特許 7043529 ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-18

(45)【発行日】2022-03-29

(54)【発明の名称】ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7105 20060101AFI20220322BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20220322BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20220322BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7105 ZNA

A61P15/00

C12N15/113 110Z

【請求項の数】 1

(21)【出願番号】P 2019572795

(86)(22)【出願日】2018-02-23

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-24

(86)【国際出願番号】 CN2018077040

(87)【国際公開番号】W WO2019071902

(87)【国際公開日】2019-04-18

【審査請求日】2020-03-26

(31)【優先権主張番号】201710929803.9

(32)【優先日】2017-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】519463950

【氏名又は名称】南京鼓楼医院

【氏名又は名称原語表記】ＮＡＮＪＩＮＧ ＤＲＵＭ ＴＯＷＥＲ ＨＯＳＰＩＴＡＬ

【住所又は居所原語表記】３２１ Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ Ｒｏａｄ， Ｇｕｌｏｕ Ｎａｎｊｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１０００８， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100205936

【弁理士】

【氏名又は名称】崔 海龍

(74)【代理人】

【識別番号】100132805

【弁理士】

【氏名又は名称】河合 貴之

(72)【発明者】

【氏名】胡 ▲あ▼莉

(72)【発明者】

【氏名】周 艶

(72)【発明者】

【氏名】趙 光鋒

(72)【発明者】

【氏名】李 若天

【審査官】藤代 亮

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０１０７８２５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】中国特許出願公開第１０６３１９０３１（ＣＮ，Ａ）

【文献】中国特許出願公開第１０７５１９１９４（ＣＮ，Ａ）

【文献】東京慈恵会医科大学 教育・研究年報２０１４年版，2014年，Ｐ．１８４－１９１

【文献】Reproductive Biomedicine Online ，2013年，Vol.27，P.515-529

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／７１０５

Ａ６１Ｐ １５／００

Ｃ１２Ｎ １５／１１３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

子宮内膜上皮細胞線維化を抑制するための医薬品の製造におけるｍｉＲ－２１の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物製薬分野に属し、ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用に関する。

【背景技術】

【0002】

子宮内膜再生障害は、主に子宮腔癒着と薄い子宮内膜を含む。子宮腔癒着は、子宮内膜基底層の損傷および機能層の再生修復障害のため、子宮内膜線維化を形成することを特徴とする子宮壁間の癒着であり、子宮性不妊症の最も一般的な理由で、不妊症患者のうち、２５－３０％まで占めている。中国では、子宮腔手術、特に無痛妊娠中絶手術の増加に伴い、子宮腔癒着および子宮内膜線維化の発生率が明らかに上昇している。現在、主な治療法は、手術により癒着を分離し、子宮内避妊器具、球形嚢または生体材料を配置して、子宮の前壁と後壁とを阻隔することで、再癒着を防ぐ方法である。しかし，これらの治療法は，重度の子宮腔癒着に対して治療効果が低く、再癒着の発生率が６２．５％で依然として高く、かつ再癒着しなくても子宮内膜線維化は相変わらず胚胎着床の深刻な障害となっている。薄い子宮内膜とは、患者が大量のエストロゲンで刺激された後、子宮内膜の厚さがまだ明らかに増加されていないことを指し、そのような子宮内膜が薄い子宮内膜と呼ばれている。現在、薄い子宮内膜の厚さの定義については、まだ広範囲にコンセンサスを取ってない（一般的に７ｍｍ未満と見なされる）。発病メカニズムが不明確であるため、子宮腔癒着和薄い子宮内膜に対する効果的な治療を深刻に妨げている。発明者は、研究において、大部分の薄い子宮内膜患者も子宮腔手術によって引き起こされ、ある程度の子宮内膜線維化が存在することを発見した。従って，子宮腔癒着と薄い子宮内膜を予測および治療するための有効な方法を見出すことが急務であった。

【0003】

ｍｉＲＮＡは、長さが約１８～２５のヌクレオチドで、高度の種保護性を備えている内因性ノンコーディング小分子一本鎖ＲＮＡの一種である。ｍｉＲＮＡは、塩基配列の作用メカニズムにより標的ｍＲＮＡを分解するか、変換を抑制することにより、標的遺伝子の発現を調節することができる。ｍｉＲ－２１は、染色体１７ｑ２３．２の脆弱部位ＦＲＡ１７Ｂ上に位置する自律転写単位を有するｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ－２１は、種々の腫瘍細胞における発現が著しく異常で、種々の癌抑制遺伝子の発現および上皮間葉転換（ＥＭＴ）の調節に関与する。これは、ｍｉＲ－２１が発癌性ｍｉＲＮＡとして種々の腫瘍の発生と転移において重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、ｍｉＲ－２１は、肝臓、腎臓、肺線維化における発現が著しく高い。これは、線維化を促進することを示唆している。しかし、ｍｉＲ－２１が子宮腔癒着症候群に関連しているか否か、ｍｉＲ－２１が子宮内膜線維化に影響を及ぼすか否かについて報告されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明の目的は、ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用を提供することである。

【0005】

本発明の他の目的は、ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜の診断用試薬の製造における応用を提供することである。

【0006】

本発明の目的は、以下の技術的解決策により達成される。

【0007】

ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜治療用薬の製造における応用。

【0008】

ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による疾患治療用薬の製造における応用。

【0009】

前記子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による疾患は、好ましくは子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による子宮性不妊、反復流産、癒着胎盤および楔入胎盤である。

【0010】

ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜診断用試薬の製造における応用。

【0011】

ｍｉＲ－２１検出用試薬の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜診断用試薬の製造における応用。

【0012】

前記ｍｉＲ－２１検出用試薬は、好ましくはＰＣＲおよびｑＰＣＲプライマ、Ｔａｑｍａｎ探り針、ジゴキシンまたは蛍光色素標識探り針、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルチップ、ディープ配列を含む。

【0013】

前記ジゴキシンまたは蛍光色素標識探り針の配列は、より好ましくは５’ｕｃａａｃａｕｃａｇｕｃｕｇａｕａａｇｃｕａ３’（配列番号１）である。

【0014】

子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜の治療におけるｍｉＲ－２１の応用。

【0015】

ｍｉＲ－２１の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による疾患の治療における応用。
前記子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による疾患は、好ましくは子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜による子宮性不妊、反復流産、癒着胎盤及び楔入胎盤である。

【0016】

ｍｉＲ－２１検出用試薬の子宮腔癒着および／または薄い子宮内膜の診断における応用。

【0017】

前記ｍｉＲ－２１検出用試薬は、好ましくはＰＣＲおよびｑＰＣＲプライマ、Ｔａｑｍａｎ探り針、ジゴキシンまたは蛍光色素標識探り針、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルチップ、ディープ配列を含む。本発明に係るｍｉＲ－２１の配列は、５’ｕａｇｃｕｕａｕｃａｇａｃｕｇａｕｇｕｕｇａ３’（配列番号２）である。

【0018】

本発明に係る子宮腔癒着とは、子宮内膜基底層の損傷および機能層の再生修復障害のため、子宮内膜線維化を形成することを特徴とする子宮壁間の癒着を指す。

【0019】

本発明に係る薄い子宮内膜とは、子宮内膜の厚さがエストロゲン刺激により著しく増加することができず、一般的に７ｍｍ未満の厚さを有する子宮内膜を指す。

【発明の効果】

【0020】

子宮腔癒着患者は、子宮内膜上皮細胞および間質細胞におけるｍｉＲ－２１の発現が著しく低下し、特に、上皮細胞における発現の減少が最も顕著であることを見出した。さらに、生体外に結果によると、ｍｉＲ－２１が子宮内膜上皮細胞のＥＭＴを逆転させることで線維化を抑制することを示している。したがって、ｍｉＲ－２１は、子宮腔癒着の治療および診断において重要な役割を果たすことができ、子宮腔癒着の診断および治療用薬の製造、または子宮線維化に関連する他の疾患治療用薬の製造に使用することができる。発明者は、研究において、大部分の薄い子宮内膜患者も子宮腔手術によって引き起こされ、ある程度の子宮内膜線維化が存在することを発見した。ｍｉＲ－２１は、子宮内膜上皮細胞のＥＭＴを逆転させることで線維化を抑制することができるため、薄い子宮内膜、特に子宮腔手術による薄い子宮内膜の治療に使用されることが期待される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】原位置ハイブリッド形成法による子宮内膜組織におけるｍｉＲ－２１の発現に対する分析である。Ａ：ｍｉＲＮＡ陰性対照群、Ｂ：ｍｉＲＮＡ陽性発現対照群（ｍｉＲ－１６）、Ｃ：正常人の子宮内膜におけるｍｉＲ－２１の発現、Ｄ：子宮腔癒着患者の子宮内膜におけるｍｉＲ－２１の発現

【図2】細胞線維化関連遺伝子の発現に対するｍｉＲ－２１の影響。Ａ－Ｄは、順番にＥ－カドヘリン（Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）、線維化関連遺伝子ＦＮ１、α－ＳＭＡおよびＩ型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉ）である。

【図3】Ｎｐ６３による子宮内膜上皮細胞線維化に対するｍｉＲ－２１の影響である。図Ａは、Ｅ－カドヘリンの免疫蛍光結果を示し、Ｂは、Ｎ－カドヘリン（Ｎ－ｃａｄｈｅｒｉｎ）の免疫蛍光結果を示す。

【発明を実施するための最適な形態】

【0022】

（実施例１）正常人および重度子宮腔癒着患者の子宮内膜組織におけるｍｉＲ－２１の発現

【0023】

１ 材料、試薬、装置

【0024】

１．１ 人の子宮内膜組織の供給源
正常な子宮内膜組織５例および子宮腔癒着症候群患者の子宮内膜組織５例を収集する。子宮内膜組織を採取するとき、超音波で卵胞の大きさを検出することで、子宮内膜組織の採取段階がすべて増殖晩期段階に統一することを確保する。参加者全員は、書面による同意書に署名し、南京鼓楼医院の倫理委員会により承認された。

【0025】

１．２ 主な試薬
ＭｉｃｒｏＲＮＡ原位検出探り針ＨＡＳ Ｐｒｏｂｅ^ＴＭ（彭済凱豊生物科技有限公司）、ハイブリダイゼーション用キット（彭済凱豊生物科技有限公司）、抗ジゴキシン抗体（Ａｎｔｉ－Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ－ＡＰ，Ｒｏｃｈｅ）、ＮＢＴ ／ ＢＣＩＰ顕色剤（彭済凱豊生物科技有限公司）、キシレン、エタノール、ＤＥＰＣ水、ＰＢＳ、ＰＦＡ、プロテイナーゼＫ、無水酢酸、ホルムアミド、ＴＥＡ、ＳＳＣ、ＭＡＢ、およびツイーン（ＴＷＥＥＮ）。

【0026】

１．３ 主な機器
ハイブリダイゼーション装置（Ｔｈｅｒｍｏｂｒｉｔｅ）、シェーカー、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）

【0027】

１．４ 主な方法
パラフィン切片原位置ハイブリッド形成法によりｍｉＲ－２１の発現を検出する。キシレンでそれぞれ１５分間ずつ２回処理し、勾配アルコール（１００％エタノールで５分間、１００％エタノールで５分間、９５％エタノールで３分間、８５％エタノールで３分間、７０％エタノールで３分間、３０％エタノールで３分間）で処理した後、ＤＥＰＣ処理水で３分間洗浄し、１ｘＰＢＳで３分間洗浄する。続いて、４％ＰＦＡで氷上で１０分間処理し、１ｘＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄する。室温で切片をプロテイナーゼＫに１５分間浸した後、１ｘＰＢＳで２分間洗浄する。１×ＴＥＡシェーカーで１０分間すすぎ、２ｘＳＳＣで５分間処理する。乾燥後、１時間インキュベートしてプレハイブリダイゼーションを行った後、一晩ハイブリッドを行う。１ｘＳＳＣ（５０％ホルムアミド＋０．１％ツイーン２０を含む）で１５分間浸し、０．２ｘＳＳＣ（５０％ホルムアミド＋０．１％ツイーン２０を含む）で１０分間ずつ２回浸す。室温で１ｘＭＡＢ（０．１％ツイーン２０を含む）で１０分間ずつ２回処理する。ブロッキング緩衝液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で３７℃で３０分間ブロックした後、抗体（抗ＤＩＧ抗体）を加えて４℃で一晩放置する。溶出後、ＮＢＴ ／ ＢＣＩＰ顕色剤で処理して封入した後、顕微鏡で観察し、写真を撮影する。

【0028】

２ 結果
重度子宮腔癒着患者の子宮内膜組織において、上皮細胞および間質細胞におけるｍｉＲ－２１の発現はいずれも著しく減少した。そのうち、腺上皮細胞におけるｍｉＲ－２１発現が最も著しく減少した（図１）。

【0029】

（実施例２）子宮内膜上皮細胞の線維化に対するｍｉＲ－２１の影響

【0030】

１ 材料、試薬、装置

【0031】

１．１ 主な試薬
コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）、ＤＮＡａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）、上皮細胞培養培地（Ｇｉｂｃｏ）、血清（Ｇｉｂｃｏ）、Ｔｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、逆転写酵素（Ｔａｋａｒａ）、Ｑｐｃｒ酵素（Ｒｏｃｈｅ）。

【0032】

１．２ 主な機器
細胞インキュベーター、シェーカー、ｑＰＣＲ機器（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＣＲ機器（ＡＢＩ）

【0033】

１．３ 主な方法

【0034】

１．３．１ 原性子宮内膜細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）の分離と培養
子宮内膜組織を新しい６０ｍｍ培養皿に入れ、組織を目に塊状が見えないように切り刻む。続いて調製された消化液を加え、叩いて均一に混合し、３７℃のインキュベーターに５分間放置する。培養皿を取り出し、組織の消化状況を顕微鏡で観察する。ＤＮＡアーゼを４ ｍｇ ／ ｍＬの濃度で加え、消化を５分間続ける。消化された後の組織を叩き、組織懸濁液を４０μｍのふるいに滴下する。ふるいに残る組織をきれいな３５ｍｍ培養皿に移し、プロテアーゼとコラゲナーゼの混合物を２ｍｌ加え、十分に混合させた後、３７℃のインキュベーターに５分間入れておく。消化された後の組織腺体が単一の腺体に分散されているか否かを顕微鏡で観察した後、上皮細胞培地に加えて消化を終了させる。続いて腺体を培養皿に入れて培養させる。

【0035】

１．３．２ ＲＮＡの抽出およびリアルタイム蛍光定量ＰＣＲ
Ｔｒｉｚｏｌ法により全ＲＮＡを抽出する。ＲＮＡを１ ｕｇ取って逆転写させてｃＤＮＡを得る。続いて、２倍容量のＲＮａｓｅフリー水で希釈させた後、各サンプルに３つの複製ウェルを用いてＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法による蛍光定量ＰＣＲ検出を行った。ＧＡＰＤＨを内部基準としたΔΔＣＴ値を用いて異なる標的遺伝子の発現量を統計する。

【0036】

２ 結果
子宮内膜上皮細胞にｍｉＲ－２１を４８時間トランスフェクションさせた後、Ｅ－カドヘリンのｍＲＮＡレベルは著しく増加したが、ＦＮ１、α－ＳＭＡおよびＩ型コラーゲン遺伝子の発現は著しく低下した。これは、細胞線維化を抑制することを示す。

【0037】

（実施例３） ｍｉＲ－２１によるＮｐ６３誘発子宮内膜上皮細胞線維化の逆転

【0038】

１ 材料、試薬、装置

【0039】

１．１ 主な試薬
Ｅ－カドヘリン抗体（Ａｂｃａｍ）、Ｎ－カドヘリン抗体（Ａｂｃａｍ）、蛍光二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）、ＤＡＰＩ含有封入剤（Ａｂｃａｍ）、ＰＦＡ、抗体希釈液（Ｇｉｂｃｏ）、メタノール、ツイーン、ＰＢＳ。

【0040】

１．２ 主な機器
蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）、シェーカー

【0041】

１．３ 主な方法
細胞免疫蛍光法によりＥ－カドヘリンおよびＮ－カドヘリンの発現状況を検出する。子宮内膜上皮細胞のスライド後、Ｎｐ６３アデノウイルスを２４時間感染させる。続いてＭｉＲ－２１を４８時間トランスフェクトさせた後、細胞搭載のスライドを取り出す。１ｘＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した後、ＰＦＡで室温で１５分間固定し、１ｘＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄する。予め冷却したメタノールで５分間処理し、１ｘＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄する。室温で、２％ＢＳＡで１時間ブロックした後、Ｅ－カドヘリンおよびＮ－カドヘリン抗体を加え、４℃で一晩放置する。次に、ＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄し、余計な一次抗体を十分に洗浄する。最後の洗浄後にスライドの表面の水を吸い取る。蛍光二次抗体を滴下し、暗闇の中でインキュベーターで３７℃で混合物を３０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄し、最後の洗浄後にスライドの表面の水を吸い取る。クエンチング防止剤含有ＤＡＰＩ色素を滴下し、暗闇の中で蛍光顕微鏡で観察し、撮影する。

【0042】

２ 結果
Ｎｐ６３は、Ｅ－カドヘリンの発現を著しく抑制し、かつＮ－カドヘリンの発現上昇を促進させる。しかし、ｍｉＲ－２１は、Ｅ－カドヘリンの発現を促進し、かつ反転Ｎ－６３誘発Ｎ－カドヘリンの発現上昇を逆転させる。これは、ｍｉＲ－２１は線維化を逆転させる作用を有し、子宮腔癒着および薄い子宮内膜および／または子宮線維化による疾患の治療において応用でき、または子宮腔癒着、薄い子宮内膜および／または子宮線維化による疾患治療用薬の製造において応用できることを表明する。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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