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▶ アミカス セラピューティックス インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-24
(45)【発行日】2022-04-01
(54)【発明の名称】高Ｍ６Ｐ組換えタンパク質の選択方法
(51)【国際特許分類】
C12N 9/26 20060101AFI20220325BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20220325BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20220325BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20220325BHJP
A61P 3/08 20060101ALI20220325BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20220325BHJP
A61K 31/7008 20060101ALI20220325BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20220325BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20220325BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20220325BHJP
C07K 1/36 20060101ALI20220325BHJP
【ＦＩ】
C12N9/26 Z ZNA
C12N15/56
C12N5/10
A61K38/47
A61P3/08
A61K45/00
A61K31/7008
A61P43/00 121
C07K1/18
C07K1/22
C07K1/36
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2018551350
(86)(22)【出願日】2017-03-30
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-04-11
(86)【国際出願番号】 US2017024981
(87)【国際公開番号】W WO2017173059
(87)【国際公開日】2017-10-05
【審査請求日】2020-03-30
(31)【優先権主張番号】62/315,400
(32)【優先日】2016-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/457,584
(32)【優先日】2017-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】15/473,994
(32)【優先日】2017-03-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507170099
【氏名又は名称】アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】ドゥ， ハン ヴィー．
(72)【発明者】
【氏名】ゴッツチョール， ラッセル
【審査官】福澤 洋光
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１５－５１６１４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００８－５４５６５７（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１１－５１４１５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００２－５３１５８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】Biochemistry and Molecular Biology International，1997年，Vol.43, No.3，pp.613-623
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
精製された組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）の生成方法であって、バイオリアクター内で、ｒｈＧＡＡを分泌する宿主細胞を培養すること；
前記バイオリアクターから培地を除去すること；
前記培地をろ過して濾液を提供すること；
前記濾液をアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムにロードして前記ｒｈＧＡＡを捕捉すること；
前記ＡＥＸカラムから前記ｒｈＧＡＡを溶出すること；
前記ＡＥＸカラムから溶出したｒｈＧＡＡを固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムにロードすること；
前記ＩＭＡＣカラムから前記ｒｈＧＡＡを溶出すること；
を含み、
精製されたｒｈＧＡＡは、配列番号２と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項2】
精製されたｒｈＧＡＡは、第１の潜在的なＮ－グリコシル化部位、第２の潜在的なＮ－グリコシル化部位、第３の潜在的なＮ－グリコシル化部位、第４の潜在的なＮ－グリコシル化部位、第５の潜在的なＮ－グリコシル化部位、第６の潜在的なＮ－グリコシル化部位、および第７の潜在的なＮ－グリコシル化部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＩＭＡＣカラムから溶出したｒｈＧＡＡを第３のクロマトグラフィーカラムにロードすること；および前記第３のクロマトグラフィーカラムからｒｈＧＡＡを溶出すること、
をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記第３のクロマトグラフィーカラムが、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記培地のろ過が、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）および接線流ろ過（ＴＦＦ）から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＡＥＸカラムから溶出したｒｈＧＡＡ、前記ＩＭＡＣカラムから溶出したｒｈＧＡＡおよび前記第３のクロマトグラフィーカラムから溶出したｒｈＧＡＡの１つ以上においてウイルスを不活性化することをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＩＭＡＣカラムから溶出したｒｈＧＡＡまたは前記第３のクロマトグラフィーカラムから溶出したｒｈＧＡＡをろ過してろ過生成物を提供することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項8】
前記ろ過生成物を凍結乾燥することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
（ｉ）精製されたｒｈＧＡＡの少なくとも９０％が、陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合している、または（ｉｉ）精製されたｒｈＧＡＡの少なくとも９０％が、モノ－マンノース－６－リン酸（モノ－Ｍ６Ｐ）またはビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を保有するＮ－グリカンを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法によって作製された、精製されたｒｈＧＡＡ。
【請求項12】
請求項１１に記載の精製されたｒｈＧＡＡおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項13】
ポンペ病を処置するための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項14】
酸性α－グルコシダーゼのための薬理学的シャペロンが、前記精製されたｒｈＧＡＡを含む前記医薬組成物の投与の４時間以内に投与される、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記薬理学的シャペロンが、１－デオキシノジリマイシンおよびＮ－ブチル－デオキシノジリマイシンから選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記薬理学的シャペロンが前記精製されたｒｈＧＡＡと共製剤化される、請求項１４または１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の原理および実施形態は、一般に、組換えタンパク質、特に高含有量のマンノース－６－リン酸を有するリソソーム酵素の製造に関する。
【背景技術】
【0002】
ソソーム蓄積症は、リソソームと呼ばれる細胞内区画内の細胞スフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、またはムコ多糖類の蓄積を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患群である。これらの疾患を有する個体は、これらの物質の１つ以上の加水分解を触媒するのに欠陥がある酵素をコードする変異遺伝子を保有し、それらの物質はリソソームに蓄積する。例えば、ポンペ病は、酸マルターゼ欠乏症またはＩＩ型糖源蓄積症としても知られ、いくつかのリソソーム蓄積症の１つである。リソソーム障害の他の例には、ゴーシェ病、ＧＭ１－ガングリオシドーシス、フコシドーシス、ムコ多糖症、ハーラー症候群、ニーマン－ピックＡおよびＢ病、およびファブリー病が含まれる。ポンペ病はまた、神経筋疾患または代謝性ミオパチーに分類される。
【0003】
ポンペ病は、約４０，０００出生で１人発生すると推定されており、酵素リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）（一般に酸性α－グルコシダーゼとしても知られる）をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異によって引き起こされる。酸性α－グルコシダーゼは、リソソーム内のグルコースへのその加水分解を触媒することにより、動物におけるグルコースの主要な貯蔵形態である分枝多糖、グリコーゲンの代謝に関与する。ポンペ病に罹患している個体は、不活性であるか、または活性が低下した変異体である欠損酸性α－グルコシダーゼを産生するため、グリコーゲン分解はゆっくりと起こるか、または全く起こらず、グリコーゲンは様々な組織、特に線条筋において、リソソームに蓄積し、進行性の筋力低下および呼吸器不全を含む広範囲の臨床症状を生じる。心臓および骨格筋などの組織は特に影響を受ける。
【0004】
ポンペ病は、酵素欠乏症の程度、発症の重症度および年齢によって大きく異なり、その多くが様々な重症度の疾患症状を引き起こす、ＧＡＡ遺伝子の５００以上の異なる突然変異が同定されている。この疾患は、早期発症または乳児期発症および後期発症という広範なタイプに分類されている。より早期の発症およびより低い酵素活性は、一般に、より重度の臨床経過に関連する。小児ポンペ病は最も重篤であり、完全またはほぼ完全な酸性α－グルコシダーゼ欠乏に起因し、筋緊張の重度な欠如、衰弱、肝臓および心臓の肥大、および心筋症を含む症状を呈する。舌が肥大して突出することがあり、嚥下が困難になることがある。ほとんどの患児は、２歳までに呼吸器または心臓の合併症で死亡する。後期発症のポンペ病は、１２ヵ月以上のいずれの年齢でも存在し得、心臓病の関与がなく、短期予後がより良好であることを特徴とする。症状は進行性の骨格筋機能不全に関連し、体幹、近位下肢および隔膜における一般的な筋力低下および呼吸筋の消耗を伴う。成人患者では、重大な症状または運動制限がない場合もある。予後は、一般に、呼吸筋の関与の程度に依存する。ポンペ病に罹患した対象の大部分は、徐々に車椅子の使用および補助換気を必要とする身体的衰弱が進行し、多くの場合に呼吸不全のために生じる早期死亡を伴う。
【0005】
ポンペ病の最近の処置の選択肢には、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）による酵素補充療法（ＥＲＴ）が含まれる。従来のｒｈＧＡＡ製品は、Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．社のアルグルコシダーゼアルファ、ミオザイム（登録商標）またはルミザイム（登録商標）の名称で知られている。ＥＲＴは、患者の生涯にわたって必要とされる慢性処置であり、静脈内注入によって置換酵素を投与することを含む。次いで、補充酵素は循環中で輸送され、細胞内のリソソームに入り、そこで蓄積されたグリコーゲンを分解するよう作用し、内因性欠損突然変異酵素の欠損した活性を補い、そうして病気の症状を緩和する。乳児期発症ポンペ病患者では、アルグルコシダーゼアルファによる処置は、過去のコントロールと比較して生存率を有意に改善することが示されており、後期発症ポンペ病では、アルグルコシダーゼアルファは、プラセボと比較して、６分間歩行試験（６ＭＷＴ）および努力性肺活量（ＦＶＣ）の結果において、控えめに言っても統計的に有意な効果を有することが示されてきた。
【0006】
しかしながら、大部分の対象は、アルグルコシダーゼアルファによる処置を受けている間、安定を維持するか、または悪化し続ける。アルグルコシダーゼアルファによるＥＲＴの明らかに最適下限の効果の理由は不明であるが、根底にある筋肉病変の進行性の性質、または現在のＥＲＴの組織標的化の不十分さに部分的に起因する可能性がある。例えば、注入された酵素は、血漿のｐＨ（約ｐＨ７．４）を含む中性ｐＨで安定でなく、循環中で不可逆的に不活性化され得る。さらに、注入されたアルグルコシダーゼアルファは、おそらくマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基による不十分なグリコシル化のために、重要な疾患関連筋肉での不十分な取り込みを示す。そのような残基は、細胞表面で陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、酵素が細胞内およびリソソーム内に入ることを可能にする。したがって、十分な量の活性酵素がリソソームに到達するように、高用量の酵素が効果的な処置のために必要とされる場合があり、これにより治療に費用がかかり、時間がかかる。
【0007】
ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。存在するＮ－結合型オリゴ糖（Ｎ－グリカン）のタイプでは、それぞれのグリコシル化部位が不均一であるため、ｒｈＧＡＡは、Ｍ６Ｐ受容体および他の炭水化物受容体に対して様々な結合親和性を有するタンパク質とＮ－グリカンとの複合混合物からなる。１つのＭ６Ｐ基（モノ－Ｍ６Ｐ）を有するＮ－グリカンを有する高マンノースを含むｒｈＧＡＡは、低（約６，０００ｎＭ）親和性でＣＩＭＰＲに結合する一方、同じＮ－グリカン（ビス－Ｍ６Ｐ）上に２つのＭ６Ｐ基を含むｒｈＧＡＡは、高い（約２ｎＭ）親和性で結合する。非リン酸化、モノ－Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐグリカンの代表的な構造を図１Ａに示す。マンノース－６－Ｐ基を図１Ｂに示す。リソソーム内に入ると、ｒｈＧＡＡは蓄積されたグリコーゲンを酵素的に分解することができる。しかしながら、従来のｒｈＧＡＡは、Ｍ６ＰおよびビスＭ６Ｐを有するグリカンの総レベルが低く、したがって、標的筋細胞は、リソソームへのｒｈＧＡＡの送達が劣る結果となる。ｒｈＧＡＡの生産的薬物標的化を図２Ａに示す。これらの従来の生成物中のｒｈＧＡＡ分子の大部分は、リン酸化されたＮ－グリカンを有さず、それによりＣＩＭＰＲに対する親和性が欠如している。非リン酸化高マンノースグリカンはまた、ＥＲＴの非生産的クリアランスをもたらすマンノース受容体によって除去され得る（図２Ｂ）。
【0008】
ガラクトースとシアル酸を含む他のタイプのＮ－グリカン、複合糖質もｒｈＧＡＡに存在する。複合Ｎ－グリカンはリン酸化されていないので、それらはＣＩＭＰＲに対する親和性を有しない。しかし、暴露されたガラクトース残基を有する複合型Ｎ－グリカンは、肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対して中程度から高度の親和性を有し、ｒｈＧＡＡの迅速な非生産的クリアランスをもたらす（図２Ｂ）。
【0009】
ミオザイム（登録商標）、ルミザイム（登録商標）またはアルグルコシダーゼアルファなどの従来のｒｈＧＡＡを作製するために使用される現在の製造方法は、細胞炭水化物の処理が本来複雑で操作が極めて困難であるため、Ｍ６Ｐまたはｂｉｓ－Ｍ６Ｐの含有量を有意に増加させなかった。したがって、ｒｈＧＡＡの新しい製造、捕捉および精製方法など、ポンペ病の処置のための酵素補充療法のさらなる改善が求められている。
【0010】
同様に、他のリソソーム酵素などのリソソームに標的化される他の組換えタンパク質もまた、ＣＩＭＰＲに結合する。しかしながら、リソソームを標的とする他の従来の組換えタンパク質を作製するために使用される現在の製造方法は、Ｍ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐの含有量が高い組換えタンパク質を提供しない。したがって、これらの他の組換えタンパク質の製造、捕捉および精製方法においても、さらなる改善が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の１つの態様は、組換えヒトリソソームタンパク質の生成方法に関する。この態様の様々な実施形態において、本方法は、組換えヒトリソソームタンパク質を分泌するバイオリアクター内で宿主細胞を培養すること、前記バイオリアクターから培地を除去すること、前記培地をろ過して濾液を提供すること、前記濾液をアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラムに充填して前記リソソームタンパク質を捕捉すること、および前記ＡＥＸカラムから第１のタンパク質生成物を溶出すること、を含む。
【0012】
１つ以上の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質は組換えヒトα－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）である。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡは、配列番号２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0013】
１つ以上の実施形態において、本方法は、第１のタンパク質生成物をクロマトグラフィーカラムに充填し、第２のタンパク質生成物をカラムから溶出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、カラムは、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムである。
【0014】
１つ以上の実施形態において、本方法は、第２のタンパク質生成物をクロマトグラフィーカラムに充填し、第３のタンパク質生成物をカラムから溶出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第３のクロマトグラフィーカラムは、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムおよびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムから選択される。
【0015】
１つ以上の実施形態において、培地のろ過は、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）および接線流ろ過（ＴＦＦ）から選択される。
【0016】
１つ以上の実施形態において、本方法は、第１のタンパク質生成物、第２のタンパク質生成物および第３のタンパク質生成物の１つ以上においてウイルスを不活性化することをさらに含む。
【0017】
１つ以上の実施形態において、本方法は、第２のタンパク質生成物または第３のタンパク質生成物をろ過してろ過生成物を提供すること、およびろ過生成物をバイアルに充填することをさらに含む。１つ以上の実施形態において、この方法は、ろ過生成物を凍結乾燥することをさらに含む。
【0018】
１つ以上の実施形態において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００またはＡＴＢ－２００－Ｘ５－１４またはその継代培養物を含む。
【0019】
１つ以上の実施形態において、（ｉ）前記第１のタンパク質生成物または前記第２のタンパク質生成物または前記第３のタンパク質生成物の少なくとも９０％は、陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合している、または（ｉｉ）前記第１のタンパク質生成物または前記第２のタンパク質生成物または前記第３のタンパク質生成物の少なくとも９０％は、モノ－マンノース－６－リン酸（モノ－Ｍ６Ｐ）またはビス－マンノース－６－リン酸（ビス－Ｍ６Ｐ）を保有するＮ－グリカンを含有する。
【0020】
１つ以上の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質は、７つの潜在的なＮ－グルコシル化部位を含むｒｈＧＡＡであって、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも５０％は、第１の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第２の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、ｒｈＧＡＡの分子の少なくとも３０％は、第４の部位に２つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有し、およびｒｈＧＡＡの分子の少なくとも２０％は、第４の部位に１つのマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含有する。
【0021】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の方法のいずれかによって作製された組換えタンパク質生成物に関する。
【0022】
本発明の別の態様は、組換えタンパク質生成物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物に関する。
【0023】
本発明のさらに別の態様は、医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、リソソーム蓄積症を処置するための方法に関する。
【0024】
１つ以上の実施形態において、リソソーム蓄積症はポンペ病であり、組換えタンパク質はｒｈＧＡＡである。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡ生成物を含む医薬組成物の投与から４時間以内に、患者にα－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンを共投与する。いくつかの実施形態において、薬理学的シャペロンは、１－デオキシノジリマイシンおよびＮ－ブチル－デオキシノジリマイシンから選択される。いくつかの実施形態において、薬理学的シャペロンはｒｈＧＡＡ生成物と共製剤される。
【0025】
様々な実施形態を以下に列挙する。以下に列挙される実施形態は、以下に列挙されるものだけでなく、本発明の範囲に従った他の適切な組み合わせで組み合わせられ得ることが理解されよう。
【0026】
本発明のさらなる特徴は、以下の明細書記載および添付図面から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1A】非リン酸化高マンノースグリカン、モノ－Ｍ６Ｐグリカン、およびビス－Ｍ６Ｐグリカンを示す。
【図1B】Ｍ６Ｐ基の化学構造を示す。
【図2A】標的組織（例えば、ポンペ病を有する対象の筋肉組織）に対するＭ６Ｐを有するグリカンを介したｒｈＧＡＡの生産的標的化を記載する。
【図2B】非標的組織（例えば、肝臓および脾臓）への非生産的薬物クリアランス、または非標的組織への非Ｍ６Ｐグリカンの結合によって説明される。
【図3A】ＣＩＭＰＲ受容体（ＩＧＦ２受容体としても知られる）およびこの受容体のドメインをグラフで示す。
【図3B】ＣＩＭＰＲに対するビス－およびモノ－Ｍ６Ｐを有するグリカンの結合親和性（ナノモル）、高マンノース型グリカンのマンノース受容体への結合親和性、およびアシアロ糖タンパク質受容体に対する脱シアル化複合グリカンの結合親和性を示す表である。Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンを有するＲｈＧＡＡは、筋肉上のＣＩＭＰＲに生産的に結合し得る。
【図4A】それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図４Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図4B】それぞれルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）のＣＩＭＰＲアフィニティークロマトグラフィーの結果を示すグラフである。破線はＭ６Ｐ溶出勾配を示す。Ｍ６Ｐによる溶出により、Ｍ６Ｐ含有グリカンを介して結合したＧＡＡ分子がＣＩＭＰＲに置換された。図４Ａに示すように、ルミザイム（登録商標）におけるＧＡＡ活性の７８％がＭ６Ｐの添加前に溶出した。図４Ｂは、ＧＡＡミオザイム（登録商標）活性の７３％がＭ６Ｐの添加前に溶出したことを示す。ルミザイム（登録商標）またはミオザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの２２％または２７％のみがＭ６Ｐで溶出された。これらの図は、これら２つの従来のｒｈＧＡＡ製品における大部分のｒｈＧＡＡが、標的筋肉組織のＣＩＭＰＲを標的化するのに必要なＭ６Ｐを有するグリカンを欠いていることを示す。
【図5】ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物で形質転換した。
【図6】組換えリソソームタンパク質の製造、捕捉および精製のための例示的方法の概略図である。
【図7A】それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図７Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図7B】それぞれミオザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。図７Ｂから明らかなように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ中のｒｈＧＡＡの約７０％はＭ６Ｐを含んでいた。
【図8】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉を伴うおよび伴わないＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図9】ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのＰｏｌｙｗａｘ溶出プロファイルを示すグラフである。
【図10】ＢＰ－ｒｈＧＡＡ、ＡＴＢ２００－１およびＡＴＢ２００－２として同定されたＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの３つの異なる調製物と比較した、ルミザイム（登録商標）のＮ－グリカン構造の概要を示す表である。
【図11A】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11B】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11C】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11D】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11E】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11F】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11G】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図11H】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの部位特異的Ｎ－グリコシル化分析の結果を示す。
【図13B】図１３Ｂは、様々なＧＡＡ濃度でポンペ病を有する対象由来の線維芽細胞内のＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ活性（左のトレース）とルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡ活性（右のトレース）とを比較する表である。
【図14A】図１４Ａは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス心筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図14B】図１４Ｂは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス四頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図14C】図１４Ｃは、溶媒（ネガティブコントロール）、２０ｍｇ／ｍｌのアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））、または５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と接触させた後の、マウス三頭筋における組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの用量に対するグリコーゲンの量を示すグラフである。
【図15】ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡとシャペロンミグルスタットとの組み合わせが、ミグルスタットシャペロンを含まないルミザイム（登録商標）またはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡによる処置よりも、ＧＡＡノックアウトマウスにおいて著しく良好なグリコーゲンクリアランスを提供したことを示す表である。
【図16】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓、隔膜およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、リソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ－１）のレベルを示す。
【図17】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の心臓およびヒラメ筋の一連の電子顕微鏡写真であり、過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することによりグリコーゲンレベルを示す。
【図18】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（１０００ｘ）であり、メチレンブルーで染色して空胞を示した（矢印で示す）。
【図19】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の四頭筋の一連の電子顕微鏡写真（４０ｘ）であり、これは、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを示す。
【図20】陰イオン交換（ＡＥＸ）カラムでの捕捉および精製前後の組換えα－ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα－Ｇａｌ Ａ）酵素のＣＩＭＰＲ親和性クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。
【図21A】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図21B】ミグルスタットの存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスのワイヤハンドおよび握力筋肉データを示すグラフである。
【図22A】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22B】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22C】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22D】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22E】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22F】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図22G】ミグルスタットの存在下および非存在下で、溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウスからの四頭筋、三頭筋および心臓細胞におけるグリコーゲンレベルを示すグラフである。
【図23】ミグルスタットの存在下および非存在下で溶媒、アルグルコシダーゼアルファおよびＡＴＢ２００で処置した野生型およびＧａａノックアウトマウス由来の外側広筋（ＶＬ）の筋線維の一連の顕微鏡写真（１００ｘおよび２００ｘ）であり、ジストロフィンシグナルを示す。
【図24】ポンペ病を有する成人における経口ミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の静脈内注入の安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性を評価するための、オープンラベル、一定連続、用量漸増、ヒト初回、第１／２相実験の実験デザインを示す。
【図25A】５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図25B】５、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図25C】２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および１３０ｍｇのミグルスタット、または２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、ヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質のＡＵＣを示すグラフである。
【図25D】２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００および２６０ｍｇのミグルスタットの投与後の、２人の別個のヒト対象における血漿中のＧＡＡ総タンパク質の濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図26】１３０ｍｇまたは２６０ｍｇのミグルスタットを投与した後のヒト対象における血漿中のミグルスタットの濃度－時間プロファイルを示すグラフである。
【図27A】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27B】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27C】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【図27D】ＡＴＢ２００（５，１０および２０ｍｇ／ｋｇ）の漸増用量の投与、次いでＡＴＢ２００（２０ｍｇ／ｋｇ）およびミグルスタット（１３０および２６０ｍｇ）の共投与後の、ヒト患者におけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）およびヘキソース四糖（Ｈｅｘ４）レベルの変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明のいくつかの例示的な実施形態を説明する前に、本発明は、以下の説明に記載された構成またはプロセスステップの詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【0029】
ＧＡＡについて特に言及しているが、リソソーム酵素α－ガラクトシダーゼＡを含むがこれに限定されない、リソソームを標的とする他の組換えタンパク質を生成、捕捉および精製するために、本明細書に記載の方法を使用することができることは、当業者に理解されるであろう。
【0030】
本発明の様々な態様は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｒｈＧＡＡ）などの組換えヒトリソソームタンパク質の生成、捕捉および精製のための新規な方法に関する。本発明の他の態様は、本明細書に記載された方法により生成された組換えタンパク質、ならびに医薬組成物、処置方法、およびそのような組換えタンパク質の使用に関する。
【0031】
本明細書で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内で、そして各用語が使用される具体的な文脈において、当該技術分野における通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらを製造および使用する方法を説明する上で、専門家に追加的な指針を提供するために、特定の用語については以下または本明細書の他の箇所で説明する。
【0032】
本明細書では、文言の説明または必要な示唆のために、文脈が他に要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味、すなわち、述べられた特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態におけるさらなる特徴の存在または追加を排除するものではない。
【0033】
本明細書で使用する「リソソームタンパク質」という用語は、リソソーム酵素などのリソソームを標的とする任意のタンパク質を指す。リソソーム酵素および関連疾患の例を以下の表１に示す：
【0034】
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「ポンペ病」は、酸マルターゼ欠乏症、ＩＩ型糖源蓄積症（ＧＳＤＩＩ）、およびＩＩ型糖源病とも呼ばれ、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするＧＡＡ遺伝子の突然変異を特徴とする、遺伝的リソソーム蓄積症を指すことが意図される。この用語には、乳児期、若年期および成人期発症のポンペ病が含まれるが、これらに限定されない、初期および後期発症形態が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「酸性α－グルコシダーゼ」は、グリコーゲン、マルトース、およびイソマルトースのＤ－グルコース単位間のα－１，４結合を加水分解するリソソーム酵素を指すことが意図される。別の名称には、リソソームα－グルコシダーゼ（ＥＣ：３．２．１．２０）；グルコアミラーゼ；１，４－α－Ｄ－グルカングルコヒドロラーゼ；アミログルコシダーゼ；ガンマ－アミラーゼおよびエキソ－１，４－α－グルコシダーゼが含まれるが、これらに限定されるものではない。ヒト酸性α－グルコシダーゼは、１７番染色体の長腕（位置１７ｑ２５．２－ｑ２５．３）にマッピングされているＧＡＡ遺伝子（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５４８）によってコードされている。５００を超える突然変異が現在ヒトＧＡＡ遺伝子において同定されており、その多くはポンペ病に関連している。酸性α－グルコシダーゼ酵素のミスフォールディングまたは誤処理を生じる突然変異には、Ｔ１０６４Ｃ（Ｌｅｕ３５５Ｐｒｏ）およびＣ２１０４Ｔ（Ａｒｇ７０２Ｃｙｓ）が含まれる。さらに、酵素の成熟および処理に影響を及ぼすＧＡＡ突然変異には、Ｌｅｕ４０５ＰｒｏおよびＭｅｔ５１９Ｔｈｒが含まれる。酸性α－グルコシダーゼタンパク質の活性には、アミノ酸残基５１６～５２１で保存されたヘキサペプチドＷＩＤＭＮＥが必要である。本明細書で使用される場合、略語「ＧＡＡ」は、酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図され、イタリック体の略語「ＧＡＡ」は、ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードするヒト遺伝子を指すことが意図される。イタリック体の略語「Ｇａａ」は、ラットまたはマウス遺伝子を含むがこれらに限定されない、非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素をコードする非ヒト遺伝子を指すことが意図され、略語「Ｇａａ」は、非ヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。したがって、略語「ｒｈＧＡＡ」は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素を指すことが意図される。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「アルグルコシダーゼアルファ」は、［１９９－アルギニン、２２３－ヒスチジン］プレプロ－α－グルコシダーゼ（ヒト）；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ登録番号４２０７９４－０５－０として同定された組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図される。アルグルコシダーゼアルファは、ルミザイム（登録商標）およびミオザイム（登録商標）として、２０１６年１月付けで米国におけるＧｅｎｚｙｍｅによる市販が承認されている。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＴＢ２００」は、同時係属中の特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを指すことが意図され、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「グリカン」は、タンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に共有結合した多糖類鎖を指すことが意図される。本明細書で使用される場合、用語「Ｎ－グリカン」または「Ｎ－結合グリカン」は、アミノ酸残基の窒素原子に共有結合によってタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸残基に結合した多糖類鎖を指すことが意図される。例えば、Ｎ－グリカンは、アスパラギン残基の側鎖窒素原子に共有結合し得る。グリカンは、１個または数個の単糖単位を含み得、単糖単位は共有結合して直鎖または分枝鎖を形成し得る。少なくとも１つの実施形態において、ＡＴＢ２００に結合したＮ－グリカン単位は、Ｎ－アセチルグルコサミン、マンノース、ガラクトースまたはシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位を含み得る。タンパク質上のＮ－グリカン単位は、質量分析などの任意の適切な分析技術によって決定し得る。いくつかの実施形態において、Ｎ－グリカン単位は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計またはＷａｔｅｒｓＸｅｖｏ（登録商標）Ｇ２－ＸＳ ＱＴｏｆ質量分析計などの機器を利用する液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって決定され得る。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「高マンノースＮ－グリカン」は、１～６個またはそれを超えるマンノース単位を有するＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、高マンノースＮ－グリカン単位は、アスパラギン残基に結合したビス（Ｎ－アセチルグルコサミン）鎖を含有し、さらに分枝状ポリマンノース鎖に結合し得る。本明細書で交換可能に使用される場合、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース－６－リン酸」は、６位がリン酸化された、すなわち、６位のヒドロキシル基に結合したリン酸基を有する、マンノース単位を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、１つ以上のＮ－グリカン単位の１つ以上のマンノース単位が６位でリン酸化されて、マンノース－６－リン酸単位を形成する。少なくとも１つの実施形態において、用語「Ｍ６Ｐ」または「マンノース－６－リン酸」は、リン酸基上に「キャップ」としてＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するマンノースホスホジエステル、およびＧｌｃＮＡｃキャップを欠く露出したリン酸基を有するマンノース単位の両方を指す。少なくとも１つの実施形態において、タンパク質のＮ－グリカンは、ＧｌｃＮＡｃキャップを有する少なくとも１つのＭ６Ｐ基およびＧｌｃＮＡｃキャップを欠く少なくとも１つの他のＭ６Ｐ基を有する複数のＭ６Ｐ基を有し得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「複合Ｎ－グリカン」は、１つ以上のガラクトースおよび／またはシアル酸単位を含むＮ－グリカンを指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、複合Ｎ－グリカンは、Ｎ－アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびシアル酸からそれぞれ独立して選択される１つ以上の単糖単位に、１つまたはマンノース単位がさらに結合した高マンノースＮ－グリカンであり得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、Ｎ－ブチル－１－デオキシノジリマイシンＮＢ－ＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－１－ブチル－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールとしても知られる化合物ミグルスタットは、以下の化学式を有する：
【0043】
ミグルスタットの１つの製剤は、１型ゴーシェ病の単剤治療として、商品名Ｚａｖｅｓｃａ（登録商標）で市販されている。
【0044】
後述するように、ミグルスタットの薬学的に許容される塩も本発明において使用し得る。ミグルスタットの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたミグルスタットの用量がミグルスタットの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。
【0045】
本明細書で使用される場合、１－デオキシノジリマイシンまたはＤＮＪまたは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）－２－（ヒドロキシメチル）ピペリジン－３，４，５－トリオールとしても知られる化合物ドゥボグルスタットは、以下の化学式を有する：
【0046】
ドゥボグルスタットの塩を使用する場合、塩の用量は、患者が受けたドゥボグルスタットの用量がドゥボグルスタットの遊離塩基が使用された場合に受けるであろう用量に等しくなるように調整される。
【0047】
本明細書で使用される場合、用語「薬理学的シャペロン」または場合によっては単に用語「シャペロン」は、リソソームタンパク質に特異的に結合し、以下の効果の１つ以上を有するものを指すことが意図される：
・タンパク質の安定した分子立体構造の形成を促進する；
・タンパク質の小胞体関連分解を防止するために、小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を促進する；
・構造的に不安定なタンパク質またはミスフォールドタンパク質の凝集を防止する；
・タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性および／または活性を回復および／または向上させる；および／または
・タンパク質を有する細胞の表現型または機能を改善する。
・タンパク質の安定した分子立体構造の形成を促進する；
・タンパク質の小胞体関連分解を防止するために、小胞体から別の細胞位置、好ましくは天然の細胞位置へのタンパク質の適切な輸送を促進する；
・構造的に不安定なタンパク質またはミスフォールドタンパク質の凝集を防止する；
・タンパク質の少なくとも一部の野生型機能、安定性および／または活性を回復および／または向上させる；および／または
・タンパク質を有する細胞の表現型または機能を改善する。
【0048】
したがって、酸性α－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、酸性α－グルコシダーゼに結合する分子であり、酸性α－グルコシダーゼの適切なフォールディング、輸送、非凝集、および活性をもたらす。本明細書で使用される場合、この用語は、酵素の活性部位に結合する活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）、阻害剤またはアンタゴニスト、およびアゴニストを含むが、これらに限定されるものではない。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンは、酸性α－グルコシダーゼの阻害剤またはアンタゴニストであり得る。本明細書で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、酸性α－グルコシダーゼに結合し、酸性α－グルコシダーゼの活性を部分的または完全に遮断、阻害、低減、または中和する任意の分子を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロンはミグルスタットである。別の非限定的な酸性α－グルコシダーゼの薬理学的シャペロンは、ドゥボグルスタットである。
【0049】
本明細書で使用される場合、用語「活性部位」は、タンパク質の特異的な生物学的活性に関連し、かつ必要である、タンパク質の領域を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、活性部位は、基質または他の結合パートナーに結合し、化学結合の形成および切断に直接関与するアミノ酸残基に寄与する部位であり得る。
【0050】
本明細書で使用される場合、「治療有効用量」および「有効量」は、対象において治療応答を生じる、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）および／またはシャペロンおよび／またはその組み合わせの量を指すことが意図される。治療応答は、本明細書に記載され、および当該技術分野で公知の、任意の代理臨床マーカーまたは症状を含む、ユーザ（例えば、臨床医）が治療に対する有効な応答として認識する任意の応答であり得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、治療応答は、当該技術分野で公知のものなどのポンペ病の１つ以上の症状またはマーカーの改善または抑制であり得る。ポンペ病の症状またはマーカーとしては、心筋症、心臓肥大、特に体幹または下肢における進行性筋力低下、重度の低血圧、巨舌（および場合により舌の突出）、嚥下、吸い込み、および／または摂食の困難、呼吸不全、肝腫（中度）、顔面筋肉の弛緩、反射消失、運動不耐性、労作性呼吸困難、起座呼吸、睡眠時無呼吸、朝の頭痛、傾眠、脊柱前弯および／または脊柱側弯症、深部腱反射の減少、腰痛、発達的運動マイルストーンの不達成が挙げられるが、これらに限定されるものではない。酸性α－グルコシダーゼに対する阻害効果を有するシャペロン（例えば、ミグルスタット）の濃度は、希釈（および結果として平衡の変化による結合の変化）、バイオアベイラビリティ、およびインビボ投与時のシャペロンの代謝のために、本発明の目的にとって「有効量」を構成し得ることに留意すべきである。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「酵素補充療法」または「ＥＲＴ」は、非天然の精製酵素を、そのような酵素の欠乏を有する個体に導入することを指すことが意図される。投与されるタンパク質は、天然源から、または組換え発現により、得ることができる。この用語はまた、その他の点で精製酵素の投与を必要とするか、または精製酵素の投与から恩恵を受ける個体における精製酵素の導入も指す。少なくとも１つの実施形態において、そのような個体は酵素不全を患っている。導入された酵素は、インビトロで産生された精製組換え酵素、または例えば胎盤または動物の乳などの単離された組織または液体から、または植物から精製されたタンパク質であってもよい。
【0052】
本明細書で使用される場合、用語「併用治療」は、２つ以上の個々の治療が同時にまたは連続して投与される任意の治療を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、併用治療の結果は、個々に行われる場合の各治療の効果と比較して、強化される。強化は、単独で実施した場合の治療によって達成された結果と比較して有利な結果をもたらし得る、様々な治療の効果の任意の改善を含み得る。強化された効果または結果には、強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも大きい、相乗的強化；強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果と実質的に等しい、相加的強化；または、強化された効果が、単独で行われた場合の各治療の相加的効果よりも低いが、単独で行われた場合の各治療の効果よりは優れている、相乗効果未満が含まれ得る。強化された効果は、処置効果または結果を測定し得る当該分野で公知の任意の手段によって測定し得る。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容され、ヒトに投与される場合に典型的には有害な反応を生じない、分子実体および組成物を指すことが意図される。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方または動物、特にヒトにおける使用のための他の一般に認められている薬局方に列挙されることを意味する。
【0054】
本明細書で使用される場合、用語「担体」は、化合物と投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を指すことが意図される。適切な薬学的担体は当該分野で公知であり、少なくとも１つの実施形態において、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１８版または他の版に記載されている。
【0055】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト動物を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、対象は哺乳動物である。少なくとも１つの実施形態において、対象はヒトである。
【0056】
本明細書で使用される場合、用語「抗薬物抗体」は、対象に投与される薬物、および対象への薬物の投与に対する体液性免疫応答の少なくとも一部として対象により生成される薬物に、特異的に結合する抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、薬物は、治療用タンパク質薬物製品である。対象における抗薬物抗体の存在は、軽度から重度の範囲の免疫応答を起こす可能性があり、これは、アナフィラキシー、サイトカイン放出症候群および重要な機能を媒介する内因性タンパク質の交差反応性中和を含むがこれらに限定されない生命を脅かす免疫応答を含むが、これに限定されるものではない。さらに、またはあるいは、対象における抗薬物抗体の存在は、薬物の有効性を低下させ得る。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「中和抗体」は、薬物の機能を中和するように作用する抗薬物抗体を指すことが意図される。少なくとも１つの実施形態において、治療用タンパク質薬物製品は、発現が対象において低減または欠損している内在性タンパク質の対応物である。少なくとも１つの実施形態において、中和抗体は、内因性タンパク質の機能を中和するように作用し得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、用語「約」および「およそ」は、測定の性質または精度を考慮して、測定された量に対する許容可能な程度の誤差を指すことが意図される。例えば、誤差の程度は、当分野で理解されているように、測定に関して提供された有効数字の数によって示すことができ、測定に関して報告された最も正確な有効数字の±１の変化を含むが、これに限定されるものではない。典型的な例示的な誤差の程度は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物系において、用語「約」および「およそ」は、所与の値の１桁倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味し得る。本明細書に記載の数値は、他に明記しない限りおよそのものであり、用語「約」または「およそ」は、明示的に記載されていない場合に推測できることを意味する。
【0059】
用語「同時に」は、本明細書で使用される場合、当業者に理解されるように、同じ時間に、または前後の合理的な短い時間以内に、を意味することが意図される。例えば、２つの処置が互いに同時に投与される場合、２つの処置のうちの後の処置の準備に必要な時間を許容するために、１つの処置は他の処置の前または後に投与し得る。したがって、２つの処置の「同時投与」は、１つの処置が２０分以下、約２０分、約１５分、約１０分、約５分、約２分、約１分または１分未満で他の処置に続くことを含むが、これに限定されるものではない。
【0060】
用語「薬学的に許容される塩」は、本明細書で使用される場合、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがなくヒトおよび下等動物の組織との接触に使用するのに適切であり、合理的な利益／危険比に応じ、一般に水溶性または油溶性または分散性であり、それらの意図された用途に有効である塩を意味することが意図される。この用語は、薬学的に許容される酸付加塩および薬学的に許容される塩基付加塩を含む。適切な塩のリストは、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｉｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９７７，６６，ｐｐ．１－１９に見出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0061】
用語「薬学的に許容される酸付加塩」は、本明細書で使用される場合、遊離塩基の生物学的有効性および性質を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸などを含むが、これらに限定されない無機酸、および酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、桂皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミスルフィック酸、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、２－ナフタレンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３－フェニルプロピオン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ウンデカン酸などを含むが、これらに限定されない有機酸で形成される塩を意味することが意図される。
【0062】
用語「薬学的に許容される塩基付加塩」は、本明細書で使用される場合、遊離酸の生物学的有効性および性質を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないものではない、アンモニア、またはアンモニウムもしくはナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩を含むが、これらに限定されない無機塩基で形成される塩を意味することが意図される。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導される塩は、第１級、第２級および第３級アミン、第４級アミン化合物、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ－ジメチルアニリン、Ｎ－メチルピペリジン、Ｎ－メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ－ジベンジルフェネチルアミン、１－エフェンアミン（ｅｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂など、の塩を含むが、これらに限定されるものではない。
【0063】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒトリソソームタンパク質の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、酸性α－グルコシダーゼは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるような、本明細書でＡＴＢ２００と称される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼである。ＡＴＢ２００は、高親和性（ＫＤ～２～４ｎＭ）でカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋芽細胞（Ｋ取り込み～７～１４ｎＭ）によって効率的に内在化されることが示されている。ＡＴＢ２００はインビボで特徴付けられ、アルグルコシダーゼアルファ（ｔ１／２～６０分）よりも短い見かけの血漿半減期（ｔ１／２～４５分）を有することが示された。
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現し、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒトリソソームタンパク質の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較して、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む。少なくとも１つの実施形態において、酸性α－グルコシダーゼは、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるような、本明細書でＡＴＢ２００と称される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼである。ＡＴＢ２００は、高親和性（ＫＤ～２～４ｎＭ）でカチオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合し、ポンペ線維芽細胞および骨格筋芽細胞（Ｋ取り込み～７～１４ｎＭ）によって効率的に内在化されることが示されている。ＡＴＢ２００はインビボで特徴付けられ、アルグルコシダーゼアルファ（ｔ１／２～６０分）よりも短い見かけの血漿半減期（ｔ１／２～４５分）を有することが示された。
【0064】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号１または配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する酵素である。
【0065】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、米国特許第８，５９２，３６２号明細書に記載されるような、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡアミノ酸配列を有し、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＨＥ２４１０４．１（ＧＩ：５６８７６０９７４）を有する。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、ＧＡＡ遺伝子の９つの観察されたハプロタイプのうちの最も優勢なものによってコードされるヒト酸性α－グルコシダーゼ酵素である、グルコシダーゼアルファである。
【0066】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、配列番号１に記載の野生型ＧＡＡの全長９５２アミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、アミノ酸の一部、例えば最初の５６アミノ酸を除去する細胞内プロセシングを受ける。したがって、宿主細胞によって分泌される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、細胞内で最初に発現される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも短いアミノ酸配列を有し得る。少なくとも１つの実施形態において、より短いタンパク質は、シグナルペプチドおよび前駆体ペプチドを含む最初の５６アミノ酸が除去され、したがって８９６個のアミノ酸を有するタンパク質が得られる点でのみ配列番号１と異なる、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有し得る。配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、アミノ酸の数における他の変更も可能である。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡ生成物は、異なるアミノ酸長を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ分子の混合物を含む。
【0067】
少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基において翻訳後および／または化学修飾を受ける。例えば、メチオニンおよびトリプトファン残基は酸化を受け得る。別の例として、Ｎ末端グルタミンはピログルタミン酸を形成することができる。別の例として、アスパラギン残基は、アスパラギン酸への脱アミノ化を受け得る。さらに別の例として、アスパラギン酸残基はイソアスパラギン酸への異性化を受け得る。さらに別の例として、タンパク質中の不対システイン残基は、遊離グルタチオンおよび／またはシステインとジスルフィド結合を形成し得る。したがって、いくつかの実施形態において、酵素は、配列番号１、または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するものとして最初に発現され、酵素はこれらの翻訳後および／または化学修飾の１つ以上を受ける。そのような改変形態も本開示の範囲内である。
【0068】
ＧＡＡおよびそのような変異体ヒトＧＡＡをコードするポリヌクレオチド配列もまた企図され、本発明によるｒｈＧＡＡを組換え発現するために使用され得る。
【0069】
好ましくは、全組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子の７０、６５、６０、５５、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０または５％以下が、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を欠くか、または陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）に結合する能力が欠如している。あるいは、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９％、＜１００％以上が、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する少なくとも１つのＮ－グリカン単位を含む、またはＣＩＭＰＲに結合する能力を有する。
【0070】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）分子は、そのグリカン上に１、２、３または４個のマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）基を有し得る。例えば、組換えヒトリソソームタンパク質分子における１つのＮ－グリカンのみがＭ６Ｐ（モノ－リン酸化）を有していてもよく、単一のＮ－グリカンが２つのＭ６Ｐ基（ビス－リン酸化）を有していてもよく、または同じ組換えヒトリソソームタンパク質分子における２つの異なるＮ－グリカンがそれぞれ単一のＭ６Ｐ基を有していてもよい。組換えヒトリソソームタンパク質分子はまた、Ｍ６Ｐ基を有しないＮ－グリカンを有し得る。別の実施形態において、Ｎ－グリカンは、平均して３モル／モルを超えるＭ６Ｐおよび４モル／モルを超えるシアル酸を含み、その結果、ヒトリソソームタンパク質は、平均して組換えヒトリソソームタンパク質１モルあたり少なくとも３モルのマンノース－６－リン酸残基、および組換えヒトリソソームタンパク質１モルあたり少なくとも４モルのシアル酸を含む。平均して組換えヒトリソソームタンパク質における総グリカンの少なくとも約３、４、５、６、７、８、９または１０％は、モノ－Ｍ６Ｐグリカンの形態であってもよく、例えば、総グリカンの約６．２５％が単一のＭ６Ｐ基を有していてもよく、平均して組換えヒトリソソームタンパク質における総グリカンの少なくとも約０．５、１、１．５、２．０、２．５、３．０％がビス－Ｍ６Ｐグリカンの形態であり、平均して総組換えヒトリソソームタンパク質の２５％未満が、ＣＩＭＰＲに結合するリン酸化グリカンを含まない。
【0071】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、０．５～７．０モル／モル組換えヒトリソソームタンパク質の範囲、または０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５または７．０モル／モル組換えヒトリソソームタンパク質を含む部分範囲の任意の中間値のＭ６Ｐを担持するＮ－グリカンの平均含有量を有し得る。組換えヒトリソソームタンパク質を分画して、異なる平均数のＭ６Ｐ含有またはビス－Ｍ６Ｐ含有グリカンを有する組換えヒトリソソームタンパク質調製物を提供することができ、これにより、特定の画分を選択することにより、または選択的に異なる画分を組み合わせることにより、標的組織のリソソームへ標的化する組換えヒトリソソームタンパク質のさらなるカスタマイズが可能となる。
【0072】
いくつかの実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）１モル当たり平均して２．０～８．０モルのＭ６Ｐを有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０モルＭ６Ｐ／モル組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）を含む、すべての中間値および部分範囲が含まれる。
【0073】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）におけるＮ－グリカンの最大６０％が完全にシアリル化されていてもよく、例えばＮ－グリカンの最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％が完全にシアリル化されていてもよい。いくつかの実施形態において、全Ｎ－グリカンの４～２０％が完全にシアリル化されている。他の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）におけるＮ－グリカンの５％、１０％、２０％または３０％以下がシアル酸および末端ガラクトース残基（Ｇａｌ）を有する。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組換えヒトリソソームタンパク質における全Ｎ－グリカンの７～３０％がシアル酸および末端ガラクトースを運ぶことができる。さらに他の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質におけるＮ－グリカンの５、１０、１５、１６、１７、１８、１９または２０％以下が末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない。この範囲には、全ての中間値および部分範囲が含まれ、例えば、組成物中の組換えヒトリソソームタンパク質における全Ｎ－グリカンの８～１９％が、末端ガラクトースのみを有し、シアル酸を含有しない場合がある。
【0074】
本発明の他の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における総Ｎ－グリカンの４０、４５、５０、５５～６０％が複合型Ｎ－グリカンであり；または組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における総Ｎ－グリカンの１、２、３、４、５、６、７％以下がハイブリッド型Ｎ－グリカンであり；組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの５、１０または１５％以下が非リン酸化されており；組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも５％または１０％がリン酸化されたモノ－Ｍ６Ｐであり；および／または組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）における高マンノース型Ｎ－グリカンの少なくとも１または２％がリン酸化されたビス－Ｍ６Ｐである。これらの値には、全ての中間値および部分範囲が含まれる。組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、上記の１つ以上の含有量範囲を満たし得る。
【0075】
いくつかの実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）１モル当たり平均して２．０～８．０モルのシアル酸残基を有する。この範囲には、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５および８．０モル残基／モル組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）を含む、全ての中間値および部分範囲が含まれる。理論に拘束されるものではないが、シアル酸残基を有するＮ－グリカン単位の存在は、アシアロ糖タンパク質受容体による組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）の非生産的クリアランスを防止し得ると考えられる。
【0076】
１つ以上の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、組換えヒトリソソームタンパク質の一定のＮ－グリコシル化部位にＭ６Ｐおよび／またはシアル酸単位を有する。例えば、上記のように、ｒｈＧＡＡには７つの潜在的なＮ結合グリコシル化部位がある。これらの潜在的なグリコシル化部位は、配列番号２の次の位置に存在する：Ｎ８４、Ｎ１７７、Ｎ３３４、Ｎ４１４、Ｎ５９６、Ｎ８２６およびＮ８６９。同様に、配列番号１の全長アミノ酸配列に関して、これらの潜在的なグリコシル化部位は、以下の位置に存在する：Ｎ１４０、Ｎ２３３、Ｎ３９０、Ｎ４７０、Ｎ６５２、Ｎ８８２およびＮ９２５。ｒｈＧＡＡの他の変異体は、アスパラギン残基の位置に応じて、同様のグリコシル化部位を有し得る。一般に、タンパク質アミノ酸配列におけるＡＳＮ－Ｘ－ＳＥＲまたはＡＳＮ－Ｘ－ＴＨＲの配列は、潜在的なグリコシル化部位を示すが、例外として、ＸはＨＩＳまたはＰＲＯではあり得ない。
【0077】
様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、特定のＮ－グリコシル化プロファイルを有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８４および配列番号１のＮ１４０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第１のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第１のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。
【0078】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ１７７および配列番号１のＮ２２３）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第２のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第２のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ３３４および配列番号１のＮ３９０）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第３のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第３のＮ－グリコシル化部位は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカン、ならびに主要な種としてのハイブリッドグリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％が第３のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0079】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ４１４および配列番号１のＮ４７０）。例えば、ｒｈＧＡＡの少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第４のＮ－グリコシル化部位でリン酸化され得る。このリン酸化は、モノ－Ｍ６Ｐおよび／またはビス－Ｍ６Ｐ単位の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でモノ－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、第４のＮ－グリコシル化部位でビス－Ｍ６Ｐ単位を有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％または２５％が第４のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0080】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ５９６および配列番号１のＮ６９２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第５のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第５のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、フコシル化されたジ－アンテナリ複合グリカンを有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第５のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0081】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８２６および配列番号１のＮ８８２）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第６のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。例えば、第６のＮ－グリコシル化部位は、主要な種として、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカンの混合物を有し得る。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％が第６のＮ－グリコシル化部位でシアリル化される。
【0082】
１つ以上の実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも５％が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される（例えば、配列番号２のＮ８６９および配列番号１のＮ９２５）。他の実施形態において、ｒｈＧＡＡの５％、１０％、１５％、２０％または２５％未満が第７のＮ－グリコシル化部位でリン酸化される。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％未満が第７のＮ－グリコシル化部位に任意のグリカンを有する。いくつかの実施形態において、ｒｈＧＡＡの少なくとも３０％、３５％または４０％が第７のＮ－グリコシル化部位にグリカンを有する。
【0083】
様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり０～５モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～３０モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり５～２０モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり１０～４０モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルｒｈＧＡＡ当たり２～８モルのシアル酸含有量を有する。様々な実施形態において、ｒｈＧＡＡは、モルｒｈＧＡＡ当たり２～３モルの平均フコース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２０～２５モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルｒｈＧＡＡ当たり８～１２モルのガラクトース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり２２～２７モルのマンノース含量、モルｒｈＧＡＡ当たり３～５モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルｒｈＧＡＡ当たり４～７モルのシアル酸含有量を有する。
【0084】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００またはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４などのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により、またはそのようなＣＨＯ細胞培養物の継代培養物もしくは誘導体により好ましく産生される。配列番号１または配列番号２と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるものなど、酸性α－グルコシダーゼまたは他の変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列の対立遺伝子変異体を発現するＤＮＡ構築物を構築し、ＣＨＯ細胞で発現させることができる。これらの変異体酸性α－グルコシダーゼアミノ酸配列は、例えば、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれを超える欠失、置換および／または挿入を有するなど、配列番号１に対して欠失、置換および／または挿入を含有してもよい。当業者は、そのようなＤＮＡ構築物の産生のためのＣＨＯ細胞の形質転換に適した代替的ベクターを選択し得る。
【0085】
ＧＣＧ配列分析パッケージ（ウィスコンシン大学、ウィスコンシン州マディソン）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴを含む、２つの配列間の同一性を計算するために、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用することができ、例えば、デフォルト設定で使用することができる。例えば、本明細書に記載され、好ましくは実質的に同じ機能を示す特定のポリペプチドに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが企図される。別段の指示がない限り、類似度スコアはＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づく。ＢＬＡＳＴＰが使用される場合、類似性割合はＢＬＡＳＴＰ陽性スコアに基づき、配列同一性割合はＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰの「同一性」は、同一の高スコア配列対における総残基の数および割合を示す；およびＢＬＡＳＴＰの「陽性」は、整列スコアが正の値を有し、互いに類似している残基の数および割合を示す。これらの同一性または類似性の程度または本明細書に開示されるアミノ酸配列との類似性の任意の中程度の同一性を有するアミノ酸配列が企図され、この開示によって包含される。類似のポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを使用して推定され、従来の手段、特に遺伝子コードを使用してそのアミノ酸配列を逆翻訳することによって得ることができる。
【0086】
本発明では、陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩＭＰＲ）および細胞リソソームを標的とする優れた能力を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ、ならびにインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用して産生できることを見出した。これらの細胞は、アルグルコシダーゼアルファなどの従来の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ製品よりも、１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有する有意に高いレベルのＮ－グリカン単位を有する組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを発現するように誘導し得る。これらの細胞によって産生される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、例えばＡＴＢ２００によって例示されるように、ルミザイム（登録商標）などの従来の酸性α－グルコシダーゼよりも、有意に多くの筋肉細胞標的化マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）およびビス－マンノース－６－リン酸Ｎ－グリカン残基を有する。理論に拘束されるものではないが、この広範なグリコシル化により、ＡＴＢ２００酵素がより効果的に標的細胞に取り込まれることができ、したがって、例えば、はるかに低いＭ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐ含有量を有するアルグルコシダーゼアルファなど、他の組換えヒト酸性α－グルコシダーゼよりも効率的に循環から除去され得ると考えられる。ＡＴＢ２００は、ＣＩＭＰＲに効率的に結合し、骨格筋および心筋によって効率的に取り込まれ、好ましい薬物動態プロファイルを提供しインビボでの非生産的クリアランスを減少させるグリコシル化パターンを有することが示されている。
【0087】
ＡＴＢ２００の広範なグリコシル化は、例えば、アルグルコシダーゼアルファと比較して、ＡＴＢ２００の免疫原性の低下に寄与し得ることも企図される。当業者によって理解されるように、保存された哺乳動物糖によるタンパク質のグリコシル化は、一般に、生成物の溶解性を高め、生成物の凝集および免疫原性を減少させる。グリコシル化は、タンパク質の凝集を最小限にし、免疫系からタンパク質免疫原性エピトープを遮断することにより、タンパク質免疫原性を間接的に変化させる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ－Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１４）。したがって、少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、抗薬物抗体を誘導しない。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与は、アルグルコシダーゼアルファの投与によって誘導される抗薬物抗体のレベルよりも対象における抗薬物抗体の発生率を低下させる。
【0088】
同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されるように、ＣＨＯ細胞などの細胞を使用して同文献に記載されるｒｈＧＡＡを生成することができ、このｒｈＧＡＡは、本発明で使用され得る。そのようなＣＨＯ細胞株の例は、ＧＡ－ＡＴＢ－２００またはＡＴＢ－２００－００１－Ｘ５－１４、またはそこに記載されるようなｒｈＧＡＡ組成物を産生するその継代培養物である。そのようなＣＨＯ細胞株は、ＧＡＡをコードする１ポリヌクレオチドにつき５、１０、１５、２０またはそれを超えるコピーなどの遺伝子の複数のコピーを含有し得る。
【0089】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡなどの高Ｍ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐ ｒｈＧＡＡは、ＧＡＡをコードするＤＮＡ構築物でＣＨＯ細胞を形質転換する。ＣＨＯ細胞は以前にｒｈＧＡＡを作製するために使用されていたが、形質転換ＣＨＯ細胞は、ＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐおよびビス－Ｍ６Ｐグリカンの高い含有量を有するｒｈＧＡＡを産生するように培養および選択できたことは認められなかった。
【0090】
驚くべきことに、ＣＨＯ細胞株を形質転換し、ＣＩＭＰＲを標的化するＭ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高含有量を含有するｒｈＧＡＡを生成する形質転換体を選択し、この高Ｍ６Ｐ ｒｈＧＡＡを安定に発現させることが可能であることが見出された。したがって、これらのＣＨＯ細胞株を作製するための方法はまた、同時係属中の国際特許出願ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１５／０５３２５２号明細書に記載されている。この方法は、ＣＨＯ細胞をＧＡＡまたはＧＡＡ変異体をコードするＤＮＡで形質転換すること、ＧＡＡをコードするＤＮＡをその染色体に安定に組み込み、安定にＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、およびＭ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐを有するグリカンの高い含有量を有するＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞を選択すること、および任意選択により、高いシアル酸含有量を有するおよび／または低い非リン酸化高マンノース含有量を有するＮ－グリカンを有するＣＨＯ細胞を選択することを含む。
【0091】
これらのＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株を培養し、前記組成物をＣＨＯ細胞の培養物から回収することにより、ｒｈＧＡＡおよびｒｈＧＡＡ組成物を生産するために使用され得る。
【0092】
組換えヒトリソソームタンパク質の生成、捕捉および精製
本発明の様々な実施形態は、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）の生成および／または捕捉および／または精製のための方法に関する。組換えヒトリソソームタンパク質を生成、捕捉および精製するための例示的な方法６００を図６に示す。
本発明の様々な実施形態は、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）の生成および／または捕捉および／または精製のための方法に関する。組換えヒトリソソームタンパク質を生成、捕捉および精製するための例示的な方法６００を図６に示す。
【0093】
図６において、矢印は、組換えヒトリソソームタンパク質を含有する様々な液相の動きの方向を示す。バイオリアクター６０１は、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）を発現して周囲の液体培地に分泌する、ＣＨＯ細胞などの細胞の培養物を含む。バイオリアクター６０１は、灌流、バッチまたは流加式培養バイオリアクターなどの、細胞を培養するための任意の適切なバイオリアクターであり得る。様々な実施形態において、バイオリアクターは、約１Ｌ～約２０，０００Ｌの容積を有する。例示的なバイオリアクターの容積は、約１Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約３５０Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌ、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、約２，５００Ｌ、約３，０００Ｌ、約３，５００Ｌ、約４，０００Ｌ、約５，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約７，０００Ｌ、約８，０００Ｌ、約９，０００Ｌ、約１０，０００Ｌ、約１５，０００Ｌおよび約２０，０００Ｌを含む。
【0094】
図６に示すように、培地はバイオリアクターから除去することができる。そのような培地の除去は、灌流バイオリアクターについて連続的であってもよく、バッチまたは流加式リアクターについてバッチ式であってもよい。培地をろ過システム６０３によってろ過して細胞を除去する。いくつかの実施形態において、培地から除去した細胞をバイオリアクターに再導入し、分泌組換えヒトリソソームタンパク質を含む培地をさらに処理することができる。ろ過システム６０３は、交互接線流ろ過（ＡＴＦ）システム、接線流ろ過（ＴＦＦ）システム、遠心ろ過システムなどを含む、任意の適切なろ過システムとすることができる。様々な実施形態において、ろ過システムは、約１０ナノメートル～約２マイクロメートルの孔サイズを有するフィルターを利用する。典型的なフィルター孔サイズは、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、約４００ｎｍ、約５００ｎｍ、約６００ｎｍ、約７００ｎｍ、約８００ｎｍ、約９００ｎｍ、約１μｍ、約１．５μｍおよび約２μｍを含む。
【0095】
様々な実施形態において、培地除去速度は、約１Ｌ／日～約２０，０００Ｌ／日である。例示的な培地除去速度は、約１Ｌ／日、約１０Ｌ／日、約２０Ｌ／日、約３０Ｌ／日、約４０Ｌ／日、約５０Ｌ／日、約６０Ｌ／日、約７０Ｌ日、約８０Ｌ／日、約９０Ｌ／日、約１００Ｌ／日、約１５０Ｌ／日、約２００Ｌ／日、約２５０Ｌ／日、約３００Ｌ／日、約３５０Ｌ／日、約４００Ｌ／日、約５００Ｌ／日、約６００Ｌ／日、約７００Ｌ／日、約８００Ｌ／日、約９００Ｌ／日、約１，０００Ｌ／日、約１，５００Ｌ／日、約２，０００Ｌ／日、約２，５００Ｌ／日、約３，０００Ｌ／日、約３，５００Ｌ／日、約４，０００Ｌ／日、約５，０００Ｌ／日、約６，０００Ｌ／日、約７，０００Ｌ／日、約８，０００Ｌ日、約９，０００Ｌ／日、約１０，０００Ｌ／日、約１５，０００Ｌ／日および約２０，０００Ｌ／日である。あるいは、培地除去速度は、約０．１～約３リアクター容積／日などの、バイオリアクター容積の関数として表すことができる。例示的な培地除去速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約２．５および約３リアクター容積を含む。
【0096】
連続または流加処理の場合、新鮮な培地がバイオリアクターに供給される速度は、約１Ｌ／日～約２０，０００Ｌ／日とすることができる。例示的な培地導入速度は、約１Ｌ／日、約１０Ｌ／日、約２０Ｌ／日、約３０Ｌ／日、約４０Ｌ／日、約５０Ｌ／日、約６０Ｌ／日、約７０Ｌ日、約８０Ｌ／日、約９０Ｌ／日、約１００Ｌ／日、約１５０Ｌ／日、約２００Ｌ／日、約２５０Ｌ／日、約３００Ｌ／日、約３５０Ｌ／日、約４００Ｌ／日、約５００Ｌ／日、約６００Ｌ／日、約７００Ｌ／日、約８００Ｌ／日、約９００Ｌ／日、約１，０００Ｌ／日、約１，５００Ｌ／日、約２，０００Ｌ／日、約２，５００Ｌ／日、約３，０００Ｌ／日、約３，５００Ｌ／日、約４，０００Ｌ／日、約５，０００Ｌ／日、約６，０００Ｌ／日、約７，０００Ｌ／日、約８，０００Ｌ日、約９，０００Ｌ／日、約１０，０００Ｌ／日、約１５，０００Ｌ／日および約２０，０００Ｌ／日である。あるいは、培地導入速度は、約０．１～約３リアクター容積／日などの、バイオリアクター容積の関数として表すことができる。例示的な培地導入速度は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約２、約２．５および約３リアクター容積を含む。
【0097】
ろ過後、濾液をタンパク質捕捉システム６０５に充填する。タンパク質捕捉システム６０５は、１つ以上のクロマトグラフィーカラムを含み得る。２つ以上のクロマトグラフィーカラムを使用する場合、カラムを直列に配置して、最初のカラムが充填された後に次のカラムが充填されるようにしてもよい。あるいは、培地除去方法は、カラムを切り替えている間、停止することができる。
【0098】
様々な実施形態において、タンパク質捕捉システム６０５は、組換えヒトリソソームタンパク質、特に高Ｍ６Ｐ含有量を有するリソソームタンパク質の直接的生成物捕捉のための１つ以上のアニオン交換（ＡＥＸ）カラムを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ろ過された培地から組換えヒトリソソームタンパク質を捕捉するためにＡＥＸクロマトグラフィーを使用すると、１つ以上のＭ６Ｐ基を有する組換えタンパク質のより多くの負電荷のために、捕捉された組換えタンパク質生成物がより高いＭ６Ｐ含量を有することが保証されると考えられる。その結果、非リン酸化組換えタンパク質および宿主細胞不純物は、カラム樹脂および高リン酸化組換えタンパク質に結合せず、非リン酸化組換えタンパク質および宿主細胞不純物はカラムを通過する。したがって、ＡＥＸクロマトグラフィーは、ＡＥＸ樹脂に対するＭ６Ｐ含有タンパク質の高い親和性により、タンパク質生成物のＭ６Ｐ含有量を富化する（すなわち、より多くのＭ６Ｐを有するタンパク質を選択する）ために使用することができる。
【0099】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＡＥＸクロマトグラフィーを使用した組換えタンパク質の直接的生成物捕捉により、プロテアーゼ、ならびにタンパク質を分解しおよび／またはタンパク質を脱リン酸化することができる他の酵素、を含む培地から高Ｍ６Ｐ含有量を有する組換えタンパク質が確実に除去されると考えられる。その結果、高品質の生成物が保存される。
【0100】
適切なＡＥＸクロマトグラフィーカラムは、負に荷電したタンパク質に結合する化学的官能基を有する。例示的な官能基には、第１級、第２級、第３級および第４級アンモニウムまたはアミン基が含まれるが、これらに限定されない。これらの官能基は、膜（例えば、セルロース膜）または通常のクロマトグラフィー樹脂に結合していてもよい。例示的なカラム媒体には、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＰ、ＣＭ、ＱおよびＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ媒体が含まれる。
【0101】
ＡＥＸクロマトグラフィーカラムの容積は、１Ｌ～１，０００Ｌなどの任意の適切な容積とすることができる。例示的なカラム容積は、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約３５０Ｌ、約４００Ｌ、約５００Ｌ、約６００Ｌ、約７００Ｌ、約８００Ｌ、約９００Ｌおよび約１，０００Ｌを含む。
【0102】
アニオン交換カラムのための例示的な条件を以下の表２に示す：
【0103】
【0104】
組換えヒトリソソームタンパク質がタンパク質捕捉システム６０５に充填された後、組換えヒトリソソームタンパク質は、カラム中のｐＨおよび／または塩含有量を変化させることによってカラム（単数または複数）から溶出される。
【0105】
溶出した組換えヒトリソソームタンパク質は、さらなる精製ステップおよび／または品質保証ステップに供され得る。例えば、図６に示すように、溶出した組換えヒトリソソームタンパク質は、ウイルス死滅ステップ６０７に供され得る。このようなウイルス死滅６０７は、低ｐＨ死滅、洗浄剤死滅、または当分野で公知の他の技術の１つ以上を含み得る。
【0106】
ウイルス死滅ステップ６０７からの組換えタンパク質生成物を第２のクロマトグラフィーシステム６０９に導入して、組換えタンパク質生成物をさらに精製することができる。あるいは、タンパク質捕捉システム６０５から溶出した組換えタンパク質は、第２のクロマトグラフィーシステム６０９に直接供給することができる。様々な実施形態において、第２のクロマトグラフィーシステム６０９は、不純物のさらなる除去のための１つ以上の固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）カラムを含む。例示的な金属イオンには、コバルト、ニッケル、銅、鉄、亜鉛またはガリウムが含まれる。
【0107】
第２のクロマトグラフィーカラム（例えば、ＩＭＡＣカラム）の容積は、０．１Ｌ～１００Ｌなどの任意の適切な容積とすることができる。例示的なカラム容積は、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約２．５Ｌ、約３Ｌ、約３．５Ｌ、約４Ｌ、約４．５Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１５Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌおよび約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌおよび約１００Ｌを含む。
【0108】
ＩＭＡＣカラムの例示的な条件を以下の表３に示す：
【0109】
【0110】
【0111】
組換えタンパク質が第２のクロマトグラフィーシステム６０９に充填された後、組換えタンパク質がカラムから溶出される。図６に示すように、溶出した組換えタンパク質は、ウイルス死滅ステップ６１１に供され得る。ウイルス死滅６０７の場合と同様に、ウイルス死滅６１１は、低ｐＨ死滅、洗浄剤死滅、または当分野で公知の他の技術の１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態において、ウイルス死滅６０７または６１１のうちの１つのみが使用されるか、または複数のウイルス死滅が精製方法において同じ段階で行われる。
【0112】
図６に示すように、ウイルス死滅ステップ６１１からの組換えタンパク質生成物を第３のクロマトグラフィーシステム６１３に導入して、組換えタンパク質生成物をさらに精製することができる。あるいは、第２のクロマトグラフィーシステム６０９からの溶出した組換えタンパク質は、第３のクロマトグラフィーシステム６１３に直接供給することができる。様々な実施形態において、第３のクロマトグラフィーシステム６１３は、不純物のさらなる除去のための１つ以上の陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラムおよび／またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムを含む。組換えタンパク質生成物は、次いで、第３のクロマトグラフィーシステム６１３から溶出される。
【0113】
第３のクロマトグラフィーカラム（例えば、ＣＥＸまたはＳＥＣカラム）の容積は、０．１Ｌ～２００Ｌなどの任意の適切な容積とすることができる。例示的なカラム容積は、約０．１Ｌ、約０．２Ｌ、約０．３Ｌ、約０．４Ｌ、約０．５Ｌ、約０．６Ｌ、約０．７Ｌ、約０．８Ｌ、約０．９Ｌ、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約２．５Ｌ、約３Ｌ、約３．５Ｌ、約４Ｌ、約４．５Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１５Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ、約３０Ｌ、約３５Ｌ、約４０Ｌおよび約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌおよび約２００Ｌを含む。
【0114】
ＣＥＸカラムのための例示的な条件を以下の表４に示す：
【0115】
【0116】
組換えタンパク質産物はまた、さらなる処理に供され得る。例えば、ウイルスを除去するために別のろ過システム６１５を用いてもよい。いくつかの実施形態において、そのようなろ過は、５～５０μｍの孔径を有するフィルターを利用することができる。他の生成物処理には、組換えタンパク質生成物が滅菌、ろ過、濃縮、貯蔵され、および／または最終生成物の製剤に添加するためのさらなる成分を有してもよい、生成物調整ステップ６１７が含まれ得る。例えば、組換えタンパク質生成物は、約２～約２０ｍｇ／ｍｌの初期タンパク質濃度から約４～約２００ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度までのように、２～１０倍の因数で濃縮することができる。この最終生成物は、バイアルを充填するために使用することができ、将来の使用のために凍結乾燥してもよい。
【0117】
組換えタンパク質の投与 組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）またはその薬学的に許容される塩は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化し得る。例えば、好ましい実施形態において、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位において痛みを和らげるための局所麻酔剤を含み得る。一般に、成分は、別個に供給されるか、または単位剤形中で一緒に混合されて、例えば、または活性物質の量を示すアンプルまたはサシェなどの密閉容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、医薬グレードの滅菌水、生理食塩水またはデキストロース／水を含有する注入ボトルで分注し得る。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0118】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）（または組換えヒトリソソームタンパク質含有する組成物または医薬）は、適切な経路で投与される。一実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質は静脈内投与される。他の実施形態において、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、心臓もしくは骨格筋（例えば、筋肉内）または神経系（例えば、脳への直接注射；脳室内；髄腔内）などの標的組織への直接投与によって投与される。必要に応じて、複数の経路を同時に使用できる。
【0119】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）（または組換えヒトリソソームタンパク質を含有する組成物または医薬）は、治療有効量（例えば、定期的に投与された場合に、疾患に関連する症状を改善すること、疾患の発症を予防または遅延させること、および／または疾患の症状の重症度または頻度を軽減することなどにより、疾患を処置するのに十分な投与量）で投与される。疾患の処置における治療上有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存し、標準的な臨床技術によって決定し得る。さらに、インビトロアッセイまたはインビボアッセイを、任意選択により、最適な投与量範囲の同定を助けるために使用し得る。使用される正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し、施術者の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量応答曲線から外挿し得る。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、典型的には約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、約２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注入によって投与される。特定の個体の有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変化させる（例えば、増加または減少させる）ことができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、または抗酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、その量を増加することができる。
【0120】
組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含有する組成物または医薬）の治療有効量は、性質および疾患の影響の程度に依存して定期的に、および継続的に投与される。本明細書で使用される場合、「定期的」な投与は、治療有効量が周期的に投与されることを示す（１回投与とは区別される）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。好ましい実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは毎月、隔月；毎週；毎週２回；または毎日投与される。単一の個体に対する投与間隔は、一定間隔である必要はなく、個体の必要性に応じて、経時的に変化させることができる。例えば、身体疾患もしくはストレスを有する時、抗組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ抗体が存在するようになったかもしくは増加する場合、または疾患の症状が悪化する場合、投与の間隔を減少させることができる。いくつかの実施形態において、治療有効量の５，１０，２０，５０，１００または２００ｍｇ酵素／ｋｇ体重を、シャペロンを伴いまたは伴わず、週に２回、毎週または隔週投与する。
【0121】
組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）は、単位用量のバイアルもしくはシリンジ中、または静脈内投与のための瓶もしくは袋の中など、後の使用のために調製してもよい。組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）、ならびに任意選択による賦形剤またはシャペロンもしくは他の薬物などの他の活性成分を含むキットは、包装材料に封入され、再構成、希釈、またはポンペ病に罹患している患者などの処置を必要とする対象を処置する投与のための説明書を伴い得る。
【0122】
ｒｈＧＡＡと薬理学的シャペロンの併用治療 様々な実施形態において、本明細書に記載の方法によって生成されたｒｈＧＡＡ（例えば、ＡＴＢ２００）は、ミグルスタットまたはドゥボグルスタットなどの薬理学的シャペロンとの併用治療において使用することができる。
【0123】
少なくとも１つの実施形態において、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）は、経口投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２００～約４００ｍｇの経口用量で、または約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇもしくは約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２３３ｍｇ～約４００ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２５０～約２７０ｍｇの経口用量で、または約２５０ｍｇ、約２５５ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２６５ｍｇもしくは約２７０ｍｇの経口用量で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約２６０ｍｇの経口用量として投与される。
【0124】
平均体重が約７０ｋｇの成人患者の場合、約２００ｍｇ～４００ｍｇの範囲または任意のそれより小さい範囲のミグルスタットの経口用量が適し得ることが、当業者に理解されよう。乳児、小児または低体重の成人を含むがこれらに限定されない、体重が約７０ｋｇよりも著しく低い患者については、より少ない用量が適切であると医師によって考えられ得る。したがって、少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの経口用量として、または約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇまたは約２００ｍｇの経口用量として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、約６５ｍｇ～約１９５ｍｇの経口用量として、または約６５ｍｇ、約１３０ｍｇもしくは約１９５ｍｇの経口用量として投与される。
【0125】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、経口投与に適した薬学的に許容される剤形として投与され、これは即時放出、遅延放出、変形放出、持続放出、パルス放出または制御放出用途のための、錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液または懸濁液、ゲル、シロップ、口腔洗浄剤、または使用前に水または他の適切な溶媒で再構成するための乾燥粉末、任意選択により、香味剤および着色剤を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、ピル、ボーラス、粉末、ペースト、顆粒、弾丸状、糖衣錠またはプレミックス調製物などの固体組成物も使用できる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは錠剤として投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはカプセルとして投与される。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約５０ｍｇ～約３００ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約６５ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約１３０ｍｇのミグルスタットを含有する。少なくとも１つの実施形態において、剤形は、約２６０ｍｇのミグルスタットを含有する。剤形が約６５ｍｇのミグルスタットを含む場合、ミグルスタットは、４剤形の投与量または２６０ｍｇのミグルスタットの総投与量として投与され得ることが企図される。しかしながら、乳児、小児または成人低体重を含むが、これに限定されない平均成人体重の７０ｋｇよりも有意に低い体重を有する患者の場合、ミグルスタットは１剤形（総用量６５ｍｇのミグルスタット）、２剤形（総投与量１３０ｍｇのミグルスタット）、または３剤形（総投与量１９５ｍｇのミグルスタット）の投与量として投与され得る。
【0126】
経口使用のための固体および液体組成物は、当該技術分野で周知の方法に従って調製し得る。そのような組成物はまた、固体または液体形態であり得る１つ以上の薬学的に許容される担体および賦形剤を含み得る。錠剤またはカプセルは、結合剤、充填剤、滑沢剤、崩壊剤または湿潤剤を含むがこれらに限定されない、薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の手段によって調製し得る。適切な薬学的に許容される賦形剤は当該技術分野で公知であり、アルファ化デンプン、ポリビニルピロリドン、ポビドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルエチルセルロース（ＨＰＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルク、シリカ、トウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、グリシンクロスカルメロースナトリウムおよびケイ酸塩複合体を含むが、これらに限定されるものではない。錠剤は、当該技術分野で周知の方法によってコーティングすることができる。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットはＺａｖｅｓｃａ（登録商標）（Ａｃｔｅｌｉｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として市販されている製剤として投与される。
【0127】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼは、連続的に投与される。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前にミグルスタットを投与する。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前３時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前の２時間以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１．５時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約１時間前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５０分～約７０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約５５分～約６５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約３０分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２５分～約３５分前に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与の約２７分～約３３分前に投与される。
【0128】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与と同時に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前または投与後２０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前または投与後１５分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前または投与後１０分以内に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与前または投与後５分以内に投与される。
【0129】
少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後に投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後２時間までに投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約３０分で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約１時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約１．５時間で投与される。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットは、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与後約２時間で投与される。
【0130】
本発明の別の態様は、それを必要とする患者におけるポンペ病の併用治療のためのキットを提供する。キットは、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形、本明細書で定義される組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形、およびミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形および組換え酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を、それを必要とする患者に投与するための説明書を含む。少なくとも１つの実施形態において、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形は、錠剤またはカプセルを含むが、これに限定されない、本明細書に記載される経口剤形である。少なくとも１つの実施形態において、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形は、本明細書に記載の注射に適した滅菌溶液である。少なくとも１つの実施形態において、剤形を投与するための説明書は、本明細書に記載されるように、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼを含む薬学的に許容される剤形を静脈内注入によって投与する前に、ミグルスタットを含む薬学的に許容される剤形を投与するための説明書を含む。
【0131】
理論に拘束されるものではないが、ミグルスタットは組換えヒト酸性α－グルコシダーゼＡＴＢ２００の薬理学的シャペロンとして作用し、その活性部位に結合すると考えられている。例えば、ミグルスタットは、アンフォールドＡＴＢ２００タンパク質の割合を減少させ、ＡＴＢ２００の活性立体構造を安定化さし、血漿の中性ｐＨでの変性および不可逆的な不活性化を防止し、循環中で組織に到達して取り込まれるのに十分な長さの生存条件を許容することが見出された。しかしながら、ミグルスタットのＡＴＢ２００の活性部位への結合はまた、天然基質であるグリコーゲンが活性部位にアクセスすることを防止することによって、ＡＴＢ２００の酵素活性の阻害をもたらし得る。ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼが本明細書に記載の条件下で患者に投与される場合、血漿および組織内のミグルスタットおよびＡＴＢ２００の濃度は、ＡＴＢ２００が組織に取り込まれ、リソソームを標的化するまで安定化される程度であるが、ミグルスタットのクリアランスが迅速であるために、リソソーム内のＡＴＢ２００によるグリコーゲンの加水分解は、ミグルスタットの存在によって過度に阻害されず、酵素は治療的に有用な十分な活性を保持すると考えられる。
【0132】
上記のすべての実施形態を組み合わせてもよい。これは、以下に関する特定の実施形態を含む：
・薬理学的シャペロン、例えば、ミグルスタットの性質；およびそれが特異的である活性部位；
・投与量、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）の投与経路、および担体の性質および市販の組成物の使用を含む医薬組成物のタイプ；
・薬の性質、例えば対象において発現が低下または欠損している内因性タンパク質の対応物であってもよい、治療用タンパク質薬物製品、好適には、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、１つ以上のアルグルコシダーゼのアルファマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較した場合に、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ；および好適には、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するもの；
・組換えヒトリソソームタンパク質に結合したＮ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸またはこれらの組み合わせから形成された複合Ｎ－グリカンなどの、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のＮ－グリカン単位の数およびタイプ；
・マンノース－６－リン酸および／またはビス－マンノース－６－リン酸を形成する組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のマンノース単位のリン酸化の程度；
・補充酵素（例えば、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ）の投与量および投与経路（例えば、静脈内投与、特に静脈内注入または標的組織への直接投与）および担体および治療有効量を含む製剤のタイプ；
・薬理学的シャペロン（ミグルスタット）および組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与間隔；
・治療応答の性質および併用治療の結果（例えば、個々に行われる各治療の効果と比較して強化された結果）；
・併用治療の投与タイミング、例えば、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの同時投与または逐次投与、例えば、ミグルスタットが、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの前、または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの後、または投与前または投与後の一定時間内に投与される場合；および
・処置患者の性質（例えば、ヒトなどの哺乳動物）および個体が罹患している病状（例えば、酵素不全）。
・薬理学的シャペロン、例えば、ミグルスタットの性質；およびそれが特異的である活性部位；
・投与量、薬理学的シャペロン（例えば、ミグルスタット）の投与経路、および担体の性質および市販の組成物の使用を含む医薬組成物のタイプ；
・薬の性質、例えば対象において発現が低下または欠損している内因性タンパク質の対応物であってもよい、治療用タンパク質薬物製品、好適には、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現され、１つ以上のアルグルコシダーゼのアルファマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位の含有量と比較した場合に、増加した含有量の１つ以上のマンノース－６－リン酸残基を有するＮ－グリカン単位を含む、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ；および好適には、配列番号１または配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するもの；
・組換えヒトリソソームタンパク質に結合したＮ－アセチルグルコサミン、ガラクトース、シアル酸またはこれらの組み合わせから形成された複合Ｎ－グリカンなどの、組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のＮ－グリカン単位の数およびタイプ；
・マンノース－６－リン酸および／またはビス－マンノース－６－リン酸を形成する組換えヒトリソソームタンパク質（例えば、ｒｈＧＡＡ）上のマンノース単位のリン酸化の程度；
・補充酵素（例えば、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ）の投与量および投与経路（例えば、静脈内投与、特に静脈内注入または標的組織への直接投与）および担体および治療有効量を含む製剤のタイプ；
・薬理学的シャペロン（ミグルスタット）および組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの投与間隔；
・治療応答の性質および併用治療の結果（例えば、個々に行われる各治療の効果と比較して強化された結果）；
・併用治療の投与タイミング、例えば、ミグルスタットおよび組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの同時投与または逐次投与、例えば、ミグルスタットが、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの前、または組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの後、または投与前または投与後の一定時間内に投与される場合；および
・処置患者の性質（例えば、ヒトなどの哺乳動物）および個体が罹患している病状（例えば、酵素不全）。
【0133】
上記リストの任意の実施形態は、リストの他の実施形態の１つ以上と組み合わせることができる。
【実施例】
【0134】
本発明のさらなる特徴は、例として、本発明の原理を説明する以下の非限定的な実施例から明らかになる。
【0135】
実施例１：既存のミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡ製品の限界
現在承認されている唯一のポンペ病処置薬であるミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物を（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）ＣＩＭＰＲカラムに注入し、続いて遊離Ｍ６勾配で溶出した。画分を９６ウェルプレートに集め、ＧＡＡ活性を４ＭＵ－α－グルコース基質によってアッセイした。結合および未結合ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
現在承認されている唯一のポンペ病処置薬であるミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）におけるｒｈＧＡＡの能力を評価するために、これらのｒｈＧＡＡ調製物を（Ｍ６Ｐ基を有するｒｈＧＡＡに結合する）ＣＩＭＰＲカラムに注入し、続いて遊離Ｍ６勾配で溶出した。画分を９６ウェルプレートに集め、ＧＡＡ活性を４ＭＵ－α－グルコース基質によってアッセイした。結合および未結合ｒｈＧＡＡの相対量をＧＡＡ活性に基づいて決定し、全酵素の割合として報告した。
【0136】
図４Ａ～Ｂは、従来のＥＲＴ（ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標））に関連する問題を説明する：ミオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７３％（図４Ｂ）およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの７８％（図４Ａ）は、ＣＩＭＰＲに結合しなかった（各図の一番左のピークを参照）。ミオザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２７％およびルミザイム（登録商標）のｒｈＧＡＡの２２％のみが、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲに標的化し得るＭ６Ｐを含んでいた。
【0137】
ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）の有効用量は、筋肉細胞上のＣＩＭＰＲを標的とするＭ６Ｐを含有するｒｈＧＡＡの量に対応する。しかしながら、これら２つの従来製品におけるｒｈＧＡＡの大部分は、標的筋肉細胞上のＣＩＭＰＲ受容体を標的としない。ｒｈＧＡＡの大部分が筋肉細胞に標的化されていない従来のｒｈＧＡＡの投与は、非標的化ｒｈＧＡＡに対するアレルギー反応または免疫誘導のリスクを増加させる。
【0138】
実施例２：高含有量のモノ－またはビス－Ｍ６Ｐ含有Ｎ－グリカンを有するＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを産生するＣＨＯ細胞の調製
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図５に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。ｒｈＧＡＡをコードするＤＮＡでＣＨＯ細胞を形質転換するためのＤＮＡ構築物を図５に示す。ＣＨＯ細胞を、ｒｈＧＡＡを発現するＤＮＡでトランスフェクトし、続いてｒｈＧＡＡを産生する形質転換体を選択した。
【0139】
トランスフェクション後、安定的に組み込まれたＧＡＡ遺伝子を含むＤＧ４４ ＣＨＯ（ＤＨＦＲ－）細胞をヒポキサンチン／チミジン欠損（－ＨＴ）培地で選択した。
【0140】
これらの細胞におけるＧＡＡ発現の増幅は、メトトレキサート処理（ＭＴＸ、５００ｎＭ）によって誘導された。大量のＧＡＡを発現する細胞プールはＧＡＡ酵素活性アッセイによって同定され、ｒｈＧＡＡを産生する個々のクローンを確立するために使用された。個々のクローンを半固体培地プレート上で生成し、ＣｌｏｎｅＰｉｘシステムにより採取し、２４ディープウェルプレートに移した。個々のクローンをＧＡＡ酵素活性についてアッセイして、高レベルのＧＡＡを発現するクローンを同定した。ＧＡＡ活性を決定するための条件培地は、４－ＭＵ－α－グルコシダーゼ基質を用いた。ＧＡＡ酵素アッセイによって測定される、より高レベルのＧＡＡを産生するクローンを生存能力、成長能力、ＧＡＡ生産性、Ｎ－グリカン構造および安定なタンパク質発現についてさらに評価した。強化されたモノ－Ｍ６Ｐまたはビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンを有するｒｈＧＡＡを発現するＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を含むＣＨＯ細胞株を、この手順を用いて単離した。
【0141】
実施例３：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡの捕捉と精製
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチを、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を用いて振盪フラスコおよび灌流バイオリアクターで産生し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡについて、図７Ｂおよび図８に示されるものと同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）が観察され、これはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが一貫して産生され得ることを示す。図４Ａ、４Ｂ、７Ａおよび７Ｂに示されるように、ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡよりも有意に低いＣＩＭＰＲ結合を示した。
本発明によるｒｈＧＡＡの複数のバッチを、ＣＨＯ細胞株ＧＡ－ＡＴＢ－２００を用いて振盪フラスコおよび灌流バイオリアクターで産生し、ＣＩＭＰＲ結合を測定した。異なる産生バッチからの精製ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡについて、図７Ｂおよび図８に示されるものと同様のＣＩＭＰＲ受容体結合（約７０％）が観察され、これはＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが一貫して産生され得ることを示す。図４Ａ、４Ｂ、７Ａおよび７Ｂに示されるように、ミオザイム（登録商標）およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡは、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡよりも有意に低いＣＩＭＰＲ結合を示した。
【0142】
実施例４：ルミザイム（登録商標）に対するＡＴＢ２００の分析比較
弱いアニオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸によりＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを分画した。溶出プロファイルは、増加する量の塩でＥＲＴを溶出することによって生成された。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニターした。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。ルミザイム（登録商標）は商業的供給源から入手した。ルミザイム（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側に高いピークを示した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）の右側に溶出する４つの顕著なピークを示した（図９）。これにより、この評価がＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるものであるため、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがルミザイム（登録商標）よりも大幅にリン酸化されたことを確認される。
弱いアニオン交換（「ＷＡＸ」）液体クロマトグラフィーを使用して、末端リン酸によりＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡを分画した。溶出プロファイルは、増加する量の塩でＥＲＴを溶出することによって生成された。プロファイルをＵＶ（Ａ２８０ｎｍ）でモニターした。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡをＣＨＯ細胞から得て精製した。ルミザイム（登録商標）は商業的供給源から入手した。ルミザイム（登録商標）は、その溶出プロファイルの左側に高いピークを示した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）の右側に溶出する４つの顕著なピークを示した（図９）。これにより、この評価がＣＩＭＰＲ親和性ではなく末端電荷によるものであるため、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがルミザイム（登録商標）よりも大幅にリン酸化されたことを確認される。
【0143】
実施例５：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡのオリゴ糖特性
精製したＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡおよびルミザイム（登録商標）グリカンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上に見出される個々のグリカン構造を決定した（図１０）。ＡＴＢ２００試料は、ルミザイム（登録商標）より少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンを含有することが判明した。ルミザイム（登録商標）よりもＡＴＢ２００のＭ６Ｐグリカンの含有量が高いほど、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが筋肉細胞をより効果的に標的とする。ＭＡＬＤＩによって決定されるモノ－リン酸化およびビス－リン酸化構造の高いパーセンテージは、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ２００の結合が有意に大きいことを示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によるＮ－グリカン分析は、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ上の、このビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンのより高い含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイ（ＫＤ約２～４ｎＭ）においてＣＩＭＰＲへの高親和性結合と直接相関していた、図１２Ａ。
精製したＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡおよびルミザイム（登録商標）グリカンをＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで評価し、各ＥＲＴ上に見出される個々のグリカン構造を決定した（図１０）。ＡＴＢ２００試料は、ルミザイム（登録商標）より少ない量の非リン酸化高マンノース型Ｎ－グリカンを含有することが判明した。ルミザイム（登録商標）よりもＡＴＢ２００のＭ６Ｐグリカンの含有量が高いほど、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡが筋肉細胞をより効果的に標的とする。ＭＡＬＤＩによって決定されるモノ－リン酸化およびビス－リン酸化構造の高いパーセンテージは、ＣＩＭＰＲ受容体へのＡＴＢ２００の結合が有意に大きいことを示したＣＩＭＰＲプロファイルと一致する。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によるＮ－グリカン分析は、平均して各ＡＴＢ２００分子が少なくとも１つの天然ビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカン構造を含有することを確認した。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ上の、このビス－Ｍ６Ｐ Ｎ－グリカンのより高い含有量は、Ｍ６Ｐ受容体プレート結合アッセイ（ＫＤ約２～４ｎＭ）においてＣＩＭＰＲへの高親和性結合と直接相関していた、図１２Ａ。
【0144】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡも、２つの異なるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析技術を用いて部位特異的Ｎ－グリカンプロファイルについて分析した。第１の分析では、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析前にタンパク質を変性させ、還元し、アルキル化し、消化した。タンパク質の変性および還元中、２００μｇのタンパク質試料、５μｌの１モル／Ｌトリス－ＨＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、７５μＬの８モル／ＬグアニジンＨＣｌ（最終濃度６Ｍ）、１μＬの０．５モル／Ｌ ＥＤＴＡ（最終濃度５ｍＭ）、２μＬの１モル／Ｌ ＤＴＴ（最終濃度２０ｍＭ）およびＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）水を１．５ｍＬチューブに添加して、１００μＬの全容量を提供した。試料を混合し、乾燥浴中において５６℃で３０分間インキュベートした。アルキル化中、変性および還元タンパク質試料を５μＬの１モル／Ｌヨードアセトアミド（ＩＡＭ、最終濃度５０ｍＭ）と混合し、次いで暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化後、４００μＬの予冷されたアセトンを試料に加え、混合物を－８０℃で４時間凍結させた。次いで、試料を４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。予冷されたアセトン４００μｌをペレットに添加し、次いでこれを４℃、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。試料を暗所にて氷上で風乾し、アセトン残留物を除去した。４０μＬの８Ｍ尿素および１６０μＬの１００μＭＮＨ４ＨＣＯ３を試料に添加して、タンパク質を溶解させた。トリプシン消化中、５０μｇのタンパク質をトリプシン消化緩衝液と添加して最終容積１００μｌとし、５μＬの０．５μｇ／ｍＬトリプシン（タンパク質対酵素比２０／１ｗ／ｗ）を添加した。溶液をよく混合し、３７℃で一晩（１６±２時間）インキュベートした。２．５μｌの２０％ＴＦＡ（最終濃度０．５％）を加えて反応を停止させた。次に、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ（商標）質量分析計を用いて試料を分析した。
【0145】
第２のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析では、ＩＡＭの代わりにアルキル化試薬としてヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いた以外、同様の変性、還元、アルキル化および消化手順に従ってＡＴＢ２００試料を調製し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ Ｔｒｉｂｉｄ（商標）質量分析計を用いて分析した。
【0146】
第１および第２の分析の結果を図１１Ａ～１１Ｈに示す。図１１Ａ～１１Ｈにおいて、第１の分析の結果は左のバー（濃い灰色）で表され、第２の分析の結果は右のバー（薄い灰色）で表される。図１１Ｂ～１１Ｇにおいて、グリカンの記号命名法はＶａｒｋｉ，Ａ．，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｅｓｋｏ Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（２００９）に従う。
【0147】
図８Ａ～８Ｉから分かるように、２つの分析は同様の結果を示したが、その結果の間にはある程度の差異があった。この変化は、使用機器およびＮ－グリカン分析の完全性を含む多くの要因に起因し得る。例えば、リン酸化されたグリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、リン酸化されたグリカンの総数は過小評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過小評価される可能性がある。別の例として、非リン酸化グリカンのいくつかの種が同定されていないか、および／または定量化されていない場合、非リン酸化グリカンの総数は過大評価される可能性があり、その部位でリン酸化されたグリカンを有するｒｈＧＡＡのパーセンテージは、過大評価される可能性がある。図１１Ａは、ＡＴＢ２００のＮ－グリコシル化部位占有率を示す。図１１Ａから分かるように、第１、第２、第３、第４、第５および第６のＮ－グリコシル化部位は、それぞれの潜在的部位で検出されたグリカンを有するＡＴＢ２００酵素の９０％超および最大約１００％を検出する両分析により、大部分が占有される。しかしながら、第７の潜在的Ｎ－グリコシル化部位は、約半分の時間でグリコシル化される。
【0148】
図１１Ｂは、第１の部位であるＮ８４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｂから分かるように、主要なグリカン種はビス－Ｍ６Ｐグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７５％以上が第１の部位にビス－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【0149】
図１１Ｃは、第２の部位であるＮ１７７のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｃから分かるように、主要なグリカン種は、モノ－Ｍ６Ｐグリカンおよび非リン酸化高マンノースグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位にモノ－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。
【0150】
図１１Ｄは、第３の部位であるＮ３３４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｄから分かるように、主要なグリカン種は、非リン酸化高マンノースグリカン、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカン、ならびにハイブリッドグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２０％以上が第３の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0151】
図１１Ｅは、第４の部位であるＮ４１４のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｅから分かるように、主要なグリカン種はビス－Ｍ６Ｐおよびモノ－ＭＧＰグリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の４０％以上が第４の部位にビス－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことが検出された。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の２５％以上が第４の部位にモノ－Ｍ６Ｐグリカンを有していたことも検出された。
【0152】
図１１Ｆは、第５の部位であるＮ５９６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、フコシル化されたジ－アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の７０％以上が第５の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0153】
図１１Ｇは、第６の部位であるＮ８２６のＮ－グリコシル化プロファイルを示す。図１１Ｆから分かるように、主要なグリカン種は、ジ－、トリ－、およびテトラ－アンテナリ複合グリカンである。第１および第２の分析の両方で、ＡＴＢ２００の８０％以上が第６の部位にシアル酸残基を有していたことが検出された。
【0154】
第７の部位であるＮ８６９のグリコシル化の分析は、最も一般的なグリカンがＡ４Ｓ３Ｓ３ＧＦ（１２％）、Ａ５Ｓ３Ｇ２Ｆ（１０％）、Ａ４Ｓ２Ｇ２Ｆ（８％）およびＡ６Ｓ３Ｇ３Ｆ（８％）である、約４０％のグリコシル化を示した。
【0155】
図１１Ｈは、７つの潜在的Ｎ－グリコシル化部位のそれぞれにおけるリン酸化の概要を示す。図１１Ｇから分かるように、第１および第２の分析の両方で、第１、第２および第４の部位における高いリン酸化レベルが検出された。両方の分析は、ＡＴＢ２００の８０％以上が第１の部位でモノ－またはジ－リン酸化されていたこと、ＡＴＢ２００の４０％以上が第２の部位でモノ－リン酸化されていたこと、およびＡＴＢ２００の８０％以上が第４の部位でモノ－またはジ－リン酸化されていたことを検出した。
【0156】
親水性相互作用液体クロマトグラフィー－蛍光検出－質量分析（ＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ）法に従って、ＡＴＢ２００の別のグリカン分析を行った。
【0157】
ＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ分析の結果を以下の表５に示す。表５において、３桁の数字の最初の数字はグリカンの枝の数を示し、２番目の数字はコアフコース単位の数を示し、３番目の数字は末端シアル酸単位の数を示す。この命名法を用いて、「３０３」は０個のコアフコース（２番目の０）および３つの末端シアル酸（最後の３）を有する３分岐型グリカン（最初の３）を表し、「２１２」は１つのコアフコースおよび２つの末端シアル酸を有する２分岐型グリカンを表し、「４０４」は０個のコアフコースおよび４つの末端シアル酸を含む４分岐型グリカンを表す、などである。
【0158】
【0159】
【0160】
【0161】
このＨＩＬＩＣ－ＦＬＤ－ＭＳ分析に基づいて、試験したＡＴＢ２００は、モルＡＴＢ２００当たり２～３モルの平均フコース含量、モルＡＴＢ２００当たり２０～２５モルのＧｌｃＮＡｃ含量、モルＡＴＢ２００当たり８～１２モルのガラクトース含量、モルＡＴＢ２００当たり２２～２７モルのマンノース含量、モルＡＴＢ２００当たり３～５モルのＭ６Ｐ含有量、およびモルＡＴＢ２００当たり４～７モルのシアル酸含有量を有することが期待される。
【0162】
実施例６：ＡＴＢ２００のＣＩＭＰＲ親和性特性
ＣＩＭＰＲに結合し得るｒｈＧＡＡの割合がより高いことに加え、その相互作用の質を理解することが重要である。ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ受容体結合を、ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＩＭＰＲ被覆プレートを用いてＧＡＡを捕捉した。様々な濃度のｒｈＧＡＡを、固定化した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い流した。残りのｒｈＧＡＡ量は、ＧＡＡ活性によって決定された。図１２Ａに示すように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）より有意に良好に、ＣＩＭＰＲに結合した。
ＣＩＭＰＲに結合し得るｒｈＧＡＡの割合がより高いことに加え、その相互作用の質を理解することが重要である。ルミザイム（登録商標）およびＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ受容体結合を、ＣＩＭＰＲプレート結合アッセイを用いて測定した。簡潔には、ＣＩＭＰＲ被覆プレートを用いてＧＡＡを捕捉した。様々な濃度のｒｈＧＡＡを、固定化した受容体に適用し、未結合ｒｈＧＡＡを洗い流した。残りのｒｈＧＡＡ量は、ＧＡＡ活性によって決定された。図１２Ａに示すように、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイム（登録商標）より有意に良好に、ＣＩＭＰＲに結合した。
【0163】
図１２Ｂは、ルミザイム（登録商標）、従来のｒｈＧＡＡ、および本発明によるＡＴＢ２００におけるビス－Ｍ６Ｐグリカンの相対含有量を示す。ルミザイム（ルミザイム）（登録商標）では、平均して１０％の分子のみがビス－リン酸化グリカンを有する。これを、平均して全てのｒｈＧＡＡ分子が少なくとも１つのビス－リン酸化グリカンを有するＡＴＢ２００と対比する。
【0164】
実施例７：ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、ルミザイムよりも線維芽細胞により効率的に内在化された
ＡＴＢ２００およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを、正常およびポンペ（Ｐｏｍｐｅ）線維芽細胞系を用いて比較した。比較は、本発明による５～１００ｎＭのＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡと１０～５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡルミザイム（登録商標）との比較を含んでいた。１６時間のインキュベーション後、外部ｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞を収集前にＰＢＳで３回洗浄した。内在化ＧＡＡは、４ＭＵ－α－グルコシド加水分解によって測定され、総細胞タンパク質に対してグラフ化され、その結果は図１３Ａ～Ｂに表される。
ＡＴＢ２００およびルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡの相対的な細胞取り込みを、正常およびポンペ（Ｐｏｍｐｅ）線維芽細胞系を用いて比較した。比較は、本発明による５～１００ｎＭのＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡと１０～５００ｎＭの従来のｒｈＧＡＡルミザイム（登録商標）との比較を含んでいた。１６時間のインキュベーション後、外部ｒｈＧＡＡをＴＲＩＳ塩基で不活性化し、細胞を収集前にＰＢＳで３回洗浄した。内在化ＧＡＡは、４ＭＵ－α－グルコシド加水分解によって測定され、総細胞タンパク質に対してグラフ化され、その結果は図１３Ａ～Ｂに表される。
【0165】
ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡはまた、それぞれ効率的に細胞内に内在化することが示され（図１３Ａおよび１３Ｂ）、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡ正常およびポンペ線維芽細胞の両方に内在化し、従来のルミザイム（登録商標）ｒｈＧＡＡよりも高度に内在化していること示す。ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡは、約２０ｎＭで細胞受容体を飽和させる一方、ルミザイム（登録商標）は約２５０ｎＭ必要である。これらの結果から外挿される取り込み効率定数（Ｋ取り込み）は、図１３Ｃに示すように、ＡＴＢ２００では２～３ｎｍであり、ルミザイム（登録商標）では５６ｎＭである。これらの結果は、ＡＴＢ２００ ｒｈＧＡＡがポンペ病によく標的化された処置であることを示唆している。
【0166】
実施例８：Ｇａａノックアウトマウスにおけるグリコーゲン還元
図１４Ａ～１４Ｃは、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。動物は２回のＩＶボーラス投与（隔週）を受けた。最終投与の２週間後に組織を収集し、酸性α－グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含有量について分析した。
図１４Ａ～１４Ｃは、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果を示す。動物は２回のＩＶボーラス投与（隔週）を受けた。最終投与の２週間後に組織を収集し、酸性α－グルコシダーゼ活性およびグリコーゲン含有量について分析した。
【0167】
図１４Ａ～１４Ｃから分かるように、ＡＴＢ２００は、酸性α－グルコシダーゼ（Ｇａａ）ノックアウトマウスの組織グリコーゲンを用量依存的に激減させることが判明した。２０ｍｇ／ｋｇ用量のＡＴＢ２００は、Ｇａａノックアウトマウスにおいて、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量レベルよりも大きい割合で貯蔵グリコーゲンを一貫して除去した。しかしながら、図１４Ａ～１４Ｃに見られるように、５ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、マウス心臓および骨格筋（四頭筋および三頭筋）におけるグリコーゲンの、２０ｍｇ／ｋｇで投与されたルミザイム（登録商標）と同様の減少を示した一方、１０および２０ｍｇ／ｋｇで投与されたＡＴＢ２００は、ルミザイム（登録商標）よりも骨格筋におけるグリコーゲンレベルの著しく良好な低下を示した。
【0168】
図１５は、アルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））およびＡＴＢ２００の、Ｇａａノックアウトマウスにおける投与の効果、ならびにグリコーゲンクリアランスにおいてＡＴＢ２００およびミグルスタットを共投与することの効果を示す。１２週齢のＧＡＡ ＫＯマウスを、Ｌｕｍｉｚｙｍｅ（登録商標）またはＡＴＢ２００、２０ｍｇ／ｋｇ ＩＶで４週間おきに注射し；示されるように、ｒｈＧＡＡの３０分前に１０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯでミグルスタットを共投与した。グリコーゲン測定の最後の酵素用量の１４日後に組織を収集した。図１５は、四頭筋および三頭筋骨格筋におけるグリコーゲンの相対的減少を示し、ＡＴＢ２００は、ルミザイム（登録商標）よりも大きいグリコーゲンの減少を生じ、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、さらにより大きいグリコーゲンの減少を生じる。
【0169】
実施例９：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉生理学および形態学
Ｇａａノックアウトマウスに、隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の２回のＩＶボーラス投与を与えた。ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の投与の３０分前にＡＴＢ２００で処置した動物のサブセットに、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与された。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。ヒラメ筋、四頭筋および隔膜組織は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集される。ヒラメ筋および隔膜組織は、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてポンペ病においてアップレギュレートされたリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）マーカーのレベルを測定することにより分析した。エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋された四頭筋の半薄切片をメチレンブルーで染色し、電子顕微鏡（１０００×）で観察し、空胞の存在の程度を決定した。四頭筋試料を免疫組織化学的に分析して、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを決定した。
Ｇａａノックアウトマウスに、隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の２回のＩＶボーラス投与を与えた。ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の投与の３０分前にＡＴＢ２００で処置した動物のサブセットに、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与された。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。ヒラメ筋、四頭筋および隔膜組織は、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集される。ヒラメ筋および隔膜組織は、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することにより、およびリソソーム増殖についてポンペ病においてアップレギュレートされたリソソーム関連膜タンパク質（ＬＡＭＰ１）マーカーのレベルを測定することにより分析した。エポキシ樹脂（Ｅｐｏｎ）に包埋された四頭筋の半薄切片をメチレンブルーで染色し、電子顕微鏡（１０００×）で観察し、空胞の存在の程度を決定した。四頭筋試料を免疫組織化学的に分析して、オートファジーマーカー微小管関連タンパク質１Ａ／１Ｂ型軽鎖３ホスファチジルエタノールアミンコンジュゲート（ＬＣ３Ａ ＩＩ）およびｐ６２、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルを決定した。
【0170】
同様の実験において、Ｇａａノックアウトマウスに隔週で２０ｍｇ／ｋｇの組換えヒト酸性α－グルコシダーゼ（アルグルコシダーゼアルファまたはＡＴＢ２００）の４回のＩＶボーラス投与を与えた。ミグルスタットは、ＡＴＢ２００の投与の３０分前にＡＴＢ２００で処置した動物のサブセットに、１０ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与された。コントロールマウスは、溶媒のみで処置した。心臓筋肉組織を、組換えヒト酸性α－グルコシダーゼの最後の投与の２週間後に収集し、グリコーゲンレベルについて過ヨウ素酸シッフ試薬（ＰＡＳ）で染色することによって、およびリソソーム増殖についてＬＡＭＰ１のレベルを測定することによって分析した。
【0171】
図１６に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織におけるリソソーム増殖の減少を示し、ＡＴＢ２００とのミグルスタットの共投与は、リソソーム増殖において、野生型（ＷＴ）マウスに見られるレベルに近づいていることを示した。さらに、図１７に見られるように、ＡＴＢ２００の投与は、アルグルコシダーゼアルファによる従来の処置と比較して、心臓および骨格筋（ヒラメ筋）組織における点状のグリコーゲンレベルの減少を示し、ＡＴＢ２００とのミグルスタットの共投与は、再び野生型（ＷＴ）マウスに見られるレベルに近づいていることを示した。
【0172】
同様に、図１８に見られるように、ミグルスタットとＡＴＢ２００との共投与は、未処置のマウスおよびアルグルコシダーゼアルファで処置したマウスと比較して、Ｇａａノックアウトマウスの四頭筋における筋線維中の空胞の数を有意に減少させた。図１９に見られるように、ＬＣ３ＩＩおよびｐ６２の両方のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスで増加するが、ＡＴＢ２００およびミグルスタットでの処置で有意に減少し、これは酸性α－グルコシダーゼ欠乏に関連するオートファジーの増加がＡＴＢ２００およびミグルスタットの共投与で減少することを示唆している。さらに、インスリン依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４およびインスリン非依存性グルコーストランスポーターＧＬＵＴ１のレベルは、野生型マウスと比較してＧａａノックアウトマウスにおいて増加するが、再び、ＡＴＢ２００およびミグルスタットでの処置で有意に低下する。酸性α－グルコシダーゼ欠乏に関連する上昇したＧＬＵＴ４およびＧＬＵＴ１レベルは、筋線維へのグルコース取り込みの増加に寄与し得、基礎および食物摂取後の両方でグリコーゲン合成の増加をもたらす。したがって、ＡＴＢ２００およびミグルスタットでの併用処置は、ポンペ病のマウスモデルにおける骨格筋の形態学および生理学を改善することが見出された。
【0173】
実施例１０：Ｇａａノックアウトマウスにおける筋肉機能
１２回の隔週投与の長期実験では、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットは、握力およびワイヤハング試験（図２１Ａ～２１Ｂ）の両方によって測定されたベースラインからＧａａＫＯマウスの機能的筋力を進行的に増加させた。同一のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）を受けたアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））処置マウスは、実験の大部分を通して同一条件下で低下することが観察された（図２１Ａ～２１Ｂ）。短期実験と同様に、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファよりも処置の３ヶ月後（図２２Ａ～２２Ｃ）および６ヶ月後（図２２Ｄ～２２Ｇ）に実質的により良好なグリコーゲンクリアランスを有していた。ＡＴＢ２００／ミグルスタットはまた、アルグルコシダーゼアルファと比較して、３ヶ月の処置後、オートファジーおよびＬＡＭＰ１およびジスフェリンの細胞内蓄積を減少させた（図２３）。図２１Ａにおいて、＊は、ルミザイム単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）。図２２Ａ～２２Ｇにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ分析の下でＤｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較）。
１２回の隔週投与の長期実験では、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００＋１０ｍｇ／ｋｇのミグルスタットは、握力およびワイヤハング試験（図２１Ａ～２１Ｂ）の両方によって測定されたベースラインからＧａａＫＯマウスの機能的筋力を進行的に増加させた。同一のＥＲＴ用量（２０ｍｇ／ｋｇ）を受けたアルグルコシダーゼアルファ（ルミザイム（登録商標））処置マウスは、実験の大部分を通して同一条件下で低下することが観察された（図２１Ａ～２１Ｂ）。短期実験と同様に、ＡＴＢ２００／ミグルスタットは、アルグルコシダーゼアルファよりも処置の３ヶ月後（図２２Ａ～２２Ｃ）および６ヶ月後（図２２Ｄ～２２Ｇ）に実質的により良好なグリコーゲンクリアランスを有していた。ＡＴＢ２００／ミグルスタットはまた、アルグルコシダーゼアルファと比較して、３ヶ月の処置後、オートファジーおよびＬＡＭＰ１およびジスフェリンの細胞内蓄積を減少させた（図２３）。図２１Ａにおいて、＊は、ルミザイム単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、両側ｔ検定）。図２２Ａ～２２Ｇにおいて、＊は、ルミザイム（登録商標）単独と比較して統計的に有意であることを示す（ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ分析の下でＤｕｎｎｅｔｔの方法を用いた多重比較）。
【0174】
まとめると、これらのデータは、ＡＴＢ２００／ミグルスタットが効率的に筋肉を標的とし、細胞機能障害を逆行させ、筋肉機能を改善したことを示す。重要なことに、筋肉構造の明らかな改善ならびにＬＡＭＰ１およびジスフェリンのオートファジーおよび細胞内蓄積の減少は、機能的筋力の改善と相関する改善された筋肉生理学のための良い代替となり得る。これらの結果は、臨床実験における筋肉生検から有用なバイオマーカーであると判明する可能性のあるＧａａＫＯマウスにおけるポンペ病の治療的処置の効果を評価するために、オートファジーおよびこれらの重要な筋肉タンパク質のモニタリングが合理的で実用的な方法であることを示唆している。
【0175】
図２３は、ミグルスタットを伴うまたは伴わない６ヶ月のＡＴＢ２００投与が、ＧａａＫＯマウスにおけるジストロフィンの細胞内蓄積を低下させることを示す。ＡＴＢ２００±ミグルスタットについて、ルミザイム（登録商標）よりもジストロフィンの蓄積が大幅に減少した。
【0176】
実施例１１：ｒｈα－Ｇａｌ Ａの捕捉
使用済み細胞培養培地中の組換えヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα－Ｇａｌ Ａ）のＣＩＭＰＲ結合プロファイルを、ＡＥＸクロマトグラフィーを用いた生成物捕捉の前（図２０Ａ）、およびＡＥＸクロマトグラフィーを用いた生成物捕捉の後（図２０Ｂ）に測定した。両方のグラフにおける破線は、Ｍ６Ｐ溶出勾配を示す。ＡＥＸ生成物の捕捉前に、ｒｈα－Ｇａｌ Ａの８０％がＣＩＭＰＲに結合することができる。ＡＥＸ生成物捕捉後、全ｒｈα－Ｇａｌ Ａ結合は９６％に増加する。
使用済み細胞培養培地中の組換えヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ｒｈα－Ｇａｌ Ａ）のＣＩＭＰＲ結合プロファイルを、ＡＥＸクロマトグラフィーを用いた生成物捕捉の前（図２０Ａ）、およびＡＥＸクロマトグラフィーを用いた生成物捕捉の後（図２０Ｂ）に測定した。両方のグラフにおける破線は、Ｍ６Ｐ溶出勾配を示す。ＡＥＸ生成物の捕捉前に、ｒｈα－Ｇａｌ Ａの８０％がＣＩＭＰＲに結合することができる。ＡＥＸ生成物捕捉後、全ｒｈα－Ｇａｌ Ａ結合は９６％に増加する。
【0177】
実施例１２：ポンペ病を有するＥＲＴ経験患者およびＥＲＴ未経験患者における、ミグルスタットと共投与した組換え酸性α－グルコシダーゼＡＴＢ２００の薬物動態および安全性データ
この実験は、ミグルスタットと併用投与されたＡＴＢ２００の安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を主に評価するよう設計された。ＧａａノックアウトマウスのＰＫ／薬力学（ＰＤ）翻訳モデルから、ヒトにおける２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量（例えば、２６０ｍｇ）のミグルスタットとの組み合わせが、最適なグリコーゲン低減を提供することが予測される。
この実験は、ミグルスタットと併用投与されたＡＴＢ２００の安全性、忍容性、および薬物動態（ＰＫ）を主に評価するよう設計された。ＧａａノックアウトマウスのＰＫ／薬力学（ＰＤ）翻訳モデルから、ヒトにおける２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量（例えば、２６０ｍｇ）のミグルスタットとの組み合わせが、最適なグリコーゲン低減を提供することが予測される。
【0178】
以下の説明において、ミグルスタットの「高用量」は約２６０ｍｇの用量を指し、「低用量」は約１３０ｍｇの用量を指す。
【0179】
この目的は、この第１／２相試験において、１０人の患者からの予備的総ＧＡＡタンパク質、ＡＴＢ２００およびミグルスタットＰＫデータ、および安全性マーカーを評価することであった。
【0180】
これは、ポンペ病を有する成人における経口ミグルスタットと共投与したＡＴＢ２００の静脈内注入の安全性、忍容性、ＰＫ、ＰＤ、および有効性を評価するための、オープンラベル、一定連続、用量漸増、ヒト初回、第１／２相実験の実験デザインを示す（図２４）。来診９を通じた最初の８人のコホート１患者、および最初の２人のコホート３患者からの、平均総ＧＡＡタンパク質およびミグルスタットＰＫの結果の評価を行った。
ａコホート２および３での投与前に、各用量レベルにおいて、コホート１の２人のセンチネル患者からの安全データをレビューした。
ｂステージ２および３では、ＡＴＢ２００静脈内注入の開始前にミグルスタットを経口投与した。すべての用量について、ＡＴＢ２００を静脈内に４時間注入した。
ｃコホート２および３の最初の２人の患者は、それぞれのコホートにつきセンチネル患者となった。
ａコホート２および３での投与前に、各用量レベルにおいて、コホート１の２人のセンチネル患者からの安全データをレビューした。
ｂステージ２および３では、ＡＴＢ２００静脈内注入の開始前にミグルスタットを経口投与した。すべての用量について、ＡＴＢ２００を静脈内に４時間注入した。
ｃコホート２および３の最初の２人の患者は、それぞれのコホートにつきセンチネル患者となった。
【0181】
主要な参加基準
・報告されたＧＡＡ酵素活性の欠乏に基づいて、またはＧＡＡ遺伝子型判定によって、ポンペ病と診断された１８～６５才の男性および女性
・試験開始前に２～６年間（コホート２については２年以上）、アルグルコシダーゼアルファを用いてＥＲＴを受けた（コホート１）
・現在、隔週の頻度でアルグルコシダーゼアルファを投与されており、投薬中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後の２回の注入を完了した（コホート１および２）
・６分間歩行試験（コホート１および３）で２００～５００メートルを歩くことができなければならない
・直立努力性肺活量は、予測正常値の３０％～８０％でなければならない（コホート１および３）
・車椅子生活であり、補助なしで歩行することが不能でなければならない（コホート２）
ＰＫ分析：
・血漿総ＧＡＡタンパク質および活性濃度についての血液試料を収集した
・ステージ１：ＡＴＢ２００注入の開始前、および注入の１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後
・ステージ２および３：ミグルスタット経口投与後１、２、３、４、４．５、５、６、７、９、１１、１３および２５時間
・血漿ミグルスタット濃度の血液試料は、ミグルスタット経口投与の直前（時間０）およびミグルスタット経口投与後１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、９、１１および２５時間後に採取した。血漿ミグルスタットは、有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定される
・ＡＴＢ２００についての血漿中の総ＧＡＡタンパク質濃度５、１０および２０ｍｇ／ｋｇを、ｒｈＧＡＡ特異的「シグネチャー」ペプチド（単数または複数）の有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量化によって決定した
・報告されたＧＡＡ酵素活性の欠乏に基づいて、またはＧＡＡ遺伝子型判定によって、ポンペ病と診断された１８～６５才の男性および女性
・試験開始前に２～６年間（コホート２については２年以上）、アルグルコシダーゼアルファを用いてＥＲＴを受けた（コホート１）
・現在、隔週の頻度でアルグルコシダーゼアルファを投与されており、投薬中断を生じる薬物関連有害事象なしに最後の２回の注入を完了した（コホート１および２）
・６分間歩行試験（コホート１および３）で２００～５００メートルを歩くことができなければならない
・直立努力性肺活量は、予測正常値の３０％～８０％でなければならない（コホート１および３）
・車椅子生活であり、補助なしで歩行することが不能でなければならない（コホート２）
ＰＫ分析：
・血漿総ＧＡＡタンパク質および活性濃度についての血液試料を収集した
・ステージ１：ＡＴＢ２００注入の開始前、および注入の１、２、３、３．５、４、４．５、５、６、８、１０、１２および２４時間後
・ステージ２および３：ミグルスタット経口投与後１、２、３、４、４．５、５、６、７、９、１１、１３および２５時間
・血漿ミグルスタット濃度の血液試料は、ミグルスタット経口投与の直前（時間０）およびミグルスタット経口投与後１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、９、１１および２５時間後に採取した。血漿ミグルスタットは、有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイによって決定される
・ＡＴＢ２００についての血漿中の総ＧＡＡタンパク質濃度５、１０および２０ｍｇ／ｋｇを、ｒｈＧＡＡ特異的「シグネチャー」ペプチド（単数または複数）の有効なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ定量化によって決定した
【0182】
ステージ１およびステージ２を完了したコホート１の患者８人およびステージ３を開始したコホート３の患者２人について予備分析を完了した。
・最初のＥＲＴスイッチ患者は、ポンペ病の集団を代表しており、平均５．０２年のＥＲＴを受けていた（表６）
・最初のＥＲＴスイッチ患者は、ポンペ病の集団を代表しており、平均５．０２年のＥＲＴを受けていた（表６）
【0183】
【0184】
総ＧＡＡタンパク質
単独で投与された場合、ＡＴＢ２００はわずかに用量比例を上回って増加する（表７および図２５Ａ～２５Ｄ）。変動性は、ミグルスタット投与量とともに増加するようである（図２５Ｃ）。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量のミグルスタット（２６０ｍｇ）との共投与は、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独と比較して総ＧＡＡタンパク質曝露（ＡＵＣ）を約２５％増加させた。分布半減期（α相）は４５％増加し、これは高用量のミグルスタットがＡＴＢ２００を血漿中で安定化させることを示唆している。分布半減期の増加には、投与後約１２時間までの、時間から最大血漿濃度までのＡＵＣの増加が付随する。ＡＵＣおよび半減期の増加は、末端排出段階の間、対数スケールで観察することができる（図２５Ｂ）。ＡＴＢ２００は比較的高い分布容積を示した。血漿総ＧＡＡタンパク質の性質は、ＥＲＴ未経験患者（コホート３）とＥＲＴ経験患者（コホート１）との間で類似しているようである（図２５Ａおよび２５Ｄ）。
単独で投与された場合、ＡＴＢ２００はわずかに用量比例を上回って増加する（表７および図２５Ａ～２５Ｄ）。変動性は、ミグルスタット投与量とともに増加するようである（図２５Ｃ）。２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００と高用量のミグルスタット（２６０ｍｇ）との共投与は、２０ｍｇ／ｋｇのＡＴＢ２００単独と比較して総ＧＡＡタンパク質曝露（ＡＵＣ）を約２５％増加させた。分布半減期（α相）は４５％増加し、これは高用量のミグルスタットがＡＴＢ２００を血漿中で安定化させることを示唆している。分布半減期の増加には、投与後約１２時間までの、時間から最大血漿濃度までのＡＵＣの増加が付随する。ＡＵＣおよび半減期の増加は、末端排出段階の間、対数スケールで観察することができる（図２５Ｂ）。ＡＴＢ２００は比較的高い分布容積を示した。血漿総ＧＡＡタンパク質の性質は、ＥＲＴ未経験患者（コホート３）とＥＲＴ経験患者（コホート１）との間で類似しているようである（図２５Ａおよび２５Ｄ）。
【0185】
【0186】
ミグルスタットＰＫ
ミグルスタットは用量比例的動態を示した（表８および図２６）。血漿ミグルスタットは、単回投与と複数投与の間で同様のようである。
ミグルスタットは用量比例的動態を示した（表８および図２６）。血漿ミグルスタットは、単回投与と複数投与の間で同様のようである。
【0187】
【0188】
薬力学
コホート１からのＥＲＴ経験患者における１１回目の来診までに（図２７Ａおよび２７Ｂ）：
・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は８人中５人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する４／４人の患者が標準化された
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する３／４人の患者が標準化された
・クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する２／６人の患者が標準化された
・尿中グルコース四糖（ＨＥＸ４）濃度は、８人の患者のうち８人で減少した
コホート１からのＥＲＴ経験患者における１１回目の来診までに（図２７Ａおよび２７Ｂ）：
・アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は８人中５人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する４／４人の患者が標準化された
・アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する３／４人の患者が標準化された
・クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）は８人中６人の患者で減少し、上昇したベースラインレベルを有する２／６人の患者が標準化された
・尿中グルコース四糖（ＨＥＸ４）濃度は、８人の患者のうち８人で減少した
【0189】
第４週までに、治療未経験コホート（コホート３）の２人の患者において、４つのバイオマーカーレベルがすべて減少した（図２７Ｃおよび２７Ｄ）。
【0190】
図２７Ａ～２７Ｄにおいて、データは平均±標準誤差として表される。
【0191】
安全性
・すべての患者において１５５回以上の全注入後に重篤な有害事象（ＡＥ）または注入関連反応は報告されなかった
・１１／１３（８４％）の患者で報告された、処置により発生したＡＥは、一般に軽度かつ一時的であった。
・７／１３（５３％）の患者で報告された処置関連ＡＥ：悪心（ｎ＝１）、疲労（ｎ＝１）、頭痛（ｎ＝１）、振戦（ｎ＝２）、ざ瘡（ｎ＝１）、頻脈（ｎ＝１）および低血圧（ｎ＝１）。
・すべての患者において１５５回以上の全注入後に重篤な有害事象（ＡＥ）または注入関連反応は報告されなかった
・１１／１３（８４％）の患者で報告された、処置により発生したＡＥは、一般に軽度かつ一時的であった。
・７／１３（５３％）の患者で報告された処置関連ＡＥ：悪心（ｎ＝１）、疲労（ｎ＝１）、頭痛（ｎ＝１）、振戦（ｎ＝２）、ざ瘡（ｎ＝１）、頻脈（ｎ＝１）および低血圧（ｎ＝１）。
【0192】
結論
・ＡＴＢ２００単独およびミグルスタットとの併用は、安全かつ十分に忍容されており、これまで輸液関連反応はなかった。
・ＡＴＢ２００単独では暴露において用量比例を上回る増加を示し、これはミグルスタットでさらに増強され、ＡＴＢ２００に対するシャペロンの安定化効果を示唆している。
・標準治療からＡＴＢ２００／ミグルスタットに切り替えた後、患者は一般に筋肉損傷のバイオマーカーの改善を示し、多くの患者が１８週目までに正常化を示した。
・ＡＴＢ２００／ミグルスタットで治療された最初の２人の治療未経験患者は、筋肉損傷のすべてのバイオマーカーにおいて強い減少を示した。
・ＡＴＢ２００単独およびミグルスタットとの併用は、安全かつ十分に忍容されており、これまで輸液関連反応はなかった。
・ＡＴＢ２００単独では暴露において用量比例を上回る増加を示し、これはミグルスタットでさらに増強され、ＡＴＢ２００に対するシャペロンの安定化効果を示唆している。
・標準治療からＡＴＢ２００／ミグルスタットに切り替えた後、患者は一般に筋肉損傷のバイオマーカーの改善を示し、多くの患者が１８週目までに正常化を示した。
・ＡＴＢ２００／ミグルスタットで治療された最初の２人の治療未経験患者は、筋肉損傷のすべてのバイオマーカーにおいて強い減少を示した。
【0193】
本明細書に記載の実施形態は、本発明の組成物および方法を例示することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に全体として一致し、当業者には容易に明らかである様々な改変および変更が含まれることが意図される。添付の特許請求の範囲は、実施例に記載された特定の実施形態によって限定されるべきではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【0194】
特許、特許出願、刊行物、製品説明、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号およびプロトコルは、本出願を通して引用され、これらの開示は、すべての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21A】
【図21B】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図22E】
【図22F】
【図22G】
【図23】
【図24】
【図25A】
【図25B】
【図25C】
【図25D】
【図26】
【図27A】
【図27B】
【図27C】
【図27D】
【配列表】