特許 7043115 細胞培養用バッグアセンブリ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-18

(45)【発行日】2022-03-29

(54)【発明の名称】細胞培養用バッグアセンブリ

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20220322BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20220322BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 C

C12N1/00 A

【請求項の数】 5

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2020112853

(22)【出願日】2020-06-30

(62)【分割の表示】P 2016568628の分割

【原出願日】2015-04-27

(65)【公開番号】P2020156512

(43)【公開日】2020-10-01

【審査請求日】2020-07-02

(31)【優先権主張番号】62/003,754

(32)【優先日】2014-05-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】597064713

【氏名又は名称】サイティバ・スウェーデン・アクチボラグ

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100154922

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 允辰

(74)【代理人】

【識別番号】100207158

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 研二

(72)【発明者】

【氏名】ゲバウアー，クラウス

(72)【発明者】

【氏名】カスタン，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】エストマー－ニルソン，カミラ

(72)【発明者】

【氏名】フォークマン，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ウィレン，アンダース

(72)【発明者】

【氏名】ミラー，マイケル

(72)【発明者】

【氏名】スタンコウスキ，ラルフ

【審査官】西垣 歩美

(56)【参考文献】

【文献】特表２０００－５０３５４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００８／１０１１２７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】特表平０８－５１１２１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－１０２０４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表平０３－５０５１６４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｍ １／００－３／１０

Ｃ１２Ｎ １／００－７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

一連の培養段階において細胞を培養するためのフレキシブル多区画バッグであって、
一連の培養段階の対応する段階にそれぞれ適合した、一連の各区画が異なるサイズの複数の直列に接続された培養区画と、
一連の隣接する２つの区画の間の破壊可能な封止部であって、２つの隣接する区画の一方で培養が完了した際には、一度開かれた前記破壊可能な封止部は、前記隣接する２つの区画を流体的に接続するよう構成され、細胞培養の次の段階のために一連の区画における後続である他方の区画に培養された細胞を移送することができ、隣接する２つの区画の間の境界全体を構成する破壊可能な封止部と、
を備える、バッグ。

【請求項2】

一連の区画における後続の培養区画は、一連の区画における前の培養区画の容積の少なくとも１２０％または１５０％の容積を有する、請求項１に記載のバッグ。

【請求項3】

少なくとも１つの温度制御区画を備える少なくとも１つのバッグをさらに含み、前記少なくとも１つの温度制御区画は、恒温流体入口と、任意に恒温流体出口とを備える、請求項１に記載のバッグ。

【請求項4】

細胞を培養する方法であって、
ａ）請求項１に記載のフレキシブル多区画バッグを用意するステップと、
ｂ）一連の区画における第１培養区画に培養培地および細胞を導入するステップ
と、
ｃ）前記第１培養区画において細胞を培養することで、第１細胞培養物を得るステップと、
ｄ）前記破壊可能な封止部を破壊することで、前記第１培養区画を一連の区画における後続の第２培養区画と流体的に接続するステップと、
ｅ）前記第１細胞培養物を前記第２培養区画に移送するステップと、
ｆ）前記第２培養区画に培地を導入するステップと、
ｇ）前記第２培養区画において細胞を培養することで、第２細胞培養物を得るステップと、
を含む、細胞を培養する方法。

【請求項5】

一連の培養段階において細胞を培養するためのフレキシブル多区画バッグであって、
異なるサイズの複数の直列に接続された培養区画であって、一連の直列に接続された区画の少なくとも一部が、一連の培養段階の対応する段階にそれぞれ適合している、培養区画と、
一連の直列に接続された区画の少なくとも一部における隣接する２つの区画の間の破壊可能な封止部であって、２つの隣接する区画の一方で培養が完了した際には、一度開かれた前記破壊可能な封止部は、前記隣接する２つの区画を流体的に接続するよう構成され、細胞培養の次の段階のために一連の区画における後続の他方の区画に培養された細胞を移送することができ、隣接する２つの区画の間の境界全体を構成する破壊可能な封止部と、
を備える、バッグ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は細胞培養用のバイオリアクターに関し、より具体的には、シードトレーン増殖又は細胞治療用細胞の増殖などといった細胞培養物の多段増殖に適するフレキシブルバッグバイオリアクターに関する。本発明はフレキシブルバッグバイオリアクターにおいて細胞培養物を増殖させる方法にも関係する。

【背景技術】

【0002】

細胞培養物を小さな細胞バンクサンプルから大きな生産バッチへとスケールアップする場合、通常はこれを別々のバイオリアクターを使って数段階で行う必要がある。この一連の培養はしばしばシードトレーンと呼ばれ、細胞密度を特定の最適ウインドウ内に、多くの場合、１ｍｌ当たり＞１０5細胞程度に、保つために必要となる。小さな凍結保存バイアルサンプルから数ｍ3へのスケールアップが行われる生物製剤の大規模生産では、シー
ドトレーンは最大６段階を必要とし、数週間を要する場合がある。また、あるバイオリアクターから別のバイオリアクターへの培養物の無菌的移送が要求され、移送をＬＡＦベンチ内又は無菌クリーンルーム内で行う必要があることから、シードトレーンは複雑な手順でもある。また、これらの条件下でも偶発的な感染のリスクはある程度存在し、高価な大規模培養物の場合、そのような感染は甚大な被害をもたらしうる。同様の懸念は、臨床的細胞治療に使用される細胞、例えば幹細胞の増殖にも当てはまる。

【0003】

細胞培養物には使い捨て容器が使用されるという一般的動向に伴って、シードトレーンにおけるフレキシブルバッグバイオリアクターの使用は増加傾向にある。しかし、小さなバッグを空にしてその内容物を大きなバッグに移送する必要は依然として残っており、ある程度の汚染リスクを伴う労働集約的作業である。バッグ断面全体にわたってバッグの一部をクランプで閉鎖し、次にそのクランプを取り除くことによって（国際公開第２００８／１５３４０１号）、又は折りたたまれたバッグから開始して、次にそれを広げることによって（米国特許出願公開第２０１０／００５５７６４号）、フレキシブルバッグ内の培養物体積を徐々に増加させることが提案されている。しかしこれらの解決策では使用された区画と未使用の区画との間に良好な封止が得られず、未使用区画への培養物の漏出と、不適切な条件下で成長する細胞から放出された物質による細胞培養物の汚染とにつながる。これらの方法ではバッグが機械的損傷を受けるリスクも高く、その結果、バッグが破裂するリスクがある。

【0004】

したがって、細胞培養物をある可撓性培養物区画からもう一つの可撓性培養物区画へと無菌条件下で移送する安全かつ便利な方法が必要とされている。感受性細胞培養物の、特に小体積における、正確な温度制御も必要とされている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】米国特許出願公開第２０１１／２１７６９０号明細書

【発明の概要】

【0006】

本発明の一態様は、区画間での時期尚早な漏出のリスクもバッグ損傷のリスクも伴わずに、ある培養区画から別の培養区画への細胞培養物の移送を可能にするフレキシブルバッグアセンブリを提供することである。これは請求項１に規定するアセンブリで達成される。

【0007】

一つの利点は、複数の培養区画を単一のトレー上に都合よく設置することができ、同じ撹拌手段を使って撹拌できることである。さらにもう一つの利点は、例えば重力又はガス圧などを使って培養物を容易に移送できることである。

【0008】

本発明の第２態様は、区画間での時期尚早な漏出のリスクもバッグ損傷のリスクも伴わずに、ある培養区画から別の培養区画への細胞培養物の移送を可能にする、揺動台上のフレキシブルバッグを含む、バイオリアクターアセンブリを提供することである。これは請求項に規定するアセンブリで達成される。

【0009】

本発明の第３態様は、ある培養区画から別の培養区画へと細胞培養物が安全かつ便利に移送される培養方法を提供することである。これは請求項に規定する方法で達成される。

【0010】

本発明の第４態様は、１以上の培養区画における実質的に一定した温度での細胞の培養を可能にするフレキシブルバッグアセンブリを提供することである。これは請求項に規定するアセンブリで達成される。

【0011】

本発明の第５態様は、１以上の培養区画における実質的に一定した温度での細胞の培養を可能にするバイオリアクターアセンブリを提供することである。これは請求項に規定するアセンブリで達成される。

【0012】

本発明の第６態様は、細胞が実質的に一定した温度で培養される培養方法を提供することである。これは請求項に規定する方法で達成される。

【0013】

本発明のさらなる適切な実施形態は従属請求項に記載する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】３つの接続可能バッグがトレー上に横並びに配置されている本発明の実施形態を示す図である。

【図2】１つのバッグが３つの接続可能な培養区画を有している本発明の実施形態を示す図である。

【図3】１つのバッグが３つの接続可能な培養区画を有している本発明のもう一つの実施形態を示す図である。

【図4】３つの接続可能バッグがトレー上に積み重なっている本発明の実施形態を示す図である。

【図5】スタックの底にある第１バッグにおいて開始される、図４の３つのバッグにおける培養のシーケンスを示す図である。ａ）第１バッグにおける培養、ｂ）第２バッグにおける培養、及びｃ）第３バッグにおける培養。

【図6】図５に代わる代替的シーケンスを示す図である。ここでは、使用済みバッグが、次のバッグにおける培養の前に取り除かれる。ａ）第１バッグにおける培養、ｂ）第２バッグにおける培養、及びｃ）第３バッグにおける培養。

【図7】第１バッグがスタックの最上部にある、代替的積み重ねバッグ配置を示す図である。ａ）第１バッグにおける培養、ｂ）第２バッグにおける培養、及びｃ）第３バッグにおける培養。

【図8】バッグ相互間接続部の２つの例を示す図である。ａ）スタックの上を通るループ状の管材によって第２バッグ中の注入ポートと接続された第１バッグ中の浸漬管排液ポート、ｂ）スタックの外側を通るループ状の管材によって第２バッグ中の注入ポートと接続された第１バッグ中の排液ポート。

【図9】排液ポートの２つの例を示す図である。ａ）水平位置にあるバッグで使用される浸漬管及びｂ）傾斜した位置にあるバッグで使用されるポート。

【図10】１つのバッグが３つの接続可能な培養区画と１つの温度制御区画とを有している本発明の実施形態を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

図１～１０に図解する一態様において、本発明は細胞培養用のフレキシブルバッグアセンブリ１；２１；４１；６１；８１を開示する。本アセンブリは、複数の培養区画５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７、例えば２つ、３つ又はそれ以上の区画を形成する、１以上のバッグ２，３，４；２２；４２；６２，６３，６４；８２、例えば１以上の可撓性及び／又は折りたたみ可能バッグを備える。少なくとも第１培養区画５；２５；４５；６５；８５中の第１排液ポート８；２８；４８；６８；８８は、第１弁手段１０；３０；５０；７０；９０の開通時に第２培養区画６；２６；４６；６６；８６と流体的に接続されるように構成されている。第２培養区画は、第１培養区画より大きくてもよく、例えば第１培養区画の容積の少なくとも１２０％、例えば少なくとも１５０％又は１２０～１０００％の容積を有しうる。排液ポートは、第１培養区画の完全な排液が容易になるように、第１培養区画の低い箇所に適切に設けることができる。低い箇所とは、ここでは、当該区画が培養位置にある時、又は当該区画が移送位置又は排液位置に動かされた時に、区画容積の下から２０％、１０％又は５％以
内に設けられた箇所を意味しうる。排液ポートの２つの例を図９に示す。図９ａ）は培養位置にあるバッグで使用することができる浸漬管６８を示し、図９ｂ）は、ポートがバッグの下端になる傾斜排液位置又は垂直排液位置にバッグがある時に排液するのに適したバッグの端部にある単純なポート６８を示している。図８ａ）に示すように、排液ポートとしてバッグの端部に浸漬管を使用することも可能である。この配置は水平位置と傾斜／垂直位置のどちらにおける排液も可能にする。弁手段は、細胞を第１培養区画で培養する時は閉鎖位置にすることができ、次に培養物が第２区画に移送される時には開通位置に動かす／再配置することができる。次に、場合によっては、第２培養区画における培養中に漏出して第１区画に戻ることを防止するために、弁手段を閉鎖位置に動かす／再配置することもできる。或いは、弁手段は、第１区画から第２区画に向かう方向の流れだけを可能にする逆止め弁（図示していない）を備えてもよい。弁手段は例えばピンチ弁、ダイヤフラム弁、円板弁、ボール弁、仕切り弁、ニードル弁又はピストン弁などの弁であることができるが、弁手段はクランプ、例えばピンチクランプであるか、又は破壊可能な閉鎖部、例えば区画間の破裂円板又は破壊可能な溶接であることもできる。弁手段は可逆的であることができる、すなわち弁手段は開通位置から閉鎖位置に戻すように動かす／再配置することができるか、又は弁手段は不可逆的であることができる、すなわち閉鎖位置から開通位置に動かす／再配置することしかできない。弁及びクランプは可逆的弁手段の例であり、破壊可能な閉鎖部は不可逆的弁手段の例である。ピンチ弁及びピンチクランプは、管材又は導管上に外部から適用することができ、接液部が一切ないので、無菌性／汚染の観点から有利である。内径１０ｍｍまで又は外径１５ｍｍまでの管材又は導管への適用に適合しているピンチ弁又はピンチクランプは、効率のよい閉鎖及び開通をもたらす簡単で安価な構成要素であるから、特に好適である。弁手段の機能は、閉鎖位置にある時は、第１区画における培養中に第２区画への培養物のいかなる漏出も防止することであり、開通位置にある時は、第１区画から第２区画への容易な流れを可能にすることである。弁手段が可逆的であるか、逆止め弁を備える場合、弁は、所望であれば、第２区画における培養中に第１区画への培養物の逆流を防止する機能も有しうる。

【0016】

バッグ２，３，４；２２；４２；６２，６３，６４；８２は、例えば溶接によって、１以上の可撓性プラスチックフィルム又はプラスチック積層品から製造し、接合し、封止することができる。フィルム／積層品はポリオレフィン、例えばポリエチレン及び／又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどを含みうるが、バリア層、例えばエチレンビニルアルコールポリマー、及び／又は例えばポリアミドの引き裂き抵抗層も含みうる。フィルム又は積層品の厚さは、例えば５０～３００マイクロメーター、例えば１００～２５０マイクロメーターでありうる。

【0017】

本発明のバッグアセンブリは、培養中に撹拌を与えるために、揺動トレー１３；３３；７３；９３台上に、都合よく配置することができる。トレーは、例えばトレーのやや下に設置された軸１６；３６；７６；９６の周りを前後に揺動することができる。この目的に適した揺動トレー台は、例えば参照によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第６，１９０，９１３号に記載があり、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－ＳｃｉｅｎｃｅｓからＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）として市販されている。

【0018】

特定の実施形態では、フレキシブルバッグアセンブリ１；２１；４１；６１；８１は３以上の培養区画を備え、第２弁手段１１；３１；５１；９１の開通時に第３培養区画７；２７；４７；６７；８７と流体的に接続されるように構成された第２排液ポート９；２９；４９；８９を第２培養区画６；２６；４６；６６；８６に有する。第２排液ポート及び第２弁手段は、第１排液ポート及び第１弁手段について上述したような構造を有しうる。第３培養区画は第２培養区画より大きくてもよく、例えば第２培養区画の容積の少なくとも１２０％、例えば少なくとも１５０％又は１２０～１０００％の容積を有し、及び／又は第１培養区画の容積の少なくとも１４０％、例えば少なくとも２００％又は１４０～１
００００％の容積を有しうる。これにより、第１培養区画から第２培養区画を経て第３培養区画への安全かつ便利な３段階スケールアップが可能になる。

【0019】

図１及び図４に図解するいくつかの実施形態では、フレキシブルバッグアセンブリ１；６１は、管材１２によって適切に接続された２以上のバッグを備える。管材は第１バッグの排液ポート８，９及び第２バッグの培養物注入口１７に接続することができる。弁手段１０，１１は、ａ）管材によって接続された弁構成要素、ｂ）管材と一体化した弁、又はｃ）ピンチクランプ又はピンチ弁などの外部から適用される器具であることができる。これらの弁手段はいずれも、閉鎖位置では漏出を防止することができ、開通位置では流れを可能にすることができる。バッグは、図１の場合のようにトレー１３上に横に並べて設置するように構成させるか、又は図４～７の場合のようにトレー７３上で積み重ねられるように構成させることができる。横に並べて設置されたバッグと上に積み重ねられたバッグとの組合せ、例えば２つ又は３つのバッグを図１の場合のように横に並べ、それら２つ又は３つのバッグの下又は上に、それより大きなバッグを１つ設置することなども可能である。横に並んだ配置には、アセンブリを調製してトレー上に配置するのが容易であり、操作が簡単であるという利点がある。積み重ね配置には、トレーの面積がより効率よく使用されるという利点がある。バッグを積み重ねる場合は、接続部を管材によって作製し、その管材をスタックの外又は上にループ状に伸ばすと有利である。これにより、弁手段をそのループ上に設置すれば、手の届きやすさが改良され、弁手段の容易な操作が可能になる。バッグは、例えば、図５及び図６に示すように第２バッグが第１バッグの上になり、場合によっては第３バッグ（及びさらなるバッグ）が第２バッグの上になるように、積み重ねることができる。この配置には、バッグの底側にあるセンサーがいずれもトレー表面上のセンサー端子と接触できるという利点がある。特に、第２バッグへの培養物の移送後に第１バッグがスタックから取り除かれ、場合によっては、第３バッグへの培養物の移送後に第２バッグが取り除かれる、図６に図解するような培養シーケンスは、全てのバッグ中のセンサーがトレー表面上の同じセンター端子と接触することを可能にする。このシーケンスには、培養中はバッグ面積全体がトレー表面と接触していることで、トレー表面に設けられた加熱要素からの熱移動が容易になり、温度制御が改良されるという利点もある。或いは、バッグは、図７に示すように、第２バッグが第１バッグの下になり、場合によっては第３バッグ（及びさらなるバッグ）が第２バッグの下になるように、バッグを積み重ねることができる。この配置では、先のバッグの排液ポートを、スタックの上を通る管材ループによって、後続のバッグの空いている上面上の注入ポートに容易に接続することができるので、より容易な接続部の締めつけが可能になる。もう一つの利点は、各バッグからのサンプルをバッグの空いている上面上のサンプルポートから取り出すことが、より容易な点である。必要であれば、温度制御を改良するために、シート状の加熱要素をスタック中のバッグの間に差し入れてもよい。どのスタック配置でも、後続のバッグへの培養物の移送後に使用済みバッグをスタックから取り除くべき場合には、例えば接続管材が熱可塑性（例えば軟質ＰＶＣ製又は熱可塑性エラストマー製）であるなら、熱封止による分断などによって、無菌状態を維持したまま、それを容易に行うことができる。熱可塑性管材を熱封止するための装置は、例えばＨｏｔ Ｌｉｐｓ Ｔｕｂｅ Ｓｅａｌｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）などの名称で、容易に入手することができる。

【0020】

図２～３及び図１０に図解する特定の実施形態では、フレキシブルバッグアセンブリ２１；４１；８１は、内部導管３２；９２によって接続されているか又は接続可能である培養区画２５，２６，２７；４５，４６，４７；８５，８６，８７を有する１以上の多区画バッグ２２；４２；８２を備える。内部導管は、バッグの断面の１０％未満、例えば５％未満の大きさの内（円相当）径を好適に有することができる。図２及び図１０に示すように、区画は、例えばバッグ断面の少なくとも大部分、例えば断面全体にわたって拡がる壁又は溶接シームによって、互いに区切ることができる。そして、内部導管３２；９２は、
例えば壁のポート２８，２９；８８，８９の中空部分であるか、又は溶接シームにポート２８，２９；８８，８９として挿入された短い管材の断片であることができる。弁手段３０，３１；９０，９１は、導管と一体化しているか、クランプ又はピンチ弁として外部から適用することができる。或いは、内部導管３２；９２は、バッグ断面のうち、壁又は溶接シームが及んでいない部分であってもよく、この場合、壁／溶接シームはバッグ断片の一部、例えばバッグ断片の９０～９９．９％又は９５～９９．５％にしか拡がっておらず、断片の残りの部分は開口したままで内部導管３２；９２を形成することになる。この場合は、短い距離に適用する必要しかないことから漏れのない封止部を与えることができる外部から適用されるクランプを、好適な弁手段とすることができる。

【0021】

図１０に図解する特定の実施形態では、フレキシブルバッグアセンブリ８１はさらに、１以上の温度制御区画９８を含む１以上のバッグ８２を備える。バッグ８２は、上部フィルム９９、底部フィルム１００及び境界フィルム９７を好適に備えることができ、境界フィルムは温度制御区画９８と培養区画８５，８６，８７とを区切っている。温度制御区画は少なくとも恒温流体用の注入口（図示していない）を好適に備えることができる。温度制御区画はさらに恒温流体用の排出口（図示していない）を備えてもよい。恒温流体は例えば水又は細胞培養培地であることができる。水などの恒温流体は、注入口及び排出口を介し、温度制御区画を通して、恒温槽などの恒温機器から／へ循環させることができる。或いは、温度制御区画は、トレー９３上の１以上の温度制御表面又は加熱要素と直接接触して設けられるように構成されていてもよい。この場合、水又は細胞培養培地などの恒温流体は循環させる必要がなく、温度緩衝材として作用することができる。温度制御流体が細胞培養培地である場合、温度制御区画は、排液ポート及び弁手段（図示していない）を介して、第１培養区画、第２培養区画又は第３培養区画に流体的に接続可能であってもよく、その場合は、上での議論と同じ方法でさらなる培養区画として使用することができる。温度制御区画を設けることの利点は、とりわけ小さな培養区画では、培養区画中に温度センサーを設けてフィードバックループを使ってトレーの温度制御（加熱）表面で温度を制御するという従来の手段では、温度を十分正確に制御することが困難な場合があることである。温度制御区画があれば、恒温流体の熱容量ゆえに、より良い温度安定性を得ることができる。温度制御区画の効果は、容積が１Ｌ未満、例えば２５０ｍＬ未満、１００ｍＬ未満、５０～１００ｍＬ、５０～２５０ｍＬ又は５０～１００ｍＬの培養区画で、最も顕著である。これは特に第１培養区画に当てはまる。温度制御区画の容積は、例えば少なくとも１Ｌ、例えば少なくとも２Ｌもしくは少なくとも５Ｌ、又は第１培養区画の容積の少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍であることができる。

【0022】

図３に図解するいくつかの実施形態では、フレキシブルバッグアセンブリ４１は、１以上の破壊可能な封止部５２を介して接続可能な培養区画４５，４６，４７を含む１以上の多区画バッグ４２を備える。破壊可能な封止部は、例えば、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる欧州特許公開第２，２２６，０５８号（Ａ１）又は米国特許第４，５１９，４９９号に開示されているような、弱い溶接部であることができる。破壊可能な封止部は、隣接する２つの区画の間の境界全体を構成しうる。この場合、溶接部は、第１区画が第２区画に開放されるように、破裂又はバッグの外側からの他の機械的作用によって破壊され、第２培養段階は合併された区画で実行される。この配置の利点は余分な構成要素が必要ないことである。さらにもう一つの利点は、図３では各区画について別々のガス注入口５４及びガス排出口５５が示されているが、全ての区画を含むバッグ全体に１つのガス注入口及び１つのガス排出口だけでも培養を行いうることである。

【0023】

フレキシブルバッグアセンブリの特定の実施形態では、各培養区画はガス注入口１４；３４；５４；７４；９４及びガス排出口１５；３５；５５；７５；９５を備える。これらの注入口及び排出口は、培養物の感染／汚染を防止するために無菌フィルタ（図示していない）を装備することができ、例えば空気／酸素を培養物に供給し、二酸化炭素などのガ
ス状代謝産物を取り除くために使用される。ガス注入口及びガス排出口は、培養液をある区画から別の区画に移送するためのガス圧を供給するためにも使用することができる。ガスは、例えばガス注入口を介して供給することができ、この際、ガス排出口は閉鎖しておくか、単に排出口無菌フィルタに頼ることで、培養液を輸送するための十分に高い背圧を与えうる。培養区画はサンプリング排出口、培養培地の注入口、並びに例えば温度、細胞密度、ｐＨ及び酸素又は代謝産物などの濃度に関するセンサーのうちの１つ以上を備えていてもよい。

【0024】

上に開示したバッグアセンブリは、組み立て済みの状態、かつ例えばガンマ線照射又は電子線照射などによる放射線殺菌によって殺菌済みの状態で、好適に供給することができる。全ての液体接触材料を、放射線安定であるように選択すること、及び照射後でも浸出物のレベルが低くなるように選択することは適切である。全ての材料を例えば米国薬局方クラスＶＩ（ＵＳＰ ＶＩ）品質のものにすることができる。

【0025】

図１～４及び図１０に図解する第２の態様において、本発明は、１以上の軸１６；３６；５６；７６；９６の周りを前後に揺動するように構成されたトレー１３；３３；５３；７３；９３上に搭載されている、上に開示したフレキシブルバッグアセンブリ１；２１；４１；６１；８１を備えるバイオリアクターアセンブリを開示する。トレーの揺動機構及び支持体は図面には示されていないが、米国特許第６，１９０，９１３号及びＶ．Ｓｉｎｇｈ：Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１－３），１４９－１５８（１９９９）に詳述されている。本バイオリアクターはさらに、培養区画５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７の少なくとも１つに細胞培養物を含んでいてもよい。トレーには、１以上のバッグと直接接触している温度制御（加熱）表面を装備することができる。トレーにはさらに、１以上のバッグと電気的に接触しているセンサーコネクタを装備することができる。培養区画の少なくとも１つは、ガス注入口及び無菌フィルタを介してガス供給源に接続することができる。

【0026】

第３の態様において、本発明は細胞を培養する方法を開示する。本方法は、
ａ）上に開示したバイオリアクターを用意する段階と、
ｂ）第１培養区画５；２５；４５；６５；８５に培養培地及び細胞を導入する段階と、
ｃ）第１培養区画において細胞を培養することで、第１細胞培養物を得る段階と、
ｄ）第１弁手段１０；３０；５０；７０；９０を開通することで、第１培養区画を第２培養区画６；２６；４６；６６；８６と流体的に接続する段階と、
ｅ）第１細胞培養物を第２培養区画に移送する段階と、
ｆ）第２培養区画に培養培地を導入する段階と、
ｇ）第２培養区画において細胞を培養することで、第２細胞培養物を得る段階と
を含む。

【0027】

第１培養区画及び第２培養区画における培養は、例えばＶ．Ｓｉｎｇｈ：Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３０（１－３），１４９－１５８（１９９９）又はＣｌｉｎｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２０１３，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．３に記載されている当技術分野において周知の方法を使って行うことができる。空気又は他のガスは、ガス注入口１４；３４；５４；７４；９４を介して供給することができ、過剰の空気／ガスはガス状代謝産物（例えば二酸化炭素）と一緒にガス排出口１５；３５；５５；７５；９５を介して排気することができる。第１区画における培養は、予定の生細胞密度（ＶＣＤ）、例えば１．０×１０5、２．０×１０5、５．０×１０5又は１．０×１０6生細胞／ｍｌに達するまで継続することができる。ＶＣＤは、例えば、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる米国特許第８，１８０，５７５号又は国際公開第２０１０／０１０３１３号（Ａ２）などに記載されているようなインラインバイオマスセンサーで、測定することができる。予定のＶＣＤに到達したら、段階ｄ）以降を開始することがで
きる。段階ｅ）における移送は、重力によって、例えばトレーをバッグと一緒に傾斜させるか、トレーを垂直に立てることなどによって達成することができる。移送は、第１バッグのガス注入口を介して加えられた適切なガス圧によって達成することもでき、その場合、ガス排出口上の無菌フィルタの背圧は移送を可能にするのに十分でありうる。移送はさらに、他の手段によって、例えば第１区画に圧力をかけることによって、又は異なる手段の併用によって、達成することもできる。

【0028】

いくつかの実施形態では、本方法はさらに、段階ｅ）の後に、第１弁手段を閉鎖する段階ｅ’）を含む。上記に代えて、又は上記に加えて、例えば区画間の任意の管材１２；７２を切断し封止することなどによって、第１区画及び第２区画を互いに分断してもよい。区画を別々のバッグに設ける場合、これは、トレーから第１バッグを取り除くことを可能にし、それにより、熱移動を改良することができ、及び／又は上で議論したトレー表面上のセンサー端子との接触を可能にすることができる。

【0029】

特定の実施形態では、本方法はさらに
ｈ）第２弁手段を開通することで、第２培養区画を第３培養区画と流体的に接続する段階と、
ｉ）第２細胞培養物を第３培養区画に移送する段階と、
ｊ）第３培養区画に培地を導入する段階と、
ｋ）第３培養区画において細胞を培養することで、第３細胞培養物を得る段階と
を含む。

【0030】

この方法はさらに、段階ｉ）の後に、第２弁手段を閉鎖する段階ｉ’）を含むことができる。上記に代えて、又は上記に加えて、例えば区画間の任意の管材１２；７２を切断し封止することなどによって、第２区画及び第３区画を互いに分断することができる。

【0031】

いくつかの実施形態では、段階ｋ）及び／又は段階ｇ）は灌流方式で、すなわち培養物の少なくとも一部をフィルタに運搬し、そこで濾液を取り除き、細胞を運搬して培養物に戻すと共に、取り除いた濾液を新鮮培養培地で置き換えることによって、実行することができる。これによってＶＣＤのさらなる増加が可能になる。

【0032】

第４の態様において、本発明は細胞培養用のフレキシブルバッグアセンブリを開示する。本アセンブリは、１以上の培養区画８５，８６，８７と１以上の温度制御区画９８とを含む１以上のバッグ８２を備える。温度制御区画は、好適には、培養区画を温度制御区画の上にして、トレー支持体上に乗るように構成させることができる。複数の培養区画は上で開示したように流体的に接続可能であってもよいが、複数の培養区画が個別であって並行培養に適合していてもよい。バッグ８２は、図１０に図解するように、上部フィルム９９、底部フィルム１００及び境界フィルム９７を備え、境界フィルムは１以上の温度制御区画９８と１以上の培養区画８５，８６，８７、例えば各培養区画とを区切っている。各培養区画などの培養区画は例えば１Ｌ未満、例えば５０～２５０ｍＬの容積を有することができ、及び／又は温度制御区画の容積は、各培養区画などの１以上の培養区画の容積の、例えば少なくとも１０倍であることができる。温度制御区画は、例えば、恒温槽などからの恒温流体の循環を可能にするために、恒温流体用の注入口及び排出口を備えていてもよい。或いは、温度制御区画は、温度制御区画が閉じていて温度緩衝材として作用する条件下での培養を可能にするために、恒温流体用の注入口を有しうる。

【0033】

第５の態様において、本発明は、
ａ）１以上の培養区画８５，８６，８７を含む１以上のバッグ８２又はボトル、
ｂ）恒温流体を含む１以上の可撓性温度制御区画９８、及び
ｃ）１以上の軸９６の周りを前後に揺動するように構成されたトレー９３又はトレーのス
タック
を備えるバイオリアクターアセンブリを開示する。

【0034】

１以上の可撓性温度制御区画はトレー上に搭載又は設置され、１以上のバッグ又はボトルは１以上の可撓性温度制御区画の最上部に好適に設けられる。したがって、恒温流体と培養区画中の細胞培養物との間の熱移動は、効率よく進行することができ、恒温流体の熱容量が、小さな培養区画にさえ、例えば容積が１Ｌ未満、例えば２５０ｍＬ未満、１００ｍＬ未満、５０～１００ｍＬ、５０～２５０ｍＬ、又は５０～１００ｍＬの培養区画にさえ、狭い温度範囲内での良好な温度制御をもたらす。バッグ８２は、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の培養区画を備えることができ、それらの培養区画は、上で開示したように並行培養及び／又は逐次培養に適合させることができる。可撓性温度制御区画は、１以上のバッグ８２の一部を形成することができ、すなわちバッグ８２は、図１０に図解するように、可撓性温度制御区画９８と１以上の培養区画８５，８６，８７とを、どちらも備えることができる。１以上のバッグはさらに、上部フィルム９９、底部フィルム１００及び境界フィルム９７を備えることができ、境界フィルムは１以上の温度制御区画９８と１以上の培養区画８５，８６，８７とを区切っている。この配置では、バッグの上部に１以上の培養区画を含み、底部に温度制御区画を含む、一体型バッグが得られる。温度制御区画は、例えば恒温槽から温度制御区画を通る流体の循環が可能になるように、恒温流体用の注入口及び排出口を装備することができる。培養区画の１つ又は複数、例えば各培養区画には、フィードバックループによる温度制御を可能にする制御ユニットに電気的又は電磁的に接続することができる温度センサーも装備することができる。制御ユニットはさらに、フィードバックループ内の恒温槽又は他の温度制御装置に接続することができる。さらに、又は上記に代えて、温度制御区画は、制御ユニットに接続することができる温度センサーを備えうる。トレーには、１以上のバッグと直接接触する温度制御（加熱）表面を装備することができる。トレーにはさらに、１以上のバッグと電気的に接触するセンサーコネクタを装備することができる。培養区画の少なくとも１つはガス注入口及び無菌フィルタを介してガス供給源に接続することができる。

【0035】

第６の態様において、本発明は細胞を培養する方法を開示する。本方法は、
ａ）上に開示したバイオリアクターアセンブリを用意する段階と、
ｂ）１以上の培養区画８５，８６，８７に培養培地及び細胞を導入する段階と、
ｃ）１以上の培養区画において細胞を培養する段階と
を含む。

【0036】

特定の実施形態では、段階ｃ）における温度は、目標温度±２℃、例えば±１℃又は±０．５℃の範囲内に維持される。目標温度は細胞タイプに依存しうる。哺乳動物細胞の場合、例えば３５～３８℃、例えば３６～３７℃を目標温度とすることができる。

【0037】

いくつかの実施形態では、可撓性温度制御区画を通して恒温流体を循環させる。これにより、温度の精密な制御が可能になる。或いは、温度制御区画はトレー上の温度制御（加熱）表面と接触しており、温度制御区画中／上の温度センサーを使用して、制御ユニット及びフィードバックループを使って、温度が制御される。

【0038】

特定の実施形態では、１以上の培養区画は、制御ユニットと電気的又は電磁的に接続される温度センサーを備え、恒温流体及び／又は培養区画の温度は、フィードバックループを使って、制御ユニットによって制御される。

【0039】

本明細書では実施例を使って、本発明を、その最良の形態を含めて開示し、そしてまた当業者が本発明を、任意の器具又はシステムを作製し使用すること、及び任意の組み込まれた方法を行うことを含めて、実施することができるようにしている。特許を受けること
ができる本発明の範囲は特許請求の範囲によって画定され、これには、当業者が思いつく他の実施例も含まれうる。そのような他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文言と相違しない構造要素を有するか、特許請求の範囲の文言との相違が実質的でない均等な構造要素を含むのであれば、特許請求の範囲内にあるものとする。本明細書において言及する特許及び特許出願は全て、あたかも個別に組み込まれたかのように、参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
［実施態様１］
少なくとも第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）中の排液ポート（８；２８；４８；６８；８８）が弁手段（１０；３０；５０；７０；９０）の開通時に第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）と流体的に接続されるように構成されている、複数の培養区画（５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７）を形成する１以上のバッグ（２，３，４；２２；４２；６２，６３，６４；８２）を備える細胞培養用のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様２］
第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）が第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）の容積の少なくとも１２０％、例えば少なくとも１５０％の容積を有する、実施態様１に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様３］
３以上の培養区画（５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７）を備え、第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）中の排液ポート（９；２９；４９；８９）が弁手段（１１；３１；５１；９１）の開通時に第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）と流体的に接続されるように構成されている、実施態様１又は実施態様２に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様４］
第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）が第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）の容積の少なくとも１２０％、例えば少なくとも１５０％の容積を有する、実施態様３に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様５］
１以上の培養区画（５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７）、例えば第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）が、剛性又は半剛性容器である、実施態様１乃至４のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様６］
弁手段（１０；３０；５０；７０；９０）が弁又はクランプである、実施態様１乃至５のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様７］
弁手段（１０；３０；５０；７０；９０）がピンチ弁又はピンチクランプである、実施態様６に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様８］
ピンチ弁又はピンチクランプが、外径１５ｍｍまでの管材（１２；７２）又は導管への適用に適合している、実施態様７に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様９］
排液ポート（８，９；２８，２９；４８，４９；６８）の少なくとも１つが浸漬管（６８）である、実施態様１乃至８のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様１０］
管材（１２；７２）によって接続された２以上のバッグ（２，３，４；６２，６３，６４）、例えば３以上のバッグ（２，３，４；６２，６３，６４）を備える、実施態様１乃至９のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；６１）。
［実施態様１１］
２以上のバッグ（２，３，４）がトレー（１３）上に横に並べて配置されるように構成されている、実施態様１０に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１）。
［実施態様１２］
２以上のバッグ（６２，６３，６４）がトレー（７３）上又はトレーのスタック上に積み重ねられるように構成されている、実施態様１０に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（６１）。
［実施態様１３］
複数の培養区画（２５，２６，２７；４５，４６，４７；８５，８６，８７）が内部導管（３２；９２）を介して接続されているか又は接続可能である１以上の多区画バッグ（２２；４２；８２）を備える、実施態様１乃至１２のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（２１；４１；８１）。
［実施態様１４］
複数の培養区画（２５，２６，２７；４５，４６，４７）が１以上の破壊可能な封止部（５２）を介して接続可能である１以上の多区画バッグ（２２；４２）を備える、実施態様１乃至１３のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（２１；４１）。
［実施態様１５］
１以上の温度制御区画（９８）を備える１以上のバッグ（８２）を備える、実施態様１乃至１４のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様１６］
１以上のバッグ（８２）が上部フィルム（９９）、底部フィルム（１００）及び境界フィルム（９７）を備え、境界フィルム（９７）が、１以上の温度制御区画（９８）と１以上の培養区画（８５，８６，８７）、例えば少なくとも第１培養区画（８５）とを区切っている、実施態様１５に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様１７］
温度制御区画（９８）が恒温流体注入口及び場合によっては恒温流体排出口を備える、実施態様１５又は実施態様１６に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様１８］
第１培養区画（８５）の容積が１Ｌ未満、例えば５０～２５０ｍＬであり、及び／又は温度制御区画（９８）の容積が第１培養区画（８５）の容積の少なくとも１０倍である、実施態様１５乃至１７のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様１９］
揺動トレー台上での細胞培養に適合した、実施態様１乃至１８のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様２０］
各培養区画（５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７）がガス注入口（１４；３４；５４；７４；９４）及びガス排出口（１５；３５；５５；７５；９５）を備える、実施態様１乃至１９のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様２１］
放射線殺菌などによる殺菌済みの状態で供給される、実施態様１乃至２０のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）。
［実施態様２２］
１以上の軸（１６；３６；５６；７６；９６）の周りを前後に揺動するように構成されたトレー（１３；３３；５３；７３；９３）上又はトレーのスタック上に搭載された実施態様１乃至２１のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（１；２１；４１；６１；８１）を備えるバイオリアクターアセンブリ。
［実施態様２３］
培養区画（５，６，７；２５，２６，２７；４５，４６，４７；６５，６６，６７；８５，８６，８７）の少なくとも１つに細胞培養物を含む、実施態様２２に記載のバイオリアクターアセンブリ。
［実施態様２４］
ａ）実施態様２２に記載のバイオリアクターアセンブリを用意する段階と、
ｂ）第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）に培養培地及び細胞を導入する段階と、
ｃ）第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）において細胞を培養することで、第１細胞培養物を得る段階と、
ｄ）第１弁手段（１０；３０；５０；７０；９０）を開通することで、第１培養区画（５；２５；４５；６５；８５）を第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）と流体的に接続する段階と、
ｅ）第１細胞培養物を第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）に移送する段階と、
ｆ）第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）に培地を導入する段階と、
ｇ）第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）において細胞を培養することで、第２細胞培養物を得る段階と
を含む、細胞を培養する方法。
［実施態様２５］
段階ｅ）の後に、第１弁手段（１０；３０；５０；７０；９０）を閉鎖する段階ｅ’）をさらに含む、実施態様２４に記載の方法。
［実施態様２６］
ｈ）第２弁手段（１１；３１；５１；９１）を開通することで、第２培養区画（６；２６；４６；６６；８６）を第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）と流体的に接続する段階と、
ｉ）第２細胞培養物を第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）に移送する段階と、
ｊ）第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）に培地を導入する段階と、
ｋ）第３培養区画（７；２７；４７；６７；８７）において細胞を培養することで、第３細胞培養物を得る段階と
をさらに含む、実施態様２４又は実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
段階ｉ）の後に、（第２）弁手段（１１；３１；５１；９１）を閉鎖する段階ｉ’）をさらに含む、実施態様２６に記載の方法。
［実施態様２８］
１以上の培養区画（８５，８６，８７）と１以上の温度制御区画（９８）とを含む１以上のバッグ（８２）を備える細胞培養用のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様２９］
１以上のバッグ（８２）が上部フィルム（９９）、底部フィルム（１００）及び境界フィルム（９７）を備え、境界フィルム（９７）が１以上の温度制御区画（９８）と１以上の培養区画（８５，８６，８７）、例えば各培養区画（８５，８６，８７）とを区切っている、実施態様２８に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様３０］
１以上の培養区画（８５，８６，８７）、例えば各培養区画（８５，８６，８７）が１Ｌ未満、例えば５０～２５０ｍＬの容積を有し、及び／又は温度制御区画（９８）の容積が、１以上の培養区画（８５，８６，８７）、例えば各培養区画（８５，８６，８７）の容積の少なくとも１０倍である、実施態様２８又は実施態様２９に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様３１］
温度制御区画（９８）が恒温流体用の注入口及び排出口を備える、実施態様２８乃至３０のいずれか１項に記載のフレキシブルバッグアセンブリ（８１）。
［実施態様３２］
ａ）１以上の培養区画（８５，８６，８７）を含む１以上のバッグ（８２）又はボトル、
ｂ）恒温流体を含む１以上の可撓性温度制御区画（９８）、及び
ｃ）１以上の軸（９６）の周りを前後に揺動するように構成されたトレー（９３）
を備え、１以上の可撓性温度制御区画（９８）がトレー（９３）上に搭載され、１以上のバッグ（８２）又はボトルが１以上の可撓性温度制御区画（９８）の上に設けられている、バイオリアクターアセンブリ。
［実施態様３３］
１以上の可撓性温度制御区画（９８）が１以上のバッグ（８２）の一部を形成している、実施態様３２に記載のバイオリアクターアセンブリ。
［実施態様３４］
１以上の可撓性温度制御区画（９８）が１以上のバッグ（８２）とは別個の第２バッグの一部を形成している、実施態様３２に記載のバイオリアクターアセンブリ。
［実施態様３５］
ａ）実施態様３２乃至３４のいずれか１項に記載のバイオリアクターアセンブリを用意する段階と、
ｂ）１以上の培養区画（８５，８６，８７）に培養培地及び細胞を導入する段階と、
ｃ）１以上の培養区画（８５，８６，８７）において細胞を培養する段階と
を含む、細胞を培養する方法。
［実施態様３６］
段階ｃ）における温度が目標温度±２℃、例えば±１℃又は±０．５℃の範囲内に維持される、実施態様３５に記載の方法。
［実施態様３７］
可撓性温度制御区画（９８）を通して恒温流体を循環させる、実施態様３５又は実施態様３６に記載の方法。
［実施態様３８］
１以上の培養区画（８５，８６，８７）が、制御ユニットに電気的又は電磁的に接続される温度センサーを備え、恒温流体の温度が、フィードバックループを使って、制御ユニットによって制御される、実施態様３５乃至３７のいずれか１項に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】