特許 7046408 Ｌ－アスパラギンの測定方法、及びそのためのキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-25

(45)【発行日】2022-04-04

(54)【発明の名称】Ｌ－アスパラギンの測定方法、及びそのためのキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/52 20060101AFI20220328BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20220328BHJP

   C12Q 1/26 20060101ALI20220328BHJP

   C12Q 1/30 20060101ALI20220328BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/52

C12M1/34 E

C12Q1/26

C12Q1/30

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2022007121

(22)【出願日】2022-01-20

【審査請求日】2022-01-20

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】511312207

【氏名又は名称】株式会社エンザイム・センサ

(74)【代理人】

【識別番号】110000109

【氏名又は名称】特許業務法人特許事務所サイクス

(72)【発明者】

【氏名】日下部 均

(72)【発明者】

【氏名】新舘 啓子

(72)【発明者】

【氏名】ウォロ トリアルシ ステスティアニンディア

(72)【発明者】

【氏名】西山 辰也

(72)【発明者】

【氏名】上田 賢志

【審査官】田村 直寛

(56)【参考文献】

【文献】特開２０２０－２０２８２５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特許第６７０３７２１（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】特許第６７０３７２２（ＪＰ，Ｂ１）

【文献】特許第６５８５２４４（ＪＰ，Ｂ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／５２

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｑ １／２６

Ｃ１２Ｑ １／３０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記Ａ液及びＢ液を含有する、試料中のＬ－アスパラギンを測定するためのキット：
（Ａ液）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミナーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及びα－ケトグルタル酸を含む液；
（Ｂ液）アスパラギナーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む液；
ただし、Ａ液及びＢ液は、いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含む。

【請求項2】

Ａ液がさらにアスコルビン酸オキシダーゼを含む、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

Ａ液がカプラー化合物を含み、Ｂ液が新トリンダー試薬を含み、Ａ液がさらにピリドキサールリン酸を含む、請求項１又は２に記載のキット。

【請求項4】

カプラー化合物が、４－アミノアンチピリンである、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット。

【請求項5】

新トリンダー試薬が、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、又はＮ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載のキット。

【請求項6】

Ｌ－アスパラギン標準溶液をさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のキット。

【請求項7】

生じた色素の量を測定するためのＬＥＤ光源を用いた装置を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のキット。

【請求項8】

下記工程１及び工程２を含む、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、アスコルビン酸、及びエリソルビン酸からなる群より選択されるいずれかを含んでいてもよい試料中の、Ｌ－アスパラギンを測定する方法：
（工程１）容器内で、Ｌ－アスパラギン酸にアスパラギン酸トランスアミナーゼ及びα－ケトグルタル酸を作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミンにグルタミナーゼを作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミン酸にグルタミン酸オキシダーゼを作用させてα－ケトグルタル酸を生成させるとともに生成された過酸化水素にカタラーゼを作用させて分解し、アスコルビン酸又はエリソルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させてアスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程；
（工程２）（工程１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させてカタラーゼを失活させ、かつＬ－アスパラギンにアスパラギナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、α－ケトグルタル酸、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物及び新トリンダー試薬を作用させて色素を形成させる工程。

【請求項9】

工程１及び工程２が、２５～４０℃で行われる、請求項８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｌ－アスパラギンの測定方法、及びそのためのキットに関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－アスパラギンは、非必須アミノ酸の一つであり、生体内では、Ｌ－アスパラギン酸からアスパラギンシンテターゼにより生合成され、またアスパラギナーゼによりアスパラギン酸とアンモニアに分解される。アスパラギナーゼは、急性白血病及び悪性リンパ腫の治療薬として用いられており、アスパラギナーゼの基質特異性や安定性を高める検討が行われている（特許文献１及び２）。

【0003】

Ｌ－アスパラギンの測定は、一般的にはＨＰＬＣを利用したアミノ酸分析機によって行われている。アミノ酸分析機にチャージするアミノ酸測定用試料では、試料が加水分解されている場合が多く、Ｌ－アスパラギンとＬ－グルタミンは、それぞれＬ－アスパラギン酸とＬ－グルタミン酸に合算されて定量されていることが多い。

【0004】

また、酵素法によるＬ－アスパラギン測定のためのキットが市販されている（非特許文献１）。このキットの詳細なスキームは明らかにされていない。

【0005】

さらに、酵素を用いたＬ－アスパラギン測定方法としては、Ｌ－アスパラギンをアスパラギナーゼでＬ－アスパラギン酸とし、生成したＬ－アスパラギン酸をＬ－アスパラギン酸オキシダーゼで酸化し、生成する過酸化水素を測定する酵素センサー法が開発されている（特許文献３）。

【0006】

一方、本発明者らは、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－アラニンの測定方法として、アミノ酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼを用いた酵素サイクリング反応とペルオキシダーゼの反応を組み合わせた方法を開発し、測定キットとして実用化している（特許文献４～６）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特開２０１０－２０７１６８号公報

【文献】特開２０２０－１２９９６９号公報

【文献】特開２０２０－２０２８２５号公報

【文献】特許第６５８５２４４号公報

【文献】特許第６７０３７２１号公報

【文献】特許第６７０３７２２号公報

【非特許文献】

【0008】

【文献】Asparagine Assay Kit (Fluorometric), Catalog # K736-100 (BioVision, Inc., 155 S Milpitas Blvd. Milpitas, CA 95035), https://www.biovision.com/documentation/datasheets/K736.pdf

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

上述した市販のキットの方法は、Ｌ－アスパラギンをアスパラギナーゼでＬ－アスパラギン酸にし、生成したＬ－アスパラギン酸を何らかの酵素でピルビン酸に転換し、このピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼで酸化して、生成する過酸化水素をパーオキシダーゼ反応による比色法又は蛍光法で測定する原理と推定される。生体成分を対象試料としているこの方法では、試料に共存するＬ－アスパラギン酸やピルビン酸を除去できていないので、試料に共存するＬ－アスパラギン酸やピルビン酸のバックグランドが大きく、別途にこれらを測定して差し引く必要があると思われる。また、アスパラギナーゼとＬ－アスパラギン酸オキシダーゼとを用いる酵素センサーの場合も、試料に共存するＬ－アスパラギン酸の量を予め測定して差し引く必要がある。

【0010】

Ｌ－アスパラギン測定のための酵素法としては、Ｌ－アスパラギンをアスパラギナーゼで処理し、生成するＬ－アスパラギン酸をアスパラギン酸トランスアミナーゼによりＬ－グルタミン酸とし、このＬ－グルタミン酸を、Ｌ－グルタミン酸脱水素酵素又はＬ－グルタミン酸オキシダーゼで処理して生じた反応生成物を測定する方法が考えられる。しかし、実際にこのような酵素法による実用的なＬ－アスパラギン測定キットは開発されていない。また、食品試料や生体試料にはＬ－グルタミンが比較的多く含まれているために、この方法では、最初のアスパラギナーゼの基質特異性が問題となる。アスパラギナーゼは、一般的にＬ－グルタミンにも比較的高い反応性を示してＬ－グルタミン酸を生成するため、試料中のＬ－アスパラギンの測定に適用するには、Ｌ－アスパラギンとＬ－グルタミンを分別してＬ－アスパラギンだけを測定できるように工夫する必要がある。すなわち、アスパラギナーゼを使用して、Ｌ－アスパラギンからＬ－グルタミン酸に導いて測定する方法においては、予めＬ－グルタミンを除去することが好ましい。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、複数の酵素による逐次かつ同時に進行する反応、特にＬ－アスパラギン酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼとの酵素サイクリング法を活用することにより、一般的に食品試料や生体試料に含有されているＬ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びアスコルビン酸などのＬ－アスパラギン測定に影響を与える共存物質を除去してから、Ｌ－アスパラギンを特異的に測定する新しい方法を発明した。

【0012】

具体的には、本発明は以下を提供する。
［１］ 下記Ａ液及びＢ液を含有する、試料中のＬ－アスパラギンを測定するためのキット：
（Ａ液）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミナーゼ、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びα－ケトグルタル酸を含む液；
（Ｂ液）アスパラギナーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む液；
ただし、Ａ液及びＢ液は、いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含む。
［２］ Ａ液がさらにアスコルビン酸オキシダーゼを含む、１に記載のキット。
［３］ Ａ液がカプラー化合物を含み、Ｂ液が新トリンダー試薬を含み、Ａ液がさらにピリドキサールリン酸を含む、１又は２に記載のキット。
［４］ カプラー化合物が、４－アミノアンチピリンである、１～３のいずれか１項に記載のキット。
［５］ 新トリンダー試薬が、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、又はＮ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）である、１～４のいずれか１項に記載のキット。
［６］ Ｌ－アスパラギン標準溶液をさらに含む、１～５のいずれか１項に記載のキット。
［７］ 生じた色素の量を測定するためのＬＥＤ光源を用いた装置を含む、１～６のいずれか１項に記載のキット。
［８］ 下記工程１及び工程２を含む、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、アスコルビン酸、及びエリソルビン酸からなる群より選択されるいずれかを含んでいてもよい試料中の、Ｌ－アスパラギンを測定する方法：
（工程１）容器内で、Ｌ－アスパラギン酸にアスパラギン酸トランスアミナーゼ及びα－ケトグルタル酸を作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミンにグルタミナーゼを作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミン酸にグルタミン酸オキシダーゼを作用させてα－ケトグルタル酸を生成させるとともに生成された過酸化水素にカタラーゼを作用させて分解し、アスコルビン酸又はエリソルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させてアスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程；
（工程２）（工程１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させてカタラーゼを失活させ、かつＬ－アスパラギンにアスパラギナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、α－ケトグルタル酸、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物及び新トリンダー試薬を作用させて色素を形成させる工程。
［９］ 工程１及び工程２が、２５～４０℃で行われる、８に記載の方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明のアスパラギンの測定方法及びキットは、試料中のアスパラギンにアスパラギナーゼを作用させる前にＬ－グルタミンをＬ－グルタミン酸に変換して除去するため、アスパラギナーゼの低い特異性にもかかわらず、試料に共存するＬ－グルタミンの影響を排除してＬ－アスパラギンを特異的に測定できる。

【0014】

本発明のアスパラギンの測定方法及びキットは、同一容器内で連続して反応を行うものであり、またエンドポイント法であるため、Ｌ－アスパラギンを簡便に精度よく測定できる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1】本発明のL―アスパラギン（L-Asn）測定原理図（Ａ液による工程１及びＢ液 による工程２の両方における酵素サイクリング法の応用）

【図2】吸光度のタイムコース

【図3】Ｌ－アスパラギンの濃度と５５５ｎｍの吸光度との関係

【図4】グルタミナーゼ無添加のＡ液を使用した場合の、Ｌ－アスパラギンの発色度 （１００％）に対する各アミノ酸の発色度％

【図5】Ｌ－グルタミン分解のためのグルタミナーゼを添加したＡ液を使用した場合 の、Ｌ－アスパラギンの発色度（１００％）に対する各アミノ酸の発色度％

【図6】Ｌ－アスパラギン酸の影響

【図7】Ｌ－グルタミン酸の影響

【図8】Ｌ－グルタミンの影響

【図9】アスコルビン酸の影響

【発明を実施するための形態】

【0016】

（Ａ液、Ｂ液）
本発明は、下記Ａ液及びＢ液を含有する、試料中のＬ－アスパラギンを測定するためのキットを提供する：
（Ａ液）アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミナーゼ、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及びα－ケトグルタル酸を含む液
（Ｂ液）アスパラギナーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む液
ただし、Ａ液及びＢ液は、いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含む。好ましい態様の一つは、Ａ液がカプラー化合物を含み、Ｂ液が新トリンダー試薬を含む。これにより溶液の安定性がより良くなる。

【0017】

本発明のキットは、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン、及びＬ－グルタミン酸からなる群より選択されるいずれかを含んでいてもよい試料中の、Ｌ－アスパラギンを測定するために用いることができる。Ａ液は、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含んでいてもよく、このようなキットは、アスコルビン酸又はエリソルビン酸を含む試料中のＬ－アスパラギンを測定するために用いることができる。

【0018】

（酵素）
本発明には、酵素として、公知の、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、グルタミナーゼ、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、アスパラギナーセ、ペルオキシダーゼ、及びアスコルビン酸オキシダーゼを使用することができる。

【0019】

具体的には、本発明に使用するアスパラギン酸トランスアミナーゼの例として、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Mycobacterium tuberculosis、Pseudomonas auruginosa、Pseudomonas putida、Thermus thermophilus、Saccharomyces cerevisiae、Saccharolobus solfataricus、Aspergillus oryzae、Streptomyces griseusなどの微生物由来のアスパラギン酸トランスアミナーゼを挙げることができる。好ましい例の一つは、Escherichia coli K12 MG1655株由来の遺伝子（遺伝子番号：b0928）を挿入して構築したプラスミッドを用いた組換え大腸菌によって発現し、イオン交換樹脂カラム及びゲル濾過樹脂カラム等によって精製したものである。

【0020】

以下に、大腸菌K-12 MG1655株由来アスパラギン酸トランスアミナーゼのアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）及び遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO:2）を順に記載する。

【0021】

【化1】

【0022】

【化2】

【0023】

本発明に使用するアスパラギナーゼの例として、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Proteus vulgaris、Pseudomonas auruginosa、Thermus thermophilus、Saccharomyces cerevisiae、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、 Streptomyces fradiaeなどの微生物由来のアスパラギナーゼを挙げることができる。好ましい例の一つは、細菌由来のアスパラギナーゼ(EC 3.5.1.1)である。特に好ましい例として、市販のアスパラギナーゼである、Novozymes社製Aspergillus oryzae由来の酵素液（商品名Acrylaway）を挙げることができる。

【0024】

本発明に使用するグルタミン酸オキシダーゼの例として、Streptomyces sp. X-119-6、Streptomyces violascens、及び Streptomyces endusなどの微生物由来のＬ－グルタミン酸オキシダーゼを挙げることができる。

【0025】

本発明に使用するグルタミナーゼの例として、Bacillus amyloriquefaciens由来のグルタミナーゼなどを挙げることができる。

【0026】

本発明に使用するカタラーゼとして、ウシ肝臓由来カタラーゼの他、Aspergillus nigerやCorynebacterium glutamicumなどの微生物由来のカタラーゼを挙げることができる。

【0027】

本発明に使用するペルオキシダーゼの例として、西洋わさび由来のペルオキシダーゼを挙げることができる。

【0028】

本発明に使用するアスコルビン酸オキシダーゼの例としては、キュウリ又はカボチャ由来のアスコルビン酸オキシダーゼを挙げることができる。

【0029】

（新トリンダー試薬）
本発明では、新トリンダー試薬として公知のものを使用することができる。本発明に使用する新トリンダー試薬の例としては、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ－（２－カルボキシエチル）－Ｎ－エチル－３，５－ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ－（２－カルボキシエチル）－Ｎ－エチル－３－メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５ジメトキシ－４－フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３，５ジメトキシ－４－フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）を挙げることができる。Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）のいずれかを用いるのが好ましく、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）を用いるのがより好ましい。

【0030】

（カプラー化合物）
本発明では、カプラー化合物として公知のものを使用することができる。本発明では、新トリンダー試薬との組み合わせで発色を生じる化合物として任意のものを用いればよく、例として、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン－１－（４－スルホフェニル）－２，３－ジメチル－４－アミノ－５－ピラゾロン（ＣＰ２－４）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－トルイジン又はその誘導体を挙げることができる。４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）を用いるのが好ましい。

【0031】

（他の成分）
本発明のキットに含まれるＡ液は、酵素の安定化のために、トランスアミナーゼの補酵素であるピリドキサールリン酸をさらに含んでもよい。Ｂ液は防腐剤をさらに含んでもよい。防腐剤としては公知のものを使用することができる。例として、アジ化ナトリウム、プロクリン３００、プロクリン９５０、クロラムフェニコールを挙げることができる。

【0032】

Ａ液及びＢ液は、ｐＨ緩衝能を有する成分を含んでいてもよい。このような成分の例としては、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン）、Ｈｅｐｅｓ（［２－［４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル］エタンスルホン酸］）を挙げることができる。

【0033】

（成分の含有量）
Ａ液の各酵素及びカプラー化合物等の含有量は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ０．１～１０Ｕ／ｍＬ、グルタミナーゼ０．０５～３Ｕ／ｍＬ、グルタミン酸オキシダーゼ０．１～２Ｕ／ｍＬ、カタラーゼ５００～２，０００Ｕ／ｍＬ、カプラー化合物０．１～２．０μｍｏｌ／ｍＬの範囲にあることが好ましく、特にアスパラギン酸トランスアミナーゼ０．５～２Ｕ／ｍＬ、グルタミナーゼ０．２～１Ｕ／ｍＬ、グルタミン酸オキシダーゼ０．４～１Ｕ／ｍＬ、カタラーゼ１０００～１，５００Ｕ／ｍＬ、カプラー化合物０．２～1．０μｍｏｌ／ｍＬの範囲にあることがより好ましい。α－ケトグルタル酸は１～６μｍｏｌ／ｍＬとすることができ、２～３μｍｏｌ／ｍＬが好ましい。ピリドキサールリン酸は０．００５～０．０５μｍｏｌ／ｍＬとすることができ、０．０１～０．０２μｍｏｌ／ｍＬが好ましい。アスコルビン酸オキシダーゼは５～３０Ｕ／ｍＬとすることができ、１０～２０Ｕ／ｍＬであることが好ましい。

【0034】

Ｂ液における酵素、新トリンダー試薬、及びカタラーゼ失活剤の含有量は、アスパラギナーゼは２～２０倍希釈、ペルオキシダーゼ５～２０Ｕ／ｍＬ、新トリンダー試薬０．１～２．０μｍｏｌ／ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０１～０．０９％の範囲にあることが好ましく、特にアスパラギナーゼは５～１０倍希釈、ペルオキシダーゼ１０～１５Ｕ／ｍＬ、新トリンダー試薬０．２～１．０μｍｏｌ／ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０５～０．０９％の範囲にあることが好ましい。

【0035】

（Ｌ－アスパラギン標準溶液）
本発明のキットは、上記Ａ液及びＢ液のほかに、Ｌ－アスパラギン標準溶液を含んでいてもよい。Ｌ－アスパラギン標準溶液の濃度は、適宜とすることができるが、測定の際に検量線を作製するために系列希釈するとの観点からは、キットの測定上限前後の濃度であることが好ましい。具体的には、例えば１００～２００ｍｇ/ｍＬとすることができ、１００ｍｇ/ｍＬにすることが好ましい。

【0036】

（キットの他の構成物）
本発明のキットはさらに、Ａ液の採取用スポイト、Ｂ液の採取用スポイト、ＬＥＤを光源とする生じた色素の量を測定するための比色計、測定のためのプラスティック製セルを含んでいてもよい。

【0037】

（用途）
本発明の測定対象となる試料としては、Ｌ－アスパラギンを含有することが予想されるものであれば、特に限定されない。具体例として、農産物、酒やビールなどの酒類、食品原料、加工食品、細胞又は微生物等の培養液、血液、体液及び組織抽出物等の生体試料を挙げることができる。

【0038】

（工程）
本発明のキットによる試料中のＬ－アスパラギンを測定する反応は、下記工程１及び工程２を含む：
（工程１）容器内で、Ｌ－アスパラギン酸にアスパラギン酸トランスアミナーゼ及びα－ケトグルタル酸を作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミンにグルタミナーゼを作用させてＬ－グルタミン酸を生成させ、Ｌ－グルタミン酸にグルタミン酸オキシダーゼを作用させてα－ケトグルタル酸を生成させるとともに生成された過酸化水素にカタラーゼを作用させて分解し、アスコルビン酸又はエリソルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させてアスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解する工程；
（工程２）（工程１）に続いて同じ容器内で行われる工程であって、該カタラーゼに、カタラーゼ失活剤を作用させてカタラーゼを失活させ、かつＬ－アスパラギンにアスパラギナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、α－ケトグルタル酸、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、カプラー化合物及び新トリンダー試薬を作用させて色素を形成させる工程。

【0039】

本発明では、対象アミノ酸を測定するため、まず容器内の試料にＡ液を添加して工程1を実施する。これにより、試料中に共存するＬ－アスパラギン酸を、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ及びカタラーゼによる酵素サイクリング法で除去し、同時に試料中に共存するＬ－グルタミンを、グルタミナーゼによりＬ－グルタミン酸とする。さらに同時に進行するＬ－グルタミン酸オキシダーゼ及びカタラーゼの反応により、元々試料中に共存するＬ－グルタミン酸、及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ又はグルタミナーゼにより生成したＬ－グルタミン酸を分解し、かつ試料中のアスコルビン酸又はエリソルビン酸を、アスコルビン酸オキシダーゼにより分解する。

【0040】

なお、工程１では、試料中にＬ－アスパラギン酸が含まれない場合は、Ｌ－アスパラギン酸にアスパラギン酸トランスアミナーゼを作用させてＬ－グルタミン酸を生成させることは行われず、試料中にＬ－グルタミンが含まれない場合は、Ｌ－グルタミンにグルタミナーゼを作用させてＬ－グルタミン酸を生成させることは行われず、試料中にアスコルビン酸又はエリソルビン酸が含まれない場合は、アスコルビン酸又はエリソルビン酸にアスコルビン酸オキシダーゼを作用させてアスコルビン酸又はエリソルビン酸を分解することは行われない。

【0041】

本発明では、Ａ液による反応が十分に進行した後、Ｂ液を添加することにより、工程２を実施する。工程２では、試料中の測定対象であるＬ－アスパラギンのみを、Ｂ液中のアスパラギナーゼによりＬ－アスパラギン酸とし、生じたＬ－アスパラギン酸を、Ａ液から移行したアスパラギン酸トランスアミナーゼによりＬ－グルタミン酸とする。さらに生じたＬ－グルタミン酸を、Ａ液から移行したＬ－グルタミン酸オキシダーゼにより分解し、過酸化水素を生じせしめ、該過酸化水素に発色剤及びペルオキシダーゼを反応させることにより、発色させる。この工程２では、Ａ液から移行したカタラーゼは、Ｂ液に含まれているカタラーゼ失活剤により失活するので、カタラーゼによる発色反応の阻害は起きない。

【0042】

工程１及び２の反応条件は、それぞれ使用する酵素の至適ｐＨ及び酵素反応が効率的に進む温度に基づき、適宜設定すればよい。双方の工程はそれぞれ、温度２５℃～４０℃で、ｐＨ６．５～ｐＨ９．０、１０分～３０分で行うことができる。好ましい態様において、工程１及び２の少なくともいずれか一方の工程、好ましくは双方の工程は、２５～４０℃で行われる。

【0043】

工程２で生じた発色は、一般的な手法、例えばハロゲンランプ、キセノンランプ等の光源を用いた吸光度計により、特定波長の吸光度として測定できる。また、特定範囲の波長のＬＥＤを光源とし、受光部にフォトトランジスター等を用いた比色計により、発色の程度を電気信号（例えば、電圧値）として測定できる。ＬＥＤを光源とする場合、発色を測定する光源の波長は、用いる発色剤の種類に応じて選択すればよい。例えば新トリンダー試薬としてＴＯＯＳを用いた場合、生じる色素の吸収極大は５５５ｎｍであることから、光源として５５５ｎｍの純緑色ＬＥＤが適している。測定値に基づき、予め測定した既知濃度のＬ－アスパラギンの測定値と比較して、試料中のＬ－アスパラギンの濃度を算出することができる。

【0044】

（特徴）
本発明においては、Ａ液による工程１では、アスパラギン酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼとの酵素サイクリング反応とカタラーゼ反応を共役させる。続く同一容器内でのＢ液による工程２では、カタラーゼ阻害剤の存在下、工程１で実施されたアスパラギン酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼとの酵素サイクリング反応が再度実施され、これとパーオキシダーゼ及び発色剤による色素形成反応を共役させる。工程１と工程２で、複数の酵素の組み合わせによって、実質的には同時に起きる各酵素による逐次反応を応用したアミノ酸測定方法は、他に類を見ない。

【0045】

本発明の特徴の一つは、対象試料中のＬ－アスパラギン酸を除去するために、アスパラギン酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼとの酵素サイクリング法を、最初の段階で行う点である。従来の、ＧＡＢＡ、Ｌ－アスパラギン酸及びＬ－アラニンの各測定（特許文献４～６）においては、２段階目で酵素サイクリング法を行っている。しかし、本発明ではＡ液による工程１で酵素サイクリング法を行うことによって、試料中のＬ－アスパラギン酸から生じたＬ－グルタミン酸のみならず、元々試料中に共存していたＬ－グルタミン酸、及びＬ－グルタミンから生じたＬ－グルタミン酸を含む、容器中のすべてのＬ－グルタミン酸を、分解除去できる。

【0046】

本発明の他の特徴は、工程１（カタラーゼ存在下）及び工程２（カタラーゼ阻害剤存在下）の両方で、アスパラギン酸トランスアミナーゼとＬ－グルタミン酸オキシダーゼとの酵素サイクリング法を行う点である。工程１ではＬ－アスパラギン酸の除去のため、工程２では測定対象であるＬ－アスパラギンと等モルの過酸化水素を生成させるため、同一の酵素サイクリング法で行う。

【0047】

本発明の他の特徴は、Ａ液にグルタミナーゼを含ませ、アスパラギナーゼの低い基質特異性の問題を解消している点である（図４，図５参照）。グルタミナーゼを用いない場合は、アスパラギナーゼを含むＢ液の添加後の室温での反応中に、アスパラギナーゼが試料に共存するＬ－グルタミンにも作用してしまう。本発明では、試料中のＬ－アスパラギンの測定の前に、試料にＡ液を添加して試料中のＬ－グルタミンをＬ－グルタミン酸にして除去している。

【0048】

本発明の他の特徴の一つは、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びＬ－グルタミン酸が試料中に含まれていたとしても、Ｌ－アスパラギンだけを特異的に測定することができる点である。Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－グルタミン及びＬ－グルタミン酸と測定対象のＬ－アスパラギンは、タンパク質を構成するアミノ酸であり、食品や生体由来の試料には、程度の差こそあれ共存するものである。特に、Ｌ－グルタミンは、野菜や血液等に、普遍的に最も多量に存在するアミノ酸であり、ＮＨ₃のキャリアとしてＬ－アスパラギンに類似するアミノ酸である。

【0049】

本発明の他の特徴は、酵素サイクリング法とカタラーゼ反応又はオキシダーゼ反応の共役により、いわゆるエンドポイント法によりＬ－アスパラギンの測定を行っている点である（図２参照）。すなわち、Ｌ－アスパラギンから生じるＬ－アスパラギン酸に対するＫｍ値がそれほど低くないトランスアミナーゼを用いる場合であっても、Ｌ－アスパラギン酸とα－ケトグルタル酸を消費してＬ－グルタミン酸を生成する反応において、この生成したＬ－グルタミン酸がＫｍ値が小さくかつ活性の高いＬ－グルタミン酸オキシダーゼによって速やかに酸化分解されることにより、トランスアミナーゼの反応がより効率的にＬ－グルタミン酸を生成する方向へ進行すると考えられる。

【0050】

また、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼの反応ではα－ケトグルタル酸が生成され、再びトランスアミナーゼの反応に利用される（図１参照）。そのため、最終的には、試料中の対象アミノ酸の全量が反応に用いられ、精度のよい測定結果が得られる。なお、酵素を用いたエンドポイントアッセイにおいて、エンドポイントに到達するまでの時間は、使用する酵素のＫｍ値が小さく、Ｖｍａｘが大きいほど短くなるとことが知られている。一般に、トランスアミナーゼのＫｍ値はエンドポイント法に好適であるＫｍ値とはいえない。また、一般に、トランスアミナーゼの反応は可逆的である（酵素ハンドブック第３版、朝倉書店（２００８）、第４１４頁、ＥＣ２．６．１．１９参照）。そのため、トランスアミナーゼを用いて対象アミノ酸のエンドポイント測定を実施することは通常困難である。

【実施例】

【0051】

（実施例１）キットの構成
Ｌ－アスパラギン測定キットのＡ液及びＢ液の組成例を表１に示す。なお、アスパラギナーゼとして、Novozymes社製Aspergillus oryzae由来の酵素液（商品名Acrylaway）を使用した。

【0052】

【表1】

【0053】

（実施例２）発色のタイムコース
本発明の測定キットは、Ｌ－アスパラギンから各種酵素反応によって最終的に色素を生成させる。同一容器内での逐次かつ同時反応により、Ｌ－アスパラギンから色素形成への転換反応が完全にエンドポイントに到達していることを確認するため、室温における発色のタイムコースを調べた。

【0054】

Ｌ－アスパラギンの濃度が１００ｍｇ／Ｌの溶液を供試サンプルとして、以下のような手順に従って測定を実施した。まず、１ｃｍ角ディスポセルにＬ－アスパラギン溶液を０．０５ｍＬ入れ、Ａ液を０．５ｍＬ添加して室温で１０分間放置後、Ｂ液を０．５ｍＬ添加して、室温における５５５ｎｍの吸光度の変化を、吸光度表示タイプのＬＥＤ比色計で測定した。

【0055】

図２に、吸光度のタイムコースを示す。反応開始後約９分以上で吸光度が一定になった。したがって、本発明によるＬ－アスパラギンの測定は、いわゆるエンドポイント法によることが示された。

【0056】

（実施例３）検量線
Ｌ－アスパラギンの濃度が１２．５～２００ｍｇ／Ｌの各濃度の溶液を供試サンプルとして検量線を作成した。なお、測定は、以下のような手順に従って実施した。まず、１ｃｍ角ディスポセルに各濃度のＬ－アスパラギン溶液を０．０５ｍＬ入れ、Ａ液を０．５ｍＬ添加して室温で１０分間反応後、Ｂ液を０．５ｍＬ添加して、さらに室温で１０分間反応させた。反応終了後、吸光度表示タイプのＬＥＤ比色計で５５５ｎｍの吸光度を測定した。また、ブランクとして水を検体として吸光度を測定した。検量線はブランクを引いた値で作成した。

【0057】

Ｌ－アスパラギンの濃度と５５５ｎｍの吸光度との関係は、図３に示すように相関係数０．９９９６の直線となった。

【0058】

（実施例４）基質特異性の確認
既存のアスパラギナーゼはＬ－グルタミンにも比較的高い反応を示すことが分かっている。Ａ液中に、Ｌ－グルタミン分解のためのグルタミナーゼを添加することにより、Ｌ－グルタミンに対する反応を除去して、Ｌ－アスパラギンだけを特異的に測定できるかどうかを確認した。

【0059】

測定は以下のような手順に従って実施した。まず、１ｃｍ角ディスポセルに２０種類の各アミノ酸溶液（１ｍＭ）を、それぞれ０．０５ｍＬ入れ、グルタミナーゼ無添加のＡ液又はグルタミナーゼを０．５Ｕ/ｍＬ含むＡ液を０．５ｍＬ添加して室温で１０分間反応後、Ｂ液を０．５ｍＬ添加して、さらに１０分間室温で反応させた。反応終了後、吸光度表示タイプのＬＥＤ比色計で５５５ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとして水の吸光度を引いた値で、L-アスパラギンの発色度（１００％）に対する各アミノ酸の発色度％を算出した。

【0060】

グルタミナーゼ無添加のＡ液を使用した場合は、L-グルタミンに１８％程度の発色が見られたが、Ａ液中にＬ－グルタミン分解のためのグルタミナーゼを添加することにより、ほぼ完全に副反応が除去された。また、他のアミノ酸の発色度はL-アスパラギンの発色に対して２％以下となり、L-アスパラギンの特異的な測定方法が確立された（図４、図５）。

【0061】

実験方法を下記に示す。

【0062】

【表2】

【0063】

この結果により、グルタミナーゼの添加効果を確認した。したがって、本発明は、食品等のＬ－グルタミンが含まれると想定される試料中のＬ－アスパラギンの測定に適用できる。

【0064】

（実施例５）共存するＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、アスコルビン酸の存在量による影響の確認

【0065】

実験方法を下表に示す。

【0066】

【表3】

【0067】

図６～９に示すように、試料中にＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、アスコルビン酸が種々の濃度で共存している場合においても、Ｌ－アスパラギンの吸光度測定値は影響を受けないことが判明した。

【配列表フリーテキスト】

【0068】

SEQ ID NO:1 大腸菌K-12 MG1655株由来 アスパラギン酸トランスアミナーゼのアミノ酸配列
SEQ ID NO:2 大腸菌K-12 MG1655株由来 アスパラギン酸トランスアミナーゼをコードする遺伝子の塩基配列（SEQ ID NO:2）

【要約】

【課題】酵素を用いた食品等の試料中のＬ－アスパラギン測定方法を提供する。Ｌ－アスパラギンとＬ－グルタミン、Ｌ－グルタミン酸及びＬ－アスパラギン酸を分別して除去し、Ｌ－アスパラギンだけを測定できる方法を提供する。
【解決手段】下記Ａ液及びＢ液を含有する、試料中のＬ－アスパラギンを測定するためのキットを提供する：（Ａ液）アスパラギン酸トランスアミナーゼ（GOT）、グルタミナーゼ、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、及びα－ケトグルタル酸を含む液；
（Ｂ液）アスパラギナーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカタラーゼ失活剤を含む液；ただし、Ａ液及びＢ液は、いずれか一方がカプラー化合物を含み、他方が新トリンダー試薬を含む。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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