特許7038671定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）を用いた非侵襲性のｐＨ依存的イメージング
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-10
(45)【発行日】2022-03-18
(54)【発明の名称】定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）を用いた非侵襲性のｐＨ依存的イメージング
(51)【国際特許分類】
A61B 5/055 20060101AFI20220311BHJP
G01N 24/08 20060101ALI20220311BHJP
【ＦＩ】
A61B5/055 311
A61B5/055 382
G01N24/08 510D
G01N24/08 510Y
【請求項の数】
21
(21)【出願番号】P 2018564357
(86)(22)【出願日】2017-06-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-09-19
(86)【国際出願番号】 US2017036617
(87)【国際公開番号】W WO2017214439
(87)【国際公開日】2017-12-14
【審査請求日】2020-04-22
(31)【優先権主張番号】62/347,509
(32)【優先日】2016-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】514135801
【氏名又は名称】シーダーズ－サイナイ メディカル センター
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100102118
【弁理士】
【氏名又は名称】春名 雅夫
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】ガジット ダン
(72)【発明者】
【氏名】リ デビアオ
(72)【発明者】
【氏名】ペレド ガディ
(72)【発明者】
【氏名】ガジット ズルマ
(72)【発明者】
【氏名】チョウ ツェンウェイ
【審査官】亀澤 智博
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００８１５７８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０８９７０（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３２３６３２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特開２０１５－１４４８２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２００７－１５２１２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００５４２９９（ＵＳ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｂ ５／０５５
Ｇ０１Ｎ ２４／００ －２４／１４
Ｇ０１Ｒ ３３／２０ －３３／６４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における状態を検査するための方法であって、前記方法が、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、前記領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；
前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、前記生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び
前記対象における状態を検査するために前記対象由来の不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、前記参照値と比較した前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が、前記対象における1以上の神経原性因子の上方調節と相関する、工程
を含む、前記方法。
【請求項2】
前記参照値と比較した前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が低いｐＨ値と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が２００交換／秒より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が２０１～１０００交換／秒である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記低いｐＨ値が５．６～６．９９である、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記参照値が参照の不安定プロトン交換速度であり、前記参照の不安定プロトン交換速度が１００～２００交換／秒である、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記参照の不安定プロトン交換速度が参照のｐＨ値と相関する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記参照のｐＨ値が７．０～７．２である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記状態が、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記対象の身体の前記画像化された領域が関節または椎間板を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記状態が痛みを伴う状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記参照値と比較した前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における１以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記１以上の疼痛関連因子が、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記参照値と比較した前記対象由来の上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における１以上の炎症関連因子の上方調節と相関する、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記炎症関連因子がインターロイキン－６（ＩＬ－６）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記神経原性因子が脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスが二次元（２Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスが三次元（３Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
前記ＭＲＩスキャナーが３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記ＭＲＩスキャナーが１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記ＭＲＩスキャナーが７．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年６月８に出願された米国仮特許出願番号６２／３４７，５０９の米国特許法第１１９条のもとでの優先権を主張する。
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１６年６月８に出願された米国仮特許出願番号６２／３４７，５０９の米国特許法第１１９条のもとでの優先権を主張する。
【0002】
連邦支援の研究開発に関する言及
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＲ０６６５１７のもとでの政府の支援によって行われた。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＡＲ０６６５１７のもとでの政府の支援によって行われた。
【0003】
技術分野
本発明は、一般に、イメージング及び画像処理についてのシステム及び方法に関する。
本発明は、一般に、イメージング及び画像処理についてのシステム及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
背景
本明細書における出版物はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。以下の記載は本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。それは、本明細書で提供されている情報のいずれかが従来技術であるもしくは現在請求されている発明に関連する、または具体的にもしくは暗に引用されている任意の出版物が従来技術であると認めることではない。
本明細書における出版物はすべて、各個々の出版物または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのような同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。以下の記載は本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。それは、本明細書で提供されている情報のいずれかが従来技術であるもしくは現在請求されている発明に関連する、または具体的にもしくは暗に引用されている任意の出版物が従来技術であると認めることではない。
【0005】
腰痛は米国人口の８５％までを冒すと推定される主要な医学的状態である。椎間板（ＩＶＤ）変性は背痛に関連することが多い。変性した椎間板は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を用いて特定することができるが、それらは常に痛みを引き起こすわけではない。従って、腰痛のある患者が幾つかの変性した椎間板を有するのであれば、外科的介入を決定するまえにどの椎間板が痛みの源であるかを判定するためにさらなる検査が必要とされる。標準の処置には椎間板造影法が挙げられ、その間に、痛みを誘発するために疑わしい椎間板が圧迫される。これは、椎間板の変性、椎間板ヘルニア、及び椎間板の高さの喪失をさらに加速し、隣接する脊椎端板を冒すことも知られる痛みを伴う処置である。それはまた、針の配置、加えられた圧力及び麻酔の変化に対しても自覚的である。最近の研究は低いｐＨを椎間板起因の疼痛と関連付けている。ｐＨは椎間板起因の背痛についての新しい代謝性バイオマーカーとして役立つ可能性があると考えられている。
【0006】
化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）はｐＨ依存的なシグナル変化を測定する新たに出現したＭＲ（磁気共鳴）技法である。この技法は、特定の分子における水のプロトンと溶質のプロトンとの間でのｐＨに感受性である絶え間ない化学交換を活用する。化学交換の速度はｐＨ値に依存する。溶質のプロトンが先ず一連の周波数選択性の高周波（ＲＦ）パルスによって磁化飽和され、水のプロトンで交換した後、飽和は水のシグナルにて間接的に検出される。たとえば、化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の含量を検出するための新たに出現したＭＲ技法である。この技法はＧＡＧにおける水のプロトンとヒドロキシルのプロトンとの間での絶え間ない化学交換を活用する。先ずヒドロキシルのプロトンが飽和され、水のプロトンとの移動の後、飽和は水のシグナルにて間接的に検出されるであろう。以前の研究はｇａｇＣＥＳＴを適用して変性した椎間板疾患の患者にてＧＡＧ含量の分布を調べていた。濃度に加えて、ｐＨとの相関も報告された。しかしながら、ｇａｇＣＥＳＴのコントラストはむしろ複雑な効果である。それには、（ａ）ｐＨに左右される水プロトンとＧＡＧプロトンとの間の交換速度；（ｂ）ＧＡＧの濃度と線形で相関する不安定プロトンの比；（ｃ）水緩和パラメータＴ１及びＴ２；ならびに（ｄ）ＣＥＳＴの飽和モジュールのＲＦ照射パワーを含むが、これらに限定されない複数の交絡因子が関与する。
【0007】
最近の研究は、ＣＥＳＴ実験にて交換速度または不安定プロトンの比を他の交絡因子から分離することに焦点が置かれている。これらの方法の間で、定量的ＣＥＳＴ（ｑＣＥＳＴ）は交換速度及び不安定プロトンの比の同時測定を可能にする。それは、ＣＥＳＴの効果が１／Ｂ１
２の線形関数として表すことができるという観察に基づいて開発された。オメガプロット解析のＢ１振幅を変化させて複数のＣＥＳＴ実験を行った。
【0008】
ｑＣＥＳＴを用いたｐＨ値及び濃度の同時測定はクレアチンのファントム試験で示されている。クレアチンのプロトンは水プロトンとの遅い～中程度の交換速度を有する。しかしながら、相対的に速い化学交換を受けるＧＡＧのプロトンについては、この技法がｐＨの変化を検出できるかどうかは検討されていない。加えて、試験のほとんどは連続波（ｃｗ）飽和パルスを用いて前臨床スキャナーで行われた。生体内での検証は行われておらず、臨床応用の可能性は未だ明らかではない。
【0009】
組織変性、特に背痛に関連するものを含む状態の進行を診断する、予後診断する、及びモニターするための改善されたシステム及び方法について当該技術にてニーズが明らかに存在する。
【発明の概要】
【0010】
例示であり、説明に役立ち、範囲を限定するのではないシステム、組成物、製造物品及び方法と併せて、以下の実施形態及びその態様が記載され、説明されている。
【0011】
種々の実施形態では、本発明は、対象において状態を診断する方法を提供し、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的バイオマーカーを測定する工程であって、生理的バイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び参照値に比べて不安定プロトン交換速度が上昇する場合、対象がその状態を有すると判定する工程を含む。一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は低いｐＨ値と相関する。一部の実施形態では、不安定プロトンの上昇した交換速度は２００交換／秒を超える。一部の実施形態では、不安定プロトンの上昇した交換速度は２０１～１０００交換／秒である。一部の実施形態では、低いｐＨ値は５．６～６．９９である。一部の実施形態では、参照値は参照の不安定プロトン交換速度であり、参照の不安定プロトン交換速度は１００～２００交換／秒である。一部の実施形態では、参照の不安定プロトン交換速度は参照のｐＨ値と相関する。一部の実施形態では、参照のｐＨ値は７．０～７．２である。一部の実施形態では、状態は、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は関節または椎間板を含む。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、１以上の疼痛関連因子は、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）から選択される。一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の炎症関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、炎症関連因子はインターロイキン６（ＩＬ－６）である。一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の神経原性因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、神経原性因子は脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ）である。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは、二次元（２Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは三次元（３Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは７．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、方法はさらに、対象の状態の起源が生理的なバイオマーカーを測定した対象の身体の画像化された領域の範囲内にあると判定する工程を含む。一部の実施形態では、低いｐＨ値は状態を有する対象を示す。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0012】
例となる実施形態が参照の図面にて説明される。本明細書で開示されている実施形態及び図面は制約ではなく説明に役立つと見なされるべきであることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明の種々の実施形態に従って、同一濃度（６０ｍＭ）であるが、ｐＨ値を変化させた（５．８、６．１、６．４、６．７及び７．０）ファントム（Ａ）及び同じｐＨ値（７．０）であるが、ＧＡＧ濃度を変化させた（２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ及び１００ｍＭ）ファントム（Ｂ）のΩプロット解析を示す図である。
【図2A】本発明の種々の実施形態に従って、ファントム試験の定量結果を示す図である。（Ａ）不安定プロトン交換速度の画素単位のマッピング。
【図2B】本発明の種々の実施形態に従って、ファントム試験の定量結果を示す図である。（Ｂ）不安定プロトンの比の画素単位のマッピング。
【図2C】本発明の種々の実施形態に従って、ファントム試験の定量結果を示す図である。（Ｃ）ｐＨの関数としての化学交換速度。
【図2D】本発明の種々の実施形態に従って、ファントム試験の定量結果を示す図である。（Ｄ）ＧＡＧ濃度の関数としての不安定プロトンの比。
【図3】本発明の種々の実施形態に従って、１匹のミニブタにおけるＩＶＤの代表的な画像及び対応する交換速度マップを示す図である。（Ａ）矢状面におけるＴ２加重画像。（Ｂ）相当するＩＶＤの軸方向の解剖学的画像。（Ｃ）相当するＩＶＤの交換速度マップ。低いｐＨのＩＶＤは高い交換速度を有する傾向がある。
【図4】本発明の種々の実施形態に従って、動物試験におけるｐＨ値を変化させた（５．０、５．８及び６．７）代表的なＩＶＤのΩプロット解析（Ａ）及びｐＨの関数としての化学交換速度（Ｂ）を示す図である。
【図5】本発明の種々の実施形態に従って、本発明の方法を実行することができるＭＲＩ装置及びコンピュータ機器を含むシステムを示す図である。
【図6】本発明の種々の実施形態に従って、ＩＶＤ変性の時系列を示す図である。ミニブタは４つのＩＶＤレベルにて線維輪の損傷を受け、変性を誘導した。変性に続いて、動物を無作為に３群に分け、２、６及び１０週に走査した。各時点で、群の１匹を屠殺し、損傷したＩＶＤ内のｐＨを測定した。遺伝子解析及び組織学のためにＩＶＤを採取した。
【図7A】本発明の種々の実施形態に従って、椎間板内穿刺に続くＩＶＤの変性を示す図である。（Ａ）Ｔ２加重矢状方向ＭＲＩによってモニターされるような穿刺に続く２、６、１０週でのＩＶＤ変性の進行。白矢印は、変性したＩＶＤを示す。穿刺に続く２、６、１０週での健常対照と比べた変性したＩＶＤのＴ２（Ｂ）、Ｔ１（Ｃ）及びＴ１ρ（Ｄ）のマッピングの定量（実験群当たりｎ＝１２、＊ｐ＜０．０５、****ｐ＜０．０００１）。（Ｅ）低倍率（上の図、縮尺棒：１ｍｍ）及び高倍率（下の図、縮尺棒：１００μｍ）での変性の誘導後２、６、１０週での変性を受けた代表的なＩＶＤのヘマトキシリンとエオシンの染色。
【図8A】本発明の種々の実施形態に従って、ＩＶＤ変性に続くｐＨ及びｑＣＥＳＴの変化を示す図である。（Ａ）溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）によって表されるｑＣＥＳＴのシグナルと動物の屠殺に続いてＩＶＤ内で測定されたｐＨとの間の相関。（Ｂ）変性しているＩＶＤの検出のためのｑＣＥＳＴシグナルについてのＲＯＣ曲線解析。変性の２、６、１０週後での変性しているＩＶＤ内でのｐＨ（Ｃ）及びｑＣＥＳＴ（Ｄ）の測定（実験群当たりｎ＝１２、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＝０．０００１、ｑＣＥＳＴ＝定量的化学交換飽和移動）。
【図9A】本発明の種々の実施形態に従って、変性しているＩＶＤにおける疼痛及び炎症のマーカーの上方調節を示す図である。変性の誘導の２、６及び１０週後での変性したＩＶＤの線維輪及び髄核から採取した疼痛に関連する遺伝子（ＣＧＲＰ、ＢＤＫＲＢ１及びＣＯＭＴ）（Ａ～Ｃ）、ＩＬ－６（Ｄ）及びＢＤＮＦ（Ｅ）の定量的ＲＴ－ＰＣＲ解析。（群当たりｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ＣＧＲＰ＝カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＢＤＫＲＢ１＝ブラジキニン受容体Ｂ１、ＣＯＭＴ＝カテコール－０－メチルトランスフェラーゼ、ＢＤＮＦ＝脳由来の神経栄養因子）。
【図10-1】本発明の種々の実施形態に従って、ＩＶＤの変性及びマーカーの上方調節の免疫蛍光解析を示す図である。変性の２、６及び１０週後での髄核の連続切片のＣＯＭＴ、ＩＬ－６、ＢＤＮＦ、ＣＧＲＰ、ＢＤＫＲＢ１に対する免疫染色及びＤＡＰＩによる対比染色。異なる染色をマージしたパネルを右の欄に提示する（ＮＰ＝髄核、ＣＧＲＰ＝カルシトニン遺伝子関連ペプチド、ＢＤＫＲＢ１＝ブラジキニン受容体Ｂ１、ＣＯＭＴ＝カテコール－０－メチルトランスフェラーゼ、ＢＤＮＦ＝脳由来の神経栄養因子）。
【図11】本発明の種々の実施形態に従って、変性しているＩＶＤにおけるｑＣＥＳＴとバイオマーカーとの間の線形相関を示す図である。ｑＣＥＳＴのシグナルと、変性したＩＶＤ及び健常のＩＶＤから抽出したＣＧＲＰ（Ａ）、ＢＤＫＲＢ１（Ｂ）、ＣＯＭＴ（Ｃ）、ＩＬ－６（Ｄ）及びＢＤＮＦ（Ｅ）の対応する発現との間の相関曲線。
【発明を実施するための形態】
【0014】
発明の詳細な説明
本明細書で引用されている参考文献はあたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって組み入れられる。定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＲＩ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ４ｔｈ ｅｄ．，ならびにＧｕｙｔｏｎ及びＨａｌｌ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２ｔｈ ｅｄ．，は当業者に本出願で使用されている用語の多くに対する一般的な手引きを提供する。
本明細書で引用されている参考文献はあたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって組み入れられる。定義されない限り、本明細書で使用されている専門用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＲＩ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ４ｔｈ ｅｄ．，ならびにＧｕｙｔｏｎ及びＨａｌｌ，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２ｔｈ ｅｄ．，は当業者に本出願で使用されている用語の多くに対する一般的な手引きを提供する。
【0015】
当業者は、本発明の実践で使用されてもよい、本明細書に記載されているものに類似するまたはそれと同等である多数の方法及び物質を認識するであろう。本発明の他の特徴及び利点は、例として本発明の実施形態の種々の特徴を説明している添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明らかになるであろう。実際、本発明は、記載されている方法及び物質に決して限定されない。便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で採用された特定の用語がここに収集されている。
【0016】
記述されない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語及び語句は以下で提供される意味を含む。明白に記述されない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語及び語句は、その用語及び語句が関係する技術分野で獲得している意味を排除しない。定義は、特定の実施形態を記載するのに役立つように提供されるのであって、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるので、請求される本発明を限定するように意図されるものではない。
【0017】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、実施形態に有用である組成物、方法、システム、製造物品及びその各成分（複数可）を参照して使用され、有用であろうとなかろうと特定されていない要素の包含を受け入れる。一般に本明細書で使用されている用語は一般に「非限定」用語として意図されることが当業者によって理解されるであろう（たとえば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むが、それに限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むが、それに限定されない」として解釈されるべきである）。
【0018】
記述されない限り、本出願の特定の実施形態を記載する文脈（特に特許請求の範囲における文脈）で使用される用語「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」及び類似の参照は、単数及び複数の双方を扱うように解釈することができる。本明細書での値の範囲の引用は、範囲内に入る各別個の値を個々に参照する簡潔な方法として役立つように単に意図される。本明細書で示されない限り、各個々の値は、それが個々に本明細書で引用されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書で示されない限り、または文脈によって明瞭に反対に示されない限り、本明細書に記載されている方法はすべて好適な順序で実施することができる。本明細書での特定の実施形態に関連して提供される任意の及びすべての例または例示となる言語（たとえば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）は本出願をよりよく説明するように単に意図されるのであって、さもなければ請求される本出願の範囲での限定を提起するものではない。略記「たとえば（ｅ．ｇ．）」はラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定例を示すのに本明細書で使用される。従って略記「たとえば（ｅ．ｇ．）」は用語「たとえば」と同義である。本明細書における言語は、本出願の実践に必須である請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0019】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」または「改善」は疾患、障害、状態、病状または医学的状態を参照して使用される場合、治療上の処置及び予防的なまたは予防上の対策を指し、目的は、症状または状態の進行または重症度を元に戻す、緩和する、改善する、抑制する、減らす、減速するまたは停止させることである。用語「治療すること」には、状態の少なくとも１つの有害効果または症状を軽減するまたは緩和することを含む。治療は一般に、１以上の症状または臨床マーカーが低減する場合、「有効」である。或いは、治療は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の進行が減るまたは停止する場合、「有効」である。すなわち、「治療」は、単に症状またはマーカーの改善だけでなく、治療の非存在下で予想される症状の進行または悪化の停止または少なくとも減速も含む。また、「治療」は、有益な成績を続けるもしくは得ること、または治療が最終的に不首尾であるとしても状態を進展させる個体の機会を減らすことを意味してもよい。治療を必要とする者には、状態をすでに伴う者と同様に状態を有する傾向がある者または状態が防がれるべきである者が挙げられる。治療または治療上の処置の非限定例には、薬物療法、生物学的療法、細胞療法及び遺伝子治療及び／または介入性の外科治療が挙げられる。治療または治療上の処置の非限定例は薬物治療である。治療または治療上の処置の非限定例は生物学的治療である。治療または治療上の処置の非限定例は細胞治療である。治療または治療上の処置の非限定例は遺伝子治療である。治療または治療上の処置の非限定例は介入性の外科治療である。治療または治療上の処置には１以上の治療または治療の併用が含まれてもよい。
【0020】
「有益な成績」または「所望の成績」には、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の重症度を減らすことまたは緩和すること、疾患、障害、状態、病状または医学的状態が悪化するのを防ぐこと、疾患、障害、状態、病状または医学的状態を治癒させること、疾患、障害、状態、病状または医学的状態が発症するのを防ぐこと、疾患、障害、状態、病状または医学的状態を発症する患者の機会を減らすこと、罹患率及び死亡率を減らすこと、ならびに患者の生命または平均余命を延ばすことが挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。非限定例として、「有益な成績」または「所望の成績」は、１以上の症状（複数可）の緩和、欠損の程度の縮小、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の安定した（すなわち、悪化しない）容態、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の遅延または減速、及び疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する症状の改善または緩和であってもよい。
【0021】
本明細書で使用されるとき、用語「投与すること」は、所望の部位での作用物質または治療の少なくとも部分的な局在を生じる方法または経路によって対象に本明細書で開示されているような作用物質または治療を配置することを指す。「投与の経路」は、エアロゾル、鼻、吸入を介した、経口、肛門、肛門内、肛門周囲、経粘膜、経皮、非経口、腸内、局所、または局部を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の投与経路を指してもよい。「非経口」は、頭蓋内、脳室内、髄腔内、硬膜外、硬膜内、眼窩内、点滴、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、髄腔内、子宮内、血管内、静脈内、動脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜または経気管を含む注射に一般に関連する投与の経路を指す。
【0022】
「診断」は、病態の存在または性質を特定することを意味し、疾患、障害、状態、病状または医学的状態を発症するリスクがある患者を特定することを含む。診断方法はその感度及び特異度で異なる。診断アッセイの「感度」は陽性を検査する罹患個体の比率（「真陽性」のパーセント）である。アッセイによって検出されない罹患個体は「偽陰性」である。罹患していない且つアッセイで陰性を検査する対象は「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は１マイナス偽陽性比率であり、「偽陽性」比率は陽性を検査する疾患のない者の比率として定義される。特定の診断方法が状態の明確な診断を提供しなくてもよい一方で、方法が診断に役立つ陽性の指示を提供すれば、それは十分である。
【0023】
「のリスクがある」によって、正常対象に比べてまたは正常群に比べて、たとえば、患者集団の高いリスクを意味するように意図される。従って、特定のマーカーを持つ対象は、特定の疾患、障害、状態、病状または医学的状態について高いリスクを有してもよく、さらなる検査を必要とすると特定されてもよい。「高いリスク」または「上昇したリスク」は、たとえば、対象が疾患、障害、状態、病状または医学的状態を有する可能性での統計的に有意な上昇を意味する。リスクは好ましくは、比較が行われる対照群に対して少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも２０％、一層さらに好ましくは少なくとも５０％上昇する。
【0024】
用語「統計的に有意な」または「有意に」は、差異があるという統計的な証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真実であるとき帰無仮説を拒絶する決定を行う確率として定義される。決定はｐ値を用いて行われることが多い。
【0025】
用語「検出」、「検出すること」等は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態を検出する文脈で使用されてもよい（たとえば、陽性のアッセイ結果が得られる場合）。後者の文脈では、「検出すること」及び「診断すること」は同義と見なされる。
【0026】
用語「診断」または「ｄｘ」は特定の現象の性質及び原因の特定を指す。本明細書で使用されるとき、診断は通常、どの疾患、障害、状態、病状または医学的状態が症状及び兆候を説明するかを判定する過程である医学診断を指す。診断手順、多くは診断の検査またはアッセイを用いて診断を提供することができる。診断は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の存在を検出すること、または疾患、障害、状態、病状または医学的状態になるリスクを検出することを含むことができる。
【0027】
用語「予後診断」または「ｐｘ」は本明細書で使用されるとき、現在の立場のありそうな転帰を予測することを指す。たとえば、予後診断には、疾患、障害、状態、病状または医学的状態の予想される持続時間及び経過、たとえば、進行性の低下及び予想される回復を挙げることができる。
【0028】
用語「セラノーシス」または「ｔｘ」は本明細書で使用されるとき、医療の文脈で使用される診断及び予後診断を指す。たとえば、セラノーシスは、遺伝的内容または他の分子解析または細胞解析の背景に基づいて適当な且つ最適な治療法（または逆）を選択するために使用される診断検査を含むことができる。セラノーシスは薬理ゲノミクス、オーダーメイド医療及びプレシジョン医療を含む。
【0029】
本明細書で使用されるとき、「対象」はヒトまたは動物を意味する。たとえば、動物は、たとえば、霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物のような脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、たとえば、アカゲザルが挙げられる。齧歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ及びハムスターが挙げられる。家畜及び狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ科種、たとえば、イエネコ、及びイヌ科種、たとえば、イヌ、キツネ、オオカミが挙げられる。用語「患者」、「個体」及び「対象」は本明細書では相互交換可能に使用される。一実施形態では、対象は哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであることができるが、これらの例に限定されない。加えて、本明細書に記載されている方法は飼い慣らされた動物及び／またはペットを治療するのに使用することができる。一実施形態では、対象はヒトである。
【0030】
「哺乳類」は本明細書で使用されるとき、限定しないで、ヒト及び非ヒト霊長類、たとえば、チンパンジー及び他の類人猿及びサル種、たとえば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマのような家畜、たとえば、イヌ及びネコのような飼い慣らされた動物、たとえば、マウス、ラット及びモルモットのような齧歯類を含む実験動物、等を含む哺乳動物綱の任意のメンバーを指す。その用語は特定の年齢または性別を意味しない。従って、成熟対象及び新生児対象はオスであれ、メスであれ、この用語の範囲内に含まれるように意図される。示されない限り、本明細書に記載されている対象は哺乳類を含むことができる。
【0031】
対象は、治療を必要とする疾患、障害、状態、病状または医学的状態または疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する１以上の合併症であると以前診断されている、またはそれを患っているもしくは有すると特定されている者、及び任意で、疾患、障害、状態、病状または医学的状態または疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する１以上の合併症についての治療をすでに受けている者であることができる。或いは、対象は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態または疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する１以上の合併症を有すると以前診断されていない者であることができる。たとえば、対象は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態または疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する１以上の合併症について１以上のリスク因子を示す者、またはリスク因子を示さない対象であることができる。たとえば、対象は、疾患、障害、状態、病状または医学的状態または疾患、障害、状態、病状または医学的状態に関連する１以上の合併症について１以上の症状を示す者、または症状を示さない対象であることができる。特定の疾患、障害、状態、病状または医学的状態について診断または治療を「必要とする対象」は、その疾患、障害、状態、病状または医学的状態を有すると疑われる対象、その疾患、障害、状態、病状または医学的状態を有すると診断された対象、その疾患、障害、状態、病状または医学的状態についてすでに治療されたまたは治療されている対象、その疾患、障害、状態、病状または医学的状態について治療されていない対象、またはその疾患、障害、状態、病状または医学的状態を発症するリスクがある対象であることができる。
【0032】
「試料」は本明細書では最も広い意味で使用される。用語「生体試料」は本明細書で使用されるとき、生物から採取されたまたは単離された試料を意味する。試料または生体試料は、血液、血清、血漿、涙液、水性及び粘性の体液、脊髄液を含む体液；細胞または組織の調製物の可溶性画分、または細胞が増殖する培地；または細胞または組織から単離されたまたは抽出された膜；溶液におけるまたは基質に結合したポリペプチドまたはペプチド；細胞、組織、組織プリント、フィンガープリント、皮膚または毛髪；それらの断片及び誘導体を含んでもよい。試料または生体試料の非限定例には、口腔粘膜検体、粘液、全血、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、リンパ、糞便抽出物、痰、他の体液または生物流体、細胞試料、及び組織試料、等が挙げられる。その用語はまた上述の試料または生体試料の混合物も含む。用語「試料」は未治療のまたは治療前の（または処理前の）生体試料も含む。一部の実施形態では、試料または生体試料は対象に由来する１以上の細胞を含むことができる。一部の実施形態では、試料または生体試料は対象に由来する１以上の組織試料を含むことができる。
【0033】
「任意の」または「任意で」は、その後に続く記載されている状況が生じてもよくまたは生じなくてもよいので、記載は状況が生じる場合の例及びそれが生じない場合の例を含むことを意味する。
【0034】
「上方調節」は遺伝子発現の上昇を意味する。
【0035】
「下方調節」は遺伝子発現の低下を意味する。
【0036】
本発明の方法
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程、及び画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含み、（ａ）生理的なバイオマーカーは、溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、領域は定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程、及び画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含み、（ａ）生理的なバイオマーカーは、溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、領域は定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。
【0037】
種々の実施形態では、本発明は、対象において状態を診断する方法を提供し、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；及び画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程を含む。
【0038】
種々の実施形態では、本発明は、対象において状態を診断する方法を提供し、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、対象がその状態を有すると判定する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、治療は、薬物療法、生物学的療法、細胞療法及び遺伝子治療及び／または介入性の外科治療から選択される。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は低いｐＨ値と相関する。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は２００交換／秒を超える。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は２０１～１０００交換／秒である。一部の実施形態では、低いｐＨ値は５．６～６．９９である。一部の実施形態では、参照値は参照の不安定プロトン交換速度であり、参照の不安定プロトン交換速度は１００～２００交換／秒である。一部の実施形態では、参照の不安定プロトン交換速度は参照のｐＨ値と相関する。一部の実施形態では、参照のｐＨ値は７．０～７．２である。一部の実施形態では、状態は、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される。一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は関節または椎間板を含む。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は、対象における１以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、１以上の疼痛関連因子は、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）から選択される。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は、対象における１以上の炎症関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、炎症関連因子はインターロイキン－６（ＩＬ－６）である。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は対象における１以上の神経原性因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、神経原性因子は脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ）である。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは、二次元（２Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは三次元（３Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは７．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、対象の状態の起源が、生理的なバイオマーカーが測定された対象の身体の画像化された領域内にあると判定する工程をさらに含む。一部の実施形態では、低いｐＨ値は状態を有する対象を示す。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0039】
種々の実施形態では、本発明は、状態を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、対象は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、対象がその状態を有すると判定する工程；対象のために治療を選択する工程；及び対象をその治療で治療する工程を含む方法によって、その状態を有すると診断された。
【0040】
種々の実施形態では、本発明は、状態を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、対象は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；対象のために治療を選択する工程；及び対象をその治療で治療する工程とを含む方法によって、その状態を有すると診断された。
【0041】
種々の実施形態では、本発明は、対象が治療されてもよいように診断結果を要求する工程；対象のために治療を選択する工程：及び診断結果に基づいて対象を治療する工程を含む、状態を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、対象は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、対象がその状態を有すると判定する工程を含む方法によって、その状態を有すると診断された。
【0042】
種々の実施形態では、本発明は、対象が治療されてもよいように診断結果を要求する工程；対象のために治療を選択する工程；及び診断結果に基づいて対象を治療する工程を含む、状態を有すると診断された対象を治療する方法を提供し、対象は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；及び画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程を含む方法によって、その状態を有すると診断された。
【0043】
対象において状態を予後診断する方法であって、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び１以上の生理的なバイオマーカーの測定値を同じ１以上の生理的なバイオマーカーの以前の測定値と比較する工程であって、不安定プロトン交換速度の経時的な上昇が状態の予後不良である、工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態の予後診断に基づいて対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態の予後診断に基づいて１以上の治療で対象を治療する工程を含む。一部の実施形態では、低いｐＨ値は状態の予後不良を示す。
【0044】
対象において組織変性及び／または疼痛に関連する状態を予後診断する方法であって、該方法は、対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスで画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び画像化された領域内で測定された１以上の生理的なバイオマーカーの測定値を画像化された領域内で測定された同じ１以上の生理的なバイオマーカーの以前の測定値と比較することによって状態を予後診断する工程を含む。
【0045】
対象において組織変性及び／または疼痛に関連する状態を予後診断する方法であって、該方法は、対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスで画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び画像化された領域内で測定された１以上の生理的なバイオマーカーの測定値を画像化された領域内で測定された同じ１以上の生理的なバイオマーカーの以前の測定値と比較することによって状態を予後診断する工程を含む。
【0046】
種々の実施形態では、本発明は、対象において状態を検出する方法を提供し、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、対象が状態を有すると判定する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、治療は、薬物療法、生物学的療法、細胞療法及び遺伝子治療及び／または介入性の外科治療から選択される。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0047】
種々の実施形態では、本発明は、対象において状態を検出する方法を提供し、該方法は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；及び画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、治療は、薬物療法、生物学的療法、細胞療法及び遺伝子治療及び／または介入性の外科治療から選択される。一部の実施形態では、方法はさらに、状態が判定される場合、１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0048】
一部の実施形態では、１以上の磁気共鳴画像がある期間にわたって得られる。一部の実施形態では、１以上の磁気共鳴画像が様々な時間に得られる。一部の実施形態では、１以上の磁気共鳴画像が同時に得られる。一部の実施形態では、１以上の磁気共鳴画像は２以上の磁気共鳴画像である。一部の実施形態では、ある期間は、ミリ秒、秒、分、時間、日数、月数または年数またはそれらの組み合わせで測定される。
【0049】
一部の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び対象に由来する不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、参照値と比較した対象に由来する不安定プロトン交換速度の上昇が状態を発症する対象のリスクの上昇を示す工程を含む、対象において状態を発症するリスクを判定する方法を提供する。一部の実施形態では、低いｐＨ値は状態を発症する対象のリスクの上昇を示す。一部の実施形態では、方法はさらに、状態を発症する対象の高いリスクに基づいて対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態を発症する対象の高いリスクに基づいて１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0050】
一部の実施形態では、方法はさらに、対象に由来する不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、参照値と比較した対象に由来する不安定プロトン交換速度の上昇が対象の評価であり、その評価が状態を発症する予後診断である、工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、対象に由来する不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、参照値と比較した対象に由来する不安定プロトン交換速度の上昇が対象の評価であり、その評価が状態の診断である、工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、対象に由来する不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、参照値と比較した対象に由来する不安定プロトン交換速度の上昇が対象の評価であり、状態を示す、工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、評価に基づいて対象を治療する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、評価に基づいて対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、評価に基づいて１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0051】
一部の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び対象に由来する不安定プロトン交換速度を参照値と比較する工程であって、参照値と比較した対象に由来する不安定プロトン交換速度の上昇が状態を発症する対象のリスクの上昇を示す、工程を含む、対象において状態を発症するリスクを判定する方法を提供する。一部の実施形態では、低いｐＨ値は状態を発症する対象のリスクの上昇を示す。一部の実施形態では、方法はさらに、状態を発症する対象の高いリスクに基づいて対象のための１以上の治療を選択する工程を含む。一部の実施形態では、方法はさらに、状態を発症する対象の高いリスクに基づいて１以上の治療で対象を治療する工程を含む。
【0052】
一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、疼痛関連因子（疼痛関連マーカー）は、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）から選択される。一部の実施形態では、疼痛関連因子はブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）である。一部の実施形態では、疼痛関連因子はカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）である。一部の実施形態では、疼痛関連因子はカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）である。一部の実施形態では、方法はさらに、状態に関連する対象の疼痛の起源が、１以上の疼痛関連因子（疼痛関連マーカー）の発現が検出される対象の身体の領域内にあると判定する工程を含む。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。
【0053】
一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の炎症関連因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、炎症因子（炎症関連マーカーまたは炎症関連因子）はインターロイキン－６（ＩＬ－６）から選択される。一部の実施形態では、方法はさらに、状態に関連する対象の疼痛の起源が、１以上の炎症因子（炎症関連マーカー）の発現が検出される対象の身体の領域内にあると判定する工程を含む。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。
【0054】
一部の実施形態では、不安定プロトン交換速度の上昇は対象における１以上の神経原性因子の上方調節と相関する。一部の実施形態では、神経原性因子（神経原性マーカー）は脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ）から選択される。一部の実施形態では、方法はさらに、状態に関連する対象の疼痛の起源が、１以上の神経原性因子（神経原性マーカー）の発現が検出される対象の身体の領域内にあると判定する工程を含む。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。
【0055】
一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）または溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む。一部の実施形態では、生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む。
【0056】
特定の実施形態では、異常な生理的な状況には、状態を有さない正常な対象と比べて低いｐＨ及び／または低いＧＡＧ濃度が挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。特定の実施形態では、異常な生理的な状況は、状態を有さない正常な対象と比べて低いＧＡＧ濃度である。特定の実施形態では、異常な生理的な状況は低いＧＡＧ濃度である。一部の実施形態では、異常な生理的な状況には、状態を有さない正常な対象と比べて低いｐＨである。一部の実施形態では、ＧＡＧ濃度は健常な変性のない椎間板に関係がある。一部の実施形態では、低いｐＨ濃度は健常な変性のない椎間板に関係がある。一部の実施形態では、ＧＡＧ濃度は対象における健常な変性のない椎間板に関係がある。一部の実施形態では、低いｐＨ濃度は対象における健常な変性のない椎間板に関係がある。一部の実施形態では、正常な対象は対象が状態を有さない対象である。一部の実施形態では、正常な対象は対象が状態について治療される前の対象である。一部の実施形態では、正常な対象は状態について治療された対象である。一部の実施形態では、正常な対象は早い時点（早い時点）での対象である。
【0057】
特定の実施形態では、異常な生理的状況は状態を有さない正常な対象と比べて低いｐＨである。特定の実施形態では、異常な生理的状況は低いｐＨである。一部の実施形態では、異常な生理的状況は、ｐＨ参照試料から得られるｐＨ値（参照ｐＨ値）と比べて低いｐＨである。一部の実施形態では、低いｐＨ（低いｐＨ値）は５．６～６．９９である。一部の実施形態では、低いｐＨ（低いｐＨ値）は、５．６～５．７、５．６～５．８、５．６～５．９、５．６～６．０、５．６～６．１、５．６～６．２、５．６～６．３、５．６～６．４、５．６～６．５、５．６～６．６、５．６～６．７、５．６～６．８、５．６～６．９、または５．６～６．９９である。
【0058】
一部の実施形態では、低いｐＨ（低いｐＨ値）は、５．６０～６．９９、５．６０～６．９０、５．６０～６．８０、５．６０～６．７０、５．６０～６．６０、５．６０～６．５０、５．６０～６．４０、５．６０～６．３０、５．６０～６．２０、５．６０～６．１０、５、６０～６．００、５．６０～５．９０、５．６０～５．８０、５．６０～５．７０、５．７０～６．９９、５．７０～６．９０、５．７０～６．８０、５．７０～６．７０、５．７０～６．６０、５．７０～６．５０、５．７０～６．４０、５．７０～６．３０、５．７０～６．２０、５．７０～６．１０、５．７０～６．００、５．７０～５．９０、５．７０～５．８０、５．８０～６．９９、５．８０～６．９０、５．８０～６．８０、５．８０～６．７０、５．８０～６．６０、５．８０～６．５０、５．８０～６．４０、５．８０～６．３０、５．８０～６．２０、５．８０～６．１０、５．８０～６．００、５．８０～５．９０、５．９０～６．９９、５．９０～６．９０、５．９０～６．８０、５．９０～６．７０、５．９０～６．６０、５．９０～６．５０、５．９０～６．４０、５．９０～６．３０、５．９０～６．２０、５．９０～６．１０、５．９０～６．００、６．００～６．９９、６．００～６．９０、６．００～６．８０、６．００～６．７０、６．００～６．６０、６．００～６．５０、６．００～６．４０、６．００～６．３０、６．００～６．２０、６．００～６．１０、６．１０～６．９９、６．１０～６．９０、６．１０～６．８０、６．１０～６．７０、６．１０～６．６０、６．１０～６．５０、６．１０～６．４０、６．１０～６．３０、６．０～６．２０、６．２０～６．９９、６．２０～６．９０、６．２０～６．８０、６．２０～６．７０、６．２０～６．６０、６．２０～６．５０、６．２０～６．４０、６．２０～６．３０、６．３０～６．９９、６．３０～６．９０、６．３０～６．８０、６．３０～６．７０、６．３０～６．６０、６．３０～６．５０、６．３０～６．４０、６．４０～６．９９、６．４０～６．９０、６．４０～６．８０、６．４０～６．７０、６．４０～６．６０、６．４０～６．５０、６．５０～６．９９、６．５０～６．９０、６．５０～６．８０、６．５０～６．７０、６．５０～６．６０、６．６０～６．９９、６．６０～６．９０、６．６０～６．８０、６．６０～６．７０、６．７０～６．９９、６．７０～６．９０、６．７０～６．８０、６．８０～６．９９、６．８０～６．９０、または６．９０～６．９９である。
【0059】
特定の実施形態では、参照ｐＨ値は７．０～７．２である。一部の実施形態では、参照ｐＨ値は７．００～７．２０、７．００～７．１５、７．００～７．１０、７．００～７．０５、７．０５～７．２０、７．０５～７．１５、７．０５～７．１０、７．１０～７．２０、７．１０～７．１５、または７．１５～７．２０である。
【0060】
一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は２００交換／秒より大きい。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は２０１～１０００交換／秒である。一部の実施形態では、上昇した不安定プロトン交換速度は２０１～１０００、２０１～９５０、２０１～９００、２０１～８５０、２０１～８００、２０１～７５０、２０１～７００、２０１～６５０、２０１～６００、２０１～５５０、２０１～５００、２０１～４５０、２０１～４００、２０１～３５０、２０１～３００、２０１～２５０、２５０～１０００、２５０～９５０、２５０～９００、２５０～８５０、２５０～８００、２５０～７５０、２５０～７００、２５０～６５０、２５０～６００、２５０～５５０、２５０～５００、２５０～４５０、２５０～４００、２５０～３５０、２５０～３００、３００～１０００、３００～９５０、３００～９００、３００～８５０、３００～８００、３００～７５０、３００～７００、３００～６５０、３００～６００、３００～５５０、３００～５００、３００～４５０、３００～４００、３００～３５０、３５０～１０００、３５０～９５０、３５０～９００、３５０～８５０、３５０～８００、３５０～７５０、３５０～７００、３５０～６５０、３５０～６００、３５０～５５０、３５０～５００、３５０～４５０、３５０～４００、４００～１０００、４００～９５０、４００～９００、４００～８５０、４００～８００、４００～７５０、４００～７００、４００～６５０、４００～６００、４００～５５０、４００～５００、４００～４５０、４５０～１０００、４５０～９５０、４５０～９００、４５０～８５０、４５０～８００、４５０～７５０、４５０～７００、４５０～６５０、４５０～６００、４５０～５５０、４５０～５００、５００～１０００、５００～９５０、５００～９００、５００～８５０、５００～８００、５００～７５０、５００～７００、５００～６５０、５００～６００、５００～５５０、５５０～１０００、５５０～９５０、５５０～９００、５５０～８５０、５５０～８００、５５０～７５０、５５０～７００、５５０～６５０、５５０～６００、６００～１０００、６００～９５０、６００～９００、６００～８５０、６００～８００、６００～７５０、６００～７００、６００～６５０、６５０～１０００、６５０～９５０、６５０～９００、６５０～８５０、６５０～８００、６５０～７５０、６５０～７００、７００～１０００、７００～９５０、７００～９００、７００～８５０、７００～８００、７００～７５０、７５０～１０００、７５０～９５０、７５０～９００、７５０～８５０、７５０～８００、８００～１０００、８００～９５０、８００～９００、８００～８５０、８５０～１０００、８５０～９５０、８５０～９００、９００～１０００、９００～９５０、または９５０～１０００交換／秒である。
【0061】
一部の実施形態では、参照値は参照の不安定プロトン交換速度であり、参照の不安定プロトン交換速度は１００～２００交換／秒である。一部の実施形態では、参照の不安定プロトン交換速度は、１００～２００、１００～１９０、１００～１８０、１００～１７０、１００～１６０、１００～１５０、１００～１４０、１００～１３０、１００～１２０、１００～１１０、１１０～２００、１１０～１９０、１１０～１８０、１１０～１７０、１１０～１６０、１１０～１５０、１１０～１４０、１１０～１３０、１１０～１２０、１２０～２００、１２０～１９０、１２０～１８０、１２０～１７０、１２０～１６０、１２０～１５０、１２０～１４０、１２０～１３０、１３０～２００、１３０～１９０、１３０～１８０、１３０～１７０、１３０～１６０、１３０～１５０、１３０～１４０、１４０～２００、１４０～１９０、１４０～１８０、１４０～１７０、１４０～１６０、１４０～１５０、１５０～２００、１５０～１９０、１５０～１８０、１５０～１７０、１５０～１６０、１６０～２００、１６０～１９０、１６０～１８０、１６０～１７０、１７０～２００、１７０～１９０、１７０～１８０、１８０～２００、１８０～１９０、または１９０～２００交換／秒である。
【0062】
一部の実施形態では、参照値は、状態を有さない正常な対象から得られる。一部の実施形態では、参照値は、状態を有さない対照の対象から得られる。一部の実施形態では、参照値は、状態を有さない対象から得られる。一部の実施形態では、参照値は、対象が状態について治療される前の対象から得られる。一部の実施形態では、参照値は、状態について治療された対象から得られる。一部の実施形態では、参照値は、早い時点（早い時点）で対象から得られる。
【0063】
一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は、対象の脊椎または脊柱または背骨またはその切片または成分を含む。一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は関節または椎間板を含む。一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は１以上の関節である。一部の実施形態では、対象の身体の画像化された領域は１以上の椎間板である。
【0064】
一部の実施形態では、状態には、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせが挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。一部の実施形態では、状態は、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、状態は椎間板起因の疼痛である。特定の実施形態では、状態は椎間板起因の腰痛である。特定の実施形態では、状態は椎間板変性である。一部の実施形態では、状態は病状である。一部の実施形態では、状態は医学的状態である。一部の実施形態では、状態は障害である。一部の実施形態では、状態は疾患である。一部の実施形態では、状態は椎間板変性である。一部の実施形態では、状態は変形性関節症である。一部の実施形態では、状態は関節リウマチである。一部の実施形態では、状態は関節軟骨傷害である。一部の実施形態では、状態は側頭下顎骨円板変性である。一部の実施形態では、状態は慢性腰痛である。一部の実施形態では、状態は腰痛である。一部の実施形態では、状態は背痛である。一部の実施形態では、状態は慢性背痛である。一部の実施形態では、状態は進行性椎間板変性である。一部の実施形態では、状態は痛みを伴う状態である。
【0065】
特定の実施形態では、方法はさらに、状態に関連する対象の疼痛の起源が、１以上の異常な生理的状況が検出される対象の身体の領域内にあると判定する工程を含む。
【0066】
一部の実施形態では、磁気共鳴イメージング法は化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、磁気共鳴イメージング法は定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、領域は化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。一部の実施形態では、領域は定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。一部の実施形態では、二次元（２Ｄ）縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。一部の実施形態では、領域は二次元（２Ｄ）縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される。一部の実施形態では、代替のＣＥＳＴシーケンスを用いて前述の生理的なバイオマーカーを測定してもよい。一部の実施形態では、代替のｑＣＥＳＴシーケンスを用いて前述の生理的なバイオマーカーを測定してもよい。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは二次元（２Ｄ）定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスは三次元（３Ｄ）定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。
【0067】
種々の実施形態では、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによる対象の身体の領域のイメージングは生体内で実施される。種々の実施形態では、対象からの磁気共鳴画像は生体内で得られる。
【0068】
ＣＥＳＴシーケンスの読み出しには、勾配エコー（ＧＲＥ）、エコープラナー画像化法（ＥＰＩ）、勾配及びスピンエコー（ＧＲＡＳＥ）、及び平衡定常状態自由歳差運動（ＳＳＦＰ）が挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。ｑＣＥＳＴシーケンスの読み出しには、勾配エコー（ＧＲＥ）、エコープラナー画像化法（ＥＰＩ）、勾配及びスピンエコー（ＧＲＡＳＥ）、及び平衡定常状態自由歳差運動（ＳＳＦＰ）が挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。特定の実施形態では、方法はさらに、イメージングから検出される生理的なバイオマーカーが画像化された領域内で１以上の異常な生理的状況を示す場合、疼痛及び／または組織変性を特徴とする状態を有すると対象を診断する工程を含む。
【0069】
一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは７．０Ｔスキャナーである。特定の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである。
【0070】
特定の実施形態では、イメージングは縮小視野（ｒＦＯＶ）励起を用いて実施される。他の実施形態では、ｒＦＯＶ励起は使用されない。一部の実施形態では、ＭＲＩ走査のためのスライス厚は、脂肪によるシグナルの妨害を回避するのに十分小さく選択される。特定の実施形態では、ＣＥＳＴ ＭＲＩイメージングのパラメータには、ＴＲ／ＴＥ＝１０５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショットが挙げられる。特定の実施形態では、ｑＣＥＳＴ ＭＲＩイメージングのパラメータには、ＴＲ／ＴＥ＝１０５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショットが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＥＳＴ ＭＲＩイメージングのパラメータには、ＴＲ／ＴＥ１／４ １０，５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショットが挙げられる。特定の実施形態では、ｑＣＥＳＴ ＭＲＩイメージングのパラメータには、ＴＲ／ＴＥ１／４ １０，５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショットが挙げられる。一部の実施形態では、ＴＲ／ＴＥ＝７０００～１６０００／７～１５ｍｓ。特定の実施形態では、各ＩＶＤについて、画像は、３ｍｍのスライス厚、１００×４０ｍｍ２の視野（ＦＯＶ）、及び０．８×０．８ｍｍ２の空間分解能で軸平面にて取得される。一部の実施形態では、スライス厚は２～４ｍｍであり、ＦＯＶは８０～１６０×４０～１６０ｍｍ２であり、空間分解能は０．６～１ｍｍ２である。特定の実施形態では、各ＩＶＤについて、画像は、３ｍｍのスライス厚、１４０×４０ｍｍ２の視野、及び１．１×１．１ｍｍ２の空間分解能で軸平面にて取得される。特定の実施形態では、イメージングで利用されるＣＥＳＴの飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（γｔｐ）＝０．７３μＴ、１．２２μＴ、１．７１μＴ及び２．４５μＴ；ガウス飽和パルスのパラメータｃ１＝０．５０、ｃ２＝０．５９）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状パルスから成る。特定の実施形態では、イメージングで利用されるｑＣＥＳＴの飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（γｔｐ）＝０．７３μＴ、１．２２μＴ、１．７１μＴ及び２．４５μＴ；ガウス飽和パルスのパラメータｃ１＝０．５０、ｃ２＝０．５９）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状パルスから成る。一部の実施形態では、ＣＥＳＴの飽和モジュールは６００°から３０００°に及ぶ飽和フリップ角にて総飽和Ｔｓ＝４０００～８０００ｍｓを有してもよい。一部の実施形態では、ｑＣＥＳＴの飽和モジュールは６００°から３０００°に及ぶ飽和フリップ角にて総飽和Ｔｓ＝４０００～８０００ｍｓを有してもよい。特定の実施形態では、Ｚスペクトルは±１．６、±１．３、±１．０、±０．７及び±０．４ｐｐｍを含むが、これらに限定されない様々な飽和頻度で取得される。一部の実施形態では、各ＩＶＤについてのＣＥＳＴ実験の走査時間は約４０分であった。一部の実施形態では、各ＩＶＤについてのｑＣＥＳＴ実験の走査時間は約４０分であった。
【0071】
本明細書で使用されるとき、生理的なバイオマーカーは、たとえば、ｐＨ値、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）または溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）を指す。用語、生理的なバイオマーカー及び代謝バイオマーカーは同一の意味を有し、本明細書では相互交換可能に使用される。
【0072】
システム及びコンピュータ
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）パルスシーケンスを対象における関心体積（ＶＯＩ）に適用する工程であって、ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）を含む、工程；対象における関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び取得した磁気共鳴データに基づいて画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、ＭＲＩ装置の１以上のプロセッサに実行させる；ための、コンピュータ可読の指示書を有する持続性のコンピュータ可読の媒体を開示し、（ａ）生理的なバイオマーカーは、たとえば、「実施例」のセクションでさらに詳細に本明細書に記載されているような、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元（２Ｄ）の縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）の化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスである。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元（２Ｄ）の縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは７．０Ｔスキャナーである。特定の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである。
種々の実施形態では、本発明は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）パルスシーケンスを対象における関心体積（ＶＯＩ）に適用する工程であって、ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）を含む、工程；対象における関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び取得した磁気共鳴データに基づいて画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、ＭＲＩ装置の１以上のプロセッサに実行させる；ための、コンピュータ可読の指示書を有する持続性のコンピュータ可読の媒体を開示し、（ａ）生理的なバイオマーカーは、たとえば、「実施例」のセクションでさらに詳細に本明細書に記載されているような、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元（２Ｄ）の縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）の化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスである。特定の実施形態では、パルスシーケンスは二次元（２Ｄ）の縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは７．０Ｔスキャナーである。特定の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである。一部の実施形態では、ＭＲＩスキャナーは１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである。
【0073】
種々の実施形態では、本発明は、磁場を提供するように操作可能な磁石と；磁場内の領域に伝達するように操作可能な送信器と；領域から磁気共鳴シグナルを受け取るように操作可能な受信器と；送信器と受信器を制御するように操作可能な１以上のプロセッサと；本明細書に記載されているパルスシーケンスを対象における関心体積（ＶＯＩ）に適用する工程であって、ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）またはその一部を含む、工程；対象における関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び取得した磁気共鳴データに基づいて、画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程とを含む方法を、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）システムの１以上のプロセッサに実行させるための、コンピュータ可読の指示書を有する持続性のコンピュータ可読の媒体とを含む、磁気共鳴イメージングシステムを開示し、（ａ）生理的なバイオマーカーは、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む。
【0074】
当業者は、本明細書に記載されている本発明の方法を実施するのに多数の異なる型のイメージングシステムが使用されてもよいことを容易に十分に理解する。単に例として、実施例に記載されているイメージングシステムが使用されてもよい。図５もやはり本発明の方法を達成するのに使用することができるシステム１００の図を示す。システム１００はハードウェア及びコンピュータ１０７を含む。ハードウェアは、磁石１０２と送信器１０３と受信器１０４と勾配１０５とを含み、そのすべてはプロセッサ１０１と連絡を取り合う。磁石１０２には永久磁石、超電導磁石または他の型の磁石を挙げることができる。送信器１０３は受信器１０４と共にＲＦシステムの一部である。送信器１０３は高周波の送信器、電力増幅器、及びアンテナ（またはコイル）を表すことができる。受信器１０４は図５に示されるように、受信器アンテナ（またはコイル）及び増幅器を表すことができる。示される例では、送信器１０３及び受信器１０４は別々の表されるが、一例では、送信器１０３及び受信器１０４は共通のコイルを共有することができる。ハードウェアは勾配１０５を含む。勾配１０５は局在化のための勾配を適用するのに使用される１以上のコイルを表すことができる。
【0075】
ハードウェアの種々の要素と連絡を取り合うプロセッサ１０１は、本明細書で開示されている方法のいずれかに相当する一揃いの指示書を実施するように構成される１以上のプロセッサを含む。プロセッサ１０１は、ＲＦ励起と勾配を提供し、関心体積から磁気共鳴データを受け取るための一揃いの指示書（ハードウェアまたはサブシステム１０８のメモリに保存されている）を実施するように構成することができる。サブシステム１０８はハードウェアと、ＭＲＩ装置におけるプロセッサ１０１によって通常取り扱われる画像の再構成に関連する処理の代用と併せて、または代用としてハードウェアによって生成されるデータの処理を促すことができるソフトウエアとを含むことができる。当業者は、プロセッサ１０１及び／またはサブシステム１０８を含む、本明細書に記載されているイメージングシステムの特定の成分が使用されてコンピュータ可読の媒体に組み込まれた指示書を実行して本明細書に記載されている本発明のデータの取得、画像の再構成、及び生理的なバイオマーカーの評価方法を実施することを容易に十分に理解する。
【0076】
一部の実施形態では、コンピュータ１０７はハードウェア及びサブシステム１０８に操作可能に繋がれる。コンピュータ１０７には、デスクトップ型コンピュータ、ワークステーション、またはラップトップ型コンピュータの１以上を挙げることができる。一例では、コンピュータ１０７は、ユーザーが操作可能であり、ディスプレイ、プリンター、ネットワークインターフェース、または他のハードウェアを含んで操作者がシステム１００の操作を制御するのを可能にする。
【0077】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている方法またはシステムのいずれかを使用して、取得した画像に基づいて背痛、１以上の変性椎間板、関節痛、１以上の変性関節、等を含むが、決してこれらに限定されない疾患、障害、状態、病状または医学的状態の存在または非存在で対象を診断する工程を含む。
【0078】
種々の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されている方法を実施するように構成されるシステムを開示し、該システムはコンピュータ機器に操作可能に接続された（物理的または電子的な連絡を介して）磁気共鳴イメージング装置（本明細書または本明細書で引用された参考文献に記載されている磁気共鳴イメージング装置のいずれかの型を含むが、決してこれらに限定されない）を含む。コンピュータ機器には、本明細書に記載されている方法を実施するのに十分な計算許容能力を持つデスクトップ型コンピュータ、ラップトップ型コンピュータ、またはコンパクトなコンピュータ機器が挙げられてもよいが、決してこれらに限定されない。一部の実施形態では、コンピュータ機器は本明細書に記述されている画像解析のための方法の１以上の工程を実施するように具体的に構成される。
【0079】
本発明によれば、「通信回線」は本開示で使用されるとき、少なくとも２つの点の間でデータまたは情報を伝達する有線の及び／またはワイヤレスの媒体を意味する。有線のまたはワイヤレスの媒体には限定しないで、たとえば、金属導体回線、高周波（ＲＦ）通信回線、赤外線（ＩＲ）通信回線、光学通信回線、等が挙げられてもよい。ＲＦ通信回線には、たとえば、ＷｉＦｉ、ＷｉＭＡＸ、ＩＥＥＥ ８０２．１１、ＤＥＣＴ、０Ｇ、１Ｇ、２Ｇ、３Ｇまたは４Ｇのセルラー規格、ブルートゥース等が挙げられてもよい。
【0080】
コンピュータ及びコンピュータ機器は通常、コンピュータ可読の保存媒体及び／または通信媒体を含むころができる種々の媒体を含み、これら２つの用語が以下のように互いに異なって本明細書では使用されている。
【0081】
コンピュータ可読の保存媒体は、コンピュータによってアクセスすることができ、通常持続性の性質であり、且つ揮発性及び非揮発性双方の媒体、脱着式及び非脱着式の媒体を含むことができる利用可能な保存媒体であることができる。例として且つ限定ではなく、コンピュータ可読の保存媒体は、たとえば、コンピュータ可読の指示書、プログラムモジュール、構造化データまたは非構造化データのような情報の保存のための方法または技術と関連して実施することができる。コンピュータ可読の保存媒体には、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリまたは他の記憶技術、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）または光学ディスク保存、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク保存または他の磁気保存装置、または所望の情報を保存するのに使用することができる有形的表示媒体及び／または持続性媒体を挙げることができるが、これらに限定されない。コンピュータ可読の保存媒体は、媒体によって保存されている情報に関する種々の操作のために、たとえば、アクセス要求、クエリまたは他のデータ検索プロトコールを介して１以上の近くのまたは遠隔のコンピュータ機器によってアクセスすることができる。
【0082】
他方、通信媒体は通常、たとえば、調節されたデータシグナル、たとえば、キャリア波または他の輸送メカニズムのように一時的であることができるデータシグナルにてコンピュータ可読の指示書、プログラムモジュールまたは他の構造化もしくは非構造化データを具体化し、任意の情報送達または輸送媒体を含む。用語「調節されたデータシグナル」またはシグナルは、１以上のシグナルにて情報をコード化するような方法で設定されたまたは変更された特徴の１以上を有するシグナルを指す。例として、且つ限定ではなく、通信媒体には、有線の媒体、たとえば、有線のネットワークまたは直接ワイヤでの接続、及び楽器のようなワイヤレス媒体、ＲＦ媒体、赤外線媒体及び他のワイヤレス媒体が挙げられる。
【0083】
コンピュータ可読の媒体のいずれか１つまたはその組み合わせにて保存して、本開示の例となる実施形態は、例となる実施形態のデバイス及びサブシステムを制御するために、例となる実施形態のデバイス及びサブシステムを動かすために、例となる実施形態のデバイス及びサブシステムがヒトユーザーと対話するのを可能にするために、及びその類のためにソフトウエアを含んでもよい。そのようなソフトウエアには、デバイスドライバー、ファームウエア、操作システム、開発ツール、アプリケーションソフトウエア、データベース管理ソフトウエア等を挙げることができるが、これらに限定されない。例となる実施形態のコンピュータコードデバイスは、スクリプト、説明できるプログラム、動的リンクライブラリ（ＤＬＬ）、Ｊａｖａクラス及びアプレット、完全な実行できるプログラム、等を含むが、これらに限定されない好適な説明できるまたは実行できるコードメカニズムを含むことができる。さらに、処理許容能力は、さらに良好な性能、信頼性、コストまたは他の利益のために複数のプロセッサにわたって分配されてもよい。
【0084】
本開示の態様を提供するために、実施形態は、ソフトウエアまたは保存された指示書を実行する任意の数のプログラム可能な処理デバイスを採用してもよい。処理または評価のために本開示の実施形態によって採用される物理的なプロセッサ及び／または機構には、例となる実施形態の開示に従ってプログラムされた１以上のネットワーク化された（インターネット、クラウド、ＷＡＮ、ＬＡＮ、サテライト、有線またはワイヤレス（ＲＦ、セルラー、ＷｉＦｉ、ブルートゥース、等））またはネットワーク化されていない一般目的のコンピュータシステム、マイクロプロセッサ、ファイルしたプログラム可能なゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、マイクロコントローラ、スマートデバイス（たとえば、スマートフォン）、コンピュータタブレット、小型コンピュータ、等が挙げられてもよい。加えて、例となる実施形態のデバイス及びサブシステムは、アプリケーション専用の集積回路（ＡＳＩＣ）によって、または従来の成分回路の適当なネットワークを相互接続することによって実施することができる。従って、例となる実施形態はハードウェア回路及び／またはソフトウエアの特定の組み合わせに限定されない。
【0085】
本発明の一部の実施形態は以下の番号を付けたパラグラフのいずれかとして定義することができる。
１．磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程；及び
前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含む方法であって、（ａ）前記生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記方法。
１．磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程；及び
前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含む方法であって、（ａ）前記生理的なバイオマーカーは溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記方法。
【0086】
２．前記領域が化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、パラグラフ１に記載の方法。
【0087】
３．前記領域が二次元（２Ｄ）縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、パラグラフ１に記載の方法。
【0088】
４．前記イメージングから検出される前記生理的なバイオマーカーが、前記画像化された領域内で１以上の異常な生理的状況を示し、前記生理的状況が、状態を有さない正常な対象と比べて低いｐＨ及び／または低いＧＡＧ濃度から成る群から選択される場合、疼痛及び／または組織変性を特徴とする前記状態を有すると前記対象を診断する工程をさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【0089】
５．前記対象の身体の前記画像化された領域が関節または椎間板を含む、パラグラフ１または２に記載の方法。
【0090】
６．前記状態が、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、パラグラフ２または３に記載の方法。
【0091】
７．さらに、前記状態に関連する前記対象の疼痛の起源が、前記異常な生理的状況が検出される前記対象の身体の前記領域内にあると判定する工程を含む、パラグラフ３または４に記載の方法。
【0092】
８．前記ＭＲＩスキャナーが３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0093】
９．前記ＭＲＩスキャナーが１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0094】
１０．前記ＭＲＩスキャナーが７．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0095】
１１．前記イメージングが縮小視野（ｒＦＯＶ）励起を用いて実施される、パラグラフ１に記載の方法。
【0096】
１２．前記ＭＲＩ走査のためのスライス厚が脂肪によるシグナル妨害を回避するのに十分小さく選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【0097】
１３．磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）装置の１以上のプロセッサに方法を実行させるための、コンピュータ可読の指示書を有する持続性のコンピュータ可読の媒体であって、
前記方法が、
対象における関心体積（ＶＯＩ）にＭＲＩパルスシーケンスを適用する工程であって、前記ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）またはその一部を含む、工程；
前記対象における前記関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び
取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含み、（ａ）前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記持続性のコンピュータ可読の媒体。
前記方法が、
対象における関心体積（ＶＯＩ）にＭＲＩパルスシーケンスを適用する工程であって、前記ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）またはその一部を含む、工程；
前記対象における前記関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び
取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程
を含み、（ａ）前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記持続性のコンピュータ可読の媒体。
【0098】
１４．前記パルスシーケンスが、二次元（２Ｄ）縮小視野（ｒＦＯＶ）高速スピンエコー（ＴＳＥ）化学交換飽和移動（ＣＥＳＴ）シーケンスである、パラグラフ１３に記載の持続性のコンピュータ可読の媒体。
【0099】
１５．前記ＭＲＩスキャナーが３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１３に記載の持続性のコンピュータ可読の媒体。
【0100】
１６．前記ＭＲＩスキャナーが１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１３に記載の持続性のコンピュータ可読の媒体。
【0101】
１７．磁気共鳴イメージングシステムであって、
磁場を提供するように操作可能な磁石と、
前記磁場内の領域に伝達するように操作可能な送信器と、
前記領域からの磁気共鳴シグナルを受け取るように操作可能な受信器と、
前記送信器及び前記受信器を制御するように操作可能な１以上のプロセッサと、
パルスシーケンスを対象における関心体積（ＶＯＩ）に適用する工程であって、前記ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）またはその一部を含む、工程；前記対象における前記関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、前記磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）システムの１以上のプロセッサに実行させるための、コンピュータ可読の指示書を有する持続的なコンピュータ可読の媒体と
を含み、（ａ）前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記磁気共鳴イメージングシステム。
磁場を提供するように操作可能な磁石と、
前記磁場内の領域に伝達するように操作可能な送信器と、
前記領域からの磁気共鳴シグナルを受け取るように操作可能な受信器と、
前記送信器及び前記受信器を制御するように操作可能な１以上のプロセッサと、
パルスシーケンスを対象における関心体積（ＶＯＩ）に適用する工程であって、前記ＶＯＩが関節または椎間板（ＩＶＤ）またはその一部を含む、工程；前記対象における前記関心体積（ＶＯＩ）から磁気共鳴データを取得する工程；及び取得した前記磁気共鳴データに基づいて、前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程を含む方法を、前記磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）システムの１以上のプロセッサに実行させるための、コンピュータ可読の指示書を有する持続的なコンピュータ可読の媒体と
を含み、（ａ）前記生理的なバイオマーカーが、溶質プールと水プールとの間での不安定プロトンの比（ｆｒ）及び／または溶質プールと水プールとの間での交換速度（ｋｓｗ）を含む、
前記磁気共鳴イメージングシステム。
【0102】
本発明の一部の実施形態は以下の番号を付けたパラグラフのいずれかとして定義することができる。
１．対象において状態を診断する方法であって、前記方法が、
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、前記領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；
前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、前記生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び
前記不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、前記対象が前記状態を有すると判定する工程
を含む、前記方法。
１．対象において状態を診断する方法であって、前記方法が、
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャナーによって対象の身体の領域を画像化する工程であって、前記領域が定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスを用いて画像化される、工程；
前記画像化された領域内で１以上の生理的なバイオマーカーを測定する工程であって、前記生理的なバイオマーカーが溶質プールと水プールとの間での不安定プロトン交換速度（ｋｓｗ）を含む、工程；及び
前記不安定プロトン交換速度が参照値に比べて上昇する場合、前記対象が前記状態を有すると判定する工程
を含む、前記方法。
【0103】
２．前記上昇した不安定プロトン交換速度が低いｐＨ値と相関する、パラグラフ１に記載の方法。
【0104】
３．前記上昇した不安定プロトン交換速度が２００交換／秒より大きい、パラグラフ１に記載の方法。
【0105】
４．前記上昇した不安定プロトン交換速度が２０１～１０００交換／秒である、パラグラフ１に記載の方法。
【0106】
５．前記低いｐＨ値が５．６～６．９９である、パラグラフ２に記載の方法。
【0107】
６．前記参照値が参照の不安定プロトン交換速度であり、前記参照の不安定プロトン交換速度が１００～２００交換／秒である、パラグラフ１に記載の方法。
【0108】
７．前記参照の不安定プロトン交換速度が参照のｐＨ値と相関する、パラグラフ６に記載の方法。
【0109】
８．前記参照のｐＨ値が７．０～７．２である、パラグラフ７に記載の方法。
【0110】
９．前記状態が、椎間板変性、椎間板起因の疼痛、椎間板起因の腰痛、慢性腰痛、腰痛、背痛、慢性背痛、進行性椎間板変性、変形性関節症、関節リウマチ、関節軟骨傷害、側頭下顎骨円板変性及びそれらの組み合わせから選択される、パラグラフ１に記載の方法。
【0111】
１０．前記対象の身体の前記画像化された領域が関節または椎間板を含む、パラグラフ１に記載の方法。
【0112】
１１．前記状態が痛みを伴う状態である、パラグラフ１に記載の方法。
【0113】
１２．前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における１以上の疼痛関連因子の上方調節と相関する、パラグラフ１に記載の方法。
【0114】
１３．前記１以上の疼痛関連因子が、ブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）から選択される、パラグラフ１２に記載の方法。
【0115】
１４．前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における１以上の炎症関連因子の上方調節と相関する、パラグラフ１に記載の方法。
【0116】
１５．前記炎症関連因子がインターロイキン－６（ＩＬ－６）である、パラグラフ１４に記載の方法。
【0117】
１６．前記上昇した不安定プロトン交換速度が前記対象における１以上の神経原性因子の上方調節と相関する、パラグラフ１に記載の方法。
【0118】
１７．前記神経原性因子が脳に由来する神経栄養因子（ＢＤＮＦ）または神経成長因子（ＮＧＦ）である、パラグラフ１６に記載の方法。
【0119】
１８．前記定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスが二次元（２Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである、パラグラフ１に記載の方法。
【0120】
１９．前記定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスが三次元（３Ｄ）の定量的化学交換飽和移動（ｑＣＥＳＴ）シーケンスである、パラグラフ１に記載の方法。
【0121】
２０．前記ＭＲＩスキャナーが３．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0122】
２１．前記ＭＲＩスキャナーが１．５Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0123】
２２．前記ＭＲＩスキャナーが７．０Ｔ ＭＲＩスキャナーである、パラグラフ１に記載の方法。
【0124】
２３．前記対象の状態の起源が、前記生理的なバイオマーカーを測定した前記対象の身体の前記画像化された領域内にあると判定する工程をさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【0125】
２４．前記低いｐＨ値が前記状態を有する前記対象を示す、パラグラフ２に記載の方法。
【0126】
２５．前記状態が判定される場合、前記対象のための１以上の治療を選択する工程をさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【0127】
２６．前記状態が判定される場合、１以上の治療で前記対象を治療する工程をさらに含む、パラグラフ１に記載の方法。
【0128】
本発明の種々の実施形態は、実施例を裏付けることにおいて記載されている。実施例は説明に役立つように且つ決して制約ではないように意図される。
【実施例】
【0129】
以下の実施例は本発明の特許請求の範囲を限定するようには意図されず、むしろ、特定の実施形態の例示であるように意図される。当業者に思い当たる例示された方法における任意の変更は本発明の範囲内に入るように意図される。
【0130】
本発明は、本発明の純粋に例示であるように意図され、本発明を限定するとは決して見なされるべきではない以下の実施例によってさらに説明されるであろう。以下の実施例は請求されている本発明をさらによく説明するために提供されているのであって、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。具体的な物質が言及される程度に、それは単に説明目的であって、本発明を限定するように意図されるものではない。当業者は創造力を行使することなく、且つ本発明の範囲を逸脱しないで同等の手段または反応物質を開発してもよい。
【0131】
実施例１
理論
追加の背景を経て、以前の研究は、プール「ｗ」（水プール）とプール「ｓ」（溶質プール）の間でのプロトン交換を記載しているＢｌｏｃｈ－ＭｃＣｏｎｎｅｌｌの方程式を用いた２つのプールの交換モデルに焦点を置いている。この２プールシステムでは、ｆｒは不安定プロトンの比Ｍ０ｓ／Ｍ０ｗを指し、ｋｓｗは溶質プールと水プールとの間での交換速度を指す。Ｒ１ｗ、Ｒ２ｗ、Ｒ１ｓ及びＲ２ｓはそれぞれ水プロトン及び溶質プロトンについての縦緩和及び横緩和の速度である。
理論
追加の背景を経て、以前の研究は、プール「ｗ」（水プール）とプール「ｓ」（溶質プール）の間でのプロトン交換を記載しているＢｌｏｃｈ－ＭｃＣｏｎｎｅｌｌの方程式を用いた２つのプールの交換モデルに焦点を置いている。この２プールシステムでは、ｆｒは不安定プロトンの比Ｍ０ｓ／Ｍ０ｗを指し、ｋｓｗは溶質プールと水プールとの間での交換速度を指す。Ｒ１ｗ、Ｒ２ｗ、Ｒ１ｓ及びＲ２ｓはそれぞれ水プロトン及び溶質プロトンについての縦緩和及び横緩和の速度である。
【0132】
従来のＣＥＳＴ非対称解析は、標識走査（溶質プールの共鳴周波数での）及び参照走査（水に関する逆周波数での）の間での直接差異を利用する。それは、ＣＥＳＴＲ＝Ｚｌａｂｅｌ－Ｚｒｅｆとして定義することができ、Ｚｌａｂｅｌ及びＺｒｅｆは基準化されたシグナル強度または標識走査と参照走査のためのＺスペクトルである。
【0133】
最近の研究は、逆数ＣＥＳＴの差異（ＣＥＳＴＲｉｎｄ）を
として簡略化しており、式中、Ｚｌａｂｅｌ及びＺｒｅｆは基準化されたシグナル強度または標識走査（溶質プールの共鳴周波数での）及び参照走査（水に関する逆周波数での）のためのＺスペクトルである。ω１はＲＦ照射の振幅である。
【0134】
方程式１はｃｗＣＥＳＴの飽和についてのみ有効である。ＣＥＳＴ実験でパルス状の飽和が適用される場合、方程式１は、
として書くことができ、式中、ＤＣはデューティサイクルを表し；ｃ１及びｃ２はガウスの飽和パルスの形状を記載する。（
σ及びｔｐはガウスパルスの幅及び長さである）。
ここでのω１はガウスパルス１つの平均ＲＦ照射振幅として定義され、すなわち、ω１＝フリップ角／パルス持続時間であることに留意のこと。
ここでのω１はガウスパルス１つの平均ＲＦ照射振幅として定義され、すなわち、ω１＝フリップ角／パルス持続時間であることに留意のこと。
【0135】
この表現では、１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは１／ω１
２の線形関数として記載されている。ＣＥＳＴＲｉｎｄを様々なＲＦ照射振幅で測定することによって傾きｍ及びインターカットｎを算出することができ、最終的にｋｓｗ及びｆｒを推定することができる。
Ｒ１ｗはＴ１マッピング法を用いて測定することができる。ＧＡＧのＲ２ｓは２００ｓ－１であると推定される（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｅｅ，Ｊ－Ｓ，Ｘｉａ，Ｄ，Ｊｅｒｓｃｈｏｗ，Ａ，Ｒｅｇａｔｔｅ，ＲＲ，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＣＥＳＴ ａｇｅｎｔｓ ａｔ ３ Ｔ ａｎｄ ７ Ｔ．Ｃｏｎｔｒａｓｔ Ｍｅｄｉａ Ｍｏｌ.Ｉｍａｇｉｎｇ，２０１６；１１：４‐１４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｍｍｉ．１６５２を参照のこと）。
【0136】
方程式１はＣＥＳＴ実験の定常状態を記載する簡略化された表現であることに留意のこと。ｑＣＥＳＴ実験を行う場合、ＲＦ飽和パルスは定常状態に達することを保証するのに十分に長いことが必要である。簡略化は遅い及び中間の化学交換を受けている希釈ＣＥＳＴ作用物質についてのみ有効である。
【0137】
方法
ファントム
種々のｐＨ値及び濃度を持つコンドロイチン硫酸Ａ（Ａｌｄｒｉｃｈ－Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）から調製されたＧＡＧを含有する２セットのファントムを準備した。ｐＨのセットについては、ＧＡＧ濃度を６０ｍＭに固定し、ｐＨを５．８、６．１、６．４、６．７及び７．０に用量設定した。濃度ファントムについては、種々のＧＡＧ濃度（１００ｍＭ、８０ｍＭ、６０ｍＭ、４０ｍＭ及び２０ｍＭ）を使用し、ｐＨを７．０に用量設定した。次いで溶液を１５ｍＬのチューブに移した。これら１０本のチューブを水で満たしたファントムホルダーに入れた。
ファントム
種々のｐＨ値及び濃度を持つコンドロイチン硫酸Ａ（Ａｌｄｒｉｃｈ－Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）から調製されたＧＡＧを含有する２セットのファントムを準備した。ｐＨのセットについては、ＧＡＧ濃度を６０ｍＭに固定し、ｐＨを５．８、６．１、６．４、６．７及び７．０に用量設定した。濃度ファントムについては、種々のＧＡＧ濃度（１００ｍＭ、８０ｍＭ、６０ｍＭ、４０ｍＭ及び２０ｍＭ）を使用し、ｐＨを７．０に用量設定した。次いで溶液を１５ｍＬのチューブに移した。これら１０本のチューブを水で満たしたファントムホルダーに入れた。
【0138】
試験管内ＭＲＩ実験
イメージング実験は室温で３．０Ｔｅｓｌａ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。画像はすべて８ｍｍのスライス厚、１６０×１６０ｍｍ２の視野、及び１２８×１２８のイメージングマトリクスで取得した。ＣＥＳＴ ＭＲＩはパルス状ＲＦ飽和高速スピンエコー（ＴＳＥ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１６０００／１２ｍｓ、２平均）で行った。ＣＥＳＴ飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（γｔｐ）＝０．７３μＴ、１．２２μＴ、１．７１μＴ及び２．４５μＴ；ガウス飽和パルスのパラメータｃ１＝０．５０、ｃ２＝０．５９）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓａｔ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状のパルスから成る。Ｚスペクトルは±１．６ｐｐｍ、±１．３ｐｐｍ、±１．０ｐｐｍ、±０．７ｐｐｍ及び±０．４ｐｐｍでの様々な飽和頻度（１０の異なる飽和頻度）で取得した。Ｂ０電界は水飽和シフト参照（ＷＡＳＳＲ）マップを用いて修正した（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＫｉｍ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｗａｔｅｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ （ＷＡＳＳＲ） ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＣＥＳＴ） ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９；６１：１４４１‐１４５０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｒｍ．２１８７３を参照のこと）。Ｔ１加重ＭＲ画像は１０の異なる反転遅延を伴った反転回復ＴＳＥシーケンスによって取得した（ＴＩ＝５０－４０００ｍｓ（すなわち、ＴＩ＝５０，１５０，３５０，７００，１０５０，１４００，２０００，２５００，３０００，及び４０００ｍｓ）；ＴＲ／ＴＥ＝６０００／１２ｍｓ）。Ｔ２加重ＭＲ画像は様々なエコー遅延を伴ったＴＳＥシーケンスによって取得した（ＴＥ＝１２－３９９ｍｓ（すなわち、ＴＥ＝１２，２４，４８，９７，２０５及び３９９ｍｓ）；ＴＲ＝６０００ｍｓ）。
イメージング実験は室温で３．０Ｔｅｓｌａ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。画像はすべて８ｍｍのスライス厚、１６０×１６０ｍｍ２の視野、及び１２８×１２８のイメージングマトリクスで取得した。ＣＥＳＴ ＭＲＩはパルス状ＲＦ飽和高速スピンエコー（ＴＳＥ）シーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１６０００／１２ｍｓ、２平均）で行った。ＣＥＳＴ飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（γｔｐ）＝０．７３μＴ、１．２２μＴ、１．７１μＴ及び２．４５μＴ；ガウス飽和パルスのパラメータｃ１＝０．５０、ｃ２＝０．５９）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓａｔ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状のパルスから成る。Ｚスペクトルは±１．６ｐｐｍ、±１．３ｐｐｍ、±１．０ｐｐｍ、±０．７ｐｐｍ及び±０．４ｐｐｍでの様々な飽和頻度（１０の異なる飽和頻度）で取得した。Ｂ０電界は水飽和シフト参照（ＷＡＳＳＲ）マップを用いて修正した（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＫｉｍ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｗａｔｅｒ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｈｉｆｔ ｒｅｆｅｒｅｎｃｉｎｇ （ＷＡＳＳＲ） ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ（ＣＥＳＴ） ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９；６１：１４４１‐１４５０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｒｍ．２１８７３を参照のこと）。Ｔ１加重ＭＲ画像は１０の異なる反転遅延を伴った反転回復ＴＳＥシーケンスによって取得した（ＴＩ＝５０－４０００ｍｓ（すなわち、ＴＩ＝５０，１５０，３５０，７００，１０５０，１４００，２０００，２５００，３０００，及び４０００ｍｓ）；ＴＲ／ＴＥ＝６０００／１２ｍｓ）。Ｔ２加重ＭＲ画像は様々なエコー遅延を伴ったＴＳＥシーケンスによって取得した（ＴＥ＝１２－３９９ｍｓ（すなわち、ＴＥ＝１２，２４，４８，９７，２０５及び３９９ｍｓ）；ＴＲ＝６０００ｍｓ）。
【0139】
動物の準備
動物関連の手順はすべてＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉメディカルセンターの施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。合計４匹のメスのユカタンミニブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ）を使用した。１８時間の術前絶食に続いて、各ブタを筋肉内薬剤（アセプロマジン０．２５ｍｇ／ｋｇ、ケタミン２０ｍｇ／ｋｇ及びアトロピン０．０２～０．０５ｍｇ／ｋｇ）で鎮静し、それに続いて動物にプロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射し、完全な麻酔を誘導した。これが達成された後、気管に挿管し、気管チューブを介して吸入された１～３．５％のイソフルランを用いて手順の持続時間の間麻酔を維持した。麻酔に続いて、蛍光透視鏡の誘導のもとで、３本のＭＲ適合性の１４Ｇ同軸針（Ｉｎｖｉｖｏ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ）を腰椎椎間板Ｌ１／Ｌ２、Ｌ３／Ｌ４及びＬ５／Ｌ６の実質部に挿入した。Ｍｅｌｋｕｓらによって記載されたように及び患者の病的な椎間板内で測定されたｐＨ値に従って、５～７の範囲での椎間板内でのｐＨ値の勾配を誘導するために、様々な濃度の乳酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をこれらの腰椎椎間板に注入した。椎間板内への注入に続いて、ＭＲ走査の直前にＭＲ適合性の針を介して挿入された特注の針状の組織ｐＨプローブ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）を用いて椎間板内部の正確なｐＨ値を測定した。腰椎椎間板Ｌ２／Ｌ３も対照椎間板として走査した。動物を安楽死させた直後にそのｐＨ値を測定した。
動物関連の手順はすべてＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉメディカルセンターの施設内動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。合計４匹のメスのユカタンミニブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ）を使用した。１８時間の術前絶食に続いて、各ブタを筋肉内薬剤（アセプロマジン０．２５ｍｇ／ｋｇ、ケタミン２０ｍｇ／ｋｇ及びアトロピン０．０２～０．０５ｍｇ／ｋｇ）で鎮静し、それに続いて動物にプロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射し、完全な麻酔を誘導した。これが達成された後、気管に挿管し、気管チューブを介して吸入された１～３．５％のイソフルランを用いて手順の持続時間の間麻酔を維持した。麻酔に続いて、蛍光透視鏡の誘導のもとで、３本のＭＲ適合性の１４Ｇ同軸針（Ｉｎｖｉｖｏ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ）を腰椎椎間板Ｌ１／Ｌ２、Ｌ３／Ｌ４及びＬ５／Ｌ６の実質部に挿入した。Ｍｅｌｋｕｓらによって記載されたように及び患者の病的な椎間板内で測定されたｐＨ値に従って、５～７の範囲での椎間板内でのｐＨ値の勾配を誘導するために、様々な濃度の乳酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をこれらの腰椎椎間板に注入した。椎間板内への注入に続いて、ＭＲ走査の直前にＭＲ適合性の針を介して挿入された特注の針状の組織ｐＨプローブ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）を用いて椎間板内部の正確なｐＨ値を測定した。腰椎椎間板Ｌ２／Ｌ３も対照椎間板として走査した。動物を安楽死させた直後にそのｐＨ値を測定した。
【0140】
生体内ＭＲＩ実験
イメージング実験は３．０Ｔｅｓｌａ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン（１～３．５％）によって維持した。
イメージング実験は３．０Ｔｅｓｌａ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン（１～３．５％）によって維持した。
【0141】
ＣＥＳＴ ＭＲＩは、二次元（２Ｄ）縮小視野（ｒＦＯＶ）ＴＳＥ ＣＥＳＴシーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝１０５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショット）を用いて行った。ｒＦＯＶは腸運動による作為的な結果を効果的に抑え、走査の効率を高めることができる（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｉｕ，Ｑ ｅｔ ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｍｂａｒ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｄｕｃｅｄ‐ｆｉｅｌｄ‐ｏｆ‐ｖｉｅｗ ｔｕｒｂｏ ｓｐｉｎ ｅｃｈｏ ａｔ ３．０ Ｔ．ＮＭＲ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３；２６：１６７２‐１６７９．ｄｏｉ：１０．１００２／ｎｂｍ．３００１を参照のこと）。各ＩＶＤについて、画像は、３ｍｍのスライス厚、１００×４０ｍｍ２の視野、及び０．８×０．８ｍｍ２の空間分解能で軸平面にて取得した。ＣＥＳＴの飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（γｔｐ）＝０．７３μＴ、１．２２μＴ、１．７１μＴ及び２．４５μＴ；ガウス飽和パルスのパラメータｃ１＝０．５０、ｃ２＝０．５９）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状のパルスから成る。Ｚスペクトルは±１．６ｐｐｍ、±１．３ｐｐｍ、±１．０ｐｐｍ、±０．７ｐｐｍ及び±０．４ｐｐｍでの様々な飽和頻度（１０の異なる飽和頻度）で取得した。各ＲＦの照射振幅についてのＣＥＳＴ実験の走査時間は約６分である。Ｂ０電界はＷＡＳＳＲを用いて修正した。
【0142】
Ｔ１加重ＭＲ画像は、７つの様々なＴＩ（５０ｍｓ、１５０ｍｓ、３５０ｍｓ、７００ｍｓ、１０５０ｍｓ、１４００ｍｓ及び２０００ｍｓ）による反転回復ＴＳＥシーケンスによって取得した。画像はＣＥＳＴ ＭＲＩシーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝６０００／１２ｍｓ；１つの平均；ＦＯＶ＝２００×２００ｍｍ２；空間分解能＝０．８×０．８×３ｍｍ３；走査時間＝約２．５分）と同じ切片の位置で取得した。
【0143】
データ解析
後処理はＭａｔｌａｂにおける特注のプログラム（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ＣＥＳＴＲｉｎｄは、１．０ｐｐｍ（Ｚｌａｂ＝Ｚ（＋１．０ｐｐｍ），Ｚｒｅｆ＝Ｚ（－１．０ｐｐｍ））でのＢ０の修正の後、方程式１に従って算出した。線形回帰を使用して１／ＣＥＳＴＲｉｎｄと１／ω１ ２の間でのΩプロット解析を行い、傾き及びインターカットを得た。交換速度ｋｓｗ及び不安定プロトンの比ｆｒはその後方程式［３］及び［４］に従って算出した。これらの算出は画素単位で、及び関心領域（ＲＯＩ）によって行った。Ｔ１マップ及びＴ２マップは、Ｉがシグナル強度であるシグナル方程式Ｉ＝Ｉ０［１－（１＋η）・ｅｘｐ（－ＴＩ／Ｔ１）］の画素単位での対数適合によって得た。ＴＩは反転時間であり、ηは反転効率である。Ｔ２マップはＩがシグナル強度であり、ＴＥがエコー時間であるシグナル方程式Ｉ＝Ｉ０・ｅｘｐ（－ＴＥ／Ｔ２）を適合させることによって得た。
後処理はＭａｔｌａｂにおける特注のプログラム（Ｔｈｅ Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）で行った。ＣＥＳＴＲｉｎｄは、１．０ｐｐｍ（Ｚｌａｂ＝Ｚ（＋１．０ｐｐｍ），Ｚｒｅｆ＝Ｚ（－１．０ｐｐｍ））でのＢ０の修正の後、方程式１に従って算出した。線形回帰を使用して１／ＣＥＳＴＲｉｎｄと１／ω１ ２の間でのΩプロット解析を行い、傾き及びインターカットを得た。交換速度ｋｓｗ及び不安定プロトンの比ｆｒはその後方程式［３］及び［４］に従って算出した。これらの算出は画素単位で、及び関心領域（ＲＯＩ）によって行った。Ｔ１マップ及びＴ２マップは、Ｉがシグナル強度であるシグナル方程式Ｉ＝Ｉ０［１－（１＋η）・ｅｘｐ（－ＴＩ／Ｔ１）］の画素単位での対数適合によって得た。ＴＩは反転時間であり、ηは反転効率である。Ｔ２マップはＩがシグナル強度であり、ＴＥがエコー時間であるシグナル方程式Ｉ＝Ｉ０・ｅｘｐ（－ＴＥ／Ｔ２）を適合させることによって得た。
【0144】
結果
ファントム
図１では、様々なＧＡＧ濃度とｐＨ値のチューブにて１／ＣＥＳＴＲｉｎｄと１／ω１ ２との関係を評価した。１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは各チューブの関心領域（ＲＯＩ）内での平均シグナルである。チューブのすべてにおいて１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは１／ω１ ２の線形関数として表すことができる。この実験的知見は方程式［２］に一致する。
ファントム
図１では、様々なＧＡＧ濃度とｐＨ値のチューブにて１／ＣＥＳＴＲｉｎｄと１／ω１ ２との関係を評価した。１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは各チューブの関心領域（ＲＯＩ）内での平均シグナルである。チューブのすべてにおいて１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは１／ω１ ２の線形関数として表すことができる。この実験的知見は方程式［２］に一致する。
【0145】
加えて、化学交換速度ｋｓｗ及び不安定プロトンの比ｆｒの画素単位のマッピングを再構築し、図２Ａ及び図２Ｂで示す。ｐＨ値が変わるにつれて化学交換速度がどのように変化するか（図２Ａ）及びＧＡＧ濃度が変わるにつれて不安定ピクセルの比がどのように変化するか（図２Ｂ）を見ることができる。定量的には、化学交換速度はｋｓｗ＝１．５ｘ１０－ｐＨ＋８＋２５２．０，Ｒ２＝０．９５０８として記載することができる（図２Ｃ）。これは酸が触媒する化学交換の式に従う（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＥｎｇｌａｎｄｅｒ，ＳＷ，ｅｔ ａｌ．Ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７２；４１：９０３－９２４．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｂｉ．４１．０７０１７２．００４３５１を参照のこと）。不安定プロトンの比はＧＡＧ濃度と線形に相関する（図２Ｄ）。それは、ｆｒ＝４．６×１０－５［ＧＡＧ］－４．４×１０－５（Ｒ２＝０．９８６９）として表すことができ、［ＧＡＧ］はｍＭでのＧＡＧ濃度である。図２Ｃ及び図２Ｄにおけるエラーバーは、それぞれｋｓｗ及びｆｒについて各チューブのＲＯＩ内での画素すべての標準偏差を表す。これらの実験結果はｑＣＥＳＴ法の生体内での適用を促した。
【0146】
動物試験
この試験で１６のＩＶＤを調べ、そのうち３つは針がＩＶＤの両側を通り抜け、形態的な損傷を引き起こしたので除外した。乳酸ナトリウムの注射後に調べたＩＶＤのｐＨ値は５．０から７．２に及んだ。図３Ａ～３Ｃは、１匹の代表的なミニブタ腰椎のＩＶＤの解剖学的画像及び相当する交換速度マップを示す。図３Ａ～３Ｃで示されるように、交換速度は低いｐＨ値のＩＶＤで高かった。各椎間板内で、交換速度マップにて若干の不均質性があった。これは、現在のＳＮＲがシグナル画素の正確な測定を保証できないためである。しかしながら、各ＩＶＤの平均値はさらに信頼できることが判明した。これは、類似のｐＨ環境にある画素すべてを平均した後ＳＮＲが上昇するためである。
この試験で１６のＩＶＤを調べ、そのうち３つは針がＩＶＤの両側を通り抜け、形態的な損傷を引き起こしたので除外した。乳酸ナトリウムの注射後に調べたＩＶＤのｐＨ値は５．０から７．２に及んだ。図３Ａ～３Ｃは、１匹の代表的なミニブタ腰椎のＩＶＤの解剖学的画像及び相当する交換速度マップを示す。図３Ａ～３Ｃで示されるように、交換速度は低いｐＨ値のＩＶＤで高かった。各椎間板内で、交換速度マップにて若干の不均質性があった。これは、現在のＳＮＲがシグナル画素の正確な測定を保証できないためである。しかしながら、各ＩＶＤの平均値はさらに信頼できることが判明した。これは、類似のｐＨ環境にある画素すべてを平均した後ＳＮＲが上昇するためである。
【0147】
図４Ａでは、我々は異なるｐＨ値（５．０、５．８及び６．７）での代表的なＩＶＤにおける１／ＣＥＳＴＲｉｎｄと１／ω１
２の間の関係を評価した。ファントム試験で示したのに類似して、１／ＣＥＳＴＲｉｎｄは１／ω１
２の線形関数として表すことができる。図４Ｂでは、各椎間板の平均交換速度を例にとり、ｐＨプローブを用いて椎間板内ｐＨ値を直接測定することによって得た、相当するｐＨ値でその関係を評価した。交換速度は、酸が触媒する化学交換の式ｋｓｗ＝９．２ｘ１０－ｐＨ＋６＋１９６．９，Ｒ２＝０．７８８３によって記載することができる。
【0148】
考察
この研究では、ｑＣＥＳＴを用いて生体内にて３．０ＴｅｓｌａＭＲスキャナーでＩＶＤにおけるｐＨ変化を検出することができるかどうかを検討した。ファントム試験は、ｑＣＥＳＴ解析で使用された近似値がＧＡＧのような分子についてやはり当てはまり、ｑＣＥＳＴ解析から決定された交換速度がＧＡＧ溶液のｐＨレベルに依存することを示した。交換速度とｐＨ値の間の関係をブタ脊椎の生体内試験にてさらに調べた。結果は、酸が触媒するプロトンの化学交換の式を用いて、ｐＨの関数として交換速度を記載することができることを示した。これは、組織ｐＨメーターを参照として用いたｑＣＥＳＴの妥当性を示す最初の生体内試験であると考えられる。
この研究では、ｑＣＥＳＴを用いて生体内にて３．０ＴｅｓｌａＭＲスキャナーでＩＶＤにおけるｐＨ変化を検出することができるかどうかを検討した。ファントム試験は、ｑＣＥＳＴ解析で使用された近似値がＧＡＧのような分子についてやはり当てはまり、ｑＣＥＳＴ解析から決定された交換速度がＧＡＧ溶液のｐＨレベルに依存することを示した。交換速度とｐＨ値の間の関係をブタ脊椎の生体内試験にてさらに調べた。結果は、酸が触媒するプロトンの化学交換の式を用いて、ｐＨの関数として交換速度を記載することができることを示した。これは、組織ｐＨメーターを参照として用いたｑＣＥＳＴの妥当性を示す最初の生体内試験であると考えられる。
【0149】
以前の研究は、ｇａｇＣＥＳＴのｐＨ依存性を検討していた。Ｔ１ρを用いてＧＡＧ濃度を修正したとしても、水緩和のパラメータＴ１及びＴ２は依然としてｇａｇＣＥＳＴのシグナルに寄与する。一方、ｑＣＥＳＴ解析は、数値シミュレーション及びファントム試験にてＴ１、Ｔ２及び濃度と無関係なｐＨ変化を検出することが示されている。Ｔ１及びＴ２は椎間板変性の後で有意に変化するので、ＩＶＤにおけるｐＨ変化を測定することはさらに信頼できるアプローチである。この生体内試験では、交換速度とｐＨレベルの間で関係性が確立されたが、それは交換速度をｐＨレベルに変換する将来の試験に適用される可能性があり得る。
【0150】
この試験は３．０Ｔｅｓｌａ臨床ＭＲスキャナーで行われたので、パルス状のＣＥＳＴ飽和パルスが使用された。パルス状のｑＣＥＳＴ解析は絶え間なく変化するＲＦ照射振幅のために一層さらに複雑である。パルス状のＣＥＳＴ実験は通常、等価のｃｗＢ１電界強度として照射パワーを報告する。しかしながら、パルス状のＣＥＳＴ実験におけるプロトン交換は予想以上に複雑である。等価のｃｗＢ１電界強度を単に組み込むことが、交換速度及び不安定プロトンの比を推定することにおいてエラーを引き起こすであろう。Ｍｅｉｓｓｎｅｒらはパルス状のＣＥＳＴ実験のための分析用溶液を考え付いた（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｅｉｓｓｎｅｒ，Ｊ－Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｕｌｓｅｄ ＣＥＳＴ－ＭＲＩ ｕｓｉｎｇ Ω－ｐｌｏｔｓ ＮＭＲ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５；２８：１１９６-１２０８．ｄｏｉ：１０．１００２／ｎｂｍ．３３６２を参照のこと）。これはパルス状のＣＥＳＴ実験さらに正確な定量的結果を可能にする。
【0151】
この研究では、交換速度とｐＨレベルの間の関係性がファントム試験及び生体内動物試験の双方で研究された。しかしながら、結果は正確に同一であるわけではない。理由の１つはこれら２つの試験が異なる温度（ファントム試験は約２０℃及び動物試験は約３８℃）で行われたことである。もう１つの考えられる理由はＩＶＤにおけるＧＡＧがさらに複雑な環境を経験することである。ＣＥＳＴの影響に加えて、ｑＣＥＳＴ解析に影響を及ぼし得る高分子のような半固形成分からの磁化移動（ＭＴ）の影響もＩＶＤには存在する。
【0152】
いつものＣＥＳＴ実験は、長いＴＲや複数の平均等のために相対的に時間がかかる。それに加えて、ｑＣＥＳＴ解析は、（ａ）定常状態を達成するための長いＲＦ飽和時間（本試験では６秒）及び（ｂ）Ωプロットを行うために様々なＲＦ照射振幅での複数回のＣＥＳＴ実験も必要とする。圧縮センシング法及びパラレルイメージング法を利用してｑＣＥＳＴ実験を加速することができる（あたかも完全に記述されているかのようにその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＨｅｏ，ＨＹ，Ｚｈａｎｇ，Ｙ，Ｌｅｅ，ＤＨ，Ｊｉａｎｇ，Ｓ，Ｚｈａｏ，Ｘ，Ｚｈｏｕ，Ｊ．，Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ （ＣＥＳＴ） ＭＲＩ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｎｓｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６：ｎ／ａ‐ｎ／ａ．ｄｏｉ：１０．１００２／ｍｒｍ．２６１４１を参照のこと）ので、本発明のシステム及び方法と併せたこれらの技法の実施は本発明の範囲内として熟考される。
【0153】
乳酸ナトリウムを注射することによるＩＶＤにおけるｐＨレベルの操作は限定された程度にのみ変性状態を模倣する。ｐＨの変化に加えて、椎間板変性は髄核におけるＧＡＧ及び含水量の喪失に関係する。ＧＡＧの喪失はＣＥＳＴ値を有意に低下させ、脱水過程はＭＲ緩和のパラメータの変化を引き起こすであろう。
【0154】
結論
本出願で報告されている実験はＩＶＤにおけるＧＡＧの生体内ｑＣＥＳＴ解析の実現可能性を実証している。本出願で報告されている実験はまた、ｑＣＥＳＴ解析から決定される交換速度がｐＨ値と密接に相関し、ＩＶＤにてｐＨを非侵襲的に測定するのに使用することができることも実証している。ｑＣＥＳＴ法は、ＩＶＤの病態に関する追加の情報を提供し、腰痛及びその根底にある変性過程の病態形成についての洞察を得るのに役立つ潜在性を有する。
本出願で報告されている実験はＩＶＤにおけるＧＡＧの生体内ｑＣＥＳＴ解析の実現可能性を実証している。本出願で報告されている実験はまた、ｑＣＥＳＴ解析から決定される交換速度がｐＨ値と密接に相関し、ＩＶＤにてｐＨを非侵襲的に測定するのに使用することができることも実証している。ｑＣＥＳＴ法は、ＩＶＤの病態に関する追加の情報を提供し、腰痛及びその根底にある変性過程の病態形成についての洞察を得るのに役立つ潜在性を有する。
【0155】
実施例２
結果
ＩＶＤ変性の誘導
ミニブタは、４つのＩＶＤ（Ｌ１／２～Ｌ４／５）の線維輪に穴を開けて変性を誘導する手術を受けた（図６）。ＩＶＤ変性の進行をＭＲＩを用いてモニターし、健常なＩＶＤに比べて穴を開けたＩＶＤではＴ２加重のシグナル強度に明瞭な低下があった（図７Ａ）。穴を開けたＩＶＤ内での含水量の２倍の低下は、Ｔ２加重のマッピングに基づいて健常なブタＩＶＤに比べて変性誘導の２週間後すぐに明らかだった（ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）。含水量は２週目に比べて変性誘導の１０週後さらに低下した（ｐ＜０．０５）。加えて、１．６から１．４へのＴ１シグナルの有意な低下は健常対照に比べて変性誘導の２週間後注目に値した（ｐ＜０．０００１；図７Ｃ）。Ｔ１シグナルの１．２までのさらなる低下は変性誘導の６週間後に測定された（ｐ＜０．０００１）。Ｔ１ρマッピングは変性誘導の２週間後すぐにシグナルの２倍の低下を明らかにした（ｐ＜０．０００１；図７Ｄ）。全体的に見て、これらの定量的なシグナルは、穴を開けたＩＶＤにおける迅速に進行する変性状況を示している。組織学は、穴開けに続く異常なＩＶＤ構造及び細胞マトリクスを示し、変性したＩＶＤに典型的な髄核における広範な線維化及び細胞塊の形成があった（図７Ｅ）。
結果
ＩＶＤ変性の誘導
ミニブタは、４つのＩＶＤ（Ｌ１／２～Ｌ４／５）の線維輪に穴を開けて変性を誘導する手術を受けた（図６）。ＩＶＤ変性の進行をＭＲＩを用いてモニターし、健常なＩＶＤに比べて穴を開けたＩＶＤではＴ２加重のシグナル強度に明瞭な低下があった（図７Ａ）。穴を開けたＩＶＤ内での含水量の２倍の低下は、Ｔ２加重のマッピングに基づいて健常なブタＩＶＤに比べて変性誘導の２週間後すぐに明らかだった（ｐ＜０．０００１；図７Ｂ）。含水量は２週目に比べて変性誘導の１０週後さらに低下した（ｐ＜０．０５）。加えて、１．６から１．４へのＴ１シグナルの有意な低下は健常対照に比べて変性誘導の２週間後注目に値した（ｐ＜０．０００１；図７Ｃ）。Ｔ１シグナルの１．２までのさらなる低下は変性誘導の６週間後に測定された（ｐ＜０．０００１）。Ｔ１ρマッピングは変性誘導の２週間後すぐにシグナルの２倍の低下を明らかにした（ｐ＜０．０００１；図７Ｄ）。全体的に見て、これらの定量的なシグナルは、穴を開けたＩＶＤにおける迅速に進行する変性状況を示している。組織学は、穴開けに続く異常なＩＶＤ構造及び細胞マトリクスを示し、変性したＩＶＤに典型的な髄核における広範な線維化及び細胞塊の形成があった（図７Ｅ）。
【0156】
ＭＲシグナルは変性したＩＶＤにおける椎間板内ｐＨと相関する
ＩＶＤの変性状況を測定することに加えて、変性ＩＶＤからｑＣＥＳＴシグナルを取得した。これらの値はＩＶＤから直接測定した相当するｐＨの読み取りと相関した（図８Ａ）。強い相関は変性ＩＶＤのｑＣＥＳＴシグナルとｐＨとの間で観察された（Ｒ２＝０．８００４；ｐ＜０．０００１）。２、６及び１０週目での利用可能なｑＣＥＳＴの読み取りを健常または変性のいずれかに分類し、それを用いて８１．３％感度及び７６．１％特異度のＲＯＣ曲線（曲線下面積＝０．８１３、ｐ＝０．０００３）を作り出した（図８Ｂ）。７．２から６．３までの有意なｐＨ低下は損傷の２週間後すぐにＩＶＤにて測定された（ｐ＝０．０００１、図８Ｃ）。ｐＨにおけるこの低下は１０週目まで維持された。ｐＨ低下に従って、取得したｑＣＥＳＴシグナルは損傷の２週間後有意に上昇した（ｐ＜０．０５、図８Ｄ）。シグナルのさらなる上昇が６週及び１０週で観察された（ｐ＜０．０１）ということは、物理的測定によっては統計的に有意ではなかったｐＨにおける小さな変化に対するＭＲプロトコールの高い感度を実証している。
ＩＶＤの変性状況を測定することに加えて、変性ＩＶＤからｑＣＥＳＴシグナルを取得した。これらの値はＩＶＤから直接測定した相当するｐＨの読み取りと相関した（図８Ａ）。強い相関は変性ＩＶＤのｑＣＥＳＴシグナルとｐＨとの間で観察された（Ｒ２＝０．８００４；ｐ＜０．０００１）。２、６及び１０週目での利用可能なｑＣＥＳＴの読み取りを健常または変性のいずれかに分類し、それを用いて８１．３％感度及び７６．１％特異度のＲＯＣ曲線（曲線下面積＝０．８１３、ｐ＝０．０００３）を作り出した（図８Ｂ）。７．２から６．３までの有意なｐＨ低下は損傷の２週間後すぐにＩＶＤにて測定された（ｐ＝０．０００１、図８Ｃ）。ｐＨにおけるこの低下は１０週目まで維持された。ｐＨ低下に従って、取得したｑＣＥＳＴシグナルは損傷の２週間後有意に上昇した（ｐ＜０．０５、図８Ｄ）。シグナルのさらなる上昇が６週及び１０週で観察された（ｐ＜０．０１）ということは、物理的測定によっては統計的に有意ではなかったｐＨにおける小さな変化に対するＭＲプロトコールの高い感度を実証している。
【0157】
ＭＲシグナルは変性ＩＶＤにおける疼痛マーカーと相関する
次に、我々は変性したＩＶＤにおける疼痛関連因子の発現を評価した。採取した変性ＩＶＤにて髄核及び線維輪から抽出されたＲＮＡの遺伝子発現解析を行った。具体的には、我々はブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の発現を評価した。ＣＧＲＰ発現における１０倍の上昇は変性の６及び１０週後の髄核で観察された（ｐ＜０．０５、図９Ａ）。ＢＤＫＲＢ１発現の１３倍の上昇は変性の６週後、線維輪にて観察された（ｐ＜０．０５）一方で、有意ではない低下が変性の１０週後に観察された（ｐ＝０．１３６７、図９Ｂ）。変性の２、６及び１０週後、線維輪にてＣＯＭＴの発現で４倍の上昇があった（ｐ＜０．０１、図９Ｃ）。加えて、炎症過程に関与するＩＬ－６の発現も変性に続いて評価した。ＩＬ－６の発現解析は変性の６及び１０週後、線維輪にて２０倍の上昇を明らかにした（ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。我々はまた、神経の成長に関与する脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現も評価した。変性の６週後、線維輪におけるＢＤＮＦの発現で２２倍の上昇が観察された（ｐ＜０．０５、図９Ｅ）。驚くべきことに、変性１０週後の線維輪では有意ではない下方調節が観察された（ｐ＝０．０９２５）一方で、その間に髄核では有意な１８倍の上昇が観察された（ｐ＜０．０５）。前述のマーカーに対する抗体による髄核の免疫蛍光染色は、健常ＩＶＤに比べて調べた疼痛マーカーの上昇したシグナルと同時局在化を明らかにした（図１０）。ＣＯＭＴとＩＬ－６の同時局在化が変性ＩＶＤ内で観察されたということは、これらの過程を変性の進行の一部として関連付けている。遺伝子解析の結果とは対照的に、変性の１０週後、ＢＤＮＦの発現は髄核では観察されなかった。しかしながら、場合によっては、タンパク質の発現は免疫蛍光染色では測定できず、遺伝子発現試験は一般にさらに高感度である。全体として見れば、我々は変性したＩＶＤにて幾つかの疼痛因子、炎症因子及び神経原性因子の上方調節があることを見いだした。最終的に、測定したｑＣＥＳＴのシグナルは同じＩＶＤに由来する前述のマーカーの発現レベルと対を為し、強い線形の相関を生じる（すべての対合についてｐ＜０．０００１；図１１Ａ～図１１Ｅ）。本明細書に記載されている我々の他の結果と組み合わせて、このデータはｑＣＥＳＴシグナルの上昇がＩＶＤ内での幾つかの疼痛マーカーの上方調節と相関するので、痛みを伴うＩＶＤの検出を可能にすることを実証している。
次に、我々は変性したＩＶＤにおける疼痛関連因子の発現を評価した。採取した変性ＩＶＤにて髄核及び線維輪から抽出されたＲＮＡの遺伝子発現解析を行った。具体的には、我々はブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）の発現を評価した。ＣＧＲＰ発現における１０倍の上昇は変性の６及び１０週後の髄核で観察された（ｐ＜０．０５、図９Ａ）。ＢＤＫＲＢ１発現の１３倍の上昇は変性の６週後、線維輪にて観察された（ｐ＜０．０５）一方で、有意ではない低下が変性の１０週後に観察された（ｐ＝０．１３６７、図９Ｂ）。変性の２、６及び１０週後、線維輪にてＣＯＭＴの発現で４倍の上昇があった（ｐ＜０．０１、図９Ｃ）。加えて、炎症過程に関与するＩＬ－６の発現も変性に続いて評価した。ＩＬ－６の発現解析は変性の６及び１０週後、線維輪にて２０倍の上昇を明らかにした（ｐ＜０．０５、図９Ｄ）。我々はまた、神経の成長に関与する脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の発現も評価した。変性の６週後、線維輪におけるＢＤＮＦの発現で２２倍の上昇が観察された（ｐ＜０．０５、図９Ｅ）。驚くべきことに、変性１０週後の線維輪では有意ではない下方調節が観察された（ｐ＝０．０９２５）一方で、その間に髄核では有意な１８倍の上昇が観察された（ｐ＜０．０５）。前述のマーカーに対する抗体による髄核の免疫蛍光染色は、健常ＩＶＤに比べて調べた疼痛マーカーの上昇したシグナルと同時局在化を明らかにした（図１０）。ＣＯＭＴとＩＬ－６の同時局在化が変性ＩＶＤ内で観察されたということは、これらの過程を変性の進行の一部として関連付けている。遺伝子解析の結果とは対照的に、変性の１０週後、ＢＤＮＦの発現は髄核では観察されなかった。しかしながら、場合によっては、タンパク質の発現は免疫蛍光染色では測定できず、遺伝子発現試験は一般にさらに高感度である。全体として見れば、我々は変性したＩＶＤにて幾つかの疼痛因子、炎症因子及び神経原性因子の上方調節があることを見いだした。最終的に、測定したｑＣＥＳＴのシグナルは同じＩＶＤに由来する前述のマーカーの発現レベルと対を為し、強い線形の相関を生じる（すべての対合についてｐ＜０．０００１；図１１Ａ～図１１Ｅ）。本明細書に記載されている我々の他の結果と組み合わせて、このデータはｑＣＥＳＴシグナルの上昇がＩＶＤ内での幾つかの疼痛マーカーの上方調節と相関するので、痛みを伴うＩＶＤの検出を可能にすることを実証している。
【0158】
考察
以前の研究は椎間板起因の腰痛を診断するための測定単位としてｐＨを評価しようとした。Ｚｕｏらは、インタクトなウシ及びヒトの死体ＩＶＤにて３．０Ｔスキャナーで局在した１Ｈスペクトルを取得して低いｐＨの原因となる乳酸塩を定量することの実現可能性を実証した（Ｊ．Ｚｕｏ，Ｅ．Ｓａａｄａｔ，Ａ．Ｒｏｍｅｒｏ，Ｋ．Ｌｏｏ，Ｘ．Ｌｉ，Ｔ．Ｍ．Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｃｚ，Ｓ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｖｏｘｅｌ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ，６２，１１４０－１１４６（２００９））。しかしながら、この技法を生体内の分光法に変換することは幾つかの制限に悩まされる。著者らが言及したように、それらの共鳴周波数が近いので脂質ピークから乳酸塩を識別するのは困難である。別の制限は崩壊した空間でのＩＶＤにおける代謝産物の不適切な定量である。同じグループの後者の研究は分光法によって生体内でＩＶＤを特徴付けた（Ｊ．Ｚｕｏ，Ｇ．Ｂ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ｘ．Ｌｉ，Ｔ．Ｍ．Ｌｉｎｋ，Ｓ．Ｓ．Ｈｕ，Ｓ．Ｈ．Ｂｅｒｖｅｎ，Ｊ．Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｔｚ，Ｓ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔ１ｒｈｏ ｉｍａｇｉｎｇ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｃｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｏｓｗｅｓｔｒｙ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ－３６ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）３７，２１４－２２１（２０１２））。有意な上昇した水／プロテオグリカンの面積比が陽性の椎間板造影法によってＩＶＤで見いだされた。生体内ＭＲＳは、低いＳＮＲ、生理的な動き及び骨感受性が誘導する線幅拡大のために難題であり、乳酸塩の評価を不正確にしている。
以前の研究は椎間板起因の腰痛を診断するための測定単位としてｐＨを評価しようとした。Ｚｕｏらは、インタクトなウシ及びヒトの死体ＩＶＤにて３．０Ｔスキャナーで局在した１Ｈスペクトルを取得して低いｐＨの原因となる乳酸塩を定量することの実現可能性を実証した（Ｊ．Ｚｕｏ，Ｅ．Ｓａａｄａｔ，Ａ．Ｒｏｍｅｒｏ，Ｋ．Ｌｏｏ，Ｘ．Ｌｉ，Ｔ．Ｍ．Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｃｚ，Ｓ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｖｏｘｅｌ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ，６２，１１４０－１１４６（２００９））。しかしながら、この技法を生体内の分光法に変換することは幾つかの制限に悩まされる。著者らが言及したように、それらの共鳴周波数が近いので脂質ピークから乳酸塩を識別するのは困難である。別の制限は崩壊した空間でのＩＶＤにおける代謝産物の不適切な定量である。同じグループの後者の研究は分光法によって生体内でＩＶＤを特徴付けた（Ｊ．Ｚｕｏ，Ｇ．Ｂ．Ｊｏｓｅｐｈ，Ｘ．Ｌｉ，Ｔ．Ｍ．Ｌｉｎｋ，Ｓ．Ｓ．Ｈｕ，Ｓ．Ｈ．Ｂｅｒｖｅｎ，Ｊ．Ｋｕｒｈａｎｅｗｉｔｚ，Ｓ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔ１ｒｈｏ ｉｍａｇｉｎｇ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｃｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｏｓｗｅｓｔｒｙ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ Ｆｏｒｍ－３６ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｕｒｖｅｙ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）３７，２１４－２２１（２０１２））。有意な上昇した水／プロテオグリカンの面積比が陽性の椎間板造影法によってＩＶＤで見いだされた。生体内ＭＲＳは、低いＳＮＲ、生理的な動き及び骨感受性が誘導する線幅拡大のために難題であり、乳酸塩の評価を不正確にしている。
【0159】
別の研究はブタＩＶＤ検体にてｐＨに対するＧＡＧのＣＥＳＴ効果の非線形の依存性を見いだした（Ｇ．Ｍｅｌｋｕｓ，Ｍ．Ｇｒａｂａｕ，Ｄ．Ｃ．Ｋａｒａｍｐｉｎｏｓ，Ｓ．Ｍａｊｕｍｄａｒ，Ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｏｒｃｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｐＨ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ ｄｉｓｃ．Ｍａｇｎ Ｒｅｓｏｎ Ｍｅｄ，７１，１７４３－１７４９（２０１４））。しかしながら、試験は７．０Ｔ ＭＲＩにて生体外で行われたが、方法の臨床ＭＲシステム（１．５Ｔまたは３．０Ｔ）に対する有効性は示されていない。
【0160】
以前の研究とは対照的に、この研究では、我々はＭＲＩを使用して、ＩＶＤ変性のミニブタモデルにて生体内で椎間板起因の腰痛を検出した。我々は、ＭＲＩ及び組織学によって検出されたように、変性は損傷に続く１０週間で達成されることを示した。変性過程の間で有意なｐＨ低下が観察されたと共に、ｑＣＥＳＴシグナルの有意な上昇も観察された。これらの変化は損傷の２週後すぐに検出された。ｑＣＥＳＴのシグナルは変性したＩＶＤから直接得られたｐＨ測定値と良く相関した。遺伝子解析は変性したＩＶＤにて幾つかの疼痛マーカーの上方調節を明らかにし、この上方調節は種々の時点でｑＣＥＳＴのシグナルの上昇と強く相関した。
【0161】
そのようなものとして、種々の実施形態では、本発明は、臨床のＭＲＩシステムで実施することができる。ｑＣＥＳＴ法を用いてＩＶＤの生理に関する追加の情報を提供し、早期の変性に関連するｐＨ変化を検出することができるので、患者に早期の診断を提供することができる。種々の実施形態では、本発明はまた、ＩＶＤ変性についての早期の介入及び慢性腰痛の予防も可能にする。
【0162】
材料及び方法
研究計画
我々の研究の目的は、腰痛を診断するためのｐＨレベル依存的ＭＲイメージングのアプローチを開発することであった。我々の事前に特定した仮説は、変性しているＩＶＤにおける疼痛は椎間板内の酸性環境により少なくとも部分的に生じ、このｐＨ低下はｑＣＥＳＴイメージングを用いて非侵襲的に検出できるということだった。９匹の健常なメスで骨格上成熟したユカタンミニブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ；平均年齢１．５歳、３５～４０ｋｇ）をこの研究に含めた。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、使用した試料サイズを概算して０．８の検出力及びα＝０．０５を達成した。ｑＣＥＳＴは、ＩＶＤ内でのｐＨ変化を検出し、この変化が疼痛マーカーの上方調節と相関し得るかどうかを見るその能力について検討された。この目的で、我々は、１４Ｇの針で線維輪に穴を開け、こうしてミニブタ当たり４つの変性しているＩＶＤを作り出すことによって大型で臨床的に関連する動物モデルにてＩＶＤ変性のモデルを作り出した（図６）。次いで、ミニブタは変性の２、６及び１０週後、ＭＲＩ走査を体験した。各時点で、ｐＨメーターを用いてＩＶＤ内でのｐＨを直接測定するために３匹のブタを無作為に安楽死させ、遺伝子発現解析、組織学及び免疫蛍光のために変性したＩＶＤを採取した。イメージングパラメータ及び組織学を用いてＩＶＤの変性を評価した。疼痛は遺伝子発現及び免疫蛍光を用いて検出し、ＩＶＤ内でのｑＣＥＳＴ測定値と比較した。動物の福祉を損なう経過観察中での神経損傷または苦痛の兆候のような急性の手技上の合併症を発症した動物は試験から除外した。
研究計画
我々の研究の目的は、腰痛を診断するためのｐＨレベル依存的ＭＲイメージングのアプローチを開発することであった。我々の事前に特定した仮説は、変性しているＩＶＤにおける疼痛は椎間板内の酸性環境により少なくとも部分的に生じ、このｐＨ低下はｑＣＥＳＴイメージングを用いて非侵襲的に検出できるということだった。９匹の健常なメスで骨格上成熟したユカタンミニブタ（Ｓ＆Ｓ Ｆａｒｍｓ；平均年齢１．５歳、３５～４０ｋｇ）をこの研究に含めた。一元配置ＡＮＯＶＡを用いて、使用した試料サイズを概算して０．８の検出力及びα＝０．０５を達成した。ｑＣＥＳＴは、ＩＶＤ内でのｐＨ変化を検出し、この変化が疼痛マーカーの上方調節と相関し得るかどうかを見るその能力について検討された。この目的で、我々は、１４Ｇの針で線維輪に穴を開け、こうしてミニブタ当たり４つの変性しているＩＶＤを作り出すことによって大型で臨床的に関連する動物モデルにてＩＶＤ変性のモデルを作り出した（図６）。次いで、ミニブタは変性の２、６及び１０週後、ＭＲＩ走査を体験した。各時点で、ｐＨメーターを用いてＩＶＤ内でのｐＨを直接測定するために３匹のブタを無作為に安楽死させ、遺伝子発現解析、組織学及び免疫蛍光のために変性したＩＶＤを採取した。イメージングパラメータ及び組織学を用いてＩＶＤの変性を評価した。疼痛は遺伝子発現及び免疫蛍光を用いて検出し、ＩＶＤ内でのｑＣＥＳＴ測定値と比較した。動物の福祉を損なう経過観察中での神経損傷または苦痛の兆候のような急性の手技上の合併症を発症した動物は試験から除外した。
【0163】
ＩＶＤ変性の動物モデル
動物の処置はすべてＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉメディカルセンターの施設内動物実験委員会によって承認された。ＩＶＤ変性のモデルは以前確立された方法の改変によって作り出された（Ｏ．Ｍｉｚｒａｈｉ，Ｄ．Ｓｈｅｙｎ，Ｗ．Ｔａｗａｃｋｏｌｉ，Ｓ．Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｓｕ，Ｎ．Ｌｉ，Ａ．Ｏｈ，Ｈ．Ｂａｅ，Ｄ．Ｇａｚｉｔ，Ｚ．Ｇａｚｉｔ，Ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ１３，８０３－８１４（２０１３））。１８時間の術前絶食に続いて、各ミニブタを筋肉内アセプロマジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びアトロピン（０．０２～０．０５ｍｇ／ｋｇ）を用いて鎮静した。次いで、動物にプロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、気管内挿管を行った。処置の間中、１～３．５％の吸入イソフルランを用いて麻酔を維持した。ＩＶＤ変性を誘導するために、髄核吸引またはアポトーシス剤の注入に比べてそれが最も信頼でき且つ再現性がある方法であることが見いだされているので、線維輪に単一の損傷を作った（Ｋ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｊ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｃ．Ｈｕｔｔｏｎ，Ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ： ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｏｕｒ ｄｉｓｃ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）３０，３３－３７（２００５））。蛍光透視鏡の誘導のもとで、１４ＧのＶｅｒｔｅｐｏｒｔの針（Ｓｔｒｙｋｅｒ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を用いて後側部のアプローチを介して運動終板に平行にＩＶＤの線維輪に侵入し、損傷させた。４つの標的レベル：Ｌ１／Ｌ２、Ｌ２／Ｌ３、Ｌ３／Ｌ４及びＬ４／Ｌ５にてこの処置を繰り返した。
動物の処置はすべてＣｅｄａｒｓ－Ｓｉｎａｉメディカルセンターの施設内動物実験委員会によって承認された。ＩＶＤ変性のモデルは以前確立された方法の改変によって作り出された（Ｏ．Ｍｉｚｒａｈｉ，Ｄ．Ｓｈｅｙｎ，Ｗ．Ｔａｗａｃｋｏｌｉ，Ｓ．Ｂｅｎ－Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｓｕ，Ｎ．Ｌｉ，Ａ．Ｏｈ，Ｈ．Ｂａｅ，Ｄ．Ｇａｚｉｔ，Ｚ．Ｇａｚｉｔ，Ｎｕｃｌｅｕｓ ｐｕｌｐｏｓｕｓ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｌｔｅｒｓ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ１３，８０３－８１４（２０１３））。１８時間の術前絶食に続いて、各ミニブタを筋肉内アセプロマジン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）、ケタミン（２０ｍｇ／ｋｇ）及びアトロピン（０．０２～０．０５ｍｇ／ｋｇ）を用いて鎮静した。次いで、動物にプロポフォール（２ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与し、気管内挿管を行った。処置の間中、１～３．５％の吸入イソフルランを用いて麻酔を維持した。ＩＶＤ変性を誘導するために、髄核吸引またはアポトーシス剤の注入に比べてそれが最も信頼でき且つ再現性がある方法であることが見いだされているので、線維輪に単一の損傷を作った（Ｋ．Ｓ．Ｋｉｍ，Ｓ．Ｔ．Ｙｏｏｎ，Ｊ．Ｌｉ，Ｊ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｃ．Ｈｕｔｔｏｎ，Ｄｉｓｃ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ： ａ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｆｏｕｒ ｄｉｓｃ ｉｎｊｕｒｙ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）３０，３３－３７（２００５））。蛍光透視鏡の誘導のもとで、１４ＧのＶｅｒｔｅｐｏｒｔの針（Ｓｔｒｙｋｅｒ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，ＭＩ）を用いて後側部のアプローチを介して運動終板に平行にＩＶＤの線維輪に侵入し、損傷させた。４つの標的レベル：Ｌ１／Ｌ２、Ｌ２／Ｌ３、Ｌ３／Ｌ４及びＬ４／Ｌ５にてこの処置を繰り返した。
【0164】
生体内ＭＲＩ
イメージング実験は３Ｔ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン（１％～３．５％）によって維持した。
イメージング実験は３Ｔ臨床スキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ Ｖｅｒｉｏ；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で行った。後面棘突起を中心として巻き付けられたボディアレイコイルと共に動物を右臥位で置いた。イメージング手順の全体を通して麻酔はイソフルラン（１％～３．５％）によって維持した。
【0165】
ＣＥＳＴ ＭＲＩは、二次元縮小視野ＴＳＥ ＣＥＳＴシーケンス（ＴＲ／ＴＥ １／４ １０，５００／１０ｍｓ、２平均、単一ショット）を用いて行った。各ＩＶＤについて、画像は、３ｍｍのスライス厚、１４０×４０ｍｍ２の視野、及び１．１×１．１ｍｍ２の空間分解能で軸平面にて取得した。ＣＥＳＴ飽和モジュールは、各パルスについて持続時間ｔｐ＝８０ｍｓ、ならびに飽和フリップ角９００°、１５００°、２１００°及び３０００°（Ｂ１振幅＝フリップ角／（ｇｔｐ）＝０．７３、１．２２、１．７１及び２．４５μＴ）でのパルス間遅延ｔｄ＝８０ｍｓ（デューティサイクル＝５０％、合計飽和持続時間Ｔｓ＝６２４０ｍｓ）を伴う３９のガウス形状のパルスから成る；Ｚスペクトルは±１．６ｐｐｍ、±１．３ｐｐｍ、±１．０ｐｐｍ、±０．７ｐｐｍ及び±０．４ｐｐｍでの１０の異なる飽和頻度で取得した。各ＩＶＤについてのＣＥＳＴ実験の走査時間はおよそ４０分だった。Ｂ０電界は水飽和シフト参照（ＷＡＳＳＲ）マップを用いて修正した。
【0166】
Ｔ１マッピングは、７つの変化するＴＩ（５０、１５０、３５０、７００、１０５０、１４００、及び２０００ｍｓ）による反転回復ＴＳＥシーケンスを用いて行った。他のイメージングパラメータは、ＴＲ／ＴＥ＝６０００／１２ｍｓ；ＦＯＶ＝２８０×２８０ｍｍ２；空間分解能＝１．１×１．１×３ｍｍ３である。
【0167】
Ｔ２マッピングは、変化するエコー遅延（ＴＥ＝１２、２５、５０、９９、１９９及び３９７ｍｓ；ＴＲ＝６０００ｍｓ）によるＴＳＥシーケンスを用いて行った。他のイメージングパラメータは、ＴＲ＝６０００ｍｓ；ＦＯＶ＝２８０×２８０ｍｍ２；空間分解能＝１．１×１．１×３ｍｍ３である。
【0168】
Ｔ１ρマッピングは、変化するスピンロック時間（ＴＳＬ＝０、１０、４０及び８０ｍｓ）によるｒＦＯＶ ＴＳＥシーケンスを用いて行った。スピンロック周波数は３００Ｈｚである。他のイメージングパラメータは、ＴＲ／ＴＥ＝３５００／９．１ｍｓ；１平均；ＦＯＶ＝１４０×４０ｍｍ２；空間分解能＝１．１×１．１×３ｍｍ３である。イメージングのデータ解析はＭＡＴＬＡＢにおける特注のプログラムで行った（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）。
【0169】
ＩＶＤのｐＨ測定
ＩＶＤ内部のｐＨの測定は動物の屠殺の直後に行った。脊椎を外科的に露出し、線維輪の細かく切った切開を介して損傷したＩＶＤの髄核に特注の針状の組織ｐＨプローブ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｍｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を挿入した。
ＩＶＤ内部のｐＨの測定は動物の屠殺の直後に行った。脊椎を外科的に露出し、線維輪の細かく切った切開を介して損傷したＩＶＤの髄核に特注の針状の組織ｐＨプローブ（Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｍｄｅｎ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を挿入した。
【0170】
遺伝子発現の解析
変性の２、６及び１０週後に採取した変性したＩＶＤにて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。変性ＩＶＤに由来する遺伝子発現を各時点で採取した健常ＩＶＤと比較した。製造元のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて線維輪及び髄核から全ＲＮＡを抽出した。無作為プライマー及び逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ ７５００ Ｐｒｉｓｍシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の助けを借りて定量的なリアルタイムＰＣＲを行った。調べたブタの遺伝子は、疼痛マーカーの上方調節を検出するためのブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１；Ｓｓ０３３８９８０４＿ｓ１，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ；Ｓｓ０３３８６４３２＿ｕＨ）及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ；Ｓｓ０４２４７８８１＿ｇ１）、炎症反応を調べるためのインターロイキン－６（ＩＬ－６；Ｓｓ０３３８４６０４＿ｕ１）ならびに神経の成長を判定するための脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｓｓ０３８２２３３５＿ｓ１）であった。１８ｓをハウスキーピング遺伝子対照として使用した。
変性の２、６及び１０週後に採取した変性したＩＶＤにて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。変性ＩＶＤに由来する遺伝子発現を各時点で採取した健常ＩＶＤと比較した。製造元のプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて線維輪及び髄核から全ＲＮＡを抽出した。無作為プライマー及び逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いてＲＮＡを逆転写した。ＡＢＩ ７５００ Ｐｒｉｓｍシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の助けを借りて定量的なリアルタイムＰＣＲを行った。調べたブタの遺伝子は、疼痛マーカーの上方調節を検出するためのブラジキニン受容体Ｂ１（ＢＤＫＲＢ１；Ｓｓ０３３８９８０４＿ｓ１，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ；Ｓｓ０３３８６４３２＿ｕＨ）及びカテコール－０－メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ；Ｓｓ０４２４７８８１＿ｇ１）、炎症反応を調べるためのインターロイキン－６（ＩＬ－６；Ｓｓ０３３８４６０４＿ｕ１）ならびに神経の成長を判定するための脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ；Ｓｓ０３８２２３３５＿ｓ１）であった。１８ｓをハウスキーピング遺伝子対照として使用した。
【0171】
組織学的解析及び免疫蛍光イメージング
変性の２、６及び１０週後に採取した変性したＩＶＤにて組織学的解析を行った。ＩＶＤを切片にし、以前記載された（Ｄ．Ｓｈｅｙｎ，Ｄ．Ｃｏｈｎ Ｙａｋｕｂｏｖｉｃｈ，Ｉ．Ｋａｌｌａｉ，Ｓ．Ｓｕ，Ｘ．Ｄａ，Ｇ．Ｐｅｌｌｅｄ，Ｗ．Ｔａｗａｃｋｏｌｉ，Ｇ．Ｃｏｏｋ－Ｗｅｉｎｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｇａｚｉｔ，Ｚ．Ｇａｚｉｔ，ＰＴＨ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｌｖａｒｉａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１０，４４６２－４４７１（２０１３）ように形態的解析のためにヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。免疫蛍光染色については、組織を脱パラフィン処理し、３７℃で４５分間の予備加熱したＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）におけるインキュベートによって抗原を検索した。ブロッキング無血清溶液（Ｄａｋｏ）を適用することによって非特異的な抗原をブロックした。ＢＤＫＲＢ１、ＣＧＲＰ、ＣＯＭＴ、ＩＬ－６及びＢＤＮＦに対する一次抗体でスライドを染色した。一次抗体をスライドに塗布し、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳを用いて洗い流し、スライドを二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、その後、それをＰＢＳで洗い流した（表Ｓ１）。次いでスライドを暗所にて４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（１μｇ／ｍｌ）で５分間染色し、その後再びそれをＰＢＳで３回洗浄した。ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を組織に適用した。×２０倍率、ｚ－スタッキング及び５×５のタイル走査での４チャンネルレーザー走査顕微鏡７８０（Ｚｅｉｓｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いてスライドを画像化した。ズームイン画像については、単一のｚ－スタック画像を生成した。試料はすべて同じゲイン及び露出の設定を用いて走査した。
変性の２、６及び１０週後に採取した変性したＩＶＤにて組織学的解析を行った。ＩＶＤを切片にし、以前記載された（Ｄ．Ｓｈｅｙｎ，Ｄ．Ｃｏｈｎ Ｙａｋｕｂｏｖｉｃｈ，Ｉ．Ｋａｌｌａｉ，Ｓ．Ｓｕ，Ｘ．Ｄａ，Ｇ．Ｐｅｌｌｅｄ，Ｗ．Ｔａｗａｃｋｏｌｉ，Ｇ．Ｃｏｏｋ－Ｗｅｉｎｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｄ．Ｇａｚｉｔ，Ｚ．Ｇａｚｉｔ，ＰＴＨ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｃａｌｖａｒｉａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１０，４４６２－４４７１（２０１３）ように形態的解析のためにヘマトキシリン及びエオシンを用いて染色した。免疫蛍光染色については、組織を脱パラフィン処理し、３７℃で４５分間の予備加熱したＴａｒｇｅｔ Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）におけるインキュベートによって抗原を検索した。ブロッキング無血清溶液（Ｄａｋｏ）を適用することによって非特異的な抗原をブロックした。ＢＤＫＲＢ１、ＣＧＲＰ、ＣＯＭＴ、ＩＬ－６及びＢＤＮＦに対する一次抗体でスライドを染色した。一次抗体をスライドに塗布し、４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳを用いて洗い流し、スライドを二次抗体と共に室温で１時間インキュベートし、その後、それをＰＢＳで洗い流した（表Ｓ１）。次いでスライドを暗所にて４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール二塩酸塩（１μｇ／ｍｌ）で５分間染色し、その後再びそれをＰＢＳで３回洗浄した。ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を組織に適用した。×２０倍率、ｚ－スタッキング及び５×５のタイル走査での４チャンネルレーザー走査顕微鏡７８０（Ｚｅｉｓｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いてスライドを画像化した。ズームイン画像については、単一のｚ－スタック画像を生成した。試料はすべて同じゲイン及び露出の設定を用いて走査した。
【0172】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ｆソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてデータを解析した。データ解析はＴｕｋｅｙの多重比較事後検定と共に一元配置または二元配置のＡＮＯＶＡを用いて行った。結果は平均値±ＳＥとして提示する。箱髭図では、中央値を横線で示し、箱は２５番目の１００分位数から７５番目の１００分位数まで広がり、髭は最小値から最大値まで広がる。ｑＣＥＳＴとｐＨ値の間でピアソン相関を行った。ｑＣＥＳＴについてＲＯＣ曲線を生成し、曲線下面積を算出した。０．０５未満であるＰ値を統計的に有意であると見なした。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０ｆソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてデータを解析した。データ解析はＴｕｋｅｙの多重比較事後検定と共に一元配置または二元配置のＡＮＯＶＡを用いて行った。結果は平均値±ＳＥとして提示する。箱髭図では、中央値を横線で示し、箱は２５番目の１００分位数から７５番目の１００分位数まで広がり、髭は最小値から最大値まで広がる。ｑＣＥＳＴとｐＨ値の間でピアソン相関を行った。ｑＣＥＳＴについてＲＯＣ曲線を生成し、曲線下面積を算出した。０．０５未満であるＰ値を統計的に有意であると見なした。
【0173】
（表Ｓ１）試験の全体を通して免疫蛍光法に使用された抗体
*Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃから購入した。
【0174】
上記に記載されている種々の方法及び技法は本出願を実施するための多数の手段を提供している。当然、記載されている目的及び利点の必ずしもすべてが本明細書に記載されている特定の実施形態に従って達成することができるわけではないことが理解されるべきである。従って、たとえば、当業者は、本明細書で開示されているまたは示唆されているような他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で開示されているような利点の１つまたは利点の群を達成するまたは最適化するやり方で方法を実施することができることを認識するであろう。種々の代替が本明細書で言及されている。一部の好まれる実施形態が具体的に１つ、もう１つ、または幾つかの特徴を含む一方で、他は具体的に１つ、もう１つ、または幾つかの特徴を排除する一方で、さらに他は１つ、もう１つ、または幾つかの有利な特徴の包含によって特定の特徴を軽減することが理解されるべきである。
【0175】
さらに、当業者は様々な実施形態に由来する種々の特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記で考察された種々の要素、特徴及び工程と同様にそのような要素、特徴及び工程それぞれについての他の既知の同等物がこの当該技術の当業者によって種々の君合わせで採用されて本明細書に記載されている原理に従って方法を実施することができる。種々の要素、特徴及び工程の中で、多様な実施形態にて一部が具体的に含まれ、他は具体的に排除されるであろう。
【0176】
本出願は特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されているが、本出願の実施形態は具体的に開示された実施形態を超えて他の代替の実施形態及び／またはその使用及び改変及び同等物に拡大することが当業者によって理解されるであろう。
【0177】
本出願を実施するための本発明者らに既知の最良の方法を含む本出願の好まれる実施形態が本明細書に記載されている。それら好まれる実施形態における変化は前述の記載を読んだ際、当業者に明らかになるであろう。当業者は適宜そのような変化を採用することができることが熟考され、本出願は本明細書に具体的に記載されている以外に実践することができる。従って、本出願の多数の実施形態は、適用法令で認められているように本明細書に添付されている特許請求の範囲で引用されている主題の改変及び同等物すべてを含む。さらに、考えられるその変化すべてにおける上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書で指示されない限りまたは文脈によって明瞭に矛盾しない限り、本出願によって包含される。
【0178】
本明細書で参照される特許、特許出願、特許出願の出版物、及びたとえば、論文、書籍、明細書、出版物、文書、物、等のような他の物質すべては、本文書と一致しないまたは矛盾するそれら、それらのいずれかに、または本文書に今または後で関連する特許請求の範囲の最も広い範囲に関して制限する影響を有し得るそれらのいずれかに関連する審査出願経歴を除いて、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。例として、組み入れられた物質のいずれかに関連し、且つ本文書に関連する用語の記載、定義及び／または使用の間で不一致または矛盾がある場合、本文書における用語の記載、定義及び／または使用が優先すべきである。
【0179】
本明細書で開示されている本出願の実施形態は本出願の実施形態の原理を説明するのに役立つことが理解されるべきである。採用することができる他の改変は本出願の範囲内にあることができる。従って、例として、しかし、限定ではなく、本出願の実施形態の代替の構成は本明細書での開示に従って利用することができる。従って、本出願の実施形態は正確に示され、記載されているものに限定されない。
【0180】
本発明の種々の実施形態は詳細な説明にて上記で記載されている。これらの記載が上記の実施形態を直接記載する一方で、当業者は、本明細書で示され、記載されている具体的な実施形態に対する改変及び／または変異を思い付いてもよいことが理解される。この記載の範囲の中に入る任意のそのような改変または変化は同様にその中に含まれるように意図される。具体的に言及されない限り、本明細書及び特許請求の範囲における単語及び語句には適用できる技術分野（複数可）の当業者にとって普通で且つ習慣的な意味が与えられることは本発明者らの意図である。
【0181】
本出願を出願するこの時期に出願者に知られている本発明の種々の実施形態の前述の記載が提示されており、説明及び記載を目的とする。本記載は、開示されている正確な形態に徹底的であることも、または本発明をそれに限定することも目的とせず、多数の改変及び変化が上記開示の観点で可能である。記載されている実施形態は、本発明の原理及びその実践的な応用を説明するのに役立ち、他の当業者が種々の実施形態で及び熟考される特定の使用に合うような種々の改変と共に本発明を利用するのを可能にするのに役立つ。従って、本発明は、本発明を実施するために開示されている特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【0182】
本発明の特定の実施形態が示され、記載されている一方で、本明細書の開示に基づいて、本発明及びそのさらに広い態様を逸脱することなく変更及び改変が行われてもよいので、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲の範囲内にあるようにそのような変更及び改変のすべてをその範囲内に包含するべきであることは当業者に明らかであろう。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】