｔｔａａｃｔｇｔａｇｇｃｇｔｇｃｔｔｔｔｇｃａａｃａｇａａａｔｃａａｔａｇａａｇａｔｃｔｇａａｃｃａｇａｇａａｔａａｃａｔａｔａｃａｃｇｔｇａｔｇａｔｃｔｔｇｔａａａｃｔａｃａａｃｃｃｇａｔｔａｃｇｇａａａａｇｃａｃｇｔｔｇａｔａｃｇｇｇａａｔｇａｃｇｃｔｃａａａｇａｇｃｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｇｃｔｔｃｇａｔａｔａｇｔｇａｃａａｔｇｃｇｇｃａｃａｇａａｔｃｔｃａｔｔｃｔｔａａａｃａａａｔｔｇｇｃｇｇａｃｃｔｇａａａｇｔｔｔｇａａａａａｇｇａａｃｔｇａｇｇａａｇａｔｔｇｇｔｇａｔｇａｇｇｔｔａｃａａａｔｃｃｃｇａａｃｇａｔｔｃｇａａｃｃａｇａｇｔｔａａａｔｇａａｇｔｇａａｔｃｃｇｇｇｔｇａａａｃｔｃａｇｇａｔａｃｃａｇｔａｃａｇｃａａｇａｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｇａｇｃｃｔｔｔｇｃｔｃｔｔｇａａｇａｔａａａｃｔｔｃｃａａｇｔｇａａａａａｃｇｃｇａｇｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｔｔｇｇａｔｇａａａｃｇａａａｔａｃｃａｃｔｇｇａｇａｃｇｃｃｔｔａａｔｃｃｇｔｇｃｃｇｇｔｇｔｇｃｃｇｇａｃｇｇｔｔｇｇｇａａｇｔｇｇｃｔｇａｔａａａａｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａｔｃａｔａｔｇｇａａｃｃｃｇｇａａｔｇａｃａｔｔｇｃｃａｔｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｃｃａａａａｇｇａｇａｔｃｃｔｇｔｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｇｔａｔｔａｔｃｃａｇｃａｇｇｇａｔａａａａａｇｇａｃｇｃｃａａｇｔａｔｇａｔｇａｔａａａｃｔｔａｔｔｇｃａｇａｇｇｃａａｃａａａｇｇｔｇｇｔａａｔｇａａａｇｃｃｔｔａａａｃａｔｇａａｃｇｇｃａａａｔａａ

【0019】

３１個のアミノ酸シグナル配列およびＮ末端のＱＡＳＫＴペンタペプチドの除去前のＰ１Ａのポリヌクレオチド配列も配列番号４として提供される。本明細書で記載のように、この配列に対して変異を加えて、本発明のβ－ラクタマーゼを生成することができる（遺伝子コードの縮退の考慮を含む）。
配列番号：４
ａｔｇａｔｔｃａａａａａｃｇａａａｇｃｇｇａｃａｇｔｔｔｃｇｔｔｃａｇａｃｔｔｇｔｇｃｔｔａｔｇｔｇｃａｃｇｃｔｇｔｔａｔｔｔｇｔｃａｇｔｔｔｇｃｃｇａｔｔａｃａａａａａｃａｔｃａｇｃｇｃａａｇｃｔｔｃｃａａｇａｃｇｇａｇａｔｇａａａｇａｔｇａｔｔｔｔｇｃａａａａｃｔｔｇａｇｇａａｃａａｔｔｔｇａｔｇｃａａａａｃｔｃｇｇｇａｔｃｔｔｔｇｃａｔｔｇｇａｔａｃａｇｇｔａｃａａａｃｃｇｇａｃｇｇｔａｇｃｇｔａｔｃｇｇｃｃｇｇａｔｇａｇｃｇｔｔｔｔｇｃｔｔｔｔｇｃｔｔｃｇａｃｇａｔｔａａｇｇｃｔｔｔａａｃｔｇｔａｇｇｃｇｔｇｃｔｔｔｔｇｃａａｃａｇａａａｔｃａａｔａｇａａｇａｔｃｔｇａａｃｃａｇａｇａａｔａａｃａｔａｔａｃａｃｇｔｇａｔｇａｔｃｔｔｇｔａａａｃｔａｃａａｃｃｃｇａｔｔａｃｇｇａａａａｇｃａｃｇｔｔｇａｔａｃｇｇｇａａｔｇａｃｇｃｔｃａａａｇａｇｃｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｇｃｔｔｃｇａｔａｔａｇｔｇａｃａａｔｇｃｇｇｃａｃａｇａａｔｃｔｃａｔｔｃｔｔａａａｃａａａｔｔｇｇｃｇｇａｃｃｔｇａａａｇｔｔｔｇａａａａａｇｇａａｃｔｇａｇｇａａｇａｔｔｇｇｔｇａｔｇａｇｇｔｔａｃａａａｔｃｃｃｇａａｃｇａｔｔｃｇａａｃｃａｇａｇｔｔａａａｔｇａａｇｔｇａａｔｃｃｇｇｇｔｇａａａｃｔｃａｇｇａｔａｃｃａｇｔａｃａｇｃａａｇａｇｃａｃｔｔｇｔｃａｃａａｇｃｃｔｔｃｇａｇｃｃｔｔｔｇｃｔｃｔｔｇａａｇａｔａａａｃｔｔｃｃａａｇｔｇａａａａａｃｇｃｇａｇｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｔｔｇｇａｔｇａａａｃｇａａａｔａｃｃａｃｔｇｇａｇａｃｇｃｃｔｔａａｔｃｃｇｔｇｃｃｇｇｔｇｔｇｃｃｇｇａｃｇｇｔｔｇｇｇａａｇｔｇｇｃｔｇａｔａａａａｃｔｇｇａｇｃｇｇｃａｔｃａｔａｔｇｇａａｃｃｃｇｇａａｔｇａｃａｔｔｇｃｃａｔｃａｔｔｔｇｇｃｃｇｃｃａａａａｇｇａｇａｔｃｃｔｇｔｃｇｔｔｃｔｔｇｃａｇｔａｔｔａｔｃｃａｇｃａｇｇｇａｔａａａａａｇｇａｃｇｃｃａａｇｔａｔｇａｔｇａｔａａａｃｔｔａｔｔｇｃａｇａｇｇｃａａｃａａａｇｇｔｇｇｔａａｔｇａａａｇｃｃｔｔａａａｃａｔｇａａｃｇｇｃａａａｔａａ

【0020】

いくつかの実施形態では、本発明は、有利な酵素（例えば、広範囲の抗生物質を標的にすることができる酵素）を得るための、β－ラクタマーゼ（例えば、クラスＡβ－ラクタマーゼ）の変異誘発に関する。いくつかの実施形態では、本発明は部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、および／または定向進化の手法を含む。いくつかの実施形態では、変異設計は、特に、次の構造データ（例えば、結晶構造データ、相同体モデル、など）： Ｐ１Ａ結晶構造（Ｋｎｏｘ ａｎｄ Ｍｏｅｗｓ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２２０，４３５－４５５（１９９１））、ＣＴＸ－Ｍ－４４（１ＢＺＡ（Ｉｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８５，Ｉｓｓｕｅ ５ ２０７９－２０８７（１９９９））、１ＩＹＳ（Ｉｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２（３６）：１０６３４－４３）、１ＩＹＯ、１ＩＹＰおよび１ＩＹＱ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７：４６６０１－０８）、プロテウス・ブルガリスＫ１（１ＨＺＯ，Ｎｕｇａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｍａｒ １５；３１７（１）：１０９－１７）およびプロテウス・ペンネリＨｕｇＡ（Ｌｉａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２ Ｊａｎ；４６（１）：２１６－９．２００２）、また、Ｂｏｎｎｅｔ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８（１）：１－１４（２００４）（ＣＴＭ－Ｘに対して）中で概説されている）に基づいている。全てのこれらの文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本変異は次のβ－ラクタマーゼのいずれか１種の構造データ（例えば、結晶構造データ、相同体モデル、など）の分析から情報を得ている：Ｐ１Ａ（例えば、米国特許第５，６０７，６７１号（内容が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、Ｐ２Ａ（例えば、国際公開第２００７／１４７９４５号（内容が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、Ｐ３Ａ（例えば、国際公開第２０１１／１４８０４１号（内容が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）、ＣＴＸ－Ｍ－３、ＣＴＸ－Ｍ－４、ＣＴＸ－Ｍ－５、ＣＴＸ－Ｍ－９、ＣＴＸ－Ｍ－１０、ＣＴＸ－Ｍ－１４、ＣＴＸ－Ｍ－１５、ＣＴＸ－Ｍ－１６、ＣＴＸ－Ｍ－１８、ＣＴＸ－Ｍ－１９、ＣＴＸ－Ｍ－２５、ＣＴＸ－Ｍ－２６、ＣＴＸ－Ｍ－２７、ＣＴＸ－Ｍ－３２、ＣＴＸ－Ｍ－４４、ＣＴＸ－Ｍ－４５、およびＣＴＸ－Ｍ－５４。このような情報は当業者により既知のデータベース、例えば、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＮＣＢＩ、およびＰＤＢで入手可能である。

【0021】

いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１または配列番号３に対する、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも、３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、９９．９％の同一性（または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列番号１もしくは配列番号３に対する同一性）を有する配列に対する１つまたは複数（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１５、または約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００、または約１１０、または約１２０、または約１３０、または約１４０、または約１５０）の変異に関する。種々の実施形態では、配列番号１または配列番号３の１つまたは複数のアミノ酸が、天然のアミノ酸、例えば、親水性のアミノ酸（例えば、極性で正電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）；極性で中性電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、およびシステイン（Ｃ）、極性で負電荷の親水性のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）もしくはグルタミン酸（Ｅ）、または芳香族の極性で正電荷の親水性のアミノ酸、例えば、ヒスチジン（Ｈ））または疎水性のアミノ酸（例えば、疎水性の脂肪族アミノ酸、例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）、疎水性の芳香族アミノ酸、例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、もしくはチロシン（Ｙ））または非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロールリジン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡおよびδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、共通アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸、デザイナーアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、および一般的にアミノ酸類似体）により置換される。

【0022】

例示的実施形態では、本発明の変異には、限定されないが、配列番号１もしくは配列番号３に対する、または配列番号１もしくは配列番号３に対して少なくとも、３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、９９．９％の同一性（または約７０％、または約７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％の配列番号１もしくは配列番号３に対する同一性）を有する配列に対する１つまたは複数（約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０、または約１５、または約２０、または約３０、または約４０、または約５０、または約６０、または約７０、または約８０、または約９０、または約１００、または約１１０、または約１２０、または約１３０、または約１４０、または約１５０）の次の変異を含む：
Ｇｌｕ１Ａｌａ； Ｇｌｕ１Ｃｙｓ； Ｇｌｕ１Ａｓｐ； Ｇｌｕ１Ｐｈｅ； Ｇｌｕ１Ｇｌｙ； Ｇｌｕ１Ｈｉｓ； Ｇｌｕ１Ｉｌｅ； Ｍｅｔ１Ｌｙｓ； Ｇｌｕ１Ｌｅｕ； Ｇｌｕ１Ｍｅｔ； Ｇｌｕ１Ａｓｎ； Ｇｌｕ１Ｐｒｏ； Ｇｌｕ１Ｇｌｎ； Ｇｌｕ１Ａｒｇ； Ｇｌｕ１Ｓｅｒ； Ｇｌｕ１Ｔｈｒ； Ｇｌｕ１Ｖａｌ； Ｇｌｕ１Ｔｒｐ； Ｇｌｕ１Ｔｙｒ； Ｍｅｔ２Ａｌａ； Ｍｅｔ２Ｃｙｓ； Ｍｅｔ２Ａｓｐ； Ｍｅｔ２Ｇｌｕ； Ｍｅｔ２Ｐｈｅ； Ｍｅｔ２Ｇｌｙ； Ｍｅｔ２Ｈｉｓ； Ｍｅｔ２Ｉｌｅ； Ｍｅｔ１Ｌｙｓ； Ｍｅｔ２Ｌｅｕ； Ｍｅｔ２Ａｓｎ； Ｍｅｔ２Ｐｒｏ； Ｍｅｔ２Ｇｌｎ； Ｍｅｔ２Ａｒｇ； Ｍｅｔ２Ｓｅｒ； Ｍｅｔ２Ｔｈｒ； Ｍｅｔ２Ｖａｌ； Ｍｅｔ２Ｔｒｐ； Ｍｅｔ２Ｔｙｒ； Ｌｙｓ３Ａｌａ； Ｌｙｓ３Ｃｙｓ； Ｌｙｓ３Ａｓｐ； Ｌｙｓ３Ｇｌｕ； Ｌｙｓ３Ｐｈｅ； Ｌｙｓ３Ｇｌｙ； Ｌｙｓ３Ｈｉｓ； Ｌｙｓ３Ｉｌｅ； Ｌｙｓ３Ｌｅｕ； Ｌｙｓ３Ｍｅｔ； Ｌｙｓ３Ａｓｎ； Ｌｙｓ３Ｐｒｏ； Ｌｙｓ３Ｇｌｎ； Ｌｙｓ３Ａｒｇ； Ｌｙｓ３Ｓｅｒ； Ｌｙｓ３Ｔｈｒ； Ｌｙｓ３Ｖａｌ； Ｌｙｓ３Ｔｒｐ； Ｌｙｓ３Ｔｙｒ； Ａｓｐ４Ａｌａ； Ａｓｐ４Ｃｙｓ； Ａｓｐ４Ｇｌｕ； Ａｓｐ４Ｐｈｅ； Ａｓｐ４Ｇｌｙ； Ａｓｐ４Ｈｉｓ； Ａｓｐ４Ｉｌｅ； Ａｓｐ４Ｌｙｓ； Ａｓｐ４Ｌｅｕ； Ａｓｐ４Ｍｅｔ； Ａｓｐ４Ａｓｎ； Ａｓｐ４Ｐｒｏ； Ａｓｐ４Ｇｌｎ； Ａｓｐ４Ａｒｇ； Ａｓｐ４Ｓｅｒ； Ａｓｐ４Ｔｈｒ； Ａｓｐ４Ｖａｌ； Ａｓｐ４Ｔｒｐ； Ａｓｐ４Ｔｙｒ； Ａｓｐ５Ａｌａ； Ａｓｐ５Ｃｙｓ； Ａｓｐ５Ｇｌｕ； Ａｓｐ５Ｐｈｅ； Ａｓｐ５Ｇｌｙ； Ａｓｐ５Ｈｉｓ； Ａｓｐ５Ｉｌｅ； Ａｓｐ５Ｌｙｓ； Ａｓｐ５Ｌｅｕ； Ａｓｐ５Ｍｅｔ； Ａｓｐ５Ａｓｎ； Ａｓｐ５Ｐｒｏ； Ａｓｐ５Ｇｌｎ； Ａｓｐ５Ａｒｇ； Ａｓｐ５Ｓｅｒ； Ａｓｐ５Ｔｈｒ； Ａｓｐ５Ｖａｌ； Ａｓｐ５Ｔｒｐ； Ａｓｐ５Ｔｙｒ； Ｐｈｅ６Ａｌａ； Ｐｈｅ６Ｃｙｓ； Ｐｈｅ６Ａｓｐ； Ｐｈｅ６Ｇｌｕ； Ｐｈｅ６Ｇｌｙ； Ｐｈｅ６Ｈｉｓ； Ｐｈｅ６Ｉｌｅ； Ｐｈｅ６Ｌｙｓ； Ｐｈｅ６Ｌｅｕ； Ｐｈｅ６Ｍｅｔ； Ｐｈｅ６Ａｓｎ； Ｐｈｅ６Ｐｒｏ； Ｐｈｅ６Ｇｌｎ； Ｐｈｅ６Ａｒｇ； Ｐｈｅ６Ｓｅｒ； Ｐｈｅ６Ｔｈｒ； Ｐｈｅ６Ｖａｌ； Ｐｈｅ６Ｔｒｐ； Ｐｈｅ６Ｔｙｒ； Ａｌａ７Ｃｙｓ； Ａｌａ７Ａｓｐ； Ａｌａ７Ｇｌｕ； Ａｌａ７Ｐｈｅ； Ａｌａ７Ｇｌｙ； Ａｌａ７Ｈｉｓ； Ａｌａ７Ｉｌｅ； Ａｌａ７Ｌｙｓ； Ａｌａ７Ｌｅｕ； Ａｌａ７Ｍｅｔ； Ａｌａ７Ａｓｎ； Ａｌａ７Ｐｒｏ； Ａｌａ７Ｇｌｎ； Ａｌａ７Ａｒｇ； Ａｌａ７Ｓｅｒ； Ａｌａ７Ｔｈｒ； Ａｌａ７Ｖａｌ； Ａｌａ７Ｔｒｐ； Ａｌａ７Ｔｙｒ； Ｌｙｓ８Ａｌａ； Ｌｙｓ８Ｃｙｓ； Ｌｙｓ８Ａｓｐ； Ｌｙｓ８Ｇｌｕ； Ｌｙｓ８Ｐｈｅ； Ｌｙｓ８Ｇｌｙ； Ｌｙｓ８Ｈｉｓ； Ｌｙｓ８Ｉｌｅ； Ｌｙｓ８Ｌｅｕ； Ｌｙｓ８Ｍｅｔ； Ｌｙｓ８Ａｓｎ； Ｌｙｓ８Ｐｒｏ； Ｌｙｓ８Ｇｌｎ； Ｌｙｓ８Ａｒｇ； Ｌｙｓ８Ｓｅｒ； Ｌｙｓ８Ｔｈｒ； Ｌｙｓ８Ｖａｌ； Ｌｙｓ８Ｔｒｐ； Ｌｙｓ８Ｔｙｒ； Ｌｅｕ９Ａｌａ； Ｌｅｕ９Ｃｙｓ； Ｌｅｕ９Ａｓｐ； Ｌｅｕ９Ｇｌｕ； Ｌｅｕ９Ｐｈｅ； Ｌｅｕ９Ｇｌｙ； Ｌｅｕ９Ｈｉｓ； Ｌｅｕ９Ｉｌｅ； Ｌｅｕ９Ｌｙｓ； Ｌｅｕ９Ｍｅｔ； Ｌｅｕ９Ａｓｎ； Ｌｅｕ９Ｐｒｏ； Ｌｅｕ９Ｇｌｎ； Ｌｅｕ９Ａｒｇ； Ｌｅｕ９Ｓｅｒ； Ｌｅｕ９Ｔｈｒ； Ｌｅｕ９Ｖａｌ； Ｌｅｕ９Ｔｒｐ； Ｌｅｕ９Ｔｙｒ； Ｇｌｕ１０Ａｌａ； Ｇｌｕ１０Ｃｙｓ； Ｇｌｕ１０Ａｓｐ； Ｇｌｕ１０Ｐｈｅ； Ｇｌｕ１０Ｇｌｙ； Ｇｌｕ１０Ｈｉｓ； Ｇｌｕ１０Ｉｌｅ； Ｇｌｕ１０Ｌｙｓ； Ｇｌｕ１０Ｌｅｕ； Ｇｌｕ１０Ｍｅｔ； Ｇｌｕ１０Ａｓｎ； Ｇｌｕ１０Ｐｒｏ； Ｇｌｕ１０Ｇｌｎ； Ｇｌｕ１０Ａｒｇ； Ｇｌｕ１０Ｓｅｒ； Ｇｌｕ１０Ｔｈｒ； Ｇｌｕ１０Ｖａｌ； Ｇｌｕ１０Ｔｒｐ； Ｇｌｕ１０Ｔｙｒ； Ｇｌｕ１１Ａｌａ； Ｇｌｕ１１Ｃｙｓ； Ｇｌｕ１１Ａｓｐ； Ｇｌｕ１１Ｐｈｅ； Ｇｌｕ１１Ｇｌｙ； Ｇｌｕ１１Ｈｉｓ； Ｇｌｕ１１Ｉｌｅ； Ｇｌｕ１１Ｌｙｓ； Ｇｌｕ１１Ｌｅｕ； Ｇｌｕ１１Ｍｅｔ； Ｇｌｕ１１Ａｓｎ； Ｇｌｕ１１Ｐｒｏ； Ｇｌｕ１１Ｇｌｎ； Ｇｌｕ１１Ａｒｇ； Ｇｌｕ１１Ｓｅｒ； Ｇｌｕ１１Ｔｈｒ； Ｇｌｕ１１Ｖａｌ； Ｇｌｕ１１Ｔｒｐ； Ｇｌｕ１１Ｔｙｒ； Ｇｌｎ１２Ａｌａ； Ｇｌｎ１２Ｃｙｓ； Ｇｌｎ１２Ａｓｐ； Ｇｌｎ１２Ｇｌｕ； Ｇｌｎ１２Ｐｈｅ； Ｇｌｎ１２Ｇｌｙ； Ｇｌｎ１２Ｈｉｓ； Ｇｌｎ１２Ｉｌｅ； Ｇｌｎ１２Ｌｙｓ； Ｇｌｎ１２Ｌｅｕ； Ｇｌｎ１２Ｍｅｔ； Ｇｌｎ１２Ａｓｎ； Ｇｌｎ１２Ｐｒｏ； Ｇｌｎ１２Ａｒｇ； Ｇｌｎ１２Ｓｅｒ； Ｇｌｎ１２Ｔｈｒ； Ｇｌｎ１２Ｖａｌ； Ｇｌｎ１２Ｔｒｐ； Ｇｌｎ１２Ｔｙｒ； Ｐｈｅ１３Ａｌａ； Ｐｈｅ１３Ｃｙｓ； Ｐｈｅ１３Ａｓｐ； Ｐｈｅ１３Ｇｌｕ； Ｐｈｅ１３Ｇｌｙ； Ｐｈｅ１３Ｈｉｓ； Ｐｈｅ１３Ｉｌｅ； Ｐｈｅ１３Ｌｙｓ； Ｐｈｅ１３Ｌｅｕ； Ｐｈｅ１３Ｍｅｔ； Ｐｈｅ１３Ａｓｎ； Ｐｈｅ１３Ｐｒｏ； Ｐｈｅ１３Ｇｌｎ； Ｐｈｅ１３Ａｒｇ； Ｐｈｅ１３Ｓｅｒ； Ｐｈｅ１３Ｔｈｒ； Ｐｈｅ１３Ｖａｌ； Ｐｈｅ１３Ｔｒｐ； Ｐｈｅ１３Ｔｙｒ； Ａｓｐ１４Ａｌａ； Ａｓｐ１４Ｃｙｓ； Ａｓｐ１４Ｇｌｕ； Ａｓｐ１４Ｐｈｅ； Ａｓｐ１４Ｇｌｙ； Ａｓｐ１４Ｈｉｓ； Ａｓｐ１４Ｉｌｅ； Ａｓｐ１４Ｌｙｓ； Ａｓｐ１４Ｌｅｕ； Ａｓｐ１４Ｍｅｔ； Ａｓｐ１４Ａｓｎ； Ａｓｐ１４Ｐｒｏ； Ａｓｐ１４Ｇｌｎ； Ａｓｐ１４Ａｒｇ； Ａｓｐ１４Ｓｅｒ； Ａｓｐ１４Ｔｈｒ； Ａｓｐ１４Ｖａｌ； Ａｓｐ１４Ｔｒｐ； Ａｓｐ１４Ｔｙｒ； Ａｌａ１５Ｃｙｓ； Ａｌａ１５Ａｓｐ； Ａｌａ１５Ｇｌｕ； Ａｌａ１５Ｐｈｅ； Ａｌａ１５Ｇｌｙ； Ａｌａ１５Ｈｉｓ； Ａｌａ１５Ｉｌｅ； Ａｌａ１５Ｌｙｓ； Ａｌａ１５Ｌｅｕ； Ａｌａ１５Ｍｅｔ； Ａｌａ１５Ａｓｎ； Ａｌａ１５Ｐｒｏ； Ａｌａ１５Ｇｌｎ； Ａｌａ１５Ａｒｇ； Ａｌａ１５Ｓｅｒ； Ａｌａ１５Ｔｈｒ； Ａｌａ１５Ｖａｌ； Ａｌａ１５Ｔｒｐ； Ａｌａ１５Ｔｙｒ； Ｌｙｓ１６Ａｌａ； Ｌｙｓ１６Ｃｙｓ； Ｌｙｓ１６Ａｓｐ； Ｌｙｓ１６Ｇｌｕ； Ｌｙｓ１６Ｐｈｅ； Ｌｙｓ１６Ｇｌｙ； Ｌｙｓ１６Ｈｉｓ； Ｌｙｓ１６Ｉｌｅ； Ｌｙｓ１６Ｌｅｕ； Ｌｙｓ１６Ｍｅｔ； Ｌｙｓ１６Ａｓｎ； Ｌｙｓ１６Ｐｒｏ； Ｌｙｓ１６Ｇｌｎ； Ｌｙｓ１６Ａｒｇ； Ｌｙｓ１６Ｓｅｒ； Ｌｙｓ１６Ｔｈｒ； Ｌｙｓ１６Ｖａｌ； Ｌｙｓ１６Ｔｒｐ； Ｌｙｓ１６Ｔｙｒ； Ｌｅｕ１７Ａｌａ； Ｌｅｕ１７Ｃｙｓ； Ｌｅｕ１７Ａｓｐ； Ｌｅｕ１７Ｇｌｕ； Ｌｅｕ１７Ｐｈｅ； Ｌｅｕ１７Ｇｌｙ； Ｌｅｕ１７Ｈｉｓ； Ｌｅｕ１７Ｉｌｅ； Ｌｅｕ１７Ｌｙｓ； Ｌｅｕ１７Ｍｅｔ； Ｌｅｕ１７Ａｓｎ； Ｌｅｕ１７Ｐｒｏ； Ｌｅｕ１７Ｇｌｎ； Ｌｅｕ１７Ａｒｇ； Ｌｅｕ１７Ｓｅｒ； Ｌｅｕ１７Ｔｈｒ； Ｌｅｕ１７Ｖａｌ； Ｌｅｕ１７Ｔｒｐ； Ｌｅｕ１７Ｔｙｒ； Ｇｌｙ１８Ａｌａ； Ｇｌｙ１８Ｃｙｓ； Ｇｌｙ１８Ａｓｐ； Ｇｌｙ１８Ｇｌｕ； Ｇｌｙ１８Ｐｈｅ； Ｇｌｙ１８Ｈｉｓ； Ｇｌｙ１８Ｉｌｅ； Ｇｌｙ１８Ｌｙｓ； Ｇｌｙ１８Ｌｅｕ； Ｇｌｙ１８Ｍｅｔ； Ｇｌｙ１８Ａｓｎ； Ｇｌｙ１８Ｐｒｏ； Ｇｌｙ１８Ｇｌｎ； Ｇｌｙ１８Ａｒｇ； Ｇｌｙ１８Ｓｅｒ； Ｇｌｙ１８Ｔｈｒ； Ｇｌｙ１８Ｖａｌ； Ｇｌｙ１８Ｔｒｐ； Ｇｌｙ１８Ｔｙｒ； Ｉｌｅ１９Ａｌａ； Ｉｌｅ１９Ｃｙｓ； Ｉｌｅ１９Ａｓｐ； Ｉｌｅ１９Ｇｌｕ； Ｉｌｅ１９Ｐｈｅ； Ｉｌｅ１９Ｇｌｙ； Ｉｌｅ１９Ｈｉｓ； Ｉｌｅ１９Ｌｙｓ； Ｉｌｅ１９Ｌｅｕ； Ｉｌｅ１９Ｍｅｔ； Ｉｌｅ１９Ａｓｎ； Ｉｌｅ１９Ｐｒｏ； Ｉｌｅ１９Ｇｌｎ； Ｉｌｅ１９Ａｒｇ； Ｉｌｅ１９Ｓｅｒ； Ｉｌｅ１９Ｔｈｒ； Ｉｌｅ１９Ｖａｌ； Ｉｌｅ１９Ｔｒｐ； Ｉｌｅ１９Ｔｙｒ； Ｐｈｅ２０Ａｌａ； Ｐｈｅ２０Ｃｙｓ； Ｐｈｅ２０Ａｓｐ； Ｐｈｅ２０Ｇｌｕ； Ｐｈｅ２０Ｇｌｙ； Ｐｈｅ２０Ｈｉｓ； Ｐｈｅ２０Ｉｌｅ； Ｐｈｅ２０Ｌｙｓ； Ｐｈｅ２０Ｌｅｕ； Ｐｈｅ２０Ｍｅｔ； Ｐｈｅ２０Ａｓｎ； Ｐｈｅ２０Ｐｒｏ； Ｐｈｅ２０Ｇｌｎ； Ｐｈｅ２０Ａｒｇ； Ｐｈｅ２０Ｓｅｒ； Ｐｈｅ２０Ｔｈｒ； Ｐｈｅ２０Ｖａｌ； Ｐｈｅ２０Ｔｒｐ； Ｐｈｅ２０Ｔｙｒ； Ａｌａ２１Ｃｙｓ； Ａｌａ２１Ａｓｐ； Ａｌａ２１Ｇｌｕ； Ａｌａ２１Ｐｈｅ； Ａｌａ２１Ｇｌｙ； Ａｌａ２１Ｈｉｓ； Ａｌａ２１Ｉｌｅ； Ａｌａ２１Ｌｙｓ； Ａｌａ２１Ｌｅｕ； Ａｌａ２１Ｍｅｔ； Ａｌａ２１Ａｓｎ； Ａｌａ２１Ｐｒｏ； Ａｌａ２１Ｇｌｎ； Ａｌａ２１Ａｒｇ； Ａｌａ２１Ｓｅｒ； Ａｌａ２１Ｔｈｒ； Ａｌａ２１Ｖａｌ； Ａｌａ２１Ｔｒｐ； Ａｌａ２１Ｔｙｒ； Ｌｅｕ２２Ａｌａ； Ｌｅｕ２２Ｃｙｓ； Ｌｅｕ２２Ａｓｐ； Ｌｅｕ２２Ｇｌｕ； Ｌｅｕ２２Ｐｈｅ； Ｌｅｕ２２Ｇｌｙ； Ｌｅｕ２２Ｈｉｓ； Ｌｅｕ２２Ｉｌｅ； Ｌｅｕ２２Ｌｙｓ； Ｌｅｕ２２Ｍｅｔ； Ｌｅｕ２２Ａｓｎ； Ｌｅｕ２２Ｐｒｏ； Ｌｅｕ２２Ｇｌｎ； Ｌｅｕ２２Ａｒｇ； Ｌｅｕ２２Ｓｅｒ； Ｌｅｕ２２Ｔｈｒ； Ｌｅｕ２２Ｖａｌ； Ｌｅｕ２２Ｔｒｐ； Ｌｅｕ２２Ｔｙｒ； Ａｓｐ２３Ａｌａ； Ａｓｐ２３Ｃｙｓ； Ａｓｐ２３Ｇｌｕ； Ａｓｐ２３Ｐｈｅ； Ａｓｐ２３Ｇｌｙ； Ａｓｐ２３Ｈｉｓ； Ａｓｐ２３Ｉｌｅ； Ａｓｐ２３Ｌｙｓ； Ａｓｐ２３Ｌｅｕ； Ａｓｐ２３Ｍｅｔ； Ａｓｐ２３Ａｓｎ； Ａｓｐ２３Ｐｒｏ； Ａｓｐ２３Ｇｌｎ； Ａｓｐ２３Ａｒｇ； Ａｓｐ２３Ｓｅｒ； Ａｓｐ２３Ｔｈｒ； Ａｓｐ２３Ｖａｌ； Ａｓｐ２３Ｔｒｐ； Ａｓｐ２３Ｔｙｒ； Ｔｈｒ２４Ａｌａ； Ｔｈｒ２４Ｃｙｓ； Ｔｈｒ２４Ａｓｐ； Ｔｈｒ２４Ｇｌｕ； Ｔｈｒ２４Ｐｈｅ； Ｔｈｒ２４Ｇｌｙ； Ｔｈｒ２４Ｈｉｓ； Ｔｈｒ２４Ｉｌｅ； Ｔｈｒ２４Ｌｙｓ； Ｔｈｒ２４Ｌｅｕ； Ｔｈｒ２４Ｍｅｔ； Ｔｈｒ２４Ａｓｎ； Ｔｈｒ２４Ｐｒｏ； Ｔｈｒ２４Ｇｌｎ； Ｔｈｒ２４Ａｒｇ； Ｔｈｒ２４Ｓｅｒ； Ｔｈｒ２４Ｖａｌ； Ｔｈｒ２４Ｔｒｐ； Ｔｈｒ２４Ｔｙｒ； Ｇｌｙ２５Ａｌａ； Ｇｌｙ２５Ｃｙｓ； Ｇｌｙ２５Ａｓｐ； Ｇｌｙ２５Ｇｌｕ； Ｇｌｙ２５Ｐｈｅ； Ｇｌｙ２５Ｈｉｓ； Ｇｌｙ２５Ｉｌｅ； Ｇｌｙ２５Ｌｙｓ； Ｇｌｙ２５Ｌｅｕ； Ｇｌｙ２５Ｍｅｔ； Ｇｌｙ２５Ａｓｎ； Ｇｌｙ２５Ｐｒｏ； Ｇｌｙ２５Ｇｌｎ； Ｇｌｙ２５Ａｒｇ； Ｇｌｙ２５Ｓｅｒ； Ｇｌｙ２５Ｔｈｒ； Ｇｌｙ２５Ｖａｌ； Ｇｌｙ２５Ｔｒｐ； Ｇｌｙ２５Ｔｙｒ； Ｔｈｒ２６Ａｌａ； Ｔｈｒ２６Ｃｙｓ； Ｔｈｒ２６Ａｓｐ； Ｔｈｒ２６Ｇｌｕ； Ｔｈｒ２６Ｐｈｅ； Ｔｈｒ２６Ｇｌｙ； Ｔｈｒ２６Ｈｉｓ； Ｔｈｒ２６Ｉｌｅ； Ｔｈｒ２６Ｌｙｓ； Ｔｈｒ２６Ｌｅｕ； Ｔｈｒ２６Ｍｅｔ； Ｔｈｒ２６Ａｓｎ； Ｔｈｒ２６Ｐｒｏ； Ｔｈｒ２６Ｇｌｎ； Ｔｈｒ２６Ａｒｇ； Ｔｈｒ２６Ｓｅｒ； Ｔｈｒ２６Ｖａｌ； Ｔｈｒ２６Ｔｒｐ； Ｔｈｒ２６Ｔｙｒ； Ａｓｎ２７Ａｌａ； Ａｓｎ２７Ｃｙｓ； Ａｓｎ２７Ａｓｐ； Ａｓｎ２７Ｇｌｕ； Ａｓｎ２７Ｐｈｅ； Ａｓｎ２７Ｇｌｙ； Ａｓｎ２７Ｈｉｓ； Ａｓｎ２７Ｉｌｅ； Ａｓｎ２７Ｌｙｓ； Ａｓｎ２７Ｌｅｕ； Ａｓｎ２７Ｍｅｔ； Ａｓｎ２７Ｐｒｏ； Ａｓｎ２７Ｇｌｎ； Ａｓｎ２７Ａｒｇ； Ａｓｎ２７Ｓｅｒ； Ａｓｎ２７Ｔｈｒ； Ａｓｎ２７Ｖａｌ； Ａｓｎ２７Ｔｒｐ； Ａｓｎ２７Ｔｙｒ； Ａｒｇ２８Ａｌａ； Ａｒｇ２８Ｃｙｓ； Ａｒｇ２８Ａｓｐ； Ａｒｇ２８Ｇｌｕ； Ａｒｇ２８Ｐｈｅ； Ａｒｇ２８Ｇｌｙ； Ａｒｇ２８Ｈｉｓ； Ａｒｇ２８Ｉｌｅ； Ａｒｇ２８Ｌｙｓ； Ａｒｇ２８Ｌｅｕ； Ａｒｇ２８Ｍｅｔ； Ａｒｇ２８Ａｓｎ； Ａｒｇ２８Ｐｒｏ； Ａｒｇ２８Ｇｌｎ； Ａｒｇ２８Ｓｅｒ； Ａｒｇ２８Ｔｈｒ； Ａｒ
ｇ２８Ｖａｌ； Ａｒｇ２８Ｔｒｐ； Ａｒｇ２８Ｔｙｒ； Ｔｈｒ２９Ａｌａ； Ｔｈｒ２９Ｃｙｓ； Ｔｈｒ２９Ａｓｐ； Ｔｈｒ２９Ｇｌｕ； Ｔｈｒ２９Ｐｈｅ； Ｔｈｒ２９Ｇｌｙ； Ｔｈｒ２９Ｈｉｓ； Ｔｈｒ２９Ｉｌｅ； Ｔｈｒ２９Ｌｙｓ； Ｔｈｒ２９Ｌｅｕ； Ｔｈｒ２９Ｍｅｔ； Ｔｈｒ２９Ａｓｎ； Ｔｈｒ２９Ｐｒｏ； Ｔｈｒ２９Ｇｌｎ； Ｔｈｒ２９Ａｒｇ； Ｔｈｒ２９Ｓｅｒ； Ｔｈｒ２９Ｖａｌ； Ｔｈｒ２９Ｔｒｐ； Ｔｈｒ２９Ｔｙｒ； Ｖａｌ３０Ａｌａ； Ｖａｌ３０Ｃｙｓ； Ｖａｌ３０Ａｓｐ； Ｖａｌ３０Ｇｌｕ； Ｖａｌ３０Ｐｈｅ； Ｖａｌ３０Ｇｌｙ； Ｖａｌ３０Ｈｉｓ； Ｖａｌ３０Ｉｌｅ； Ｖａｌ３０Ｌｙｓ； Ｖａｌ３０Ｌｅｕ； Ｖａｌ３０Ｍｅｔ； Ｖａｌ３０Ａｓｎ； Ｖａｌ３０Ｐｒｏ； Ｖａｌ３０Ｇｌｎ； Ｖａｌ３０Ａｒｇ； Ｖａｌ３０Ｓｅｒ； Ｖａｌ３０Ｔｈｒ； Ｖａｌ３０Ｔｒｐ； Ｖａｌ３０Ｔｙｒ； Ａｌａ３１Ａｌａ； Ａｌａ３１Ｃｙｓ； Ａｌａ３１Ａｓｐ； Ａｌａ３１Ｇｌｕ； Ａｌａ３１Ｐｈｅ； Ａｌａ３１Ｇｌｙ； Ａｌａ３１Ｈｉｓ； Ａｌａ３１Ｉｌｅ； Ａｌａ３１Ｌｙｓ； Ａｌａ３１Ｌｅｕ； Ａｌａ３１Ｍｅｔ； Ａｌａ３１Ａｓｎ； Ａｌａ３１Ｐｒｏ； Ａｌａ３１Ｇｌｎ； Ａｌａ３１Ａｒｇ； Ａｌａ３１Ｓｅｒ； Ａｌａ３１Ｔｈｒ； Ａｌａ３１Ｖａｌ； Ａｌａ３１Ｔｒｐ； Ａｌａ３１Ｔｙｒ； Ｔｙｒ３２Ａｌａ； Ｔｙｒ３２Ｃｙｓ； Ｔｙｒ３２Ａｓｐ； Ｔｙｒ３２Ｇｌｕ； Ｔｙｒ３２Ｐｈｅ； Ｔｙｒ３２Ｇｌｙ； Ｔｙｒ３２Ｈｉｓ； Ｔｙｒ３２Ｉｌｅ； Ｔｙｒ３２Ｌｙｓ； Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ； Ｔｙｒ３２Ｍｅｔ； Ｔｙｒ３２Ａｓｎ； Ｔｙｒ３２Ｐｒｏ； Ｔｙｒ３２Ｇｌｎ； Ｔｙｒ３２Ａｒｇ； Ｔｙｒ３２Ｓｅｒ； Ｔｙｒ３２Ｔｈｒ； Ｔｙｒ３２Ｖａｌ； Ｔｙｒ３２Ｔｒｐ； Ａｒｇ３３Ａｌａ； Ａｒｇ３３Ｃｙｓ； Ａｒｇ３３Ａｓｐ； Ａｒｇ３３Ｇｌｕ； Ａｒｇ３３Ｐｈｅ； Ａｒｇ３３Ｇｌｙ； Ａｒｇ３３Ｈｉｓ； Ａｒｇ３３Ｉｌｅ； Ａｒｇ３３Ｌｙｓ； Ａｒｇ３３Ｌｅｕ； Ａｒｇ３３Ｍｅｔ； Ａｒｇ３３Ａｓｎ； Ａｒｇ３３Ｐｒｏ； Ａｒｇ３３Ｇｌｎ； Ａｒｇ３３Ｓｅｒ； Ａｒｇ３３Ｔｈｒ； Ａｒｇ３３Ｖａｌ； Ａｒｇ３３Ｔｒｐ； Ａｒｇ３３Ｔｙｒ； Ｐｒｏ３４Ａｌａ； Ｐｒｏ３４Ｃｙｓ； Ｐｒｏ３４Ａｓｐ； Ｐｒｏ３４Ｇｌｕ； Ｐｒｏ３４Ｐｈｅ； Ｐｒｏ３４Ｇｌｙ； Ｐｒｏ３４Ｈｉｓ； Ｐｒｏ３４Ｉｌｅ； Ｐｒｏ３４Ｌｙｓ； Ｐｒｏ３４Ｌｅｕ； Ｐｒｏ３４Ｍｅｔ； Ｐｒｏ３４Ａｓｎ； Ｐｒｏ３４Ｇｌｎ； Ｐｒｏ３４Ａｒｇ； Ｐｒｏ３４Ｓｅｒ； Ｐｒｏ３４Ｔｈｒ； Ｐｒｏ３４Ｖａｌ； Ｐｒｏ３４Ｔｒｐ； Ｐｒｏ３４Ｔｙｒ； Ａｓｐ３５Ａｌａ； Ａｓｐ３５Ｃｙｓ； Ａｓｐ３５Ｇｌｕ； Ａｓｐ３５Ｐｈｅ； Ａｓｐ３５Ｇｌｙ； Ａｓｐ３５Ｈｉｓ； Ａｓｐ３５Ｉｌｅ； Ａｓｐ３５Ｌｙｓ； Ａｓｐ３５Ｌｅｕ； Ａｓｐ３５Ｍｅｔ； Ａｓｐ３５Ａｓｎ； Ａｓｐ３５Ｐｒｏ； Ａｓｐ３５Ｇｌｎ； Ａｓｐ３５Ａｒｇ； Ａｓｐ３５Ｓｅｒ； Ａｓｐ３５Ｔｈｒ； Ａｓｐ３５Ｖａｌ； Ａｓｐ３５Ｔｒｐ； Ａｓｐ３５Ｔｙｒ； Ｇｌｕ３６Ａｌａ； Ｇｌｕ３６Ｃｙｓ； Ｇｌｕ３６Ａｓｐ； Ｇｌｕ３６Ｐｈｅ； Ｇｌｕ３６Ｇｌｙ； Ｇｌｕ３６Ｈｉｓ； Ｇｌｕ３６Ｉｌｅ； Ｇｌｕ３６Ｌｙｓ； Ｇｌｕ３６Ｌｅｕ； Ｇｌｕ３６Ｍｅｔ； Ｇｌｕ３６Ａｓｎ； Ｇｌｕ３６Ｐｒｏ； Ｇｌｕ３６Ｇｌｎ； Ｇｌｕ３６Ａｒｇ； Ｇｌｕ３６Ｓｅｒ； Ｇｌｕ３６Ｔｈｒ； Ｇｌｕ３６Ｖａｌ； Ｇｌｕ３６Ｔｒｐ； Ｇｌｕ３６Ｔｙｒ； Ａｒｇ３７Ａｌａ； Ａｒｇ３７Ｃｙｓ； Ａｒｇ３７Ａｓｐ； Ａｒｇ３７Ｇｌｕ； Ａｒｇ３７Ｐｈｅ； Ａｒｇ３７Ｇｌｙ； Ａｒｇ３７Ｈｉｓ； Ａｒｇ３７Ｉｌｅ； Ａｒｇ３７Ｌｙｓ； Ａｒｇ３７Ｌｅｕ； Ａｒｇ３７Ｍｅｔ； Ａｒｇ３７Ａｓｎ； Ａｒｇ３７Ｐｒｏ； Ａｒｇ３７Ｇｌｎ； Ａｒｇ３７Ｓｅｒ； Ａｒｇ３７Ｔｈｒ； Ａｒｇ３７Ｖａｌ； Ａｒｇ３７Ｔｒｐ； Ａｒｇ３７Ｔｙｒ； Ｐｈｅ３８Ａｌａ； Ｐｈｅ３８Ｃｙｓ； Ｐｈｅ３８Ａｓｐ； Ｐｈｅ３８Ｇｌｕ； Ｐｈｅ３８Ｇｌｙ； Ｐｈｅ３８Ｈｉｓ； Ｐｈｅ３８Ｉｌｅ； Ｐｈｅ３８Ｌｙｓ； Ｐｈｅ３８Ｌｅｕ； Ｐｈｅ３８Ｍｅｔ； Ｐｈｅ３８Ａｓｎ； Ｐｈｅ３８Ｐｒｏ； Ｐｈｅ３８Ｇｌｎ； Ｐｈｅ３８Ａｒｇ； Ｐｈｅ３８Ｓｅｒ； Ｐｈｅ３８Ｔｈｒ； Ｐｈｅ３８Ｖａｌ； Ｐｈｅ３８Ｔｒｐ； Ｐｈｅ３８Ｔｙｒ； Ａｌａ３９Ｃｙｓ； Ａｌａ３９Ａｓｐ； Ａｌａ３９Ｇｌｕ； Ａｌａ３９Ｐｈｅ； Ａｌａ３９Ｇｌｙ； Ａｌａ３９Ｈｉｓ； 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２Ａｒｇ； Ｈｉｓ８２Ｓｅｒ； Ｈｉｓ８２Ｔｈｒ； Ｈｉｓ８２Ｖａｌ； Ｈｉｓ８２Ｔｒｐ； Ｈｉｓ８２Ｔｙｒ； Ｖａｌ８３Ａｌａ； Ｖａｌ８３Ｃｙｓ； Ｖａｌ８３Ａｓｐ； Ｖａｌ８３Ｇｌｕ； Ｖａｌ８３Ｐｈｅ； Ｖａｌ８３Ｇｌｙ； Ｖａｌ８３Ｈｉｓ； Ｖａｌ８３Ｉｌｅ； Ｖａｌ８３Ｌｙｓ； Ｖａｌ８３Ｌｅｕ； Ｖａｌ８３Ｍｅｔ； Ｖａｌ８３Ａｓｎ； Ｖａｌ８３Ｐｒｏ； Ｖａｌ８３Ｇｌｎ； Ｖａｌ８３Ａｒｇ； Ｖａｌ８３Ｓｅｒ； Ｖａｌ８３Ｔｈｒ； Ｖａｌ８３Ｔｒｐ； Ｖａｌ８３Ｔｙｒ； Ａｓｐ８４Ａｌａ； Ａｓｐ８４Ｃｙｓ； Ａｓｐ８４Ｇｌｕ； Ａｓｐ８４Ｐｈｅ； Ａｓｐ８４Ｇｌｙ； Ａｓｐ８４Ｈｉｓ； Ａｓｐ８４Ｉｌｅ； Ａｓｐ８４Ｌｙｓ； Ａｓｐ８４Ｌｅｕ； Ａｓｐ８４Ｍｅｔ； Ａｓｐ８４Ａｓｎ； Ａｓｐ８４Ｐｒｏ； Ａｓｐ８４Ｇｌｎ； Ａｓｐ８４Ａｒｇ； Ａｓｐ８４Ｓｅｒ； Ａｓｐ８４Ｔｈｒ； Ａｓｐ８４Ｖａｌ； Ａｓｐ８４Ｔｒｐ； Ａｓｐ８４Ｔｙｒ； Ｔｈｒ８５Ａｌａ； Ｔｈｒ８５Ｃｙｓ； Ｔｈｒ８５Ａｓｐ； Ｔｈｒ８５Ｇｌｕ； Ｔｈｒ８５Ｐｈｅ； Ｔｈｒ８５Ｇｌｙ； Ｔｈｒ８５Ｈｉｓ； Ｔｈｒ８５Ｉｌｅ； Ｔｈｒ８５Ｌｙｓ； Ｔｈｒ８５Ｌｅｕ； Ｔｈｒ８５Ｍｅｔ； Ｔｈｒ８５Ａｓｎ； Ｔｈｒ８５Ｐｒｏ； Ｔｈｒ８５Ｇｌｎ； Ｔｈｒ８５Ａｒｇ； Ｔｈｒ８５Ｓｅｒ； Ｔｈｒ８５Ｖａｌ； Ｔｈｒ８５Ｔｒｐ； Ｔｈｒ８５Ｔｙｒ； Ｇｌｙ８６Ａｌａ； Ｇｌｙ８６Ｃｙｓ； Ｇｌｙ８６Ａｓｐ； Ｇｌｙ８６Ｇｌｕ； Ｇｌｙ８６Ｐｈｅ； Ｇｌｙ８６Ｈｉｓ； Ｇｌｙ８６Ｉｌｅ； Ｇｌｙ８６Ｌｙｓ； Ｇｌｙ８６Ｌｅｕ； Ｇｌｙ８６Ｍｅｔ； Ｇｌｙ８６Ａｓｎ； Ｇｌｙ８６Ｐｒｏ； Ｇｌｙ８６Ｇｌｎ； Ｇｌｙ８６Ａｒｇ； Ｇｌｙ８６Ｓｅｒ； Ｇｌｙ８６Ｔｈｒ； Ｇｌｙ８６Ｖａｌ； Ｇｌｙ８６Ｔｒｐ； Ｇｌｙ８６Ｔｙｒ； Ｍｅｔ８７Ａｌａ； Ｍｅｔ８７Ｃｙｓ； Ｍｅｔ８７Ａｓｐ； Ｍｅｔ８７Ｇｌｕ； Ｍｅｔ８７Ｐｈｅ； Ｍｅｔ８７Ｇｌｙ； Ｍｅｔ８７Ｈｉｓ； Ｍｅｔ８７Ｉｌｅ； Ｍｅｔ８７Ｌｙｓ； Ｍｅｔ８７Ｌｅｕ； Ｍｅｔ８７Ａｓｎ； Ｍｅｔ８７Ｐｒｏ； Ｍｅｔ８７Ｇｌｎ； Ｍｅｔ８７Ａｒｇ； Ｍｅｔ８７Ｓｅｒ； Ｍｅｔ８７Ｔｈｒ； Ｍｅｔ８７Ｖａｌ； Ｍｅｔ８７Ｔｒｐ； 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２Ｇｌｙ； Ｌｙｓ１８２Ｈｉｓ； Ｌｙｓ１８２Ｉｌｅ； Ｌｙｓ１８２Ｌｅｕ； Ｌｙｓ１８２Ｍｅｔ； Ｌｙｓ１８２Ａｓｎ； Ｌｙｓ１８２Ｐｒｏ； Ｌｙｓ１８２Ｇｌｎ； Ｌｙｓ１８２Ａｒｇ； Ｌｙｓ１８２Ｓｅｒ； Ｌｙｓ１８２Ｔｈｒ； Ｌｙｓ１８２Ｖａｌ； Ｌｙｓ１８２Ｔｒｐ； Ｌｙｓ１８２Ｔｙｒ； Ａｒｇ１８３Ａｌａ； Ａｒｇ１８３Ｃｙｓ； Ａｒｇ１８３Ａｓｐ； Ａｒｇ１８３Ｇｌｕ； Ａｒｇ１８３Ｐｈｅ； Ａｒｇ１８３Ｇｌｙ； Ａｒｇ１８３Ｈｉｓ； Ａｒｇ１８３Ｉｌｅ； Ａｒｇ１８３Ｌｙｓ； Ａｒｇ１８３Ｌｅｕ； Ａｒｇ１８３Ｍｅｔ； Ａｒｇ１８３Ａｓｎ； Ａｒｇ１８３Ｐｒｏ； Ａｒｇ１８３Ｇｌｎ； Ａｒｇ１８３Ｓｅｒ； Ａｒｇ１８３Ｔｈｒ； Ａｒｇ１８３Ｖａｌ； Ａｒｇ１８３Ｔｒｐ； Ａｒｇ１８３Ｔｙｒ； Ａｓｎ１８４Ａｌａ； Ａｓｎ１８４Ｃｙｓ； Ａｓｎ１８４Ａｓｐ； Ａｓｎ１８４Ｇｌｕ； Ａｓｎ１８４Ｐｈｅ； Ａｓｎ１８４Ｇｌｙ； Ａｓｎ１８４Ｈｉｓ； Ａｓｎ１８４Ｉｌｅ； Ａｓｎ１８４Ｌｙｓ； Ａｓｎ１８４Ｌｅｕ； Ａｓｎ１８４Ｍｅｔ； Ａｓｎ１８４Ｐｒｏ； Ａｓｎ１８４Ｇｌｎ； Ａｓｎ１８４Ａｒｇ； Ａｓｎ１８４Ｓｅｒ； Ａｓｎ１８４Ｔｈｒ； Ａｓｎ１８４Ｖａｌ； Ａｓｎ１８４Ｔｒｐ； Ａｓｎ１８４Ｔｙｒ； Ｔｈｒ１８５Ａｌａ； Ｔｈｒ１８５Ｃｙｓ； Ｔｈｒ１８５Ａｓｐ； Ｔｈｒ１８５Ｇｌｕ； Ｔｈｒ１８５Ｐｈｅ； Ｔｈｒ１８５Ｇｌｙ； Ｔｈｒ１８５Ｈｉｓ； Ｔｈｒ１８５Ｉｌｅ； Ｔｈｒ１８５Ｌｙｓ； Ｔｈｒ１８５Ｌｅｕ； Ｔｈｒ１８５Ｍｅｔ； Ｔｈｒ１８５Ａｓｎ； Ｔｈｒ１８５Ｐｒｏ； Ｔｈｒ１８５Ｇｌｎ； Ｔｈｒ１８５Ａｒｇ； Ｔｈｒ１８５Ｓｅｒ； Ｔｈｒ１８５Ｖａｌ； Ｔｈｒ１８５Ｔｒｐ； Ｔｈｒ１８５Ｔｙｒ； Ｔｈｒ１８６Ａｌａ； Ｔｈｒ１８６Ｃｙｓ； Ｔｈｒ１８６Ａｓｐ； Ｔｈｒ１８６Ｇｌｕ； Ｔｈｒ１８６Ｐｈｅ； Ｔｈｒ１８６Ｇｌｙ； Ｔｈｒ１８６Ｈｉｓ； Ｔｈｒ１８６Ｉｌｅ； Ｔｈｒ１８６Ｌｙｓ； Ｔｈｒ１８６Ｌｅｕ； Ｔｈｒ１８６Ｍｅｔ； Ｔｈｒ１８６Ａｓｎ； Ｔｈｒ１８６Ｐｒｏ； Ｔｈｒ１８６Ｇｌｎ； Ｔｈｒ１８６Ａｒｇ； Ｔｈｒ１８６Ｓｅｒ； Ｔｈｒ１８６Ｖａｌ； Ｔｈｒ１８６Ｔｒｐ； Ｔｈｒ１８６Ｔｙｒ； Ｇｌｙ１８７Ａｌａ； Ｇｌｙ１８７Ｃｙｓ； Ｇｌｙ１８７Ａｓｐ； Ｇｌｙ１８７Ｇｌｕ； Ｇｌｙ１８７Ｐｈｅ； Ｇｌｙ１８７Ｈｉｓ； Ｇｌｙ１８７Ｉｌｅ； Ｇｌｙ１８７Ｌｙｓ； Ｇｌｙ１８７Ｌｅｕ； Ｇｌｙ１８７Ｍｅｔ； Ｇｌｙ１８７Ａｓｎ； Ｇｌｙ１８７Ｐｒｏ； Ｇｌｙ１８７Ｇｌｎ； Ｇｌｙ１８７Ａｒｇ； Ｇｌｙ１８７Ｓｅｒ； Ｇｌｙ１８７Ｔｈｒ； Ｇｌｙ１８７Ｖａｌ； Ｇｌｙ１８７Ｔｒｐ； Ｇｌｙ１８７Ｔｙｒ； Ａｓｐ１８８Ａｌａ； Ａｓｐ１８８Ｃｙｓ； Ａｓｐ１８８Ｇｌｕ； Ａｓｐ１８８Ｐｈｅ； Ａｓｐ１８８Ｇｌｙ； Ａｓｐ１８８Ｈｉｓ； Ａｓｐ１８８Ｉｌｅ； Ａｓｐ１８８Ｌｙｓ； Ａｓｐ１８８Ｌｅｕ； Ａｓｐ１８８Ｍｅｔ； Ａｓｐ１８８Ａｓｎ； Ａｓｐ１８８Ｐｒｏ； Ａｓｐ１８８Ｇｌｎ； Ａｓｐ１８８Ａｒｇ； Ａｓｐ１８８Ｓｅｒ； Ａｓｐ１８８Ｔｈｒ； Ａｓｐ１８８Ｖａｌ； Ａｓｐ１８８Ｔｒｐ； Ａｓｐ１８８Ｔｙｒ； Ａｌａ１８９Ｃｙｓ； Ａｌａ１８９Ａｓｐ； Ａｌａ１８９Ｇｌｕ； Ａｌａ１８９Ｐｈｅ； Ａｌａ１８９Ｇｌｙ； Ａｌａ１８９Ｈｉｓ； Ａｌａ１８９Ｉｌｅ； Ａｌａ１８９Ｌｙｓ； Ａｌａ１８９Ｌｅｕ； Ａｌａ１８９Ｍｅｔ； Ａｌａ１８９Ａｓｎ； Ａｌａ１８９Ｐｒｏ； Ａｌａ１８９Ｇｌｎ； Ａｌａ１８９Ａｒｇ； Ａｌａ１８９Ｓｅｒ； Ａｌａ１８９Ｔｈｒ； Ａｌａ１８９Ｖａｌ； Ａｌａ１８９Ｔｒｐ； Ａｌａ１８９Ｔｙｒ； Ｌｅｕ１９０Ａｌａ； Ｌｅｕ１９０Ｃｙｓ； Ｌｅｕ１９０Ａｓｐ； Ｌｅｕ１９０Ｇｌｕ； Ｌｅｕ１９０Ｐｈｅ； Ｌｅｕ１９０Ｇｌｙ； Ｌｅｕ１９０Ｈｉｓ； Ｌｅｕ１９０Ｉｌｅ； Ｌｅｕ１９０Ｌｙｓ； Ｌｅｕ１９０Ｍｅｔ； Ｌｅｕ１９０Ａｓｎ； Ｌｅｕ１９０Ｐｒｏ； Ｌｅｕ１９０Ｇｌｎ； Ｌｅｕ１９０Ａｒｇ； Ｌｅｕ１９０Ｓｅｒ； Ｌｅｕ１９０Ｔｈｒ； Ｌｅｕ１９０Ｖａｌ； Ｌｅｕ１９０Ｔｒｐ； Ｌｅｕ１９０Ｔｙｒ； Ｉｌｅ１９１Ａｌａ； Ｉｌｅ１９１Ｃｙｓ； Ｉｌｅ１９１Ａｓｐ； Ｉｌｅ１９１Ｇｌｕ； Ｉｌｅ１９１Ｐｈｅ； Ｉｌｅ１９１Ｇｌｙ； Ｉｌｅ１９１Ｈｉｓ； Ｉｌｅ１９１Ｌｙｓ； Ｉｌｅ１９１Ｌｅｕ； Ｉｌｅ１９１Ｍｅｔ； Ｉｌｅ１９１Ａｓｎ； Ｉｌｅ１９１Ｐｒｏ； Ｉｌｅ１９１Ｇｌｎ； Ｉｌｅ１９１Ａｒｇ； Ｉｌｅ１９１Ｓｅｒ； Ｉｌｅ１９１Ｔｈｒ； 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Ｌｙｓ２４５Ｇｌｎ； Ｌｙｓ２４５Ａｒｇ； Ｌｙｓ２４５Ｓｅｒ； Ｌｙｓ２４５Ｔｈｒ； Ｌｙｓ２４５Ｖａｌ； Ｌｙｓ２４５Ｔｒｐ； Ｌｙｓ２４５Ｔｙｒ； Ｌｅｕ２４６Ａｌａ； Ｌｅｕ２４６Ｃｙｓ； Ｌｅｕ２４６Ａｓｐ； Ｌｅｕ２４６Ｇｌｕ； Ｌｅｕ２４６Ｐｈｅ； Ｌｅｕ２４６Ｇｌｙ； Ｌｅｕ２４６Ｈｉｓ； Ｌｅｕ２４６Ｉｌｅ； Ｌｅｕ２４６Ｌｙｓ； Ｌｅｕ２４６Ｍｅｔ； Ｌｅｕ２４６Ａｓｎ； Ｌｅｕ２４６Ｐｒｏ； Ｌｅｕ２４６Ｇｌｎ； Ｌｅｕ２４６Ａｒｇ； Ｌｅｕ２４６Ｓｅｒ； Ｌｅｕ２４６Ｔｈｒ； Ｌｅｕ２４６Ｖａｌ； Ｌｅｕ２４６Ｔｒｐ； Ｌｅｕ２４６Ｔｙｒ； Ｉｌｅ２４７Ａｌａ； Ｉｌｅ２４７Ｃｙｓ； Ｉｌｅ２４７Ａｓｐ； Ｉｌｅ２４７Ｇｌｕ； Ｉｌｅ２４７Ｐｈｅ； Ｉｌｅ２４７Ｇｌｙ； Ｉｌｅ２４７Ｈｉｓ； Ｉｌｅ２４７Ｌｙｓ； Ｉｌｅ２４７Ｌｅｕ； Ｉｌｅ２４７Ｍｅｔ； Ｉｌｅ２４７Ａｓｎ； Ｉｌｅ２４７Ｐｒｏ； Ｉｌｅ２４７Ｇｌｎ； Ｉｌｅ２４７Ａｒｇ； Ｉｌｅ２４７Ｓｅｒ； Ｉｌｅ２４７Ｔｈｒ； Ｉｌｅ２４７Ｖａｌ； Ｉｌｅ２４７Ｔｒｐ； Ｉｌｅ２４７Ｔｙｒ； Ａｌａ２４８Ｃｙｓ； Ａｌａ２４８Ａｓｐ； Ａｌａ２４８Ｇｌｕ； Ａｌａ２４８Ｐｈｅ； Ａｌａ２４８Ｇｌｙ； Ａｌａ２４８Ｈｉｓ； Ａｌａ２４８Ｉｌｅ； Ａｌａ２４８Ｌｙｓ； Ａｌａ２４８Ｌｅｕ； Ａｌａ２４８Ｍｅｔ； Ａｌａ２４８Ａｓｎ； Ａｌａ２４８Ｐｒｏ； Ａｌａ２４８Ｇｌｎ； Ａｌａ２４８Ａｒｇ； Ａｌａ２４８Ｓｅｒ； Ａｌａ２４８Ｔｈｒ； Ａｌａ２４８Ｖａｌ； Ａｌａ２４８Ｔｒｐ； Ａｌａ２４８Ｔｙｒ； Ｇｌｕ２４９Ａｌａ； Ｇｌｕ２４９Ｃｙｓ； Ｇｌｕ２４９Ａｓｐ； Ｇｌｕ２４９Ｐｈｅ； Ｇｌｕ２４９Ｇｌｙ； Ｇｌｕ２４９Ｈｉｓ； Ｇｌｕ２４９Ｉｌｅ； Ｇｌｕ２４９Ｌｙｓ； Ｇｌｕ２４９Ｌｅｕ； Ｇｌｕ２４９Ｍｅｔ； Ｇｌｕ２４９Ａｓｎ； Ｇｌｕ２４９Ｐｒｏ； Ｇｌｕ２４９Ｇｌｎ； Ｇｌｕ２４９Ａｒｇ； Ｇｌｕ２４９Ｓｅｒ； Ｇｌｕ２４９Ｔｈｒ； Ｇｌｕ２４９Ｖａｌ； Ｇｌｕ２４９Ｔｒｐ； Ｇｌｕ２４９Ｔｙｒ； Ａｌａ２５０Ｃｙｓ； Ａｌａ２５０Ａｓｐ； Ａｌａ２５０Ｇｌｕ； Ａｌａ２５０Ｐｈｅ； Ａｌａ２５０Ｇｌｙ； Ａｌａ２５０Ｈｉｓ； Ａｌａ２５０Ｉｌｅ； Ａｌａ２５０Ｌｙｓ； Ａｌａ２５０Ｌｅｕ； Ａｌａ２５０Ｍｅｔ； Ａｌａ２５０Ａｓｎ； Ａｌａ２５０Ｐｒｏ； Ａｌａ２５０Ｇｌｎ； Ａｌａ２５０Ａｒｇ； Ａｌａ２５０Ｓｅｒ； Ａｌａ２５０Ｔｈｒ； Ａｌａ２５０Ｖａｌ； Ａｌａ２５０Ｔｒｐ； Ａｌａ２５０Ｔｙｒ； Ｔｈｒ２５１Ａｌａ； Ｔｈｒ２５１Ｃｙｓ； Ｔｈｒ２５１Ａｓｐ； Ｔｈｒ２５１Ｇｌｕ； Ｔｈｒ２５１Ｐｈｅ； Ｔｈｒ２５１Ｇｌｙ； Ｔｈｒ２５１Ｈｉｓ； Ｔｈｒ２５１Ｉｌｅ； Ｔｈｒ２５１Ｌｙｓ； Ｔｈｒ２５１Ｌｅｕ； Ｔｈｒ２５１Ｍｅｔ； Ｔｈｒ２５１Ａｓｎ； Ｔｈｒ２５１Ｐｒｏ； Ｔｈｒ２５１Ｇｌｎ； Ｔｈｒ２５１Ａｒｇ； Ｔｈｒ２５１Ｓｅｒ； Ｔｈｒ２５１Ｖａｌ； Ｔｈｒ２５１Ｔｒｐ； Ｔｈｒ２５１Ｔｙｒ； Ｌｙｓ２５２Ａｌａ； Ｌｙｓ２５２Ｃｙｓ； Ｌｙｓ２５２Ａｓｐ； Ｌｙｓ２５２Ｇｌｕ； Ｌｙｓ２５２Ｐｈｅ； Ｌｙｓ２５２Ｇｌｙ； Ｌｙｓ２５２Ｈｉｓ； Ｌｙｓ２５２Ｉｌｅ； Ｌｙｓ２５２Ｌｅｕ； Ｌｙｓ２５２Ｍｅｔ； Ｌｙｓ２５２Ａｓｎ； Ｌｙｓ２５２Ｐｒｏ； Ｌｙｓ２５２Ｇｌｎ； Ｌｙｓ２５２Ａｒｇ； Ｌｙｓ２５２Ｓｅｒ； Ｌｙｓ２５２Ｔｈｒ； Ｌｙｓ２５２Ｖａｌ； Ｌｙｓ２５２Ｔｒｐ； Ｌｙｓ２５２Ｔｙｒ； Ｖａｌ２５３Ａｌａ； Ｖａｌ２５３Ｃｙｓ； Ｖａｌ２５３Ａｓｐ； Ｖａｌ２５３Ｇｌｕ； Ｖａｌ２５３Ｐｈｅ； Ｖａｌ２５３Ｇｌｙ； Ｖａｌ２５３Ｈｉｓ； Ｖａｌ２５３Ｉｌｅ； Ｖａｌ２５３Ｌｙｓ； Ｖａｌ２５３Ｌｅｕ； Ｖａｌ２５３Ｍｅｔ； Ｖａｌ２５３Ａｓｎ； Ｖａｌ２５３Ｐｒｏ； Ｖａｌ２５３Ｇｌｎ； Ｖａｌ２５３Ａｒｇ； Ｖａｌ２５３Ｓｅｒ； Ｖａｌ２５３Ｔｈｒ； Ｖａｌ２５３Ｔｒｐ； Ｖａｌ２５３Ｔｙｒ； Ｖａｌ２５４Ａｌａ； Ｖａｌ２５４Ｃｙｓ； Ｖａｌ２５４Ａｓｐ； Ｖａｌ２５４Ｇｌｕ； Ｖａｌ２５４Ｐｈｅ； Ｖａｌ２５４Ｇｌｙ； Ｖａｌ２５４Ｈｉｓ； Ｖａｌ２５４Ｉｌｅ； Ｖａｌ２５４Ｌｙｓ； Ｖａｌ２５４Ｌｅｕ； Ｖａｌ２５４Ｍｅｔ； Ｖａｌ２５４Ａｓｎ； Ｖａｌ２５４Ｐｒｏ； Ｖａｌ２５４Ｇｌｎ； Ｖａｌ２５４Ａｒｇ； Ｖａｌ２５４Ｓｅｒ； Ｖａｌ２５４Ｔｈｒ； Ｖａｌ２５４Ｔｒｐ； Ｖａｌ２５４Ｔｙｒ； Ｍｅｔ２５５Ａｌａ； Ｍｅｔ２５５Ｃｙｓ； Ｍｅｔ２５５Ａｓｐ； Ｍｅｔ２５５Ｇｌｕ； Ｍｅｔ２５５Ｐｈｅ； Ｍｅｔ２５５Ｇｌｙ； Ｍｅｔ２５５Ｈｉｓ； Ｍｅｔ２５５Ｉｌｅ； Ｍｅｔ２５５Ｌｙｓ； Ｍｅｔ２５５Ｌｅｕ； Ｍｅｔ２５５Ａｓｎ； Ｍｅｔ２５５Ｐｒｏ； Ｍｅｔ２５５Ｇｌｎ； Ｍｅｔ２５５Ａｒｇ； Ｍｅｔ２５５Ｓｅｒ； Ｍ
ｅｔ２５５Ｔｈｒ； Ｍｅｔ２５５Ｖａｌ； Ｍｅｔ２５５Ｔｒｐ； Ｍｅｔ２５５Ｔｙｒ； Ｌｙｓ２５６Ａｌａ； Ｌｙｓ２５６Ｃｙｓ； Ｌｙｓ２５６Ａｓｐ； Ｌｙｓ２５６Ｇｌｕ； Ｌｙｓ２５６Ｐｈｅ； Ｌｙｓ２５６Ｇｌｙ； Ｌｙｓ２５６Ｈｉｓ； Ｌｙｓ２５６Ｉｌｅ； Ｌｙｓ２５６Ｌｅｕ； Ｌｙｓ２５６Ｍｅｔ； Ｌｙｓ２５６Ａｓｎ； Ｌｙｓ２５６Ｐｒｏ； Ｌｙｓ２５６Ｇｌｎ； Ｌｙｓ２５６Ａｒｇ； Ｌｙｓ２５６Ｓｅｒ； Ｌｙｓ２５６Ｔｈｒ； Ｌｙｓ２５６Ｖａｌ； Ｌｙｓ２５６Ｔｒｐ； Ｌｙｓ２５６Ｔｙｒ； Ａｌａ２５７Ｃｙｓ； Ａｌａ２５７Ａｓｐ； Ａｌａ２５７Ｇｌｕ； Ａｌａ２５７Ｐｈｅ； Ａｌａ２５７Ｇｌｙ； Ａｌａ２５７Ｈｉｓ； Ａｌａ２５７Ｉｌｅ； Ａｌａ２５７Ｌｙｓ； Ａｌａ２５７Ｌｅｕ； Ａｌａ２５７Ｍｅｔ； Ａｌａ２５７Ａｓｎ； Ａｌａ２５７Ｐｒｏ； Ａｌａ２５７Ｇｌｎ； Ａｌａ２５７Ａｒｇ； Ａｌａ２５７Ｓｅｒ； Ａｌａ２５７Ｔｈｒ； Ａｌａ２５７Ｖａｌ； Ａｌａ２５７Ｔｒｐ； Ａｌａ２５７Ｔｙｒ； Ｌｅｕ２５８Ａｌａ； Ｌｅｕ２５８Ｃｙｓ； Ｌｅｕ２５８Ａｓｐ； Ｌｅｕ２５８Ｇｌｕ； Ｌｅｕ２５８Ｐｈｅ； Ｌｅｕ２５８Ｇｌｙ； Ｌｅｕ２５８Ｈｉｓ； Ｌｅｕ２５８Ｉｌｅ； Ｌｅｕ２５８Ｌｙｓ； Ｌｅｕ２５８Ｍｅｔ； Ｌｅｕ２５８Ａｓｎ； Ｌｅｕ２５８Ｐｒｏ； Ｌｅｕ２５８Ｇｌｎ； Ｌｅｕ２５８Ａｒｇ； Ｌｅｕ２５８Ｓｅｒ； Ｌｅｕ２５８Ｔｈｒ； Ｌｅｕ２５８Ｖａｌ； Ｌｅｕ２５８Ｔｒｐ； Ｌｅｕ２５８Ｔｙｒ； Ａｓｎ２５９Ａｌａ； Ａｓｎ２５９Ｃｙｓ； Ａｓｎ２５９Ａｓｐ； Ａｓｎ２５９Ｇｌｕ； Ａｓｎ２５９Ｐｈｅ； Ａｓｎ２５９Ｇｌｙ； Ａｓｎ２５９Ｈｉｓ； Ａｓｎ２５９Ｉｌｅ； Ａｓｎ２５９Ｌｙｓ； Ａｓｎ２５９Ｌｅｕ； Ａｓｎ２５９Ｍｅｔ； Ａｓｎ２５９Ｐｒｏ； Ａｓｎ２５９Ｇｌｎ； Ａｓｎ２５９Ａｒｇ； Ａｓｎ２５９Ｓｅｒ； Ａｓｎ２５９Ｔｈｒ； Ａｓｎ２５９Ｖａｌ； Ａｓｎ２５９Ｔｒｐ； Ａｓｎ２５９Ｔｙｒ； Ｍｅｔ２６０Ａｌａ； Ｍｅｔ２６０Ｃｙｓ； Ｍｅｔ２６０Ａｓｐ； Ｍｅｔ２６０Ｇｌｕ； Ｍｅｔ２６０Ｐｈｅ； Ｍｅｔ２６０Ｇｌｙ； Ｍｅｔ２６０Ｈｉｓ； Ｍｅｔ２６０Ｉｌｅ； Ｍｅｔ２６０Ｌｙｓ； Ｍｅｔ２６０Ｌｅｕ； Ｍｅｔ２６０Ａｓｎ； Ｍｅｔ２６０Ｐｒｏ； Ｍｅｔ２６０Ｇｌｎ； Ｍｅｔ２６０Ａｒｇ； Ｍｅｔ２６０Ｓｅｒ； Ｍｅｔ２６０Ｔｈｒ； Ｍｅｔ２６０Ｖａｌ； Ｍｅｔ２６０Ｔｒｐ； Ｍｅｔ２６０Ｔｙｒ； Ａｓｎ２６１Ａｌａ； Ａｓｎ２６１Ｃｙｓ； Ａｓｎ２６１Ａｓｐ； Ａｓｎ２６１Ｇｌｕ； Ａｓｎ２６１Ｐｈｅ； Ａｓｎ２６１Ｇｌｙ； Ａｓｎ２６１Ｈｉｓ； Ａｓｎ２６１Ｉｌｅ； Ａｓｎ２６１Ｌｙｓ； Ａｓｎ２６１Ｌｅｕ； Ａｓｎ２６１Ｍｅｔ； Ａｓｎ２６１Ｐｒｏ； Ａｓｎ２６１Ｇｌｎ； Ａｓｎ２６１Ａｒｇ； Ａｓｎ２６１Ｓｅｒ； Ａｓｎ２６１Ｔｈｒ； Ａｓｎ２６１Ｖａｌ； Ａｓｎ２６１Ｔｒｐ； Ａｓｎ２６１Ｔｙｒ； Ｇｌｙ２６２Ａｌａ； Ｇｌｙ２６２Ｃｙｓ； Ｇｌｙ２６２Ａｓｐ； Ｇｌｙ２６２Ｇｌｕ； Ｇｌｙ２６２Ｐｈｅ； Ｇｌｙ２６２Ｈｉｓ； Ｇｌｙ２６２Ｉｌｅ； Ｇｌｙ２６２Ｌｙｓ； Ｇｌｙ２６２Ｌｅｕ； Ｇｌｙ２６２Ｍｅｔ； Ｇｌｙ２６２Ａｓｎ； Ｇｌｙ２６２Ｐｒｏ； Ｇｌｙ２６２Ｇｌｎ； Ｇｌｙ２６２Ａｒｇ； Ｇｌｙ２６２Ｓｅｒ； Ｇｌｙ２６２Ｔｈｒ； Ｇｌｙ２６２Ｖａｌ； Ｇｌｙ２６２Ｔｒｐ； Ｇｌｙ２６２Ｔｙｒ； Ｌｙｓ２６３Ａｌａ； Ｌｙｓ２６３Ｃｙｓ； Ｌｙｓ２６３Ａｓｐ； Ｌｙｓ２６３Ｇｌｕ； Ｌｙｓ２６３Ｐｈｅ； Ｌｙｓ２６３Ｇｌｙ； Ｌｙｓ２６３Ｈｉｓ； Ｌｙｓ２６３Ｉｌｅ； Ｌｙｓ２６３Ｌｅｕ； Ｌｙｓ２６３Ｍｅｔ； Ｌｙｓ２６３Ａｓｎ； Ｌｙｓ２６３Ｐｒｏ； Ｌｙｓ２６３Ｇｌｎ； Ｌｙｓ２６３Ａｒｇ； Ｌｙｓ２６３Ｓｅｒ； Ｌｙｓ２６３Ｔｈｒ； Ｌｙｓ２６３Ｖａｌ； Ｌｙｓ２６３Ｔｒｐ； Ｌｙｓ２６３Ｔｙｒ； Ｍｅｔ ２６４Ａｌａ； Ｍｅｔ ２６４Ｃｙｓ； Ｍｅｔ ２６４Ａｓｐ； Ｍｅｔ ２６４Ｇｌｕ； Ｍｅｔ ２６４Ｐｈｅ； Ｍｅｔ ２６４Ｇｌｙ； Ｍｅｔ ２６４Ｈｉｓ； Ｍｅｔ ２６４Ｉｌｅ； Ｍｅｔ ２６４Ｌｙｓ； Ｍｅｔ ２６４Ｌｅｕ； Ｍｅｔ ２６４Ａｓｎ； Ｍｅｔ ２６４Ｐｒｏ； Ｍｅｔ ２６４Ｇｌｎ； Ｍｅｔ ２６４Ａｒｇ； Ｍｅｔ ２６４Ｓｅｒ； Ｍｅｔ ２６４Ｔｈｒ； Ｍｅｔ ２６４Ｖａｌ； Ｍｅｔ ２６４Ｔｒｐ； Ｍｅｔ ２６４Ｔｙｒ； Ａｓｎ ２６５Ａｌａ； Ａｓｎ ２６５Ｃｙｓ； Ａｓｎ ２６５Ａｓｐ； Ａｓｎ ２６５Ｇｌｕ； Ａｓｎ ２６５Ｐｈｅ； Ａｓｎ ２６５Ｇｌｙ； Ａｓｎ ２６５Ｈｉｓ； Ａｓｎ ２６５Ｉｌｅ； Ａｓｎ ２６５Ｌｙｓ； Ａｓｎ ２６５Ｌｅｕ； Ａｓｎ ２６５Ｍｅｔ； ； Ａｓｎ ２６５Ｐｒｏ； Ａｓｎ ２６５Ｇｌｎ； Ａｓｎ ２６５Ａｒｇ； Ａｓｎ ２６５Ｓｅｒ； Ａｓｎ ２６５Ｔｈｒ； Ａｓｎ ２６５Ｖａｌ； Ａｓｎ ２６５Ｔｒｐ； Ａｓｎ ２６５Ｔｙｒ； Ｇｌｙ ２６６Ａｌａ； Ｇｌｙ ２６６Ｃｙｓ； Ｇｌｙ ２６６Ａｓｐ； Ｇｌｙ ２６６Ｇｌｕ； Ｇｌｙ ２６６Ｐｈｅ； ； Ｇｌｙ ２６６Ｈｉｓ； Ｇｌｙ ２６６Ｉｌｅ； Ｇｌｙ ２６６Ｌｙｓ； Ｇｌｙ ２６６Ｌｅｕ； Ｇｌｙ ２６６Ｍｅｔ； Ｇｌｙ ２６６Ａｓｎ； Ｇｌｙ ２６６Ｐｒｏ； Ｇｌｙ ２６６Ｇｌｎ； Ｇｌｙ ２６６Ａｒｇ； Ｇｌｙ ２６６Ｓｅｒ； Ｇｌｙ ２６６Ｔｈｒ； Ｇｌｙ ２６６Ｖａｌ； Ｇｌｙ ２６６Ｔｒｐ； Ｇｌｙ ２６６Ｔｙｒ； Ｌｙｓ２６７Ａｌａ； Ｌｙｓ２６７Ｃｙｓ； Ｌｙｓ２６７Ａｓｐ； Ｌｙｓ２６７Ｇｌｕ； Ｌｙｓ２６７Ｐｈｅ； Ｌｙｓ２６７Ｇｌｙ； Ｌｙｓ２６７Ｈｉｓ； Ｌｙｓ２６７Ｉｌｅ； Ｌｙｓ２６７Ｌｅｕ； Ｌｙｓ２６７Ｍｅｔ； Ｌｙｓ２６７Ａｓｎ； Ｌｙｓ２６７Ｐｒｏ； Ｌｙｓ２６７Ｇｌｎ； Ｌｙｓ２６７Ａｒｇ； Ｌｙｓ２６７Ｓｅｒ； Ｌｙｓ２６７Ｔｈｒ； Ｌｙｓ２６７Ｖａｌ； Ｌｙｓ２６７Ｔｒｐ； および Ｌｙｓ２６７Ｔｙｒ．

【0023】

いくつかの実施形態では、配列番号１は、配列の最初の残基の直前にＭｅｔおよび／またはＴｈｒを有することができる。これらの残基は上記と同様に変異されてもよい。

【0024】

これら全ての変異体では、残基のナンバリングは配列番号１に対応する。これらの残基番号は、任意の従来の生物情報学的方法を使って、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ）またはＦＡＳＴＡ（ＦＡＳＴ－ＡＩＩ）を使って、Ａｍｂｌｅｒ番号（Ａｍｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓ Ａ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７６：２６９－２７２）に変換することができる。例えば、残基２４４は、Ａｍｂｌｅｒ２７６に対応する。例えば、次の変換表を使用することができる：

【表1】

【0025】

さらに、パーセント同一性も同様にこれら従来の生物情報学的方法により評価することができる。

【0026】

一態様では、本発明は、少なくとも７０％（例えば、約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列番号１または配列番号３に対する配列同一性および１つまたは複数のＡｍｂｌｅｒ分類による次の変異：Ｆ３３Ｘ、Ｑ１３５Ｘ、Ｇ１５６Ｘ、Ａ２３２Ｘ、Ａ２３７Ｘ、Ａ２３８Ｘ、Ｓ２４０Ｘ、Ｔ２４３Ｘ、Ｒ２４４Ｘ、Ｓ２６６Ｘ、およびＤ２７６Ｘ（Ｘは、任意の天然アミノ酸である。但し、Ｄ２７６Ｘは単一変異体の場合には存在しない）を有するアミノ酸配列を含むβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、Ｘは、天然の親水性または疎水性のアミノ酸残基または非古典的アミノ酸である。

【0027】

別の態様では、本発明は、少なくとも７０％の配列番号１または配列番号３に対する配列同一性を有し、１つまたは複数の次のＡｍｂｌｅｒ分類による変異を有するアミノ酸配列を含むβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物に関する：位置３３のフェニルアラニン（Ｆ）以外の疎水性の残基；位置１３５のグルタミン（Ｑ）以外の疎水性の残基；位置１５６のグリシン（Ｇ）以外の親水性の残基；位置２３２のアラニン（Ａ）以外の疎水性の残基；位置２３７のアラニン（Ａ）以外の親水性の残基；位置２３８のアラニン（Ａ）以外の親水性の残基；位置２４０のセリン（Ｓ）以外の親水性の残基；位置２４３のトレオニン（Ｔ）以外の疎水性の残基；位置２４４のアルギニン（Ｒ）以外の疎水性の残基；位置２６６以外のセリン（Ｓ）以外の親水性の残基；および位置２７６のアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性の残基（但し、位置２７６に対応するアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性のアミノ酸残基は、単一変異体の場合には存在しない）。

【0028】

本明細書全体を通して使用される場合、親水性のアミノ酸残基としては、アルギニン（Ｒ）もしくはリシン（Ｋ）から選択される極性で正電荷の親水性残基、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、およびシステイン（Ｃ）から選択される極性で中性電荷の親水性の残基、アスパラギン酸（Ｄ）もしくはグルタミン酸（Ｅ）から選択される極性で負電荷の親水性の残基、またはヒスチジン（Ｈ）を含む芳香族の極性で正電荷の親水性の残基を含むことができる。本明細書全体を通して使用される場合、疎水性のアミノ酸残基としては、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、もしくはバリン（Ｖ）から選択される疎水性の脂肪族アミノ酸、またはフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、もしくはチロシン（Ｙ）から選択される疎水性の芳香族アミノ酸を含むことができる。

【0029】

変異を、コドン縮退を考慮に入れることを含む遺伝子コードを参照することによりβ－ラクタマーゼ（例えば、配列番号３および４）の遺伝子配列に対し加えることができる。

【0030】

いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物は１つまたは複数のＡｍｂｌｅｒ分類の位置の次の変異を含む：Ｆ３３Ｙ、Ｑ１３５Ｍ、Ｇ１５６Ｒ、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８ＧまたはＴ、Ｓ２４０ＰまたはＤ、Ｔ２４３Ｉ、Ｒ２４４Ｔ、Ｓ２６６Ｎ、Ｄ２７６ＮまたはＲまたはＫ。但し、単一変異体の場合には、Ｄ２７６ＮまたはＲまたはＫは存在しない。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＱ１３５Ｍを含む。別の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＧ１５６ＲおよびＡ２３８Ｔを含む。別の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＦ３３ＹおよびＤ２７６Ｎを含む。さらに別の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＦ３３Ｙ、Ｓ２４０Ｐ、およびＤ２７６Ｎを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＦ３３Ｙ、Ａ２３８Ｔ、およびＤ２７６Ｎを含む。別の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、およびＳ２４０Ｄを含む。さらなる実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＲ２４４Ｔを含む。別の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｒを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｋを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＱ１３５Ｍを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３８Ｔを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＴ２４３Ｉ、Ｓ２６６Ｎ、およびＤ２７６Ｎを含む。一実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物はＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎを含む。

【0031】

他の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、配列番号２との少なくとも７０％の配列同一性を有し、Ａｍｂｌｅｒ分類による次の残基を有する：位置２３２のアラニン（Ａ）以外の疎水性の残基；位置２３７のアラニン（Ａ）以外の親水性の残基；位置２３８のアラニン（Ａ）以外の疎水性の残基；位置２４０のセリン（Ｓ）以外の親水性の残基；および位置２７６のアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性の残基。いくつかの実施形態では、位置２３２のアラニン（Ａ）以外の疎水性の残基はグリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、位置２３７のアラニン（Ａ）以外の親水性の残基はセリン（Ｓ）である。いくつかの実施形態では、位置２３８のアラニン（Ａ）以外の疎水性の残基はグリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態では、位置２４０のセリン（Ｓ）以外の親水性の残基はアスパラギン酸（Ｄ）である。いくつかの実施形態では、位置２７６のアスパラギン酸（Ｄ）以外の残基はアスパラギン（Ｎ）である。いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎの内の１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎの全てを含み、その配列は、配列番号５であってよい：
配列番号：５
ＥＭＫＤＤＦＡＫＬＥＥＱＦＤＡＫＬＧＩＦＡＬＤＴＧＴＮＲＴＶＡＹＲＰＤＥＲＦＡＦＡＳＴＩＫＡＬＴＶＧＶＬＬＱＱＫＳＩＥＤＬＮＱＲＩＴＴＲＤＤＬＶＮＹＮＰＩＴＥＫＨＶＤＴＧＭＴＬＫＥＬＡＤＡＳＬＲＹＳＤＮＡＡＱＮＬＩＬＫＱＩＧＧＰＥＳＬＫＫＥＬＲＫＩＧＤＥＶＴＮＰＥＲＦＥＰＥＬＮＥＶＮＰＧＥＴＱＤＴＳＴＡＲＡＬＶＴＳＬＲＡＦＡＬＥＤＫＬＰＳＥＫＲＥＬＬＩＤＷＭＫＲＮＴＴＧＤＡＬＩＲＡＧＶＰＤＧＷＥＶＧＤＫＴＧＳＧＤＹＧＴＲＮＤＩＡＩＩＷＰＰＫＧＤＰＶＶＬＡＶＬＳＳＲＤＫＫＤＡＫＹＤＮＫＬＩＡＥＡＴＫＶＶＭＫＡＬＮＭＮＧＫ
または
配列番号６：信号配列およびＱＡＳＫＴアミノ酸の付加を含む配列番号５（コード領域は下線付き）：

【化1】

【0032】

本発明は、本発明のいずれかのβ－ラクタマーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば、このようなポリヌクレオチドを含むベクターなども提供する。このようなポリヌクレオチドは、本発明のβ－ラクタマーゼをコードする配列に加えて、１つまたは複数の発現制御配列をさらに含んでよい。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御配列として、１つまたは複数のプロモータまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、およびポリアデニル化シグナルを含んでよい。ポリヌクレオチドは任意の好適なベクター内に挿入することができ、これは、任意の好適な発現用宿主細胞中に含めることができる。本発明の例示的ポリヌクレオチドは配列番号７である：
配列番号：７
Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎ変異体、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴは太字）ならびに追加のＫおよびＴアミノ酸の完全ヌクレオチド配列。リーダーおよび追加のヌクレオチド（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位ならびにＫおよびＴアミノ酸－アミノ酸配列ＱＡＳＫＴの付加用）には下線を引いている。

【化2】

【0033】

いくつかの実施形態では、治療薬をコードする挿入が転写され得る限り、ベクターはエピソームのままで残るか、または染色体に統合することができる。ベクターは標準的組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス、または原核または真核細胞中で複製および発現に使用することができる当該技術分野において既知のいずれか他のタイプ（例えば、アデノウイルス；レトロウイルス；レンチウイルス；ｓｃＡＡＶ；ｐＧＥＸベクター；ｐＥＴベクター。およびｐＨＴベクター）であってよい。当業者なら、多種多様の転写シグナル、例えば、プロモータおよびＲＮＡポリメラーゼのプロモータへの結合を調節するその他の配列を含む当該技術分野において既知の多種多様の要素（例えば、発現制御配列）をこのようなベクター中に含めることができることを理解するであろう。ベクターが発現される細胞中で効果的であることが分かっているいずれのプロモータも治療薬の発現を開始するために使用することができるであろう。適切なプロモータは、誘導可能、または構成的であってもよい。適切なプロモータの例としては、ｐＥＴ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ラックプロモータ、タック、ｔｒｃ、Ｔ７、ｔ７Ａ３プロモータ、ＰｈｏＡ、ｐｌｕｘ、およびファージラムダｐＲ、ラムダｐＬプロモータ（例えば、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２）３９：３８３－３９９；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１，１２：１９５を参照。これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）が含まれる。プロモータは誘導可能であってよい（例えば、ＩＰＴＧ、代謝物、温度を介して）。適切なプロモータの例には、ＳＶ４０初期プロモータ領域、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復配列中に含まれるプロモータ、ＨＳＶ－１チミジンキナーゼプロモータ、メタロチオネイン遺伝子の調節配列、など、ならびに次の動物転写制御領域、これは組織特異性を示し、遺伝子導入動物に利用されている：膵腺房細胞で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域；膵臓のベータ細胞中で活性なインスリン遺伝子制御領域、リンパ球系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域；精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞中で活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域；肝臓中で活性なアルブミン遺伝子制御領域、肝臓中で活性なアルファフェトプロテイン遺伝子制御領域、肝臓中で活性なアルファ１－抗トリプシン遺伝子制御領域、赤血球の細胞中で活性なベータグロビン遺伝子制御領域、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質制御領域、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖－２遺伝子制御領域、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域、が含まれる。

【0034】

本発明は、ポリヌクレオチドを提供し、このようなポリヌクレオチドは本発明のβ－ラクタマーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、本発明のβ－ラクタマーゼをコードするヌクレオチド配列。このようなポリヌクレオチドは、プロモータ配列および／またはその他の転写または発現関連シグナルなどのヌクレオチド配列に機能的に連結された追加の調節領域（単一または複数）をさらに含んでもよい。ポリヌクレオチドは種々のベクター中に挿入することができ、これは、例えば、細菌宿主細胞および真核生物の宿主細胞を含む宿主細胞中での治療薬の産生に有用であり得る。本発明のβ－ラクタマーゼは、既知の組換え体発現技術により調製することができる。例えば、組換えにより本発明のβ－ラクタマーゼを産生するために、このような本発明のβ－ラクタマーゼをコードする核酸配列が宿主細胞中で転写および／または翻訳されるように、それぞれの遺伝子をコードする核酸配列が適切なプロモータ配列に機能的に連結される。例示的プロモータは、Ｔ７プロモータ、Ｐｓｐａｃ、ＰｇｒｏＥＳ、ＰｇｓｉおよびＰｌｕｘならびにバチルス・アミロリケファシエンス（非限定的例であるが、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＩＤ Ｎｏ．Ｊ０１５４２．１、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）由来のａｍｙＱプロモータおよび／またはａｍｙＱシグナルペプチドなどの種々のシステム中の発現に有用なものである。真核細胞系または原核細胞系を含む、いずれのよく使われる発現系も使用することができる。具体例には、酵母（例えば、サッカロマイセス属菌種、ピキア属菌種）、バキュロウイルス、哺乳類および細菌系、例えば、大腸菌、枯草菌、およびカウロバクターが含まれる。

【0035】

本発明の宿主細胞には、例えば、原核細胞、真核細胞、細菌細胞、酵母細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞および／または哺乳動物細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明は、組換えにより本発明に関連する遺伝子を発現する原核および真核細胞を含む任意のタイプの細胞を包含する。いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞、例えば、大腸菌属菌種、ストレプトマイセス属菌種、ザイモナス属菌種、アセトバクター属菌種、シトロバクター属菌種、シネコシスティス属菌種、リゾビウム属菌種、クロストリジウム属菌種、コリネバクテリウム属菌種、連鎖球菌属菌種、キサントモナス属菌種、ラクトバチルス属菌種、ラクトコッカス属菌種、バチルス属菌種、アルカリゲネス属菌種、シュードモナス属菌種、エロモナス属菌種、アゾトバクター属菌種、コマモナス属菌種、マイコバクテリウム属菌種、ロドコッカス属菌種、グルコノバクター属菌種、ラルストニア属菌種、アシドチオバシラス属菌種、ミクロルナタス属菌種、ジオバクター属菌種、ゲオバチルス属菌種、アルスロバクター属菌種、フラボバクテリウム属菌種、セラチア属菌種、サッカロポリスポラ属菌種、テルムス属菌種、ステノトロホモナス属菌種、クロモバクテリウム属菌種、シノリゾビウム属菌種、サッカロポリスポラ属菌種、アグロバクテリウム属菌種、およびパンテア属菌種の細胞である。細菌細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などのグラム陰性細胞、またはバチルス属菌種のグラム陽性細胞であってよい。他の実施形態では、細胞は、例えば、イースト菌、例えばサッカロマイセス属菌種、シゾサッカロミセス属菌種、ピキア属菌種、パフィア属菌種、クリベロマイセス属菌種、カンジダ属菌種、タラロミセス属菌種、ブレタノマイセス属菌種、パチソレン属菌種、デバリオマイセス属菌種、ヤロウイア属菌種、および工業的倍数体酵母株などの真菌細胞である。酵母株は、出芽酵母株またはヤロウイア属菌種株であってよい。真菌のその他の例には、例えば、アスペルギルス属菌種、アオカビ属菌種、フサリウム属菌種、リゾプス属菌種、アクレモニウム属菌種、パンカビ属菌種、ソルダリア属菌種、マグナポルテ属菌種、カワリミズカビ属菌種、ウスチラゴ属菌種、ボトリチス属菌種、およびトリコデルマ属菌種が含まれる。他の実施形態では、細胞は藻類細胞または植物細胞（例えば、シロイヌナズナ、コナミドリムシ、スピルリナ、珪藻、海洋性緑藻、ハプト藻、珪藻、クロレラ属菌種、例えば、クロレラ・ブルガリス）である。標的細胞には、遺伝子導入および組換え細胞株を含めることができる。さらに、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの異種の細胞株を使用することができる。宿主細胞は、単細胞の宿主細胞であっても、または多細胞の宿主細胞であってもよい。

【0036】

種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、それらを治療的使用を含む種々の使用にとって望ましいものにしている機能的特性を有する。β－ラクタマーゼの特性を明らかにする方法は、当技術分野において既知である（例えば、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１ ：２８３－２８８に記載されているニトロセフィンアッセイ；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００８；１４２：２３９－６０の各種方法）。

【0037】

一実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、１種または複数種のペニシリンおよびセファロスポリンを加水分解する。本明細書全体を通して使用される場合、ペニシリンとしては、例えば、アモキシシリン（例えば、ＮＯＶＡＭＯＸ、ＡＭＯＸＩＬ）；アンピシリン（例えば、ＰＲＩＮＣＩＰＥＮ）；アズロシリン；カルベニシリン（例えば、ＧＥＯＣＩＬＬＩＮ）；クロキサシリン（例えば、ＴＥＧＯＰＥＮ）；ジクロキサシリン（例えば、ＤＹＮＡＰＥＮ）；フルクロキサシリン（例えば、ＦＬＯＸＡＰＥＮ）；メズロシリン（例えば、ＭＥＺＬＩＮ）；メチシリン（例えば、ＳＴＡＰＨＣＩＬＬＩＮ）；ナフシリン（例えば、ＵＮＩＰＥＮ）；オキサシリン（例えば、ＰＲＯＳＴＡＰＨＬＩＮ）；ペニシリンＧ（例えば、ＰＥＮＴＩＤＳまたはＰＦＩＺＥＲＰＥＮ）；ペニシリンＶ（例えば、ＶＥＥＴＩＤＳ（ＰＥＮ－ＶＥＥ－Ｋ））；ピペラシリン（例えば、ＰＩＰＲＡＣＩＬ）；テモシリン（例えば、ＮＥＧＡＢＡＮ）；およびチカルシリン（例えば、ＴＩＣＡＲ）が含まれる。本明細書全体を通して使用される場合、セファロスポリンとしては、例えば、第一世代セファロスポリン（例えば、セファドロキシル（例えば、ＤＵＲＩＣＥＦ）；セファゾリン（例えば、ＡＮＣＥＦ）；セフトロザン、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）／セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（例えば、ＫＥＦＬＩＮ）；セファレキシン（例えば、ＫＥＦＬＥＸ）；第二世代セファロスポリン（例えば、セファクロール（例えば、ＤＩＳＴＡＣＬＯＲ）；セファマンドール（例えば、ＭＡＮＤＯＬ）；セフォキシチン（例えば、ＭＥＦＯＸＩＮ）；セフプロジル（例えば、ＣＥＦＺＩＬ）；セフロキシム（例えば、ＣＥＦＴＩＮ、ＺＩＮＮＡＴ））；第三世代セファロスポリン（例えば、セフィキシム（例えば、ＳＵＰＲＡＸ）；セフジニル（例えば、ＯＭＮＩＣＥＦ，ＣＥＦＤＩＥＬ）；セフジトレン（例えば、ＳＰＥＣＴＲＡＣＥＦ）；セフォペラゾン（例えば、ＣＥＦＯＢＩＤ）；セフォタキシム（例えば、ＣＬＡＦＯＲＡＮ）；セフポドキシム（例えば、ＶＡＮＴＩＮ）；セフタジジム（例えば、ＦＯＲＴＡＺ）；セフチブテン（例えば、ＣＥＤＡＸ）セフチゾキシム（例えば、ＣＥＦＩＺＯＸ）；およびセフトリアキソン（例えば、ＲＯＣＥＰＨＩＮ））；第四世代セファロスポリン（例えば、セフェピム（例えば、ＭＡＸＩＰＩＭＥ））または第五世代セファロスポリン（例えば、セフタロリンフォサミル（例えば、ＴＥＦＬＡＲＯ）；セフトビプロール（例えば、ＺＥＦＴＥＲＡ））が含まれる。特定の実施形態では、セファロスポリンには、例えば、セフォペラゾン、セフトリアキソンまたはセファゾリンが含まれる。特定の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、配列番号１に比較して、セファロスポリンに対する触媒効率を改善した。

【0038】

種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、望ましい酵素動力学的特性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、例えば、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ（１００ｎＭ）、または約０．０１μＭ（１０ｎＭ）、または約１ｎＭ未満などの低いＫ_Ｍを有する。例えば、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、例えば、約５００μＭ、または約１００μＭ、または約１０μＭ、または約１μＭ、または約０．１μＭ（１００ｎＭ）、または約０．０１μＭ（１０ｎＭ）、または約１ｎＭ未満などの低いＫ_Ｍを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、例えば、約１００ｓ－１、または約１０００ｓ－１、または約１００００ｓ－１、または約１０００００ｓ－１、または約１００００００ｓ－１を超えるＶ_ｍａｘなどの高いＶ_ｍａｘを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、例えば、約１００ｓ－１、または約１０００ｓ－１、または約１００００ｓ－１、または約１０００００ｓ－１、または約１００００００ｓ－１を超えるＶ_ｍａｘなどの高いＶ_ｍａｘを有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のセファロスポリンに対して、約１０^６Ｍ^－１ｓ^－１より大きい触媒効率を有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、少なくとも１種のペニシリンに対して、約１０^６Ｍ^－１ｓ^－１より大きい触媒効率を有する。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、セファロスポリンおよびペニシリンのいずれかまたは両方の内の少なくとも１種に対して、望ましい酵素動力学的特性を有する。

【0039】

種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、ＧＩ管中、例えば、口、食道、胃、十二指腸、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸、盲腸、および直腸の内の１つまたは複数の器官中で安定および／または活性である。特定の実施形態では、β－ラクタマーゼは、大腸中、任意選択で、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸から選択される１つまたは複数の器官中で安定である。特定の実施形態では、β－ラクタマーゼは、小腸中、任意選択で、十二指腸、空腸、および回腸から選択される１つまたは複数の器官中で安定である。いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、例えば、小腸を含むＧＩ管中のプロテアーゼに対し耐性がある。いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、約６．０～約７．５、例えば、約６．０、または約６．１、または約６．２、または約６．３、または約６．４、または約６．５、または約６．６、または約６．７、または約６．８、または約６．９、または約７．０、または約７．１、または約７．２、または約７．３、または約７．４、または約７．５のｐＨで実質的に活性である（例えば、本明細書で記載のように、製剤を経由することを含む）。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼは、任意選択で、アビバクタム、タゾバクタム、スルバクタム、およびクラブラン酸から選択される、１種または複数種のβ－ラクタマーゼ阻害剤に対して耐性がある。いくつかの実施形態では、安定は、十分長い半減期を有し、治療効果に対し十分な活性を維持する酵素を意味する。

【0040】

種々の実施形態では、本発明は、本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび本明細書で記載の１種または複数種の薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物に関する。特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、タブレットまたは多粒子含有スプリンクルまたは多粒子含有カプセルとして、経口投与用に処方される。しかし、本明細書で記載のように、その他の投与経路および処方も提供される。

【0041】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は追加の薬剤と一緒に、または共製剤として使用することができる。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、追加の抗生物質分解酵素、例えば、クラスＥＣ３．５．２．６のβ－ラクタマーゼである。いくつかの実施形態では、抗生物質分解酵素は、機能グループ１、グループ２、グループ３、またはグループ４のβ－ラクタマーゼ（例えば、Ｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，３９：１２１１を参照されたい。この内容は、参照により本明細書に組み込まれる：理論に束縛されることを意図するものではないが、グループ１は、クラブラン酸により十分に阻害されないセファロスポリナーゼからなり；グループ２は、通常、活性部位特異的β－ラクタマーゼ阻害剤により阻害されるペニシリナーゼ、セファロスポリナーゼおよび広域性β－ラクタマーゼからなり；グループ３は、ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネムを加水分解し、ほとんど全てのベータラクタム含有分子により不十分に阻害されるメタロベータラクタマーゼからなり；およびグループ４は、クラブラン酸により十分には阻害されないペニシリナーゼからなる）および／または分子／ＡｍｂｌｅｒクラスＡ、またはクラスＢ、またはクラスＣ、またはクラスＤβ－ラクタマーゼ（例えば、Ａｍｂｌｅｒ １９８０，Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２８９：３２１を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる：理論に束縛されることを意図するものではないが、クラスＡ、およびＤは、異なるグループのセリンβ－ラクタマーゼ酵素を進化的に集約し、クラスＢは亜鉛依存性（「ＥＤＴＡ阻害された」）β－ラクタマーゼ酵素を集約する（Ａｍｂｌｅｒ Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９１ ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２７６：２６９－２７０を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる））から選択される。いくつかの実施形態では、抗生物質分解酵素はセリンβ－ラクタマーゼまたは亜鉛依存性（ＥＤＴＡ阻害された）β－ラクタマーゼである。例えば、いくつかの実施形態では、β－ラクタマーゼは、Ｐ１Ａ、Ｐ２Ａ、またはＰ３Ａの内の１種または複数種である。さらに、β－ラクタマーゼは、任意選択で、ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ－Ｍ、ＯＸＡ、ＰＥＲ、ＶＥＢ、ＧＥＳ、およびＩＢＣβ－ラクタマーゼから選択される広域性β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）であってよい。さらに、β－ラクタマーゼは、任意選択で、ＡｍｐＣ型β－ラクタマーゼ、カルバペネマーゼ、ＩＭＰ型カルバペネマーゼ（メタロ－β－ラクタマーゼ）、ＶＩＭ（ベローナインテグロンにコードされたメタロ－β－ラクタマーゼ）、ＯＸＡ（オキサシリナーゼ）グループのβ－ラクタマーゼ、ＫＰＣ（肺炎桿菌カルバペネマーゼ）、ＣＭＹ（クラスＣ）、ＳＭＥ、ＩＭＩ、ＮＭＣおよびＣｃｒＡ、ならびにＮＤＭ（ニューデリー・メタロベータラクタマーゼ、例えば、ＮＤＭ－１）β－ラクタマーゼから選択される阻害剤耐性β－ラクタマーゼであってよい。

【0042】

いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、例えば、本明細書で記載のＣＤＩの処置に使われる補助的療法剤である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、メトロニダゾール（例えば、ＦＬＡＧＹＬ）、フィダキソマイシン（例えば、ＤＩＦＩＣＩＤ）、またはバンコマイシン（例えば、バンコシン）、リファキシミン、糞便細菌療法剤、木炭系結合剤（例えば、ＤＡＶ１３２）、プロバイオティック療法剤（例えば、Ｉｎｔｎａｔ’ｌ Ｊ Ｉｎｆ Ｄｉｓ，１６（１１）：ｅ７８６を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる。例示的プロバイオティクス剤には、サッカロマイセス・ブラウディ、ラクトバシラス・ラムノーサスラムノーサス菌ＧＧ；ラクトバシラス・プランタラム２９９ｖ；クロストリジウム・ブチリクムＭ５８８；クロストリジウム・ディフィシレＶＰ２０６２１（無毒のクロストリジウム・ディフィシレ株）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・アシドフィルスの組み合わせ（Ｂｉｏ－Ｋ＋ＣＬ１２８５）；ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス、ストレプトコッカス・サーモフィルスの組み合わせ（Ａｃｔｉｍｅｌ）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの組み合わせ（Ｆｌｏｒａｊｅｎ３）；ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・ブルガリカス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリクス、ラクトバシラス・ブルガリカス・カゼイ、ラクトバシラス・ブルガリカス・プランタルム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ストレプトコッカス・サリバリウス・サブスピーシーズ・サーモフィラスの組み合わせ（ＶＳＬ＃３））および抗体またはその他の生物学的療法剤（例えば、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０；３６２（３）：１９７（この内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡおよびＢに対するモノクローナル抗体）；例えば、米国特許出願公開第２０１３／００５８９６２号（この内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、１つまたは複数の配列番号（例えば、配列番号５９、６０、９５、６７、６８および８７の１つまたは複数）に向けられているマルチマーとして構成された中和結合タンパク質）または任意のクロストリジウム・ディフィシレ二元毒素に対する中和結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書で記載のペニシリンおよびセファロスポリンのいずれかは、追加の薬剤であってよい。

【0043】

すべての追加の薬剤組成物および方法に対し、本明細書で記載のように、ＧＩ管の種々の部分への標的化を採用することができる。

【0044】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、すなわち、共有結合が組成物の活性を妨げないようにして、任意のタイプの分子の組成物への共有結合により改変されている誘導体を含む。例えば、限定するものではないが、誘導体には、特に、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、細胞リガンドまたはその他のタンパク質への結合、などにより改変されている組成物が含まれる。多くの化学的改変のいずれかを、既知の技術、例えば、限定されないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成、などを使って行うことができる。さらに、誘導体は１種または複数種の非古典的アミノ酸を含むことができる。

【0045】

さらにその他の実施形態では、本明細書で記載の本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物を改変して、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光染料、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、およびなどの検出可能な部分、および例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒、細胞傷害性薬物、および放射性物質などの化学発光部分または機能性部分を付加することができる。

【0046】

本明細書で記載の本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、充分に塩基性の官能基を有することができ、これは無機もしくは有機酸またはカルボキシル基と反応することができ、またこれは、無機または有機塩基と反応することができ、薬学的に許容可能な塩を形成することができる。当該技術分野でよく知られているように、薬学的に許容可能な酸付加塩は、薬学的に許容可能な酸から形成される。このような塩には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２－１９（１９７７およびＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ．Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２、に挙げられた薬学的に許容可能な塩を含む。これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0047】

薬学的に許容可能な塩には、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、ホスフェート、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルカロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、パモ酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ－アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン－２－安息香酸塩、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、α－ヒドロキシ酪酸塩、ブチン－１，４－ジカルボキシレート、ヘキシン－１，４－ジカルボキシレート、カプリン酸塩、カプリル酸塩、ケイ皮酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、ヒプル酸塩、リンゴ酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ニコチン酸塩、フタル酸塩、テラフタル酸塩、プロピオール酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、セバシン酸塩、スベリン酸塩、ｐ－ブロモベンゼンスルホン酸塩、クロロベンゼンスルホン酸塩、エチルスルホン酸塩、２－ヒドロキシエチルスルホン酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフタレン－１－スルホン酸塩、ナフタレン－２－スルホン酸塩、ナフタレン－１，５－スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、および酒石酸塩が含まれる。

【0048】

「薬学的に許容可能な塩」という用語はまた、カルボン酸官能基などの酸性官能基、および塩基を有する本発明の組成物の塩を意味する。適切な塩基には、限定されないが、ナトリウム、カリウム、およびリチウムなどのアルカリ金属の水酸化物；カルシウムおよびマグネシウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アルミニウムおよび亜鉛などのその他の金属の水酸化物；アンモニア、および非置換またはヒドロキシ置換のモノ－、ジ－、またはトリ－アルキルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどの有機アミン；トリブチルアミン；ピリジン；Ｎ－メチル、Ｎ－エチルアミン；ジエチルアミン；トリエチルアミン；モノ－、ビス－、またはトリス－（２－ヒドロキシエチル）アミン、２－ヒドロキシ－ｔｅｒｔ－ブチルアミン、またはトリス－（ヒドロキシメチル）メチルアミンなどのモノ－、ビス－、またはトリス－（２－ＯＨ－低級アルキルアミン）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ－（２－ヒドロキシエチル）アミンなどのＮ，Ｎ－ジ－低級アルキル－Ｎ－（ヒドロキシル－低級アルキル）－アミン；Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン；およびアルギニン、リシンなどのアミノ酸などが含まれる。

【0049】

いくつかの実施形態では、本明細書で記載の組成物は、薬学的に許容可能な塩の形である。

【0050】

さらに、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、薬学的に許容可能なキャリアまたはビークルを含む組成物の成分として、対象に投与することができる。このような組成物は、適切な投与用の形態を与えるように、任意選択で、適切な量の薬学的に許容可能な賦形剤を含むことができる

【0051】

医薬賦形剤は、水、およびピーナッツオイル、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油などの石油、動物、植物、または人工起源のものを含む油などの液体であってよい。医薬賦形剤は、例えば、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、滑石、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであってよい。さらに、補助材料、安定化剤、増粘化剤、潤滑剤、および着色料を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、対象に投与される場合、無菌である。本明細書で記載のいずれかの薬剤が静脈内に投与される場合、水は有用な賦形剤である。生理食塩水および水性デキストロースならびにグリセリン溶液はまた、液体賦形剤として、特に注射可能溶液に用いることができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども挙げられる。本明細書で記載のいずれの薬剤も、必要に応じ、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含んでよい。

【0052】

本発明は、記載された発明の、種々の処方によるβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）を含む。本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、液剤、懸濁剤、乳濁液、点滴剤、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル剤、液体含有カプセル剤、散剤、徐放製剤、坐剤、乳剤、エアロゾル、噴霧剤、懸濁剤、または使用に適するその他の任意の形態の形態をとることができる。一実施形態では、組成物はカプセルの形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照）。適切な医薬賦形剤のそのほかの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0053】

本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、必要に応じて、可溶化剤も含めることができる。また、薬剤は当技術分野において既知の適切なビークルまたはデリバリー装置を使って送達することができる。投与用の組成物には、任意選択で、注射の部位での疼痛を緩和するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔剤を含めることも可能である。本明細書で概要を述べた併用療法剤は、単一の送達ビークルまたはデリバリー装置で同時に送達することができる。

【0054】

本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）を含む製剤は都合よく単位剤形として存在させることができ、薬学の分野でよく知られたいずれかの方法により調製することができる。このような方法は通常、治療薬をキャリアと混合するステップを含み、これは１つまたは複数の補助成分となる。通常、製剤は、治療薬と、液体キャリア、微粉化固相キャリア、または両方とを均一に、完全に混合し、その後、必要に応じ、生成物を所望の製剤の剤形に成形（例えば、湿式または乾式造粒、散剤ブレンド、など、続けて、当該技術分野で既知の従来の方法を使って錠剤化）することにより調製することができる。

【0055】

一実施形態では、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、本明細書で記載の投与方法に適合された組成物として、ルーチン手順に従って処方される。

【0056】

いくつかの実施形態では、いずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与も、経口、静脈内、および非経口の内のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、いずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与も、例えば、全身投与された抗生物質との干渉を防ぐために、静脈内経路ではない。他の実施形態では、投与経路には、例えば、経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、大脳内、膣内、経皮、直腸内、吸入、または特に、耳部、鼻、目、または皮膚に対しては局所投与が含まれる。いくつかの実施形態では、投与は、経口または非経口注射により行われる。投与方法は、開業医の自由裁量に任すことができ、１つには、病状の部位に依存する。大抵の場合、投与により、本明細書で記載のいずれかの薬剤の血流中への放出が生ずる。

【0057】

さらに、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、経口投与することができる。このような本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）はまた、他の任意の都合のよい経路、例えば、静脈内注入またはボーラス注入により、上皮または皮膚粘膜表層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜、など）を介した吸収により投与することができ、また、追加の薬剤と一緒に投与することができる。投与は全身性または局所的であってよい。いくつかの実施形態では、投与は、例えば、感染部位での抗生物質の加水分解を避けるために、感染の部位には行わない。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルへの封入などの各種の送達システムが知られており、投与する目的で使用することができる。

【0058】

特定の実施形態では、処置を必要とする領域へ局所的に投与することが望ましい場合がある。

【0059】

一実施形態では、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、ヒトの経口投与に適合された組成物として、ルーチン手順に従って処方される。経口送達用の組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、水性または油性懸濁剤、粒剤、散剤、スプリンクル、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の形態であってよい。経口投与される組成物は、薬学的に美味な製剤を提供するために、１種または複数種の薬剤、例えば、フルクトース、アスパルテームまたはサッカリンなどの甘味料、ペパーミント、冬緑油またはチェリー油などの調味料、着色料および保存剤を含んでよい。さらに、錠剤または丸薬形態では、組成物をコーティングして崩壊を遅延させて、長期間にわたり持続作用を提供することができる。本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）を送り出す浸透的に活性な薬剤を取り囲む選択的透過性膜も、経口投与組成物として好適する。これらの後者のプラットフォームでは、カプセルの周りの環境からの液体が駆動化合物により吸収され、この化合物は膨潤し、開口部を介して薬剤または薬剤組成物と置換する。これらの送達プラットフォームは、即時放出製剤の急上昇プロファイルとは対照的に、実質的に０次の送達プロファイルを提供することができる。グリセロールモノステアレートまたはグリセロールステアレートなどの時間遅延物質も使用することができる。経口組成物には、標準的な賦形剤、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、エタクリル酸およびこれらの誘導体ポリマー、ならびに炭酸マグネシウムを含めることができる。一実施形態では、賦形剤は医薬品グレードである。活性化合物に加えて、懸濁剤には、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロオキシド、ベントナイト、寒天、トラガント、など、およびこれらの混合物などの懸濁化剤を含むことができる。

【0060】

非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内の、皮下および関節内注射および注入）に好適な剤形には、例えば、液剤、懸濁剤、分散剤、乳剤、などが含まれる。それらは、無菌の固相組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造することもでき、これは、使用直前に、無菌の注射可能媒体中に溶解または懸濁することができる。それらは、例えば、当該技術分野において既知の懸濁化剤または分散化剤を含むことができる。

【0061】

本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、対象に、例えば、消化管の粘膜組織に直接にまたは間接的に接触することにより投与することができる。消化管は、食道、胃、十二指腸、小腸、大腸および直腸などの消化器系の器官を含み、その全ての細区分を含む（例えば、小腸は十二指腸、空腸および回腸を含むことができ、大腸は横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸を含むことができる）。各種方法を使って、本明細書で記載の薬剤を処方および／または目的の部位へ送達することができる。例えば、本明細書で記載の本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、小腸、大腸および直腸などの消化器系の器官およびその全ての細区分（例えば、小腸は十二指腸、空腸および回腸、大腸は横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸）の内の１つまたは複数に送達するために処方することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で記載の組成物は上部または下部ＧＩ管に送達するように処方することができる。

【0062】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、腸溶性送達用に処方される。例えば、組成物は、経口送達用のカプセル剤または錠剤として、１種または複数種の腸溶性薬剤を含む遅延放出コーティングを含むことができる。遅延放出コーティングは、胃液中で実質的に安定で、腸液中で実質的に不安定（例えば、急速に溶解するまたは物理的に不安定である）であり、したがって、小腸の罹患した領域、例えば、十二指腸、空腸、および／または回腸中で、または大腸の、例えば、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸中で、組成物からの活性薬剤の実質的な放出を可能とする。

【0063】

本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は通常、胃液または模擬腸液中で安定であり、すなわち、組成物は酸性環境中で安定である。したがって、組成物は、ｐＨ５以下の胃液中、またはｐＨ５以下の模擬胃液中、約１２０分で、活性薬剤の３０重量％未満を放出する。本発明の組成物は、ｐＨ５以下の胃液中、またはｐＨ５以下の模擬胃液中、約１２０分で、活性薬剤の約０重量％～約２５重量％、または約０重量％～約１０重量％を放出することができる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ｐＨ５以下の胃液中、または模擬胃液中、約１２０分で、活性薬剤の約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、または約１０重量％以下を放出する。医薬組成物は通常、小腸または大腸の領域で局所的に作用する活性薬剤を放出する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、小腸または大腸中、約１２０分以内に、約７０重量％以上の活性薬剤を放出する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、小腸または大腸中、約９０分または約１２０分以内に、約８０重量％以上、または約９０重量％以上の活性薬剤を放出する。特定の実施形態では、小腸または大腸中のこの放出は、胃液または模擬胃液のｐＨにより媒介され、例えば、約５以上のｐＨ時に放出する（例えば、十二指腸中での放出には約５．５～６．５のｐＨ、上行結腸または空腸中での放出には約６～７のｐＨ、回腸中での放出には約６．５～７のｐＨ、下行結腸中での放出には約７～７．５のｐＨ）。

【0064】

医薬組成物は、胃液中では、実質的に損なわれないままで残るおよび／または実質的に不溶性であり得る、１つまたは複数の遅延放出コーティング（単一または複数）を介して、活性薬剤の腸放出を制御することができる。遅延放出コーティングの安定性はｐＨ依存性であってよい。ｐＨ依存性である遅延放出コーティングは、酸性環境（ｐＨ５以下）では実質的に安定であり、中性近傍からアルカリ環境（ｐＨ５超）では実質的に不安定である。例えば、遅延放出コーティングは、小腸または大腸中で認められる、中性近傍からアルカリ環境では実質的に崩壊または溶解し、それにより、活性薬剤を病気または罹患組織に局所的に放出することができる。

【0065】

模擬胃液および模擬腸液の例には、限定されないが、２００５ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２３ＮＦ／２８ＵＳＰ ｉｎ Ｔｅｓｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの２８５８頁で開示されているもの、および／またはその他の当業者に既知の模擬胃液および模擬腸液、例えば、酵素なしで調製された模擬胃液および／または腸液が含まれる。

【0066】

あるいは、遅延放出コーティングの安定性は酵素依存性であってよい。酵素依存性の遅延放出コーティングは、特定の酵素を含まない体液中では実質的に安定であり、酵素を含む体液中では実質的に不安定である。遅延放出コーティングは適切な酵素を含む体液中では基本的に崩壊または溶解する。酵素依存性制御は、例えば、腸中で酵素に曝露時にのみ有効成分を放出するガラクトマンナンなどの物質を使うことにより生じさせることができる。

【0067】

いくつかの実施形態では、胃耐性カプセル剤または錠剤を含む本発明の組成物から活性薬剤を放出する標的器官は、小腸、例えば、十二指腸、空腸、または大腸、例えば、横行結腸、下行結腸、上行結腸、Ｓ状結腸および盲腸である。このような錠剤またはカプセル剤の調製の例としては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄ．，Ｅｄｓ．Ｏｓｏｌ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ８９（１９８０）；Ｄｉｇｅｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８３：９１５－９２１（１９９４）；Ｖａｎｔｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａ Ｔｅｒａｐｅｕｔｉｃａ，１４５：４４５－４５１（１９９３）；Ｙｏｓｈｉｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，４０：１９０２－１９０５（１９９２）；Ｔｈｏｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｚｉｅ，４６：３３１－３３６（１９９１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，７：３０９－３１９（１９９１）；およびＬｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓ．，８：９１９－９２４（１９９１）を参照されたい（上記の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。

【0068】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、当技術分野において既知のように、ＥＵＤＲＡＧＩＴシステムを使って処方することができ、Ｐｈａｒｍａ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎｏ．７，Ｏｃｔ．２０００に記載されている。この文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0069】

本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与量ならびに投与計画も、限定されないが、治療される疾患、対象の総体的な健康、および投与する医師の自由裁量を含む種々のパラメータに依存し得る。本明細書で記載のいずれの薬剤も、追加の治療薬の、それを必要としている対象への投与の前に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週前に）、それと同時に、またはその後に（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、３週、４週、５週、６週、８週、または１２週後に）、投与することができる。種々の実施形態では、本明細書で記載のいずれの薬剤も、１分置きに、１０分置きに、３０分置きに、１時間未満の時間置きに、１時間置きに、１時間～２時間置きに、２時間～３時間置きに、３時間～４時間置きに、４時間～５時間置きに、５時間～６時間置きに、６時間～７時間置きに、７時間～８時間置きに、８時間～９時間置きに、９時間～１０時間置きに、１０時間～１１時間置きに、１１時間～１２時間置きに、２４時間以上の間隔を置かないでまたは４８時間以上の間隔を置かないで、投与される。

【0070】

単回用量を生成するためにキャリア物質と混合される本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の量も、処置される対象および特定の投与方法に応じて変わってよい。インビトロまたはインビボアッセイを用いて最適な用量範囲を特定するために役立てることができる。

【0071】

一般に、有用な用量は当業者に知られている。例えば、用量は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，６６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＰＤＲ Ｎｅｔｗｏｒｋ；２０１２ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２７，２０１１）を参考にして決定することができる。この文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本発明は患者がＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅを参考にして決定した値を超える用量を投与されることを可能とする。

【0072】

本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与量も、処置または予防される状態の重症度、処置される対象の年齢、体重、および健康状態を含むいくつかの因子に依存し得る。さらに、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態学、薬力学または効力プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報が、使われる投与量に影響を与えることもある。さらに、正確な個別の投与量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、処置される特定の疾患、障害の重症度、および障害の解剖学的部位、などの種々の要因に応じて、幾分調節することができる。ある程度の投与量の変動は予測可能である。

【0073】

特定の実施形態では、いずれかの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の濃度は、経口投与される場合は約０．２～約２０ｇ／Ｌ、または静脈内投与される場合は約４ｇ／ｍＬである。

【0074】

いくつかの実施形態では、哺乳動物に経口投与される場合は、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与量も、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日～約５０ｍｇ／ｋｇ／日、または０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１０ｍｇ／ｋｇ／日であってよい。ヒトに経口投与される場合、本明細書で記載のいずれの薬剤も通常、１日当たり約０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ、１日当たり約１ｍｇ～約６００ｍｇ、または１日当たり約５ｍｇ～約３０ｍｇである。一実施形態では、１日当たり１００ｍｇの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物がヒトに経口投与される。いずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の非経口投与による投与量も通常、１日当たり約０．１ｍｇ～２５０ｍｇ、１日当たり約１ｍｇ～約２０ｍｇ、または１日当たり約３ｍｇ～約５ｍｇである。注射は毎日４回まで投与することができる。通常、経口または非経口投与される場合、本明細書で記載のいずれの薬剤の投与量も通常、１日当たり約０．１ｍｇ～１５００ｍｇ、または１日当たり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇ、または１日当たり約０．５ｍｇ～約５ｍｇである。１日当たり約３０００ｍｇまでの投与量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は１日当たり約１０００ｍｇであってよい。いくつかの実施形態では、次の投与計画を使用することができる：１００ｍｇ、１日４回。

【0075】

種々の実施形態では、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０，０００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５，０００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２，５００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌ、約１ｎｇ／ｍｌ～約１０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１０，０００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５，０００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２，５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ～約２５ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０，０００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５，０００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約２，５００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１００ｎｇ／ｍｌ～約５００ｎｇ／ｍｌ、または約１００ｎｇ／ｍｌ～約２５０ｎｇ／ｍｌの腸内濃度を達成するように投与される。種々の実施形態では、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の腸内濃度も、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、または１，０００ｎｇ／ｍｌである。

【0076】

別の実施形態では、送達は、小胞、特に、リポソームに入れて行ってもよい（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）を参照）。

【0077】

本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、当業者に既知の制御放出もしくは徐放手段または送達装置により投与可能である。例としては、米国特許第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、および同第５，７３３，５５６号に記載のものが挙げられるが、これらに限定されない。これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。このような剤形は、例えば、ヒドロプロピルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、その他のポリマーマトリクス、ゲル、浸透膜、浸透系、多層被膜、微粒子、リポソーム、マイクロスフェア、またはこれらの組み合わせを用いて、１つまたは複数の有効成分の制御放出または徐放を可能とするために有用であり、様々な割合での所望の放出プロファイルを提供することができる。本明細書に記載されたものを含む当業者に既知の適切な制御放出または徐放製剤は、本明細書で記載の薬剤の有効成分と共に使用する上で容易に選択することができる。このように、本発明は、限定されないが、制御放出または徐放に適合された錠剤、カプセル、ジェルカプセルおよびカプレットなどの経口投与に好適な単位剤形を提供する。

【0078】

有効成分の制御放出または徐放は、限定されないが、ｐＨ変化、温度変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度もしくは利用可能性、水の濃度または利用可能性、またはその他の生理学的条件または化合物などの種々の条件により刺激を受ける可能性がある。

【0079】

別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたい；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。

【0080】

別の実施形態では、徐放系を処置される標的領域の近傍に配置することができるので、全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前出，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、中の概説で考察されているその他の放出制御系を使用することができる。

【0081】

本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）の投与も、毎日６回までの投与（例えば、１日当たり１回、または２回、または３回、または４回、または５回、または６回）、または毎月４回までの投与、または毎年６回までの投与、または２年毎に１回、３年毎に１回、４年毎に１回もしくは５年毎に１回の投与であってよい。投与の期間は、１日または１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、さらには、対象の一生の間であってよい。慢性の長期投与は多くの症例で用いられる。投与量を単回で、または複数用量に分割して投与してよい。一般に、目的の投与量を設定された間隔で長期間、通常、数週間または数ヶ月間にわたり投与する必要があるが、数ヶ月または数年またはそれ以上のより長期間の投与が必要となる場合もある。

【0082】

本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）を使った投与計画も、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別および病状；処置される状態の重症度；投与経路；対象の腎臓または肝臓機能；個別の薬理ゲノミクス構成；および採用した特定の本発明の化合物、などの種々の因子に従って選択することができる。本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、単一の一日量で投与してもよく、または全毎日投与量を、１日２回、３回または４回の用量に分けて投与してもよい。さらに、本明細書で記載のいずれの本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）も、投与計画の間、間欠的ではなく連続的に投与することができる。

【0083】

種々の態様では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を処置または予防するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、それを必要としている患者に投与することを含む。一態様では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を予防するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、それを必要としている患者（非限定的例であるが、本明細書で記載のものを含む抗生物質を投与されているまたは投与される予定の患者）に投与することを含む。種々の態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患を処置または予防する方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、それを必要としている患者に投与することを含む。一態様では、本発明は、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患を予防する方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、それを必要としている患者（非限定的例であるが、本明細書で記載のものを含む抗生物質を投与されているまたは投与される予定の患者）に投与することを含む。

【0084】

種々の実施形態では、抗生物質誘発性有害作用および／またはＣＤＩまたはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患は、抗生物質関連下痢、クロストリジウム・ディフィシレ下痢（ＣＤＤ）、クロストリジウム・ディフィシレ炎症性腸疾患、大腸炎、偽膜性大腸炎、発熱、腹痛、脱水および電解質障害、巨大結腸症、腹膜炎、および結腸の穿孔および／または破裂の内の１つまたは複数である。

【0085】

種々の態様では、本発明は、対象の消化管マイクロバイオームを保護する方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を投与することを含む。種々の実施形態では、対象は抗生物質を使って現在処置を受けているか、または最近処置を受けたことがある。種々の実施形態では、本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、抗生物質を分解または不活化することができる。

【0086】

種々の実施形態では、対象には、限定されないが、抗生物質を使って処置を現在受けているかまたは最近処置を受けたことがある対象などのマイクロバイオーム媒介障害に対する特定のリスクのある対象が含まれる。例えば、対象は過去３０日程度の間、抗生物質を摂取した可能性がある、および／または免疫系が低下した可能性がある（例えば、慢性疾患が原因で）、および／または女性である、および／または高齢者である（例えば、６５才を超える）、および／または高齢女性である、および／または胸焼けまたは胃酸障害で処置を受けている（または受けたことがある）（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ、ＴＡＧＡＭＥＴ、ＰＲＩＬＯＳＥＣ、またはＮＥＸＩＵＭなどの薬剤および関連薬剤を使って）、および／または集中治療室中またはナーシングホームに居住を含めて、最近病院にいた。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用により、院内感染症および／または二次新興感染症および／または医療関連感染症（ＨＡＩ）が処置または予防される。

【0087】

種々の実施形態では、本発明の方法は、マイクロバイオーム媒介障害を処置または予防を含む。例示的マイクロバイオーム媒介障害には、限定されないが、例えば、国際公開第ＷＯ２０１４／１２１２９８号の表３に認められるものが含まれる。この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、マイクロバイオーム媒介障害は、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、クロストリジウム・ディフィシレ関連疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、および過敏性腸症候群から選択することができる。種々の実施形態では、マイクロバイオーム媒介障害は、抗生物質誘発性有害作用、クロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）、またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患である。一実施形態では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を処置するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用を予防するための方法を提供し、方法は、有効量の本明細書で記載のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加薬剤）を、抗生物質を使って現在処置を受けているまたは最近処置を受けたことがある対象に投与することを含む。

【0088】

種々の実施形態では、本使用および方法は、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物および本明細書で記載の任意の追加薬剤および／または初期療法剤および／または補助的療法剤を使った共処置（同時または逐次）、または本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物および本明細書で記載の任意の追加薬剤および／または本明細書で記載の種々の疾患の処置のための初期療法剤および／または補助的療法剤の共製剤を使った処置、または本明細書で記載の任意の追加薬剤および／または本明細書で記載の初期療法剤および／または補助的療法剤での処置を受けている患者の本明細書で記載の種々の疾患を、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物を患者に投与することにより治療する方法に関する。

【0089】

種々の実施形態では、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患は、初期発症または再燃／再発（例えば、継続または再開抗生物質療法が原因で）の状況において、処置または予防される。例えば、以前にＣＤＩを煩っていた患者において、本β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）を、最初の再発症状の際に投与することができる。非限定的例であるが、再発の症状には、軽度の症例では、１日当たり約５～約１０回の水様便通、大きな発熱なし、血液検査で白血球数の約１５，０００まで（正常レベルは約１０，０００まで）のわずかの上昇を示す場合、軽度の腹部疝痛のみ、および、重症では、１日当たり約１０回を超える水様便、悪心、嘔吐、高熱（例えば、約１０２～１０４°Ｆ）、直腸出血、重篤な腹痛（例えば、圧痛を伴う）、腹部膨満、および高白血球数（例えば、１５，０００～約４０，０００）が含まれる。

【0090】

最初の発症または再燃／再発に関わらず、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患は、本明細書で記載のいずれかの症状（例えば、２日間以上の、１日当たり約３回以上の水様下痢、腹部の軽度から悪性筋痙攣および疼痛、発熱、便中の血液または膿、悪心、脱水、食欲不振、体重減、など）により診断することができる。初期の発症または再燃／再発に関わらず、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患はまた、酵素イムノアッセイにより（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ生物により産生されるクロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡまたはＢ抗原および／またはグルタミン脱水素酵素（ＧＤＨ）を検出して）、ポリメラーゼ連鎖反応により（例えば、クロストリジウム・ディフィシレ毒素ＡまたはＢ遺伝子またはその一部分（例えば、ｔｃｄＡまたはｔｃｄＢ）、ＩＬＬＵＭＩＧＥＮＥ ＬＡＭＰアッセイを含む）、細胞毒性アッセイにより診断することができる。例えば、次の試験のいずれか１種を使用することができる：Ｍｅｒｉｄｉａｎ ＩｍｍｕｎｏＣａｒｄ Ｔｏｘｉｎｓ Ａ／Ｂ；Ｗａｍｐｏｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａ／Ｂ Ｑｕｉｋ Ｃｈｅｋ；Ｗａｍｐｏｌｅ Ｃ．ｄｉｆｆ Ｑｕｉｋ Ｃｈｅｋ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｅｍｅｌ Ｘｐｅｃｔ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａ／Ｂ；Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｏｘｉｎｓ Ａ／Ｂ；Ｗａｍｐｏｌｅ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘ Ａ／Ｂ ＩＩ；Ｒｅｍｅｌ Ｐｒｏｓｐｅｃｔ Ｔｏｘｉｎ Ａ／Ｂ ＥＩＡ；Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｄａｓ Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａ＆Ｂ；ＢＤ Ｇｅｎｅｏｈｍ Ｃ．ｄｉｆｆ；Ｐｒｏｄｅｓｓｅ Ｐｒｏｇａｓｔｒｏ ＣＤ；ａｎｄ Ｃｅｐｈｅｌｄ Ｘｐｅｒｔ Ｃ．ｄｉｆｆ。種々の実施形態では、臨床試料は患者の便試料である。

【0091】

また、軟性Ｓ状結腸鏡検査「スコープ」試験および／または腹部Ｘ線および／または結腸の画像を提供するコンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを患者の評価に使用することができる（例えば、結腸壁に付着した特徴的なクリーム状の白色または黄色プラークを探す）。さらに、生検（例えば、ＧＩ管のいずれかの領域の）を使って、潜在的ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の患者を評価することができる。

【0092】

さらに、本発明の患者には、限定されないが、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の特定のリスクのある患者、例えば、過去３０日程度の間、抗生物質を摂取した可能性がある、および／または免疫系が低下している（例えば、慢性疾患が原因で）、および／または女性である、および／または高齢者である（例えば、６５才を超える）、および／または高齢女性である、および／または胸焼けまたは胃酸障害で処置を受けている（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ、ＴＡＧＡＭＥＴ、ＰＲＩＬＯＳＥＣ、またはＮＥＸＩＵＭなどの薬剤および関連薬剤を使って）、および／または集中治療室中またはナーシングホームでの居住を含めて、最近病院にいた患者が含まれる。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用により、院内感染症および／または二次新興感染症および／または医療関連感染症（ＨＡＩ）が処置または予防される。

【0093】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、セフトリアキソン関連有害作用（例えば、下痢、悪心、嘔吐、味覚異常、および偽膜性大腸炎および／または症状）を処置または予防する。

【0094】

いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、１種または複数種の一次抗生物質による処置を受けている、または最近処置を受けたことがある患者に関する。「一次抗生物質」という用語は、患者に投与され、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患を生ずる可能性がある抗生物質を意味する。これらには、ほとんどの場合ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患をもたらす抗生物質：フルオロキノロン、セファロスポリン、クリンダマイシンおよびペニシリンが含まれる。

【0095】

いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、大腸に入る前に一次抗生物質を加水分解する本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）に関する。いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、ＧＩ管中の過剰抗生物質残留物を加水分解する本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）に関する。いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、患者のＧＩ管中の正常な腸内微生物叢を維持し、かつ／または１種または複数種の病原微生物の異常増殖を防止する本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）に関する。種々の実施形態では、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、一次抗生物質の血漿中濃度と実質的に干渉しない。例えば、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、感染症のために必要と思われ、抗生物質の全身的な有用性と干渉しない一次抗生物質を患者に投与することを可能とする。むしろ、β－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、ＧＩ管の一部を占める場合がある過剰の抗生物質を不活化し、それにより、本明細書で記載の種々の疾患状態と関連する微生物叢の破壊を防ぐ。

【0096】

種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、全身的に吸収されることはない。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、全身的に投与された抗生物質の活性と実質的に干渉しない。種々の実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、抗生物質によるマイクロバイオームの微生物叢との干渉を解消するように機能する（例えば、大腸を含む腸）。いくつかの実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、腸からの抗生物質吸収と干渉しない、および／または抗生物質循環の半減期を変えるほどには腸や肝臓に対し干渉しない。いくつかの実施形態では、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤）は、腸からの抗生物質吸収と干渉しない、および／または臨床的に重要になるほどには腸や肝臓に干渉しない。

【0097】

いくつかの実施形態では、本発明の方法および使用は、初期療法剤および／または補助的療法剤が患者に投与される方法および使用を含む。初期療法および／または補助的療法は、ＣＤＩおよび／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の検出時に、このような疾患を処置するために使用される療法を示す。いくつかの実施形態では、初期療法剤および／または補助的療法剤は、本明細書で記載の、メトロニダゾール、バンコマイシン、フィダキソマイシン、リファキシミン、糞便細菌療法剤、プロバイオティック療法剤、および抗体治療剤の内の１種または複数種である。種々の実施形態では、本発明の方法および使用は、初期療法および／または補助的療法のいずれかに対する本発明のβ－ラクタマーゼの補助剤としての使用を含む（同時投与または逐次投与を含む）。種々の実施形態では、本発明の方法および使用は、初期療法および／または補助的療法を受ける患者における本発明のβ－ラクタマーゼの使用を含む。

【0098】

他の態様では、本発明は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用の処置での使用、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の予防または処置での使用のためのβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物を提供する。他の態様では、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用の処置のための、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の予防または処置のためのβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物の使用が提供される。さらに、いくつかの態様は、ＧＩ管中の抗生物質誘発性有害作用の処置での使用、および／またはクロストリジウム・ディフィシレ感染症（ＣＤＩ）および／またはクロストリジウム・ディフィシレ関連疾患の予防または処置での使用のための、薬物の製造における開示β－ラクタマーゼの使用を提供する。

【0099】

種々の実施形態では、本発明は、患者の腸の種々の大腸菌型（毒性および／または抗生物質耐性の大腸菌型を含む）の異常増殖を減らすまたは防ぐ組成物および方法を提供する。種々の態様では、本明細書で記載の方法および組成物は、耐性生物の二次感染を防ぐかまたは減らし、いくつかの実施形態では、ベータラクタム系薬耐性の進展を減少させることができる。さらに、本明細書で記載の方法および組成物は、耐性の懸念が理由で現在回避されているベータラクタム系抗生物質の使用を可能とし、かつ／または１種または複数種のβ－ラクタマーゼ阻害剤との同時投与または共製剤（例えば、オーグメンチンは、アモキシシリンとクラブラン酸との混合物である）の必要性を減らすことができる。

【0100】

いくつかの実施形態では、用語の「患者」および「対象」は、同義に使用される。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、または非ヒト霊長類、例えば、サル、チンパンジー、もしくはヒヒである。他の実施形態では、対象および／または動物は、非哺乳動物、例えば、ゼブラフィッシュなどである。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は、蛍光タグ付き細胞（例えば、ＧＦＰで）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対象および／または動物は、蛍光細胞を含む遺伝子導入動物である。

【0101】

いくつかの実施形態では、対象および／または動物はヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは小児のヒトである。別の実施形態では、ヒトは成人のヒトである。別の実施形態では、ヒトは老人のヒトである。他の実施形態では、ヒトは患者と呼ばれることもある。

【0102】

特定の実施形態では、ヒトは、約６～約１８ヶ月、約１８～約３６ヶ月、約１～約５才、約５～約１０才、約１０～約１５才、約１５～約２０才、約２０～約２５才、約２５～約３０才、約３０～約３５才、約３５～約４０才、約４０～約４５才、約４５～約５０才、約５０～約５５才、約５５～約６０才、約６０～約６５才、約６５～約７０才、約７０～約７５才、約７５～約８０才、約８０～約８５才、約８５～約９０才、約９０～約９５才または約９５～約１００才の範囲の年齢である。

【0103】

別の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は、獣医学的使用に関する。特定の実施形態では、非ヒト動物は家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は家畜動物である。

【0104】

本発明は、本明細書で記載のいずれかの薬剤の投与を単純化することができるキットを提供する。本発明の代表的キットは、単位剤形の本明細書で記載のいずれかの組成物を含む。一実施形態では、単位剤形は、本明細書で記載のいずれかの薬剤および薬学的に許容可能なキャリア、希釈、賦形剤、またはビークルを含む、無菌であってよいプレフィルシリンジなどの容器である。キットは、ラベルまたは本明細書で記載のいずれかの試薬の使用方法が印刷された説明書をさらに含んでよい。キットはまた、開瞼器、局所麻酔剤、および投与部位用の洗浄剤も含んでもよい。キットはまた、本明細書で記載の１種または複数種の追加の薬剤をさらに含んでもよい。一実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物および本明細書で記載のものなどの有効量の別の組成物を含む容器を含む。

【0105】

本発明は、次の非限定的な実施例によりさらに説明される。
実施例
全体を通して、次の略語が使用される。

【表2】

【0106】

実施例１：材料と方法
ＳＯＥもしくはＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使った部位特異的変異誘発により、またはＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使ったランダム変異誘発により種々のＰ１Ａ変異体を作製した。変異ＤＮＡを細菌、大腸菌または枯草菌に形質転換し、これをセフォタキシム（部位特異的な変異体）またはセフトリアキソン（ランダム変異体）について検査した。ニトロセフィン試験によりコロニー中のβ－ラクタマーゼの存在をさらに確認し、陽性のコロニーをさらなる分析用に選別した。変異体β－ラクタマーゼのＤＮＡ配列をシーケンシングにより確認した。

【0107】

アンピシリン、セフォタキシム、セフトリアキソン、セフロキシム、セフタジジム、メロペネムおよびイミペネムを含む大腸菌細胞ライセートおよび枯草菌増殖上清から変異体のβ－ラクタマーゼ活性をさらに特徴付けた。活性を、それぞれの試験抗生物質の１個のみの基質濃度を使って測定した。抗生物質濃度の選択は、出来る限り濃い実用的な抗生物質の濃度、［Ｓ］＞＞Ｋｍ、で行った。これらの予備実験に基づいて、部位特異的およびランダム変異誘発研究系統由来の数個の変異体に対し、より正確な動力学的パラメータを決定した。さらに詳細な調査用に選択された全ての変異体酵素を、枯草菌宿主株ＲＳ３０３中で発現させた。変異タンパク質を保有する細胞を最少培地中で一晩増殖し、その後、細胞を採取し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心装置ＭＷＣＯ１００００（Ａｍｉｃｏｎ）を使って上清を１：１０に濃縮した。それぞれの培養上清中のタンパク質濃度を、Ｐ１Ａ基準試料Ａ１８Ｋ３１を標準として使って、１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ，ＢｉｏＲａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から推定した。セフォタキシム、セフトリアキソンおよびセフロキシムについて選択されたそれぞれの変異体株で動力学的パラメータを測定した。部位特異的変異体を、セフォタキシムを加水分解するように設計し、ランダム変異体をセフトリアキソンについて検査した。これにより、これらの抗生物質が、動力学的パラメータを決定するための自然の選択となった。

【0108】

Ｐ１Ａの改変
下記のように、Ｐ１Ａの一連の変異を導入した：

【表3】

【0109】

部位特異的変異誘発と平行して、セフトリアキソンを検査抗生物質として使用して、Ｐ１ＡおよびＰ３Ａに対しランダム変異誘発を行った。

【0110】

また、品質管理調査用に作製されたＰ１Ａの２つの次の改変変異体が存在する：Ｐ１Ａ－Ｎ２９３Ｄ（ＩＳ２０５、「脱アミド化変異体」）およびＰ１Ａ－ΔＭＮＧＫ（ＩＳ２０６、「欠失変異体」）。これらの株の両方とも、Ｐ１Ａ株ＲＳ３１０と同様に良好に増殖し、タンパク質産生も同様にほぼ同じであった。これらの変異は、どちらのタンパク質の結晶性にも影響を与えなかった。

【0111】

選択されたＣＴＸ－Ｍ－酵素の配列はＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔタンパク質配列データバンクから入手し、３Ｄ構造はＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から入手した。個々の配列および構造用のアクセッションコードは以下に示す。場合によっては、このデータを使って、構造機能活性を予測した。

【表4】

【0112】

リナックスワークステーションおよびＦｅｄｏｒａ Ｃｏｒｅ５オペレーティングシステムを調査プラットフォームとして使用した。配列の整列および分析ならびにモデル化および３Ｄ構造分析をＢｏｄｉｌ分子モデリング環境で行った。

【0113】

さらに、いくつかのその他のＰ１Ａ変異体を設計し、作製した。これらの変異体の内の１つはＩＳ２８８で、次の変異を有する：Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ａ２４０ＳおよびＤ２７６Ｎ。４つの変異Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８ＧおよびＡ２４０Ｓは、いわゆる、「ブロック２」変異である。５番目の変異、Ｄ２７６Ｎは、「Ｐ３Ａ」変異であり、これは単独でセフトリアキソンを分解するタンパク質の能力を与える。Ｐ１Ａ変異体ＩＳ２８８は、Ｐ１Ａ遺伝子に対する２ラウンドの変異誘発および分泌されたＰ１Ａ変異体の予備的活性アッセイの結果であった。部位特異的変異誘発により作製されたいくつかのＰ１Ａ変異体を枯草菌産生宿主中に挿入し、振とうフラスコ培養で産生した。これらの変異体株の増殖上清を濃縮し、それぞれの株の選択されたセファロスポリンを分解する能力を測定するために使用した。ＩＳ２８８を大規模に産生し、硫酸アンモニウム沈殿、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよび限外濾過を使って精製した。選択されたＰ１Ａ変異体ＩＳ２８８をさらに詳細に特徴付けるように調査の準備ができた。

【0114】

ＨＩＣによるに加えて、さらに脱塩し、溶出タンパク質ピーク中のタンパク質の量と純度を特徴付ける方法が開発された。

【0115】

疎水性相互作用クロマトグラフィー、すなわち、ＨＩＣは、生体分子の分離が、媒体の疎水性、試料の性質と組成、表面露出疎水性アミノ酸残基の発生率および分布と、結合バッファー中の塩のタイプおよび濃度との間の相互作用に基づく方法である。タンパク質のゲルマトリックス中への吸着は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４およびＮａ_２ＳＯ_４などのアンチカオトロピック塩の濃度に依存する；塩濃度が高くなるほど、ＨＩＣ媒体の吸着能力は強くなる。ＨＩＣマトリックスは、異なるタイプの疎水性の置換基、例えば、ブチル、オクチル、またはフェニル基を有することができる。Ｐ１Ａはオクチルセファロースにしっかり結合し、適切に溶出されないので、ブチルセファロースをＨＩＣマトリックスとして選択した。

【0116】

ＩＳ２８８精製手順：
第１日目に、１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で、少量の凍結ＩＳ２８８バチルス・ズブチリス細胞の画線培養を行った。翌朝、単独培養物をこのプレートから採取し、振とうフラスコ培養のために１０Ｘ３ｍｌの最小増殖培地中に播種した。同日午後に、１００ｍｌの一晩（ｏ／ｎ）培養物で出発ＯＤ_６００が０．０１となる一定容量を３ｍｌの前培養液から採取した。１００ｍｌの培養液を振とう器中、＋３７℃で一晩インキュベートした。数個の３ｍｌ前培養液から、ＯＤ_６００＝１グリセリンストック（１０％グリセリン）を作製した。グリセリンストックを－７０℃で保存した。

【0117】

約１６時間の培養後、３日目に、振とうフラスコ培養液の最終ＯＤ_６００を測定し、細胞を遠心分離した（ＳＬＡ－３０００ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ６、７０００ｒｐｍ、１０分、＋４℃）。培養上清を集め、合わせた後、０．２μｍフィルターで濾過した。濾液の体積は約７４５ｍｌと測定された。７０％の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４飽和を生ずる３２６．８６ｇの固形（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を秤量し、約３３ｇの一定分量を上清に加え、連続的に混合した。全ての塩を溶解すると、この溶液を＋４℃の冷蔵庫に移した。

【0118】

翌朝、硫酸アンモニウム溶液を遠心分離した（ＳＬＡ－３０００ローターを備えたＳｏｒｖａｌｌ ＲＣ６、９０分、１０５００ｒｐｍ、＋４℃、加速９および減速４）。遠心分離後、上清を合わせ、０．２μｍの細菌濾過器を通して濾過した。７２．５ｍｌの濾液を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用として採取した。残りの濾液を１７ｘ５０ｍｌの分割量に分け、最初＋４℃で保存し、その後－２０℃に移した。さらに、２つの１ｍｌの濾液試料を採取し、最初は＋４℃で保存し、その後－２０℃に移した。

【0119】

硫酸アンモニウム濾液の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度を約２．７Ｍと推定し、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の濃度が約２Ｍに低下するように、１９０ｍＭのＮａ－Ｈ－リン酸緩衝液、ｐＨ６．８で希釈した。濾液を、５０ｍＭのＮａ－Ｈ－リン酸塩、ｐＨ６．９，２Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラムで、ＨＩＣに供した。合計５０ｍｌの試料をカラムを通して圧送し、通過画分を５ｍｌの画分として集めた。非結合試料を、５０ｍＭのＮａ－Ｈ－リン酸塩、ｐＨ６．９、２Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４で洗い流した。結合ＩＳ２８８をステップ勾配および５０ｍＭのＮａ－Ｈ－リン酸塩、ｐＨ６．８を使って、漸減（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度で溶出した。最初のランでは、溶出画分は１ｍｌであった。溶出タンパク質を含む画分を３つの異なるセット；Ｃ３－Ｃ８、Ｃ９－Ｄ１およびＤ２－Ｄ８、として混ぜ合わせた。通過画分および残りの溶出画分を＋４℃で保存した。通過画分Ｂ１およびＢ８ならびにプールしたタンパク質画分から試料を採取し、＋４℃で保存した。

【0120】

ＨＩＣステップを異なる試料体積、すなわち、６５ｍｌおよび１２５ｍｌの平衡化硫酸アンモニウム濾液に対し、２回繰り返した。これらの後のＨＩＣランを最初のランとは少々変更した。非結合試料の洗浄体積は３および４ＣＶであり、通過画分の体積を１０ｍｌに増やし、溶出画分の体積を１．５ｍｌに増やした。操作条件に対するその他の変更は行わなかった。

【0121】

プールしたタンパク質画分ならびに最初のランのＢ１およびＢ８の通過画分をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４濃縮器を使って、１００００ＮＭＷＬで限外濾過および濃縮した。試料を６回遠心分離し、最後の遠心分離を除いて、各遠心分離後、４ｍｌの体積を得るために、残りの試料または緩衝液を残余分中に加えた。６回の濃縮ステップ後、残余分を集め、測定し、＋４℃で保存した。次のＨＩＣランからの試料、ならびに最初のランからのもう一つの通過画分を、１００００ＮＭＷＬで、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５を使って限外濾過および濃縮したが、４回の濃縮ラウンドのみが必要であった。これらの試料も＋４℃で保存した。硫酸アンモニウム濾液を限外濾過および濃縮し、１００００ＮＭＷＬのＵｌｔｒａｃｅｌｌ－１０膜を備えたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレートを使って通過画分をもう一度濃縮した。この最後の濃縮の前に、通過画分試料のタンパク質濃度を測定し、一方、硫酸アンモニウム濾液に対してはタンパク質濃度を測定しなかった。

【0122】

試料のタンパク質濃度をＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ－ｋｉｔを使って測定した。Ａｋｔａから入手した溶出ピークに基づいて、溶出したタンパク質画分を約１：２０および約１：４０に希釈し、通過画分をそのままで（１：１希釈）または半分に希釈（１：２希釈）して使用した。

【0123】

最終的に、全ての３つの精製由来の試料を、６～６６ｋＤａの大きさのタンパク質を適切に分離するＭＯＰＳランニングバッファーを使って、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ＸＴ １２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥで測定した。３３Ｘ濃縮試料でタンパク質含量が０．２１μｇ／μｌであると測定されたＢ１_{１２１１０８}を除いて、硫酸アンモニウム濾液および全通過画分の最大量の試料を加えた。０．５μｇのタンパク質がゲルに添加されるように、ピペットで採取するタンパク質ピーク画分の量を計算した。

【0124】

精製されたＩＳ２８８のタンパク質溶液を使って、質量単位当たりのＩＳ２８８の活性を測定した。タンパク質が分解しているかまたは何か別の原因により保存中に変化しているかどうかを見つけるために、保存条件下のＩＳ２８８の安定性を調べた。標的部位マトリックスでのタンパク質の安定性についても同様に測定した。標的部位マトリックス中の安定性アッセイの結果と、活性アッセイの結果とを組み合わせて、小腸中の抗生物質残留物を除去するためにＩＳ２８８が要する時間を推定した。

【0125】

Ｐ１Ａ変異体ＩＳ２８８に関するさらに詳細な情報を得ることに加えて、調査中に作成された特徴付けスキームを、その後の別のＰ１Ａ変異体の特徴付けに使用した。

【0126】

Ｐ１Ａ変異体ＩＳ２８８の産生レベルの調査方法
バチルス・ズブチリスの振とうフラスコ培養中に、種々の時点で試料を採取し、ＩＳ２８８の産生レベルを評価した。さらに細胞がどの程度増殖しているかを調べるために、各時点でＯＤ_６００値を測定した。製造されるタンパク質の量をＳＤＳ－ＰＡＧＥで推定した。

【0127】

種々のｐＨレベルでの酵素の有効性および抗生物質薬効範囲の調査方法
この調査で用いられた抗生物質は、例えば、静脈内投与によるセファロスポリンを選択した。理論に束縛されることを意図するものではないが、選択された抗生物質の濃度は、文献で報告された胆汁または十二指腸中の濃度に出来る限り近い濃度とした。この実験はまた、様々なｐＨで行われた。

【0128】

ヒト回腸キームス中の酵素安定性の調査方法
異なる量の精製酵素をヒト回腸キームス中、適切な温度で設定した時間、インキュベートした。種々の時点で試料を採取した。ＩＳ２８８の分解パターンをＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析し、ＩＳ２８８の活性をニトロセフィンを基質として使用して分析した。

【0129】

化合物および菌株：アンピシリン、セフトリアキソン、セフタジジム、メロペネム、セフェピム、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォペラゾン、セフォタキシム、およびセフロキシムを市販品入手源から購入し、それぞれ、１５ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬの凍結ストックとして保存した。Ｐ１Ａを３２ｍｇ／ｍＬのストック濃度としてＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓにより入手し、－８０℃で保存した。大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。

【0130】

Ｐ１Ａ（ＲＳ３１０）、Ｐ３Ａ（ＩＳ１１８）およびＰ４Ａ（ＩＳ２８８）の存在下および非存在下における有効阻害濃度の決定：アンピシリン、セフトリアキソン、セフタジジム、メロペネム、セフェピム、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォペラゾン、セフォタキシム、およびセフロキシムの有効阻害濃度（ＥＣ５０、９０）を、ＣＬＳＩガイドライン（Ｍ０７－Ａ９：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｔｈａｔ Ｇｒｏｗ Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ－Ｎｉｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）に従って、ミクロブロス希釈分析により測定した。陽イオン調整ミュラーヒントン培地中、大気環境下、３７℃で大腸菌株２５９２２をグリセリンストックから対数増殖まで培養し、陽イオン調整ミュラーヒントン培地で希釈し、５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌの出発ウエル濃度を得た。陽イオン調整ミュラーヒントン培地中で抗菌性化合物の段階２倍希釈を調製し、アンピシリンに対して、１２８μｇ／ｍＬ～０．１３μｇ／ｍＬ、ならびに４μｇ／ｍＬ～４ｎｇ／ｍＬの段階１０倍希釈のＰ１Ａ、Ｐ３Ａ、またはＰ４Ａβ－ラクタマーゼ標準の存在下または非存在下で、アンピシリンに対して、５ｐｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬ、およびセフトリアキソン、セフタジジム、メロペネム、セフェピム、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォペラゾン、セフォタキシム、およびセフロキシムに対して、５０ｐｇ／ｍＬ～５００ｎｇ／ｍＬの最終ウエル濃度を得た。抗生物質をＰ１Ａに添加して、細菌の添加前に３７℃で３０分インキュベート（プレインキュベーション）するか、またはＰ１Ａ、Ｐ３Ａ、Ｐ４Ａ、および細菌の添加（同時）後にプレートに抗生物質を加えた。全濃度および組み合わせを、培地のみ、化合物＋培地のみ（比色分析対照）、および無処理細菌対照の条件下で９６ウエルプレート中、３回繰り返して評価した。一晩インキュベーション後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４プレートリーダーでプレートのＯＤ６２５を測定し、細菌増殖を５０％、９０％および９９％阻害する有効濃度（ＥＣ５０、９０、９９）を線形回帰分析により決定するために、データをカスタマイズしたエクセルのスプレッドシートに入力した。

【0131】

実施例２：変異誘発の結果
変異設計は、特に、次の構造データ（例えば、結晶構造データ、相同体モデル、など）： Ｐ１Ａ結晶構造（Ｋｎｏｘ ａｎｄ Ｍｏｅｗｓ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２２０，４３５－４５５（１９９１））、ＣＴＸ－Ｍ－４４（１ＢＺＡ（Ｉｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８５，Ｉｓｓｕｅ ５ ２０７９－２０８７（１９９９））、１ＩＹＳ（１ＢＺＡ（Ｉｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２８５，Ｉｓｓｕｅ ５ ２０７９－２０８７（１９９９））、１ＩＹＳ（Ｉｂｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２（３６）：１０６３４－４３）、１ＩＹＯ、１ＩＹＰおよび１ＩＹＱ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７：４６６０１－０８）、プロテウス・ブルガリスＫ１（１ＨＺＯ，Ｎｕｇａｋａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｍａｒ １５；３１７（１）：１０９－１７）およびプロテウス・ペンネリＨｕｇＡ（Ｌｉａｓｓｉｎｅ ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２ Ｊａｎ；４６（１）：２１６－９．２００２）、また、Ｂｏｎｎｅｔ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８（１）：１－１４（２００４）（ＣＴＭ－Ｘに対して）中で概説されている）をベースにした。全てのこれらの文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本変異は次のβ－ラクタマーゼのいずれか１種の構造データ（例えば、結晶構造データ、相同体モデル、など）から情報を得ている：Ｐ１Ａ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ａ、ＣＴＸ－Ｍ－３、ＣＴＸ－Ｍ－４、ＣＴＸ－Ｍ－５、ＣＴＸ－Ｍ－９、ＣＴＸ－Ｍ－１０、ＣＴＸ－Ｍ－１４、ＣＴＸ－Ｍ－１５、ＣＴＸ－Ｍ－１６、ＣＴＸ－Ｍ－１８、ＣＴＸ－Ｍ－１９、ＣＴＸ－Ｍ－２５、ＣＴＸ－Ｍ－２６、ＣＴＸ－Ｍ－２７、ＣＴＸ－Ｍ－３２、ＣＴＸ－Ｍ－４４、ＣＴＸ－Ｍ－４５、およびＣＴＸ－Ｍ－５４。このような情報は当業者により既知のデータベース、例えば、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ、ＮＣＢＩ、およびＰＤＢで入手可能である。

【0132】

部位特異的およびランダム変異誘発結果をそれぞれ表２および３にまとめている。選択変異体の酵素活性を表４に、動力学的パラメータを表５に示す。前に行った酵素Ｐ１Ａ、Ｐ３ＡおよびＰ２Ａに対する動力学的パラメータも表に含めている。

【0133】

変異ブロック１．Ｉ７２Ｓ、Ｑ１３５ＭおよびＴ１６０Ｆ
Ｉ７２Ｓ、Ｑ１３５ＭおよびＴ１６０Ｆを含む変異の第１のブロックをＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ変異誘発キット（以降では略してＭｕｌｔｉキットと呼ぶ）を使った１つの反応で変異誘発性プライマー中に導入した。ｐｅｎＰ遺伝子を保持するプラスミドを変異誘発反応におけるテンプレートとして使用した。変異体一本鎖プラスミドを大腸菌ＸＬ１０Ｇｏｌｄ中に形質転換し、カナマイシン／クロラムフェニコールで選択した。コンピテントＸＬ１０ Ｇｏｌｄ細胞をＭｕｌｔｉキットと共に入手した。コロニー（１０～３０）を採取し、ニトロセフィンで試験し、β－ラクタマーゼ活性を確認した。コロニーの一部をＰＣＲのテンプレートとして使って、得られた断片が不純物を含まない場合は、それをＤＮＡ塩基配列決定に移した。残りのコロニーを適切な抗生物質を補充したルリア培地中で一晩、３７℃で培養し、一部の培養液をグリセリン中（≦１０％、最終）で保存し、別の一部をプラスミド単離に使用した。目的の変異がＤＮＡ塩基配列決定法で確認された後、変異体クローンをさらに詳細に特徴付けた。周辺質ライセートを調製し、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析して、セフォタキシム加水分解の動力学を分光測定により測定した。

【0134】

変異ブロック２．Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８ＧおよびＳ２４０Ｄ
Ｐ１ＡのＢ３β－鎖の標的アミノ酸は相互に非常に近くに位置しているので、少なくとも１ラウンドにおいてはＭｕｌｔｉ－Ｓｉｔｅプロトコルは適さない。その代わりに、ＳＯＥ技術を使って４つ全てのアミノ酸が交換された。交換を含む領域は、２４ヌクレオチド（８個のアミノ酸コドン）を含み、２つのＰＣＲプライマーの重複伸張部分中に含まれた。変異ｐｅｎＰ遺伝子を、プライマーＡ＋ＢおよびＣ＋Ｄを使って、最初に２つの部分でＰＣＲした（図７）。その後、２つのＰＣＲ産物を合わせ、ｐｅｎＰ遺伝子の５’および３’部分に相補的な、プライマーＡおよびＤを使って増幅した。クローニング部位はプライマーＡおよびＤに含めた。構築物の準備ができると、Ｍｕｌｔｉキットを使って、さらなる変異を加えた。

【0135】

さらなる変異、Ｒ２４４ＴおよびＤ２７６Ｒ（Ｋ）
これらの変異は、Ｍｕｌｔｉ－Ｓｉｔｅキット技術を使い、以前に作成した変異体プラスミドを鋳型として使って加えた。作成した変異のリストを表１に示す。変異の組み合わせの数は容易に増やせるので、個々のクローンのセフォタキシム分解動力学の測定よりもさらに堅牢な方法を使って特徴付けを行った。一次特徴付けは、セフォタキシムＭＩＣの決定であった。

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【表9】

【表10】

【0136】

酵素活性および動力学的パラメータ
理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｐ１Ａのセフォタキシム、セフトリアキソンおよびセフロキシムに対し測定した動力学的パラメータから、Ｐ１Ａは固有の低いセファロスポリナーゼ活性を有することが推定される。全体的に、変異体のリガンドに対する親和性は、増加した（すなわち、Ｋｍが減少した）。ＩＳ２２９（ブロック２＋Ｒ２４４Ｔ）変異体ではＶ_ｍａｘが増加し、親和性が減少した（Ｋｍが増加した）（表５）。ＩＳ２２９に対しては、Ｋ_ｃａｔが最も大きく増加した。

【0137】

セフトリアキソンでのランダム変異誘発検査では、抗生物質に対し低Ｋｍ（高親和性）の変異体が選択される。

【0138】

変異シリーズＰ３Ａ→ＩＳ１５８→ＩＳ２３２では、その後の変異ラウンドによるＫｍの減少が認められ、ＩＳ２３２がセフトリアキソンに対する極端に高い親和性を有した。セフトリアキソンに対するＶ_ｍａｘは順に減少せず、ＩＳ１５８が最高であったが、それにもかかわらず、Ｋ_ｃａｔは変異ラウンドを通して減少した。このラウンドの最初の２つの変異体は、セフォタキシマーゼ活性を持たなかったが、追加のＡ２３８Ｔを含むＩＳ２３２は、セフォタキシマーゼ活性を有した。

【0139】

部位特異的ブロック２（ＩＳ１９１）変異単独は、セファロスポリンに対するＰ１Ａ誘導体の活性を大きく高めなかったが、アンピシリンに対する活性は２０倍低減された（表４）。ブロック２＋Ｄ２７６Ｒ／Ｋ（ＩＳ２１９／ＩＳ２２１）のセファロスポリナーゼ活性は、ＩＳ１９１の活性よりかなり良好であった。ＩＳ２１９およびＩＳ２２１部位特異的変異体の動力学的パラメータは、部位特異的変異誘発が、好ましくも、標的抗生物質に対する酵素の親和性を高めることを明らかにした。

【0140】

安定性アッセイ／グルコースストレス試験
枯草菌増殖条件中の変異体の安定性を試験するために、ＲＳ３１０、ＩＳ２１９およびＩＳ２３２の振とうフラスコ培養を行った。培養を５ｇ／ｌおよび１０ｇ／ｌの２つの異なるグルコース濃度で行った。

【0141】

５または１０ｇ／ｌのグルコースを添加した最少培地中で、Ｐ１Ａ（ＲＳ３１０）および２つの変異体ＩＳ２１９およびＩＳ２３２を振とうフラスコ（１００ｍｌ）培養を行った。細胞の状態を顕微鏡でモニターし、５ｇ／ｌ増殖物から測定したグルコース消費を計測し、培養上清（濃縮および非濃縮）由来の試料を、１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ，ＢｉｏＲａｄ）に供した（図１および２）。細胞培養液のＯＤもモニターした。

【0142】

１０ｇ／ｌグルコース培養では、Ｐ１ＡおよびＩＳ２３２を同等量産生したが、ＩＳ２１９の産生は少なかった（レーン２～４、図１）。濃縮中、ＩＳ２１９の収量はさらに低下した（レーン６、９および１６、図１）。約２９ｋＤａのわずかなバンドが図１のレーン１６に認められる。Ｐ１ＡおよびＩＳ２３２は、再度濃縮することが可能である（レーン５、７、８、１０、１５および１６、図１）。

【0143】

５ｇ／ｌグルコースの存在下では、Ｐ１Ａ株ＲＳ３１０は、その他の２つの株よりゆっくり増殖を開始した。しかし、培養の終わりまでに、Ｐ１Ａの量は、その他のタンパク質の量に取って代わられた（図２）。変異体株ＩＳ２１９は株ＩＳ２３２とほぼ同じ速度で産生を開始したが、培養の１０時間までに、その産生はＩＳ２３２に遅れはじめ、その量は時間がたつにつれ減少した。ＩＳ２１９とＩＳ２３２の両方の培養において、全てのグルコースは培養の９．５時間までに消費され、そのときから、プロテアーゼの量が増加し始めたことが想定される。ＲＳ３１０はゆっくり増殖することから、培養の１１時間にも少しのグルコースが残されていたが、ＲＳ３１０でも、翌朝までに全てのグルコースが消費された。夜の間にＲＳ３１０から試料が採取されなかったので、ＲＳ３１０が全てのグルコースを使い切って、プロテアーゼを産生し始めた正確な時点を明言することができない。培養の２７．５時間までに、Ｐ１Ａの量は増加したが、ＩＳ２１９とＩＳ２３２の両方の量は、前日より減少した。理論に束縛されることを意図するものではないが、調査から、ＩＳ２３２はＩＳ２１９より良好にプロテアーゼに耐え、ＩＳ２１９は全く耐えることができないと推定することができる。

【0144】

１０ｇ／ｌグルコースおよび５ｇ／ｌグルコース両方の培養に基づくと、理論に束縛されることを意図するものではないが、Ｐ１Ａに対する改変は、タンパク質プロテアーゼ耐性を低減させるということができる。ＩＳ２１９とＩＳ２３２の場合には、グルコース欠如は分解生成物の出現に繋がり、全てのグルコースが消費された後で、分解生成物の量が増加した。ＩＳ２１９タンパク質は、その量がＩＳ２３２の場合より多く減少するために、分解に対しより感受性が高い。理論に束縛されることを意図するものではないが、これは、バチルスプロテアーゼに対し、より低い分泌能またはより高い感受性、または両方を示すと思われる。結論として、ＩＳ２１９の産生は、ＲＳ３１０およびＩＳ２３２と同じ増殖条件下では、可能ではない。グルコースストレス試験はまた、この試験が生成された変異体のプロテアーゼ耐性を推定するために使用できることを実証した。

【0145】

グルコースストレス試験で、ブロック２＋Ｄ２７６Ｒ＝ＩＳ２１９（および、おそらく、ブロック２＋Ｄ２７６Ｋ＝ＩＳ２２１）変異は酵素のプロテアーゼ耐性を低下させることが実証された。理論に束縛されることを意図するものではないが、おそらく、不安定性はＤ２７６Ｒ変異に起因し、これは、タンパク質の表面上にプロテアーゼ開裂部位を生成する。

【0146】

ブロック２＋Ｄ２７６Ｎ変異を生ずるＩＳ１９１上のＤ２７６Ｎ変異が作られた。理論に束縛されることを意図するものではないが、アスパラギン酸のアスパラギンへの変異は、ＩＳ１９１のセフトリアキソン（および、たぶんセフォタキシムも）活性を高めるが、同時に、この酵素をＩＳ２１９（およびＩＳ２２１）よりもプロテアーゼに対する高い耐性に維持することが予測される。Ｒ２４４Ｔ変異を、ブロック２およびＤ２７６Ｎと組み合わせて、この変異でＶ_ｍａｘ（およびＫ_ｃａｔ）が高まるがどうかを調べることが可能であろう。Ｒ２４４Ｔ変異はまた、ＩＳ２１９およびＩＳ２２１と組み合わせることが可能であろう。

【0147】

活性アッセイ（表４）によると、Ｒ２４４Ｔ（ＩＳ２１７）変異はほとんど全てのＰ１Ａの酵素活性を消滅させた。一部の活性が二重変異体Ｒ２４４Ｔ＋Ｄ２７６Ｋ（ＩＳ２１５）により増加したが、野生型酵素のレベルまでにはならなかった。したがって、Ｒ２４４Ｔ変異単独では、セファロスポリナーゼ活性を有するＰ１Ａが得られない。

【0148】

動的データ（表５）に基づくと、ブロック１変異（Ｉ７２Ｓ／Ｑ１３５Ｍ／Ｔ１６０Ｆ、ＩＳ２２７）は、Ｐ１Ａのセファロスポリンを加水分解する能力を改善しなかった。その他の活性アッセイでは、Ｑ１３５ＭもＴ１６０Ｆも、単独では、Ｐ１Ａのセファロスポリンを加水分解する能力を高めるよりむしろ、単一変異は、アンピシリンに対するものも含め、ほぼ全てのＰ１Ａの酵素活性を消滅させた。しかし、ブロック２（ＩＳ１９１）と、ブロック２＋Ｄ２７６Ｒ／Ｋ（ＩＳ２１９／ＩＳ２２１）の変異体との間の、セフォタキシムおよびセフトリアキソンに対し活性を有するブロック２＋Ｑ１３５Ｍ変異体（ＩＳ２２４）が存在した。理論に束縛されることを意図するものではないが、ブロック１は、触媒的Ｇｌｕ１６６が位置するΩループを「ゆるめる」可能性がある。Ｔ１６０Ｆ変異は、タンパク質の構造のコアにおける極めて大きな改変である。それは構造を完全にまたは少なくともタンパク質を適切に機能動作しないように無能化する可能性がある。この可能性を回避するために、Ｐ１ＡのＴ１６０Ｆ変異に伴って２つの代償性変異、すなわち、Ｉ７２ＳおよびＱ１３５Ｍを加え、この組み合わせを「ブロック１」と呼んだ。

【0149】

実施例３：Ｐ１Ａ変異体ＩＳ２８８の産生および精製の結果
精製の結果を溶出ピーク図（図３、４および５）およびタンパク質濃度として、ピークテーブルとして、ならびにＳＤＳ－ＰＡＧＥ図（図６）として示す。

【0150】

疎水性相互作用クロマトグラフィーからのクロマトグラム
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を３つの別々の場合について、異なるパラメータを用いて実行した。
第１のラン（１６．１０．０８、図３）では、試料体積を約５０ｍｌ、通過画分の体積を５ｍｌ、非結合試料用の洗浄体積を２ＣＶ、および溶出画分の体積を１．０ｍｌとした。その後のＨＩＣラン（４．１１．０８、図４）では、試料体積を６５ｍｌに、通過画分体積を１０ｍｌに、非結合試料用洗浄体積を３ＣＶに、および画分の大きさを１．５ｍｌに増やした。最後のラン（１２．１１．０８、図５）では、試料体積および非結合試料用洗浄体積が前のランと異なり、それぞれ１２５ｍｌおよび４ＣＶとした。

【0151】

ＨＩＣランのすべてのグラフ（図３、４、および５）は同じ全体の形式を表す。通過画分は、試料適用全体を通して一定の２８０ｎｍでの吸光度約７００ｍＡＵを与え、一方、非結合試料の洗浄中、２８０ｎｍでの吸光度は０に低下し、結合タンパク質が溶出されると再度上昇した。試料の伝導率は、２Ｍの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含むランニングバッファーＡよりも図３および図４の適用試料でわずかに低く、一方、１２．１１．２００８のランでは、Ａ緩衝液と同じままであった。２つの最初のランでは、硫酸アンモニウム濾液の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度は２．７Ｍと推定され、最後のランでは２．６Ｍと推定された。２．６Ｍ推定は、試料適用中に流出する溶液の伝導率が低下しなかったので、硫酸アンモニウム濾液の実際の（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４濃度により近かったと思われる（図５）。

【0152】

緩衝液（緩衝液Ｂ）がカラムに適用された直後に溶出が開始した。これは、タンパク質が勾配中を非常に速く溶出されたので、試料中のタンパク質がほとんどカラムに結合しなかったことを示す。したがって、試料の伝導率が約２４０ｍＳ／ｃｍ未満に決してならなかったことは重要であった。

【0153】

典型的に急峻な上昇傾斜および緩やかな下降傾斜を有する、わずかに非対称の溶出ピークとして結合タンパク質が溶出した。ピークのサイズは第１のランで最大で、約１８ｍｌ（１８ｘ１ｍｌ画分）（図３）であった。このピークは、３セット：第１の６ｍｌ（画分Ｃ３－Ｃ８）、第２の５ｍｌ（画分Ｃ９－Ｄ１）および第３の７ｍｌ（画分Ｄ２－Ｄ８）に収集された。これは、画分Ｃ８－Ｃ９の間では溶出ピークに「肩」があったため、また、最後の７画分は濃縮用としては希釈されすぎている可能性があることが理由である。２つのその後に続くＨＩＣラン（４．１１．２００８および１２．１１．２００８、それぞれ図４および５）では、溶出ピークは１３．５ｍｌ（９ｘ１．５ｍｌ画分、４．１１．２００８）および１２ｍｌ（８ｘ１．５ｍｌ画分、１２．１１．２００８）であり、全ピークを１つの画分にプールされた。

【0154】

表７には、３つのＨＩＣランのＡ_２８０グラフ用の統計値が示されている。ピークの面積を使って、その試料のタンパク質含量を推定し、また、ＢＣＡアッセイでの種々の試料用の希釈因子の推定に使用した。計算には、タンパク質の理論的消衰係数が必要で、これをＥｘＰＡＳｙウェブサービスでＰｒｏｔＰａｒａｍＴｏｏｌを使って計算した。ＩＳ２８８に対しては、この係数は、２５４４０Ｍ^－１ｃｍ^－１であり、Ａ_２８０として、０．１％（＝１ｇ／ｌ）溶液で０．８６９を得た。

【0155】

上記比率、溶出タンパク質試料中のタンパク質の量およびこれらの試料の既知の体積を使って、カラムから溶出したタンパク質の量を計算した。使用した式は、（（ｍＡＵ^＊ｍｌ）^＊１０^∧－３／Ｖ_{ｆｒａｃｔｉｏｎ}）／０．８６９^＊Ｖ_{ｆｒａｃｔｉｏｎ}→（ｍＡＵ^＊ｍｌ）^＊１０^∧－３／０．８６９であり、これから、３．３６ｍｇのタンパク質１６１００８、２．９５ｍｇの０４１１０８、および３．６０ｍｇの１２１１０８が得られる。

【表11】

【0156】

限外濾過および通過画分および溶出タンパク質画分の濃度
それぞれの精製物から、１つ、２つまたは３つの通過画分ならびに溶出タンパク質ピークを含む全画分を濃縮のために選択した。選択試料を表８に示す。表中には、その試料の出発体積ならびに最終体積および濃縮係数も示した。

【表12】

【0157】

限外濾過用に選択された通過画分は、試料適用の開始（Ｂ１_{１６１００８}およびＡ２_{０４１１０８}）からおよび試料適用の終了（Ｂ７_{１６１００８}、Ｂ８_{１６１００８}、Ａ７_{０４１１０８}およびＢ１_{１２１１０８}）からであった。これらの試料を分析して、特定の試料の量がカラム容量を超えたかどうかを調べた。

【0158】

さらに、各々の精製物の硫酸アンモニウム濾液を限外濾過および濃縮し、一度濃縮した通過画分を、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ－１０膜、１００００ＮＭＷＬを備えたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートでまたさらに濃縮した。その濃縮の結果を表９に示す。

【表13】

【0159】

このように、ＨＩＣランの通過画分は、１６倍以上に濃縮された。通過画分の最終濃縮係数を表１０に示した。

【表14】

【0160】

ＢＣＡアッセイ結果
ＢＣＡアッセイの結果を表１１に示す。Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ－１０を備えたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎプレートによる最終濃縮ステップの前に、通過画分のタンパク質濃度を測定した。

【表15】

【0161】

ＨＩＣランからのクロマトグラムは、試料の適用中を通して、流出溶液の幾分高い約７００ｍＡＵのＡ_２８０値を与える。溶出タンパク質ピークは、十分な量のタンパク質を含んでいた。それらは、カラムの想定結合容量、１０ｍｇに近かった。Ａｋｔａからのピーク面積は、ＢＣＡアッセイより３倍低いタンパク質量の推定値を与えた。

【0162】

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
６．５μｌを加えたＢ１_{１２１１０８}を除いて、最大体積（１７．５μｌ）の硫酸アンモニウム濾液および通過画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥに加えた（図６）。レーン当たり約０．５μｇのタンパク質になるように、また、試料中の全てのタンパク質がＰ１Ａ誘導体ＩＳ２８８であると仮定して、タンパク質ピークからの試料の体積を計算した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを図６に示した。

【0163】

硫酸アンモニウム濾液試料は、全て、３０ｋＤａ近傍に二重のバンドを含む（ＩＳ２８８のＭＷは２９２８８Ｄａで、Ｐ１ＡのＭＷは２９２７３Ｄａである）。わずかに小さい余分のバンドを伴った同じ二重のバンドは、通過画分Ｂ１_{１２１１０８}に明らかに認めることができ、通過画分Ａ７_{０４１１０８}でさらに弱く認めることができる。他方では、これらの両方の余分のバンドは、溶出タンパク質ピークからは除かれている。約１０倍の目的量のタンパク質が加えられた場合、精製Ｄ２－Ｄ８ １６１００８の最後のプール画分で、いくつかの少量の不純物を認めることができる。精製タンパク質は、主要タンパク質型であり、分子量分析により、それはＰ１Ａ変異体ＩＳ２８８であったと結論付けることができる。

【0164】

実施例４：β－ラクタマーゼ活性についての微生物学的検査アッセイの試験
Ｐ１Ａβ－ラクタマーゼの非存在下および存在下で、大腸菌に対するアンピシリンおよびセフトリアキソンの５０％有効阻害濃度（ＥＣ_５０）を決定した。これらの調査においては、示した有効濃度は、実験の最初に加えられたアンピシリンまたはセフトリアキソンの初期濃度であって、実験の過程でまたはインキュベーション期間の最後に測定された濃度ではない。分析の結果を表１２～１４に示す。

【0165】

初期評価では、０．５ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬの濃度のＰ１Ａおよび０．１３μｇ／ｍＬ～１２８μｇ／ｍＬの濃度のアンピシリンまたはセフトリアキソンを使用した。同時に添加した場合、最低濃度のＰ１Ａ（０．５ｎｇ／ｍＬ）の添加により、アンピシリンのＥＣ_５０が、１６μｇ／ｍＬから最大試験濃度の１２８μｇ／ｍＬにシフトし、細菌の添加の前に、Ｐ１Ａをアンピシリンと共にプレインキュベートした場合、６４μｇ／ｍＬにシフトした（表１２）。同じ濃度のＰ１Ａと、０．１３μｇ／ｍＬ～１２８μｇ／ｍＬのセフトリアキソンを使用する場合、セフトリアキソンは最低濃度で完全に阻害性であり（ＥＣ_９９＜０．１３μｇ／ｍＬ）、また、同時に添加した場合、セフトリアキソンのＥＣ_５０は、５ｎｇ／ｍＬのＰ１Ａの存在下で０．２５μｇ／ｍＬにシフトし、５０ｎｇ／ｍＬのＰ１Ａを抗生物質とプレインキュベーションした場合、１２８μｇ／ｍＬにシフトしたことが観察された。この分析に基づいて、Ｐ１Ａおよびセフトリアキソンの濃度を調節して、両方の阻害性濃度の限界を定めた。

【0166】

５ｐｇ／ｍＬ～５０ｎｇ／ｍＬのＰ１Ａと、０．１３μｇ／ｍＬ～１２８μｇ／ｍＬのアンピシリンの濃度を使って試験すると、プレインキュベーションまたは同時に添加した場合、アンピシリンのＥＣ_５０が、Ｐ１Ａの非存在下の１６μｇ／ｍＬから５０ｐｇ／ｍＬのＰ１Ａの存在下の１２８μｇ／ｍＬにシフトした。より低い濃度のＰ１Ａ（５ｐｇ／ｍＬ）はアンピシリンＥＣ_５０に対し影響を与えなかった。プレインキュベーションまたは同時に添加した場合、セフトリアキソンのＥＣ_５０が、Ｐ１Ａの非存在下の０．０３μｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬ以上のＰ１Ａの存在下の４μｇ／ｍＬ超にシフトした（表１３）。より低い濃度のＰ１Ａ（５０ｐｇ／ｍＬ～５ｎｇ／ｍＬ）はセフトリアキソンＥＣ_５０に対し影響を与えなかった。アンピシリンまたはセフトリアキソンとＰ１Ａの同時添加についての結果を反復分析により確認した（表１４）。

【表16】

【0167】

抗生物質をＰ１Ａに添加して、細菌の添加前に３７℃で３０分インキュベート（プレインキュベーション）するか、またはＰ１Ａおよび細菌の添加（同時）後にプレートに抗生物質を加えた。全濃度および組み合わせを、９６ウエルプレート形式で３回繰り返して評価した。一晩インキュベーション後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４プレートリーダーでプレートのＯＤ_６２５を測定し、５０％有効阻害濃度（ＥＣ_５０）を線形回帰分析により決定するために、データをカスタマイズしたエクセルのスプレッドシートに入力した。これらの調査においては、示した有効濃度は、実験の最初に加えられたアンピシリンまたはセフトリアキソンの初期濃度であって、実験の過程でまたはインキュベーション期間の最後に測定された濃度ではない。

【表17】

【0168】

抗生物質をＰ１Ａに添加して、細菌の添加前に３７℃で３０分インキュベート（プレインキュベーション）するか、またはＰ１Ａおよび細菌の添加（同時）後にプレートに抗生物質を加えた。全濃度および組み合わせを、９６ウエルプレート形式で３回繰り返して評価した。一晩インキュベーション後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４プレートリーダーでプレートのＯＤ_６２５を測定し、５０％有効阻害濃度（ＥＣ_５０）を決定するために、データをカスタマイズしたエクセルのスプレッドシートに入力した。

【表18】

【0169】

抗生物質をＰ１Ａおよび細菌（同時）に加えた。全濃度および組み合わせを、９６ウエルプレート形式で３回繰り返して評価した。一晩インキュベーション後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４プレートリーダーでプレートのＯＤ_６２５を測定し、５０％有効阻害濃度（ＥＣ_５０）を線形回帰分析により決定するために、データをカスタマイズしたエクセルのスプレッドシートに入力した。

【0170】

これらの結果は、Ｐ１Ａは、インビトロ微生物学的アッセイにおいてアンピシリンおよびセフトリアキソンの活性を効果的に阻害することを実証し、Ｐ１Ａは、微生物学的アッセイにおいてセフトリアキソンに対するよりは、アンピシリンに対して１，０００倍活性であることを示した。

【0171】

次に、Ｐ１Ａ、Ｐ３Ａ、またはＰ４Ａβ－ラクタマーゼの非存在下および存在下で、大腸菌に対するアンピシリン、セフトリアキソン、セフタジジム、メロペネム、セフェピム、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォペラゾン、セフォタキシム、およびセフロキシムの９０％有効阻害濃度（ＥＣ_９０）を決定した。これらの調査においては、示した有効濃度は、実験の最初に加えられたアンピシリン、セフトリアキソン、セフタジジム、メロペネム、セフェピム、セファゾリン、アンピシリン／スルバクタム、セフォペラゾン、セフォタキシム、およびセフロキシムの初期濃度であって、実験の過程でまたはインキュベーション期間の最後に測定された濃度ではない。分析の結果を表１５～１７に示す。下表（表１５～１７）中のそれぞれのボックスにはスラッシュで分離された２つの数字が示されている。これら２つの数字は、２回の繰り返しアッセイを意味し、２回の値は全てぴったり一致した。

【0172】

特に、選択した抗生物質を９６ウェルディッシュの行に沿って希釈（２倍ステップ）することによってアッセイを行った。ＭＩＣを、希釈した抗生物質の細菌（この場合、全ての抗生物質に敏感な大腸菌株）の死滅から非死滅へ変化する点として決定した。Ｐ１Ａ、Ｐ３Ａ、およびＰ４Ａを列に沿って希釈（１０倍ステップ）した（β－ラクタマーゼの濃度を列の下方向に増加させた）。β－ラクタマーゼ濃度が増加すると、抗生物質を分解して見かけ上のＭＩＣ読みを変えるのに十分なレベルに達した（ＭＩＣは実際には変化しなかったが、ウエルに残っている抗生物質の量がウエルに加えた量より少なくなったので、変化したことが分かった）。ほとんどの場合、２つのブレイクポイントがあり、最初の点ではＭＩＣが少し増加したことが分かり、その後、１０倍濃度がより高い点で、ＭＩＣが試験した抗生物質の最大量を超えた。後者の点を終止点として使用した。この大腸菌では、ＭＩＣがそれぞれの抗生物質で異なることに留意することは重要である。しかし、このアッセイでは、絶対ＭＩＣは最も重要なパラメータではない。最も重要な読み値は、見かけ上のＭＩＣが試験した抗生物質の最大量まで増えるβ－ラクタマーゼ濃度であった。

【0173】

終止点が低いβ－ラクタマーゼ濃度で発生する場合は、β－ラクタマーゼが抗生物質を分解する点で強力であったことを意味する。ＭＩＣを変化させるのに多くのβ－ラクタマーゼを要する場合は、β－ラクタマーゼはその抗生物質に対し効果が比較的弱かった。理論に束縛されることを意図するものではないが、このアッセイは、所与の抗生物質に対するそれぞれのβ－ラクタマーゼのインビボ効力の予測を提供するように設計された。これらのデータはインビトロ動的データと組み合わせることができる。

【表19】

【0174】

大腸菌２９５２２を、段階希釈の抗生物質および培養上清由来の表示量のβ－ラクタマーゼタンパク質の存在下、９６ウエルプレート中で一晩インキュベートした。培養液の細菌密度（ＯＤ_６２５）を測定し、密度が未処理細菌対照に対して９０％減少した時点の濃度（ＥＣ_９０）を決定した。２回のアッセイを別の日に行い、データをＲｅｐ１およびＲｅｐ２として報告した。ＮＡ＝アッセイせず。

【表20】

【0175】

大腸菌２９５２２を、段階希釈の抗生物質および培養上清由来の表示量のβ－ラクタマーゼタンパク質の存在下、９６ウエルプレート中で一晩インキュベートした。培養液の細菌密度（ＯＤ_６２５）を測定し、密度が未処理細菌対照に対して９０％減少した時点の濃度（ＥＣ９０）を決定した。２回のアッセイを別の日に行い、データをスラッシュで分離された２つの数値として報告した。ＮＡ＝アッセイせず。

【表21】

【0176】

大腸菌２９５２２を、段階希釈の抗生物質および培養上清由来の表示量のβ－ラクタマーゼタンパク質の存在下、９６ウエルプレート中で一晩インキュベートした。培養液の細菌密度（ＯＤ６２５）を測定し、密度が未処理細菌対照に対して９０％減少した時点の濃度（ＥＣ９０）を決定した。２回のアッセイを別の日に行い、データをスラッシュで分離された２つの数値として報告した。ＮＡ＝アッセイせず。

【0177】

理論に束縛されることを意図するものではないが、これらのデータは、対応する動的データからの予測よりも大きいインビトロ活性を示唆する。例えば、セフタジジムの動的データからは治療効果がないことが予測されたが、これらのデータは５００ｎｇ／ｍｌで活性を示し、Ｐ４Ａに対する１０倍の改善がなされた。次に、Ｐ１ＡおよびＰ３Ａはアンピシリンに対し極めて効果的であるが、Ｐ４Ａはアンピシリンに対し幾分活性が減ることが観察された。アンピシリン／スルバクタムデータにより、スルバクタムはＰ１Ａ、Ｐ３Ａ、およびＰ４Ａを効果的に阻害することが確認された。アンピシリン／スルバクタムデータは効果的β－ラクタマーゼ阻害剤であることが確認されたが、これにより、これらのβ－ラクタマーゼがインビボで効果的ではないことを意味すると解釈されるべきではない。特に、胆汁排出の薬物動態が抗生物質および阻害剤について異なる場合は、抗生物質を、その阻害剤の非存在下で、小腸中で見つけることができる。例えば、Ｐ１Ａは、ヒト中でピペラシリン／タゾバクタムに対し効果的であることが示されている。メロペネムデータにより、Ｐ１Ａ、Ｐ３Ａ、およびＰ４Ａβ－ラクタマーゼがペニシリナーゼおよびセファロスポリナーゼであるという、予測されたことが確認された。最終的に、Ｐ４Ａは、セフトリアキソンの分解の点で著しく効果的で、Ｐ３Ａより優れていることが観察された。Ｐ４Ａは、アンピシリンに対すると同じくらいセフトリアキソンに対し良好である。Ｐ４はまた、セフェピムを除くいくつかの重要なセファロスポリンに対し活性が改善された。Ｐ１Ａに比べて、Ｐ４Ａはセフトリアキソン、セフォタキシム、セフタジジム、セファゾリン、セフォペラゾン、およびセフロキシムに対し、約１０倍以上のβ－ラクタマーゼ活性を示した。

【0178】

実施例５：Ｐ１Ａ、Ｐ３Ａ、およびＰ４Ａの抗生物質分解特性の分析
高抗生物質濃度の存在下で腸中のβ－ラクタマーゼの活性を模倣するように設計されたマイクロタイタープレート活性アッセイにより、Ｐ１ＡおよびＰ４Ａを、アンピシリン、セフトリアゾン、セフォタキシム、セファゾリン、セフロキシム、セフォペラゾン、セフェピム、およびセフタジジムの分解について検査した。１０、１００または１０００μｇ／ｍｌの示した抗生物質と、１０または１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＰ１ＡまたはＰ４Ａを混合することにより、アッセイを行った。プレートを３７℃で１時間インキュベートした後に大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２）を加えた、またはβ－ラクタマーゼ酵素の添加直後に大腸菌を添加した。プレートを一晩インキュベートし、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３８４Ｐｌｕｓプレートリーダーで６２５ｎｍの吸光度（ＯＤ_６２５）を測定することにより、細菌増殖を定量化した。それぞれのβ－ラクタマーゼおよび抗生物質に対し、分析を２回行った。培養上清のβ－ラクタマーゼ活性を、個々のウエル中の細菌増殖の外観に基づいて、陽性または陰性として判定した。１．０以上のＯＤ_６２５は最大細菌増殖を示し、したがって、完全な抗生物質分解および高β－ラクタマーゼ活性を示した。１．０未満のＯＤ_６２５は低細菌増殖を示し、したがって、不完全な抗生物質分解、すなわち、低β－ラクタマーゼ活性を示した。

【0179】

分析結果を図８に示す。β－ラクタマーゼおよび抗生物質と共にプレインキュベーションしたプレートで得られた読み値は、プレインキュベーションしなかったプレートの読み値に比べて、差異は存在しなかった。

【0180】

アンピシリンを除くすべての抗生物質に対し、Ｐ４ＡはＰ１Ａに比べて改善された活性を示した。Ｐ１Ａは、セフトリアキソン、セフォタキシム、およびセフタジジムに対し活性を示さなかった。Ｐ４Ａは、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフェピム、およびセフタジジムに対し、より大きな有効性を示す。

【0181】

したがって、Ｐ１Ａ中の５個のアミノ酸の改変（Ｐ４Ａ）により、セファロスポリナーゼ活性が１０～１０００倍増幅された。この結果、Ｐ４Ａの経口投与は、腸管内菌叢をよく使われるセファロスポリンから保護し、例えば、ＣＤＩの予防に対するこの予防戦略の臨床的有用性を広げることができる。特に、本明細書で提示のアッセイは、小腸で容易に達成される濃度で、Ｐ４Ａがセファロスポリンおよびその他の抗生物質を分解し、Ｐ１Ａに対する改善された基質プロファイルを有することができることを示している。

【0182】

定義
次の定義は、本明細書で開示の本発明との関連で使用される。特に断らなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0183】

本明細書で使われる「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、「１つ（１種）または複数（複数種）の」を意味することができる。

【0184】

さらに、参照数値表示に関連して使われる用語の「約」は、参照数値表示±参照数値表示の１０％を意味する。例えば、用語の「約５０」は、４５から５５の範囲を含む。

【0185】

「有効量」という用語は、医学的使用に関連して使用される場合、測定できるほどの目的の疾患の処置、予防、または発病速度の低下を与えるのに効果的である量である。

【0186】

本明細書において参照される場合、全ての組成物百分率は、部および比率は、特に指定がない限り、総組成物に対する重量を基準とする。本明細書で使用する場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語とその変形は、非限定であることを意図し、それにより、リスト中の項目の記載は、この技術の組成物および方法に有用である可能性を同様に有する他の類似項目の除外を意図するものではない。同様に、用語の「ｃａｎ」および「ｍａｙ」およびその変形は、非限定であることを意図し、それにより、ある実施形態が特定の要素または特徴を含むことが「できる（ｃａｎ）」または含んでも「よい（ｍａｙ）」という記載は、これらの要素または特徴を含まないこの技術のその他の実施形態を排除するものではない。

【0187】

ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ、またはｈａｖｉｎｇなどの用語の同義語であるオープンエンド用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用して本開示を記載および請求するが、本技術、またはその実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの代替用語を使って、別の選択肢として記載することができる。

【0188】

用語の「好ましい」および「好ましくは」は、特定の状況下で、特定の利点をもたらす本技術の実施形態を指す。しかしながら、同じまたは他の環境下で、他の実施形態も同様に好ましい場合がある。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、また、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。

【0189】

治療効果を達成に必要な本明細書で記載の組成物の量は、特定目的のための従来の手順に従って経験的に決定することができる。一般に、治療薬（例えば、本発明のβ－ラクタマーゼおよび／または医薬組成物（および／または追加の薬剤））の治療目的のために投与される場合、治療薬は薬理学的有効量で与えられる。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」、または「有効量」は、特に障害または疾患を処置するために、目的の生理的な効果を生み出すのに十分な量または目的の結果を達成することができる量を意味する。本明細書で使用される場合、有効量には、例えば、障害または疾患の症状の発症を遅らせる、障害または疾患の症状の過程を変える（例えば、疾患の症状の進行を遅らせる）、障害または疾患の１つまたは複数の症状または発症を減らすまたはなくする、および障害または疾患の症状を改善するのに十分な量を含めることが可能である。例えば、ＧＩ管障害（例えば、ＣＤＩ）に罹患している患者に対する治療薬の投与は、根底にある状態が根絶または改善される場合のみではなく、患者が重症度の低下または疾患に関連する症状の期間の短縮を報告する場合にも、治療の恩恵が得られる。治療の恩恵にはまた、改善が実現されるかどうかにかかわらず、根底にある疾患または障害の進行を止めるまたは遅らせることも含まれる。

【0190】

有効量、毒性、および治療効果は、例えば、細胞培養または実験動物によりＬＤ５０（集団の約５０％致死用量）およびＥＤ５０（集団の約５０％に対する治療的有効量）を測定するための標準的薬学的手順により決定できる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて変化してもよい。毒性と治療効果との間の用量比率は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。いくつかの実施形態では、大きな治療指数を示す組成物および方法が好ましい。治療有効量は、最初は、例えば、細胞培養アッセイを含むインビトロアッセイから推測することができる。また、用量は、細胞培養または適切な動物モデルで決定したＩＣ５０などの循環血漿中濃度を達成するように動物モデルで処方することができる。記載の組成物の血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。いずれかの特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニターすることができる。投与量は医師により決定することができ、必要に応じて、観察された処置の効果に適合するように調節することができる。

【0191】

特定の実施形態では、効果は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約９０％の定量化可能な変化をもたらすであろう。いくつかの実施形態では、効果は、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、またはさらに約９０％以上の定量化可能な変化をもたらすであろう。特定の実施形態では、効果は、２倍、または３倍、または４倍、または５倍、または１０倍の定量可能な変化をもたらすであろう。治療の恩恵にはまた、改善が実現されるかどうかにかかわらず、根底にある疾患もしくは障害の進行を止めるまたは遅らせる、または毒性の低減が含まれる。

【0192】

等価物
本発明をその特定の実施形態と関連付けて説明してきたが、その実施形態はさらに修正が可能であり、本出願は、一般的に、本発明の原理に従った本発明の任意の変形、使用、または改変を包含することが意図され、本発明が属する技術内の既知のまたは日常的な実施の範囲に入る、および本明細書に示されるおよび以下の添付の請求項の範囲に入る本質的な特徴に該当し得る本開示からの乖離を含むものと理解されよう。

【0193】

当業者は、特に本明細書に記載された特定の実施形態に対する多数の等価物を、ルーチン実験のみを用いて認識し、確認できるであろう。このような等価物は、次の請求項の範囲内に包含されることが意図されている。
参照による組み込み

【0194】

本明細書で引用されている全ての特許および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0195】

本明細書で考察された出版物は、単に本出願の出願日に先行してそれらが開示されているという理由で提供されている。本明細書のいずれも、本発明が、先行発明の理由でこのような出版物に先行する権利がないことを容認すると解釈されるべきではない。

【0196】

本明細書で使用されている全ての見出しは、単に構成上の理由によるものであり、どんな形にせよ、本開示を限定することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、等しく全てのセクションに適用することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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