特許 7041182 糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-14

(45)【発行日】2022-03-23

(54)【発明の名称】糖鎖工学的に操作された抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20220315BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20220315BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20220315BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220315BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20220315BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20220315BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20220315BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K47/68

A61P35/00

C12N9/10

C12N15/13

C12N15/54

【請求項の数】 24

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020035173

(22)【出願日】2020-03-02

(62)【分割の表示】P 2016547823の分割

【原出願日】2014-10-14

(65)【公開番号】P2020114818

(43)【公開日】2020-07-30

【審査請求日】2020-04-01

(31)【優先権主張番号】13188585.7

(32)【優先日】2013-10-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】14165581.1

(32)【優先日】2014-04-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】512278490

【氏名又は名称】シンアフィックス ビー．ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ファン デルフト， フローリス ルイ

(72)【発明者】

【氏名】ファン ヘール， レモン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイデーヴェン， マリア アントニア

【審査官】宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９－５３１２８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１１－１２１９５４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１０－５０６５６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００９－５２８９８８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１３－５３４５３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】STROP P. et al.，Chemistry & Biology，20(2013 Feb)，p.161-167

【文献】RAMAKRISHNAN B. et al.，J. Biol. Chem.，Vol.277, No.23(2002)，p.20833-20839

【文献】ALMEIDA G. et al.，Angew. Chem. Int. Ed.，Vol. 51 (2012)，p.2443-2447

【文献】HUANG W. et al.，J. Am. Chem. Soc.，Vol.134(2012)，p.12308-12318

【文献】AGNEW B. et al.，J. Biomol. Tech，Vol. 23, No. Supp.8(2012)，S28, 115

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １６／００－１６／４６

Ｃ１２Ｐ ２１／０８

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ１２Ｎ １５／０９ー１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

修飾抗体を調製する方法であって、
ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１ ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｇ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ａからなる群から選択されるβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップを含み、
Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１又は２であり、Ａがアジド基であり、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位に結合しており、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択でフコシル化されており、前記モノサッカライド誘導体Ｓｕが、Ｎ－アセチルガラクトースのガラクトースから誘導される、方法。

【請求項2】

Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ、及び６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

アスパラギン２９７又はその周辺に存在する、ＩｇＧにおける天然のグリコシル化部位は除去されている、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

アスパラギン（Ａｓｎ）が変異Ｎ－結合型グリコシル化部位で置換されており、アスパラギンは配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はトレオニンのどちらかである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体であって、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基が前記抗体に結合しており、前記Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃが、任意選択でフコシル化されており、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１又は２であり、Ａがアジド基であり、前記モノサッカライド誘導体Ｓｕが、Ｎ－アセチルガラクトースのガラクトースから誘導される、ＩｇＧ抗体。

【請求項6】

式（１４０）：

【化1】

（式中、
Ａｂは、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を表し、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位は、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、Ｓｕ（Ａ）及びｘは、請求項５に定義されている通りであり、ｂは０又は１である）
による、請求項５に記載の抗体。

【請求項7】

アスパラギン２９７又はその周辺に存在する、ＩｇＧにおける天然のグリコシル化部位は除去されている、請求項５又は６に記載の抗体。

【請求項8】

アスパラギン（Ａｓｎ）が変異Ｎ－結合型グリコシル化部位で置換されており、アスパラギンは配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒはセリン又はトレオニンのどちらかである、請求項５～７のいずれか一項に記載の抗体。

【請求項9】

抗体コンジュゲートの調製における請求項５～８のいずれか一項に記載の抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子Ｄにコンジュゲートされている抗体として定義される、使用。

【請求項10】

抗体コンジュゲートを調製する方法であって、請求項５～８のいずれか一項に記載の修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、前記修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａがアジド基である、方法。

【請求項11】

前記リンカーコンジュゲートが、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

式（１５６）又は（１５７）：

【化2】

（式中、
Ａｂは、請求項６において定義されている通りであり、
Ｓｕは、Ｎ－アセチルガラクトースのガラクトースから誘導された糖誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｂは、０又は１であり、
ｒは、１～２０であり、
ｘは、１又は２であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、前記アルキル基、前記（ヘテロ）アリール基、前記アルキル（ヘテロ）アリール基及び前記（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－であり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）、

【化3】

（式中、
Ａｂは、請求項６において定義されている通りであり、
Ｓｕは、Ｎ－アセチルガラクトースのガラクトースから誘導された糖誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｂは、０又は１であり、
ｒは、１～２０であり、
ｘは、１又は２であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、前記アルキル基、前記（ヘテロ）アリール基、前記アルキル（ヘテロ）アリール基及び前記（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化しているアレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－であり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａ’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’＋ａ’’＜１０である）
による抗体コンジュゲート。

【請求項13】

ｘが１であり、及び／又はｒが１若しくは２である、請求項１２に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項14】

前記対象の分子が、薬学的に活性な物質の群から選択される、請求項１２又は１３に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項15】

医薬として使用するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項16】

がんの処置に使用するための、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項17】

抗体コンジュゲートの抗体における変異コンジュゲート部位の使用であって、
前記コンジュゲート部位が、ＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位に結合した近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基のための結合点であり、前記ＩｇＧ抗体が単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含み、前記ＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位は、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、
前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が任意選択でフコシル化されており、前記抗体コンジュゲートの特性を調節するため、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ） _ｘ が前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合しており、Ｓｕ（Ａ） _ｘ がｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１又は２であり、Ａがアジド基であり、ＳｕがＮ－アセチルガラクトースのガラクトースから誘導される、使用。

【請求項18】

前記抗体コンジュゲートが、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートである、請求項１７に記載の使用。

【請求項19】

前記調節される特性が、抗腫瘍活性、最大耐量、薬物動態、血漿クリアランス、治療指数、有効性、毒性、薬物の弱毒化、凝集する傾向、薬物の結合の安定性、及び標的に到達後の薬物の放出から選択される、請求項１７又は１８に記載の使用。

【請求項20】

前記調節される特性が、前記抗体コンジュゲートのインビボ有効性である、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

前記重鎖の位置２９７のアスパラギンがグルタミンに改変されている、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項22】

Ｓｕ（Ａ） _ｘ が（８）、（９）、（１０）又は（１１）の構造を有する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【化4】

【請求項23】

対象の分子Ｄが細胞毒である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。

【請求項24】

前記細胞毒が、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）から選択される、請求項２３に記載の抗体コンジュゲート。

【発明の詳細な説明】

【発明の技術分野】

【0001】

本発明は、抗体、修飾抗体及び抗体コンジュゲート、特に、糖鎖工学的に操作された抗体、修飾抗体及び抗体コンジュゲートに関する。本発明はまた、本発明の修飾抗体及び抗体コンジュゲートを調製する方法に関する。抗体は、活性物質にコンジュゲートされ得る。したがって、本発明はまた、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及びその調製方法に関する。

【発明の背景】

【0002】

抗体コンジュゲート、すなわちリンカーを介して対象の分子にコンジュゲートされている抗体は、当技術分野において公知である。対象分子が薬物、例えば、細胞毒性化学物質である、抗体コンジュゲートに大きな関心がよせられている。抗体－薬物－コンジュゲートは当技術分野において公知であり、合成リンカーを介して細胞毒性化学物質に共有結合している、組換え抗体からなる（参照により組み込まれている、Ｓ．Ｃ．Ａｌｌｅｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１０年、１４巻、５２９～５３７頁）。免疫毒素とも呼ばれる抗体－薬物－コンジュゲート（ＡＤＣ）の主な目的は、腫瘍関連抗原のためのモノクローナル抗体の高い特異性と「小さな」細胞毒性薬物（通常、３００～１０００Ｄａ）の薬理学的有効性とを合わせ持たせることである。ＡＤＣの例には、ゲムツズマブオゾガマイシン（マイロターグ；カリケアマイシンにコンジュゲートされている抗ＣＤ３３ｍＡｂ、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｗｙｅｔｈ）；ブレンツキシマブベドチン（ＳＧＮ－３５、アドセトリス、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチン）に共有結合で結合しているブレンツキシマブからなる、ＣＤ３０標的ＡＤＣ、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）；トラスツズマブ－ＤＭ１コンジュゲート（Ｔ－ＤＭ１、カドシラ）が含まれる。

【0003】

この分野における進歩の１つには、かなり強力な毒素、特に、タキサン、カリケアマイシン、マイタンシン、ピロロベンゾジアゼピン、デュオカルマイシン及びアウリスタチンの出現が含まれる。低ナノモルからピコモルのこれらの物質の毒性が、以前に適用された毒素をしのぐ、主な改善原動力である。別の重要な技術的進歩には、細胞質中で加水分解可能である、プロテアーゼに対して抵抗性若しくは感受性がある、又は細胞毒性の高い薬物に関連する多剤耐性排出ポンプに対して抵抗性がある、最適化されたリンカーの使用が関与している。

【0004】

従来技術から公知のＡＤＣは、それぞれアシル化又はアルキル化により、リンカー－毒素のアミノ酸であるリシン又はシステインの側鎖へのコンジュゲーションによって一般に調製される。

【0005】

リシンの場合、コンジュゲーションは、立体的に最も高い接近性、最も低いｐＫａ又はそれらの組合せを有するリシン側鎖において優先的に行われる。この方法の欠点は、コンジュゲーションの部位の制御が低いことである。

【0006】

部位特異性のよりよい制御は、通常、抗体において遊離システインが全く存在しないという事実に基づいて、システインをアルキル化することによって得られ、これにより、還元工程により選択的に遊離させるか、又は遊離システインとして、抗体に特異的に工学操作される（いわゆる、ＴＨＩＯｍａｂと同様）、こうしたシステインしかアルキル化しないという選択肢が提供される。還元による選択的なシステイン遊離は、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ又はＤＴＴ）により全抗体を処理することによって通常、行われ、ジスルフィド結合は２つの遊離チオールに変換される（大部分は、抗体のヒンジ領域）。次に、遊離したチオールは、通常、リンカー－毒素に結合しているマレイミドに基づいて、求電子試薬によりアルキル化され、これは、迅速且つ高い選択性で一般に進行する。追加の（遊離）システインを抗体に工学的に操作する点では、添加されるシステイン（複数可）の位置に関して、部位制御の向上が達成される。同様に、この戦略では、遊離システインのアルキル化は、マレイミド化学により行われるが、完全な均質性は達成されない。ごく最近の報告の１つ（参照により組み込まれている、Ｏｋｅｌｅｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１３年、２４巻、１６５０～１６５５頁）は、６－チオフコースをモノクローナル抗体に代謝的に取り込ませることを記載している。しかし、６－チオフコースの取込み効率は、７０％しかないことが分かり、すなわち、マレイミドコンジュゲーション後、１．３のＤＡＲが達成される。

【0007】

同時に、マレイミドによるアルキル化によって得られるＡＤＣの欠点は、一般に、得られるコンジュゲートが、アルキル化の逆、すなわちレトロマイケル反応のために不安定となり、これにより、抗体からリンカー毒素が放出されるおそれがあることである。システイン－マレイミドコンジュゲートの安定性は、モノクローナル抗体中のシステインの位置にかなり依存することが記載されている。例えば、溶媒が非常に接近し易い部位は、アルブミン、グルタチオン又は他のタンパク質中の反応性チオールとのマレイミド交換のため、血漿中で、通常、迅速にコンジュゲートでなくなる。対照的に、この望ましくない交換反応は、陽性電荷の環境を有する部分的に接近可能な部位では、スクシンイミド環の加水分解（マレイミドへのチオール付加の結果）により防止される一方、部分的に溶媒接近できる及び中性電荷を有する部位は、両方の特性を示した。同様に、上記の６－チオフコースマレイミドコンジュゲートは、システインマレイミドコンジュゲートに関して、安定性の増強をいくらか示すことが分かったということが見いだされたが、説明はなされなかった。上記を鑑みると、システイン－マレイミドのアルキル化に基づくコンジュゲーションは、毒素の早期放出を好ましくは示すべきではない、ＡＤＣの開発にとって、理想的な技術ではない。

【0008】

抗体－薬物コンジュゲートを調製するための代替的な戦略には、抗体のグリカン構造に１つ又は複数のアルデヒド官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を生成させることが含まれる。哺乳動物の宿主系において産生する組換え抗体はすべて、複合型のグリカンによって修飾されている、アスパラギン－２９７において、保存されているＮ－グリコシル化部位を含有している。後者の複合型のグリカンは、各Ｎ－グリカンの非還元末端において０、１つ又は２つの末端ガラクトース単位があることを特徴としており、このガラクトース単位は、化学的手段（過ヨウ素酸ナトリウム）又は酵素手段（ガラクトースオキシダーゼ）のどちらかによって、アルデヒド官能基を生成させるために適用することができる。後者のアルデヒド官能基は、続いて、例えば、官能基化ヒドロキシルアミン又はヒドラジン分子との縮合による選択的なコンジュゲーション法に使用することができ、これにより、それぞれ、オキシム結合又はヒドラゾン結合された抗体コンジュゲートを生成する。しかし、特に、脂肪族アルデヒドから誘導されたオキシム及びヒドラゾンは、水中、又は低いｐＨにおいて、経時的な安定性に制限があることを示すことが知られている。例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、オキシム結合されている抗体－薬物コンジュゲートであり、インビボにおいて、早期の脱コンジュゲーションを被ることが知られている。

【0009】

当技術分野で公知の抗体コンジュゲートには、いくつかの欠点が一般にある。抗体－薬物コンジュゲートの場合、抗体に毒素をローディングする尺度は、薬物－抗体比（ＤＡＲ）によって与えられ、この比は、抗体あたりの活性物質分子の平均数を与えるものである。しかし、ＤＡＲは、こうしたＡＤＣの均質性に関して、何らかの指標を与えるものではない。

【0010】

従来技術から公知の抗体コンジュゲートの調製方法により、１．５～４の間のＤＡＲを有する生成物が一般に生じるが、実際には、こうした生成物は、抗体コンジュゲートと、０～８つ、又はそれ超で変動するいくつかの対象の分子との混合物を含む。言い換えると、従来技術から公知の抗体コンジュゲートは、標準偏差の高いＤＡＲを伴って形成される。

【0011】

例えば、ゲムツズマブオゾガマイシンは、５０％のコンジュゲート（溶媒に曝露された抗体のリシン残基に、平均で２つ又は３つがランダムに結合されて含む、ＩｇＧ分子あたり０～８つのカリケアマイシン部分）と５０％のコンジュゲートされていない抗体との不均一な混合物である（どちらも参照により組み込まれている、Ｂｒｏｓｓら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１年、７巻、１４９０頁；Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９年、２７巻、７６７頁）。しかし、臨床開発における、ブレンツキシマブベドチン、Ｔ－ＤＭ１（カドシラ）、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス）、及び他のＡＤＣの場合と同様に、正確にどれだけの数の薬物を任意の所与の抗体に結合させるかを制御することは依然として不可能であり（薬物対抗体比、ＤＡＲ）、ＡＤＣは、コンジュゲートの統計的分布物として得られる。抗体あたりの最適な薬物数が、例えば、２つ、４つ又はそれ超であるかどうかに関わりなく、標準偏差の狭い部位特異的コンジュゲーションにより、薬物を予想可能な数で、且つ予想可能な位置に結合させることは、依然として難題である。

【0012】

すべてのモノクローナル抗体に一般に適用可能となり得る多様性のある戦略は、哺乳動物（又は、酵母）の細胞培養物において発現されるすべての抗体中に天然に存在している、Ｆｃ結合グリカンに対する部位特異的コンジュゲーションを含む。末端ガラクトースの酸化による、又は（非天然）シアル酸の同一ガラクトース部分への酵素による転移によるなど、この概念に基づいたいくつかの戦略が当技術分野で公知である。しかし、ＡＤＣを目的とする場合、こうした戦略は、グリカンが、様々なレベルのガラクトシル化（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２）を含有し得る、アイソフォームの複雑な混合物として、通常、形成されるので、不十分であり、したがって、薬物－抗体比（ＤＡＲ、以下を参照されたい）の制御に乏しいＡＤＣが得られると思われる。

【0013】

Ｑａｓｂａらは、どちらも参照により本明細書に組み込まれている国際公開第２００４／０６３３４４号及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁において、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体であるＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｉ）及びＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｎ）により、ＧａｌＮＡｃが非還元ＧｌｃＮＡｃ糖に酵素的に結合され得ることを開示している。例えば、ＧｌｃＮＡｃは、モノクローナル抗体（例えば、リツキサン、レミケード、ハーセプチン）上のＮ－グリカンなどの、複合Ｎ－グリカンの一部の末端構成成分である。

【0014】

Ｑａｓｂａらは、参照により本明細書に組み込まれている、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００９年、２０巻、１２２８頁において、国際公開第２００４／０６３３４４号において開示されている方法はまた、Ｎ－アセチル基上で置換されている、非天然ＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ変種の場合にも進行することを開示している。Ｇ０グリコ型を有する、β－ガラクトシダーゼにより処理されたモノクローナル抗体は、Ｃ２－置換されているアジドアセトアミド部分（ＧａｌＮＡｚ）を含むガラクトース部分がグリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基へ転移した後に、Ｇ２グリコ型に完全にガラクトシル化されて、テトラアジド置換抗体、すなわち、重鎖あたり２つのＧａｌＮＡｚ部分になる（図３の、３の６への変換を参照されたい）。例えば、ＤＡＲが４となる抗体－薬物コンジュゲートを調製するために、例えば、シュタウディンガーライゲーション、又はアルキンとのクリック反応（図３の、６の７への変換を参照されたい）により、前記テトラアジド置換抗体を対象の分子にコンジュゲートすることが、潜在的に関心が持たれているが、開示されてはいない。Ｃ２置換ケト基（Ｃ２－ケト－Ｇａｌ）を含むガラクトース部分のＧ０グリコ型グリカンの末端ＧｌｃＮＡｃ残基への転移、及びＣ２－ケト－Ｇａｌのアミノオキシビオチンへの結合も開示されている。しかし、上記の通り、得られるオキシムコンジュゲートは、水による加水分解のため、限られた安定性を示し得る。

【0015】

どちらも参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００７／０９５５０６号及び国際公開第２００８／０２９２８１号（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）変異体とＣ２－置換アジドアセトアミド－ガラクトースＵＤＰ－誘導体（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ）とを組み合わせると、グリカンの末端非還元ＧｌｃＮＡｃに、ＧａｌＮＡｚが取り込まれることを開示している。次に、シュタウディンガーライゲーションによる、又は銅を触媒とするクリック化学を用いた、その後のコンジュゲーションにより、蛍光性アルキンプローブが抗体にコンジュゲートされた、個々の抗体コンジュゲートが得られる。国際公開第２００７／０９５５０６号及び国際公開第２００８／０２９２８１号は、エンドＨによりグリカンのトリミングを行うことができ、これにより、ＧｌｃＮＡｃ－ＧｌｃＮＡｃグリコシド結合が加水分解され、ＧａｌＮＡｚの酵素による導入のための、ＧｌｃＮＡｃが遊離することをさらに開示している。

【0016】

国際公開第２００４／０６３３４４号及びＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００９年、２０巻、１２２８頁に開示されている方法の欠点は、テトラアジド置換抗体を対象の分子に対するコンジュゲーションにより、グリカンあたり、通常、対象の分子を２つ有する抗体コンジュゲートになること（但し、前記コンジュゲーションは、完全な変換を伴って進むことを条件とする）と思われることである。一部の場合、例えば、対象の分子が脂溶性毒素である場合、抗体あたりの対象の分子があまりにも多く存在することは、特に、脂溶性部分が近位すると、上記のことにより凝集体が形成するおそれがあるので（参照により組み込まれている、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ２００６年、４巻、４２～４３頁）、望ましいものではない。

【0017】

参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００７／１３３８５５号（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍａｒｙｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において、均質な糖タンパク質又はグリコペプチドを調製するための酵素化学的な方法が開示されており、ほぼ完全な樹状グリカン（ｇｌｙｃａｎ ｔｒｅｅ）を最初に（エンドＡ、エンドＨ又はエンドＳの作用下で）トリミングしてコアＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分（いわゆる、ＧｌｃＮＡｃ－タンパク質）だけを残し、次いで、エンドグリコシダーゼ（ＥＮＧアーゼ）を含む触媒の存在下で、オリゴサッカライド部分をＧｌｃＮＡｃタンパク質に転移させて、均質な糖タンパク質又はグリコペプチドを生じさせるという、再グリコシル化イベントを必要とする、２段階戦略を含む。アジド官能基化糖タンパク質の場合の戦略が開示されており、この場合、ＧｌｃＮＡｃタンパク質を、ＥＮＧアーゼの存在下で、２つの６－アジドマンノース部分を含有するテトラサッカライドオキサゾリンと反応させ、これにより、グリカンに同時に２つのアジドを導入する。次に、アジド官能基化糖タンパク質は、触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ）触媒）の存在下で、対象の官能性部分Ｘを保有する末端アルキンを用いる「クリック化学」付加環化反応において、触媒的に反応し得る。前記クリック化学の実際の例は、開示されていない。

【0018】

参照により本明細書に組み込まれている、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、８０３０頁において、Ｄａｖｉｓらは、グリコシンターゼエンドＳの存在下で、無傷抗体の、コアがフコシル化されている及びフコシル化されていないコア－ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃドメイン上のオリゴサッカライドオキサゾリンの転移を開示している。

【0019】

参照により本明細書に組み込まれている、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、１２３０８頁において、Ｗａｎｇらは、グリコシンターゼ変異体であるエンドＳ－Ｄ２３３Ａ及びエンドＳ－Ｄ２３３Ｑの存在下で、無傷抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（リツキシマブ）の、コアがフコシル化されている及びフコシル化されていないコア－ＧｌｃＮＡｃ－Ｆｃドメイン上に、２つの６－アジドマンノース部分を含有するテトラサッカライドオキサゾリンの転移を開示している。

【0020】

しかし、国際公開第２００７／１３３８５５号、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、８０３０頁及びＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２年、１３４巻、１２３０８頁に開示されているグリコシンターゼ戦略の欠点は、必要なアジド含有オリゴサッカライドオキサゾリンの合成に時間がかかり、複雑であることである。

【0021】

Ｎ－グリカンによる抗体コンジュゲートを調製する現在の技術の限界の１つは、（ａ）天然に存在するＮ－グリコシル化部位（複数可）へのこうした手法の内在的な依存性である。ＩｇＧタイプのモノクローナル抗体はすべて、重鎖のアスパラギン－２９７（又はその周辺）において、少なくとも１つのＮ－グリコシル化部位を有する。Ｎ２９７におけるグリカンは、Ｆｃ－ガンマ受容体への結合によって、エフェクター機能（抗体依存性細胞の細胞毒性、ＡＤＣＣ）を誘発するために不可欠である。しかし、Ｎ２９７グリカンは、血中において長い循環時間を維持するために必須ではなく、この循環時間は、抗体のＣ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３ドメインインターフェースとＦｃＲｎ受容体との相互作用によって調節される。Ｎ２９７のグリコシル化部位とは別に、約２０％のモノクローナル抗体が、通常、Ｆａｂドメインに、第２のグリコシル化部位を保持している。しかし、第２のグリコシル化部位は、いかなる種類の抗体活性にも不可欠であることは知られておらず、したがって、所望の場合、（例えば、トラスツズマブの開発において適用された通り）工学的に操作して抗体から切り離され得る。

【0022】

Ｗｒｉｇｈｔら（参照により本明細書に組み込まれている、ＥＭＢＯ Ｊ．１９９１年、１０巻、２７１７頁）は、それぞれ、２つの異なる抗体ＴＳＴ２及びＴＳＵ７のＶ_Ｈにおいて、特定の位置５４又は６０にグリコシル化部位を新たに操作することを記載しており、抗原の親和力及び抗体に由来する（Ｆａｂ’）_２断片の結合に及ぼす、グリコシル化処理におけるこうした部位の影響を決定している。

【0023】

参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６２５４８６８号及び欧州特許第９７９１６７８７号において、どのように、１０個の新しいグリコシル化部位を設計してヒト化抗ＣＤ２２モノクローナル抗体であるｈＬＬ２に工学的に操作するのかが記載されている。グリコシル化にとって都合よく位置している２つのＣＨ_１ドメイングリコシル化部位である、ＨＣＮ１及びＨＣＮ５が特定された。新しいグリコシル化部位が、抗体に由来する（Ｆａｂ’）_２断片に、キレート剤及び薬物を部位特異的コンジュゲーションのために適用されている。コンジュゲートは、過ヨウ素酸酸化、次に、還元アミノ化により、免疫反応性に及ぼす影響を無視できる程に行われた。ＣＨ_１に付随しているＣＨＯのどちらも、小さなキレート剤と等しい効率でコンジュゲートされ、ＨＣＮ５－ＣＨＯは、構造的及び位置的優位性のために、大きな薬物複合体にとって、抗体の可変ドメイン中でのコンジュゲーションよりも、より優れたコンジュゲーション部位となるように思われると結論づけられた。

【発明の概要】

【0024】

本発明は、修飾抗体を調製する方法であって、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップを含み、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位に結合しており、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択でフコシル化されている、方法に関する。

【0025】

本発明はまた、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む修飾ＩｇＧ抗体であって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基が抗体に結合しており、Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃが、任意選択でフコシル化されており、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、修飾ＩｇＧ抗体に関する。

【0026】

さらに、本発明は、抗体コンジュゲートの調製における、本発明による修飾抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子Ｄにコンジュゲートされている抗体として定義される、使用に関する。

【0027】

同様に、本発明は、抗体コンジュゲートを調製する方法であって、本発明による修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、前記リンカーコンジュゲートが官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子を含み、前記官能基Ｂが、修飾糖タンパク質のグリカン上の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、官能基Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、方法に関する。

【0028】

本発明はさらに、本発明による方法によって得ることができる、抗体コンジュゲート及び抗体－薬物コンジュゲートに関する。

【0029】

さらに、本発明は、医薬として使用するための、本発明による抗体コンジュゲートに関する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】哺乳動物の宿主において産生するモノクローナル抗体の、考えられるグリコシル化プロファイルの例を示す図である。二アンテナ複合グリカンだけが示されており、他の選択肢、例えば、シアル化グリカン及び三アンテナ構造も、同様に考えられる。

【図2】通常の発現、続いてエンド－グリコシダーゼ（１）を用いてトリミングすることにより得ることができる、モノクローナル抗体の様々なグリコ型を示す図である。グリコ型２は、スワインソニンの存在下で、哺乳動物系におけるｍＡｂの発現により、又は工学的に操作された宿主生物、例えばピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）における発現により得ることができる。最後に、グリコ型３は、シアリダーゼとガラクトシダーゼが組み合わせて作用すると、グリコ型（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）の通常の混合物をトリミングすることにより得ることができる。

【図3】それぞれ、エンド－グリコシダーゼ又はシアリダーゼとガラクトシダーゼとの混合物を用いて処理すると、ｍＡｂのグリコ型の混合物が、ＧｌｃＮＡｃ末端ｍＡｂ１又は３に酵素変換することを示す図である。Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）の存在下でＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚを処理すると、グリコシル化部位あたり１つ又は２つのＧａｌＮＡｚ部分が、それぞれ導入される。４及び６におけるアジド部分は、例えば、歪みにより促進される付加環化（４→５）又は銅を触媒とするクリック反応（６→７）により、官能基を導入するための結合点として働く。

【図4】ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移させるための、アジド修飾ガラクトース誘導体（９～１１）の構造を示す図である。

【図5】ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移させるための、他のガラクトース誘導体（１２～２７）の構造を示す図である。

【図6】Ｎ２９７における天然のグリコシル化部位を除去（例えば、ＡｓｎからＧｌｎへの変異）の際のモノクローナル抗体、例えばＩｇＧの様々なグリコ型、及び重鎖又は軽鎖の任意の位置にあり得る、ｍＡｂの別の部位における、新しいグリコシル化部位の新たな工学的な操作を示す図である。

【図7】ガラクトシルトランスフェラーゼを作用させて、酵素によりＧｌｃＮＡｃ末端グリカン上に導入するための、修飾ＵＤＰ－ガラクトースヌクレオチド２８～３１の構造を示す図である。

【図8】ＢＣＮ－ＭＭＡＦコンジュゲート（３４）の合成に関する、反応スキームを示す図である。

【図9】ＢＣＮ－マイタンシノイドコンジュゲート（３５）の合成に関する、反応スキームを示す図である。

【図10a】（Ａ）ＣＨＯにおいて発現させた後に単離した、トラスツズマブ変異体－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後の、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイルを示す図である。

【図10b】（Ａ）ＣＨＯにおいて発現させた後に単離した、トラスツズマブ変異体－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後の、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイルを示す図である。

【図11a】（Ａ）エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後、及び末端ＧｌｃＮＡｃ上へのＧａｌＮＡｚのＧａｌＴ１媒介性転移後の、トラスツズマブ変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＦ３４による処理後の、アジドをチャージしたトラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎのコンジュゲーションに由来する、抗体薬物コンジュゲートの質量スペクトルのプロファイルを示す図である。

【図11b】（Ａ）エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後、及び末端ＧｌｃＮＡｃ上へのＧａｌＮＡｚのＧａｌＴ１媒介性転移後の、トラスツズマブ変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＦ３４による処理後の、アジドをチャージしたトラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎのコンジュゲーションに由来する、抗体薬物コンジュゲートの質量スペクトルのプロファイルを示す図である。

【図12】ＳＫ－Ｂｒ－３細胞株に対する、ある範囲のＡＤＣのインビトロ細胞毒性を示す図である。

【図13】ＳＫ－ＯＶ－３細胞株に対する、ある範囲のＡＤＣのインビトロ細胞毒性を示す図である。

【図14】ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞株（陰性対照）に対する、ある範囲のＡＤＣのインビトロ細胞毒性を示す図である。

【図15】トラスツズマブの糖変異体に基づき、ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシンにコンジュゲートされている、ある範囲のＡＤＣのインビボ有効性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

定義
本明細書及び特許請求の範囲において使用する動詞「含むこと（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、並びにその語形変化は、非限定的な意味で使用され、その単語に続く項目が含まれるが、具体的に明記されていない項目が除外されるわけではないことを意味する。

【0032】

さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素の言及は、文脈が、要素の１つ及び１つだけであると明確に要求していない限り、２つ以上の要素が存在する可能性を除外するものではない。すなわち、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を通常、意味する。

【0033】

本明細書及び特許請求の範囲おいて開示されている化合物は、１個又は複数の不斉中心、及び様々なジアステレオマーを含むことがあり、並びに／又は該化合物の鏡像異性体が存在することがある。特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいかなる化合物の記載も、すべてのジアステレオマー、及びそれらの混合物を含むことが意図されている。また、特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲におけるいかなる化合物の記載も、個々の鏡像異性体と、鏡像異性体の任意の混合物、ラセミ体又はその他のものの両方を含むことが意図されている。化合物の構造が、特定の鏡像異性体として図示されている場合、本出願の発明は、そうした特定の鏡像異性体に限定されないものと理解されるべきである。

【0034】

本化合物は、様々な互変異性体で生じ得る。本発明による化合物は、特に明記しない限り、すべての互変異性体を含むことが意図されている。化合物の構造が、特定の互変異性体として図示されている場合、本出願の発明は、そうした特定の互変異性体に限定されないものと理解されるべきである。

【0035】

無置換アルキル基は、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ＋１を有しており、直鎖状又は分岐状であってもよい。無置換アルキル基は、環式部分を含有することもあり、したがって、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ－１を同時に有する。任意選択で、アルキル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、２－プロピル、ｔ－ブチル、１－ヘキシル、１－ドデシルなどが含まれる。

【0036】

アリール基は、６～１２個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリール基の例は、フェニル及びナフチルである。

【0037】

アリールアルキル基及びアルキルアリール基は、少なくとも７個の炭素原子を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、アリールアルキル基及びアルキルアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。アリールアルキル基は、例えばベンジルである。アルキルアリール基は、例えば、４－ｔ－ブチルフェニルである。

【0038】

ヘテロアリール基は、少なくとも２個の炭素原子（すなわち、少なくともＣ_２）、及び１個又は複数のヘテロ原子Ｎ、Ｏ、Ｐ又はＳを含む。ヘテロアリール基は、単環式又は二環式構造を有することができる。任意選択で、ヘテロアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。適切なヘテロアリール基の例には、ピリジニル、キノリニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、ピロリル、フラニル、トリアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、プリニル、ベンゾオキサゾリル、チエニル、ホスホリル及びオキサゾリルが含まれる。

【0039】

ヘテロアリールアルキル基及びアルキルヘテロアリール基は、少なくとも３個の炭素原子（すなわち、少なくともＣ_３）を含み、単環式及び二環式構造を含むことができる。任意選択で、ヘテロアリール基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されていてもよい。

【0040】

アリール基が（ヘテロ）アリール基として意味される場合、この表記には、アリール基及びヘテロアリール基が含まれることが意図される。同様に、アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含むことが意図されており、（ヘテロ）アリールアルキルは、アリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含むことが意図される。したがって、Ｃ_２～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基とは、Ｃ_２～Ｃ_２４ヘテロアリール基及びＣ_６～Ｃ_２４アリール基を含むものとして、解釈されるべきである。同様に、Ｃ_３～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基は、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキルアリール基及びＣ_３～Ｃ_２４アルキルヘテロアリール基を含むことが意図されており、Ｃ_３～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキルは、Ｃ_７～Ｃ_２４アリールアルキル基及びＣ_３～Ｃ_２４ヘテロアリールアルキル基を含むことが意図されている。

【0041】

特に明記しない限り、アルキル基、アルケニル基、アルケン、アルキン、（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基及びアルキル（ヘテロ）アリール基は、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル基、Ｃ_５～Ｃ_１２シクロアルケニル基、Ｃ_８～Ｃ_１２シクロアルキニル基、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニルオキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニルオキシ基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ及びシリル基（シリル基は、式（Ｒ^１０）_３Ｓｉ－により表すことができ、Ｒ^１０は、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニルオキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニルオキシ基及びＣ_３～Ｃ_１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択される。）からなる群から選択される、１つ又は複数の置換基により置換されていてもよく、ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、任意選択で、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１個又は複数のヘテロ原子により分断されている。

【0042】

アルキニル基は、炭素－炭素三重結合を含む。１つの三重結合を含む無置換アルキニル基は、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ－３を有する。末端アルキニルは、三重結合が炭素鎖の末端位に位置している、アルキニル基である。任意選択で、アルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されており、並びに／又は酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択されるヘテロ原子により分断されている。アルキニル基の例には、エチニル、プロピニル、ブチニル、オクチニルなどが含まれる。

【0043】

シクロアルキニル基は、環式アルキニル基である。１つの三重結合を含む無置換シクロアルキニル基は、一般式Ｃ_ｎＨ_２ｎ－５を有する。任意選択で、シクロアルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。シクロアルキニル基の一例は、シクロオクチニルである。

【0044】

ヘテロシクロアルキニル基は、酸素、窒素及び硫黄からなる群から選択される、ヘテロ原子によって分断されているシクロアルキニル基である。任意選択で、ヘテロシクロアルキニル基は、本明細書においてさらに指定されている１つ又は複数の置換基により置換されている。ヘテロシクロアルキニル基の一例は、アザシクロオクチニルである。

【0045】

（ヘテロ）アリール基は、アリール基及びヘテロアリール基を含む。アルキル（ヘテロ）アリール基は、アルキルアリール基及びアルキルヘテロアリール基を含む。（ヘテロ）アリールアルキル基は、アリールアルキル基及びヘテロアリールアルキル基を含む。（ヘテロ）アルキニル基は、アルキニル基及びヘテロアルキニル基を含む。（ヘテロ）シクロアルキニル基は、シクロアルキニル基及びヘテロシクロアルキニル基を含む。

【0046】

（ヘテロ）シクロアルキン化合物は、本明細書では、（ヘテロ）シクロアルキニル基を含む化合物として定義される。

【0047】

本明細書及び特許請求の範囲において開示されている化合物のいくつかは、縮合（ヘテロ）シクロアルキン化合物、すなわち（ヘテロ）シクロアルキン化合物として記載することができ、ここで第２の環構造が（ヘテロ）シクロアルキニル基と縮合している、すなわち（ヘテロ）シクロアルキニル基と縮合環化（ａｎｎｅｌａｔｅｄ）している。例えば、縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物では、シクロアルキル（例えば、シクロプロピル）又はアレーン（例えば、ベンゼン）は、（ヘテロ）シクロオクチニル基と縮合環化していてもよい。縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物中の（ヘテロ）シクロオクチニル基の三重結合は、３つの考えられる位置、すなわちシクロオクチン部分の２、３又は４位（「有機化学のＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、規則Ａ３１．２に準拠した番号付け）のいずれか１つに位置することができる。本明細書及び特許請求の範囲における、いかなる縮合（ヘテロ）シクロオクチン化合物の記載も、シクロオクチン部分の３つの個々の位置異性体のすべてを含むことが意図されている。

【0048】

アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基、（ヘテロ）アリールアルキル基、（ヘテロ）シクロアルキニル基が、任意選択で置換されている場合、前記基は、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニルオキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニルオキシ基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキルオキシ基、ハロゲン、アミノ基、オキソ基及びシリル基からなる群から独立して選択される１つ又は複数の置換基により、任意選択で独立して置換されており、ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される、１個又は複数のヘテロ原子により任意選択で分断されており、シリル基は、式（Ｒ^６）_３Ｓｉ－により表され、Ｒ^６は、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニル基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニル基、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル基、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケニルオキシ基、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキニルオキシ基及びＣ_３～Ｃ_１２シクロアルキルオキシ基からなる群から独立して選択され、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アルケニルオキシ基、アルキニルオキシ基及びシクロアルキルオキシ基は、任意選択で置換されており、アルキル基、アルコキシ基、シクロアルキル基及びシクロアルコキシ基は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される、１個又は複数のヘテロ原子により任意選択で分断されている。

【0049】

一般用語「糖」は、本明細書では、モノサッカライド、例えば、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）及びフコース（Ｆｕｃ）を示すために使用される。用語「糖誘導体」は、本明細書では、モノサッカライド糖の誘導体、すなわち置換基及び／又は官能基を含む、モノサッカライド糖を示すために使用される。糖誘導体の例には、アミノ糖及び糖酸、例えば、グルコサミン（ＧｌｃＮＨ_２）、ガラクトサミン（ＧａｌＮＨ_２）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸（Ｓｉａ）（シアル酸は、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）とも呼ばれる。）及びＮ－アセチルムラミン酸（ＭｕｒＮＡｃ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）及びイズロン酸（ＩｄｏＡ）が含まれる。糖誘導体の例はまた、本明細書においてＳｕ（Ａ）_ｘで示される化合物も含み、ここで、Ｓｕは、糖又は糖誘導体であり、Ｓｕはｘ個の官能基Ａを含む。

【0050】

用語「ヌクレオチド」は、本明細書では、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのどちらか）及び１つ、２つ又は３つのリン酸エステル基から構成される分子を指す。リン酸エステル基がない場合、核酸塩基及び糖は、ヌクレオシドを構成する。したがって、ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸又はヌクレオシド三リン酸と呼ぶこともできる。核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンとすることができる。ヌクレオチドの例には、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）が含まれる。

【0051】

用語「タンパク質」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用される。本明細書では、約１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドが、タンパク質と考えられる。タンパク質は天然のアミノ酸を含み得るが、非天然アミノ酸も含んでもよい。

【0052】

用語「糖タンパク質」は、本明細書では、タンパク質に共有結合している、１つ若しくは複数のモノサッカライド鎖又は１つ若しくは複数のオリゴサッカライド鎖（「グリカン」）を含む、タンパク質を指す。グリカンは、タンパク質のヒドロキシル基（Ｏ－結合型グリカン）、例えばセリン、トレオニン、チロシン、ヒドロキシリシン若しくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基に、又はタンパク質のアミド官能基（Ｎ－糖タンパク質）、例えばアスパラギン若しくはアルギニンに、又はタンパク質の炭素（Ｃ－糖タンパク質）、例えばトリプトファンに結合し得る。糖タンパク質は、１つを超えるグリカンを含むことがあり、１つ又は複数のモノサッカライド及び１つ又は複数のオリゴサッカライドグリカンを含むことがあり、Ｎ－結合型、Ｏ－結合型及びＣ－結合型グリカンの組合せを含むことがある。すべてのタンパク質の５０％超が、あるグリコシル化形態を有しており、したがって、糖タンパク質として認められることが判断される。糖タンパク質の例には、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＣＡＬ（キャンディダ・アンタルチカ（ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｔｉｃａ）リパーゼ）、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、不凍タンパク質及び抗体が含まれる。

【0053】

用語「グリカン」は、本明細書では、タンパク質に結合している、モノサッカライド鎖又はオリゴサッカライド鎖を指す。したがって、用語グリカンとは、糖タンパク質の炭水化物の部分を指す。グリカンは、１つの糖のＣ－１炭素を介してタンパク質に結合しており、この糖は、さらに置換されていなくてもよく（モノサッカライド）、又はそのヒドロキシル基の１つ又は複数においてさらに置換されていてもよい（オリゴサッカライド）。天然に存在するグリカンは、通常、１～約１０のサッカライド部分を含む。しかし、より長鎖のサッカライド鎖がタンパク質に結合している場合、前記サッカライド鎖は、本明細書ではグリカンとも考えられる。

【0054】

糖タンパク質のグリカンは、モノサッカライドであってもよい。通常、糖タンパク質のモノサッカライドグリカンは、タンパク質と共有結合している、単一のＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、マンノース（Ｍａｎ）又はフコース（Ｆｕｃ）からなる。

【0055】

グリカンはやはり、オリゴサッカライドであってもよい。糖タンパク質のオリゴサッカライド鎖は、直鎖状又は分岐状であってもよい。オリゴサッカライドにおいて、タンパク質に直接結合している糖は、コア糖と呼ばれる。オリゴサッカライドにおいて、タンパク質に直接結合しておらず、且つ少なくとも２つの別の糖に結合している、糖は、内部糖と呼ばれる。オリゴサッカライドでは、タンパク質に直接結合していないが、他の単一の糖に結合している、すなわち１つ又は複数のその他のヒドロキシル基においてさらなる糖の置換基を有していない糖は、末端糖と呼ばれる。誤解を回避するため、糖タンパク質のオリゴサッカライドにおいて、１つだけのコア糖を除いて、複数の末端糖が存在し得る。

【0056】

グリカンは、Ｏ－結合型グリカン、Ｎ－結合型グリカン又はＣ－結合型グリカンとすることができる。Ｏ－結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、通常、セリン（Ｓｅｒ）又はトレオニン（Ｔｈｒ）のヒドロキシル基を介して、タンパク質のアミノ酸中のＯ－原子に結合している。Ｎ－結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、タンパク質のアミノ酸中のＮ原子を介して、通常、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）の側鎖中のアミド窒素を介して、タンパク質に結合している。Ｃ－結合型グリカンでは、モノサッカライド又はオリゴサッカライドグリカンは、タンパク質のアミノ酸中のＣ原子、通常、トリプトファン（Ｔｒｐ）のＣ原子に結合している。

【0057】

タンパク質に直接結合しているオリゴサッカライドの末端は、グリカンの還元末端と呼ばれる。オリゴサッカライドの別の末端は、グリカンの非還元末端と呼ばれる。

【0058】

Ｏ－結合型グリカンの場合、幅広い多様な鎖が存在する。天然に存在するＯ－結合型グリカンは、ガラクトース、シアル酸及び／又はフコースによりさらに置換されている、セリン又はトレオニン結合α－Ｏ－ＧａｌＮＡｃ部分を、通常、特徴としている。グリカン置換を有するヒドロキシル化アミノ酸は、タンパク質中の任意のアミノ酸配列の一部とすることができる。

【0059】

Ｎ－結合型グリカンの場合、幅広い多様な鎖が存在する。天然に存在するＮ－結合型グリカンは、アスパラギン結合β－Ｎ－ＧｌｃＮＡｃ部分であって、次に、その４－ＯＨにおいてβ－ＧｌｃＮＡｃによりさらに置換されており、次に、その４－ＯＨ位において、β－Ｍａｎによりさらに置換されており、次に、その３－ＯＨ及び６－ＯＨにおいてα－Ｍａｎによりさらに置換されている、β－Ｎ－ＧｌｃＮＡｃ部分を、通常、特徴としており、グリカン五糖Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２になる。コアＧｌｃＮＡｃ部分は、その６－ＯＨにおいて、α－Ｆｕｃによりさらに置換されていてもよい。五糖であるＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２は、Ｎ－結合糖タンパク質のほとんどすべての共通の足場オリゴサッカライドであり、以下に限定されないが、Ｍａｎ、ＧｌｃＮＡｃ、Ｇａｌ及びシアル酸を含めた、幅広い様々な他の置換基を有していてもよい。その側鎖のグリカンにより置換されているアスパラギンは、通常、配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であり、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓｅｒ／Ｔｈｒは、セリン又はトレオニンのどちらかである。

【0060】

用語「抗体」は、本明細書では、その通常の科学的な意味で使用される。抗体は、特定の抗原を認識して結合する能力がある免疫系により産生するタンパク質である。抗体は、糖タンパク質の一例である。用語、抗体は、本明細書では、その最も幅広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、抗体断片、並びに二重及び単鎖抗体を具体的に含む。用語「抗体」は、本明細書では、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びがん抗原に特異的に結合する抗体を含むことがやはり意図されている。用語「抗体」は、全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を含むが、抗体の断片、例えば、抗体Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ’）_２、切断した抗体に由来するＦｖ断片若しくはＦｃ断片、ｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ダイアボディ又はｓｃＦｖも含むことが意図されている。さらに、この用語には、遺伝子操作された抗体及び抗体の誘導体を含む。抗体、抗体の断片、及び遺伝子操作された抗体は、当技術分野で公知の方法によって得ることができる。上市されている適切な抗体には、とりわけ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、トシツモマブ－^１３１Ｉ、セツキシマブ、イブリツキシマブチウキセタン、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、カナキヌバム、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムバブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブが含まれる。

【0061】

用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理的効果を得ることを指す。この効果は、疾患若しくはその症状を完全に又は部分的に予防するという点で、予防的であってもよく、並びに／又は疾患及び／若しくは疾患に起因する悪影響を部分的に又は完全に治癒するという点で、治療的であってもよい。「処置」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物における、特にヒトにおける疾患のいかなる処置にも及んでおり、疾患に罹りやすいおそれがあるが、疾患を有していると未だ診断されていない対象において、疾患の発生を予防すること；疾患を阻害すること、すなわちその発症を抑止すること；疾患を軽減すること、すなわち疾患の後退を引き起こすことを含む。

【0062】

修飾抗体の調製方法
本発明は、修飾抗体を調製する方法であって、好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップを含み、好適な触媒が、Ｓｕ（Ａ）_ｘが基質である触媒として定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位に結合しており、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択でフコシル化されている、方法に関する。

【0063】

特に好ましい実施形態では、触媒は、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。

【0064】

本発明による方法により得ることができる修飾抗体は、以下により詳細に記載されている。

【0065】

本発明による修飾抗体の調製方法において、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合する。前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、Ｎ－グリコシド結合を介して、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に、１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体のＮ－結合型グリコシル化部位に結合しており、前記Ｎ－結合型グリコシル化部位は、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位である。

【0066】

ＩｇＧ抗体が全抗体である場合、抗体は、通常、２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖及び２つのＩｇ軽鎖からなる。Ｉｇ重鎖は、定常ドメインであるＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３からなる定常領域、並びに可変領域Ｖ_Ｈを含む。Ｉｇの軽鎖は、可変領域Ｖ_Ｌ及び定常領域Ｃ_Ｌからなる。

【0067】

本明細書では、用語「単一重鎖と単一軽鎖との組合せ」とは、１つの重Ｉｇ鎖と１つの軽Ｉｇ鎖との組合せを指す。全抗体は、２つの重鎖と２つの軽鎖からなる対称な二量体であるので、全抗体は、単一重鎖と単一軽鎖との前記組合せの２つからなる。用語「単一重鎖と単一軽鎖との組合せ」は、本明細書では、ＩｇＧ抗体の部分を定義する意味として単に使用されているに過ぎず、ここで、前記Ｎ－グリコシル化部位が存在していてもよく、及び本明細書では、特に明記されない限り、例えば還元ＩｇＧ抗体を指すわけではない。

【0068】

こうして、用語「単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体」は、本明細書では、１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位が、前記組合せの、重鎖のＣ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３若しくはＶ_Ｈドメイン、又は軽鎖のＣ_Ｌ若しくはＶ_Ｌドメインに存在していると定義する。

【0069】

ＩｇＧ抗体が全抗体である場合、単一重鎖と単一軽鎖との組合せが１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むので、全抗体は、したがって、２つの（かつ、２を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位、すなわち、単一重鎖と単一軽鎖の各組合せ上に１つを含むことを理解されたい。

【0070】

上で定義されている通り、用語「抗体」は、本明細書では、全抗体だけでなく、抗体断片も指し、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、前記ＩｇＧ抗体は、やはり、抗体断片であってもよい。例えば、Ｃ_Ｈ２又はＣ_Ｈ３ドメイン上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、Ｆｃ断片は、前記断片が、軽鎖ドメインを含まない場合でさえも、本明細書では、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体とやはり考えられる。単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体であると本明細書で考え得る抗体断片の例には、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、（Ｆａｂ’）_２断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ断片、還元抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディなどが含まれるが、但し、前記断片は、ちょうど１つしかＮ－結合型グリコシル化部位を含まないことを条件とする。

【0071】

好ましい実施形態では、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体は、全抗体である。単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体が、全抗体である場合、すなわち、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む抗体である場合、全抗体は２つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む。

【0072】

用語「Ｎ－結合型グリコシル化部位」とは、本明細書では、抗体上の部位であって、モノ又はオリゴサッカライドが、Ｎ－グリコシド結合を介して、抗体に結合している、部位を指す。抗体に結合している、モノ又はオリゴサッカライドは、本明細書では、グリカンとも呼ばれる。

【0073】

ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、高度に保存されているＮ－グリコシル化部位を保有する。保存されているＮ－結合型グリコシル化部位はまた、天然のＮ－結合型グリコシル化部位と呼ぶこともできる。この保存部位に結合しているＮ－グリカンは、主にコアがフコシル化されている、複合型の二アンテナ構造である。さらに、これらのＮ－グリカンの少量は、二分断ＧｌｃＮＡｃ及びα－２，６－結合シアル酸残基も保有する。ＩｇＧにおける天然のグリコシル化部位は、Ａｓｎ２９７又はＮ２９７とも呼ばれる、アスパラギン２９７（又は、その周辺）に存在している。

【0074】

図６は、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体のいくつかの例を示しており、これらのグリコシル化部位のいずれも、Ｎ２９７に保存されているグリコシル化部位ではない。

【0075】

本明細書では「コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基」とも呼ばれる、用語「近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基」とは、Ｎ－グリコシド結合を介して、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体のＮ－グリコシル化部位に、好ましくは、前記ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ１を介して、抗体アミノ酸（ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）の側鎖におけるアミド基に、より好ましくは、アスパラギン又はアルギニンアミノ酸の側鎖におけるアミドに共有結合している、ＧｌｃＮＡｃ残基を指す。前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基又はコア－ＧｌｃＮＡｃ置換基は、任意選択で、フコシル化されている。近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、式（１３８）：

【化1】

によるものである。

【0076】

上記の通り、本発明による修飾抗体の調製方法において、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合する。

【0077】

好ましい実施形態では、前記方法は、好適な触媒の存在下で、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体であって、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が前記グリコシル化部位において抗体に結合している、ＩｇＧ抗体を、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐに接触させるステップを含み、Ｎ－結合型グリコシル化部位は、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、ｘ個の官能基Ａを含む、糖誘導体Ｓｕであり、ｘは１、２、３又は４であり、Ａは、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、Ｐはヌクレオチドであり、好適な触媒は、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが基質である触媒として定義される。前記ＩｇＧ抗体が全抗体である、本方法の好ましい実施形態は、スキーム１に示されている。

【化2】

【0078】

スキーム１では、Ａｂは、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を指し、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、ｂは０（フコシル化されていない）又は１（フコシル化されている）であり、Ｓｕ（Ａ）ｘ－Ｐは、上で定義されている通りである。

【0079】

ＩｇＧ抗体は、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含み、全抗体は、前記組合せの２つからなるので、ＩｇＧ抗体が全抗体である場合、前記全抗体は、２つの（かつ、２を超えない）Ｎ－グリコシル化部位を含む。

【0080】

本発明による修飾抗体の調製方法は、好適な触媒の存在下で、好ましくは好適な触媒の作用により行われる。好適な触媒は、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが基質である触媒として定義される。好ましい実施形態では、触媒は酵素であり、好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、触媒は、ガラクトシルトランスフェラーゼ又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼである。触媒は、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼ、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、及び変異触媒ドメインを含むβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼからなる群から好ましくは選択される。

【0081】

触媒が、変異ドメインを含まないガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、好ましくは、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである。酵素がガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記ガラクトシルトランスフェラーゼは、好ましくは野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである。触媒が変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼである場合、前記変異体ＧａｌＴドメインは、完全長ＧａｌＴ酵素内に存在していてもよいが、触媒ドメインを含む組換え分子に、やはり存在していてもよい。

【0082】

一実施形態では、触媒は、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ又は野生型β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼであり、さらにより好ましくは野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼである。β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ２、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ３及びヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ４からなる群から選択されるのが、さらにより好ましい。β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼが、β（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１であるのが、さらにより好ましい。触媒が野生型β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼである場合、ヒトβ（１，３）－Ｇａｌ－Ｔ５が好ましい。

【0083】

触媒が野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである、この実施形態は、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘにおける官能基Ａが、前記糖誘導体のＣ２又はＣ６、好ましくはＣ６に存在している場合、特に好ましい。この実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、１つの官能基Ａを含むのがさらに好ましい。すなわち、ｘが１であるのが好ましい。Ｐ、Ｓｕ（Ａ）_ｘ及びＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、以下でより詳細に記載されている。

【0084】

本発明による方法の特定の実施形態では、本方法は、好適な触媒の存在下で、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体をＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐに接触させるステップを含み、前記抗体の近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択で、フコシル化されており、好適な触媒が、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが基質であるガラクトシルトランスフェラーゼ又は変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐがヌクレオチドであるが、但し、触媒が、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼである場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、１つの官能基Ａ（すなわち、ｘは１である）を含み、前記官能基Ａは、Ｓｕ（Ａ）_ｘのＣ２又はＣ６、好ましくはＣ６に存在している。

【0085】

したがって、特定の実施形態では、修飾抗体を調製する方法は、好適な触媒の存在下で、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体をＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐに接触させるステップを含み、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、任意選択で、フコシル化されており、好適な触媒は、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが基質である野生型ガラクトシルトランスフェラーゼとして定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、ｘは１であり、Ａは、糖誘導体ＳｕのＣ２又はＣ６、好ましくはＣ６に存在しており、Ａは、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、Ｐはヌクレオチドである。

【0086】

この特定の実施形態における野生型ガラクトシルトランスフェラーゼは、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ又はβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼであるのが好ましく、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼであるのがより好ましい。野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼは、野生型ヒトＧａｌＴ、より好ましくは、野生型ヒトβ４－Ｇａｌ－Ｔ１、野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ２、野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ３及び野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ４からなる群から選択される、野生型ヒトＧａｌＴであるのが、さらにより好ましい。

【0087】

本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法の別の実施形態では、触媒は、変異触媒ドメインを含むガラクトシルトランスフェラーゼであり、好ましくは変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ又は変異触媒ドメインを含むβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼである。β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。

【0088】

好ましい実施形態では、触媒が、変異触媒ドメインを含むβ（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼであり、好ましくは、前記β（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼは、ヒトβ（１－３）－Ｇａｌ－Ｔ５である。

【0089】

本触媒が、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼであるのがより好ましく、変異触媒ドメインを含むβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼＩであるのがより好ましく、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１、ヒトβ４－Ｇａｌ－Ｔ１、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ２、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ３及びヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ４からなる群から選択されるのがさらにより好ましく、すべてが変異触媒ドメインを含む。

【0090】

触媒が変異触媒ドメインを含む、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１であるのが最も好ましい。

【0091】

本発明による修飾抗体の調製方法に好適ないくつかの触媒は、当技術分野で公知である。適切な触媒は、例えば、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼＩに由来する変異触媒ドメインを含む触媒である。触媒ドメインは、本明細書では、本発明による特定の方法において、末端非還元ＧｌｃＮＡｃ－グリカンに特定の糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐを結合させる触媒となることが可能なドメインに折りたたんでいるアミノ酸セグメントを指す。β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼＩは、本明細書では、ＧａｌＴとさらに呼ばれる。こうした変異ＧａｌＴ触媒ドメインは、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁、及び国際公開第２００４／０６３３４４号（アメリカ国立衛生研究所）において開示されている。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁及び国際公開第２００４／０６３３４４号は、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉと呼ばれる、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１のＴｙｒ－２８９変異体を開示している。前記変異触媒ドメインＹ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉの調製方法は、参照により本明細書に明確に組み込まれている、国際公開第２００４／０６３３４４号の３４頁６行目～３６頁２行目に詳細に開示されている。

【0092】

グルコース－β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１０頁２５行目～１２頁４行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。Ｎ－アセチルガラクトサミン－β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１２頁６行目～１３頁２行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。Ｎ－アセチルグルコサミン－β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン結合及びマンノース－β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミン結合の形成を触媒する、変異ＧａｌＴドメインは、国際公開第２００４／０６３３４４号の１２頁１９行目から１４頁６行目（参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。

【0093】

開示されている変異ＧａｌＴドメインには、参照により本明細書に明確に組み込まれている、国際公開第２００４／０６３３４４号の１４頁３１行目～１６頁２８行目に開示されている通り、完全長ＧａｌＴ酵素内部又は触媒ドメインを含有する組換え分子に含まれ得る。

【0094】

別の変異体ＧａｌＴドメインは、例えば、参照により本明細書に明確に組み込まれている、ＢｏｊａｒｏｖａらのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００９年、１９巻、５０９頁により開示されているＹ２８４Ｌであり、この場合、Ｔｙｒ２８４がロイシンにより置きかえられている。

【0095】

別の変異体ＧａｌＴドメインは、例えば、参照により本明細書に明確に組み込まれている、Ｑａｓｂａら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２年、１２巻、６９１頁により開示されているＲ２２８Ｋであり、この場合、Ａｒｇ２２８がリシンにより置きかえられている。

【0096】

触媒はまた、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、好ましくは、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍからなる群から選択されるウシβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインも含むことができる。ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｇ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ａは、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉについて、国際公開第２００４／０６３３４４号、Ｑａｓｂａら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０巻、２１９頁及びＱａｓｂａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２年、２７７巻、２０８３３頁（すべてが、参照により組み込まれている）において開示されているものと同様の方法で、部位特異的変異誘発法により得ることができる。ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎでは、２８９位のチロシンアミノ酸（Ｙ）が、アスパラギン（Ｎ）アミノ酸により置きかえられており、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆでは、２８９位のチロシンアミノ酸（Ｙ）が、フェニルアラニン（Ｆ）アミノ酸により置きかえられており、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍでは、前記チロシンがメチオニン（Ｍ）アミノ酸により、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｖでは、バリン（Ｖ）アミノ酸により、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｇでは、グリシン（Ｇ）アミノ酸により、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉでは、イソロイシン（Ｉ）アミノ酸により、及びＹ２８９Ａでは、アラニン（Ａ）アミノ酸により置きかえられている。

【0097】

本発明により修飾抗体を調製する方法の好ましい実施形態では、前記触媒は、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する、好ましくはウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１に由来する、変異触媒ドメインを含む触媒である。

【0098】

触媒は、好ましくはウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１ ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｆ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｍ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｖ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｇ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ａからなる群から選択される、より好ましくは、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１ ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｌ、ＧａｌＴ Ｙ２８９Ｎ及びＧａｌＴ Ｙ２８９Ｉからなる群から選択される、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼに由来する変異触媒ドメインを含む触媒であるのが好ましい。

【0099】

さらなる好ましい実施形態では、前記触媒は、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｉ、Ｙ２８４Ｌ、Ｒ２２８Ｋ、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ａからなる群から選択される、好ましくはＹ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｉ、Ｙ２８４Ｌ及びＲ２２８Ｋからなる群から選択される、ＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒である。別の好ましい実施形態では、前記触媒は、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ａからなる群から選択される、ウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１変異触媒ドメインを含む、触媒である。前記触媒が、Ｙ２８９Ｌ、Ｙ２８９Ｎ及びＹ２８９Ｉからなる群から選択されるＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒であるのがより好ましく、前記触媒が、Ｙ２８９Ｌからなる群から選択されるＧａｌＴ変異触媒ドメインを含む触媒であるのが、最も好ましい。

【0100】

別のタイプの適切な触媒は、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００９／０２５６４６号に開示されている、α（１，３）－Ｎ－ガラクトシルトランスフェラーゼ（α３Ｇａｌ－Ｔとさらに呼ばれる）、好ましくはα（１，３）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（α３ＧａｌＮＡｃ－Ｔとさらに呼ばれる）に基づく触媒である。α３Ｇａｌ－Ｔの変異は、酵素の供与体特異性を拡張することができ、α３ＧａｌＮＡｃ－Ｔになる。α３ＧａｌＮＡｃ－Ｔの変異は、酵素の供与体特異性を拡張することができる。α（１，３）－Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼのポリペプチド断片及び触媒ドメインは、国際公開第２００９／０２５６４６号の２６頁１８行目～４７頁１５行目、及び７７頁２１行目～８２頁４行目（どちらも参照により本明細書に明確に組み込まれている）に開示されている。

【0101】

本発明により修飾抗体を調製する方法は、例えばリン酸で緩衝した生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ｔｒｉｓ及びグリシンなどの適切な緩衝溶液中で、好ましくは行われる。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はｔｒｉｓ緩衝液であることが好ましい。

【0102】

本方法は、約４～約５０℃の範囲、より好ましくは約１０～約４５℃の範囲、さらにより好ましくは約２０～約４０℃の範囲、及び最も好ましくは約３０～約３７℃の範囲の温度で、好ましくは行われる。

【0103】

本方法は、約５～約９の範囲、好ましくは約５．５～約８．５の範囲、より好ましくは約６～約８の範囲のｐＨで、好ましくは行われる。本方法は、約７～約８の範囲のｐＨで行うのが最も好ましい。

【0104】

Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ｘ個の官能基Ａを含む、糖誘導体として定義され、ここで、ｘは、１、２、３又は４であり、Ａは、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択される。

【0105】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ部分はまた、「修飾糖」と呼ぶこともできる。修飾糖は、本明細書では、糖又は糖誘導体として定義され、前記糖又は糖誘導体は、１個、２個、３個又は４個の官能基Ａを含み、Ａは、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホン化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される。

【0106】

修飾糖又は糖誘導体が、例えば、アジド基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、アジド修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、ケト基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、ケト修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、アルキニル基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、アルキニル修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、チオール基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、チオール修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、チオール前駆体基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、チオール前駆体修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、ハロゲンを含む場合、前記糖又は糖誘導体は、ハロゲン修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。修飾糖又は糖誘導体が、例えば、スルホニルオキシ基を含む場合、前記糖又は糖誘導体は、スルホニルオキシ修飾糖又は糖誘導体と呼ぶことができる。

【0107】

アジド基は、本明細書では、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＮ_３基として定義され、Ｒ^７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基からなる群から独立して選択され、ｏは、０～２４である。Ｒ^７が、水素又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３若しくはＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が、水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましい。ｏは、０～１０であるのが好ましく、０、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましい。Ｒ^７が、水素、－ＣＨ_３若しくはＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが０、１、２、３若しくは４であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ｏが、１又は２であるのがさらにより好ましい。ｏが０であるのが最も好ましい。

【0108】

ケト基は、本明細書では、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＣ（Ｏ）Ｒ^６基として定義され、Ｒ^６は、任意選択で置換されているメチル基又は任意選択で置換されているＣ_２～Ｃ_２４アルキル基であり、Ｒ^７は、水素、ハロゲン、メチル、及びＲ^６からなる群から独立して選択され、ｏは０～２４であり、好ましくは０～１０であり、より好ましくは０、１、２、３、４、５又は６である。Ｒ^７が、水素であるのが好ましい。好ましい実施形態では、Ｒ^６は、任意選択で置換されているＣ_２～Ｃ_２４アルキル基である。Ｓｕ（Ａ）_ｘがアミノ糖から誘導される場合、Ａは、アミノ糖のＮ－原子に結合しているケト基であり、ｏは０であり（すなわち、Ｓｕ（Ａ）が－ＮＣ（Ｏ）Ｒ^６置換基を含む場合）、Ｒ^６は、任意選択で置換されているＣ_２～Ｃ_２４アルキル基である。

【0109】

アルキニル基は、好ましくは、上で定義されている末端アルキニル基又は（ヘテロ）シクロアルキニル基である。一実施形態では、アルキニル基は、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＣ≡Ｃ－Ｒ^７基であり、Ｒ^７及びｏは上で定義されている通りであり、Ｒ^７は、好ましくは水素である。ｏが、０、１、２、３、４、５又は６であり、Ｒ^７が水素であるのが、より好ましい。ｏが０であるのが最も好ましい。

【0110】

チオール基は、本明細書では、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＳＨ基として定義され、Ｒ^７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基からなる群から独立して選択され、ｏは、０～２４である。Ｒ^７が、水素又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３若しくはＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましい。ｏが０～１０であるのが好ましく、０、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素、－ＣＨ_３又はＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが０、１、２、３又は４であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ｏが０、１、２又は３であるのがさらにより好ましく、ｏが０、１又は２であるのがより好ましく、ｏが０であるのが最も好ましい。ｏが０であるのが最も好ましい。特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは０である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは１である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは２である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは３である。

【0111】

チオール基の前駆体は、本明細書では、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＳＣ（Ｏ）ＣＨ_３基として定義され、Ｒ^７及びｏ、及びそれらの好ましい実施形態は、チオール基の場合に上で定義されている通りである。特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは０である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは１である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは２である。別の特に好ましい実施形態では、Ｒ^７は水素であり、ｏは３である。前記チオール前駆体は、－ＳＣ（Ｏ）ＣＨ_３（－ＳＡｃ）であるのが最も好ましい。本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法のステップ（４）では、Ａがチオール基の前駆体である、糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを使用してもよい。前記方法の間に、チオール前駆体はチオール基に変換される。

【0112】

ハロゲンは、本明細書では、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩとして定義される。前記ハロゲンが、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであるのが好ましく、Ｃｌであるのがより好ましい。

【0113】

スルホニルオキシ基は、本明細書では、－［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８基として定義され、Ｒ^７及びｏは、チオール基に関して上で定義されている通りであり、Ｒ^８は、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_２４アリールアルキル基からなる群から選択される。Ｒ^８は、好ましくは、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基又はＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基であり、より好ましくは－ＣＨ_３、－Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基又はＣ_７アルキルアリール基である。Ｒ^８はまた、Ｃ_１～Ｃ_２４アリール基、好ましくはフェニル基であってもよい。Ｒ^８は、最も好ましくは、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。Ｒ^７が、水素、又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３若しくはＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が、水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましい。ｏが、０～１０であるのが好ましく、０、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましい。Ｒ^７が、水素、－ＣＨ_３又はＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが０、１、２、３又は４であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ｏが１又は２であるのがさらにより好ましく、ｏが０であるのが最も好ましい。Ｒ^８は、好ましくは、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基又はＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基であり、より好ましくは－ＣＨ_３、－Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、又はＣ_７アルキルアリール基である。Ｒ^８がフェニル基であるのも、やはり好ましい。スルホニルオキシ基が、メシレート基、－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＨ_３、ベンゼンスルホネート基（－ＯＳ（Ｏ）_２（Ｃ_６Ｈ_５））、又はトシレート基（－ＯＳ（Ｏ）_２（Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_３））であるのが、最も好ましい。

【0114】

ハロゲン化アセトアミド基は、本明細書では、－ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＸ基として定義され、Ｒ^７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基からなる群から独立して選択され、Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、ｏは、０～２４である。Ｒ^７が、水素又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３又はＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が、水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０～１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｒ^７が、水素、－ＣＨ_３又はＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましく、Ｒ^７が水素であり、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｘが、Ｃｌ又はＢｒであるのが好ましく、Ｘが、Ｃｌであるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ＸがＣｌであり、ｏが１であるのが最も好ましい。

【0115】

メルカプトアセトアミド基は、本明細書では、－ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＳＨ基として定義され、Ｒ^７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基からなる群から独立して選択され、ｏは、０～２４である。Ｒ^７が、水素、又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３若しくはＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が、水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０～１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが２、３又は４であるのが最も好ましい。Ｒ^７が、水素、－ＣＨ_３又はＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ｏが、１であるのが最も好ましい。好ましい例には、メルカプトエタノイルアミド基、メルカプトプロパノイルアミド基、メルカプトブタノイルアミド基及びメルカプトペンタノイルアミド基、好ましくはメルカプトプロパノイルアミド基が含まれる。

【0116】

スルホン化ヒドロキシアセトアミド基は、本明細書では、－ＮＨＣ（Ｏ）［Ｃ（Ｒ^７）_２］_ｏＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８基として定義され、Ｒ^７は、水素、ハロゲン及び（任意選択で置換されている）Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基からなる群から独立して選択され、Ｒ^８は、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_２４アリールアルキル基からなる群から選択され、ｏは０～２４である。Ｒ^８は、好ましくは、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基又はＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基であり、より好ましくは－ＣＨ_３、－Ｃ_２Ｈ_５、Ｃ_３の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_９アリール基、又はＣ_７アルキルアリール基である。スルホニルオキシ基は、メシレート基－ＯＳ（Ｏ）_２ＣＨ_３、ベンゼンスルホネート基－ＯＳ（Ｏ）_２（Ｃ_６Ｈ_５）、又はトシレート基－ＯＳ（Ｏ）_２（Ｃ_６Ｈ_４ＣＨ_３）であるのが最も好ましい。Ｒ^７が、水素、又はＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３若しくはＣ_４アルキル基であるのが好ましく、Ｒ^７が、水素又は－ＣＨ_３であるのがより好ましく、水素であるのが最も好ましい。ｏが、０～１０であるのが好ましく、１、２、３、４、５又は６であるのがより好ましく、１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｏが１であるのが最も好ましい。Ｒ^７が、水素、－ＣＨ_３若しくはＣ_２アルキル基であり、及び／又はｏが１、２、３若しくは４であるのがより好ましい。Ｒ^７が水素であり、ｏが、１、２又は３であるのがさらにより好ましい。Ｒ^７がＨであり、ｏが１であり、Ｒ^８が、メシレート基、ベンゼンスルホネート基又はトシレート基であるのが、なおさらにより好ましい。Ｒ^７が水素であり、Ｒ^８が－ＣＨ_３であり、ｏが１であるのが最も好ましい。

【0117】

糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、１個又は複数の官能基Ａを含む。Ｓｕ（Ａ）_ｘが、２個以上の官能基Ａを含む場合、各官能基Ａは独立して選択され、すなわち１つのＳｕ（Ａ）_ｘが、異なる官能基Ａ、例えばアジド基及びケト基などを含んでもよい。好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、アジド基又はケト基であり、より好ましくはアジド基である。別の好ましい実施形態では、官能基Ａは、チオール基又はハロゲンであり、より好ましくはハロゲンである。さらなる好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ａは、アジド基、ケト基、チオール基又はハロゲンである。

【0118】

糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、糖又は糖誘導体Ｓｕ、例えばアミノ糖、又は他には誘導体化されている糖から誘導される。糖及び糖誘導体の例には、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸又はシアル酸（Ｓｉａｌ）及びフコース（Ｆｕｃ）が含まれる。

【0119】

アミノ糖は、ヒドロキシル（ＯＨ）基がアミン基により置きかえられている糖であり、例には、グルコサミン（ＧｌｃＮＨ_２）及びガラクトサミン（ＧａｌＮＨ_２）が含まれる。他の誘導体化されている糖の例には、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸、Ｓｉａ若しくはＮｅｕＮＡｃ）又はフコース（Ｆｕｃ）が含まれる。

【0120】

糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、好ましくは、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）及びＮ－アセチルノイラミン酸（シアル酸Ｓｉａ又はＮｅｕＮＡｃ）から、好ましくはＧｌｃＮＡｃ、Ｇｌｃ、Ｇａｌ及びＧａｌＮＡｃからなるから誘導される。Ｓｕ（Ａ）_ｘが、Ｇａｌ又はＧａｌＮＡｃから誘導されるのがより好ましく、Ｓｕ（Ａ）_ｘがＧａｌＮＡｃから誘導されるのが最も好ましい。

【0121】

Ｓｕ（Ａ）_ｘにおける１個又は複数の官能基Ａは、いくつかの方法で、糖又は糖誘導体Ｓｕに結合されていてもよい。１個又は複数の官能基Ａは、ヒドロキシル（ＯＨ）基の代わりに、糖又は糖誘導体のＣ２、Ｃ３、Ｃ４及び／又はＣ６に結合していてもよい。フコースは、Ｃ６にＯＨ基を欠いているので、ＡがＦｕｃのＣ６に結合している場合、ＡはＨ原子の場所を占めることに留意すべきである。

【0122】

好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘ中の１つ又は複数の官能基が、糖又は糖誘導体ＳｕのＣ２及び／又はＣ６に存在している。官能基Ａが、糖又は糖誘導体のＣ２のＯＨ基の代わりに存在している場合、Ａは、アジド基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から好ましくは選択される。しかし、Ａが、２－アミノ糖誘導体、例えば、ＧａｌＮＡｃ又はＧｌｃＮＡのＣ２に存在する場合、Ａは、アジド基、ハロゲン、チオール基又はその誘導体、及びスルホニルオキシ基からなる群から、より好ましくはアジド基、ハロゲン、チオール基及びスルホニルオキシ基からなる群から好ましくは選択される。

【0123】

Ａがアジド基である場合、Ａが、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ６に結合しているのが好ましい。上記の通り、Ｓｕ（Ａ）_ｘにおける１つ又は複数のアジド置換基が、ヒドロキシル（ＯＨ）の代わりに、又は６－アジドフコース（６－ＡｚＦｕｃ）の場合、水素原子の代わりに、糖又は糖誘導体ＳのＣ２、Ｃ３、Ｃ４又はＣ６に結合していてもよい。代替的又は追加的に、アミノ糖誘導体のＮ－アセチル置換基は、アジドアセチル置換基により置換されていてもよい。好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。Ａがアジド基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐの例は、以下に示されている。

【0124】

Ａがケト基である場合、Ａが、ＳｕのＯＨ基の代わりに、Ｃ２に結合しているのが好ましい。或いは、Ａが、アミノ糖誘導体、好ましくは２－アミノ糖誘導体のＮ－原子に結合していてもよい。したがって、糖誘導体は、－ＮＣ（Ｏ）Ｒ^６置換基を含む。Ｒ^６は、好ましくは、任意選択で置換されているＣ_２～Ｃ_２４アルキル基である。Ｒ^６は、エチル基であることがより好ましい。好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－デオキシ－（２－オキソプロピル）ガラクトース（２－ケトＧａｌ）、２－Ｎ－プロピオニルガラクトサミン（２－Ｎ－プロピオニルＧａｌＮＡｃ）、２－Ｎ－（４－オキソペンタノイル）ガラクトサミン（２－Ｎ－ＬｅｖＧａｌ）及び２－Ｎ－ブチリルガラクトサミン（２－Ｎ－ブチリルＧａｌＮＡｃ）、より好ましくは２－ケトＧａｌＮＡｃ及び２－Ｎ－プロピオニルＧａｌＮＡｃからなる群から選択される。Ａがケト基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐの例は、以下に示されている。

【0125】

Ａがアルキニル基、好ましくは末端アルキニル基又は（ヘテロ）シクロアルキニル基である場合、前記アルキニル基は２－アミノ糖誘導体上に存在するのが好ましい。Ａがアルキニル基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘの例は、２－（ブタ－３－イン酸アミド）－２－デオキシ－ガラクトースである。Ａがアルキニル基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐの例は、以下に示されている。

【0126】

Ａがチオール基である場合、前記チオール基は、糖誘導体の６位又は２ーアミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがチオール基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘの一例は、２－（メルカプトアセトアミド）－２－デオキシ－ガラクトースである。Ａがチオール基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘの別の例は、６－メルカプト－６－デオキシ－ガラクトースである。

【0127】

Ａがハロゲンである場合、前記ハロゲンは、糖誘導体の６位又は２ーアミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）_ｘの一例は、２－（クロロアセトアミド）－２－デオキシ－ガラクトースである。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）_ｘの別の例は、６－ヨード－６－デオキシ－ガラクトースである。Ａがハロゲンである、Ｓｕ（Ａ）_ｘの別の例は、６－（クロロアセトアミド）－６－デオキシ－ガラクトースである。

【0128】

Ａがスルホニルオキシ基である場合、前記スルホニルオキシ基は、糖誘導体の６位又は２－アミノ糖誘導体に存在しているのが好ましい。Ａがスルホニルオキシ基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘの一例は、２－（メチルスルホニルオキシアセトアミド）－２－デオキシ－ガラクトース（２－ＧａｌＮＡｃＯＭｓ）である。Ａがスルホニルオキシ基である、ＳｕＡ_ｘの別の例は、２－（ベンゼンスルホニルオキシアセトアミド）－２－デオキシ－ガラクトース（２－ＧａｌＮＡｃＯＭｓ）である。Ａがスルホニルオキシ基である、Ｓｕ（Ａ）_ｘの別の例は、６－（メチルスルホニル）－ガラクトースである。

【0129】

Ａが、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基又はスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基である場合、前記基は、糖誘導体の６位に存在しているのが好ましい。

【0130】

Ｐは、本明細書では、ヌクレオチドとして定義される。Ｐは、好ましくは、ヌクレオシド一リン酸及びヌクレオシド二リン酸からなる群から、より好ましくは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）及びシチジン一リン酸（ＣＭＰ）からなる群から、より好ましくは、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸及び（ＣＤＰ）からなる群から選択される。ＰがＵＤＰであるのが最も好ましい。

【0131】

ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシド二リン酸Ｐが糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘに結合している、式Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐのいくつかの化合物は、当技術分野で公知である。例えば、参照により本明細書にすべてが組み込まれている、Ｗａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０年、１６巻、１３３４３～１３３４５頁、Ｐｉｌｌｅｒら、ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２年、７巻、７５３頁、Ｐｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５年、１５巻、５４５９～５４６２頁、及び国際公開第２００９／１０２８２０号は、化合物Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐのいくつか、及びそれらの合成を開示している。

【0132】

アジド、ケト、アルキニル、ハロゲン、チオール、チオール化アセトアミド及びハロゲン化アセトアミド置換糖及び糖誘導体のいくつかの例（９～１１）及び（１２～２７）が、以下に示されており、上記のすべてが、それらの対応するＵＤＰ糖であるＳｕ（Ａ）_ｘ－ＵＤＰ（９ｂ～１１ｂ）及び（１２ｂ～２７ｂ）に変換することができる。

【化3】

【0133】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）、６－ＡｚＧａｌ－ＵＤＰ（１０ｂ）、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）、４－ＡｚＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ、６－ＡｚＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ、６－ＡｚＧｌｃ－ＵＤＰ、６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ－ＵＤＰ、２－ケトＧａｌ－ＵＤＰ（１２ｂ）、２－Ｎ－プロピオニルＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（Ｒ^１がエチルである１３ｂ）及び２－（ブタ－３－イン酸アミド）－２－デオキシ－ガラクトース－ＵＤＰ（ｎ＝１である１５ｂ）からなる群から選択されるのが好ましい。Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）又は６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）であるのがより好ましい。

【化4】

【0134】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）又は６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）であるのが好ましい。ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）及び６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）の合成は、どちらも参照により本明細書に組み込まれている、Ｐｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００５年、１５巻、５４５９～５４６２頁及びＷａｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１０年、１６巻、１３３４３～１３３４５頁に記載されている。

【0135】

２－ケトＧａｌ－ＵＤＰ（１２ｂ）の合成は、どちらも参照により本明細書に組み込まれている、Ｑａｓｂａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３年、１２５巻、１６１６２頁、特にその補足情報に開示されている。

【0136】

２－（ブタ－３－イン酸アミド）－２－デオキシ－ガラクトース－ＵＤＰ（１５ｂ）の合成は、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００９／１０２８２０号に開示されている。

【0137】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐのさらなる例には、６－クロロ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（ＸがＣｌである６－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ、（２４ｂ））、６－チオ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ、（１８ｂ））などの６－Ａ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－Ａ－Ｇａｌ－ＵＤＰ）、又は２－クロロ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ）、２－チオ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ）などの２－Ａ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－Ａ－Ｇａｌ－ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換してもよい。例には、６－クロロアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（ＸがＣｌである６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ、（２６ｂ））、６－チオアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ、（２０ｂ））などの６－Ａ－アセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＡ－ＵＤＰ）、又は２－クロロアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（ＸがＣｌである２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ、（２２ｂ））、２－チオアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ、（１６ｂ））及び２－アセチルチオアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ－ＵＤＰ）などの２－Ａ－アセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＡ－ＵＤＰ）が含まれる。さらなる例には、３－チオプロパノイルアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ－ＵＤＰ）及び４－チオブタノリルアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＢｕＳＨ－ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。

【0138】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２６ｂ））、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（２０ｂ）、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２２ｂ））、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（１６ｂ）、６－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２４ｂ））、２－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ、２－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ及び６－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ（１８ｂ）からなる群から、又は２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ－ＵＤＰ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨ－ＵＤＰからなる群から選択されるのが好ましい。

【0139】

Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐが、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２６ｂ））、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（２０ｂ）、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２２ｂ））、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（１６ｂ）、６－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ（ＸがＣｌである（２４ｂ））及び２－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰからなる群から、又は２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ－ＵＤＰ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨ－ＵＤＰからなる群から選択されるのがより好ましい。

【0140】

修飾抗体を調製する方法の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含み、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。

【0141】

好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0142】

さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別のさらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0143】

好ましい実施形態では、Ａは、アジド基、チオール基又はハロゲンである。

【0144】

Ａがアジド基である好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から好ましくは選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から選択されるのがより好ましい。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択されるのがより好ましい。

【0145】

本発明による修飾抗体の修飾方法の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。本発明による修飾抗体の修飾方法の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0146】

さらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。別のさらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0147】

最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。別の最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0148】

糖及び糖誘導体のさらなる例は、図４及び図５に示されている。図４は、アジド修飾ガラクトース誘導体（９～１１）の構造を示しており、これらの誘導体について、ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移させるために、対応するＵＤＰ糖を使用することができる。図５は、他のガラクトース誘導体（１２～２７）の構造を示しており、これらの誘導体について、ガラクトシルトランスフェラーゼ（又は、その変異体）の作用下で、ＧｌｃＮＡｃ末端糖に転移させるために、対応するＵＤＰ糖を使用することができる。

【0149】

図７は、ガラクトシルトランスフェラーゼを作用させて、ＧｌｃＮＡｃ末端グリカン上に酵素により導入するための、修飾ＵＤＰ－ガラクトースヌクレオチド２８～３１の構造を示している。

【0150】

本発明による修飾抗体を調製する方法において使用することができる、糖誘導体ヌクレオチドＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐのいくつかは、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼの基質である。これらの糖誘導体ヌクレオチドであるＳｕ（Ａ）_ｘ－Ｐの場合、本発明による方法は、触媒として、野生型ガラクトシルトランスフェラーゼ、好ましくは野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼ、より好ましくは野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼＩの存在下で行うことができる。野生型β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼは、野生型ヒトＧａｌＴ、より好ましくは、野生型ヒトβ４－Ｇａｌ－Ｔ１、野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ２、野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ３及び野生型ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ４からなる群から選択される野生型ヒトＧａｌＴであるのがより好ましい。

【0151】

野生型ガラクトシルトランスフェラーゼが触媒として使用される場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、ｘが１であり、Ａが糖誘導体のＣ２又はＣ６、より好ましくはＣ６に存在しており、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐからなる群から選択されるのが好ましい。Ａは、ヒドロキシル基の代わりに、糖誘導体に直接、置換されていてもよい。例には、６－アジド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＡｚＧａｌ－ＵＤＰ、（１０ｂ））、６－クロロ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（ＸがＣｌである６－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ、（２４ｂ））、６－チオ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ、（１８ｂ））などの６－Ａ－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－Ａ－Ｇａｌ－ＵＤＰ）、又は２－アジド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＡｚＧａｌ－ＵＤＰ）、２－クロロ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＣｌＧａｌ－ＵＤＰ）、２－チオ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ）などの２－Ａ－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－Ａ－Ｇａｌ－ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、アセトアミド基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、このアセトアミド基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換していてもよい。例には、６－アジドアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＮ_３－ＵＤＰ）、６－クロロアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（ＸがＣｌである６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ、（２６ｂ））、６－チオアセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ、（２０ｂ））などの６－Ａ－アセトアミド－６－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（６－ＧａｌＮＡｃＡ－ＵＤＰ）、又は２－アジドアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＮ_３－ＵＤＰ、（９ｂ））、２－クロロアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ、（２２ｂ））、２－チオアセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ、（１６ｂ））などの２－Ａ－アセトアミド－２－デオキシガラクトース－ＵＤＰ（２－ＧａｌＮＡｃＡ－ＵＤＰ）が含まれる。或いは、Ａは、別の官能基の一部として糖誘導体に間接的に置換され、この別の官能基は、ひいては、ヒドロキシル基を置換しているか、又はヒドロキシル基に結合していてもよい。こうした他の官能基の例には、（ヘテロ）アルキル鎖又は（ヘテロ）アリール鎖が含まれる。

【0152】

本発明による修飾抗体を調製する方法の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、ＧａｌＮＡｚ－ＵＤＰ（９ｂ）、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（１６ｂ）、２－ＧａｌＮＡｃＸ－ＵＤＰ（２２ｂ）、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８－ＵＤＰ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ－ＵＤＰ（２０ｂ）、６－ＧａｌＮＡｃＸ－ＵＤＰ（２６ｂ）及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８－ＵＤＰからなる群から選択され、触媒は、変異触媒ドメインＧａｌＴを含むウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ｒ^８は、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。本発明による修飾抗体の調製方法の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ－ＵＤＰ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨ－ＵＤＰからなる群から選択され、触媒は、変異触媒ドメインＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）を含むウシβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１であり、ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ｒ^８は、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。

【0153】

さらなる好ましい実施形態では、２－ＧａｌＮＡｃＸ－ＵＤＰは、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ又は２－ＧａｌＮＡｃＢｒ－ＵＤＰであり、より好ましくは２－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰであり、６－ＧａｌＮＡｃＸ－ＵＤＰは、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰ又は６－ＧａｌＮＡｃＢｒ－ＵＤＰであり、より好ましくは６－ＧａｌＮＡｃＣｌ－ＵＤＰである。別の好ましい実施形態では、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８－ＵＤＰにおけるＲ^８は、メチル、フェニル又はｐ－トリルであり、最も好ましくはメチルであり、６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８－ＵＤＰにおけるＲ^８は、メチル、フェニル又はｐ－トリルであり、最も好ましくはＲ^８はメチルである。

【0154】

本発明により修飾抗体を調製する方法の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（１１ｂ）、６－ＨＳＧａｌ－ＵＤＰ（１８ｂ）、６－ＸＧａｌ－ＵＤＰ（２４ｂ）、６－Ｒ^８Ｓ（Ｏ）_２ＯＧａｌ－ＵＤＰからなる群から選択され、触媒は、野生型ヒトＧａｌＴであり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、Ｒ^８は、メチル基、エチル基、フェニル基又はｐ－トリル基である。Ｘは、より好ましくは、Ｃｌ又はＢｒであり、最も好ましくはＣｌである。Ｒ^８は、より好ましくはメチル、フェニル又はｐ－トリルであり、最も好ましくはメチルである。ヒトＧａｌＴは、好ましくは、ヒトβ４－Ｇａｌ－Ｔ１、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ２、ヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ３及びヒトβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ４である。

【0155】

上記の通り、本発明による抗体の修飾方法では、Ｓｕ（Ａ）_ｘ－Ｐは、好適なガラクトシルトランスフェラーゼ触媒の基質である任意の糖誘導体ヌクレオチドであってもよい。

【0156】

ＩｇＧ抗体のＮ－グリコシル化部位に結合している、近位Ｎ－結合型Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ置換基中の糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、例えば、β（１，４）－グリコシド結合を介して、ＧｌｃＮＡｃ部分のＣ４に、又はα（１，３）－グリコシド結合を介して前記ＧｌｃＮＡｃ部分のＣ３に結合していてもよい。Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ置換基の近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、Ｎ－グリコシド結合を介してＣ１によりタンパク質又は抗体に、好ましくは、タンパク質又は抗体のアスパラギンアミノ酸の側鎖におけるアミド窒素原子に結合している。前記Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ置換基中の近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、任意選択で、フコシル化されている。抗体に結合しているＳｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ部分における糖誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘは、β（１，４）－グリコシド結合を介して前記ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ４に、又はα（１，３）－グリコシド結合を介して前記ＧｌｃＮＡｃ部分のＣ３に結合するかどうかは、本発明による方法のステップ（４）及び／又はステップ（５ｂ）において使用される触媒に依存する。前記ステップが、β（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で行われる場合、結合は、Ｓｕ（Ａ）_ｘのＣ１と近位ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ４により、β（１，４）－グリコシド結合を介して起こる。この方法が、α（１，３）－ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で行われる場合、結合は、Ｓｕ（Ａ）_ｘのＣ１と近位ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ３により、α（１，３）－グリコシド結合を介して起こる。

【0157】

Ａがアジド官能基である場合、本発明による抗体を修飾する方法によって得ることができる、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、アジド修飾抗体と呼ばれる。Ａがケト官能基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、ケト修飾抗体と呼ばれる。Ａがアルキニル官能基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、アルキン修飾抗体と呼ばれる。Ａがチオール基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、チオール修飾抗体と呼ばれる。Ａがハロゲン基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、ハロゲン修飾抗体と呼ばれる。Ａがスルホニルオキシ基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、スルホニルオキシ修飾抗体と呼ばれる。Ａがメルカプトアセトアミド基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、チオール化アセトアミド修飾抗体と呼ばれる。Ａがハロゲン化アセトアミド基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体と呼ばれる。Ａがスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基である場合、Ｓｕ（Ａ）_ｘＧｌｃＮＡｃ残基を含むＩｇＧ抗体は、メルカプトアセトアミド修飾抗体と呼ばれる。

【0158】

修飾抗体を調製する方法、すなわちモノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させる方法は、例えばリン酸で緩衝した生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ｔｒｉｓ及びグリシンなどの適切な緩衝溶液中で、好ましくは行われる。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はｔｒｉｓ緩衝液が好ましい。

【0159】

本方法は、約４～約５０℃の範囲、より好ましくは約１０～約４５℃の範囲、さらにより好ましくは約２０～約４０℃の範囲、及び最も好ましくは約３０～約３７℃の範囲の温度で、好ましくは行われる。

【0160】

本方法は、約５～約９の範囲、好ましくは約５．５～約８．５の範囲、より好ましくは約６～約８の範囲のｐＨで、好ましくは行われる。本方法は、約７～約８の範囲のｐＨで行うのが最も好ましい。

【0161】

本発明による修飾抗体を調製する方法の一実施形態は、
（１） 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を用意するステップであって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、前記グリコシル化部位において抗体に結合している、ステップ、及び
（２） 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Ｓｕ（Ａ）_ｘが基質である触媒として定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択され、前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択でフコシル化されている、ステップ
を含む。

【0162】

本発明による修飾抗体を調製する方法のより特定の実施形態では、ステップ（１）において、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体は、部位特異的変異誘発法により得られる。

【0163】

別のより特定の実施形態では、修飾抗体を調製する方法は、
（１） 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を用意するステップであって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位である、ステップ、及び
（２） エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの作用により、前記グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドをトリミングして、前記グリコシル化部位における近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を得るステップ、及び
（３） 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Ｓｕ（Ａ）_ｘが基質である触媒として定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、ステップ、
を含み、
ステップ（２）及び（３）における前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基が、任意選択でフコシル化されている。

【0164】

ステップ（１）において、前記ＩｇＧ抗体は、糖鎖工学的方法により得ることができる。例えば、前記ＩｇＧ抗体は、単一重鎖及び単一軽鎖の組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体の調製方法により得ることができ、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、
（ｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去されており、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、その野生型対応物と比べると、１つの改変されたＮ－グリコシル化部位を含み、
（ｉｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去されており、軽鎖が、その野生型対応物と比べると、１つの改変されたＮ－グリコシル化部位を含む。

【0165】

ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）の好ましい実施形態では、重鎖の２９７位のアスパラギンは、グルタミンに改変されている。したがって、この好ましい実施形態では、重鎖は、Ｎ２９７Ｑ変異を含む。Ｎ２９７Ｑ変異を含む、ＩｇＧ抗体では、保存されているＮ２９７のＮ－グリコシル化部位が除去される。

【0166】

したがって、前記ＩｇＧ抗体の調製方法の好ましい実施形態では、ステップ（１）において：
（ｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去されており、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、その野生型対応物と比べると、１つの改変されたＮ－グリコシル化部位を含む；又は、
（ｉｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去されており、軽鎖が、その野生型対応物と比べると、１つの改変されたＮ－グリコシル化部位を含む。

【0167】

この方法の別の好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）における重鎖又はステップ（ｉｉ）における軽鎖は、１つの新しく導入されたグリコシル化部位を含む。さらに好ましい実施形態では、ステップ（ｉ）における重鎖のアミノ酸配列、又はステップ（ｉｉ）における軽鎖のアミノ酸配列は、コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含み、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸である。前記コンセンサス配列のアミノ酸配列への導入は、前記配列のアスパラギンアミノ酸における、Ｎ－グリコシル化部位の存在下で、好ましくは起こる。

【0168】

したがって、前記ＩｇＧ抗体の調製方法の好ましい実施形態では、ステップ（１）において：
（ｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去され、重鎖の改変されたアミノ酸鎖が、コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含み、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸である；又は
（ｉｉ） 重鎖のアミノ酸鎖が改変されて、２９７位のＮ－グリコシル化部位が除去され、軽鎖のアミノ酸が、コンセンサス配列Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを含み、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸である。

【0169】

本発明による修飾抗体を調製する方法のこの特定の実施形態のステップ（２）は、適切な酵素の作用によりグリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドのトリミングを行い、前記グリコシル化部位において近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を得るステップであって、適切な酵素は、トリミングされることになるオリゴサッカライドが基質である酵素として定義されるステップを含む。

【0170】

実施例５において記載されている、トラスツズマブ糖変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）をトリミングするための方法は、図１０に図示されているＭＳプロファイルから見ることができ、この図は、主要分子質量が５０９３５、５１２２５及び５１５１７である、原料抗体上のある範囲のグリコ型を示しており、これらの分子質量は、エンドグリコシダーゼによるトリミングの後に、質量４９２２４及び４９５１４である２つのピークに収束している。結論づけることができる通り、抗体の均質性は、トリミング方法の結果として向上する。

【0171】

単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体では、オリゴサッカライドは、Ｎ－グリコシル化部位において、好ましくは抗体アミノ酸のアミド側鎖に結合している。オリゴサッカライドは、Ｎ－グリコシド結合を介して、多くの場合、アスパラギン（Ａｓｎ）又はアルギニン（Ａｒｇ）のアミノ酸側鎖に結合している。抗体に結合しているオリゴサッカライドは、グリカンとも呼ばれる。グリカンは、例えば、抗体の一部である、アスパラギンアミノ酸のアミド側鎖に結合している、ＧｌｃＮＡｃ残基のＣ１を介して、抗体に結合し得る。

【0172】

多くの異なるタイプのグリカンが存在する。上記の通り、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、高度に保存されているＮ－グリコシル化部位を有する。この部位に結合しているＮ－グリカンは、主にコアがフコシル化されている、複合型の二アンテナ構造である。別のタイプのグリカンは、高マンノースグリカンのクラスである。高マンノースは、通常、２つのＮ－アセチルグルコサミン、及び様々な数のマンノース残基を含む。

【0173】

図１は、複合型の二アンテナグリカン、並びにガラクトシル化（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２）及びフコシル化に関して様々なグリコ型を示す。

【0174】

図２は、通常の発現、続いてエンド－グリコシダーゼ（１）を用いてトリミングすることにより、又はα－及びβ－マンノシダーゼ（２）を用いてトリミングすることにより得ることができる、モノクローナル抗体の様々なグリコシル化プロファイルの例を示している。グリコ型３は、シアリダーゼ及びガラクトシダーゼが組み合わされて作用すると、グリコ型（Ｇ０、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆ）の通常の混合物をトリミングすることにより得ることができる。

【0175】

好ましい実施形態では、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体では、Ｎ－結合型グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドは、複合型の二アンテナグリカン、及びそのグリコ型である。

【0176】

上記の通り、グリカンは、ＧｌｃＮＡｃ残基を介して抗体に結合することができ、このＧｌｃＮＡｃ残基はフコシル化されていてもよい。図１及び図２では、これはｂによって示されている。ｂが０の場合、前記ＧｌｃＮＡｃ残基は、フコシル化されておらず、ｂが１の場合、前記ＧｌｃＮＡｃはフコシル化されている。

【0177】

多くのグリカンでは、第２のＧｌｃＮＡｃ残基が、図２の（２）及び（３）においても分かる通り、抗体に直接、結合しているＧｌｃＮＡｃ残基に結合している。本発明による方法のこの実施形態のステップ（２）におけるオリゴサッカライド（グリカン）のトリミングは、これらの２つのＧｌｃＮＡｃ残基の間で行われる。ステップ（２）によるグリカンのトリミングにより、ＩｇＧ抗体のＮ－グリコシル化部位に共有結合している、ＧｌｃＮＡｃ残基がもたらされる。これは、図２（１）にも示されている。好ましくは、前記ＧｌｃＮＡｃのＣ１と抗体のアミノ酸側鎖に存在しているアミドとによるＮ－グリコシド結合を介して、Ｎ－グリコシル化部位に共有結合している、こうしたＧｌｃＮＡｃ残基は、本明細書では、「近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基」と呼ばれ、「コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基」とも呼ばれる。前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基又はコア－ＧｌｃＮＡｃ置換基は、任意選択で、フコシル化されている。

【0178】

本発明による修飾抗体の調製方法のこの実施形態のステップ（２）では、適切な酵素の作用により、Ｎ－グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドのトリミングが行われ、オリゴサッカライド（グリカンとも呼ばれる）のトリミング後に、フコシル化されている（図１（１）中のｂが１である）か、又はフコシル化されていない（ｂが０である）、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基（コア－ＧｌｃＮＡｃ置換基とも呼ばれる）が得られる。

【0179】

「適切な酵素」は、トリミングされることになるオリゴサッカライドが基質である、酵素として定義される。ステップ（２）に使用されることになる酵素の好ましい例は、トリミングされる特定のオリゴサッカライド（単数又は複数）に依存する。

【0180】

本発明による方法のこの特定の実施形態の好ましいステップ（１）の実施形態では、ステップ（２）における酵素は、エンド－グリコシダーゼの群から選択される。

【0181】

エンド－グリコシダーゼは、グリカン構造における内部グリコシド結合を切断する能力があり、これにより、リモデリング及び合成上の処理（ｅｎｄｅａｖｏｒ）に別の利益をもたらす。例えば、エンド－グリコシダーゼは、エンド－グリコシダーゼがグリカンの保存領域内の予測可能な部位で切断を行う場合、不均一なグリカン集団を簡単に均一化するために使用することができる。この点でエンドグリコシダーゼの最も重要なクラスの１つは、Ｎ，Ｎ’－ジアセチルキトビオースコアにおいてβ－１，４－グリコシド結合を加水分解することにより、糖タンパク質からＮ－グリカンを取り除き、単一のタンパク質の近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基にする加水分解酵素のクラスである、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．９６、エンド及びＥＮＧアーゼとして一般に知られている）を含む（参照により本明細書に組み込まれている、ＷｏｎｇらのＣｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１１年、１１１巻、４２５９頁により概説されている）。パウチマンノースに特異的なエンドＤ；高マンノースに特異的なエンドＡ及びエンドＨ；高マンノースから二アンテナ複合型までに及ぶエンドＦサブタイプ；及びフコシル化グリカンを除く大部分のＮ－グリカン構造（高マンノース／複合型／ハイブリッド型）を切断することができるエンドＭを含む共通の化学酵素変種を含めた、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼが、自然界に幅広く分布していることが見いだされており、高マンノース型オリゴサッカライドに対する加水分解活性は、複合型及びハイブリッド型オリゴサッカライドに対する加水分解活性よりもかなり高い。これらのＥＮＧアーゼは、遠位Ｎ－グリカン構造に特異性を示し、遠位Ｎ－グリカン構造を示さないタンパク質には特異性を示さず、これにより、天然条件において、糖タンパク質から大部分のＮ－結合型グリカンを切断するのにＥＮＧアーゼを有用なものにしている。

【0182】

エンドグリコシダーゼＦ１、Ｆ２及びＦ３は、天然タンパク質の脱グリコシル化に最も適している。エンドＦ１、Ｆ２及びＦ３の結合特異性は、タンパク質を変性させることなく、すべてのクラスのＮ－結合型オリゴサッカライドを取り除くことができる、タンパク質の脱グリコシル化の一般的な戦略を示唆する。二アンテナ及び三アンテナ構造は、それぞれエンドグリコシダーゼＦ２及びＦ３により直ちに取り除くことができる。オリゴ－マンノース及びハイブリッド構造は、エンドＦ１により取り除かれ得る。

【0183】

エンドＦ３は、エンドＦ３による切断が、オリゴサッカライドのペプチド結合の状態、及びコアフコシル化の状態に敏感であるという点で、特有のものである。エンドグリコシダーゼＦ３は、アスパラギン結合されている二アンテナ及び三アンテナ複合型オリゴサッカライドを切断する。エンドグリコシダーゼＦ３は、フコシル化されていない二アンテナ及び三アンテナ構造を遅い速度で切断するが、ペプチド結合されている場合に限る。コアフコシル化されている二アンテナ構造は、エンドＦ３に対して有効な基質であり、このエンドＦ３の活性は最大４００倍である。オリゴマンノース及びハイブリッド分子に対して活性はない。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、ＴａｒｅｎｔｉｎｏらのＧｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９５年、５巻、５９９頁を参照されたい。

【0184】

エンドＳは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から分泌されるエンドグリコシダーゼであり、やはり、Ｃｏｌｌｉｎら（参照により本明細書に組み込まれている、ＥＭＢＯ Ｊ．２００１年、２０巻、３０４６頁）により開示されている通り、グリコシドヒドロラーゼファミリー１８に属する。しかし、上記のＥＮＧアーゼとは対照的に、エンドＳは、より明確な特異性を有しており、ヒトＩｇＧのＦｃドメインにおける保存Ｎ－グリカンしか切断しない特異性があり（現在のところ、別の基質は何ら特定されていない）、酵素とＩｇＧとの間のタンパク質－タンパク質相互作用によりこの特異性がもたらされることが示唆される。

【0185】

エンドＳ４９は、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１３／０３７８２４号（Ｇｅｎｏｖｉｓ ＡＢ）に記載されている。エンドＳ４９はストレプトコッカス・ピオゲネスＮＺ１３１から単離され、エンドＳのホモログである。エンドＳ４９は、天然のＩｇＧに特異的なエンドグリコシダーゼ活性を有しており、エンドＳよりも多くの様々なＦｃグリカンを切断する。

【0186】

さらなる好ましい実施形態では、この実施形態のステップ（２）における酵素は、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼである。さらなる好ましい実施形態では、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0187】

トリミングされることになるオリゴサッカライドが、複合型の二アンテナ構造である場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ１、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から好ましくは選択される。

【0188】

トリミングされることになるオリゴサッカライドが、複合型の二アンテナ構造であり（すなわち、図２（３）によるもの）、且つこのオリゴサッカライドがＮ２９７におけるＩｇＧの保存Ｎ－グリコシル化部位に存在している場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から、より好ましくはエンドＳ、エンドＳ４９、及びそれらの組合せからなる群から選択される。

【0189】

トリミングされることになるオリゴサッカライドが、複合型の二アンテナ構造であり、且つこのグリカンがＮ２９７におけるＩｇＧの保存Ｎ－グリコシル化部位に存在していない場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＦ２、エンドＦ３、及びそれらの組合せからなる群から好ましくは選択される。

【0190】

トリミングされることになるオリゴサッカライドが高マンノースである場合、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼは、エンドＨ、エンドＭ、エンドＡ及びエンドＦ１からなる群から好ましくは選択される。

【0191】

本発明による方法のトリミングするステップ（２）は、例えばリン酸で緩衝した生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｔｒｉｓ－緩衝生理食塩水）、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ｔｒｉｓ及びグリシンなどの適切な緩衝溶液中で、好ましくは行われる。適切な緩衝液は、当技術分野で公知である。緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はｔｒｉｓ緩衝液が好ましい。

【0192】

本方法は、約４～約５０℃の範囲、より好ましくは約１０～約４５℃の範囲、さらにより好ましくは約２０～約４０℃の範囲、及び最も好ましくは約３０～約３７℃の範囲の温度で、好ましくは行われる。

【0193】

本方法は、約５～約９の範囲、好ましくは約５．５～約８．５の範囲、より好ましくは約６～約８の範囲のｐＨで、好ましくは行われる。本方法は、約７～約８の範囲のｐＨで行うのが最も好ましい。

【0194】

例えば、トラスツズマブ変異体－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）は、上記の発明による方法により得られる。前記トラスツズマブ変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）は、実施例５において記載されている通り、Ｎ１９６グリコシル化部位における近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を得るために、エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミダーゼにより処理した。図１０は、（Ａ）ＣＨＯにおいて発現させた後に単離した、トラスツズマブ変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後の、トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイルを示している。続いて、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘであるＧａｌＮＡｚを近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合した。図１１は、（Ａ）実施例９に記載されている、エンドＦ３（又はエンドＦ２）による処理後、及び末端ＧｌｃＮＡｃ上への、ＧａｌＮＡｚのＧａｌＴ１媒介性転移後の、トラスツズマブ変異体（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）の質量スペクトルのプロファイル、及び（Ｂ）実施例１４に記載されている、ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＦ３４による処理後の、アジドをチャージしたトラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎのコンジュゲートに由来する、抗体薬物コンジュゲートの質量スペクトルのプロファイルを示している。

【0195】

修飾抗体
本発明はさらに、本発明による修飾抗体を調製する方法により得ることができる、修飾抗体に関する。前記方法、及びその好ましい実施形態は、上で詳細に記載されている。抗体を修飾する方法の好ましい実施形態はまた、その方法により得ることができる修飾抗体にも該当する。

【0196】

好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１であり、ここでｘは、Ｓｕ（Ａ）_ｘにおいて上で記載されている通りである。

【0197】

本発明はまた、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含む、ＩｇＧ抗体であって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基が上記の抗体に結合しており、Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基におけるＧｌｃＮＡｃが、任意選択でフコシル化されており、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、ＩｇＧ抗体に関する。

【0198】

ＩｇＧ抗体が全抗体である好ましい実施形態では、本発明による修飾抗体は、式（１４０）による抗体：

【化5】

（式中、
Ａｂは、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を表し、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、Ｓｕ（Ａ）及びｘは、上記の通りであり、ｂは０（フコシル化されていない）又は１（フコシル化されている）である）
である。

【0199】

好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含み、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは、１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。

【0200】

好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0201】

さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別のさらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0202】

本発明による修飾抗体の好ましい実施形態では、Ａは、アジド基、チオール基又はハロゲンである。修飾抗体は、好ましくは、アジド修飾抗体、チオール修飾抗体又はハロゲン修飾抗体である。抗体がハロゲン修飾抗体である場合、この抗体は、好ましくは、塩素修飾抗体、臭素修飾抗体又はヨウ素修飾抗体であり、より好ましくは塩素修飾抗体又は臭素修飾抗体であり、最も好ましくは、塩素修飾抗体である。ｘが１であり、修飾抗体が、好ましくは、アジド修飾抗体、チオール修飾抗体又はハロゲン修飾抗体（好ましくは、塩素又は臭素修飾抗体、最も好ましくは、塩素修飾抗体）であるのがより好ましい。

【0203】

Ａがアジド基である好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から好ましくは選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から選択されるのがより好ましい。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択されるのがより好ましい。

【0204】

本発明による修飾抗体の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。本発明による修飾抗体の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0205】

さらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。別のさらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0206】

最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。Ｒ^８、及びＲ^８の好ましい実施形態は、上で定義されている通りである。別の最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。

【0207】

抗体コンジュゲートを調製する方法
本発明はさらに、抗体コンジュゲートの調製における、本発明による修飾抗体の使用であって、抗体コンジュゲートが、リンカーＬを介して対象の分子Ｄにコンジュゲートされている抗体として定義される、使用に関する。

【0208】

抗体コンジュゲートは、本明細書では、リンカーＬを介して、対象の分子Ｄにコンジュゲートされている抗体として定義される。本発明による抗体コンジュゲートは、前記リンカーＬを介して１つ又は１つ超の対象の分子Ｄにコンジュゲートされ得る。

【0209】

対象の分子は、例えば、リポーター分子、診断用分子、活性物質、酵素、アミノ酸（非天然アミノ酸を含む）、（非触媒的）タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、グリカン、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール鎖、ポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール鎖、ポリプロピレンオキシド鎖、１，ｘ－ジアミノアルカン（ｘは、アルカンの炭素原子数である）、アジド又は（ヘテロ）シクロアルキニル部分とすることができ、好ましくは二価又は二官能性（ヘテロ）シクロアルキニル部分とすることができる。好ましい実施形態では、本対象の分子は、アミノ酸（特に、リシン）、活性物質、リポーター分子、アジド及び（ヘテロ）シクロアルキニル部分からなる群から選択される。

【0210】

活性物質は、本明細書では、薬理学的及び／又は生物物質、すなわち、生物学的及び／又は薬学的に活性な物質として定義され、例えば薬物又はプロドラッグ、診断剤、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡである。適切なペプチドタグの例には、ヒトラクトフェン又はポリアルギニンの様な細胞透過性ペプチドが含まれる。適切なグリカンの一例は、オリゴマンノースである。

【0211】

好ましい実施形態では、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。活性物質は、薬学的に活性な化合物、例えば、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドなどの、特に、低から中程度の分子量の化合物（例えば、約２００～約１５００Ｄａ、好ましくは約３００～約１０００Ｄａ）からなる群から選択されるのがより好ましい。細胞毒の例には、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）が含まれる。好ましい実施形態では、細胞毒は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン及びデボーガニンからなる群から選択される。

【0212】

リポーター分子は、その存在が容易に検出される分子、例えば診断剤、色素、フルオロフォア、放射活性同位体標識、コントラスト剤、磁気共鳴造影剤又は質量標識である。フルオロフォアの例には、アレクサフルオル（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）（例えば、アレクサフルオル５５５）、シアン色素（例えば、Ｃｙ３又はＣｙ５）、クマリン誘導体、フルオレセイン、ローダミン、アロフィコシアニン及びクロモマイシンのすべての種類が含まれる。

【0213】

放射活性同位体標識の例には、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１８Ｆ、^１４Ｃ、^６４Ｃｕ、^１３１Ｉ又は^１２３Ｉが含まれ、これらは、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ又はＨＹＮＩＣなどのキレート部分を介して結合させてもよく、又は結合させなくてもよい。

【0214】

本発明による抗体コンジュゲートにおいて、対象の分子Ｄは、リンカーＬを介して抗体にコンジュゲートされている。リンカー又は結合単位（ｌｉｎｋｉｎｇ ｕｎｉｔ）は、当技術分野で周知であり、以下により詳細に記載されている。

【0215】

好ましい実施形態では、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法は、単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つの（かつ、１を超えない）Ｎ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体であって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位であり、近位ＧｌｃＮＡｃＳｕ（Ａ）_ｘ置換基が前記Ｎ－結合型グリコシル化部位に結合している、ＩｇＧ抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが、官能基Ｂ及び１つ又は複数の対象の分子Ｄを含み、前記官能基Ｂが、前記抗体の近位ＧｌｃＮＡｃＳｕ（Ａ）_ｘ置換基の官能基Ａと反応する能力がある官能基であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ｘ個の官能基Ａを含む糖誘導体であり、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から独立して選択され、前記近位ＧｌｃＮＡｃＳｕ（Ａ）_ｘ置換基が、任意選択で、フコシル化されている、ステップを含む。

【0216】

抗体コンジュゲートの調製方法の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、１個又は２個の官能基Ａを含んでおり、すなわち、好ましくはｘは１又は２である。ｘが１であるのがより好ましい。別の好ましい実施形態では、Ｓｕは、ガラクトース（Ｇａｌ）である。さらに好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、ＳｕはＧａｌであり、最も好ましくは、ｘは１であり、ＳｕはＧａｌである。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。

【0217】

好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。

【0218】

さらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ、２－ＣｌＧａｌ、２－ＨＳＧａｌ及び６－ＨＳＧａｌからなる群から、より好ましくはＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、６－ＧａｌＮＡｃＣｌ、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＣｌ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＣｌＧａｌ及び２－ＣｌＧａｌからなる群から選択される。別のさらに好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートは、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。

【0219】

Ａがアジド基である好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から好ましくは選択される。さらに好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択される。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、２－アジドアセトアミドガラクトース（ＧａｌＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシガラクトース（６－ＡｚＧａｌ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドガラクトース（４－ＡｚＧａｌＮＡｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドガラクトース（６－ＡｚＧａｌＮＡｚ）、２－アジドアセトアミドグルコース（ＧｌｃＮＡｚ）、６－アジド－６－デオキシグルコース（６－ＡｚＧｌｃ）、６－アジド－６－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）、４－アジド－４－デオキシ－２－アセトアミドグルコース（４－ＡｚＧｌｃＮＡｃ）及び６－アジド－６－デオキシ－２－アジドアセトアミドグルコース（６－ＡｚＧｌｃＮＡｚ）からなる群から選択されるのがより好ましい。ｘが１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌ、４－ＡｚＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｚ及び６－ＡｚＧｌｃＮＡｃからなる群から選択されるのがより好ましい。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。

【0220】

本発明による修飾抗体の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。本発明による修飾抗体の別の特に好ましい実施形態では、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。さらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。別のさらにより好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、ＧａｌＮＡｚ、６－ＡｚＧａｌＮＡｃ、２－ＧａｌＮＡｃＳＨ、２－ＧａｌＮＡｃＸ、２－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８、６－ＧａｌＮＡｃＳＨ、６－ＧａｌＮＡｃＸ及び６－ＧａｌＮＡｃＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^８からなる群から選択される。別の最も好ましい実施形態では、ｘは１であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘは、２－ＧａｌＮＰｒｏＳＨ及び２－ＧａｌＮＢｕＳＨからなる群から選択される。これらの好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートが、１つ又は２つ、最も好ましくは１つの対象の分子を含むのがさらに好ましい。Ｒ^８、及びＲ^８の好ましい実施形態は、上で定義されている通りである。

【0221】

リンカーコンジュゲートは、好ましくは、式Ｂ－Ｌ（Ｄ）_ｒであり、Ｄは、上で定義されている対象の分子であり、Ｂ及びＬは、以下で定義されている通りであり、ｒは１～２０である。ｒが１～１０であるのが好ましく、ｒが１～８であるのがより好ましく、ｒが１、２、３、４、５又は６であるのがさらにより好ましく、ｒが１、２、３又は４であるのがさらにより好ましく、ｒが１又は２であるのがさらにより好ましく、ｒが１であるのが最も好ましい。言い換えると、リンカーコンジュゲートは、好ましくは、１つ又は２つ、好ましくは１つの対象の分子に結合されている。

【0222】

修飾抗体上の官能基Ａを補完する官能基Ｂ（Ａは、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基又はスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基である）は、当技術分野で公知である。

【0223】

Ａがアジド基である場合、アジド修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、付加環化反応により、好ましくは行われる。次に、官能基Ｂは、アルキニル基、好ましくは末端アルキニル基、及び（ヘテロ）シクロアルキニル基からなる群から好ましくは選択される。

【0224】

Ａがケト基である場合、ケト修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、ヒドロキシルアミン誘導体又はヒドラジンを用いる選択的コンジュゲートにより好ましくは行われ、それぞれ、オキシム又はヒドラゾンになる。次に、官能基Ｂは、好ましくは、一級アミノ基、例えば－ＮＨ_２基、アミノオキシ基、例えば－Ｏ－ＮＨ_２、又はヒドラジニル基、例えば－Ｎ（Ｈ）ＮＨ_２である。次に、リンカーコンジュゲートは、好ましくは、それぞれ、Ｈ_２Ｎ－Ｌ（Ｄ）_ｒ、Ｈ_２Ｎ－Ｏ－Ｌ（Ｄ）_ｒ又はＨ_２Ｎ－Ｎ（Ｈ）－Ｌ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは、上で定義されている通りである。

【0225】

Ａがアルキニル基である場合、アルキン修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、付加環化反応、好ましくは、１，３－双極子付加環化反応により、好ましくは行われる。次に、官能基Ｂは、好ましくは、１，３－双極子、例えばアジド、ニトロン又はニトリルオキシドである。次に、リンカーコンジュゲートは、好ましくは、Ｎ_３－Ｌ（Ｄ）_ｒでありＬ、Ｄ及びｒは、上で定義されている通りである。

【0226】

Ａがチオール基である場合、チオール修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、マイケル型付加反応により、好ましくは行われる。次に、官能基Ｂは、マイケル型付加反応の場合、Ｎ－マレイミジル基であり、求核置換反応の場合、ハロゲン化アセトアミド基であり、チオール－エン反応の場合、末端アルケンであるのが好ましい。次に、リンカーコンジュゲートは、好ましくはＸ－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）ＮＨＬ（Ｄ）_ｒ又はＸ－ＣＨ_２Ｃ（Ｏ）Ｎ［Ｌ（Ｄ）_ｒ］_２（Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ若しくはＩである）であり、又は以下に例示されているマレイミド－リンカーコンジュゲート（１４１）

【化6】

である。

【0227】

Ａが、ハロゲン修飾抗体、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体、スルホニルオキシ修飾抗体又はメルカプトアセトアミド修飾抗体である場合、修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。Ａが、ハロゲン、ハロゲン化アセトアミド基、スルホニルオキシ基又はメルカプトアセトアミド基である場合、修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。言い換えると、修飾抗体が、ハロゲン修飾抗体、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体、スルホニルオキシ修飾抗体又はメルカプトアセトアミド修飾抗体である場合、修飾抗体とリンカーコンジュゲートとの結合は、チオールとの反応を介して好ましくは行われ、チオエーテルを形成する。

【0228】

次に、官能基Ｂは、チオール基を好ましくは含み、好ましいリンカーコンジュゲートはＨＳ－Ｌ（Ｄ）_ｒである。しかし、官能基Ｂはまた、アルコール基又はアミン基を含んでもよい。

【0229】

本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法の好ましい実施形態は、修飾抗体をリンカーコンジュゲートと反応させるステップを含み、
（ａ） 修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロアルキニル基若しくはアルキニル基、及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
（ｂ） 修飾抗体がケト修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、一級アミン基、アミノオキシ基若しくはヒドラジニル基、及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
（ｃ） 修飾抗体がアルキン修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、アジド基、ニトロン若しくはニトリルオキシド、及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
（ｄ） 修飾抗体がチオール修飾抗体若しくはメルカプトアセトアミド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、Ｎ－マレイミド基若しくはハロゲン化アセトアミド基若しくは末端アルケン、及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む、又は
（ｅ） 修飾抗体がハロゲン修飾抗体、ハロゲン化アセトアミド修飾抗体、スルホニルオキシ修飾抗体若しくはスルホニル化ヒドロキシアセトアミド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、チオール基及び１つ若しくは複数の対象の分子を含む。

【0230】

前記修飾抗体が、ハロゲン修飾抗体であり、官能基Ｂがチオール基を含む場合、前記チオール基は脂肪族又は芳香族チオール基とすることができる。好ましい実施形態では、前記チオール基は、芳香族チオール基である。

【0231】

好ましい実施形態では、修飾抗体は、チオール修飾抗体であり、官能基Ｂは、Ｎ－マレイミド基又はハロゲン化アセトアミド基を含む。

【0232】

抗体コンジュゲートを調製する方法の好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートＢ－Ｌ（Ｄ）_ｒは、式（１４２ａ）、（１４２ｂ）、（１４３）、（１４４）、（１４１）又は（１４５）のリンカーコンジュゲート：

【化7】

（式中、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｒは、１～２０であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０であり、
ａ’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’＋ａ’’＜１０であり、
Ｘは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩであり、
Ｒ^８は、Ｒ^１又は－Ｌ（Ｄ）_ｒであり、好ましくは水素、－Ｌ（Ｄ）_ｒ又はＣ_１～Ｃ_２４アルキル基であり、より好ましくは、水素、－Ｌ（Ｄ）_ｒ又はＣ_１～Ｃ_６アルキル基である）
からなる群から選択される。

【0233】

本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法の別の好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートＢ－Ｌ（Ｄ）_ｒは、上で定義されている、式（１４２ａ）、（１４３）、（１４４）、（１４１）又は（１４５）のリンカーコンジュゲートからなる群から選択される。

【0234】

上記の通り、ｒは、１～１０であり、より好ましくは、ｒは、１～８であり、さらにより好ましくは、ｒは１、２、３、４、５又は６であり、さらにより好ましくは、ｒは１、２、３又は４であり、さらにより好ましくは、ｒは１又は２であり、最も好ましくは、ｒは１である。言い換えると、リンカーコンジュゲートは、好ましくは、１つ又は２つ、好ましくは１つの対象の分子に結合されている。

【0235】

好ましい実施形態では、本発明による修飾抗体は、アジド修飾抗体、アルキン修飾抗体、ハロゲン修飾抗体又はチオール修飾抗体である。

【0236】

本発明による抗体コンジュゲートの調製に適切なリンカーコンジュゲートは、官能基Ｂ及び対象の分子を含むリンカーコンジュゲートである。結合単位とも呼ばれる、リンカーＬは、当技術分野で周知である。本明細書に記載されているリンカーコンジュゲートでは、Ｌは、上記の通り、対象の分子Ｄ及び官能基Ｂに結合している。前記官能基Ｂ及び前記対象の分子Ｄを結合させる様々な方法が、当技術分野で公知である。当業者に明らかな通り、リンカーの一方の末端に官能基Ｂを結合させ、もう一方の末端に対象の分子Ｄを結合させる適切な方法の選択肢は、官能基Ｂ、リンカーＬ及び対象の分子Ｄの正確な性質に依存する。

【0237】

リンカーは、一般構造Ｆ^１－Ｌ（Ｆ^２）_ｒを有することができ、Ｆ^１は、官能基Ｂ、又は上記の官能基Ｂ上の官能基Ｆと反応することができる官能基のどちらか、例えば、（ヘテロ）シクロアルキニル基、末端アルキニル基、一級アミン、アミノオキシ基、ヒドラジル基、アジド基、Ｎ－マレイミジル基、アセトアミド基又はチオール基を表す。Ｆ^２は、対象の分子上の官能基Ｆと反応することができる、官能基を表す。

【0238】

２つ以上の対象の分子が、リンカーに結合することができるので、２つ以上の官能基Ｆ^２がＬに存在し得る。上記の通り、ｒは１～２０であり、好ましくは、１～１０であり、より好ましくは、１～８であり、さらにより好ましくは１、２、３、４、５又は６であり、さらにより好ましくは、１、２、３又は４であり、最も好ましくはｒは１又は２である。

【0239】

Ｌは、例えば、直鎖状又は分岐状Ｃ_１～Ｃ_２００アルキレン基、Ｃ_２～Ｃ_２００アルケニレン基、Ｃ_２～Ｃ_２００アルキニレン基、Ｃ_３～Ｃ_２００シクロアルキレン基、Ｃ_５～Ｃ_２００シクロアルケニレン基、Ｃ_８～Ｃ_２００シクロアルキニレン基、Ｃ_７～Ｃ_２００アルキルアリーレン基、Ｃ_７～Ｃ_２００アリールアルキレン基、Ｃ_８～Ｃ_２００アリールアルケニレン基、Ｃ_９～Ｃ_２００アリールアルキニレン基からなる群から選択することができる。任意選択で、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基及びアリールアルキニレン基は、置換されていてもよく、任意選択で前記基は、１個又は複数のヘテロ原子、好ましくは１～１００個のヘテロ原子により分断されてもよく、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ及びＮＲ^５からなる群から好ましくは選択され、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。ヘテロ原子がＯであるのが最も好ましい。

【0240】

Ｆ、Ｆ^１及びＦ^２は、例えば、水素、ハロゲン、Ｒ^５、Ｃ_４～Ｃ_１０（ヘテロ）シクロアルキン基、－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ^５）_２、－Ｃ≡ＣＲ^５、－［Ｃ（Ｒ^５）_２Ｃ（Ｒ^５）_２Ｏ］_ｑ－Ｒ^５（ｑは、１～２００の範囲である）、－ＣＮ、－Ｎ_３、－ＮＣＸ、－ＸＣＮ、－ＸＲ^５、－Ｎ（Ｒ^５）_２、－^＋Ｎ（Ｒ^５）_３、－Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ^５）_２、－Ｃ（Ｒ^５）_２ＸＲ^５、－Ｃ（Ｘ）Ｒ^５、－Ｃ（Ｘ）ＸＲ^５、－Ｓ（Ｏ）Ｒ^５、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、－Ｓ（Ｏ）ＯＲ^５、－Ｓ（Ｏ）_２ＯＲ^５、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ^５）_２、－Ｓ（Ｏ）_２Ｎ（Ｒ^５）_２、－ＯＳ（Ｏ）Ｒ^５、－ＯＳ（Ｏ）_２Ｒ^５、－ＯＳ（Ｏ）ＯＲ^５、－ＯＳ（Ｏ）_２ＯＲ^５、－Ｐ（Ｏ）（Ｒ^５）（ＯＲ^５）、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ^５）_２、－ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ^５）_２、－Ｓｉ（Ｒ^５）_３、－ＸＣ（Ｘ）Ｒ^５、－ＸＣ（Ｘ）ＸＲ^５、－ＸＣ（Ｘ）Ｎ（Ｒ^５）_２、－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｘ）Ｒ^５、－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｘ）ＸＲ^５、及び－Ｎ（Ｒ^５）Ｃ（Ｘ）Ｎ（Ｒ^５）_２からなる群から独立して選択することができ、Ｘは、酸素又は硫黄であり、Ｒ^５は、上で定義されている通りである。

【0241】

適切な結合単位の例には、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、又はより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコール又はポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコール又はポリプロピレンオキシド鎖及び１，ｘ－ジアミノアルカン（ｘは、アルカンの炭素原子数である）が含まれる。

【0242】

適切なリンカーの別のクラスは、切断可能なリンカーを含む。切断可能なリンカーは、当技術分野で周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｓｈａｂａｔら、Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ２０１２年、６巻、１０７３頁は、生物学的引き金、例えば酵素による切断又は酸化イベント時に、解放される自己犠牲的部分を含む、切断可能なリンカーを開示している。適切な切断可能なリンカーの一部の例は、プロテアーゼ、例えば、カテプシン、プラスミン若しくはメタロプロテアーゼによる特異的認識時に切断されるペプチドリンカー、又はグリコシダーゼ、例えばグルコロニダーゼによる特異的認識時に切断されるグリコシドに基づくリンカー、又は酸素が不足している低酸素領域において還元されるニトロ芳香族炭化水素である。

【0243】

上記の通り、修飾抗体がアジド修飾抗体である場合、リンカーコンジュゲートは、式（１４２ａ）の（ヘテロ）シクロアルキンリンカーコンジュゲート：

【化8】

（式中、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｒは、１～２０であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
であるのが好ましい。

【0244】

さらに好ましい実施形態では、ａは５であり、すなわち、前記（ヘテロ）シクロアルキニル基は、好ましくは（ヘテロ）シクロオクチン基である。

【0245】

別の好ましい実施形態では、Ｚは、Ｃ（Ｒ^２）_２又はＮＲ^２である。ＺがＣ（Ｒ^２）_２である場合、Ｒ^２は水素であるのが好ましい。ＺがＮＲ^２である場合、Ｒ^２はＬ（Ｄ）_ｒであるのが好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｒは、１～１０であり、より好ましくは、ｒは、１、２、３、４、５又は６であり、さらにより好ましくは、ｒは１、２、３又は４であり、さらにより好ましくは、ｒは１又は２であり、最も好ましくは、ｒは１である。別の好ましい実施形態では、ｑは、１又は２であり、より好ましくは、ｑは１である。ｒが１であり、ｑが１であるのがさらにより好ましく、ａが５であり、ｒが１であり、ｑが１であるのが最も好ましい。

【0246】

別のさらに好ましい実施形態では、修飾糖タンパク質がアジド修飾糖タンパク質である場合、リンカーコンジュゲートは、式（１４２ｂ）の（ヘテロ）シクロアルキンリンカーコンジュゲート：

【化9】

（式中、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｒは、１～２０であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａ’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’＋ａ’’＜１０である）
である。

【0247】

さらに好ましい実施形態では、ａ’＋ａ’’は、４、５、６又は７であり、より好ましくは、ａ’＋ａ’’は４、５又は６であり、最も好ましくは、ａ’＋ａ’’は５であり、すなわち、前記（ヘテロ）シクロアルキニル基は、好ましくは、（ヘテロ）シクロオクチン基である。

【0248】

別の好ましい実施形態では、Ｚは、Ｃ（Ｒ^２）_２又はＮＲ^２である。ＺがＣ（Ｒ^２）_２である場合、Ｒ^２は水素であるのが好ましい。ＺがＮＲ^２である場合、Ｒ^２はＬ（Ｄ）_ｒであるのが好ましい。さらに別の好ましい実施形態では、ｒは１～１０であり、より好ましくは、ｒは、１、２、３、４、５又は６であり、さらにより好ましくは、ｒは１、２、３又は４であり、さらにより好ましくは、ｒは１又は２であり、最も好ましくは、１である。別の好ましい実施形態では、ｑは、１又は２であり、より好ましくは、ｑは１である。ｒが１であり、ｑが１であるのがさらにより好ましく、ａ’＋ａ’’が５であり、ｒが１であり、ｑが１であるのが最も好ましい。

【0249】

Ｌ（Ｄ）_ｒ置換基は、前記（ヘテロ）シクロアルキニル基中のＣ原子に存在していてもよく、又はヘテロシクロアルキニル基の場合、前記ヘテロシクロアルキニル基のヘテロ原子に存在していてもよい。（ヘテロ）シクロアルキニル基が、置換基、例えば縮合環化しているシクロアルキルを含む場合、Ｌ（Ｄ）_ｒ置換基は、やはり前記置換基に存在していてもよい。

【0250】

リンカーコンジュゲートを得るために、リンカーＬを、その一方の末端の（ヘテロ）シクロアルキニル基に、及びもう一方の末端の対象の分子に結合させる本方法は、リンカー、（ヘテロ）シクロアルキニル基、及び対象の分子の正確な性質に依存する。適切な方法は、当技術分野で公知である。

【0251】

リンカーコンジュゲートは、（ヘテロ）シクロオクチン基、より好ましくは歪みのある（ヘテロ）シクロオクチン基（ｓｔｒａｉｎｅｄ （ｈｅｔｅｒｏ） ｃｙｃｌｏｏｃｔｙｎｅ ｇｒｏｕｐ）を含むのが好ましい。適切な（ヘテロ）シクロアルキニル部分は、当技術分野で公知である。例えば、ＤＩＦＯ、ＤＩＦＯ２及びＤＩＦＯ３が、参照により組み込まれている、米国特許出願公開第２００９／００６８７３８号に開示されている。ＤＩＢＯは、参照により組み込まれている、国際公開第２００９／０６７６６３号に開示されている。ＢＡＲＡＣは、どちらも参照により組み込まれている、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０年、１３２巻、３６８８～３６９０頁、及び米国特許出願公開第２０１１／０２０７１４７号に開示されている。

【0252】

（ヘテロ）シクロオクチン基を含むリンカーコンジュゲートの好ましい例は、以下に示されている。

【化10】

【0253】

当技術分野で公知の他のシクロオクチン部分は、ＤＩＢＡＣ（ＡＤＩＢＯ又はＤＢＣＯとしても公知である）及びＢＣＮである。ＤＩＢＡＣは、参照により組み込まれている、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０年、４６巻、９７～９９頁に開示されている。ＢＣＮは、参照により組み込まれている、国際公開第２０１１／１３６６４５号に開示されている。

【0254】

好ましい実施形態では、前記リンカーコンジュゲートは、式（１５１）：

【化11】

（式中、
Ｒ^１、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義した通りであり、
Ｙは、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は上で定義されている通りであり、
Ｒ^３は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｒ^４は、水素、Ｙ－Ｌ（Ｄ）_ｒ、－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｙ－Ｌ（Ｄ）_ｒ、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、アルキル基は、任意選択で、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される複数のヘテロ原子の１個により分断されており、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で独立して置換されており、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
を有する。

【0255】

さらに好ましい実施形態では、Ｒ^１は水素である。別の好ましい実施形態では、Ｒ^３は水素である。別の好ましい実施形態では、ｎは、１又は２である。別の好ましい実施形態では、Ｒ^４は、水素、Ｙ－Ｌ（Ｄ）_ｒ又は－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｙ－Ｌ（Ｄ）_ｒである。別の好ましい実施形態では、Ｒ^２は水素又はＬ（Ｄ）_ｒである。さらに好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートは、式（１５２）：

【化12】

（式中、Ｙ、Ｌ、Ｄ、ｎ及びｒは、上で定義されている通りである）を有する。ｒが１又は２であるのが好ましく、ｒが１であるのがより好ましい。

【0256】

式（１５２）によるリンカーコンジュゲートの例は、図８及び図９に示されている。図８は、ＢＣＮ－ＭＭＡＦコンジュゲート（３４）の合成に関する、反応スキームを示している。図９は、ＢＣＮ－マイタンシノイドコンジュゲート（３５）の合成に関する、反応スキームを示している。

【0257】

別の好ましい実施形態では、前記リンカーコンジュゲートは、式（１５３）：

【化13】

（式中、Ｌ、Ｄ及びｒは、上で定義されている通りである）を有する。ｒが１又は２であるのが好ましく、ｒが１であるのがより好ましい。

【0258】

本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法の好ましい実施形態では、アジド修飾抗体は、式（１４２ａ）、（１４２ｂ）、（１４６）、（１４７）、（１４８）、（１４９）、（１５０）、（１５１）、（１５２）若しくは（１５３）によるリンカーコンジュゲート、又は、式（１４２ａ）、（１４６）、（１４７）、（１４８）、（１４９）、（１５０）、（１５１）、（１５２）若しくは（１５３）によるリンカーコンジュゲートにコンジュゲートされている。好ましくは、リンカーコンジュゲートは、式（１４２ａ）、（１４２ｂ）、（１５１）、（１５２）又は（１５３）によるもの、又は式（１４２ａ）、（１５１）、（１５２）又は（１５３）によるものである。さらに好ましい実施形態では、リンカーコンジュゲートは、式（１５１）、（１５２）又は（１５３）、より好ましくは（１５２）又は（１５３）、さらにより好ましくは（１５２）によるものである。

【0259】

上記の通り、好ましい実施形態では、本修飾抗体は、チオール修飾抗体であり、官能基Ｂは、Ｎ－マレイミド基又はハロゲン化アセトアミド基を含む。

【0260】

抗体コンジュゲートを調製する方法の特定の実施形態では、前記方法は、
（１） 単一重鎖と単一軽鎖との組合せ上に１つのＮ－結合型グリコシル化部位を含むＩｇＧ抗体を用意するステップであって、Ｎ－結合型グリコシル化部位が、その野生型対応物と比べると、変異Ｎ－結合型グリコシル化部位である、ステップ、
（２） エンド－β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの作用により、前記グリコシル化部位に結合しているオリゴサッカライドをトリミングして、前記グリコシル化部位における近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基を得るステップ、及び
（３） 好適な触媒の存在下で、モノサッカライド誘導体Ｓｕ（Ａ）_ｘを前記近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基に結合させるステップであって、好適な触媒が、Ｓｕ（Ａ）_ｘが基質である触媒として定義され、Ｓｕ（Ａ）_ｘがｘ個の官能基Ａを含むモノサッカライド誘導体Ｓｕとして定義され、ｘが１、２、３又は４であり、Ａが、アジド基、ケト基、アルキニル基、チオール基又はその前駆体、ハロゲン、スルホニルオキシ基、ハロゲン化アセトアミド基、メルカプトアセトアミド基及びスルホニル化ヒドロキシアセトアミド基からなる群から選択される、ステップ、
（４） 近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基をリンカーコンジュゲートと反応させるステップであって、前記リンカーコンジュゲートが官能基（Ｂ）及び対象の分子（Ｄ）を含み、前記官能基（Ｂ）が、前記ＧｌｃＮＡｃ－Ｓｕ（Ａ）_ｘ置換基の官能基（Ａ）と反応する能力のある官能基であり、Ｓｕ（Ａ）_ｘが、上で定義されている通りであるが、但し、Ａはチオール基前駆体ではないことを条件とする、ステップ、
を含み、
ステップ（２）、（３）及び（４）における近位Ｎ－結合型ＧｌｃＮＡｃ残基は、任意選択でフコシル化されている。

【0261】

この方法のステップ（１）、（２）、（３）及び（４）は、上で詳細に記載されている。

【0262】

抗体コンジュゲート
本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートを調製する方法により得ることができる、抗体コンジュゲートに関する。

【0263】

本発明による抗体コンジュゲートの好ましい実施形態では、ｘは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。

【0264】

好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、チオール修飾抗体と、マレイミド官能基Ｂを含むリンカーコンジュゲートとの反応により得られる。さらに好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、式（１５４）：

【化14】

によるものである。

【0265】

別の好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、チオール修飾抗体と、ハロゲン化アセトアミド基を含む官能基Ｂを含む、リンカーコンジュゲートとの反応により得られる。さらに好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、式（１５５）：

【化15】

（式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｓｕは、糖誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｂは、０又は１であり、
ｒは、１～２０であり、
ｘは、１、２、３又は４であり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－又はＣＨ_２であり、
Ｒ^９は、Ｌ（Ｄ）_ｒ、水素、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_２４アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_２４アリールアルキル基は、任意選択で置換されている）によるものである。好ましくはＲ^９が、Ｌ（Ｄ）_ｒ、水素、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。より好ましくはＲ^９が、Ｌ（Ｄ）_ｒ、水素、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｃ_１～Ｃ_６アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_１２アリール基、Ｃ_７～Ｃ_１２アルキルアリール基及びＣ_７～Ｃ_１２アリールアルキル基は、任意選択で置換されている。さらにより好ましくはＲ^９が、Ｈ、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_４又はＣ_４アルキル又はＣ_６～Ｃ_１２アリールである。最も好ましくはＲ^９が、Ｈ又はメチルである。

【0266】

別の好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、アジド修飾抗体と、（ヘテロ）シクロオクチン基を含む官能基Ｂを含むリンカーコンジュゲート、好ましくは、式（１４２ａ）又は（１４２ｂ）によるリンカーコンジュゲートとの反応により得られる。さらに好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、式（１５６）：

【化16】

（式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｓｕは、糖誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｂは、０又は１であり、
ｒは、１～２０であり、
ｘは、１、２、３又は４であり、
ｙは、１～２０であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－であり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０である）
によるものである。

【0267】

別のさらに好ましい実施形態では、抗体コンジュゲートは、式（１５７）：

【化17】

（式中、
Ａｂは、抗体であり、
Ｓｕは、糖誘導体であり、
Ｌは、リンカーであり、
Ｄは、対象の分子であり、
ｂは、０又は１であり、
ｒは、１～２０であり、
ｘは、１、２、３又は４であり、
ｙは、１～２０であり、
Ｒ^１は、水素、ハロゲン、－ＯＲ^５、－ＮＯ_２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ^５、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、アルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基及び（ヘテロ）アリールアルキル基は、任意選択で置換されており、２つの置換基Ｒ^１は、一緒に結合されて、縮合環化しているシクロアルキル又は縮合環化している（ヘテロ）アレーン置換基を形成していてもよく、Ｒ^５は、水素、ハロゲン、Ｃ_１～Ｃ_２４アルキル基、Ｃ_６～Ｃ_２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ_７～Ｃ_２４アルキル（ヘテロ）アリール基及びＣ_７～Ｃ_２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、
Ｚは、Ｃ（Ｒ^１）_２、Ｏ、Ｓ又はＮＲ^２であり、Ｒ^２は、Ｒ^１又はＬ（Ｄ）_ｒであり、Ｌ、Ｄ及びｒは上で定義されている通りであり、
ｐは、０又は１であり、
Ｑは、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２－又は－ＣＨ_２－であり、
ｑは、０又は１であるが、但し、ｑが０である場合、ＺはＮ－Ｌ（Ｄ）_ｒであることを条件とし、
ａ’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’’は、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、
ａ’＋ａ’’＜１０である）
によるものである。

【0268】

さらに好ましい実施形態では、式（１５６）又は（１５７）による抗体コンジュゲートは、アジド修飾抗体と、式（１４２ａ）若しくは（１４２ｂ）、（１４６）、（１４７）、（１４８）、（１４９）、（１５０）、（１５１）、（１５２）又は（１５３）による、より好ましくは式（１４６）、（１４７）、（１４８）、（１４９）、（１５０）、（１５１）、（１５２）又は（１５３）による、シクロオクチン基官能基を含むリンカーコンジュゲートと、の反応により得られる。リンカーコンジュゲートが、式（１４２ａ）若しくは（１４２ｂ）、（１５１）、（１５２）又は（１５３）によるものであるのが好ましく、リンカーコンジュゲートが、式（１５１）、（１５２）又は（１５３）であるのがより好ましく、（１５２）又は（１５３）であるのがより好ましく、（１５２）であるのがさらにより好ましい。

【0269】

さらに好ましい実施形態では、式（１５４）、（１５５）、（１５６）及び（１５７）による抗体コンジュゲート中のｘは、１又は２であり、より好ましくは、ｘは１である。さらなる好ましい実施形態では、ｒは１又は２であり、好ましくは１である。さらなる好ましい実施形態では、ｘは１であり、ｒは１又は２であり、より好ましくは、ｘは１であり、ｒは１である。別の好ましい実施形態では、ｘは２であり、ｒは、１又は２であり、より好ましくは、ｘは２であり、ｒは１である。

【0270】

抗体－薬物コンジュゲート
本発明による抗体コンジュゲートの特に好ましい実施形態では、対象の分子は、薬学的に活性な物質からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態では、活性物質は、薬物及びプロドラッグからなる群から選択される。対象の分子は、低から中程度の分子量化合物からなる群から選択されるのがさらにより好ましい。対象の分子は、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチド及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるのがより好ましく、対象の分子は、細胞毒であるのが最も好ましい。さらなる好ましい実施形態では、対象の分子は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、デボーガニン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。好ましい実施形態では、細胞毒は、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアミシン、デュオカルマイシン、マイタンシン、アウリスタチン及びピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、細胞毒は、コルヒチン、ビンカアルカロイド、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン及びデボーガニンからなる群から選択される。

【0271】

本発明による抗体コンジュゲート中の対象の分子が、活性物質である場合、抗体コンジュゲートはまた、「抗体－薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）と呼ぶこともできる。

【0272】

一例として、図１１（Ｂ）は、ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＦ３４による処理後の、アジドをチャージしたトラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎのコンジュゲートに由来する、本発明による抗体薬物コンジュゲートの質量スペクトルのプロファイルを示す。

【0273】

本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートであって、対象の分子が、医薬として使用するための活性物質である、抗体コンジュゲートに関する。

【0274】

本発明はまた、本発明による抗体コンジュゲートの使用であって、対象の分子が、がんの処置に使用するための活性物質である、使用に関する。

【0275】

本発明はさらに、本発明による抗体コンジュゲートであって、対象の分子が、乳がんの処置に使用するため、より好ましくはＨＥＲ２陽性乳がんの処置に使用するための活性物質である、抗体コンジュゲートに関する。

【0276】

本発明はまた、本発明による抗体－薬物コンジュゲートを投与するステップによって、がんを処置する方法にも関する。

【0277】

本発明はまた、本発明による抗体－薬物コンジュゲートを投与するステップによって、乳がんを処置する方法にも関する。

【0278】

本発明はまた、本発明による抗体－薬物コンジュゲートを投与するステップによって、ＨＥＲ２陽性乳がんを処置する方法にも関する。

【0279】

上記の通り、本発明による抗体コンジュゲートは、従来技術で公知の抗体コンジュゲートよりもいくつかの利点を有する。本発明による修飾抗体、抗体コンジュゲート、及びそれらの調製方法の利点の１つは、これらの抗体及び抗体コンジュゲートが、部位特異性と化学量論の両方において均質であることである。本発明による修飾抗体及び抗体コンジュゲートは、理論値に非常に近いＤＡＲ及び非常に小さい標準偏差を伴って得られる。このことはまた、本発明による抗体コンジュゲートは、前臨床試験に対する一貫性が一層高い生成物になることも意味している。

【0280】

本発明による抗体コンジュゲートの特性は、様々なグリコシル化プロファイルを有するモノクローナル抗体を、設計、発現、及び抗体－薬物コンジュゲートに処理することにより、調節される。調節することができる特性は、例えば、抗腫瘍活性、最大耐量、薬物動態（血漿クリアランスなど）、治療指数（有効性及び毒性の両方に関する）、薬物の弱毒化、凝集する傾向、薬物の結合の安定性、及び標的に到達後の薬物の放出である。特に、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の薬物の位置とインビボ有効性との間に相関がある。

【0281】

例えば、実施例１７に記載されて表２にまとめられている通り、様々な糖変異体の凝集傾向に明確な差異が存在しており、グリコシル化部位を除くと、すべてのパラメータ（抗体、リンカー、ペイロード）が一定に維持されている。

【0282】

トラスツズマブの糖変異体間の差異もまた、実施例１８において記載されており、且つ図１５にグラフで例示されているインビボ有効性検討から明らかになっており、一部の糖変異体の場合、ほとんど効果無しから１つの別の糖変異体の場合、ほとんど腫瘍根絶までの範囲となっている。様々な糖変異体間の有効性の差異はより小さいものであるが、実施例１５に記載されており、且つ図１２及び１３、並びに陰性対照である図１４にグラフで図示されている、インビトロ有効性検討からやはり明らかになっている。

【実施例】

【0283】

合成
実施例１．ＢＣＮ－ＰＥＧ_２－ＯＳｕカーボネート（３３）の合成
Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（１．８２ｇ、７．１１ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（５０ｍＬ）溶液をアルゴン下で調製した。ＢＣＮ－ＰＥＧ_２－ＯＨ（１．０ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（５０ｍＬ）溶液を３時間かけて滴下して加えた。さらなる撹拌を１時間行った後、この反応混合物を、ＥｔＯＡｃ／Ｈ_２Ｏ（１５０ｍＬ／１５０ｍＬ）の混合物に注いだ。層を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）により抽出した。合わせた有機層を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）して濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望の生成物が無色油状物（０．７９ｇ、２．８１ｍｍｏｌ、７９％）として得られた。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ（ｐｐｍ）５．１９（ｂｓ，１Ｈ）、４．５０－４．４２（ｍ，２Ｈ）、４．１６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．７７－３．７１（ｍ，２Ｈ）、３．５７（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，５．４Ｈｚ、２Ｈ）、２．８５（ｓ，４Ｈ）、２．３５－２．１６（ｍ，６Ｈ）、１．６５－１．５１（ｍ，２Ｈ）、１．４１－１．３４（ｍ，１Ｈ）。

【0284】

実施例２．ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－ＭＭＡＦ（３４）の合成
Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ（１７．９ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＢＣＮ－ＰＥＧ_２－Ｃ（Ｏ）ＯＳｕ（１７．９ｍｇ、１４．３μｍｏｌ）（３３）をＤＭＦ（０．７８ｍＬ）溶液として、及びトリエチルアミン（６．０μＬ）を加えた。逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８、グラジエントＨ_２Ｏ／ＭｅＣＮ１％ＡｃＯＨ）による精製後、生成物（７ｍｇ、５μｍｏｌ、３５％）が得られた。ＬＲＭＳ（ＨＰＬＣ、ＥＳＩ＋）Ｃ_７４Ｈ_１１４Ｎ_１１Ｏ_１８（Ｍ＋Ｈ^＋）計算値１４４４．８３、実測値１４４５．４４。

【0285】

実施例３．ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－β－ａｌａ－マイタンシノイド（３５）の合成
ＭｅＣＮ（２ｍＬ）中のＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＡ－β－アラニノイル－マイタンシノイド（Ｃｏｎｃｏｒｔｉｓから市販）（２７ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の懸濁液に、トリエチルアミン（９．２μＬ、６．７ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）及びＢＣＮ－ＰＥＧ_２－ＯＳｕカーボネート３３（９．２ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１ｍＬ）溶液を加えた。２３時間後、この混合物を、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）と水（２０ｍＬ）との混合物に注いだ。分離後、有機相を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ→ＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ １／４）による精製後、２２ｍｇ（０．０１５ｍｍｏｌ、７０％）の所望の生成物３５が得られた。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ_７０Ｈ_９７ＣｌＮ_１０Ｏ_２０（Ｍ＋Ｈ^＋）計算値１４３２．６６、実測値１４３４．６４。

【0286】

抗体グリコシル化変異体
天然のトラスツズマブと変異体抗体の両方を、Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｚｕｒｉｃｈ、スイス）により、ＣＨＯ Ｋ１細胞において一過的に発現させ、プロテインＡセファロースを使用して精製し、質量分析により分析した。

【0287】

トラスツズマブの特定の変異体は、特に、Ｌ１９６Ｎ及びＧ１６４Ｓは、文献（Ｑｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｙｈｏｄｓ １９９８年、２１３巻、１３１頁）から誘導するか、又は、特にＶ３６３Ｔは新たに設計した。３つの場合すべてにおいて、アスパラギン２９７がグルタミン（Ｎ２９７Ｑ）に変異して、天然のグリコシル化部位が除去されることが含まれた。変異はすべて、トラスツズマブの重鎖上に局在していた。

【0288】

ＩｇＧの質量スペクトル分析の一般プロトコル
全容積約７０μＬでの、５０μｇ（修飾されている）ＩｇＧ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び３０ｍＭ ＤＴＴの溶液を、３７℃で２０分間、インキュベートし、ジスルフィド架橋を還元して、軽鎖と重鎖の両方を分析できるようにした。存在する場合、アジド官能基をこれらの条件下で、アミンに還元する。還元済み試料をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するｍｉｌｌｉＱにより３回、洗浄し、１０μＭの（修飾されている）ＩｇＧまで濃縮した。ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦで、還元済みＩｇＧをエレクトロスプレーイオン化飛行時間法（ＥＳＩ－ＴＯＦ）により分析した。Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用してデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）したスペクトルを得た。

【0289】

エンドＳを使用する、ＩｇＧグリカンをトリミングするための一般プロトコル
ＩｇＧグリカンのトリミングは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｇｅｎｏｖｉｓ（スウェーデン）から市販）由来のエンドＳを使用して行った。このＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）中、エンドＳ（最終濃度４０Ｕ／ｍＬ）と共に３７℃で１６時間、インキュベートした。

【0290】

エンドＦ２又はエンドＦ３を使用する、ＩｇＧグリカンをトリミングする一般プロトコル
エルザベトキンギア・ミリコラ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｉｒｉｃｏｌａ）（ＱＡ Ｂｉｏから市販）に由来するエンドＦ２、又はエルザベトキンギア・メニンゴセプチクム（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）（ＱＡ Ｂｉｏから市販）に由来するエンドＦ３を使用して、ＩｇＧグリカンのトリミングを行った。１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、このＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で１６時間、エンドＦ２（１００ｍＵ／ｍＬ ＩｇＧ）又はエンドＦ３（２５ｍＵ／ｍｇ ＩｇＧ）と共にインキュベートした。脱グリコシル化したＩｇＧを濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により洗浄した。

【0291】

実施例４．天然トラスツズマブのトリミング
グリコシル化物のＧ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及びＧ２Ｆアイソフォームに相当する５０４４４、５０５９１及び５０７５３及び５０９１４Ｄａの基準ＭＳピークを有するトラスツズマブに、上記のエンドＳを用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後、質量スペクトルにより、軽鎖のピーク１つ、及び重鎖のピークが２つ示された。重鎖の２つのピークは、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブに起因する１つの主要生成物（４９４９６Ｄａ、総重鎖の９０％）、及びコアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブに起因する少量の生成物（４９３５１Ｄａ、総重鎖の±１０％）に属した。

【0292】

実施例５．トラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎのトリミング
グリコシル化アイソフォームＧ２Ｆ、Ｇ２ＦＳ及びＧ２ＦＳ２に相当する５０９３４、５１２２５及び５１５１６Ｄａの主要な基準ＭＳピークを有するトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）変異体に、上記のエンドＦ３を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューション（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）した後の質量スペクトルにより、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）変異体に由来する、軽鎖のピークが１つ、及び重鎖（４９５１４Ｄａ、重鎖全体の９０％）の主要ピークが１つ、示された。上記のエンドＦ３の代わりにエンドＦ２を用いてインキュベートすると、同一のコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換重鎖生成物が得られた。一方、トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）変異体は、エンドＳの作用による加水分解に完全に不活性であった。

【0293】

実施例６．トラスツズマブ変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓのトリミング
グリコシル化アイソフォームＧ２Ｆ、Ｇ２ＦＳ及びＧ２ＦＳ２に相当する５０９６１、５１２５１及び５１５４２Ｄａの主要な基準ＭＳピークを有するトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓ）変異体に、上記のエンドＦ３を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後の質量スペクトルにより、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓ）に由来する、軽鎖のピークが１つ、及び重鎖（４９５３７Ｄａ、重鎖全体の９０％）の主要ピークが１つ、示された。

【0294】

実施例７．トラスツズマブ－変異体Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔのトリミング
グリコシル化アイソフォームＧ２Ｆ、Ｇ２ＦＳ及びＧ２ＦＳ２に相当する５０９３４、５１２２７及び５１５１７Ｄａの主要な基準ＭＳピークを有するトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）変異体に、上記のエンドＦ３を用いるトリミングプロトコルを施した。ピークをデコンボリューションした後の質量スペクトルにより、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）変異体に由来する、軽鎖のピークが１つ及び軽鎖のピークが１つ及び重鎖（４９５１５Ｄａ、重鎖全体の９０％）の主要ピークが１つ示された。同様に、上記のエンドＦ２を用いてインキュベートすると、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換重鎖生成物が得られた。

【0295】

修飾糖のＩｇＧへのグリコシル転移の一般プロトコル
ＩｇＧへの修飾糖の酵素による導入は、ウシβ（１，４）－ガラクトシルトランスフェラーゼの変異体であるβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）を用いて行った。１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で、脱グリコシル化されたＩｇＧ（上記の通り調製、１０ｍｇ／ｍＬ）を、ＵＤＰ－糖２８～３１の１つに由来する修飾ＵＤＰ－糖誘導体（０．４ｍＭ）及びβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１５時間、インキュベートした。

【0296】

修飾ＩｇＧをプロテインＡアガロース（ＩｇＧ１ｍｇあたり４０μＬ）と共に４℃で２時間、インキュベートした。プロテインＡアガロースをＰＢＳにより３回、洗浄し、ＩｇＧを１００ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．７）により溶出した。溶出したＩｇＧを１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）により中和して濃縮し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＰＢＳにより洗浄し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度にした。

【0297】

実施例８．ＵＤＰ－糖２８（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
脱グリコシル化トラスツズマブに、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ２８を用いて、上記のグリコシル転移プロトコルを施した。プロテインＡの親和力による精製後、質量スペクトル分析により、ＧａｌＮＡｚからコアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）置換トラスツズマブへの転移に由来する主要生成物（４９７１３Ｄａ、重鎖全体の９０％）が１つ、及びＧａｌＮＡｚからコアＧｌｃＮＡｃ置換トラスツズマブへの転移に由来する少量生成物（４９５６６Ｄａ、重鎖全体の±１０％）の形成が示された。

【0298】

実施例９．ＵＤＰ－糖２８（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ）の脱グリコシル化トラスツズマブ変異体へのグリコシル転移
トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓ）及びトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）に、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｚ２８を用いて、上記のグリコシル転移プロトコルを施した。トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）（４９７３３Ｄａ、重鎖全体の９０％）、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓ）（４９７５７、重鎖全体の９０％）及びトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）（４９７３４Ｄａ、重鎖全体の９０％）について、重鎖の主要ピークが１つ、観察された。３つの変異体すべての場合で、これは、コアＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ＧａｌＮａｚ置換されている重鎖に相当する。

【0299】

実施例１０．ＵＤＰ－糖２９（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたタラスツズマブ（２５０μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１６．５ｎｍｏｌ）をＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２９）（１８．５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１２．５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製し、低いｐＨを維持するためにカラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）により洗浄して、グリシン．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ）による溶出後、溶出した緩衝液をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、１Ｍ）により中和した。

【0300】

このプロトコルにより、１．１ｍｇのＩｇＧを得て、ＩｇＧのＡｃｃｕＴＯＦ分析により、ｔｒａｓｔ－（ＧａｌＮＡｃＳＨ）_２の９５％が単一の所望の生成物（恐らく、ＤＤＴによるインサイチュ脱保護による、ＧａｌＮＡｃＳＡｃマイナスアセテート基）（質量４９７２９、予期される質量４９７３０）に変換していることが示された。他の５％は、残存している出発原料（質量４９４９４）であった。

【0301】

実施例１１．ＵＤＰ－糖２９（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ）の脱グリコシル化トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）へのグリコシル転移
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＳＡｃ（２９）（１４μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（１０μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製し、低いｐＨを維持するためにカラムを２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）により洗浄して、グリシン．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．７、０．１Ｍ）による溶出後、溶出した緩衝液をＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．２、１Ｍ）により中和した。このプロトコルにより、０．２５ｍｇのＩｇＧを得て、ＩｇＧのＡｃｃｕＴＯＦ分析により、ｔｒａｓｔ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）－（ＧａｌＮＡｃＳＨ）_２が単一の所望の生成物（恐らく、ＤＤＴによるインサイチュ脱保護による、ＧａｌＮＡｃＳＡｃマイナスアセテート基）（質量４９７４４、予期される質量４９７４８）として存在していることが示された。

【0302】

実施例１２．ＵＤＰ－糖３０（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ）の脱グリコシル化トラスツズマブへのグリコシル転移
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブ（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ（３０）（５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。ＧａｌＮＡｃＳＡｃの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製すると、ｔｒａｓｔ－（ＧａｌＮＡｃＣｌ）_２（０．３６ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９７３１、予期される質量４９７３２）に完全に変換されていることが示された。

【0303】

実施例１３．ＵＤＰ－糖３０（ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ）の脱グリコシル化トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）へのグリコシル転移
１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２及び２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．０）中で、トリミングしたトラスツズマブＮ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ変異体（１００μＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、６．６ｎｍｏｌ）をＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃＣｌ（３０）（５μＬ、１０ｍＭ）及びβ（１，４）－Ｇａｌ－Ｔ１（Ｙ２８９Ｌ）（５μＬ、２ｍｇ／ｍＬ）と共に、３０℃で１６時間、インキュベートした。ＧａｌＮＡｃＳＡｃの場合のプロトコルに従い、この粗製混合物をＰｒｏｔＡにより精製すると、ｔｒａｓｔ－（ＧａｌＮＡｃＣｌ）_２（０．３５ｍｇ）が得られた。ＡｃｃｕＴＯＦ分析により、所望の生成物（質量４９７５０、予期される質量４９７５０）に完全に変換されていることが示された。

【0304】

実施例１４．ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド３５のトラスツズマブ変異体へのコンジュゲート
プロテインＡによる精製後、ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド３５に、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｌ１９６Ｎ）、トラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｇ１６４Ｓ）及びトラスツズマブ－（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）をコンジュゲートした。３つのトラスツズマブ変異体すべてをＰＢＳ中、１００μＭになるまで濃縮し、ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド（ＤＭＦ中４、当量）に加え、室温で一晩、インキュベートした。少なくとも９０％の変換率を得るため、この工程を５回、繰り返し、トラスツズマブ（Ｌ１９６Ｎ、Ｎ２９７Ｑ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２（ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する５１１８７Ｄａの主要ピークを含む、５１１００～５１５００Ｄａの間の重鎖生成物、重鎖全体の±９５％）、トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２（ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する５１１８９Ｄａの主要ピークを含む、５１１００～５１５００Ｄａの間の重鎖生成物、重鎖全体の±８０％）及びトラスツズマブ（Ｇ１６４Ｓ、Ｎ２９７Ｑ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２（ＢＣＮ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイドにコンジュゲートされている重鎖に相当する５１２１８Ｄａの主要ピークを含む、５１１００～５１５００Ｄａの間の重鎖生成物、重鎖全体の±９０％）を得た。

【0305】

実施例１５：インビトロ有効性
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２００μＬ／ウェル）を補給した、ＲＰＭＩ１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、９６ウェルプレート（５０００個細胞／ウェル）において、ＳＫ－Ｂｒ－３（Ｈｅｒ２＋）、ＳＫ－ＯＶ－３（Ｈｅｒ２＋）及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｈｅｒ２－）細胞をプレート培養し、３７℃及び５％ＣＯ_２で一晩、インキュベートした。１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ中、滅菌ろ過した化合物の３倍の希釈シリーズ（±０．００２～１００ｎＭの範囲）を調製した。培養培地を除去した後、これらの濃度のシリーズを四連で加え、３７℃及び５％ＣＯ_２で３日間、インキュベートした。この培養培地を、１０％ＦＣＳを補給したＲＰＭＩ１６４０ ＧｌｕｔａＭＡＸ中のレサズリン（Ｓｉｇｍ Ａｌｄｒｉｃｈ）０．０１ｍｇ／ｍＬにより交換した。３７℃及び５％ＣＯ_２で４～６時間後、蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ２００）を用いて、５４０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光で、蛍光を検出した。細胞を含まないウェルを０％生存率、及び最低用量の化合物を含むウェルを１００％生存率に設定することにより、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を細胞生存率に規格化した。各条件について、平均細胞生存率±標準誤差を示す。

【0306】

トラスツズマブ－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２、トラスツズマブ（Ｌ１９６Ｎ、Ｎ２９７Ｑ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２、トラスツズマブ（Ｇ１６４Ｓ、Ｎ２９７Ｑ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２、トラスツズマブ（Ｎ２９７Ｑ、Ｖ３６３Ｔ）－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２のインビトロ細胞毒性を、Ｔ－ＤＭ１を陽性対照として、並びにトラスツズマブ及びリツキシマブ－（ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシノイド）_２を陰性対照として比較した（図１２～１４）。トラスツズマブに基づくＡＤＣはすべて、Ｈｅｒ陽性細胞株ＳＫ－Ｂｒ－３及びＳＫ－ＯＶ－３の生存率に影響を及ぼしたが、Ｈｅｒ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の生存率には影響を及ぼさず、これらのことは、これらのＡＤＣがＨｅｒ２陽性細胞を特異的に標的とすることを示している。Ｈｅｒ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１では、Ｔ－ＤＭ１のみが、最高濃度（１００ｎＭ）において、細胞生存率のわずかな低下を示している。

【0307】

実施例１６：ＧａｌＴ変異体Ｙ２８９Ｎ、Ｙ２８９Ｆ、Ｙ２８９Ｍ、Ｙ２８９Ｖ、Ｙ２８９Ａ、Ｙ２８９Ｇ及びＹ２８９Ｉのクローニング及び発現
ＧａｌＴ変異体の遺伝子は、オーバーラップエクステンションＰＣＲ法により、１３０－４０２ａａ残基からなるＧａｌＴの触媒ドメインをコードする配列を含有する構築物から増幅した。野生型酵素は、配列番号１７により表される。Ｙ２８９Ｎ変異体（配列番号１８により表される）の場合、第１のＤＮＡ断片は、一対のプライマー：

【化18】

を用いて増幅した。ＮｄｅＩ制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。第２の断片は、一対のプライマー：

【化19】

により増幅した。ＢａｍＨＩ制限部位には下線を引いた一方、変異部位は、太字で強調している。ＰＣＲの最初のラウンドにおいて生じた２つの断片は、Ｏｌｉｇｏ３８＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｆｗ及びＯｌｉｇｏ２９＿ＧａｌＴ＿Ｅｘｔｅｒｎａｌ＿Ｒｗプライマーを使用して、第２のラウンドに融合した。ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩによる消化後、この断片は、同じ制限酵素を用いて切断したｐＥＴ１６ｂベクターにライゲーションした。新しく構築した発現ベクターは、Ｙ２８９Ｎ変異体をコードする遺伝子、及びｐＥＴ１６ｂベクターに由来するＨｉｓタグをコードする配列を含有しており、このことは、ＤＮＡシークエンシング結果により確認した。Ｙ２８９Ｆ（配列番号１９により表される）、Ｙ２８９Ｍ（配列番号２０により表される）、Ｙ２８９Ｉ（配列番号２１により表される）、Ｙ２８９Ｖ（配列番号２２により表される）、Ｙ２８９Ａ（配列番号２３により表される）及びＹ２８９Ｇ（配列番号２４により表される）変異体の構築の場合、それぞれ、フェニルアラニン、メチオニン、イソロイシン、バリン、アラニン又はグリシンをコードするＴＴＴ、ＡＴＧ、ＡＴＴ、ＧＴＧ、ＧＣＧ又はＧＧＣトリプレットに変化する変異部位によって、同じ手順を使用した。より詳細には、Ｙ２８９Ｆの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号５として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号６（関連配列に関しては、表１が参照される）として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。さらに、Ｙ２８９Ｍの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号７として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号８として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｉの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号９として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１０として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｖの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１１として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１２として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ａの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１３として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１４として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。Ｙ２８９Ｇの構築の場合、第１のＤＮＡ断片は、本明細書において、配列番号１及び配列番号１５として定義されている一対のプライマーを用いて増幅し、第２の断片は、本明細書において、配列番号３及び配列番号１６（関連配列に関しては、表１が参照される）として定義されている一対のプライマーを用いて増幅した。

【0308】

Ｑａｓｂａら（Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒ．２００３年、３０巻、２１９～２２９頁）により報告されている手順に従って、ＧａｌＴ変異体を発現させて単離し、封入体からリフォールディングした。リフォールディング後、沈殿物を除去し、可溶なフォールディングしたタンパク質をＮｉ－ＮＴＡカラム（ＨｉｓＴｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して単離した。２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ及び２００ｍＭイミダゾールにより溶出した後、タンパク質を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、スピンフィルター（Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ ｍｅｍｂｒａｎｅを備えたＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５遠心フィルターユニット、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【表1】

【0309】

実施例１７：様々なコンジュゲート部位を含むＡＤＣの凝集検討
対応するＡＤＣの凝集に及ぼす、マイタンシノイドのコンジュゲートしている部位の影響を、様々なトラスツズマブ変種に由来する５種のＡＤＣを使用して検討した。これらのＡＤＣは、天然のトラスツズマブ及び４種のトラスツズマブ変異体を使用して調製し、これらの各々は、重鎖（トラスツズマブ（Ｇ１６４Ｓ、Ｎ３００Ｑ）、トラスツズマブ（Ｌ１９６Ｎ、Ｎ３００Ｑ）、トラスツズマブ（Ｋ２９１Ｔ、Ｎ３００Ｑ）及びトラスツズマブ（Ｎ３００Ｑ、Ｖ３６６Ｔ））に単一グリコシル化部位を含有した。ＡＤＣは、ＧａｌＮＡｚの導入を伴う、酵素によるグリカンのリモデリング、続くＢＣＮ－マイタンシン３５へのコンジュゲートによって調製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のサイズ排除イオンクロマトグラフィーによりすべてのＡＤＣを精製し、単量体の画分を得た。精製後、１ｍｇ／ｍｌの濃度のリン酸緩衝生理食塩水中、３７℃でＡＤＣをインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ＰＣ３．２／３０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、０、１及び２週間後に凝集のレベルを分析した。Ｔ０と比べた、１及び２週間後の凝集の増加量を表２に示している。トラスツズマブ（Ｇ１６４Ｓ、Ｎ３００Ｑ）及びトラスツズマブ（Ｌ１９６Ｎ、Ｎ３００Ｑ）に由来するＡＤＣは、天然のトラスツズマブに由来するＡＤＣに比べると、それほどの凝集を示さない。

【表2】

【0310】

実施例１８：インビボ有効性
雌のＳＨＯマウス（Ｃｒｌ：ＳＨＯ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｈｒｈｒ、実験段階の開始時に６～９週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ‘Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ（フランス）から入手）をケタミン／キシラジンを用いて麻酔にかけ、皮膚をクロルヘキシジン溶液により滅菌処理し、肩甲骨領域のレベルに切り込みを入れて、２０ｍｍ^３の腫瘍断片（ＨＢＣｘ－１３Ｂ乳がん患者に由来する異種移植片モデル）を皮下組織に置き、皮膚をクリップで閉じた。腫瘍体積が、６０～２００ｍｍ^３の範囲になると、１０匹のマウスの群に、ビヒクル、トラスツズマブ－（ＧａｌＮＡｚ－ｖｃ－ＰＡＢＡ－マイタンシン）_２、又はグリコシル化変異体であるトラスツズマブ（Ｇ１６４Ｓ、Ｎ３００Ｑ）、トラスツズマブ（Ｌ１９６Ｎ、Ｎ３００Ｑ）、トラスツズマブ（Ｋ２９１Ｔ、Ｎ３００Ｑ）、トラスツズマブ（Ｎ３００Ｑ、Ｖ３６６Ｔ）、トラスツズマブ（Ｌ１７７Ｎ、Ｎ３００Ｑ）若しくはトラスツズマブ（ＬＣ－Ｒ１８Ｎ、ＨＣ－Ｎ３００Ｑ）のいずれかを、すべて６ｍｇ／ｋｇの用量で、ｉ．ｖ．注射した。０、４、７、１１、１４、１８、２１、２５及び２８日目に腫瘍を測定した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10a】

【図10b】

【図11a】

【図11b】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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