(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-17
(45)【発行日】2022-03-28
(54)【発明の名称】単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20220318BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20220318BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20220318BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20220318BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20220318BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20220318BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220318BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20220318BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20220318BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20220318BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20220318BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220318BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20220318BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20220318BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20220318BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20220318BHJP
A61P 33/00 20060101ALI20220318BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20220318BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20220318BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20220318BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220318BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46
C12N15/13 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C07K19/00
A61K35/76
A61K48/00
A61K45/00
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P35/00
A61P37/02
A61P37/06
A61P33/00
A61P31/12
A61P31/00
A61P29/00
A61P43/00 121
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2018560557
(86)(22)【出願日】2017-05-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-08-29
(86)【国際出願番号】 US2017033673
(87)【国際公開番号】W WO2017201493
(87)【国際公開日】2017-11-23
【審査請求日】2020-05-14
(31)【優先権主張番号】62/339,685
(32)【優先日】2016-05-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517403846
【氏名又は名称】ハープーン セラピューティクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100082072
【弁理士】
【氏名又は名称】清原 義博
(72)【発明者】
【氏名】ドゥブリッジ，ロバート ビー．
(72)【発明者】
【氏名】セト，プイ
(72)【発明者】
【氏名】オースティン，リチャード ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】イブニン，ルーク
(72)【発明者】
【氏名】ゲノ，ジャンマリー
(72)【発明者】
【氏名】レモン，ブライアン ディー．
【審査官】西垣 歩美
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１４／０００４１２１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１６／００１７０５８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１５／１４６４３７（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９のアミノ酸配列を含む、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質。
【請求項2】
請求項１の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項3】
請求項２のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項4】
請求項３のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項5】
（ｉ）請求項１の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、請求項２のポリヌクレオチド、請求項３のベクター、または請求項４の宿主細胞、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項6】
請求項１の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の産生のためのプロセスであって、
前記プロセスは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主を培養すること、および、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製することを含む、プロセス。
【請求項7】
請求項１の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む、多特異性の結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１６年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／３３９，６８５号の利益を主張するものであり、この文献は参照によって全体として本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年５月１９日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７－７０４＿６０１＿ＳＥＱ．ＴＸＴのファイル名であり、６６，０４２バイトのサイズである。
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含んでいる。２０１７年５月１９日に作成された上記のＡＳＣＩＩのコピーは、４７５１７－７０４＿６０１＿ＳＥＱ．ＴＸＴのファイル名であり、６６，０４２バイトのサイズである。
【0003】
引用による組み込み
本明細書で言及される公開物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の公開物、特許あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるべく具体的かつ個々に指示されるかのように、および、その全体にわたって、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される公開物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の公開物、特許あるいは特許出願がそれぞれ参照により組み込まれるべく具体的かつ個々に指示されるかのように、および、その全体にわたって、同程度まで参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体複合体（ＴＣＲ）と共にＴ細胞上で発現したホモ二量体またはヘテロ二量体の抗原であり、Ｔ細胞活性化に必要とされている。抗ＣＤ３抗体にはＴ細胞の活性化を含む治療目的がある。本開示は、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性の抗体を含む、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を提供する。
【発明の概要】
【0005】
１つの実施形態では、可変重鎖領域（ＶＨ）、可変軽鎖領域（ＶＬ）、およびリンカーを含む単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質が開示され、ここで、ＶＨは相補性決定領域ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＬは相補性決定領域ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含み、ここで、（ａ）ＨＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＧＸ１Ｘ２Ｘ３ＮＸ４ＹＸ５Ｘ６Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）に記載される通りであり、Ｘ１はフェニルアラニンまたはアスパラギンであり、Ｘ２はトレオニン、グルタミン酸、またはメチオニンであり、Ｘ３はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘ４はリジン、トレオニン、グリシン、アスパラギン、またはグルタミン酸であり、Ｘ５はアラニンまたはプロリンであり、Ｘ６はメチオニン、ロイシン、バリン、またはイソロイシンであり；（ｂ）ＨＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＲＩＲＳＸ７Ｘ８ＮＸ９ＹＸ１０ＴＸ１１ＹＸ１２ＤＸ１３ＶＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）で記載される通りであり、Ｘ７はリジンまたはグリシンであり、Ｘ８はチロシンまたはセリンであり、Ｘ９はアスパラギンまたはリジンであり、Ｘ１０はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１１はチロシンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１２はアラニンまたはリジンであり、Ｘ１３はセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、またはグルタミンであり；（ｃ）ＨＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＨＸ１４ＮＦＸ１５Ｘ１６ＳＸ１７ＩＳＹＷＡＸ１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）で記載される通りであり、Ｘ１４はグリシン、アラニン、またはトレオニンであり、Ｘ１５はグリシンまたはアスパラギンであり、Ｘ１６はアスパラギンまたはアスパラギン酸であり、Ｘ１７はチロシン、ヒスチジン、プロリン、グルタミン、ロイシン、またはグリシンであり、Ｘ１８はチロシンまたはトレオニンであり；（ｄ）ＬＣ ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＸ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２ＧＸ２３ＶＸ２４Ｘ２５ＧＸ２６ＹＰＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）に記載される通りであり、Ｘ１９はグリシンまたはアラニンであり、Ｘ２０はセリンまたはグルタミン酸であり、Ｘ２１はセリンまたはチロシンであり、Ｘ２２はトレオニン、フェニルアラニン、リジン、またはセリンであり、Ｘ２３はアラニンまたはチロシンであり、Ｘ２４はトレオニンまたはバリンであり、Ｘ２５はセリン、アスパラギン酸、リジン、ヒスチジン、またはバリンであり、Ｘ２６はアスパラギンまたはチロシンであり；（ｅ）ＬＣ ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＧＸ２７Ｘ２８Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）で記載される通りであり、Ｘ２７はトレオニンまたはイソロイシンであり、Ｘ２８はリジン、グルタミン酸、チロシン、アスパラギン、またはセリンであり、Ｘ２９はフェニルアラニン、ロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、またはバリンであり、Ｘ３０はロイシン、アスパラギン、またはグリシンであり、Ｘ３１はアラニンまたはバリンであり；および、（ｆ）ＬＣ ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＸ３２ＬＷＹＸ３３ＮＸ３４ＷＸ３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）で記載される通りであり、Ｘ３２はバリン、トレオニン、またはアラニンであり、Ｘ３３はセリン、アスパラギン酸、またはアラニンであり、Ｘ３４はアルギニンまたはセリンであり、Ｘ３５はバリン、イソロイシン、またはアラニンであり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１３、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ２０、Ｘ２１、Ｘ２２、Ｘ２３、Ｘ２４、Ｘ２５、Ｘ２６、Ｘ２７、Ｘ２８、Ｘ２９、Ｘ３０、Ｘ３１、Ｘ３２ Ｘ３３、Ｘ３４、およびＸ３５は、同時に、それぞれフェニルアラニン、トレオニン、フェニルアラニン、リジン、アラニン、メチオニン、リジン、チロシン、アスパラギン、アラニン、チロシン、アラニン、セリン、グリシン、グリシン、アスパラギン、チロシン、チロシン、グリシン、セリン、セリン、トレオニン、アラニン、トレオニン、セリン、アスパラギン、トレオニン、リジン、フェニルアラニン、ロイシン、アラニン、バリン、セリン、アルギニン、およびバリンではない。
【0006】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、以下の式：ｆ１－ｒ１－ｆ２－ｒ２－ｆ３－ｒ３－ｆ４－ｒ４－ｆ５－ｒ５－ｆ６－ｒ６－ｆ７を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり；ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり；ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり；ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５であり；ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６であり；および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり；ここで、ｆ１、ｆ２、ｆ３、ｆ４、およびｆ５は、上記のタンパク質がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２で記載されるアミノ酸配列に少なくとも８０パーセント同一であるように、選択されたフレームワーク残基である。
【0007】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８５、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８６を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９２、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９３を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３９であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６１であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８６であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８９である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６７であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７７であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９２である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６０であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６４であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７９であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９１である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３５であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４６であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６５であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８０であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８７である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７３であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７６である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５７であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７４である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３８であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６２であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８１である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３７であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７０であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８２であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８８である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６８であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７１であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８３である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６３であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８４であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９０である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４４であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５８であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６６であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８５である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４５であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６であり、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７８であり、および、ｒ６はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９３である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、アミノ酸配列を含み、式中、ｒ１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３６であり、ｒ２はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０であり、ｒ３はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５９であり、ｒ４はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７２であり、および、ｒ５はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７５である。
【0008】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５から選択されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５として記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、リンカーを含むアミノ酸配列を含み、ここで、上記リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で記載される通りのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３から選択されたＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、同等の結合親和性（Ｋｄ）を有するヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、約１ｎＭ～約２００ｎＭ間のヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、約１ｎＭ～約３００ｎＭ間のカニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、ｈＫｄとｃＫｄは、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約１１ｎＭ～約２０ｎＭ、約２５ｎＭ～約４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約６０ｎＭ、約７０ｎＭ～約９０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１２５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１４５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ～約３００ｎＭである。
【0009】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合し、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合し、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合し、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合し、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に結合し、カニクイザルＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合し、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。
【0010】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約２５ｎＭと約４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約４０ｎＭと約６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約４０ｎＭと約６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１２５ｎＭと約１４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５として記載されるアミノ酸配列を有し、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。別の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２（ｗｔ抗ＣＤ３）として記載される配列を含む単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、アミノ酸位置２７、２８、２９、３１、３３、３４、５４、５５、５７、５９、６１、６３、６５、１０２、１０５、１０６、１０８、１１４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６８、１７０、１７１、１７３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２３１、２３５、２３７、および２３９から選択された１つ以上のアミノ酸残基が置換され、ここで、アミノ酸位置２７はアスパラギンで置換され、アミノ酸位置２８はグルタミン酸またはメチオニンで置換され、アミノ酸位置２９はチロシンで置換され、アミノ酸位置３１はアスパラギン、グリシン、グルタミン酸、またはトレオニンで置換され、アミノ酸位置３３はプロリンで置換され、アミノ酸位置３４はバリン、ロイシン、またはイソロイシンで置換され、アミノ酸位置５４はグリシンで置換され、アミノ酸位置５５はセリンで置換され、アミノ酸位置５７はリジンで置換され、アミノ酸位置５９はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置６１はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置６３はリジンで置換され、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、またはグルタミンで置換され、アミノ酸位置１０２はアラニンまたはトレオニンで置換され、アミノ酸位置１０５はアスパラギンで置換され、アミノ酸位置１０６はアスパラギン酸で置換され、アミノ酸位置１０８はヒスチジン、プロリン、グルタミン、グリシン、またはロイシンで置換され、アミノ酸位置１１４はトレオニンで置換され、アミノ酸位置１６３はアラニンで置換され、アミノ酸位置１６４はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置１６５はチロシンで置換され、アミノ酸位置１６６はフェニルアラニン、リジン、またはセリンで置換され、アミノ酸位置１６８はチロシンで置換され、アミノ酸位置１７０はバリンで置換され、アミノ酸位置１７１はアスパラギン酸、リジン、バリン、またはヒスチジンで置換され、アミノ酸位置１７３はチロシンで置換され、アミノ酸位置１９３はイソロイシンで置換され、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸、チロシン、アスパラギン、またはセリンで置換され、アミノ酸位置１９５はロイシン、グルタミン酸、イソロイシン、メチオニン、またはバリンで置換され、アミノ酸位置１９６はアスパラギンまたはグリシンで置換され、アミノ酸位置１９７はバリンで置換され、アミノ酸位置２３１はトレオニンまたはアラニンで置換され、アミノ酸位置２３５はアスパラギン酸またはアラニンで置換され、アミノ酸位置２３７はセリンで置換され、およびアミノ酸位置２３９はアラニンまたはイソロイシンで置換される。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７、２８、２９、３１、３３、３４、５４、５５、５７、５９、６１、６３、６５、１０２、１０５、１０６、１０８、１１４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６８、１７０、１７１、１７
３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２３１、２３５、２３７、および２３９以外のアミノ酸位置において１つ以上の追加の置換基を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０２における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１１４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７０における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、６５、１０２、１６３、１９７、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５７、１６６、および２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０８、１６８、１９４、および２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５５、１１４、１６６、１９５、および２３７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６３、１０８、１７０、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２９、６５、１０８、１６６、１９５、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７、５９、１０２、１７３、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７１および１９３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、１６４、および１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３３、１０５、１７１、１９５、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７０、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７、１０６、１７１、および１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、５４、１６５、１９６、および２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５９、１０８、１６６、および１９６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、６１、１０８、１９４、および２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７１、および１９４における置換を含む。
３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２３１、２３５、２３７、および２３９以外のアミノ酸位置において１つ以上の追加の置換基を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置５９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置６５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０２における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１１４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１６８における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７０における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１７３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１９７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、６５、１０２、１６３、１９７、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５７、１６６、および２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置１０８、１６８、１９４、および２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５５、１１４、１６６、１９５、および２３７における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６３、１０８、１７０、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２９、６５、１０８、１６６、１９５、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７、５９、１０２、１７３、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７１および１９３における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、１６４、および１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３３、１０５、１７１、１９５、および２３１における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７０、および１９４における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２７、１０６、１７１、および１９５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、５４、１６５、１９６、および２３５における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置２８、５９、１０８、１６６、および１９６における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３４、６１、１０８、１９４、および２３９における置換を含む。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、位置３１、６５、１０８、１７１、および１９４における置換を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、６５、１０２、１６３、１９７、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、６５、１０２、１６３、１９７、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５７、１６６、および２３５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５７、１６６、および２３５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。
【0012】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置１０８、１６８、１９４、および２３９が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置１０８、１６８、１９４、および２３９が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５５、１１４、１６６、１９５、および２３７が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５５、１１４、１６６、１９５、および２３７が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６３、１０８、１７０、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６３、１０８、１７０、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２９、６５、１０８、１６６、１９５、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２９、６５、１０８、１６６、１９５、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７、５９、１０２、１７３、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７、５９、１０２、１７３、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７１、および１９３が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７１、および１９３が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約２５ｎＭと約４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、１６４、および１９５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、１６４、および１９５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３３、１０５、１７１、１９５、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３３、１０５、１７１、１９５、および２３１が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約４０ｎＭと約６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７０、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７０、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７、１０６、１７１、および１９５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７、１０６、１７１、および１９５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約４０ｎＭと約６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、５４、１６５、１９６、および２３５が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、５４、１６５、１９６、および２３５が置換され（１０Ｂ２）、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと約２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５９、１０８、１６６、および１９６が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２５倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８、５９、１０８、１６６、および１９６が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１２５ｎＭと約１４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、６１、１０８、１９４、および２３９が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４、６１、１０８、１９４、および２３９が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７１、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１、６５、１０８、１７１、および１９４が置換され、および、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。
【0013】
さらなる実施形態において、可変重鎖領域（ＶＨ）、可変軽鎖領域（ＶＬ）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）で記載される通りのアミノ酸配列を含むリンカーを含む、ｗｔ抗ＣＤ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）で記載される通りのアミノ酸配列を含む単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質が本明細書で提供され、ここで、ＶＨは相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、ここで、ＶＬは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３中に、および、ＶＬのＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、またはＬＣ ＣＤＲ３中に少なくとも１つの突然変異を含む、相補性決定領域ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含み、ここで、少なくとも１つの突然変異は、アミノ酸位置２６、３０、３２、３５、５０、５１、５２、５３、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６７、１０１、１０３、１０４、１０７、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１６７、１６９、１７２、１７４、１７５、１７６、１９２、１９８、２３２、２３３、２３４、２３６、または２３８にはない。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、２７、２８、２９、３１、３３、３４、５４、５５、５７、５９、６１、６３、６５、１０２、１０５、１０６、１０８、１１４、１６３、１６４、１６５、１６６、１６８、１７０、１７１、１７３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、２３１、２３５、２３７、および２３９から選択されたアミノ酸位置に少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３４はイソロイシンに突然変異し、位置６５はグルタミンに突然変異し、位置１０２はアラニンに突然変異し、位置１６３はアラニンに突然変異し、位置１９７はバリンに突然変異し、および位置２３１はトレオニンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５７はリジンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、および、位置２３５はアスパラギン酸に突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置１０８はヒスチジンに突然変異し、位置１６８はチロシンに突然変異し、位置１９４はセリンに突然変異し、および、位置２３９はイソロイシンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２８はメチオニンに突然変異し、位置５５はセリンに突然変異し、位置１１４はトレオニンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、位置１９５はロイシンに突然変異し、および、位置２３７はセリンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３１はトレオニンに突然変異し、位置６３はリジンに突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２９はチロシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１６６はリジンに突然変異し、位置１９５はグルタミン酸に突然変異し、および、位置２３１はトレオニンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０２はトレオニンに突然変異し、位置１７３はチロシンに突然変異し、および、位置１９４はチロシンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置６５はアラニンに突然変異し、位置１０８はグルタミンに突然変異し、位置１７１はアスパラギン酸に突然変異し、および、位置１９３はイソロイシンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３４はバリンに突然変異し、位置１６４はグルタミン酸に突然変異し、および、位置１９５はイソロイシンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３３はプロリンに突然変異し、位置１０５はアスパラギンに突然変異し、位置１７１はリジンに突然変異し、位置１９５はメチオニンに突然変異し、および、位置２３１はアラニンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３１はグリシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置１０６はアスパラギン酸に突然変異し、位置１７１はヒスチジンに突然変異し、および、位置１９５はバリンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置５４はグリシンに突然変異し、位置１６５はチロシンに突然変異し、位置１９６はアスパラギンに突然変異し、および、位置２３５はアラニンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はロイシンに突然変異し、位置１６６はセリンに突然変異し、および、位置１９６はグリシンに突然変異する。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３４はロイシンで置換され、アミノ酸位置６１はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置１０８はプロリンで置換され、アミノ酸位置１９４はアスパラギンで置換され、および、アミノ酸位置２３９はアラニンで置換される。いくつかの実施形態において、アミノ酸位置３１はグルタミン酸で置換され、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸で置換され、アミノ酸位置１０８はグリシンで置換され、アミノ酸位置１７１はバリンで置換され、および、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸で置換される。
【0014】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はイソロイシンに突然変異し、位置６５はグルタミンに突然変異し、位置１０２はアラニンに突然変異し、位置１６３はアラニンに突然変異し、位置１９７はバリンに突然変異し、および位置２３１はトレオニンに突然変異し、および、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はイソロイシンに突然変異し、位置６５はグルタミンに突然変異し、位置１０２はアラニンに突然変異し、位置１６３はアラニンに突然変異し、位置１９７はバリンに突然変異し、および、位置２３１はトレオニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５７はリジンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、および、位置２３５はアスパラギン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５７はリジンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、および、位置２３５はアスパラギン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置１０８はヒスチジンに突然変異し、位置１６８はチロシンに突然変異し、位置１９４はセリンに突然変異し、および、位置２３９はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄはｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置１０８はヒスチジンに突然変異し、位置１６８はチロシンに突然変異し、位置１９４はセリンに突然変異し、および、位置２３９はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はメチオニンに突然変異し、位置５５はセリンに突然変異し、位置１１４はトレオニンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、位置１９５はロイシンに突然変異し、および、位置２３７はセリンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性とほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はメチオニンに突然変異し、位置５５はセリンに突然変異し、位置１１４はトレオニンに突然変異し、位置１６６はフェニルアラニンに突然変異し、位置１９５はロイシンに突然変異し、および、位置２３７はセリンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約３ｎＭと約５ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はトレオニンに突然変異し、位置６３はリジンに突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はトレオニンに突然変異し、位置６３はリジンに突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２９はチロシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１６６はリジンに突然変異し、位置１９５はグルタミン酸に突然変異し、および、位置２３１はトレオニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約１．５倍～約２倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２９はチロシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１６６はリジンに突然変異し、位置１９５はグルタミン酸に突然変異し、および、位置２３１はトレオニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約６ｎＭと約１０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０２はトレオニンに突然変異し、位置１７３はチロシンに突然変異し、および、位置１９４はチロシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０２はトレオニンに突然変異し、位置１７３はチロシンに突然変異し、および、位置１９４はチロシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１１ｎＭと２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置６５はアラニンに突然変異し、位置１０８はグルタミンに突然変異し、位置１７１はアスパラギン酸に突然変異し、および、位置１９３はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置６５はアラニンに突然変異し、位置１０８はグルタミンに突然変異し、位置１７１はアスパラギン酸に突然変異し、および、位置１９３はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約２５ｎＭと約４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はバリンに突然変異し、位置１６４はグルタミン酸に突然変異し、および、位置１９５はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はバリンに突然変異し、位置１６４はグルタミン酸に突然変異し、および、位置１９５はイソロイシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約１１ｎＭと２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３３はプロリンに突然変異し、位置９０はアスパラギンに突然変異し、位置１０５はアスパラギンに突然変異し、位置１７１はリジンに突然変異し、位置１９５はメチオニンに突然変異し、および、位置２３１はアラニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３３はプロリンに突然変異し、位置９０はアスパラギンに突然変異し、位置１０５はアスパラギンに突然変異し、位置１７１はリジンに突然変異し、位置１９５はメチオニンに突然変異し、および、位置２３１はアラニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約４０ｎＭと６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグリシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグリシンに突然変異し、位置６５はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はプロリンに突然変異し、位置１７０はバリンに突然変異し、および、位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約１１ｎＭと２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置１０６はアスパラギン酸に突然変異し、位置１７１はヒスチジンに突然変異し、および、位置１９５はバリンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２７はアスパラギンに突然変異し、位置１０６はアスパラギン酸に突然変異し、位置１７１はヒスチジンに突然変異し、および、位置１９５はバリンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約４０ｎＭと６０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置５４はグリシンに突然変異し、位置１６５はチロシンに突然変異し、位置１９６はアスパラギンに突然変異し、および、位置２３５はアラニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はアスパラギンに突然変異し、位置５４はグリシンに突然変異し、位置１６５はチロシンに突然変異し、位置１９６はアスパラギンに突然変異し、および、位置２３５はアラニンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約１１ｎＭと約２０ｎＭ
の間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はロイシンに突然変異し、位置１６６はセリンに突然変異し、および、位置１９６はグリシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はロイシンに突然変異し、位置１６６はセリンに突然変異し、および、位置１９６はグリシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１２５ｎＭと約１４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はロイシンに突然変異し、アミノ酸位置６１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はプロリンに突然変異し、アミノ酸位置１９４はアスパラギンに突然変異し、アミノ酸位置２３９はアラニンに突然変異し、および、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はロイシンに突然変異し、アミノ酸位置６１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はプロリンに突然変異し、アミノ酸位置１９４はアスパラギンに突然変異し、アミノ酸位置２３９はアラニンに突然変異し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はグリシンに突然変異し、アミノ酸位置１７１はバリンに突然変異し、および、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はグリシンに突然変異し、アミノ酸位置１７１はバリンに突然変異し、および、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。
の間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はロイシンに突然変異し、位置１６６はセリンに突然変異し、および、位置１９６はグリシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置２８はグルタミン酸に突然変異し、位置５９はグルタミン酸に突然変異し、位置１０８はロイシンに突然変異し、位置１６６はセリンに突然変異し、および、位置１９６はグリシンに突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１２５ｎＭと約１４０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はロイシンに突然変異し、アミノ酸位置６１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はプロリンに突然変異し、アミノ酸位置１９４はアスパラギンに突然変異し、アミノ酸位置２３９はアラニンに突然変異し、および、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３４はロイシンに突然変異し、アミノ酸位置６１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はプロリンに突然変異し、アミノ酸位置１９４はアスパラギンに突然変異し、アミノ酸位置２３９はアラニンに突然変異し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はグリシンに突然変異し、アミノ酸位置１７１はバリンに突然変異し、および、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対する結合親和性よりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は配列を含み、ここで、アミノ酸位置３１はグルタミン酸に突然変異し、アミノ酸位置６５はアスパラギン酸に突然変異し、アミノ酸位置１０８はグリシンに突然変異し、アミノ酸位置１７１はバリンに突然変異し、および、アミノ酸位置１９４はグルタミン酸に突然変異し、ならびに、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは約１００ｎＭと約１２０ｎＭの間である。
【0015】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質はマウスＣＤ３には結合しない。
【0016】
１つの実施形態では、本開示に従って単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。１つの実施形態では、本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。１つの実施形態では、本明細書に記載されたベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。さらなる実施形態では、（ｉ）本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、本開示に係るポリヌクレオチド、本開示に係るベクター、または本開示に係る宿主細胞、および、（ｉｉ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物が提供される。
【0017】
別の実施形態では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の産生のためのプロセスが提供され、上記プロセスは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主を培養すること、および、培養物から生成されたタンパク質を回収および精製することを含む。
【0018】
別の実施形態では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の被験体への投与を含む、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病の処置または改善のための方法が提供される。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態において、方法はさらに、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質と組み合わせた薬剤の投与を含む。
【0019】
１つの実施形態では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性の結合タンパク質が本明細書で提供される。１つの実施形態は、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む抗体を記載している。さらなる実施形態は、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む、多特異性抗体、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、可変重鎖ドメイン、ペプチド、またはリガンドを提供する。１つの実施形態では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む抗体が本明細書に記載され、上記抗体はｓｃＦｖ抗体である。別の実施形態は、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質と血清アルブミン結合ドメインとを含む多特異性結合タンパク質または抗体を記載している。
【0020】
本発明の新しい特徴は、添付の請求項の特殊性をもって説明される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が用いられる実施形態を説明する以下の詳細な説明と、以下の添付図面とを引用することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【図1】ビオチンＣＤ３εとビオチン－ＨＳＡ上でのファージ滴定を例証する。
【図2】ヒトＣＤ３結合タンパク質のアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を例証する。ＨＣ ＣＤＲ１は第１の陰影を付けた配列（ＧＦＴＦＮＫＹＡＭＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３））で示され、ＨＣ ＣＤＲ２は第２の陰影を付けた配列（ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４））で示され、ＨＣ ＣＤＲ３は第３の陰影を付けた配列（ＨＧＮＦＧＮＳＹＩＳＹＷＡＹ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５））で示され、ＬＣ ＣＤＲ１は第４の陰影を付けた配列（ＧＳＳＴＧＡＶＴＳＧＮＹＰＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６））で示され、ＬＣ ＣＤＲ２は第５の陰影を付けた配列（ＧＴＫＦＬＡＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７））で示され、および、ＣＤＲ３は第６の陰影を付けた配列（ＶＬＷＹＳＮＲＷＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８））で示される。
【図3】より正確なＫｄ決定のために選択された１６のクローンのプロフィールを例証する。
【図4】複数の抗ｈｕＣＤ３ε ｓｃＦｖ変異体のための疎水性の曝露（Ｔｈ°Ｃ）の温度を例証する。
【発明を実施するための形態】
【0022】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され記載されているが、こうした実施形態がほんの一例として提供されているに過ぎないということは当業者にとって明白である。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者の心に思い浮かぶであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用されることもあることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、この請求項とその均等物の範囲内の方法および構造体がそれによって包含されるものであるということが意図されている。
【0023】
特定の定義
本明細書で使用される用語は、特別のケースだけを記載することを目的としており、本発明を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、または、その変異形が発明を実施するための形態および／または請求項のいずれかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語に類似する手法で包括的であることを意図している。
本明細書で使用される用語は、特別のケースだけを記載することを目的としており、本発明を制限することを意図していない。本明細書で使用されるように、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味を明白に示すものでない限り、同様に複数形を含むことを意図している。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「含んだ（ｗｉｔｈ）」、または、その変異形が発明を実施するための形態および／または請求項のいずれかで使用される程度には、上記のような用語は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」との用語に類似する手法で包括的であることを意図している。
【0024】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの制限に部分的に依存している。例えば、「約」とは、任意の値での実践につき１または１を超える標準偏差を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、特段の定めのない限り、「約」との用語は、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味するものであると仮定されなければならない。
【0025】
用語「個体」、「患者」、または「被験体」は交換可能に使用される。いかなる用語も、医療従事者（例えば、医者、正看護師、臨床看護師、医師助手、看護助手、あるいはホスピスの職員）の監督（例えば、常時または断続的）を特徴とする状況を必要とせず、かつ、該状況に限定されない。
【0026】
本明細書で使用されるように、「消失半減期」は、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２１－２５ （Ａｌｆｒｅｄ Ｇｏｏｄｍａｎ Ｇｉｌｍａｎ， Ｌｏｕｉｓ Ｓ． Ｇｏｏｄｍａｎ， ａｎｄ Ａｌｆｒｅｄ Ｇｉｌｍａｎ， ｅｄｓ．， ６ｔｈ ｅｄ． １９８０）に記載されるように、通常の意味で使用される。簡潔に言えば、この用語は、薬物排泄の時間的経過の定量的測度を包含することを目的としている。薬物濃度が消失プロセスの飽和に必要とされる濃度には通常接近しないので、ほとんどの医薬品の消失は指数関数的である（つまり、一次速度論に従う）。指数関数的なプロセスの速度は、１単位時間当たりの僅かな変化を表現するその速度定数ｋによって、あるいは、そのプロセスの５０％の完成のために必要とされる時間であるその半減時間ｔ１／２によって、表現されることがある。これらの２つの定数の単位はそれぞれｔｉｍｅ－１とｔｉｍｅである。反応の一次速度定数と半減時間は、単純に関連づけられ（ｋ×ｔ１／２＝０．６９３）、これに応じて交換されることがある。一次消失動力学は一定の比率の薬物が単位時間ごとに失われるように指令を出すため、薬物濃度対時間の対数のプロットは、初回の分布相の後（つまり、薬物の吸収と分布が完了している後）は常に線形である。薬物排泄のための半減時間はこうしたグラフから正確に決定することができる。
【0027】
本明細書で使用されるように、配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」との用語は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して最大のパーセント配列同一性を達成した後に、かつ、配列同一性の一部としてのいかなる保存的置換を考慮せずに、特定の配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、当該技術分野内の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている利用可能なコンピューター・ソフトウェアを用いて達成可能である。当業者は、比較されている配列の完全長にわたって最大限の整列を達成するために必要とされるあらゆるアルゴリズムを含む、配列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【0028】
用語「フレームワーク」または「ＦＲ」残基（または領域）は、本明細書に定義されるようなＣＤＲまたは超可変領域の残基以外の可変ドメイン残基を指す。「ヒト・コンセンサス・フレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬまたはＶＨフレームワーク配列の選択の際に最も一般に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。
【0029】
本明細書で使用されるように、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、可変ドメインの特定の部分が抗体中の配列で大きく異なり、その特定の抗原について各々の特定の抗体の結合と特異性で使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体に均一に分布していない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々、β－シート構造を接続する、場合によってはβ－シート構造の一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲにより接続された、β－シート構造を採用している４つのＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて接近して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体を抗原に結合することに直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。「Ｋａｂａｔでのような可変ドメイン残基の番号付け」あるいは「Ｋａｂａｔでのようなアミノ酸位置の番号付け」、およびその変更形態は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）における抗体の編集物の重鎖可変ドメインあるいは軽鎖可変ドメインのために使用された番号づけ方式を参照する。この番号付け方式を使用して、実際の線形のアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲの短縮または可変ドメインのＦＲまたはＣＤＲへの挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔに係る残基５２ａ）を、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに係る残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含むことがある。残基のＫａｂａｔの番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔの番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同領域での整列によって任意の抗体について決定されることがある。本開示のＣＤＲはＫａｂａｔの番号付けの慣習に必ず対応するということを意図するものではない。
【0030】
本明細書で使用されるように、用語「結合親和性」は、それらの結合標的に対する本開示に記載されたタンパク質の親和性を指し、「Ｋｄ」値を数的に使用して発現される。２つ以上のタンパク質が、それらの結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、その結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。２つ以上のタンパク質が単一の結合標的に対して同等の結合親和性を有すると示されている場合、上記の単一結合標的に対するそれぞれのタンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。タンパク質が同等の結合親和性で２つ以上の標的に結合すると示されている場合、２つ以上の標的に対する上記タンパク質の結合に関するＫｄ値は、互いの±２倍以内である。一般に、高いＫｄ値は弱い結合に相当する。いくつかの実施形態では、「Ｋｄ」は、放射標識された抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）、または、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイによって測定される。ある実施形態では、「ｏｎ－ｒａｔｅ」あるいは「会合速度（ｒａｔｅ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎまたはａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」あるいは「ｋｏｎ」、および「ｏｆｆ－ｒａｔｅ」あるいは「解離速度（ｒａｔｅ ｏｆ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｒａｔｅ）」、または「ｋｏｆｆ」もＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－２０００あるいはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用する表面プラズモン共鳴技術で決定される。追加の実施形態では、「Ｋｄ」、「ｋｏｎ」、および「ｋｏｆｆ」は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システムズ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して測定される。
【0031】
単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、医薬組成物、同様に、そのような単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を作るための核酸、組み換え発現ベクター、および宿主細胞が本明細書に記載されている。さらに、疾患、疾病、および障害の予防および／または処置において、開示された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を使用する方法も提供される。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３ドメインへ、同様に、標的抗原と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する単一ドメイン結合抗体などの半減期延長ドメインと特異的に結合することができる。
【0032】
ＣＤ３結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体によって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。Ｔ細胞受容体複合体を含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、Ｔ細胞受容体複合体のα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と会合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体によって抗原（主要組織適合複合体、ＭＨＣの文脈で表示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在する、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、および２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含むタンパク質複合体である。Ｔ細胞受容体複合体を含むために、ＣＤ３は、ＣＤ３ζ（ゼータ）と同様に、Ｔ細胞受容体複合体のα（アルファ）とβ（ベータ）鎖と会合する。固定された抗ＣＤ３抗体によるなどしてＴ細胞上にＣＤ３をクラスター形成することで、Ｔ細胞受容体の結合に似ているがそのクローンに典型的な特異性とは無関係のＴ細胞活性化を引き起こす。
【0033】
１つの態様において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、カニクイザルＣＤ３に特異的に結合するドメインを含む。１つの態様では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＣＤ３とカニクイザルＣＤ３とに結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３γに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３δに特異的に結合するドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＣＤ３εに特異的に結合するドメインを含む。
【0034】
別の態様では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性の結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性のタンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に特異的に結合する。ある例では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性のタンパク質は、ＴＣＲのα鎖と結合する。ある例では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性のタンパク質は、ＴＣＲのβ鎖と結合する。
【0035】
ある実施形態において、本明細書に記載される単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、ヒトＣＤ３との有力なＣＤ３結合親和性を呈するだけではなく、それぞれのカニクイザルＣＤ３タンパク質との優れた交差反応性も示す。例によっては、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ３と交差反応性である。ある例では、ヒトＣＤ３（ｈＫｄ）と結合するためのＫｄは、カニクイザルＣＤ３（ｃＫｄ）と結合するためのＫｄとほぼ同じである。ある例では、ｈＫｄとｃＫｄの間の比率（ｈＫｄ：ｃＫｄ）は、約２０：１～約１：２である。
【0036】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、ＣＤ３に結合するあらゆるドメインであり得る。例によっては、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することがＣＤ３結合ドメインにとっては有益である。例えば、ヒトで使用するためには、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含めることが、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインには有益なことがある。
【0037】
したがって、１つの態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体またはヒト抗体または抗体フラグメント、あるいはマウスの抗体または抗体フラグメントを含む。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、および軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ならびに／あるいは、本明細書に記載されるヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインの１つ以上（例えば、３つすべて）の重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、および重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、例えば、１つ以上、例えば、３つすべてのＬＣ ＣＤＲと１つ以上、例えば、３つすべてのＨＣ ＣＤＲを含むヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインを含んでいる。
【0038】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な軽鎖可変領域はヒト軽鎖フレームワーク領域中のヒトあるいはヒト以外の軽鎖ＣＤＲを含む。ある例では、軽鎖フレームワーク領域はλ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の例では、軽鎖フレームワーク領域はκ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【0039】
いくつかの実施形態において、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインは、ＣＤ３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域中のヒトまたはヒト以外の重鎖ＣＤＲを含む。
【0040】
ある例において、重鎖および／または軽鎖の相補性決定領域は、例えば、ムロモナブ－ＣＤ３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビジリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４、ＴＲ－６６、またはＸ３５－３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ－Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１－４０９、ＣＬＢ－Ｔ３．４．２、ＴＲ－６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ－Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ－１４１、ＸＩＩＩ－４６、ＸＩＩＩ－８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２－８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２－４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ－Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ－１、およびＷＴ－３１などの既知の抗ＣＤ３抗体に由来する。
【0041】
１つの実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは、本明細書で提供されるアミノ酸配列の軽鎖と重鎖を含む単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。本明細書で使用されるように、「単鎖可変フラグメント」あるいは「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域を含む抗体フラグメントと、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントを指し、軽鎖と重鎖の可変領域は、短い柔軟なポリペプチドリンカーによって連続的に結合され、単一のポリペプチド鎖として発現可能であり、およびｓｃＦｖはそれが由来する無傷の抗体の特異性を保持する。実施形態では、抗ＣＤ３結合ドメインは以下を含む：本明細書で提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５－９９％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域；および／または、本明細書で提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、あるいは３つの修飾（例えば置換）を有するが、せいぜい３０、２０、あるいは１０の修飾（例えば置換）を有するアミノ酸配列、あるいは本明細書で提供されるアミノ酸配列に９５－９９％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域。１つの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ３結合ドメインはｓｃＦｖであり、本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーによって本明細書に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に結合される。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域と重鎖可変領域は、例えば、以下の配向のいずれかであり得る：軽鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域－ｓｃＦｖリンカー－軽鎖可変領域。
【0042】
いくつかの例では、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖｓは既知の方法に従って調製される。例えば、ｓｃＦｖ分子は、柔軟なポリペプチドリンカーを使用して、ＶＨとＶＬの領域を一緒に結合することにより、生成可能である。ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さおよび／またはアミノ酸組成物を備えるｓｃＦｖリンカー（例えばＳｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。これに応じて、いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーの長さは、ＣＤ３結合部位を形成するために、ＶＨまたはＶＬのドメインが他の可変ドメインと分子間で結合することができるような長さである。ある実施形態において、こうしたｓｃＦｖリンカーは「短い」、つまり、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１あるいは１２のアミノ酸残基からなる。したがって、ある例では、ｓｃＦｖリンカーは約１２以下のアミノ酸残基からなる。０のアミノ酸残基の場合、ｓｃＦｖリンカーはペプチド結合である。いくつかの実施形態において、これらのｓｃＦｖリンカーは、約３から約１５、例えば８、１０、または１５の連続的なアミノ酸残基からなる。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸組成物に関して、柔軟性を与え、可変ドメインに干渉せず、同様に、機能的なＣＤ３結合部位を形成するために２つの可変ドメインを接合する鎖間フォールディングを許可しないペプチドが選択される。例えば、グリシンとセリンの残基を含むｓｃＦｖリンカーは一般にプロテアーゼ抵抗性を与える。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ中のリンカーはグリシンとセリンの残基を含む。ｓｃＦｖリンカーのアミノ酸配列は、例えば、ＣＤ３結合とｓｃＦｖの産生収率を改善するファージディスプレー方法によって最適化可能である。ｓｃＦｖ中の可変軽鎖ドメインと可変重鎖ドメインを結合するのに適切なペプチドｓｃＦｖリンカーの例としては、限定されないが、（ＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６）、（ＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）、（ＧＧＳＧ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）、（ＧＧＳＧＧ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）、（ＧＧＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）、または（ＧＧＧ）ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）が挙げられ、ここで、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、あるいは１０である。１つの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）、または（ＧＧＧＧＳ）３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であり得る。リンカー長さの変動は活性を保持あるいは増強し、活性研究で優れた有効性をもたらすこともある。
【0043】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫｄを有するＣＤ３発現細胞上のＣＤ３に対する親和性を有する。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、５００ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、あるいは０．５ｎＭ以下のＫｄを有する、ＣＤ３ε、γ、あるいはδに対する親和性を有する。さらなる実施形態では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のＣＤ３結合ドメインはＣＤ３に対する低い親和性（つまり、約１００ｎＭ以上）を有する。
【0044】
ある実施形態では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ヒトＫｄ（ｈＫｄ）を有するヒトＣＤ３に、および、カニクイザル（ｃｙｎｏ）のＫｄ（ｃＫｄ）を有するカニクイザルＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、ｈＫｄとｃＫｄは、約１ｎＭ～約２ｎＭ、約３ｎＭ～約５ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約１１ｎＭ～約２０ｎＭ、約２５ｎＭ～約４０ｎＭ、約４０ｎＭ～約６０ｎＭ、約７０ｎＭ～約９０ｎＭ、約１００ｎＭ～約１２０ｎＭ、約１２５ｎＭ～約１４０ｎＭ、約１４５ｎＭ～約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ～約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ～約２５０ｎＭ、約２６０ｎＭ～約３００ｎＭである。
【0045】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約１．１倍～約１．５倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約１．５倍～約２倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約２．５倍～約３倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約３倍～約５倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約６倍～約１５倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約１５倍～約２０倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約２０倍～約５０倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約５５倍～約７０倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約７５倍～約１００倍である。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のｈＫｄとｃＫｄは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２で記載される通りの配列を有するＣＤ３結合タンパク質のＫｄの約１２０倍～約２００倍である。
【0046】
いくつかの実施形態において、ｈＫｄとｃＫｄ間の比率（ｈＫｄ：ｃＫｄ）は約２０：１～約１：２に及ぶ。ＣＤ３に結合する親和性は、例えば、アッセイプレート上にコーティングされた；微生物細胞表面に表示された；溶液中などの；ＣＤ３に結合するという単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質自体またはそのＣＤ３結合ドメイン自体の能力によって、決定することができる。ＣＤ３に対する本開示の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の結合活性またはそのＣＤ３結合ドメインは、ビーズ、基質、細胞などに対して、リガンド（例えば、ＣＤ３）または単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質自体、あるいはそのＣＤ３結合ドメインを固定することにより分析可能である。薬剤は、所定の温度で一定の期間インキュベートされた適切な緩衝液と結合パートナーに加えることができる。未結合材料を取り除くために洗浄した後、結合タンパク質を、例えば、ＳＤＳ、高いまたは低いｐＨの緩衝液などで放出可能であり、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析可能である。
【0047】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５から選択されたアミノ酸配列を有する。
【0048】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約３．８ｎＭであり、ｃＫｄは約３．５ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約４．１ｎＭであり、ｃＫｄは約３．４ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約４．３ｎＭであり、ｃＫｄは約４．２ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約４．７ｎＭであり、ｃＫｄは約４．９ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約６．４ｎＭであり、ｃＫｄは約６．６ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約８ｎＭであり、ｃＫｄは約６．６ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約２０ｎＭであり、ｃＫｄは約１７ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約３７ｎＭであり、ｃＫｄは約３０ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１４ｎＭであり、ｃＫｄは約１３ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約５０ｎＭであり、ｃＫｄは約４７ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１６ｎＭであり、ｃＫｄは約１６ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約４６ｎＭであり、ｃＫｄは約４３ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１８ｎＭであり、ｃＫｄは約１７ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１３３ｎＭであり、ｃＫｄは約１３４ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１１７ｎＭであり、ｃＫｄは約１１５ｎＭである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄは約１０９ｎＭであり、ｃＫｄは約１０３ｎＭである。
【0049】
いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄとほぼ同じである。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９（２Ａ４）として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約６倍～約１５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約３倍～約５倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９４として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約２０倍～約５０倍高い。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９５として記載されるアミノ酸配列を有し、ここで、ｈＫｄとｃＫｄは、ｗｔ抗ＣＤ３で記載される通りの配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）を有するタンパク質のＣＤ３に対するＫｄよりも約２０倍～約５０倍高い。
【0050】
半減期延長ドメイン
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量～６７ｋＤａ）は、血漿中の最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトでは約２０日の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、コロイド状の血圧に貢献し、多くの代謝産物と脂肪酸の担体として機能し、および、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子量～６７ｋＤａ）は、血漿中の最も豊富なタンパク質であり、約５０ｍｇ／ｍｌ（６００μＭ）で存在し、ヒトでは約２０日の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する役目を果たし、コロイド状の血圧に貢献し、多くの代謝産物と脂肪酸の担体として機能し、および、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質として役立つ。
【0051】
アルブミンとの非共有会合は、短命のタンパク質の消失半減期を延長する。例えば、ＦＡｂフラグメントに対するアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、ＦＡｂフラグメントのみの投与と比較して、マウスとウサギの静脈内にそれぞれ投与されたとき、２５倍と５８倍のインビトロクリアランスの減少、および、２６倍と３７倍の半減期延長を引き起こした。別の例において、インスリンがアルブミンとの会合を促進するために脂肪酸でアシル化されるとき、ウサギまたはブタに皮下注射された時に長期的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続的な作用との間の関連性を実証するものである。
【0052】
１つの態様では、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含み、さらに半減期延長ドメイン、例えば、血清アルブミンに特異的に結合するドメインを含む、多特異性結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の血清アルブミン結合ドメインは、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む、血清アルブミンに結合するあらゆるドメインであり得る。いくつかの実施形態において、血清アルブミン結合ドメインは、血清アルブミンに特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体、あるいはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖフラグメントなどのＨＳＡ結合抗体の抗原結合フラグメント、１つ以上のＣＤＲで構成されたフラグメント、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ））、ジスルフィド安定化（ｄｓＦｖ）Ｆｖフラグメント、ヘテロ共役抗体（例えば、二重特異性抗体）、ｐＦｖフラグメント、重鎖単量体または二量体、軽鎖単量体または二量体、および１つの重鎖と１つの軽鎖からなる二量体、ペプチド、リガンド、または小分子実体である。ある実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、血清アルブミン結合ドメインはペプチドである。さらなる実施形態では、血清アルブミン結合ドメインは小分子である。単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の血清アルブミン結合ドメインはかなり小さく、いくつかの実施形態では、せいぜい２５ｋＤ、せいぜい２０ｋＤ、せいぜい１５ｋＤ、または、せいぜい１０ｋＤであることが企図される。ある例では、血清アルブミン結合がペプチドまたは小分子実体であれば、血清アルブミン結合は５ｋＤ以下である。
【0053】
単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質の半減期延長ドメインは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質自体の変更された薬動力学と薬物動態学をもたらす。上記のように、半減期延長ドメインは消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはさらに、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の組織分布、浸透、および拡散の変質を含む薬力学的な特性を変更する。いくつかの実施形態において、半減期延長ドメインは、半減期延長ドメインのないタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織分布、組織浸透、組織内での拡散、増強した有効性をもたらす。１つの実施形態では、治療方法は、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む量を減少させた多特異性結合タンパク質を有効かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の減少などの副作用の減少を引き起こす。
【0054】
さらに、半減期延長ドメインの結合親和性は、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む特定の多特異性結合タンパク質中の特定の消失半減期を標的とするように選択可能である。したがって、いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは高い結合親和性を有する。他の実施形態では、半減期延長ドメインは中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、半減期延長ドメインは低いまたはわずかな結合親和性を有する。典型的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高い）の、１０ｎＭ～１００ｎＭの間（中程度）の、および１００ｎＭを超える（低い）Ｋｄを含む。上記のように、血清アルブミンへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
【0055】
標的抗原結合ドメイン
記載されたＣＤ３と半減期延長ドメインに加えて、ある実施形態では、本明細書に記載された多特異性結合タンパク質は、標的抗原に結合するドメインをさらに含む。標的抗原は疾患、障害、または疾病に関与する、おより／または関連している。特に、標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患に関連する。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍細胞上で発現された腫瘍抗原である。代替的に、いくつかの実施形態では、標的抗原はウイルスまたは細菌などの病原体に関連する。
記載されたＣＤ３と半減期延長ドメインに加えて、ある実施形態では、本明細書に記載された多特異性結合タンパク質は、標的抗原に結合するドメインをさらに含む。標的抗原は疾患、障害、または疾病に関与する、おより／または関連している。特に、標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患に関連する。いくつかの実施形態において、標的抗原は腫瘍細胞上で発現された腫瘍抗原である。代替的に、いくつかの実施形態では、標的抗原はウイルスまたは細菌などの病原体に関連する。
【0056】
いくつかの実施形態において、標的抗原はタンパク質、脂質、または多糖類などの細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷を受けた赤血球、動脈のプラーク細胞、または繊維性の組織細胞である。
【0057】
本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質のデザインは、標的抗原に対する結合ドメインが、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインを含む任意のタイプの結合ドメインであり得るという点で、結合ドメインを標的抗原に対して柔軟なものとする。いくつかの実施形態において、標的抗原に対する結合ドメインは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ラクダ科由来のｓｄＡｂの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、および可変ドメイン（ＶＨＨ）などの単一ドメイン抗体である。他の実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、非Ｉｇ結合ドメイン、つまり、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）分子、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アヴィマー（ａｖｉｍｅｒｓ）、ＤＡＲＰｉｎｓ、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、クニッツドメインペプチドおよびモノボディなどの抗体模倣薬である。さらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは、標的抗原に結合または会合するリガンドまたはペプチドである。またさらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインはノッチンである。またさらなる実施形態では、標的抗原に対する結合ドメインは小分子実体である。
【0058】
単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質修飾
本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物で融合され、または、（ｉｉｉ）リーダー配列または分泌配列、あるいは、免疫原ドメインを遮断するための、および／または、タンパク質の精製のための配列などの追加のアミノ酸がタンパク質に融合される、誘導体またはアナログを包含する。
本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、（ｉ）アミノ酸が遺伝子コードによってコードされるものではないアミノ酸残基で置換され、（ｉｉ）成熟ポリペプチドがポリエチレングリコールなどの別の化合物で融合され、または、（ｉｉｉ）リーダー配列または分泌配列、あるいは、免疫原ドメインを遮断するための、および／または、タンパク質の精製のための配列などの追加のアミノ酸がタンパク質に融合される、誘導体またはアナログを包含する。
【0059】
典型的な修飾としては、限定されないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドあるいはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質への転移ＲＮＡ媒介性の添加、およびユビキチン化が挙げられる。
【0060】
修飾は、ＣＤ３結合タンパク質が、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル終端を含む、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントのいかなる場所でも行われる。単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の修飾に役立つ特定の共通したペプチド修飾は、共有結合修飾とＡＤＰリボシル化による、グルタミン酸残基のグリコシル化、脂質結合、硫酸化、ガンマ－カルボキシル化、ヒドロキシル化、ポリペプチド中のアミノ基またはカルボキシル基の遮断、またはその両方を含む。
【0061】
単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
いくつかの実施形態において、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、または単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
いくつかの実施形態において、本開示に係る単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、または単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子も提供される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ構築物として提供される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド分子はメッセンジャーＲＮＡ転写物として提供される。
【0062】
ポリヌクレオチド分子は、ペプチドリンカーによって分離されるか、または、他の実施形態ではペプチド結合によって直接結合される３つの結合ドメインをコードする遺伝子を組み合わせて、適切なプロモーター、および随意に適切な転写ターミネーターに動作可能に連結された単一の遺伝子構築物にして、および、細菌または例えば、ＣＨＯ細胞などの他の適切な発現系でそれを発現するなどの既知の方法によって構築される。標的抗原結合ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３結合ドメインと半減期延長ドメインをコードする遺伝子を含んでいる。半減期延長ドメインが小分子である実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＣＤ３と標的抗原とに結合するドメインをコードする遺伝子を含んでいる。利用されるベクター系と宿主に依存して、任意の数の適切な転写、および構成的で誘導可能なプロモーターを含む翻訳要素が使用されてもよい。プロモーターはそれぞれの宿主細胞でポリヌクレオチドの発現を駆り立てるように選択される。
【0063】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、さらなる実施形態を表すベクター、好ましくは発現ベクターに挿入される。この組換えベクターは既知の方法によって構築可能である。特定の所望のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど）、およびコスミドを含んでいる。
【0064】
様々な発現ベクター／宿主系は、記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ発現するために利用されてもよい。Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のための発現ベクターの例は、ｐＳＫＫ（Ｌｅ Ｇａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００４）２８５（１）：１１１－２７）、または哺乳動物細胞、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ（商標）酵母発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＢＡＣＵＶＡＮＣＥ（商標）バキュロウィルス発現系（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）中の発現用のｐｃＤＮＡ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【0065】
したがって、本明細書に記載されているような単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、上記のようなタンパク質をコードするベクターを宿主細胞へ導入し、および、タンパク質ドメインが発現し、単離することもあり、随意にさらに精製されることもある条件下で上記宿主細胞を培養することにより、生成される。
【0066】
単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の生成
いくつかの実施形態では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の産生のプロセスが本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、上記プロセスは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されるかトランスフェクトされた宿主を、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、および、培養物から生成されたタンパク質を回収ならびに精製することを含む。
いくつかの実施形態では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の産生のプロセスが本明細書に開示される。いくつかの実施形態において、上記プロセスは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターで形質転換されるかトランスフェクトされた宿主を、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の発現を可能にする条件下で培養すること、および、培養物から生成されたタンパク質を回収ならびに精製することを含む。
【0067】
追加の実施形態では、基準の結合化合物と比較して、本明細書に記載されるような単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、および／または単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性の結合タンパク質の１つ以上の特性、例えば、親和性、安定性、耐熱性、交差反応性などを改善することを目的としたプロセスが提供される。いくつかの実施形態において、異なるドメイン、あるいは単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質または基準結合化合物のアミノ酸セグメントに各々対応する複数の単一置換ライブラリーが提供され、これは、単一置換ライブラリーの各メンバーがその対応するドメインまたはアミノ酸セグメントの単一のアミノ酸変化のみをコードするような複数の単一置換ライブラリーである。（これにより、大きなタンパク質またはタンパク結合部位の起こりうるすべての置換を、少数の小さなライブラリーで調査することが可能となる。）いくつかの実施形態において、複数のドメインは、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質または基準結合化合物のアミノ酸のコンティグ配列を形成するか網羅する。様々な単一置換ライブラリーのヌクレオチド配列は、少なくとも１つの他の単一置換ライブラリーのヌクレオチド配列と重複する。いくつかの実施形態において、すべてのメンバーが隣接するドメインをコードするそれぞれの単一置換ライブラリーのすべてのメンバーに重複するように、複数の単一置換ライブラリーは設計される。
【0068】
こうした単一置換のライブラリーから発現された結合化合物は各ライブラリー中で変異体の部分集合を得るために別々に選択され、該変異体は、基準結合化合物と少なくとも同じぐらい優れた特性を有し、かつ、結果として生じたライブラリーはサイズが減少している。（すなわち、結合化合物の選択されたセットをコードする核酸の数は、元々の単一置換ライブラリーのメンバーをコードする核酸の数よりも少ない。）こうした特性としては、限定されないが、標的化合物への親和性、熱、高いまたは低いｐＨ、酵素分解、他のタンパク質に対する交差反応性など様々な条件に対する安定性が挙げられる。それぞれの単一置換ライブラリーからの選択された化合物は、「前候補化合物」または「前候補タンパク質」と本明細書では交換可能に呼ばれている。別々の単一置換ライブラリーからの前候補化合物をコードする核酸配列は、ＰＣＲベースの遺伝子シャッフリング技術を使用してＰＣＲでシャッフルされることで、シャッフルされたライブラリーが生成される。
【0069】
スクリーニングプロセスの典型的なワークフローが本明細書に記載される。前候補化合物のライブラリーは単一置換ライブラリーから生成され、標的タンパク質への結合のために選択され、その後、前候補ライブラリーはシャッフルされることで候補化合物をコードする核酸のライブラリーが精製され、これはファージミド発現系などの便利な発現ベクターへとクローン化される。その後、ファージ発現候補化合物は、標的分子への結合親和性などの所望の特性を改善するために１ラウンド以上の選択を経験する。標的分子は吸着されることもあれば、さもなければウェルまたは他の反応容器の表面へ付けられることもあり、あるいは、標的分子はビオチンなどの結合部分で誘導対化されてもよく、これは、候補結合化合物でのインキュベーション後に、洗浄のために、磁気ビーズなどのビーズに結合されたストレプトアビジンなどの相補的な部分で捕えられることもある。典型的な選択レジメンでは、標的分子からの非常に低い解離速度の候補化合物だけが選択されるように、候補結合化合物は長期間の洗浄工程を経験する。こうした実施形態のための典型的な洗浄時間は少なくとも８時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも２４時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも４８時間であり；あるいは、他の実施形態では、少なくとも７２時間である。選択後の単離されたクローンは増幅され、選択の追加サイクルにさらされるか、あるいは、例えば、配列決定によって、および、例えば、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合、バイオ層干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ， ＦｏｒｔｅＢｉｏ， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）などにより結合親和性の比較測定を行うことによって、分析される。
【0070】
いくつかの実施形態において、プロセスは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２のアミノ酸配列を有するタンパク質などの基準ＣＤ３結合タンパク質と比較して、改善された熱安定性、結合標的の選択されたセットに対する改善された交差反応性を有する、１つ以上の単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、および／または単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を含む多特異性の結合タンパク質を識別するために実施される。単一置換ライブラリーは、フレームワーク領域とＣＤＲ中の両方コドンを含む基準ＣＤ３結合タンパク質のＶＨとＶＬの領域中のコドンを変えることにより調製され；別の実施形態では、コドンが変えられる位置は、基準ＣＤ３結合タンパク質の重鎖と軽鎖のＣＤＲ、あるいは単独でＣＤＲ１、単独でＣＤＲ２、単独でＣＤＲ３、またはそのついなどのこうしたＣＤＲのサブセットを含む。別の実施形態で、コドンが変えられる位置はもっぱらフレームワーク領域で生じる。いくつかの実施形態において、ライブラリーは１０～２５０までの範囲で番号付けられるＶＨとＶＬの両方のフレームワーク領域だけの基準ＣＤ３結合タンパク質から単一のコドン変化のみを含む。別の実施形態では、コドンが変えられる位置は、基準ＣＤ３結合タンパク質の重鎖と軽鎖のＣＤＲ３、あるいはこうしたＣＤＲ３のサブセットを含む。別の実施形態では、ＶＨとＶＬのコード領域のコドンが変えられる位置の数は、最大で１００の位置がフレームワーク領域にあるように、１０～２５０までの範囲にある。単一置換ライブラリーの調製後に、上に概説されるように、以下の工程が行われる：（ａ）前候補タンパク質として個々の単一置換ライブラリーの各メンバーを別々に発現する工程；（ｂ）元々の結合標的［例えば、所望の交差反応標的］とは異なる結合パートナーに結合する前候補タンパク質をコードする個々の単一置換ライブラリーのメンバーを選択する工程；（ｃ）シャッフルされたコンビナトリアルライブラリーを生成するためにＰＣＲで選択されたライブラリーのメンバーをシャッフルする工程；（ｄ）候補ＣＤ３結合タンパク質としてシャッフルされたライブラリーのメンバーを発現する工程；および、（ｅ）元々の結合パートナーと結合する候補ＣＤ３結合タンパク質についてシャッフルされたライブラリーのメンバーを１回以上選択する工程、および、（ｆ）所望の交差反応標的と結合するためにさらなる候補タンパク質を選択する工程であって、それによって、元々のリガンドに対する親和性を失うことなく基準ＣＤ３結合タンパク質に対する１つ以上の物質の交差反応性を強化した核酸でコードされたＣＤ３結合タンパク質を提供する工程。追加の実施形態では、方法は、工程（ｆ）を以下の工程：望ましくない交差反応性の化合物に結合する候補単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のサブセットから、候補結合化合物を１回以上枯渇させる工程に置き換えることにより、選択された交差反応性物質または化合物またはエピトープに対する反応性が減少した単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を得るために実施されることがある。
【0071】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、または、このベクターによって形質転換された宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含んでいる。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、保存剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに含むことがある。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって保証され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、または、このベクターによって形質転換された宿主細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物も提供される。用語「薬学的に許容可能な担体」としては、限定されないが、成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ、投与される患者にとって毒性ではない任意の担体が挙げられる。適切な医薬担体の例は当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌液などを含んでいる。こうした担体は、従来の方法によって製剤することができ、適切な投与量で被験体に投与可能である。好ましくは、組成物は無菌である。これらの組成物は、保存剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントをさらに含むことがある。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって保証され得る。
【0072】
医薬組成物のいくつかの実施形態において、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、ナノ粒子でカプセル化される。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、フラーレン、液晶、リポソーム、量子ドット、超常磁性ナノ粒子、デンドリマー、またはナノロッドである。医薬組成物の他の実施形態では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質はリポソームに結合する。いくつかの例では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質はリポソームの表面へ共役する。いくつかの例では、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、リポソームのシェル内にカプセル化される。いくつかの例では、リポソームはカチオン性リポソームである。
【0073】
本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、薬物としての使用のために企図されている。投与は様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所的、または皮内の投与によって達成される。いくつかの実施形態において、投与経路は、治療の種類と、医薬組成物に含まれる化合物の種類に依存する。投与レジメンは主治医と他の臨床因子によって決定される。任意の１人の患者のための投与量は、患者の背格好、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与時間と投与経路、治療の種類、健康状態、および同時に投与されている他の医薬品を含む多くの因子に依存する。「有効量」は、こうした病状の減少または緩解をもたらす、疾患の経過と重症度に影響するのに十分な有効成分の量を指し、既知の方法を使用して決定されることもある。
【0074】
処置の方法
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の投与を含む、個体の免疫系を刺激するための方法と使用が本明細書で提供される。いくつかの例では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞に対する細胞毒性を誘発および／または保持する。いくつかの例では、細胞は癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴまたはＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、あるいは繊維症の組織である。
さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の投与を含む、個体の免疫系を刺激するための方法と使用が本明細書で提供される。いくつかの例では、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質の投与は、標的抗原を発現する細胞に対する細胞毒性を誘発および／または保持する。いくつかの例では、細胞は癌細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、自己反応性のＴまたはＢ細胞、損傷を受けた赤血球、動脈プラーク、あるいは繊維症の組織である。
【0075】
さらに、本明細書に記載された単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質を個体に投与することを含む、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病の処置のための方法と使用も本明細書で提供される。標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病としては、限定されないが、ウイルス感染、細菌感染、自己免疫性疾患、移植拒絶反応、アテローム性動脈硬化症、または線維症が挙げられる。他の実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫性疾患、感染症、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生虫性反応、移植片対宿主疾患、または宿主対移植片疾患である。１つの実施形態では、標的抗原に関連する疾患、障害、または疾病は癌である。１つの例では、癌は血液の癌である。別の例では、癌は固形腫瘍癌である。
【0076】
本明細書で使用されるように、いくつかの実施形態では、「処置」あるいは「処置すること」あるいは「処置された」とは、望ましくない生理的な疾病、障害、または疾患を遅らせる（減らす）こと、あるいは、有益なまたは望ましい臨床結果を得ることを目的とする治療的処置を指す。本明細書に記載される目的のために、有益な、または望ましい臨床結果としては、限定されないが、症状の緩和；疾病、障害、あるいは疾患の程度の減少；疾病、障害、あるいは疾患の状態の安定化（つまり、悪化しないこと）；疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせること、または進行を遅らせること；疾病、障害、あるいは疾患状態の改善；および、検出可能であれ検出不可能であれ、または疾病、障害、あるいは疾患の亢進であれ改善であれ、緩解（部分的でも全体でも）。処置は過剰なレベルの副作用のない臨床的に有意な反応を誘発することを含む。処置はさらに、処置を受けない場合の予想される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことを含む。他の実施形態では、「処置」あるいは「処置すること」あるいは「処置された」とは、予防的な処置を指し、その目的は、例えば、疾患の素因のある人（例えば、乳癌などの疾患のための遺伝子マーカーをつけた個体）など、望ましくない生理的な疾病、障害、あるいは疾患の発症を遅らせるか、あるいはその重症度を低下させることである。
【0077】
本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、特定の疾患、障害、または疾病の処置のための薬剤と組み合わせて投与される。薬剤としては、限定されないが、抗体、小分子（例えば、化学療法剤）、ホルモン（ステロイド、ペプチドなど）、放射線療法（γ線、Ｘ線、および／または、放射性同位体、マイクロ波、ＵＶ放射などの指示された送達）、遺伝子治療（例えば、アンチセンス、レトロウイルス治療など）、および他の免疫療法に関する治療が挙げられる。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は、下痢止め薬、制吐剤、鎮痛剤、オピオイド、および／または、非ステロイド性抗炎症薬と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、単鎖可変フラグメントＣＤ３結合タンパク質は手術の前、最中、後に投与される。
【実施例】
【0078】
実施例１：ヒトＣＤ３εへの親和性の異なる抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体の同定親の抗ＣＤ３εファージの特徴づけ
【0079】
親の抗ＣＤ３εはビオチンＣＤ３εに対して良好な結合を示し、ビオチン－ＨＳＡに対して低い結合を示した（図１）。
【0080】
抗ＣＤ３ε ｓｃＦｖファージライブラリー
単一置換ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のドメインに提供された。各ドメイン中で変動したアミノ酸残基は、図２の強調された領域で例証されている。残基は、ＮＮＮ突然変異誘発を介して一度に一つずつ変化した。
単一置換ライブラリーは、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３のドメインに提供された。各ドメイン中で変動したアミノ酸残基は、図２の強調された領域で例証されている。残基は、ＮＮＮ突然変異誘発を介して一度に一つずつ変化した。
【0081】
クローンの選択と結合親和性の決定
単一置換ライブラリーをビオチン化したｈｕＣＤ３εに結合させ、洗浄し、溶出させ、数を数えた。ビオチン化されたカニクイザルＣＤ３は、ラウンド１の選択標的として使用され、２つの独立したライブラリー（～２ｘ選択）からのコンビナトリアルファージ結合後に４時間洗浄された。ビオチン化されたｈｕ－ＣＤ３は、ラウンド２の選択標的として使用され、両方のライブラリー（＜２ｘ選択）の結合後に３時間洗浄した。第２ラウンドの選択からのＰＣＲｅｄ挿入物は、ｐｃＤＮＡ３．４ Ｈｉｓ６発現ベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５として開示された「Ｈｉｓ６」）へサブクローン化された。１８０のクローンが選ばれ、ＤＮＡが精製され、配列決定され、Ｅｘｐｉ２９３へトランスフェクトされた。ヒトＣＤ３εに対する様々な親和性を有する１６のクローンのパネルが、より正確なＫｄ決定のために選択された（図３）。
単一置換ライブラリーをビオチン化したｈｕＣＤ３εに結合させ、洗浄し、溶出させ、数を数えた。ビオチン化されたカニクイザルＣＤ３は、ラウンド１の選択標的として使用され、２つの独立したライブラリー（～２ｘ選択）からのコンビナトリアルファージ結合後に４時間洗浄された。ビオチン化されたｈｕ－ＣＤ３は、ラウンド２の選択標的として使用され、両方のライブラリー（＜２ｘ選択）の結合後に３時間洗浄した。第２ラウンドの選択からのＰＣＲｅｄ挿入物は、ｐｃＤＮＡ３．４ Ｈｉｓ６発現ベクター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５として開示された「Ｈｉｓ６」）へサブクローン化された。１８０のクローンが選ばれ、ＤＮＡが精製され、配列決定され、Ｅｘｐｉ２９３へトランスフェクトされた。ヒトＣＤ３εに対する様々な親和性を有する１６のクローンのパネルが、より正確なＫｄ決定のために選択された（図３）。
【0082】
実施例２：細胞毒性アッセイ
実施例１で同定された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体を含む、ＣＤ２０とＣＤ３を対象とする二重特異性抗体は、ＣＤ２０＋標的細胞へのＴ細胞依存性の細胞毒性の媒介でインビトロにおいて評価される。
実施例１で同定された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体を含む、ＣＤ２０とＣＤ３を対象とする二重特異性抗体は、ＣＤ２０＋標的細胞へのＴ細胞依存性の細胞毒性の媒介でインビトロにおいて評価される。
【0083】
蛍光標識されたＣＤ２０＋ＲＥＣ－１細胞（マントル細胞リンパ腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３００４）は、実施例１で同定された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体を含むＣＤ２０－ＣＤ３二重特異性抗体の存在下でエフェクター細胞として無作為のドナーまたはＣＢ１５ Ｔ細胞（標準化されたＴ細胞株）の単離したＰＢＭＣでインキュベートされる。加湿したインキュベータ中での３７°Ｃで４時間のインキュベーション後、標的細胞からの蛍光染料の上清への放出は分光蛍光計で判定される。実施例１で同定された抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体を含むＣＤ２０－ＣＤ３二重特異性抗体なしでインキュベートされた標的細胞と、インキュベーションの最後にサポニンを添加することで完全に溶解した標的細胞はそれぞれ、陰性対照と陽性対照として役立つ。
【0084】
測定された残りの生存している標的細胞に基づいて、特定細胞の溶解の割合は以下の式によって計算される：［１－（生きている標的（サンプル）の数）／生きている標的の数（自発的）］×１００％。Ｓ字結腸の用量－反応曲線とＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、非線形回帰／４パラメータロジスティックスフィット（４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｆｉｔ）によって計算される。所定の変異体濃度について得られた溶解値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、４パラメータロジスティックフィット（４－ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｆｉｔ）分析によってＳ字結腸の用量－反応曲線を計算するために使用される。
【0085】
実施例３：ヒトＣＤ３εへの親和性の異なる抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ変異体の熱安定性
タンパク質の疎水的曝露の温度（Ｔｈ）は、ピーク染料蛍光の変曲点の導関数に相当し、タンパク質安定性の尺度である融解温度（Ｔｍ）と相関することが知られている。この研究の目的はいくつかの抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖ変異体のＴｈを評価することであった。
タンパク質の疎水的曝露の温度（Ｔｈ）は、ピーク染料蛍光の変曲点の導関数に相当し、タンパク質安定性の尺度である融解温度（Ｔｍ）と相関することが知られている。この研究の目的はいくつかの抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖ変異体のＴｈを評価することであった。
【0086】
タンパク質産生
抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖ結合ドメインの配列を、リーダー配列が前にあり、かつ、６ｘヒスチジンタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）が後ろにある、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）は、Ｅｘｐｉ ２９３培地中の０．２～８×１ｅ６細胞／ｍＬ間でＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）の懸濁液中で維持された。精製されたプラスミドＤＮＡは、Ｅｘｐｉ２９３発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ａ１４６３５）プロトコルに合わせてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞へトランスフェクトされ、トランスフェクション後４－６日間、維持される。調整培地は、親和性と脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製された。抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮され、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され、賦形剤を含む中性の緩衝液中で分解させた。画分貯留と最終的な純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと分析的なＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって評価された。精製されたタンパク質溶液の吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して２８０ｎｍで決定され、ＵＶ透過性の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６３５）とその濃度はモル吸光係数から計算された。
抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖ結合ドメインの配列を、リーダー配列が前にあり、かつ、６ｘヒスチジンタグ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）が後ろにある、ｐｃＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ａ１４５２７）は、Ｅｘｐｉ ２９３培地中の０．２～８×１ｅ６細胞／ｍＬ間でＯｐｔｉｍｕｍ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆｌａｓｋｓ（Ｔｈｏｍｓｏｎ）の懸濁液中で維持された。精製されたプラスミドＤＮＡは、Ｅｘｐｉ２９３発現系キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ａ１４６３５）プロトコルに合わせてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞へトランスフェクトされ、トランスフェクション後４－６日間、維持される。調整培地は、親和性と脱塩クロマトグラフィーによって部分的に精製された。抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ遠心濾過ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮され、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００サイズ排除培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され、賦形剤を含む中性の緩衝液中で分解させた。画分貯留と最終的な純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥと分析的なＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）によって評価された。精製されたタンパク質溶液の吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して２８０ｎｍで決定され、ＵＶ透過性の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６３５）とその濃度はモル吸光係数から計算された。
【0087】
示差走査型蛍光定量法
精製された抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質は、賦形剤を含む中性の緩衝液中の０．１５％のＤＭＳＯ終濃度中で５ｘのＳＹＰＲＯのオレンジ色染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５１）とともに、０．２～０．２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度に、ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ光学マイクロプレートと接着剤フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４４８３４８５ ａｎｄ ４３１１９７１）へと希釈化された。希釈されたタンパク質と染料混合物を含むプレートは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）に充填され、２５°Ｃ～９５°Ｃの複数工程の温度勾配にさらされた。温度勾配は各１つの摂氏度工程における２分間の保持で構成され、このとき５００ｎｍでの励起を用い、放射をＲＯＸフィルターで集める。摂氏度のＴｈは図４においていくつかの精製された抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質変異体について提示される。
精製された抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質は、賦形剤を含む中性の緩衝液中の０．１５％のＤＭＳＯ終濃度中で５ｘのＳＹＰＲＯのオレンジ色染料（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５１）とともに、０．２～０．２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度に、ＭｉｃｒｏＡｍｐ ＥｎｄｕｒａＰｌａｔｅ光学マイクロプレートと接着剤フィルム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４４８３４８５ ａｎｄ ４３１１９７１）へと希釈化された。希釈されたタンパク質と染料混合物を含むプレートは、ＡＢＩ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｔｅｍｓ）に充填され、２５°Ｃ～９５°Ｃの複数工程の温度勾配にさらされた。温度勾配は各１つの摂氏度工程における２分間の保持で構成され、このとき５００ｎｍでの励起を用い、放射をＲＯＸフィルターで集める。摂氏度のＴｈは図４においていくつかの精製された抗ヒトＣＤ３εｓｃＦｖタンパク質変異体について提示される。
【0088】
【表1-1】
【0089】
【表1-2】
【0090】
【表1-3】
【0091】
【表1-4】
【0092】
【表1-5】
【0093】
【表1-6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】