特許 7045520 ポリミキシンＢ成分又はその塩、その製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-23

(45)【発行日】2022-03-31

(54)【発明の名称】ポリミキシンＢ成分又はその塩、その製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/62 20060101AFI20220324BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20220324BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20220324BHJP

【ＦＩ】

C07K7/62

A61K38/12

A61P31/04

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2021512913

(86)(22)【出願日】2020-11-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-01

(86)【国際出願番号】 CN2020131148

(87)【国際公開番号】W WO2021135732

(87)【国際公開日】2021-07-08

【審査請求日】2021-03-03

(31)【優先権主張番号】202010001700.8

(32)【優先日】2020-01-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】521092096

【氏名又は名称】上海上薬第一生化薬業有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＰＨ ＮＯ．１ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＆ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１３１７ Ｊｉａｎｃｈｕａｎ Ｒｏａｄ， Ｍｉｎｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２００２４０， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】張 含智

(72)【発明者】

【氏名】劉 浩

(72)【発明者】

【氏名】黄 臻輝

(72)【発明者】

【氏名】孫 寧

(72)【発明者】

【氏名】羅 文燕

(72)【発明者】

【氏名】丁 金国

(72)【発明者】

【氏名】劉 笑芬

(72)【発明者】

【氏名】卞 星晨

【審査官】西垣 歩美

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１０３７３５５０８（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５３３６７８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５０２８４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５３１３３９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

構造式が式（Ｉ）である化合物又はそのエナンチオマーであることを特徴とする、ポリミキシンＢ成分又はその塩。

【請求項2】

請求項１に記載のポリミキシンＢ成分又はその塩の製造方法であって、
前記ポリミキシンＢ成分の製造方法は、ポリミキシンＢ又はその塩から前記ポリミキシンＢ成分を分離して得るステップを含み、
前記ポリミキシンＢ成分の塩の製造方法は、前記ポリミキシンＢ成分と酸とを塩形成反応させるステップを含むことを特徴とする、製造方法。

【請求項3】

前記ポリミキシンＢ成分は、分取液体クロマトグラフィーによりポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られ、
前記分取液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィーカラムは、オクタデシル結合シリカゲルクロマトグラフィーカラムであり、
前記分取液体クロマトグラフィーの移動相は、０－１０％のギ酸水溶液－アセトニトリルであり、ギ酸水溶液の濃度は０ではなく、
前記ギ酸水溶液とアセトニトリルとの体積比は９９：１－５０：５０であり、
前記分取液体クロマトグラフィーの流速は５－２０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５０－１０００μＬ、検出波長は１９０－４００ｎｍであり、
前記分取液体クロマトグラフィーにより分離して得られた各留分をエレクトロスプレー質量分析により検出し、ポリミキシンＢ成分を収集し、
前記エレクトロスプレー質量分析は、正イオン走査モードを採用し、走査範囲ｍ／ｚが５０－３２００であることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

請求項１に記載のポリミキシンＢ成分又はその塩を含む医薬組成物であって、
前記医薬組成物は注射剤又は軟膏剤として存在することを特徴とする、医薬組成物。

【請求項5】

請求項１に記載のポリミキシンＢ成分又はその塩を含む抗菌薬であって、
前記抗菌薬は、グラム陰性菌に対する薬物であり、
前記グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）又は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であることを特徴とする、抗菌薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬物化学及び薬物分析化学分野に属し、特にポリミキシンＢ（ＰｏｌｙｍｙｘｉｎＢ）又はその塩、その製造方法及び使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ポリミキシンＢは、環状リポペプチド系抗生物質であり、グラム陰性桿菌に対して強力な殺菌作用を有する。臨床的には、主に多剤耐性グラム陰性桿菌感染症を治療する「最終防衛ライン」と考えられる硫酸ポリミキシンＢが使用されている。

【0003】

ポリミキシンＢは、発酵生成物であるため、構造が類似する一連の環状リポペプチドの混合物である。知られているポリミキシンＢの主要成分は、ポリミキシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ１－Ｉを含み、他の未知の成分もある。ポリミキシンＢ１、Ｂ２は有効成分であり、Ｂ３、Ｂ１－Ｉは主な不純物である。ポリミキシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びＢ１－Ｉは、骨格構造が同じであり、置換基が異なっている。上記ポリミキシンＢ１の構造式は図１に示される。その構成単位は、Ｎ末端脂肪アシル鎖（６'Ｒ－メチルオクタノイル）、１位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、２位のＬ－スレオニン、３位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、４位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、５位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、６位のＤ－フェニルアラニン、７位のＬ－ロイシン、８位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、９位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、１０位のＬ－スレオニンである。これらの構成単位は、順にアミド結合で結合され、４位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸と５位のＬ－α、γ－ジアミノ酪酸、１０位のＬ－スレオニンとはアミド結合で結合されてシクロヘプタペプチドを形成する。

【0004】

ポリミキシンＢが強力な殺菌作用を有するため、その化学成分の分離及び同定は非常に重要な意味を持っている。

【発明の概要】

【0005】

本発明が解決しようとする課題は、ポリミキシンＢ成分又はその塩、その製造方法及び使用を提供することである。本発明では、ポリミキシンＢから新しい成分が分離して同定される。この成分は強力な抗菌活性を有するため、潜在的な使用価値を有する。

【0006】

本発明は、以下の技術手段により上記問題を解決する。
本発明では、ポリミキシンＢ成分（以下、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１とも呼ばれる）又はその塩が提供される。上記ポリミキシンＢ成分は、順に結合された１位のα，γ－ジアミノ酪酸、２位のスレオニン、３位のα，γ－ジアミノ酪酸、４位のα，γ－ジアミノ酪酸、５位のα，γ－ジアミノ酪酸、６位のフェニルアラニン、７位のロイシン、８位のα，γ－ジアミノ酪酸、９位のα，γ－ジアミノ酪酸和１０位のスレオニンを含む。上記１０位のスレオニンと上記４位のα，γ－ジアミノ酪酸とはアミド結合で結合される。上記１位のα，γ－ジアミノ酪酸は６－メチルオクタ－２－エノイルに結合される。

【0007】

上記６－メチルオクタ－２－エノイルは、（Ｒ，Ｅ）－６－メチルオクタ－２－エノイル、（Ｒ，Ｚ）－６－メチルオクタ－２－エノイル、又はそれらのいずれか１つのエナンチオマーであってもよい。好ましくは、上記６－メチルオクタ－２－エノイルは（Ｒ，Ｅ）－６－メチルオクタ－２－エノイルである。

【0008】

本発明の好ましい実施形態において、上記１位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基は、６－メチルオクタ－２－エノイルに結合され、及び／又は
上記４位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基と、上記３位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基とは、アミド結合で結合され、上記４位のα，γ－ジアミノ酪酸のγ－アミノ基と、上記１０位のスレオニンのカルボキシル基とは、アミド結合で結合され、及び／又は
上記ポリミキシンＢ成分の塩は、ポリミキシンＢ成分の硫酸塩である。

【0009】

本発明の好ましい実施形態において、上記１位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基は、（Ｒ，Ｅ）－６－メチルオクタ－２－エノイル又は（Ｒ，Ｚ）－６－メチルオクタ－２－エノイルに結合される。本発明の好ましい実施形態において、上記ポリミキシンＢ成分は、構造式が式（Ｉ）である化合物又はそのエナンチオマーである。

【0010】

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリミキシンＢ成分は、ポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られる。当該技術分野で知られているように、本発明のポリミキシンＢ成分は、ポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られるため、上記ポリミキシンＢ又はその塩には、ポリミキシンＢ成分又はその塩が含まれるべきである。本発明では、好ましくは、硫酸ポリミキシンＢから上記ポリミキシンＢ成分を分離して得る。ここで、上記硫酸ポリミキシンＢは、上海上薬第一生化薬業有限公司から購入されたバッチ番号１５１２８０２の硫酸ポリミキシンＢであることが好ましい。

【0011】

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリミキシンＢ成分の相対分子量は１２００．７３－１２００．７５である。

【0012】

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリミキシンＢ成分は、分取液体クロマトグラフィーによりポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られる。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィーカラムはオクタデシル結合シリカゲルクロマトグラフィーカラムである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は０－１０％（Ｖ：Ｖ）のギ酸水溶液－アセトニトリルであり、ギ酸水溶液の濃度が０ではない。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は０．０１－１０％（Ｖ：Ｖ）のギ酸水溶液－アセトニトリルである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は０．１％（Ｖ：Ｖ）ギ酸水溶液－アセトニトリルである。好ましくは、上記ギ酸水溶液とアセトニトリルとの体積比は９９：１－５０：５０、８５：１５である。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの流速は５－２０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５０－１０００μＬ、検出波長は１９０－４００ｎｍである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの流速は１５ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５００μＬ、検出波長は２１５ｎｍである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーにより分離して得られた各留分をエレクトロスプレー質量分析により検出し、ポリミキシンＢ成分を収集する。好ましくは、上記エレクトロスプレー質量分析は、正イオン走査モードを採用する。走査範囲ｍ／ｚは５０－３２００、好ましくは１００－１２５０である。

【0013】

本発明では、ポリミキシンＢ成分又はその塩の製造方法がさらに提供される。
上記ポリミキシンＢ成分の製造方法は、ポリミキシンＢ又はその塩からポリミキシンＢ成分を分離して得るステップを含む。上記ポリミキシンＢ成分の分子式はＣ_５６Ｈ_９６Ｎ_１６Ｏ_１３である。
上記ポリミキシンＢ成分の塩の製造方法は、上記ポリミキシンＢ成分と酸とを塩形成反応させるステップを含む。

【0014】

上記ポリミキシンＢ成分の塩の製造方法において、上記酸は、上記ポリミキシンＢ成分と塩を形成することができれば、当該技術分野で一般的な酸であってもよく、好ましくは、硫酸である。上記ポリミキシンＢ成分の塩は、硫酸ポリミキシンＢ成分である。

【0015】

上記ポリミキシンＢ成分の製造方法において、好ましくは、上記ポリミキシンＢ成分は、分取液体クロマトグラフィーによりポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られる。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーのクロマトグラフィーカラムは、オクタデシル結合シリカゲルクロマトグラフィーカラムである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は０－１０％（Ｖ：Ｖ）のギ酸水溶液－アセトニトリルであり、ギ酸水溶液の濃度は０ではない。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は、０．０１－１０％（Ｖ：Ｖ）のギ酸水溶液－アセトニトリルである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの移動相は、０．１％（Ｖ：Ｖ）のギ酸水溶液－アセトニトリルである。好ましくは、上記ギ酸水溶液とアセトニトリルとの体積比は９９：１－５０：５０、好ましくは、８５：１５である。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの流速は５－２０ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５０－１０００μＬ、検出波長は１９０－４００ｎｍである。好ましくは、上記ポリミキシンＢ又はその塩の濃度は１０ｍｇ／ｍＬ（溶媒は水とアセトニトリルの混合物であり、体積比は水：アセトニトリル＝８０：２０）である。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーの流速は１５ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５００μＬ、検出波長は２１５ｎｍである。好ましくは、上記分取液体クロマトグラフィーから分離して得られた各留分をエレクトロスプレー質量分析により検出し、ポリミキシンＢ成分を収集する。好ましくは、上記エレクトロスプレー質量分析は、正イオン走査モードを採用し、走査範囲ｍ／ｚは５０－３２００、好ましくは、１００－１２５０である。

【0016】

上記ポリミキシンＢ成分の製造方法において、上記ポリミキシンＢ成分の構造は、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法及び核磁気共鳴により同定する。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法は、オクタデシル結合シリカゲルクロマトグラフィーカラムを使用する。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の移動相は、０－１０％（Ｖ：Ｖ）のトリフルオロ酢酸水溶液－アセトニトリルを使用し、上記トリフルオロ酢酸水溶液の濃度は０ではない。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の移動相は、０．０１－１０％（Ｖ：Ｖ）のトリフルオロ酢酸水溶液－アセトニトリルを使用する。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の移動相は、０．１％（Ｖ：Ｖ）トリフルオロ酢酸水溶液－アセトニトリルを使用する。好ましくは、上記トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルとの体積比は９９：１－５０：５０である。好ましくは、上記トリフルオロ酢酸水溶液とアセトニトリルとの体積比は８０：２０である。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の流速は０．１－２ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は０．５－１００μＬ、検出波長は１９０－４００ｎｍである。好ましくは、上記流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は２０μＬ、検出波長は２１５ｎｍである。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の質量分析におけるイオン化方式は、エレクトロスプレーイオン化又は大気圧イオン化を採用する。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法の質量分析計は、四重極飛行時間型質量分析計、線形若しくは三次元イオントラップ型質量分析計、トリプル四重極型質量分析計又は軌道イオントラップ質量分析計である。好ましくは、上記高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用法では、一次質量分析及び二次質量分析の情報に基づいて上記成分の構造を判断する。好ましくは、上記一次質量分析及び二次質量分析の走査範囲ｍ／ｚは５０－２０００である。好ましくは、上記二次質量分析の衝突エネルギーの設定範囲は、１０－３０ｅＶである。好ましくは、上記核磁気共鳴の走査周波数は、３００－８００ＭＨｚ、好ましくは５００ＭＨｚである。

【0017】

本発明では、上記製造方法により製造されるポリミキシンＢ成分又はその塩が提供される。

【0018】

本発明では、上記ポリミキシンＢ成分又はその塩を含む医薬組成物がさらに提供される。

【0019】

好ましくは、上記医薬組成物は、注射剤又は軟膏剤として存在する。

【0020】

本発明では、抗菌薬の製造における上記ポリミキシンＢ成分又はその塩の使用がさらに提供される。好ましくは、上記抗菌薬は、グラム陰性菌に対する薬物である。好ましくは、上記グラム陰性菌は、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）又は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。

【0021】

本発明では、ポリミキシンＢ成分又はその塩がさらに提供される。上記ポリミキシンＢ成分の分子式はＣ_５６Ｈ_９６Ｎ_１６Ｏ_１３である。上記ポリミキシンＢ成分は、ポリミキシンＢ又はその塩から分離して得ることができる。好ましくは、上記ポリミキシンＢ成分は、分取液体クロマトグラフィーによりポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られる。上記分取液体クロマトグラフィーによる分離方法及び条件は上記と同様である。

【0022】

本発明では、ポリミキシンＢ成分又はその塩がさらに提供される。上記ポリミキシンＢ成分の相対分子量は１２００．７３－１２００．７５である。上記ポリミキシンＢ成分は、ポリミキシンＢ又はその塩から分離して得ることができる。好ましくは、上記ポリミキシンＢ成分は、分取液体クロマトグラフィーによりポリミキシンＢ又はその塩から分離して得られる。上記分取液体クロマトグラフィーによる分離方法及び条件は上記と同様である。

【0023】

本発明は、以下の有益な効果を有する。
（１）本発明では、高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用によりポリミキシンＢの各成分の構造をオンラインで分析し、一次質量分析、二次質量分析及び核磁気共鳴の分析結果に基づいて二重結合化ポリミキシンＢ成分である２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１が初めて発見された。これは、ポリミキシンＢの研究に対して重要な意味を有する。

【0024】

（２）本発明に記載の２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１は、強力な抗菌活性を有し、潜在的な使用価値を有するとともに、ポリミキシンＢ中の２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の含有量の検出においてポリミキシンＢの質量を制御することに使用され得る。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】ポリミキシンＢ１の構造式である。

【図1】２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の構造式である。

【図3a】ポリミキシンＢ１の一次質量分析図である。

【図3b】ポリミキシンＢ１の一次質量分析の局所拡大図である。

【図4】ポリミキシンＢ１の二次質量分析図である。

【図5a】２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の一次質量分析図である。

【図5b】２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の一次質量分析の局所拡大図である。

【図6】２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の二次質量分析図である。

【図7】ポリミキシンＢ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。

【図8】２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されない。

【0027】

本発明に記載の「１位」、「２位」......「１０位」とは、アミノ酸の結合順序であり、図１における数字に対応する。

【0028】

本発明に記載の「α－アミノ基」、「γ－アミノ基」とは、それぞれα－炭素原子及びγ－炭素原子に結合されたアミノ基を指す。

【0029】

本発明の硫酸ポリミキシンＢについては、実施例において上海上薬第一生化薬業有限公司の硫酸ポリミキシンＢが使用されているが、他の硫酸ポリミキシンＢ対照品及び製剤が使用されてもよく、本発明の分離方法によりポリミキシンＢ成分を分離できればよい。

【0030】

以下の実施例で使用されるアシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ１９６０６（標準菌株）は市販菌株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入された商品番号：２２０８［８１，ＤＳＭ ６９７４］の菌株である。

【0031】

以下の実施例で使用される緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３（標準菌株）は市販菌株であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入された商品番号：Ｂｏｓｔｏｎ ４１５０１の菌株である。

【0032】

実施例１
一、装置と試薬
Ｗａｔｅｒｓ自動精製システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）、凍結乾燥機（米国ＬＡＢＣＯＮＣＯ型真空凍結乾燥機）、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０型高速液体クロマトグラフ－６５５０ＱＴＯＦ－ＭＳ（美国Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）、核磁気共鳴装置（Ｂｒｕｋｅｒ，３００ＭＨｚ）。

【0033】

硫酸ポリミキシンＢ（上海上薬第一生化薬業有限公司、バッチ番号：１５１２８０２）。

【0034】

二、分取液体クロマトグラフィーによる精製
本発明では、Ｗａｔｅｒｓ自動精製システムを用いて製造した。硫酸ポリミキシンＢの濃度は１０ｍｇ／ｍＬ（溶媒は水とアセトニトリルの混合物である。体積比は水：アセトニトリル＝８０：２０である）であった。カラムはＣ１８クロマトグラフィーカラム（１９×１００ｍｍ，５μｍ）、移動相は０．１ｖｏｌ％のギ酸水溶液－アセトニトリル（８５：１５，ｖ：ｖ）、流速は１５ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は５００μＬ、検出波長は２１５ｎｍであった。分取液体クロマトグラフィーにより分離して得られた各留分をエレクトロスプレー質量分析により検出し、ポリミキシンＢ成分を収集した。エレクトロスプレー質量分析は、正イオン走査モード、シングル四重極型質量分析計を採用し、走査範囲ｍ／ｚは１００－１２５０、コーン電圧は３５Ｖであった。ポリミキシンＢ成分（ｍ／ｚ ６０１．４，［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ ）及びポリミキシンＢ１（ｍ／ｚ ６０２．２，［Ｍ＋２Ｈ］^２＋）の留分を収集した。２００回収集し、それぞれ上記２種類の留分を合わせ、ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し、それぞれ約３－４ｍＬの水を加え、ガラス瓶に移し、凍結乾燥機に置いて凍結乾燥させた。凍結乾燥機のコールドトラップ温度を－８０℃、真空度を０ｍｂａｒに設定し、２４時間後に、瓶に白色シート状でフワフワ状の固体が出現した後、凍結乾燥を停止させた。

【0035】

三、ポリミキシンＢ１及びポリミキシンＢ成分の質量分析データ
約２ｍｇの精製成分をそれぞれ秤量し、ポリミキシンＢ１及び上記ポリミキシンＢ成分にそれぞれ１ｍＬ溶媒（水とアセトニトリルの体積比が８０：２０である）を加えて溶解した後、高速液体クロマトグラフィー－エレクトロスプレーイオン化－四重極飛行時間型質量分析計により構造を同定した。分析条件は以下の通りであった。カラムはＣ１８クロマトグラフィーカラム（４．６×２５０ｍｍ，５μｍ）、移動相は０．１ｖｏｌ％のトリフルオロ酢酸水溶液－アセトニトリル（８０：２０，ｖ：ｖ）、流速は１ｍＬ／ｍｉｎ、注入量は２０μＬ、検出波長は２１５ｎｍ、柱温は５０℃であった。正イオン走査モードにより一次質量分析図及び二次質量分析図を採取し、注入量は５μＬ、採取範囲ｍ／ｚは５０－１７００、二次質量分析衝突エネルギーは１０－３０ｅＶであった。

【0036】

ポリミキシンＢ１の一次質量分析図を図３ａ及び図３ｂに示す。その準分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚは１２０３．７６１４、［Ｍ＋Ｎａ］^＋のｍ／ｚは１２２５．７４２９であった。溶液状態又はエレクトロスプレー過程において、ポリミキシンＢ１は２つのＨ^＋に結合して主に［Ｍ＋２Ｈ］^２＋（ｍ／ｚ，６０２．３８４８）として存在しやすい。［Ｍ＋２Ｈ］^２＋を前駆体イオンとしてフラグメンテーション電圧を調整してポリミキシンＢ１の二次質量分析図を得た（図４）。特徴的なイオンｍ／ｚ９６３．５７４５，８６３．５１１７，７６２．４６３８，６６２．３９９４，４８２．２９１９，３６１．２２４３，２４１．１９２５及び１０１．０７１９に基づいて、ポリミキシンＢ１のアミノ酸結合順序を推測することができる。以上の特徴的なイオンと上記ポリミキシンＢ成分の特徴的なイオンを比較することで構造の差異を分析した。

【0037】

上記ポリミキシンＢ成分の一次質量分析図を図５ａ及び図５ｂに示す。その準分子イオンピーク［Ｍ＋Ｈ］^＋のｍ／ｚは１２０１．７４５１、［Ｍ＋Ｎａ］^＋のｍ／ｚは１２２３．７２７１であり、２つのプロトンに結合した後の［Ｍ＋２Ｈ］^２＋のｍ／ｚは６０１．３７７１であった。［Ｍ＋２Ｈ］^２＋を前駆体イオンとしてフラグメンテーション電圧を調整してポリミキシンＢ成分の二次質量分析図を得た（図６）。特徴的なイオンはｍ／ｚ９６３．５７４２，８６３．５１０２，７６２．４６２８，６６２．３９８５，４８２．２９１３，３６１．２２３７，２３９．１７６１及び１０１．０７１４であった。一次質量分析及び二次質量分析の情報に基づいて上記成分の構造を判断し、ポリミキシンＢ１に比べ、ｍ／ｚ２３９．１７６１はｍ／ｚ２４１．１９２５よりも２小さく、二重結合化が発生した位置がＮ末端の脂肪アシル鎖にあることを推測した。従って、上記ポリミキシンＢ成分は２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１であった。

【0038】

上記質量分析データにより、上記２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１は、順に結合された１位のα，γ－ジアミノ酪酸、２位のスレオニン、３位のα，γ－ジアミノ酪酸、４位のα，γ－ジアミノ酪酸、５位のα，γ－ジアミノ酪酸、６位のフェニルアラニン、７位のロイシン、８位のα，γ－ジアミノ酪酸、９位のα，γ－ジアミノ酪酸及び１０位のスレオニンを含み、上記１０位のスレオニンと上記４位のα，γ－ジアミノ酪酸とがアミド結合で結合され、上記１位のα，γ－ジアミノ酪酸が６－メチルオクタ－２－エノイルに結合されることが証明された。上記ポリミキシンＢ成分の分子式はＣ_５６Ｈ_９６Ｎ_１６Ｏ_１３であった。

【0039】

既存の薬局方及び文献データ（欧州薬局方９．７版，Ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ Ｂ ｓｕｌｆａｔｅ，ｐａｇｅ：６６６８－６６６９；ＯＲＷＡＪ Ａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００１，９１２（２）：３６９－３７３；ＧＯＶＡＥＲＴＳ Ｃ，ｅｔ ａｌ，ＪＰｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ，２００２，８（２）：４５－５５）に基づいて、１位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基が（Ｒ，Ｅ）－６－メチルオクタ－２－エノイル、（Ｒ，Ｚ）－６－メチルオクタ－２－エノイル、又はそれらのいずれか１つのエナンチオマーに結合され、１位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が２位のスレオニンのアミノ基に結合され、２位のスレオニンのカルボキシル基が３位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基に結合され、３位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が４位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基に結合され、４位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が５位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基に結合され、５位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が６位のフェニルアラニンのアミノ基に結合され、６位のフェニルアラニンのカルボキシル基が７位のロイシンのアミノ基に結合され、７位のロイシンのカルボキシル基が８位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基に結合され、８位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が９位のα，γ－ジアミノ酪酸のα－アミノ基に結合され、９位のα，γ－ジアミノ酪酸のカルボキシル基が１０位のスレオニンのアミノ基に結合されることが判断された。上記４位のα，γ－ジアミノ酪酸のγ－アミノ基と上記１０位のスレオニンのカルボキシル基とはアミド結合で結合されてシクロヘプタペプチドを形成した。

【0040】

四、ポリミキシンＢ１及び２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の核磁気共鳴データ
約２ｍｇの精製成分をそれぞれ秤量した。ポリミキシンＢ１及び２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１に重水素水を加えて溶解した後、核磁気共鳴管に移し、核磁気共鳴装置により走査して１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを得た。ポリミキシンＢ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図７に示す。２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを図８に示す。両者の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを比べて、化学シフト６－７には差異があった。化学シフト６．０５（ｄ，Ｊ＝１５．４Ｈｚ，１Ｈ）及び６．９１（ｄｔ，Ｊ＝１５．４，７．６Ｈｚ，１Ｈ）は二重結合（２'水素と３'水素）の特徴的なピークであり、かつシス二重結合のカップリング定数が約１０．９であるため、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１のカップリング定数Ｊ＝１５．４Ｈｚからトランス二重結合であると推測した。カルボニル基と共役二重結合を形成する水素の化学シフトが６－７にシフトし、単一の二重結合の場合、化学シフトが５－６の範囲内であるので、低磁場側の化学シフトから、二重結合とカルボニル基が共役構造を形成したと判断した。

【0041】

上記薬局方及び文献データに基づいて、この成分のキラルカーボン構成を判断した。上記ポリミキシンＢ成分の構造を図２に示す。

【0042】

五、ポリミキシンＢ１及び２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の抗菌活性
臨床研究所標準研究所（Ｃｌｉｎｉｃａｌ＆Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣＬＳＩ）の規定に従って、微量ブロス希釈法によりポリミキシンＢ１（ＰＭＢ１）と２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１のアシネトバクター・バウマニに対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ，ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を測定した。ポリミキシンＢ１は対照薬であり、９６ウェルプレートにアシネトバクター・バウマニＡＴＣＣ１９６０６（標準菌株）１０^６ＣＦＵ／ｍＬの細菌を接種し、ポリミキシンＢ１又は２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の溶液を加え、溶液の最終濃度をそれぞれ０．１２５、０．２５、０．５、１、２、４、８ｍｇ／Ｌにし、３５±２℃で１８～２４時間培養した後、濁度を観察した。溶液が澄むようになる最小濃度をＭＩＣとした。結果を表１に示す。

【0043】

【表1】

【0044】

結果は、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１がアシネトバクター・バウマニ標準菌株ＡＴＣＣ１９６０６に対して抗菌活性を有し、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１のＭＩＣがＰＭＢ１より１つの希釈度低く、抗菌活性が高い（この方法の誤差許容範囲は１つの希釈度である）ことを示している。

【0045】

ＣＬＳＩ規定に従って、微量ブロス希釈法によりポリミキシンＢ１及び２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の緑膿菌に対するＭＩＣを測定した。ポリミキシンＢ１は対照薬であった。９６ウェルプレートに緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３（標準菌株）１０^６ＣＦＵ／ｍＬの細菌を接種し、ポリミキシンＢ１又は２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の溶液を加え、溶液の最終濃度をそれぞれ０．１２５、０．２５、０．５、１、２、４、８ｍｇ／Ｌにし、３５±２℃で１８～２４時間培養した後、濁度を観察した。溶液が澄むようになる最小濃度をＭＩＣとした。結果を表２に示す。

【0046】

【表2】

【0047】

結果は、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１が緑膿菌標準菌株ＡＴＣＣ２７８５３に対して抗菌活性を有し、両化合物のＭＩＣが同じであり、２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１の抗菌活性がポリミキシンＢ１に相当することを示している。

【0048】

以上のことから、本発明では、新しいポリミキシンＢ成分である２'，３'－デヒドロポリミキシンＢ１が発見され、分取液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー／質量分析併用及び核磁気共鳴技術などの方法によりその構造が正確に同定された。この新しい二重結合化成分は、優れた抗菌活性及び生物活性を有し、潜在的な使用価値を有する。

【0049】

なお、以上の実施例は本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。当業者が本発明の上記内容に基づいて行う非本質的な改良及び調整はいずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図6】

【図7】

【図8】