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特許7038782高速かつ効率的にインビトロ増幅ヒト間葉系幹細胞的方法および使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-10
(45)【発行日】2022-03-18
(54)【発明の名称】高速かつ効率的にインビトロ増幅ヒト間葉系幹細胞的方法および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0775 20100101AFI20220311BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20220311BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0775
C12N5/078
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2020180939
(22)【出願日】2020-10-28
(65)【公開番号】P2022035914
(43)【公開日】2022-03-04
【審査請求日】2020-10-28
(31)【優先権主張番号】202010846476.2
(32)【優先日】2020-08-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】520422566
【氏名又は名称】遵義医科大学附属医院
(74)【代理人】
【識別番号】100205936
【弁理士】
【氏名又は名称】崔 海龍
(74)【代理人】
【識別番号】100132805
【弁理士】
【氏名又は名称】河合 貴之
(72)【発明者】
【氏名】肖 建輝
(72)【発明者】
【氏名】羅 ▲ゆう▼
(72)【発明者】
【氏名】鍾 建江
(72)【発明者】
【氏名】余 昌胤
【審査官】山本 晋也
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１９／０００２８３２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５１６７９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５２３９３４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５１１８７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００７－５３０５４３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５０７９４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１４－５１０１５３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１４０３１５（ＷＯ，Ａ２）
【文献】Kristina V. Kitaeva et al.，BioNanoScience，2019年03月15日，Vol. 9，p. 502-509
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ１２Ｑ
Ａ６１Ｋ
Ｇ０１Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト末梢血免疫細胞を用いてヒト間葉系幹細胞の増殖を促進するヒト間葉系幹細胞の高速かつ効率的なインビトロ増幅方法であって、 ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞とを共培養し、
ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞とを共培養するときの細胞数の比率は３００：１である、ことを特徴とする、方法。
【請求項2】
前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血単核細胞、ヒト末梢血単球、またはヒト末梢血リンパ球である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト末梢血リンパ球である、ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞の共培養方法は、接触共培養または非接触共培養である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ヒト末梢血免疫細胞とヒト間葉系幹細胞の共培養方法は、接触共培養である、ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項6】
ヒト末梢血免疫細胞は、ドナーの年齢により制限されない、ことを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ヒト末梢血免疫細胞は、ヒト間葉系幹細胞の生物学的特性を維持し、幹細胞マーカーおよび増殖細胞核抗原の発現を促進し、その遊走能力、増殖能力、自己更新および分化能力を顕著に増強させることができる、ことを特徴とする請求項１から６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、幹細胞および再生医療分野に属し、ヒト間葉系幹細胞を高速かつ効率的にインビトロ増幅する方法および使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒト間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）は、多方向分化、免疫調節、組織再生修復促進などの優れた機能特性を有するとともに、低免疫原性、非腫瘍形成性などの優位性を有するため、様々な治療困難な病気、例えば、心血管疾患（Ｍｉｃｒｏ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１７；２４（１））、糖尿病（Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７；４４：１９１－１９６）、神経系疾患（Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１３，７：１６９－８２．）および悪性腫瘍（Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２００８；１８：５００－５０７．）の治療において幹細胞治療に適用できる最も有望な資源であると考えられている。２０１８まで、７００を超えるヒトＭＳＣ治療臨床試験（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）が世界中で承認されており、数百の疾患が関係している。１９９５年に最初のヒトＭＳＣ臨床試験が実施されて以来、大規模な臨床応用の成功例はなかった。ヒトＭＳＣの臨床応用に関連する主要な基本的な科学的問題と主要な技術はまだ解決されていないためである。例えば、細胞の数と質は、ヒトＭＳＣの臨床応用にとって根本的で基本的な問題である。ヒト組織由来のＭＳＣの数は限られており、臨床治療に必要な細胞数の要求を満たすことは困難であるため、ヒトＭＳＣのインビトロ増幅再生医療の分野で大きな問題となっている。近年、バイオテクノロジーの急速な発展に伴い、培養条件の改善、バイオリアクター、マイクロキャリア、足場などの２Ｄおよび３ＤテクノロジーによるヒトＭＳＣの増幅により、基本的にヒトＭＳＣ細胞の数が限られているという問題が解決された（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２０１９；３：９０－１０４）。しかしながら、ヒトＭＳＣの長期継代培養およびインビトロ増幅過程において、環境ストレスおよび生理的要因による細胞形態の異常、遺伝子タンパク質発現プロファイルの変化および細胞老化により、ヒトＭＳＣ細胞表面マーカー、幹細胞マーカー、免疫調節能力、遊走およびホーミング能力、自己更新能力、多方向分化潜在能力などの生物学的特性の進行性喪失が引き起こされ、増幅により得られた細胞の品質が大きな影響を受け、臨床治療効果に大きい影響を与えることで、従来のインビトロ増幅技術により得られたヒトＭＳＣは科学研究および臨床応用において大幅に制限されている。
【0003】
そこで、科学者らは、ヒトＭＳＣインビトロ増殖細胞の品質を改善するために多くの研究を行い、一連のインビトロ増殖方法を提案した。例えば、レーザー照射による培養液の前処理、外因性サイトカインおよび細胞外マトリックスの添加（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１２；３３：４４８０－９；ＦＡＳＥＢ Ｊ．２０１１；２５：１４７４－８５）、天然小分子化合物処理（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１６；６：１８９９－１９１７．）、並びに遺伝子工学など（Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５１：１４１－６．）は、既にＭＳＣ長期増幅後の幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）および機能の維持および強化に用いられている。しかし、これらの方法に固有の設計上の多くの欠陥は、臨床応用を制限する。例えば、外因性サイトカインおよび細胞外マトリックスは継続的な作用を必要とし、その結果、効率が低く、コストが高くなる。遺伝子組換えによるＭＳＣには、突然変異または奇形の潜在的なリスクがある（Ｊ Ｔｈｏｒａｃ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｓｕｒｇ．２００８；１３６：１３８８－９．）。そのため、インビトロで増幅された後のヒトＭＳＣの機能と安全性を維持または強化するためのより効果的で信頼性の高い方法を開発する必要がある。
【0004】
炎症は多くの慢性および退行性疾患の基礎であり、体の重要な防御反応でもある。また、炎症中に生成される様々なサイトカインは、再生プロセスを調節し、損傷した細胞を除去し、組織修復を開始することができ、組織細胞再生の重要な推進要因である。例えば、腸内では、活性化されたた免疫細胞は、多くの炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７などを含む）を産生し、腸幹細胞の増殖および分化を調節することにより腸細胞の再生反応を制御することができる。さらに、炎症性サイトカインの産生は、腸粘膜細胞が損傷した後、その修復再生障碍によって引き起こされた壊死性腸炎を防ぐことができる（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１，３６４：２５５－６４；Ｃｅｌｌ．２００４，２３；１１８：２２９－４１．）。これは、炎症と組織再生の間に密接な関係があることを示している。近年、大量の証拠により、生体の微小環境はヒトＭＳＣの臨床的有効性を決定する重要な要因の一つであることを示している。炎症性因子（ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β）の前処理は、ＭＳＣがサイトカイン（ＩＬ－１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ－ＣＳＦ）を分泌することを促進し、その免疫調節能力を向上できることが証明されている（Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；９：４７３－８１；Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１７；１９：１８１－１９３）。また、ＭＳＣ免疫調節能力はその幹細胞性特徴に関係がある。Ｓｈｕａｉらによって、メラトニンはインビトロ増幅過程におけるラット骨髄ＭＳＣの幹細胞性の喪失を効果的に防止することにより、そのインビボ免疫治療の効果を維持することが証明されている（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１６，６：１８９９－１９１７．）。これは、ＭＳＣのインビトロ増幅培養の過程において、適切な炎症性微小環境が幹細胞性の喪失を防止し、さらには幹細胞性を高めるための潜在的な手段であることを示唆している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
現在のインビトロ増幅のヒトＭＳＣの存在数が不足であり、品質が悪く、臨床効果が限られたなどの問題に対して、本発明は、ヒト間葉系幹細胞のインビトロ長期増幅を促進する高速、高効率、安全、操作可能な方法を提供することを目的とする。この方法によれば、品質が高く、安全で効果的なヒト間葉系幹細胞が得られる。
【課題を解決するための手段】
【0006】
上述した目的を達成するために、本発明では、ヒトＭＳＣとヒト末梢血免疫細胞（例えばＰＢＭＣ、またはＰＢＭＣから分離されたＰＢＭおよびＰＢＬ）とを共培養する。実験データは、免疫細胞がいずれもヒトＭＳＣ増殖を促進することができ、増殖促進効果がＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであることを示している。
【0007】
本発明に記載のヒト間葉系幹細胞は、健康、満期で帝王切開で出産した女性に由来する新鮮な臍帯、羊膜、臍帯血から分離して得られたものであり、臍帯間葉系幹細胞、羊膜間葉系幹細胞および臍帯血間葉系幹細胞を含む。
【0008】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞は、正常に身体検査を受けたヒトの末梢血から採取し、密度勾配遠心分離法により分離してＰＢＭＣを取得し、さらにＰＢＭがプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭＣからＰＢＭおよびＰＢＬを分離する。
【0009】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＭＣとヒトＭＳＣとの共培養細胞比率は１：１－４００：１であり、３００：１である場合の増幅効果が最も高い。
【0010】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＭＣとヒトＭＳＣとの共培養方式は、接触共培養および非接触共培養を含み、接触共培養の効果が最も高い。
【0011】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＭＣの由来源は年齢に制限されず、ヒトＭＳＣとの接触共培養によりいずれも良好な増幅効果が得られ、異なる年齢群間で統計的な差異がない。
【0012】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの長期接触共培養により得られた細胞数は、通常培養方法の１０倍以上である。
【0013】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により、ヒトＭＳＣ幹細胞性マーカーＯｃｔ４の発現は顕著に向上する。
【0014】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により、ヒトＭＳＣの増殖能力が顕著に向上し、ヒトＭＳＣ増殖細胞核抗原ＰＣＮＡの発現が促進される。
【0015】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により、ヒトＭＳＣの遊走能力が向上し、スクラッチテストにおいて遊走細胞数が顕著に増加する。
【0016】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により、ヒトＭＳＣの自己更新能力が向上し、ヒトＭＳＣクローンの形成が顕著に促進される。
【0017】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により、ヒトＭＳＣの多方向分化（骨形成細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への分化を含む）能力が顕著に向上する。。
【0018】
本発明に記載のヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬとヒトＭＳＣとの接触共培養により得られたヒトＭＳＣは、疾患モデルに対して免疫拒絶反応が発生せず、安全で有効である。
【発明の効果】
【0019】
本発明で増幅するヒトＭＳＣは潰瘍性結腸炎マウスモデルの治療に適用でき、効果が顕著で、免疫拒絶反応が発生しない。さらに、異なる年齢ドナーに由来のＰＢＭＣはヒトＭＳＣ共培養によるインビトロ増幅に適用でき、統計的な差異がない。これは、被験体自身の末梢血免疫細胞を用いてＭＳＣを増幅することができる。したがって、本発明でインビトロ増幅したヒトＭＳＣ細胞の品質が高く、治療効果が高い。特に、被験体自身の末梢血免疫細胞を用いて増幅することにより、潜在的な免疫拒絶リスクと回避され、より安全であり、臨床には大きな応用の見通しがある。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ヒトＭＳＣの表現型同定（ヒト羊膜ＭＳＣを例とする）である。図１Ａは、フローサイトメトリーによる表面分子マーカーの検出である。図１Ｂは、免疫細胞化学染色によるビメンチンおよびケラチンＣＫ１９の検出である。
【図2】ＭＳＣ増殖能力に対するヒトＰＢＭＣとヒトＭＳＣの異なる細胞比率での接触共培養の影響のＥＤＵ測定である。
【図3】ＭＳＣ増殖能力に対するヒトＰＢＭＣとヒトＭＳＣとの異なる共培養方式（接触または非接触）の影響のＥＤＵ測定である。
【図4】ＭＳＣ増殖能力に対する異なる年齢ドーナーに由来のＰＢＭＣとヒトＭＳＣの接触共培養の影響のＥＤＵ測定である。
【図5】ＭＳＣ増殖能力に対するヒト末梢血中の異なる免疫細胞（ＰＢＭＣおよびその末梢血単球（ＰＢＭ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む）のそれぞれとヒトＭＳＣの接触共培養の影響のＥＤＵ測定である。
【図6】ＭＳＣ増殖能力に対するＰＢＬと異なる組織（臍帯）に由来のヒトＭＳＣとの接触共培養の影響のＥＤＵ測定である。
【図7】ＭＳＣ増殖能力に対するＰＢＬと異なる組織（臍帯血）に由来のヒトＭＳＣとの接触共培養の影響のＥＤＵ測定である。
【図8】ヒトＭＳＣ増幅細胞数に対するＰＢＬとヒトＭＳＣとの長期接触共培養および１２日間の通常方法培養の影響である。
【図9】ヒトＭＳＣ中の幹細胞性因子Ｏｃｔ４および増殖細胞核抗原ＰＣＮＡの発現に対するＰＢＬとヒトＭＳＣの接触共培養の影響のｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ測定である。
【図10】ヒトＭＳＣクローン形成に対する９日間のＰＢＬとヒトＭＳＣの接触共培養および通常方法培養の影響である。
【図11】ヒトＭＳＣの骨形成、軟骨および脂肪細胞への分化に対するＰＢＬとヒトＭＳＣの接触共培養および通常培養方法の影響である。
【図12】ヒトＭＳＣ遊走能力に対するＰＢＬとヒトＭＳＣの共培養および通常培養方法の影響のスクラッチテストによる測定である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本発明の実施をより十分に説明し、本発明の目的、技術的手段および利点をより明確にするために、以下、図面および実施例により本発明の技術的手段をさらに詳しく説明する。異なる組織由来のＭＳＣは結果に影響を与えない（実施例７を参照）。本実施例では、主にヒト羊膜ＭＳＣを用いて説明する。理解できるように、ここで説明する具体的な実施例は、本発明の実施を解釈するものに過ぎず、本発明を制限するものではない。また、本発明の実施計画は、遵義医学院付属病院論理委員会の審査に合格した（論理審査番号：ＫＬＬＹ－２０１７－００３）。
【0022】
炎症と組織再生との関係、およびＭＳＣ特性と機能に対する炎症性サイトカインの影響に基づいて、本発明者は、ヒトＭＳＣとヒト末梢血中の免疫細胞（末梢血単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）およびＰＢＭＣから分離した単球（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ，ＰＢＭ）およびリンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，ＰＢＬ））とを共培養することにより、これらの免疫細胞、特にＰＢＬがヒトＭＳＣの増幅を顕著に促進することができ、増殖した細胞の生物学的特性が変わらず、幹細胞性特徴、ホーミング遊走能力、増殖能力、自己更新および多方向分化能力がいずれも顕著に増強されることを発見した。
【0023】
＜実施例１＞ヒトＭＳＣの分離培養および同定
満期帝王切開により得られた健康で新鮮な胎盤から羊膜組織を剥離し、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（最終濃度はペニシリン：１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００ＩＵ／ｍＬ、使用直前に調製）を含むＤ－ＰＢＳ溶液で残留血痕および粘液を繰り返し洗浄した。約１ｃｍ２のサイズで羊膜を切った後、５０ｍＬ遠心管に分注し、羊膜組織体積の約２倍の０．０２％ＥＤＴＡ－２Ｎａ含有０．０５％トリプシン消化液を加え、３７°Ｃ恒温水槽において１８５ｒｐｍで約３０分間回転消化し、３００メッシュのステンレス鋼濾過網で濾過し、上清を捨て、上記ステップを１回繰り返した。消化後の羊膜組織を１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤ－ＰＢＳ液で１回洗浄し、等体積の０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含む０．５ｍｇ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ消化液を加え、３７°Ｃ、１９０ｒｐｍで１～１．５時間回転消化することで羊膜破片を完全に綿状に消化し、３００メッシュの篩網で濾過し、細胞濾液を収集し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿はヒト羊膜ＭＳＣ（ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＡ－ＭＳＣ）であった。１０％ＦＢＳを含む低糖ＤＭＥＭ完全培地で細胞を再懸濁し、Ｔ７５細胞培養フラスコに接種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２、８５－１００％空気、飽和湿度の条件下で恒温培養し、細胞コンフルエンスが８０％以上に達した後、継代培養を行い、第３継代（Ｐ３）細胞を収集し、実験に用いた。また、組織ブロック付着法により新鮮なヒト臍帯組織からヒト臍帯ＭＳＣを分離し、密度勾配遠心分離法により新鮮なヒト臍帯血からヒト臍帯血ＭＳＣを分離した。得られたＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４およびＣＤ２９などの間葉細胞表面分子を高発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＨＬＡ－ＤＲなどの造血幹細胞マーカー並びにＭＨＣクラスＩＩ細胞表面分子を発現しなかった（図１Ａ）。免疫細胞化学染色法により検出した結果、この細胞は間葉細胞マーカーであるビメンチンを高発現し、上皮細胞マーカーであるケラチンＣＫ１９を発現せず（図１Ｂ）、典型的な間葉細胞の表現型を有する。
満期帝王切開により得られた健康で新鮮な胎盤から羊膜組織を剥離し、１％ペニシリン・ストレプトマイシン（最終濃度はペニシリン：１００ＩＵ／ｍＬ、ストレプトマイシン：１００ＩＵ／ｍＬ、使用直前に調製）を含むＤ－ＰＢＳ溶液で残留血痕および粘液を繰り返し洗浄した。約１ｃｍ２のサイズで羊膜を切った後、５０ｍＬ遠心管に分注し、羊膜組織体積の約２倍の０．０２％ＥＤＴＡ－２Ｎａ含有０．０５％トリプシン消化液を加え、３７°Ｃ恒温水槽において１８５ｒｐｍで約３０分間回転消化し、３００メッシュのステンレス鋼濾過網で濾過し、上清を捨て、上記ステップを１回繰り返した。消化後の羊膜組織を１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤ－ＰＢＳ液で１回洗浄し、等体積の０．０５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含む０．５ｍｇ／ｍＬのＩＩ型コラゲナーゼ消化液を加え、３７°Ｃ、１９０ｒｐｍで１～１．５時間回転消化することで羊膜破片を完全に綿状に消化し、３００メッシュの篩網で濾過し、細胞濾液を収集し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を捨て、得られた細胞沈殿はヒト羊膜ＭＳＣ（ｈｕｍａｎ ａｍｎｉｏｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＡ－ＭＳＣ）であった。１０％ＦＢＳを含む低糖ＤＭＥＭ完全培地で細胞を再懸濁し、Ｔ７５細胞培養フラスコに接種し、３７°Ｃ、５％ＣＯ２、８５－１００％空気、飽和湿度の条件下で恒温培養し、細胞コンフルエンスが８０％以上に達した後、継代培養を行い、第３継代（Ｐ３）細胞を収集し、実験に用いた。また、組織ブロック付着法により新鮮なヒト臍帯組織からヒト臍帯ＭＳＣを分離し、密度勾配遠心分離法により新鮮なヒト臍帯血からヒト臍帯血ＭＳＣを分離した。得られたＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ４４およびＣＤ２９などの間葉細胞表面分子を高発現し、ＣＤ３４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ４５およびＨＬＡ－ＤＲなどの造血幹細胞マーカー並びにＭＨＣクラスＩＩ細胞表面分子を発現しなかった（図１Ａ）。免疫細胞化学染色法により検出した結果、この細胞は間葉細胞マーカーであるビメンチンを高発現し、上皮細胞マーカーであるケラチンＣＫ１９を発現せず（図１Ｂ）、典型的な間葉細胞の表現型を有する。
【0024】
＜実施例２＞ヒト末梢血から免疫細胞の分離
通常の身体検査を受けている人から新鮮な末梢血を採取し、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した。適量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍＬ遠心管に加え、管壁に沿って等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した血液をゆっくりと加え、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。中間のバフィーコート層を吸い取り、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。滅菌Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、上清を捨て、細胞沈殿物を１０％ＦＢＳ含有低糖ＤＭＥＭ培地で懸濁させ、ＰＢＭＣ免疫細胞を得た。末梢血単球（ＰＢＭ）がプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭおよび末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離されたＰＢＭＣから分離した。
通常の身体検査を受けている人から新鮮な末梢血を採取し、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した。適量のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を１５ｍＬ遠心管に加え、管壁に沿って等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳで希釈した血液をゆっくりと加え、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。中間のバフィーコート層を吸い取り、等体積の滅菌Ｄ－ＰＢＳを加え、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。滅菌Ｄ－ＰＢＳで１回洗浄し、上清を捨て、細胞沈殿物を１０％ＦＢＳ含有低糖ＤＭＥＭ培地で懸濁させ、ＰＢＭＣ免疫細胞を得た。末梢血単球（ＰＢＭ）がプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭおよび末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離されたＰＢＭＣから分離した。
【0025】
＜実施例３＞ヒトＭＳＣ増殖能力に対するＰＢＭＣとヒトＭＳＣの異なる細胞比率での接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。ここで、ＰＢＭＣの密度は、それぞれ３×１０３、３×１０４、３×１０５、６×１０５、９×１０５および１．２×１０６／ウェルであり、共培養されたＰＢＭＣとＭＳＣの細胞比率は、それぞれ１：１、１０：１、１００：１、２００：１、３００：１および４００：１であった。ＰＢＭＣとＭＳＣを４８時間共培養した後、ＥＤＵによりＭＳＣの増殖能力を測定した。結果を図２および表１に示す。通常の方法により培養された正常対照ＭＳＣ群（以下、「ＭＳＣ群」と略す）のＥＤＵ陽性細胞率は（１９．９３±０．６３）％であり、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝１：１または１０：１である場合、ＭＳＣの増殖能力は顕著に増強せず、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝１００：１である場合、ＭＳＣにおけるＥＤＵ陽性細胞率は（１９．９３±０．６３）％から（２６．５５±０．３７）％に増加し、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝３００：１である場合、ＥＤＵ陽性細胞率は（３０．０１±１．６７）％の最大値に達したが、細胞比率が増加し続けると、ＭＳＣの増殖能力は低下し始めた。例えば、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝４００：１である場合、そのＥＤＵ陽性細胞率は（２６．８９±０．９７）％であった。したがって、ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養では、細胞比率が１００：１－４００：１である場合、ＭＳＣの増殖能力が顕著に向上し、そのうち、共培養細胞比率が３００：１である場合、ヒトＭＳＣの増殖能力が最も高く、増殖促進効果が最も高かった。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。ここで、ＰＢＭＣの密度は、それぞれ３×１０３、３×１０４、３×１０５、６×１０５、９×１０５および１．２×１０６／ウェルであり、共培養されたＰＢＭＣとＭＳＣの細胞比率は、それぞれ１：１、１０：１、１００：１、２００：１、３００：１および４００：１であった。ＰＢＭＣとＭＳＣを４８時間共培養した後、ＥＤＵによりＭＳＣの増殖能力を測定した。結果を図２および表１に示す。通常の方法により培養された正常対照ＭＳＣ群（以下、「ＭＳＣ群」と略す）のＥＤＵ陽性細胞率は（１９．９３±０．６３）％であり、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝１：１または１０：１である場合、ＭＳＣの増殖能力は顕著に増強せず、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝１００：１である場合、ＭＳＣにおけるＥＤＵ陽性細胞率は（１９．９３±０．６３）％から（２６．５５±０．３７）％に増加し、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝３００：１である場合、ＥＤＵ陽性細胞率は（３０．０１±１．６７）％の最大値に達したが、細胞比率が増加し続けると、ＭＳＣの増殖能力は低下し始めた。例えば、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ＝４００：１である場合、そのＥＤＵ陽性細胞率は（２６．８９±０．９７）％であった。したがって、ＰＢＭＣとＭＳＣの共培養では、細胞比率が１００：１－４００：１である場合、ＭＳＣの増殖能力が顕著に向上し、そのうち、共培養細胞比率が３００：１である場合、ヒトＭＳＣの増殖能力が最も高く、増殖促進効果が最も高かった。
【0026】
【表1】
【0027】
＜実施例４＞ヒトＭＳＣ増殖能力に対するＰＢＭＣとＭＳＣの異なる共培養方式（接触および非接触）の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０３／ウェルの密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４７０）上室に接種し、下室または上室にそれぞれ１０５個の新たに分離されたＰＢＭＣを加え、ＭＳＣと共培養し、４８時間後に上室を取り出し、ＥＤＵによりＭＳＣ増殖能力を測定した。結果を図３に示す。正常対照ＭＳＣ群のＥＤＵ陽性細胞率は（１２．４３±１．０２）％であり、ＰＢＭＣとＭＳＣの接触および非接触共培養は、いずれもＭＳＣの増殖能力を顕著に向上できるが、接触共培養の方は効果がより高く、接触共培養によるＥＤＵ陽性細胞率は（２６．９７±１．２２）％に達した（表２）。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０３／ウェルの密度でＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３４７０）上室に接種し、下室または上室にそれぞれ１０５個の新たに分離されたＰＢＭＣを加え、ＭＳＣと共培養し、４８時間後に上室を取り出し、ＥＤＵによりＭＳＣ増殖能力を測定した。結果を図３に示す。正常対照ＭＳＣ群のＥＤＵ陽性細胞率は（１２．４３±１．０２）％であり、ＰＢＭＣとＭＳＣの接触および非接触共培養は、いずれもＭＳＣの増殖能力を顕著に向上できるが、接触共培養の方は効果がより高く、接触共培養によるＥＤＵ陽性細胞率は（２６．９７±１．２２）％に達した（表２）。
【0028】
【表2】
【0029】
＜実施例５＞ヒトＭＳＣ増殖能力に対する異なるドナー年齢に由来のＰＢＭＣの影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に異なる年齢帯のドナーから新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。ＭＳＣとＰＢＭＣを４８時間共培養した後、ＥＤＵによりＭＳＣの増殖能力を測定した。結果から分かるように（図４）、正常対照ＭＳＣ群のＥＤＵ陽性細胞率は（１９．８２±３．５８）％であり、ＭＳＣ群に比べ、異なる年齢帯のドナーに由来のＰＢＭＣはいずれもＭＳＣの増殖能力を顕著に増強でき、そのＥＤＵ陽性細胞率の平均値は、（２５．５４±３．０８）％から（２６．８９±５．４８）％であり（表３）、ＭＳＣ増殖に対する異なる年齢帯のドナーに由来のＰＢＭＣの促進効果は、群間で統計的な差異が認められなかった。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に異なる年齢帯のドナーから新たに分離されたＰＢＭＣを加えた。ＭＳＣとＰＢＭＣを４８時間共培養した後、ＥＤＵによりＭＳＣの増殖能力を測定した。結果から分かるように（図４）、正常対照ＭＳＣ群のＥＤＵ陽性細胞率は（１９．８２±３．５８）％であり、ＭＳＣ群に比べ、異なる年齢帯のドナーに由来のＰＢＭＣはいずれもＭＳＣの増殖能力を顕著に増強でき、そのＥＤＵ陽性細胞率の平均値は、（２５．５４±３．０８）％から（２６．８９±５．４８）％であり（表３）、ＭＳＣ増殖に対する異なる年齢帯のドナーに由来のＰＢＭＣの促進効果は、群間で統計的な差異が認められなかった。
【0030】
【表3】
【0031】
＜実施例６＞ＭＳＣ増殖能力に対するヒト末梢血に由来の異なる免疫細胞とヒトＭＳＣの接触共培養の影響
密度勾配遠心分離法により正常ヒト末梢血からＰＢＭＣを分離し、３×１０５／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、２時間後、ＰＢＭがプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭとＰＢＬをＰＢＭＣから分離した。対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度でそれぞれＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬを含む２４ウェル細胞培養プレートに接種し、４８時間共培養した後、顕微鏡でＭＳＣの形態的特徴を観察し、ＥＤＵによりＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬのＭＳＣ増殖能力に対する影響を測定した。結果から分かるように、ＰＢＭＣ、ＰＢＭ、ＰＢＬとＭＳＣを共培養した後、ＭＳＣは長紡錘形で渦状に成長し、細胞密度はＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであった（図５Ａ）。ＥＤＵ実験から分かるように、正常対照ＭＳＣ群は（１８．３１±２．０１）％であり、ＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬとＭＳＣとの共培養は、いずれもＥＤＵ陽性細胞率を異なる程度で向上でき、（２１．３１±１．０４）％から（３５．２１±０．５１）％の範囲内であり（表４）、増殖能力の促進は順にＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであり、ＰＢＬは最適であった（図５Ｂ）。
密度勾配遠心分離法により正常ヒト末梢血からＰＢＭＣを分離し、３×１０５／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、２時間後、ＰＢＭがプラスチック細胞培養プレートに付着して接着成長しやすい特性を利用し、ＰＢＭとＰＢＬをＰＢＭＣから分離した。対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度でそれぞれＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬを含む２４ウェル細胞培養プレートに接種し、４８時間共培養した後、顕微鏡でＭＳＣの形態的特徴を観察し、ＥＤＵによりＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬのＭＳＣ増殖能力に対する影響を測定した。結果から分かるように、ＰＢＭＣ、ＰＢＭ、ＰＢＬとＭＳＣを共培養した後、ＭＳＣは長紡錘形で渦状に成長し、細胞密度はＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであった（図５Ａ）。ＥＤＵ実験から分かるように、正常対照ＭＳＣ群は（１８．３１±２．０１）％であり、ＰＢＭＣ、ＰＢＭおよびＰＢＬとＭＳＣとの共培養は、いずれもＥＤＵ陽性細胞率を異なる程度で向上でき、（２１．３１±１．０４）％から（３５．２１±０．５１）％の範囲内であり（表４）、増殖能力の促進は順にＰＢＬ＞ＰＢＭＣ＞ＰＢＭであり、ＰＢＬは最適であった（図５Ｂ）。
【0032】
【表4】
【0033】
＜実施例７＞ＭＳＣ増殖能力に対するＰＢＬと異なる組織（臍帯および臍帯血）に由来のＭＳＣとの接触共培養の影響
組織ブロック付着法により新鮮な臍帯組織からヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣ－ＭＳＣ）を分離し、別途に密度勾配遠心分離法により新線あ臍帯血からヒト臍帯血間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を分離し、いずれもパンクレアチンを用いて継代培養により純粋化し、第３継代細胞を収集して実験に用いた。対数増殖期にある第３継代のｈＵＣ－ＭＳＣおよびｈＵＣＢ－ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養した後、ＥＤＵによりｈＵＣ－ＭＳＣおよびｈＵＣＢ－ＭＳＣの増殖能力を測定した。結果から分かるように、ＰＢＬとヒト羊膜組織に由来のｈＡ－ＭＳＣとの共培養（図５）と同様に、ＰＢＬとｈＵＣＭＳＣとの接触共培養は、ｈＵＣ－ＭＳＣ増殖を顕著に促進することができる（図６）。同様に、ＰＢＬとｈＵＣＢ－ＭＳＣとの接触共培養は、ｈＵＣＢ－ＭＳＣの増殖も顕著に促進することができる（図７）。したがって、接触共培養によりＭＳＣの増殖能力を増強させるヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬの作用は、ＭＳＣが由来する組織に制限されず、臍帯組織および血液由来のＭＳＣのいずれもに対して顕著な増殖促進効果を奏することができる。以下、主にｈＡ－ＭＳＣを例として他の生物学的特性および機能に対するＰＢＬとの共培養の影響を評価した。
組織ブロック付着法により新鮮な臍帯組織からヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣ－ＭＳＣ）を分離し、別途に密度勾配遠心分離法により新線あ臍帯血からヒト臍帯血間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＢ－ＭＳＣ）を分離し、いずれもパンクレアチンを用いて継代培養により純粋化し、第３継代細胞を収集して実験に用いた。対数増殖期にある第３継代のｈＵＣ－ＭＳＣおよびｈＵＣＢ－ＭＳＣを取り、３×１０３／ウェルの密度で２４ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後に、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養した後、ＥＤＵによりｈＵＣ－ＭＳＣおよびｈＵＣＢ－ＭＳＣの増殖能力を測定した。結果から分かるように、ＰＢＬとヒト羊膜組織に由来のｈＡ－ＭＳＣとの共培養（図５）と同様に、ＰＢＬとｈＵＣＭＳＣとの接触共培養は、ｈＵＣ－ＭＳＣ増殖を顕著に促進することができる（図６）。同様に、ＰＢＬとｈＵＣＢ－ＭＳＣとの接触共培養は、ｈＵＣＢ－ＭＳＣの増殖も顕著に促進することができる（図７）。したがって、接触共培養によりＭＳＣの増殖能力を増強させるヒト末梢血免疫細胞ＰＢＬの作用は、ＭＳＣが由来する組織に制限されず、臍帯組織および血液由来のＭＳＣのいずれもに対して顕著な増殖促進効果を奏することができる。以下、主にｈＡ－ＭＳＣを例として他の生物学的特性および機能に対するＰＢＬとの共培養の影響を評価した。
【0034】
＜実施例８＞ＭＳＣ増幅効果に対するＰＢＬとＭＳＣの長期インビトロ接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０４／皿の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後、新たに分離したＰＢＬを加え、それぞれ共培養の３日、６日、９日および１２日目にクリスタルバイオレットで染色し、撮影して記録した。共培養の６日、９日および１２日目にパンクレアチンで消化した後、遠心分離して細胞を収集し、細胞計数盤で細胞を計数した。共培養の１２日目に細胞総タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルを測定した。結果から分かるように、単独したＭＳＣ増幅に比べ、ＰＢＬとＭＳＣとの接触共培養により３日間増幅したときに、ＭＳＣ細胞数は顕著に増加し始め、６日目に約４倍増加し、９日目に７倍以上増加し、１２日目に細胞数は１０倍以上増加した（表５、図８Ａ、Ｂ）。また、ＰＢＬとＭＳＣを１２時間共培養したときに、ＭＳＣ中の増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルが顕著に増加した（図８Ｃ、Ｄ）。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１０４／皿の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後、新たに分離したＰＢＬを加え、それぞれ共培養の３日、６日、９日および１２日目にクリスタルバイオレットで染色し、撮影して記録した。共培養の６日、９日および１２日目にパンクレアチンで消化した後、遠心分離して細胞を収集し、細胞計数盤で細胞を計数した。共培養の１２日目に細胞総タンパク質を抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルを測定した。結果から分かるように、単独したＭＳＣ増幅に比べ、ＰＢＬとＭＳＣとの接触共培養により３日間増幅したときに、ＭＳＣ細胞数は顕著に増加し始め、６日目に約４倍増加し、９日目に７倍以上増加し、１２日目に細胞数は１０倍以上増加した（表５、図８Ａ、Ｂ）。また、ＰＢＬとＭＳＣを１２時間共培養したときに、ＭＳＣ中の増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルが顕著に増加した（図８Ｃ、Ｄ）。
【0035】
【表5】
【0036】
注：ＭＳＣに比べ、＊＊ｐ＜０．０１であった。
【0037】
＜実施例９＞ＭＳＣ増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４に対するＰＢＬとＭＳＣの接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、２×１０５の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現状況を分析した。結果から分かるように、ＭＳＣとＰＢＬを接触共培養した後、ＭＳＣ増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルが顕著に向上した（図９）。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、２×１０５の密度で直径１０ｃｍの細胞培養皿に接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養した後、細胞総タンパク質を抽出し、ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇにより増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現状況を分析した。結果から分かるように、ＭＳＣとＰＢＬを接触共培養した後、ＭＳＣ増殖細胞核抗原ＰＣＮＡおよび幹細胞性転写因子Ｏｃｔ４の発現レベルが顕著に向上した（図９）。
【0038】
＜実施例１０＞ＭＳＣ自己更新能力に対するＰＢＬとＭＳＣの接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１００細胞／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、９日間共培養した後、クリスタルバイオレットで染色し、細胞コロニーの形成を観察し、撮影して記録した。結果から分かるように、ＭＳＣとＰＢＬを９日間接触共培養した後、ＭＳＣのコロニー形成率は３３．３％であり、一般的に培養された対照群（３．３％）よりも１０倍以上増加した（図１０）。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、１００細胞／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、９日間共培養した後、クリスタルバイオレットで染色し、細胞コロニーの形成を観察し、撮影して記録した。結果から分かるように、ＭＳＣとＰＢＬを９日間接触共培養した後、ＭＳＣのコロニー形成率は３３．３％であり、一般的に培養された対照群（３．３％）よりも１０倍以上増加した（図１０）。
【0039】
＜実施例１１＞ＭＳＣ分化能力に対するＰＢＬとＭＳＣの接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、２×１０４／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養し、細胞コンフルエンスが８０％に達したときに、それぞれ骨分化、脂肪生成分化および軟骨分化培地に交換した。誘導分化過程において、２１日目まで３日ごとに液体を交換し、トルイジンブルーで染色し、軟骨形成分化細胞外マトリックスグリコサミノグリカンの生成を検出し、アリザリンレッドＳ染色法により骨形成分化石灰化結節の生成を検出し、オイルレッドＯ染色により脂肪生成分化脂肪滴の形成を検出した。結果から分かるように、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養により得られたＭＳＣは、通常培養により得られたＭＳＣに比べ、軟骨マトリックスグリコサミノグリカン生成能力、石灰化結節形成能力および脂肪滴生成能力のいずれもより高かった（図１１）。これは、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養がＭＳＣ骨形成分化、脂肪生成分化および軟骨形成分化を増強できることを示している。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、２×１０４／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、４８時間共培養し、細胞コンフルエンスが８０％に達したときに、それぞれ骨分化、脂肪生成分化および軟骨分化培地に交換した。誘導分化過程において、２１日目まで３日ごとに液体を交換し、トルイジンブルーで染色し、軟骨形成分化細胞外マトリックスグリコサミノグリカンの生成を検出し、アリザリンレッドＳ染色法により骨形成分化石灰化結節の生成を検出し、オイルレッドＯ染色により脂肪生成分化脂肪滴の形成を検出した。結果から分かるように、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養により得られたＭＳＣは、通常培養により得られたＭＳＣに比べ、軟骨マトリックスグリコサミノグリカン生成能力、石灰化結節形成能力および脂肪滴生成能力のいずれもより高かった（図１１）。これは、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養がＭＳＣ骨形成分化、脂肪生成分化および軟骨形成分化を増強できることを示している。
【0040】
＜実施例１２＞ＭＳＣ遊走能力に対するＰＢＬとＭＳＣの接触共培養の影響
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、５×１０４／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、細胞コンフルエンスが１００％に達するまで共培養した後、２００μＬの滅菌ピペットチップで培養プレート上を均一にスクラッチを作製した後、滅菌ＰＢＳで洗浄して細胞破片を除去し、３７℃、飽和湿度の５％ＣＯ２インキュベータに入れ、それぞれ共培養の０、６、１２、２４および３６時間目に同じスクラッチ位置を撮影して記録した。結果から分かるように、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養はＭＳＣの遊走能力を顕著に増強できる（図１２）。
対数増殖期にある第３継代のヒト羊膜ＭＳＣを取り、５×１０４／ウェルの密度で６ウェル細胞培養プレートに接種し、１６時間後、新たに分離されたＰＢＬを加え、細胞コンフルエンスが１００％に達するまで共培養した後、２００μＬの滅菌ピペットチップで培養プレート上を均一にスクラッチを作製した後、滅菌ＰＢＳで洗浄して細胞破片を除去し、３７℃、飽和湿度の５％ＣＯ２インキュベータに入れ、それぞれ共培養の０、６、１２、２４および３６時間目に同じスクラッチ位置を撮影して記録した。結果から分かるように、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養はＭＳＣの遊走能力を顕著に増強できる（図１２）。
【0041】
＜実施例１３＞ＭＳＣ治療効果に対するＰＢＬとＭＳＣの接触共培養の影響
３％ＤＳＳを自由飲食させることにより潰瘍性結腸炎マウスモデルを構築し、４０匹のＣ５７マウス（５～７週齢）を１０匹／群でランダムにＮｏｒｍａｌ、ＤＳＳ、ＤＳＳ＋ＭＳＣ、ＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣの４群に分けた。ＤＳＳ＋ＭＳＣ群およびＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣ群では、ＤＳＳを食べさせ始めた時にそれぞれＰ４およびリンパ球で４８時間処理した後のＰ４ ＭＳＣ（１×１０７／匹）を腹腔内注射した。ＮｏｒｍａｌおよびＤＳＳ群のマウスに同時に等体積の滅菌ＰＢＳを注射した。観察期間で、毎日定時で体重を秤り、死亡状況を記録し、下痢便、血便などの現象があるか否かを観察した。マウス体重、下痢、便血および死亡状況に基づいて疾患活動性指標（ＤＡＩ）を算出した。ヒト羊膜ＭＳＣ注射の１０日後、マウスを安楽死させ、結腸を取り、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で一晩固定し、パラフィン包埋し、４ｍの切片に切り出し、ＨＥ染色した。顕微鏡で結腸組織の炎性細胞浸潤および陰窩と杯状細胞の構造を観察し、従来の方法にしたがって組織病理学的スコアを行った。結果から分かるように、ＤＳＳを食べさせた５日目に、マウスは、体重減少、下痢便、血便などを含む炎症性結腸炎の重篤な症状が現れ始め、７日目に死亡し始めた（図１３）。組織学的分析により、ＤＳＳを食べさせることによりマウスの結腸粘膜が重度の炎症と損傷が発生したことが示された（図１３Ｃ、Ｄ）。ＰＢＬとＰ３ ＭＳＣを共培養して得られたＰ４ ＭＳＣを静脈注射した後、免疫細胞で処理されていないＰ４ ＭＳＣを静脈注射した場合と同様に、免疫拒絶反応が発生せず、ＤＳＳ誘導の体重減少、血便、結腸炎症および損傷を顕著に軽減でき、結腸炎マウスの死亡を効果的に阻止することができ（図１３）、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養により増幅して得られたＭＳＣを用いた疾患モデルの治療は安全で効果的であることを示している。
３％ＤＳＳを自由飲食させることにより潰瘍性結腸炎マウスモデルを構築し、４０匹のＣ５７マウス（５～７週齢）を１０匹／群でランダムにＮｏｒｍａｌ、ＤＳＳ、ＤＳＳ＋ＭＳＣ、ＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣの４群に分けた。ＤＳＳ＋ＭＳＣ群およびＤＳＳ＋ＰＢＬ＋ＭＳＣ群では、ＤＳＳを食べさせ始めた時にそれぞれＰ４およびリンパ球で４８時間処理した後のＰ４ ＭＳＣ（１×１０７／匹）を腹腔内注射した。ＮｏｒｍａｌおよびＤＳＳ群のマウスに同時に等体積の滅菌ＰＢＳを注射した。観察期間で、毎日定時で体重を秤り、死亡状況を記録し、下痢便、血便などの現象があるか否かを観察した。マウス体重、下痢、便血および死亡状況に基づいて疾患活動性指標（ＤＡＩ）を算出した。ヒト羊膜ＭＳＣ注射の１０日後、マウスを安楽死させ、結腸を取り、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で一晩固定し、パラフィン包埋し、４ｍの切片に切り出し、ＨＥ染色した。顕微鏡で結腸組織の炎性細胞浸潤および陰窩と杯状細胞の構造を観察し、従来の方法にしたがって組織病理学的スコアを行った。結果から分かるように、ＤＳＳを食べさせた５日目に、マウスは、体重減少、下痢便、血便などを含む炎症性結腸炎の重篤な症状が現れ始め、７日目に死亡し始めた（図１３）。組織学的分析により、ＤＳＳを食べさせることによりマウスの結腸粘膜が重度の炎症と損傷が発生したことが示された（図１３Ｃ、Ｄ）。ＰＢＬとＰ３ ＭＳＣを共培養して得られたＰ４ ＭＳＣを静脈注射した後、免疫細胞で処理されていないＰ４ ＭＳＣを静脈注射した場合と同様に、免疫拒絶反応が発生せず、ＤＳＳ誘導の体重減少、血便、結腸炎症および損傷を顕著に軽減でき、結腸炎マウスの死亡を効果的に阻止することができ（図１３）、ＰＢＬとＭＳＣの接触共培養により増幅して得られたＭＳＣを用いた疾患モデルの治療は安全で効果的であることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
