(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-28
(45)【発行日】2022-04-05
(54)【発明の名称】細胞壁を有する真核細胞における膜タンパク質の指向性進化
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20220329BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20220329BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20220329BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20220329BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20220329BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20220329BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 Z
G01N33/53 Y ZNA
C12Q1/02
C12Q1/6844 Z
C07K14/705
C12N1/19
【請求項の数】
7
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2020192392
(22)【出願日】2020-11-19
(62)【分割の表示】P 2017551024の分割
【原出願日】2015-12-21
(65)【公開番号】P2021058187
(43)【公開日】2021-04-15
【審査請求日】2020-12-14
(31)【優先権主張番号】14199729.6
(32)【優先日】2014-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】507396301
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】特許業務法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シュッツ，マルコ
(72)【発明者】
【氏名】プリュックトゥーン，アンドレアス
【審査官】西垣 歩美
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１４／１６９３３６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２００５－５１８８１７（ＪＰ，Ａ）
【文献】Methods in Enzymology, 2013年，Vol.520，p.67-97
【文献】Current Medicinal Chemistry, 2005年，Vol.12，p.763-771
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
発現された核酸配列のライブラリーから配列を選択する方法であり、前記配列はその発現レベルに応じて選択される、方法であって、ａ）細胞壁を含む複数の真核細胞を提供するステップであって、前記真核細胞の各々は前記ライブラリーの核酸配列メンバーを含んでおり、前記核酸配列メンバーは、前記複数の真核細胞において原形質膜中におけるＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）として発現されている、ステップと、
ｂ）透過化ステップにおいて、前記複数の真核細胞の前記細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成するステップであって、前記透過化ステップは前記複数の真核細胞を化学処理に暴露することを含む、ステップと、
ｃ）標識ステップにおいて、前記複数の透過化生細胞を、前記ＧＰＣＲに結合できるリガンドと接触させ、複数の標識細胞を生成するステップであって、前記リガンドは検出可能標識を含む、ステップと、
ｄ）洗浄ステップにおいて、前記複数の標識細胞を洗浄するステップと、
ｅ）選択ステップにおいて、前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて前記複数の標識細胞のサブセットを選択して、細胞の選択物を生成するステップと、
ｆ）単離ステップにおいて、発現された核酸配列を細胞の前記選択物から単離するステップと、
を含み、
前記発現された核酸配列は、１細胞あたり少なくとも１０００００の全機能性ＧＰＣＲに対応する前記ＧＰＣＲの高い発現レベルによって特徴付けられ、
前記化学処理は、リチウムイオン、還元剤および／またはキレート剤を含むアルカリ性ｐＨの緩衝液に前記複数の真核細胞を曝露することを含み、
前記検出可能標識は蛍光色素であり、前記選択ステップは蛍光細胞の選別によって達成される、方法。
【請求項2】
ｉ．前記選択ステップｅ）の後に、生細胞の前記選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成し、生細胞の前記増殖選択物を前記ステップｂ）～ｅ）に供するステップを更に含み、前記ステップｉ．は、少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施し、続いて最後に前記単離ステップｆ）を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ｉ．前記単離ステップｆ）で得た前記発現された核酸を、細胞壁を含む複数の真核細胞に導入して発現させ、ｉｉ．細胞壁を含む前記複数の真核細胞を、請求項１に記載の前記ステップｂ）～ｆ）に供し、
ｉｉｉ．ステップｉ．およびｉｉ．を少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記単離ステップｆ）で得た前記発現された核酸を、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって増幅させて、核酸配列の第２ライブラリーを生成し、ｉ．核酸配列の前記第２ライブラリーを、細胞壁を含む前記複数の真核細胞へ導入し、
ｉｉ．細胞壁を含む前記複数の真核細胞を、請求項１～３に記載の方法に供する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記発現された核酸配列のライブラリーは、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって前記ＧＰＣＲをコードする核酸配列を増幅することにより得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記複数の真核細胞は複数の酵母細胞である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
機能性Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞を選択する方法であって、ａ．複数の酵母細胞を提供するステップであって、前記酵母細胞の各々は、発現された核酸配列のライブラリーの核酸配列メンバーを含んでおり、前記核酸配列メンバーは、前記複数の酵母細胞において原形質膜中におけるＧＰＣＲとして発現されている、ステップと、
ｂ．透過化ステップにおいて、前記複数の酵母細胞の細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成するステップであって、前記透過化ステップは前記複数の酵母細胞を化学処理に暴露することを含む、ステップと、
ｃ．標識ステップにおいて、前記複数の透過化生細胞を、前記ＧＰＣＲに結合できるリガンドと接触させ、複数の標識細胞を生成するステップであって、前記リガンドは検出可能標識を含む、ステップと、
ｄ．洗浄ステップにおいて、前記複数の標識細胞を洗浄するステップと、
ｅ．選択ステップにおいて、前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて前記複数の標識細胞のサブセットを選択して、細胞の選択物を生成するステップと、
ｆ．細胞の前記選択物を増殖させて、細胞の増殖選択物を生成するステップと、
ｇ．生細胞の前記増殖選択物をステップｂ．～ｆ．に少なくとも１、２、３、４、５、６または７回供し、
ｈ．細胞の前記増殖選択物をステップｂ．～ｅ．に供し、
ｉ．前記複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて細胞の前記増殖選択物のサブセットを選択して、機能性ＧＰＣＲを、１細胞あたり少なくとも１０００００の全機能性ＧＰＣＲに対応する高レベルで発現する能力を有する前記適応酵母細胞を細胞の前記増殖選択物から生成する、ステップを含み、
前記化学処理は、リチウムイオン、還元剤および／またはキレート剤を含むアルカリ性ｐＨの緩衝液に前記複数の酵母細胞を曝露することを含み、
前記検出可能標識は蛍光色素であり、前記選択ステップは蛍光細胞の選別によって達成される、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
説明
真核生物の膜貫通型受容体に関する構造的及び詳細な生化学的調査は、発現、精製および結晶化の方策の技術的進歩にも拘らず、依然として阻まれている。重大な難点は、十分な量で所望の受容体を産生する能力の欠如、およびそれらの生得の不安定性である。
真核生物の膜貫通型受容体に関する構造的及び詳細な生化学的調査は、発現、精製および結晶化の方策の技術的進歩にも拘らず、依然として阻まれている。重大な難点は、十分な量で所望の受容体を産生する能力の欠如、およびそれらの生得の不安定性である。
【0002】
指向性進化によって大腸菌におけるＧＰＣＲの機能的発現レベルを向上させる方法は、当該技術分野において既知である（Ｓａｒｋａｒら（２００８）、ＰＮＡＳ１０５：１４８０８－１４８１３；ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８：５９９－６１５）。いくつかのＧＰＣＲの高発現変異体が、この方法を用いて単離されている。しかしながら大腸菌は、翻訳後修飾を実施できず、真核生物の膜タンパク質の分泌質制御および転位機構が欠けており、膜組成が異なっているため、大腸菌における真核生物膜貫通型受容体の進化は、進化の成功に必要な閾値を超えて原核生物系において生得的に発現する受容体に限定され、それゆえ真核生物のプロセシングまたは膜組成のために厳密に必要なものを有していない。
【0003】
したがって、真核生物宿主において膜貫通型受容体の機能的発現を増加させる高速で効率的かつ堅牢な方法の確立が必要とされる。原理上、理想的な真核生物宿主は、進化した高発現変異体を産生させるために使用される細胞であろう。しかし、これらの哺乳動物細胞または昆虫細胞は、いかなる類の指向性進化手法にも必須となる、ライブラリーを用いて形質転換するということが容易でない。酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの「より下等な」真核生物の使用は、ライブラリーを必要とするその他の手順において一般的である。しかし、酵母細胞は細胞壁を含んでおり、そのことは、原形質膜中に位置する発現受容体への投与リガンドの接近を制限することによって機能性試験アッセイを制限する。可溶性タンパク質の場合、この問題に対する一般的な解決策は、細胞壁の外側に提示される融合タンパク質として対象タンパク質を発現させる、酵母ディスプレイなどの方法の使用である。しかしこの手法は、原形質膜中、したがって細胞壁の下に位置しなければならないものであるとともに、細胞壁に付着した融合タンパク質として発現されることができないものである、不溶性の膜貫通型受容体の機能的高発現変異体の選択には適していない。
【0004】
本発明の根底にある課題は、膜貫通型受容体の研究および薬物設計を促進および加速する新規な効率的方法を、特に細胞壁を含む真核細胞において最適な機能的発現をもたらす膜貫通型タンパク質変異体を同定することによって提供することである。この課題は、独立請求項の主題によって解決される。
【0005】
用語および定義
本明細書との関連において、アルカリ性ｐＨという用語は、化学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、水溶液の塩基度の尺度を指す。７より大きいｐＨはアルカリ性または塩基性の溶液を指し示し、７未満のｐＨは酸性溶液を指し示す。
本明細書との関連において、アルカリ性ｐＨという用語は、化学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、水溶液の塩基度の尺度を指す。７より大きいｐＨはアルカリ性または塩基性の溶液を指し示し、７未満のｐＨは酸性溶液を指し示す。
【0006】
本明細書との関連において、還元剤という用語は、化学および生化学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、酸化還元反応において電子を別の化学物質に供与する元素または化合物を指す。このプロセスにおいて還元剤は酸化される。
【0007】
本明細書との関連において、蛍光細胞選別または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）という用語は、細胞生物学の技術分野で知られているそれらの意味で用いられ、それらは、細
胞を流体の流れの中に浮遊させて検出装置を通過させる細胞選別方法を指す。通過する各細胞は、通過する細胞の固有蛍光シグナルの強度に応じて異なる区画に導かれ得る。
胞を流体の流れの中に浮遊させて検出装置を通過させる細胞選別方法を指す。通過する各細胞は、通過する細胞の固有蛍光シグナルの強度に応じて異なる区画に導かれ得る。
【0008】
本明細書との関連において、ランダム突然変異誘発という用語は、細胞生物学および分子生物学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、ＤＮＡ突然変異をランダムに導入して突然変異体の遺伝子およびタンパク質を生じさせる方法を指す。その後、多数のこれらの突然変異遺伝子をライブラリーに蓄積することができる。ランダム突然変異誘発方法の非限定的な例は、エラープローンＰＣＲ、ＵＶ照射および化学的突然変異原である。
【0009】
本明細書との関連において、ライブラリーという用語は、細胞生物学および分子生物学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、核酸断片の収集物を指す。１つの特定のタイプのライブラリーは、ランダム突然変異誘発によって生成されるランダム突然変異体ライブラリーである。別の例は、特定の操作をしたＤＮＡ断片を含む、設計（すなわち合成）ライブラリーであろう。
【0010】
本明細書との関連において、発現レベルという用語は、細胞生物学および分子生物学の技術分野で知られているその意味で用いられ、それは、ＤＮＡ断片およびそれに由来するｍＲＮＡのそれぞれの転写および／または翻訳のレベルを指す。特定の実施形態において、突然変異遺伝子の発現が対照遺伝子または野生型遺伝子よりも高い場合に、発現レベルが高いとみなされる。特定の実施形態において、対照または野生型の遺伝子の発現よりも少なくとも２倍高くなって、突然変異遺伝子の発現が高いとみなされる。
【0011】
本発明の第１の態様によれば、発現された核酸配列のライブラリーから配列を選択する方法であって、当該配列がその発現レベルに応じて選択される、方法が提供される。方法は、以下のステップを含む。
ａ）細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
ｂ）透過化ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞の細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成する。
ｃ）標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識生細胞を生成する。
ｄ）洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかったあらゆるリガンドおよび検出可能標識を、実質的に全てではないにしてもほとんど除去する。
ｅ）選択ステップにおいて、複数の標識生細胞の各々について検出可能標識の存在を検出し、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）を生成する。
ｆ）単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
ａ）細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
ｂ）透過化ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞の細胞壁を透過化して、複数の透過化生細胞を生成する。
ｃ）標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識生細胞を生成する。
ｄ）洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかったあらゆるリガンドおよび検出可能標識を、実質的に全てではないにしてもほとんど除去する。
ｅ）選択ステップにおいて、複数の標識生細胞の各々について検出可能標識の存在を検出し、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉａｂｌｅ ｃｅｌｌｓ）を生成する。
ｆ）単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
【0012】
換言すれば、本発明の第１の態様による方法は、細胞壁を含む真核細胞における膜貫通型受容体のライブラリーの発現を可能にし、かつ、これらの受容体の機能的発現の選択を可能にする。これは、構造的に安定な生細胞をなおも維持するような仕方で細胞壁を透過化することによって可能になり、それはスフェロプラストの作製のような、細胞壁を透過化する他の方法とは異なっている。本発明の透過化手順は、膜貫通型受容体に対する大き
なリガンドの結合さえも可能にする。結合リガンドの量による細胞の選択は、非機能性受容体（例えば、細胞内膜に存在する受容体）も含むであろう全受容体量によってではなく原形質膜上の機能性受容体の量に応じて細胞を選択することを可能にする。
なリガンドの結合さえも可能にする。結合リガンドの量による細胞の選択は、非機能性受容体（例えば、細胞内膜に存在する受容体）も含むであろう全受容体量によってではなく原形質膜上の機能性受容体の量に応じて細胞を選択することを可能にする。
【0013】
特定の実施形態において、方法は、以下のステップをさらに含む：
ｉ．選択ステップｅ）の後に、増殖ステップにおいて生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。生細胞の増殖選択物をステップｂ）～ｅ）にこの順で供し、さらに、
ｉｉ．ステップｉ．を少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施し、続いて最後に単離ステップｆ）を実施する。
ｉ．選択ステップｅ）の後に、増殖ステップにおいて生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。生細胞の増殖選択物をステップｂ）～ｅ）にこの順で供し、さらに、
ｉｉ．ステップｉ．を少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施し、続いて最後に単離ステップｆ）を実施する。
【0014】
特定の実施形態において、選択ステップは多数の選択手順を含む。最初の選択の後、細胞の選択物を、これらの細胞に存在する検出可能標識に応じたこれらの細胞のサブセットの選択のために、再び使用する。細胞の選択は、少なくとも１、２、３、４または５回繰り返す。
【0015】
特定の実施形態において、発現された核酸配列のライブラリーは、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって標的膜タンパク質をコードする核酸配列を増幅することにより得られる。
【0016】
特定の実施形態において、方法は、以下のステップをさらに含む：
ｉ．単離ステップｆ）で得た発現された核酸を、細胞壁を含む複数の真核細胞に導入して発現させ、
ｉｉ．細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第１の態様によるステップｂ）～ｆ）にこの順で供し、
ｉｉｉ．ステップｉ．およびｉｉ．を少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施する。
ｉ．単離ステップｆ）で得た発現された核酸を、細胞壁を含む複数の真核細胞に導入して発現させ、
ｉｉ．細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第１の態様によるステップｂ）～ｆ）にこの順で供し、
ｉｉｉ．ステップｉ．およびｉｉ．を少なくとも１、２、３、４、５、６または７回実施する。
【0017】
特定の実施形態において、本発明の方法によって得た発現された核酸配列は、コードされた標的膜タンパク質の高い発現レベルおよび／または高い熱力学的安定性によって特徴付けられる。
【0018】
選択ステップｅ）における本発明の全ての態様による特定の実施形態において、生細胞の選択物は、最も蛍光性である細胞の上位０．１～５％を含む。
【0019】
特定の実施形態において、方法は、以下のステップをさらに含む：
ｉ．単離ステップｆ）で得た発現された核酸を、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって増幅させて、第２ライブラリーの核酸配列を生成する。
ｉｉ．この第２ライブラリーの核酸配列を、細胞壁を含む複数の真核細胞へ導入する。
ｉｉｉ．第２ライブラリーの核酸配列メンバーを今や含んでいる、細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第１の態様による方法のステップｂ）～ｆ）にこの順で供する。
ｉ．単離ステップｆ）で得た発現された核酸を、増幅配列に突然変異を導入するプロセスによって増幅させて、第２ライブラリーの核酸配列を生成する。
ｉｉ．この第２ライブラリーの核酸配列を、細胞壁を含む複数の真核細胞へ導入する。
ｉｉｉ．第２ライブラリーの核酸配列メンバーを今や含んでいる、細胞壁を含む複数の真核細胞を、本発明の第１の態様による方法のステップｂ）～ｆ）にこの順で供する。
【0020】
特定の実施形態において、細胞壁を含む真核細胞は酵母細胞である。
特定の実施形態において、標的膜タンパク質はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。
特定の実施形態において、標的膜タンパク質はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。
【0021】
特定の実施形態において、透過化ステップは、細胞壁を含む複数の真核細胞を酵素処理および／または化学処理に曝露するステップを含む。
【0022】
特定の実施形態において、透過化ステップにおける酵素処理は、細胞壁を含む複数の真核細胞を、細胞壁を透過化する酵素または酵素混合物に曝露するステップを含む。そのような酵素の非限定的な例は、グルカナーゼ、プロテアーゼ、マンナーゼおよび／またはスルファターゼである。そのような酵素混合物の非限定的な例は、ザイモリアーゼ、リチカーゼおよび／またはグルスラーゼである。
【0023】
特定の実施形態において、透過化ステップにおける化学処理は、リチウムイオン、還元剤および／またはキレート剤を含むアルカリ性ｐＨの緩衝液に、細胞壁を含む複数の真核細胞を曝露するステップを含む。
【0024】
特定の実施形態において、透過化ステップで使用する緩衝液に含まれる緩衝剤の非限定的な例は、
－ビシン（２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）または
－ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸）または
－ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸）または
－ＰＩＰＥＳ（１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸）または
－ＴＡＰＳ（３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］プロパン－１－スルホン酸）または
－ＴＡＰＳＯ（３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）または
－ＴＥＳ（２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸）または
－トリシン（Ｎ－（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）または
－トリス（２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール）である。
－ビシン（２－（ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ）酢酸）または
－ＨＥＰＥＳ（２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸）または
－ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパン－１－スルホン酸）または
－ＰＩＰＥＳ（１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸）または
－ＴＡＰＳ（３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］プロパン－１－スルホン酸）または
－ＴＡＰＳＯ（３－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］－２－ヒドロキシプロパン－１－スルホン酸）または
－ＴＥＳ（２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸）または
－トリシン（Ｎ－（２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル）グリシン）または
－トリス（２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール）である。
【0025】
特定の実施形態において、透過化ステップの緩衝液に使用するキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【0026】
特定の実施形態において、検出可能標識は蛍光色素であり、選択ステップは蛍光細胞選別によって達成される。
【0027】
特定の実施形態において、還元剤の非限定的な例は：
－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、メルカプトエタノールもしくは還元型グルタチオンなどの、チオール含有化合物、または
－トリス－カルボキシエチル－ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィン含有化合物である。
－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、メルカプトエタノールもしくは還元型グルタチオンなどの、チオール含有化合物、または
－トリス－カルボキシエチル－ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィン含有化合物である。
【0028】
特定の実施形態において、透過化ステップは以下のステップを含む：
ａ）ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｍＭの酢酸リチウムを含むＴＥＬｉ緩衝液中で酵母細胞を培養し、
ｂ）５０ｍＭのＤＴＴをさらに含むＴＥＬｉ緩衝液中で酵母細胞を３０分間２０℃で培養し、
ｃ）酵母細胞を４℃のＴＥＬｉ緩衝液中で少なくとも１回洗浄する。
ａ）ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｍＭの酢酸リチウムを含むＴＥＬｉ緩衝液中で酵母細胞を培養し、
ｂ）５０ｍＭのＤＴＴをさらに含むＴＥＬｉ緩衝液中で酵母細胞を３０分間２０℃で培養し、
ｃ）酵母細胞を４℃のＴＥＬｉ緩衝液中で少なくとも１回洗浄する。
【0029】
特定の実施形態において、ＴＥＬｉ緩衝液は、ｐＨ９の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｍＭの酢酸リチウムを含む。
【0030】
特定の実施形態において、透過化ステップで使用する緩衝液は：
ｉ．リチウムイオン、
ｉｉ．アルカリ性ｐＨ、
ｉｉｉ．還元剤、および／または
ｉｖ．キレート剤を含む。
ｉ．リチウムイオン、
ｉｉ．アルカリ性ｐＨ、
ｉｉｉ．還元剤、および／または
ｉｖ．キレート剤を含む。
【0031】
特定の実施形態において、標識ステップは、リガンドを含む４℃のＴＥＬｉ緩衝液に酵母細胞を曝露するステップを含む。
【0032】
特定の実施形態において、発現される核酸配列のライブラリーのための核酸配列は、好ましくはエラープローンＰＣＲによるランダム突然変異誘発によって生成される。
【0033】
特定の実施形態において、発現された核酸配列のライブラリーは、設計（合成）ライブラリーである。
【0034】
特定の実施形態において、発現された核酸配列のライブラリーは、配列同一性が互いに少なくとも６０％である相同配列を含む。
【0035】
特定の実施形態において、細胞壁を含む真核細胞は、酵母細胞、特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ、またはＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである。
【0036】
特定の実施形態において、細胞壁を含む真核細胞は、天然の細胞壁を含まない、突然変異酵母株または遺伝子操作酵母株である。
【0037】
特定の実施形態において、細胞壁を含む真核細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、特にＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１である。
【0038】
特定の実施形態において、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドは、作動薬、拮抗薬またはアロステリック調節薬である。
【0039】
特定の実施形態において、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドは、少なくとも３、４、５、６、８、１０、１４、１８または２５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドである。
【0040】
その他の実施形態において、受容体に特異的に結合できるリガンドは、抗体、抗体断片または別の結合タンパク質、例えば、非限定的に挙げられる例であるＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディ、アンチカリン、ナノボディ、アフィリン、フィブロネクチンに由来する足場およびその他の足場からの、足場タンパク質である。
【0041】
本発明のこの第１の態様に代わる方法によれば、発現された核酸配列のライブラリーから配列を選択する方法であって、配列がその発現レベルに応じて選択される、方法が提供される。方法は、以下のステップを含む。
ａ）細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
ｂ）標識ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識
細胞を生成する。
ｃ）洗浄ステップにおいて、複数の標識細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかった大部分の、またはあらゆるリガンドおよび検出可能標識を除去する。
ｄ）選択ステップにおいて、複数の標識細胞の各々について上記検出可能標識の存在を検出し、複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
ｅ）単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
ａ）細胞壁を含む複数の真核細胞、特に複数の酵母細胞を提供し、各真核細胞がライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、細胞内で作動可能なプロモーター配列の制御下で、細胞壁を含む複数の真核細胞内の標的膜タンパク質として発現される、細胞への導入遺伝子である。
ｂ）標識ステップにおいて、細胞壁を含む複数の真核細胞を、標的膜タンパク質に特異的に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、複数の標識
細胞を生成する。
ｃ）洗浄ステップにおいて、複数の標識細胞を洗浄し、それにより、標的膜タンパク質に特異的に結合しなかった大部分の、またはあらゆるリガンドおよび検出可能標識を除去する。
ｄ）選択ステップにおいて、複数の標識細胞の各々について上記検出可能標識の存在を検出し、複数の標識細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識細胞のサブセットを選択する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
ｅ）単離ステップにおいて、細胞の選択物から発現された核酸配列を単離する。
【0042】
換言すれば、本発明の第１の態様のこの代替態様による方法は、細胞壁を含む真核細胞における膜貫通型受容体のライブラリーの発現を可能にし、かつ、これらの受容体の機能的発現の選択を可能にする。結合リガンドの量による細胞の選択は、非機能性受容体（例えば、細胞内膜に存在する受容体）も含むであろう全受容体量によってではなく原形質膜上の機能性受容体の量に応じて細胞を選択することを可能にする。本発明の第１の態様のこの代替態様は、小さなリガンドの使用に好都合であり得る。
【0043】
本発明の第２の態様によれば、機能性膜タンパク質を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞（ａｄａｐｔｅｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ）を選択する方法が提供される。方法は、以下のステップを含む：
ａ．複数の酵母細胞を提供し、酵母細胞の各々が、発現された核酸配列のライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、複数の酵母細胞において標的膜タンパク質として発現されている。
ｂ．透過化ステップにおいて、複数の酵母細胞の細胞壁を透過化する。これは、複数の透過化生細胞を生成する。
ｃ．標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、それにより、複数の標識生細胞を生成する。
ｄ．洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄する。
ｅ．選択ステップにおいて、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択して、生細胞の選択物を生成する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
ｆ．増殖ステップにおいて、生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。
ｇ．生細胞の増殖選択物をステップｂ．～ｆ．に少なくとも１、２、３、４、５、６または７回供する。
ｈ．生細胞の増殖選択物をステップｂ．～ｅ．に供する。
ｉ．複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて生細胞の選択物のサブセットを選択する。これは、機能性膜タンパク質を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞を生細胞の増殖選択物から生成する。
ａ．複数の酵母細胞を提供し、酵母細胞の各々が、発現された核酸配列のライブラリーの核酸配列メンバーを含んでいる。核酸配列メンバーは、複数の酵母細胞において標的膜タンパク質として発現されている。
ｂ．透過化ステップにおいて、複数の酵母細胞の細胞壁を透過化する。これは、複数の透過化生細胞を生成する。
ｃ．標識ステップにおいて、複数の透過化生細胞を、標的膜タンパク質に結合できるリガンドと接触させる。リガンドは、検出可能標識を含み、それにより、複数の標識生細胞を生成する。
ｄ．洗浄ステップにおいて、複数の標識生細胞を洗浄する。
ｅ．選択ステップにおいて、複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて複数の標識生細胞のサブセットを選択して、生細胞の選択物を生成する。換言すれば、あらゆる標識すなわち特定閾値を上回る標識量を示す細胞を選択して、生細胞の選択物を生成する。
ｆ．増殖ステップにおいて、生細胞の選択物を増殖させて、生細胞の増殖選択物を生成する。
ｇ．生細胞の増殖選択物をステップｂ．～ｆ．に少なくとも１、２、３、４、５、６または７回供する。
ｈ．生細胞の増殖選択物をステップｂ．～ｅ．に供する。
ｉ．複数の標識生細胞に存在する検出可能標識に応じて生細胞の選択物のサブセットを選択する。これは、機能性膜タンパク質を高レベルで発現する能力を有する適応酵母細胞を生細胞の増殖選択物から生成する。
【0044】
分離可能な単一の特徴、例えば、細胞株または、透過化緩衝液、選別方法もしくはライブラリータイプなどについての選択肢が本明細書において「実施形態」として示されている場合にはいつでも、そのような選択肢を自由に組み合わせて、本明細書に開示される発明の別個の実施形態を形成してもよいことを理解されたい。
【0045】
以下の実施例および図面によって本発明をさらに例示するが、そこからさらなる実施形態および利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を例示することを意図したものであり、その範囲を限定することを意図していない。
【図面の簡単な説明】
【0046】
【図1】図１は、酵母におけるＧＰＣＲの指向性進化のためのワークフローを示す。第１ステップとして、ＤＮＡライブラリーを作出するために野生型ＧＰＣＲ遺伝子をエラープローンＰＣＲによってランダム化する。その後、ＤＮＡライブラリーを、線状化した酵母発現ベクターと組み合わせ、その混合物を酵母の形質転換に使用する。インサートＤＮＡおよびベクター主鎖を相同組換えによって生体内で組み立てる。得られた酵母ライブラリーを培養し、発現を誘導する。発現後、細胞を透過化し、原形質膜中の機能性ＧＰＣＲに専ら結合する蛍光リガンドと共に培養する。続いて、未結合リガンドを洗浄によって除去し、細胞をＦＡＣＳによる選択に供する。高い蛍光性を示してそれに対応して高い機能レベルでＧＰＣＲを発現する細胞の選択は、所望の高発現ＧＰＣＲ変異体の単離を可能にする。ＦＡＣＳの間、酵母細胞は、後の増殖のために直接に増殖培地の中へと選別される。最も良く発現されるＧＰＣＲを抱えた細胞の強力な濃縮をもたらすために、ＦＡＣＳによる選択を反復的に実施する。必要に応じて、選択された細胞からプラスミドＤＮＡを個々の変異体の分析のために単離することができ、またはもう１回進化させるためにランダム突然変異誘発によってさらなる多様性を導入することができる。
【図2】図２の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｅ）は、ＮＴＲ１、ＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１変異体のリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。野生型ＧＰＣＲ（左パネル）、第２回目の進化の後に得られたライブラリープール（中央パネル）、および大腸菌に基づく系において進化した変異体（右パネル）についての、酵母における機能的発現。対応するＧＰＣＲ変異体を発現している酵母細胞における受容体と蛍光性リガンドとの結合によって、全シグナルを得た（黒色の曲線）。非特異的結合は、過剰の非標識リガンドの存在下で測定した（灰色、色付）。野生型ＧＰＣＲについては、表面における機能的発現レベルが低いために特異的シグナルが検出されない。選択されたライブラリープールは、発現細胞における高い特異的シグナル（１細胞あたりの表面の機能性受容体）を示すと同時に、表面に機能性受容体を少しも発現していない少ない割合の細胞を示す（二重ピークの全シグナルに留意されたい）。大腸菌に基づく系において前もって進化させた変異体（ＮＴＲ１－Ｄ０３、ＮＫ１Ｒ－Ｅ１１）は、特異的シグナルを示すものの、酵母ライブラリープールの場合に得られたレベルには達していない。その上、より著しく高い割合の細胞において、表面における機能性ＧＰＣＲの発現が検出されない。例えば、ＮＴＲ１－Ｄ０３の発現の場合、測定された全細胞のうち約５０％のみが特異的シグナルを示す。（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｆ）ＮＴＲ１、ＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１変異体についての１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数（ａｖｅｒａｇｅ ｔｏｔａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）のＲＬＢＡによる測定。発現レベルは［３Ｈ］放射性リガンドで定量した。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドと共に［３Ｈ］放射性リガンドの存在下で測定し、全シグナルから差し引いた。野生型のＮＴＲ１およびＫＯＲ１は低い発現レベルを示し、その一方で、ＮＫ１Ｒでは機能的発現が全く検出されない。ＮＴＲ１－Ｄ０３は１細胞あたりの受容体を中程度に示すが、他方、ＮＫ１Ｒ－Ｅ１１では発現レベルが低い。選択されたライブラリープールは、１細胞あたりの受容体が１００，０００～１５０，０００である機能的産生レベルを示し、野生型ＧＰＣＲ、および大腸菌において進化した変異体と比較してそれぞれ、２５～５０倍および５～２０倍の増加を示す。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図3】図３は、未適応酵母株（ｎｏｎ－ａｄａｐｔｅｄ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ）において選択されたＮＴＲ１変異体（ＮＴＲ１－Ｙ０１～ＮＴＲ１－Ｙ０７）の機能的発現を示す。（Ａ）全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。選択された全ての変異体は、野生型ＮＴＲ１に比べて機能的表面発現の増加を示す（図２Ａ参照）。ライブラリープールＮＴＲ１ ２．５と比較して、個々の変異体は、表面に機能性受容体を発現していない亜集団の増加と、活性受容体の表面発現のある細胞のより低い特異的シグナル（１細胞あたりの受容体）とを表している（図２Ａ）。（Ｂ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。全ての変異体は、野生型ＮＴＲ１に比べて機能的発現の増加を示すが、ＮＴＲ１ ２．５プールについて観察された発現レベルには達していない（図２Ｂ参照）。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図4】図４は、未適応酵母株および適応酵母株において発現されたＨＡタグ付きＮＴＲ１変異体の定量的ウェスタンブロット分析を示す。発現後に、各試料について等しい細胞数で全細胞溶解物のタンパク質抽出を実施した。ローディング対照として、アクチンを使用した。予想される分子サイズ（４４ｋＤａ）を少し下回って流れる単量体ＧＰＣＲに対応する主バンドと、ＧＰＣＲ二量体を表す可能性が最も高く、用いた条件下で分解しなかった、より高い分子量のバンドとを有するＧＰＣＲをそれらのＨＡタグによって検出した。定量化（棒線図）のために、定義した全てのバンドの強度を考量し、野生型ＮＴＲ１について得られたＧＰＣＲおよびアクチンの強度に対してシグナルを規格化した。未適応株では、野生型ＮＴＲ１（レーン１）から、進化した変異体（レーン２）へと、産生する全ＧＰＣＲが２倍に増加する。適応株（レーン３）でもＮＴＲ１－Ｙ０６の全受容体レベルが未適応株（レーン２）に比べてわずかに増加するが、産生する全受容体の相対的増加は、機能性受容体の増加よりもはるかに低い（図１３Ｂ参照）。陰性対照（レーン４）には、ＨＡタグなしでＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している細胞を使用した。
【図5】図５は、未適応酵母株および適応酵母株において発現された、ｍＣｈとのＣ末端融合を有するＮＴＲ１変異体についての蛍光共焦点顕微鏡研究を示す。蛍光リガンドの結合（上段）によって得られたかまたはｍＣｈ（中段）から得られた蛍光強度、および明視野顕微鏡オーバーレイ（下段）を示す。野生型ＮＴＲ１（第１列）の発現の場合、細胞表面にリガンド結合シグナルがある細胞は検出されず、その一方で、いくつかの細胞は、主に細胞内部に位置する明確なｍＣｈシグナルを示し、したがって、細胞内に保持された受容体を反映している。その上、非発現の亜集団を表して、いかなる蛍光シグナルも欠如した細胞が多く検出されている。対照的に、未適応細胞におけるＮＴＲ１－Ｙ０６（第２列）の発現は、リガンド結合による細胞表面の機能性受容体の視覚化を可能にしている。これらの細胞はｍＣｈの強いシグナルも示しているが、未だ大部分が細胞内部に局在している。未適応株におけるＮＴＲ１－Ｙ０６の発現は、野生型ＮＴＲ１と同様に、非発現細胞を引き起こし、リガンド結合のシグナルもｍＣｈのシグナルも表さない。適応株におけるＮＴＲ１－Ｙ０６（第３列）の発現では、より著しく少ない非発現細胞が検出され、発現細胞は、細胞内部にｍＣｈがほとんど検出されず、表面にリガンド結合とｍＣｈとの両方の強いシグナルを示している。陰性対照（第４列）では、ｍＣｈ融合を有さないＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している細胞を、過剰の非標識ニューロテンシンの中で蛍光標識ニューロテンシンと共に培養した。代表的な写真を示す。
【図6】図６は、Ｃ末端ｍＣｈ融合を有するＮＴＲ１変異体を発現している未適応株および適応株のＦＣ分析およびＲＬＢＡ分析を示す。（Ａ）ＮＴＲ１（左パネル）およびＮＴＲ１－Ｙ０６（中央パネル）を発現している未適応株ならびにＮＴＲ１－Ｙ０６（右パネル）を発現している適応株の、ＦＣデータを示す。リガンド結合実験（上段）の度数分布図では、全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）を示して活性受容体変異体の表面発現を比較している。ＮＴＲ１は表面に活性受容体をほとんど示さず、他方、ＮＴＲ１－Ｙ０６の場合には未適応株および適応株において表面発現が著しく増加する（特異的シグナルがより高い蛍光強度に向かってシフトする）。さらに、適応株は、ｍＣｈ融合を有するＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している未適応株と比較して、活性受容体の表面発現を示さない細胞の割合の実質的な減少をもたらす。ｍＣｈ発現の度数分布図（中段）では、産生された全受容体が定量される。黒色の曲線はｍＣｈシグナルを示し、他方、蛍光リガンドと共に培養した、ｍＣｈ融合のないＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している細胞の自家蛍光は、バックグラウンド（灰色、色付）を表す。未適応株におけるＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６の発現は、ｍＣｈシグナルプロファイルが非常に似通っている。リガンド結合ＦＣ実験におけるＮＴＲ１の発現では、表面の活性受容体はほとんど検出されないため、強いｍＣｈシグナルは、大部分のＮＴＲ１が細胞内に保持されているはずであることを意味する。受容体を全く発現していない細胞の亜集団はあらゆる変異体について見受けられる（二重ピークに留意されたい）が、この非発現の割合は適応株において著しく減少している。相関分析（下段）では、ｍＣｈ蛍光強度（全産生受容体）がリガンド結合蛍光強度（表面の機能性受容体）と比較される。野生型ＮＴＲ１の発現の場合、表面の機能性受容体は、全産生受容体とよく相関していない。この相関は、未適応株において発現されたＮＴＲ１－Ｙ０６でより良好であり、ＮＴＲ１－Ｙ０６が適応株において発現される場合、表面の機能性受容体は、全産生受容体とよく相関している。（Ｂ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。未適応株では、野生型受容体から、進化した変異体へと、ｍＣｈ融合を有する受容体の機能的発現レベルが３倍に増加する。適応株は、未適応株におけるＮＴＲ１－Ｙ０６の発現と比較して、平均した機能的発現の総数（ａｖｅｒａｇｅ ｔｏｔａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を６倍さらに増加させる。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図7】図７は、Ｓｆ９昆虫細胞において進化したＧＰＣＲの機能的発現レベル、およびＮＫ１Ｒ変異体のシグナル伝達活性を示す。（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）ＮＴＲ１、ＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１変異体についての１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。野生型ＧＰＣＲに比べて、進化した全ての変異体は、１細胞あたりの平均受容体のレベルの著しい増加を示す。ＮＴＲ１－Ｙ０６は、野生型ＮＴＲ１に比べて５倍の増加を示し、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９は、ＮＫ１ＲおよびＮＫ１Ｒ－ΔＣに比べてそれぞれ４倍および２倍の増加を示し、ＫＯＲ１－Ｙ０５の場合には野生型ＫＯＲ１に比べて最も強い増加（２７倍）が検出される。各ＧＰＣＲについて、２つの独立した発現実験を実施した（別々の棒グラフ）。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の実施からの標準偏差を示す。（Ｄ）ＮＫ１Ｒ変異体のシグナル伝達活性の［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合による測定。等量の活性ＧＰＣＲと再構成Ｇタンパク質とを、Ｐ物質の存在下（灰色）および非存在下（黒色）でアッセイした。作動薬による刺激のない状態では全ての変異体が低い基礎活性を示す。作動薬を添加すると、シグナル伝達が［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合によって検出される。ＮＫ１ＲおよびＮＫ１Ｒ－ΔＣは同一のシグナル伝達活性を有し、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９のシグナル伝達は依然として野生型受容体に類似したままである。各ＧＰＣＲ変異体に対して、２つの独立した発現実験による２つの独立したシグナル伝達アッセイを実施した（別々の棒グラフ）。エラーバーは、３回の実施からの標準偏差を示す。
【図8】図８は、各ＧＰＣＲの進化の間に最も高度に濃縮されたクローンの概要を示す。各クローンの突然変異が表示されており、突然変異データの上には対応する野生型アミノ酸が示されている。突然変異の位置は、構造領域、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ付番（３）および連続的アミノ酸付番によって表示されている。（Ａ）ＮＴＲ１変異体。（Ｂ）ＮＫ１Ｒ変異体。（Ｃ）ＫＯＲ１変異体。（Ｄ）突然変異を抱えた様々な領域を描写するＧＰＣＲトポロジーの図解。
【図9】図９は、未適応酵母株において選択されたＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１変異体の機能的発現を示す。（Ａ）、（Ｂ）それぞれＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１変異体についての、示される全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。全ての変異体は、対応する野生型ＧＰＣＲ（ＮＫ１ＲおよびＫＯＲ１、図２Ｃ、Ｅ参照）と比較して機能的発現の増加を示す。ほとんどの変異体の発現細胞の特異的シグナルは、対応するライブラリープール（ＮＫ１Ｒ２．５およびＫＯＲ１ ２．５、図２Ｃ、Ｅ参照）と比較して類似しているかまたはわずかに低いが、個々の変異体には、表面に機能性受容体を少しも発現していない細胞がより高い割合で認められる。（Ｃ）、（Ｄ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。全ての変異体は、対応する野生型ＧＰＣＲと比較して機能的発現の増加を示すが、ほとんどの変異体では、対応するライブラリープールの場合と比較してＲＬＢＡによって測定された１細胞あたりの受容体の平均数が低い（図２Ｄ、Ｆ参照）。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図10】図１０は、ＮＴＲ１ ２．５プールから直接単離された酵母株と、ＦＡＣＳによる表現型選択によって後に適応させた新規形質転換株とにおけるＮＴＲ１－Ｙ０６の機能的発現レベルを示す。（Ａ）、（Ｂ）全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。単離株は、ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している未適応の再形質転換株（図３Ａ参照）とは対照的に、ＮＴＲ１ ２．５ライブラリープール（図２Ａ参照）に類似した発現プロファイルを示す。新規形質転換株を使用して５回のＦＡＣＳによる表現型選択の後に得られた、（Ｂ）に示されている後の適応株では、高い表面発現レベルが再構成される。（Ｃ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している再形質転換株（図３Ｂ参照）と比較して、単離株における機能性ＮＴＲ１－Ｙ０６の高発現、および適応株におけるこの表現型の再構成が検出される。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図11】図１１は、宿主適応のための表現型選択中での個々の選別後におけるＮＴＲ１－Ｙ０６の発現プロファイルを示す。全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。ＮＴＲ１－Ｙ０６発現の最も高い細胞を選別する（最も蛍光性である細胞の上位１％に制限する）表現型選択の過程で、表面に機能性受容体を少しも発現していない細胞の母集団は徐々に減少する。それと同時に、発現細胞の特異的シグナルは選択中により高いレベルにシフトし、これらの細胞の表面における１細胞あたりの機能性受容体の増加が指し示される。適応を誘導するには２つの選別が必要であることに留意されたい。発現プロファイルは最初の２つの選別の後に著しく変化しないが、選別３の後、活性ＮＴＲ１－Ｙ０６の表面発現を伴わない亜集団の明らかな減少と、発現亜集団内での特異的シグナルのシフトとが認められる。この傾向は、選別４の後の発現プロファイルで見受けられるように、その後の選別において継続される。
【図12】図１２は、未適応株、適応株、およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける非発現条件下で前もって培養した適応株における、ＮＴＲ１－Ｙ０６の機能的発現を示す。（Ａ）全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している新規形質転換株の適応は、発現細胞亜集団のより高い特異的シグナル（１細胞あたりの受容体）と、活性受容体の表面発現を少しも示していない亜集団の減少とをもたらす。適応株を非発現条件下で反復的に培養する場合、発現亜集団における特異的シグナル（１細胞あたりの受容体）の落ち込み、および活性ＮＴＲ１－Ｙ０６の表面発現を伴わない細胞の割合の増加によって表されて、平均発現レベルが再び減少する。（Ｂ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。ＲＬＢＡからの結果は、１細胞あたりの平均受容体数が、未適応株から適応株へと著しく増加し、それが今度は、発現誘導前に適応株を非発現条件下で反復的に培養した場合に再び約３０％落ち込む、ということを示している。未適応株の本来のより低い発現レベルへの完全な復帰（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）の欠如は、非誘導条件下においてさえ高発現の表現型を部分的に保持するのに十分である、漏出的発現の結果である可能性がある。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図13】図１３は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの未適応株および適応株におけるＮＫ１Ｒ－Ｙ０９およびＫＯＲ１－Ｙ０５の機能的発現を示す。（Ａ）、（Ｃ）全シグナル（赤色曲線）および非特異的シグナル（緑色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。適応株における発現細胞の特異的発現シグナル（１細胞あたりの受容体）は、未適応株に比べてわずかに増加し、その一方で、活性受容体の表面発現を伴わない亜集団の著しい減少が認められる。（Ｂ）、（Ｄ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。ＦＣデータに示されている、活性受容体の表面発現を示さない細胞の割合の適応株における減少は、ＲＬＢＡで測定される平均した機能的発現の増加をもたらす。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図14】図１４は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの未適応株および適応株におけるＨＡタグ付きＮＴＲ１－Ｙ０６の機能的発現を示す。（Ａ）全シグナル（黒色曲線）および非特異的シグナル（灰色、色付）に関するリガンド結合ＦＣデータの度数分布図を示す。非特異的シグナルは、過剰の非標識リガンドの存在下で得た。Ｃ末端ＨＡタグを有するＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している株の適応は、活性受容体の表面発現を示さない細胞の割合の減少と、表面発現のある細胞の表面における１細胞あたりの活性受容体の増加とをもたらす（特異的シグナルがより高い蛍光強度に向かってシフトする）。（Ｂ）１細胞あたりの平均した機能性受容体の総数のＲＬＢＡによる測定。未適応株では、野生型受容体から、進化した変異体へと、機能的発現レベルが４倍に増加する。適応株は、未適応株におけるＨＡタグ付きＮＴＲ１－Ｙ０６の発現と比較して、平均した機能的発現の総数を１０倍さらに増加させる。非特異的シグナルは全シグナルから差し引いた。エラーバーは、３回の代表的な発現実験からの標準偏差を示す。
【図15】図１５は、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の精製を示す。（Ａ）ＩＭＡＣの後の精製受容体のＳＥＣプロファイル。２つのピークが得られ、そのうちピーク１は、定義された、より高いＮＫ１Ｒ－Ｙ０９のオリゴマー状態に対応している可能性が最も高く、その一方でピーク２はモノマー受容体画分を表す。（Ｂ）還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の分析。等量の全タンパク質を各レーンに装填した。ＩＭＡＣ（レーン１）の後、純粋なＮＫ１Ｒ－Ｙ０９（３８．５ｋＤａ）が得られるとともに、より高い分子量の別のタンパク質の弱いバンドが検出される。そのようなバンドは、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９のオリゴマーを表している可能性が最も高く、それは、用いた条件下では分解しない。ピーク１（レーン２）の画分では、単量体ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の強いバンドに次いで、より高い分子量のバンドも検出され、その一方で、ピーク２（レーン３）の画分では、単量体ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９が唯一の種である。ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９は、酵母の選択によって得られたときに、昆虫細胞におけるさらなる遺伝子操作および発現が行われなかったことに留意されたい。結晶化試験を実施することを目的とした精製には、さらなる遺伝子操作、例えば、潜在的なグリコシル化部位の除去、Ｎ末端切断、ループ欠失および／または、融合タンパク質（例えば、Ｔ４リゾチームまたは熱安定化アポシトクロムｂ５６２ＲＩＬ（Ｃｈｕｎら（２０１２）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０：９６７－９７６））の導入が必要であろう。そのような手段は、異種性の低減、配座柔軟性の制限、および安定性の向上によって受容体の精製をさらに改善する可能性がある（Ｍａｅｄａ＆Ｓｃｈｅｒｔｌｅｒ（２０１３）、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ２３：３８１－３９２）。
【実施例】
【0047】
実施例１： 酵母における指向性進化による高発現機能性ＧＰＣＲの生成
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ヒトゲノム中に約８００種の様々なメンバーを有して細胞表面受容体の最大のスーパーファミリーを構成している。真核細胞生命体においてＧＰＣＲは、多様なリガンドに応答するとともにヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してＧタンパク質非依存的な様式でシグナルを変換して、高度に多目的なシグナル伝達媒介物へと進化した。ＧＰＣＲの極めて重要な役割は、異常なＧＰＣＲシグナル伝達に関連する非常に多くのヒト疾患、例えば肥満、糖尿病、心血管疾患、骨粗鬆症、免疫学的障害、神経変性疾患および癌に反映される。結果としてＧＰＣＲは、製薬産業にとって大いに重要性を有する薬剤標的を意味する。市販されている薬物の約３０～５０％が、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ関連のメカニズムに作用するものであり、それらの多くは最も売れている薬物である。
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、ヒトゲノム中に約８００種の様々なメンバーを有して細胞表面受容体の最大のスーパーファミリーを構成している。真核細胞生命体においてＧＰＣＲは、多様なリガンドに応答するとともにヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してＧタンパク質非依存的な様式でシグナルを変換して、高度に多目的なシグナル伝達媒介物へと進化した。ＧＰＣＲの極めて重要な役割は、異常なＧＰＣＲシグナル伝達に関連する非常に多くのヒト疾患、例えば肥満、糖尿病、心血管疾患、骨粗鬆症、免疫学的障害、神経変性疾患および癌に反映される。結果としてＧＰＣＲは、製薬産業にとって大いに重要性を有する薬剤標的を意味する。市販されている薬物の約３０～５０％が、ＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ関連のメカニズムに作用するものであり、それらの多くは最も売れている薬物である。
【0048】
ＧＰＣＲの構造的および詳細な生化学的調査における主要な難問は、所望の受容体を十
分な量で産生することの困難さ、ならびにそれらの生得の不安定性および柔軟性である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の使用、または脂質キュービック相（ＬＣＰ）での内在性膜タンパク質の結晶化の確立のような、発現および結晶化の方策の進歩は、Ｘ線結晶解析による三次元受容体構造を決定する上での突破口につながる。利用可能な構造データセットはＧＰＣＲ機能のメカニズムについての原子レベルでの洞察を科学界に提供し、また合理的な構造に基づく薬物設計を可能にし始めるかもしれないが、その一方で、受容体の動態および配座変化についての詳細な理解が未だにいくぶん不完全なままであることは明らかである。
分な量で産生することの困難さ、ならびにそれらの生得の不安定性および柔軟性である。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系の使用、または脂質キュービック相（ＬＣＰ）での内在性膜タンパク質の結晶化の確立のような、発現および結晶化の方策の進歩は、Ｘ線結晶解析による三次元受容体構造を決定する上での突破口につながる。利用可能な構造データセットはＧＰＣＲ機能のメカニズムについての原子レベルでの洞察を科学界に提供し、また合理的な構造に基づく薬物設計を可能にし始めるかもしれないが、その一方で、受容体の動態および配座変化についての詳細な理解が未だにいくぶん不完全なままであることは明らかである。
【0049】
さらに、現在までにタンパク質構造データバンク（ＰＤＢ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）に寄託された２６の独特のＧＰＣＲ構造は、未だに全ての受容体のうちのごくわずかな割合（＜４％）を表し、ＧＰＣＲの構造調査にとっての障害が根強く残っていることを反映している。例えば、これまでに決定された全てのＧＰＣＲ構造（情報元：ＰＤＢ；天然組織から抽出したタンパク質から得られた構造を除く）の約８５％については、組換え受容体を産生するために昆虫細胞を使用するのに成功したが、この発現系は包括的な解決策を提供しない。ＧＰＣＲスーパーファミリーのいくつかのメンバーは昆虫細胞においてさえ低収量で発現され、真核細胞においてもこれらの受容体の生合成および膜挿入に関する根本的な問題が示唆される。この問題は発現条件の単純な最適化によって解決することができない、というのも特に、個々のＧＰＣＲにとっての最適条件に一貫性が見受けられないからである。したがって、ＧＰＣＲ研究を促進および加速するためには新規な手法が必要である。
【0050】
近年、本発明者らは、指向性進化によって大腸菌におけるＧＰＣＲの機能的発現レベルを向上させる方法を開発した（Ｓａｒｋａｒら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０５：１４８０８－１４８１３；ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８ ：５９９－６１５）。野生型ＧＰＣＲのランダム突然変異誘発に続く蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による選択によって、４種の異なるＧＰＣＲ、すなわちニューロテンシン受容体１（ＮＴＲ１）、ＮＫ－１受容体（ＮＫ１Ｒ、別名タキキニン受容体１またはＰ物質受容体）ならびにアルファ－１Ａおよびアルファ－１Ｂアドレナリン受容体のランダム化ライブラリーから高発現変異体を単離することが可能となった。得られた第１世代の変異体は、ＮＴＲ１の継続的研究において、広範な選択（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０９：９８１０－９８１５）および網羅的な組換え（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２２：４１４－４２８）による第２世代の突然変異体の作出のための基礎を築いた。これらの研究で作出された合成ライブラリーを、短鎖界面活性剤中での安定性の向上したＮＴＲ１変異体をＣＨＥＳＳと呼ばれる相補的指向性進化手法によって生成させるためにも使用した（ＳｃｏｔｔおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１３）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５：６６２－６７７；Ｓｃｏｔｔら（２０１４）、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １８３８：２８１７－２８２４）。究極的には、これらの取り組みは、大腸菌で産生された材料から作動薬結合ＮＴＲ１の３つの異なる変異体の構造をもたらし（Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １１１：Ｅ６５５－６２）、膜タンパク質工学における指向性進化の力を際立たせた。
【0051】
大腸菌における進化で得られた好結果、および真核生物発現宿主について証明された有効性により、特に真核生物発現系における高い機能性ＧＰＣＲ発現に向けてこの手法をさらに開発することが求められた。本発明者らは、真核生物において特異的配列適応とそれによる改善した機能的産生とを獲得するためには真核生物系において直接、ＧＰＣＲの進化を実施することが好適かもしれないという仮説を立てた。さらに、真核生物宿主に比べて大腸菌は、翻訳後修飾を行うことができず、真核生物膜タンパク質の分泌質制御および
転位機構が欠けており、膜組成が異なっている。したがって、大腸菌におけるＧＰＣＲの指向性進化は、進化の成功に必要な閾値を超えて原核生物系において生得的に発現する受容体に限定され、それゆえ真核生物のプロセシングまたは膜組成のために厳密に必要なものを有していない。
転位機構が欠けており、膜組成が異なっている。したがって、大腸菌におけるＧＰＣＲの指向性進化は、進化の成功に必要な閾値を超えて原核生物系において生得的に発現する受容体に限定され、それゆえ真核生物のプロセシングまたは膜組成のために厳密に必要なものを有していない。
【0052】
ここで、本発明者らは、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける指向性進化によって真核生物宿主においてＧＰＣＲの機能的発現を増加させる、高速で効率的かつ堅牢な方法の確立を開示する。この方法は、実証されるとおり、３種の異なるＧＰＣＲに関して概して適用可能であり、たった２回の進化によって、酵母および昆虫細胞のいずれにおいても高い機能的発現を示す受容体変異体を生成する。その上、誘導される宿主適応によって、酵母における機能的発現レベルを再現性よくさらに増加させることができる。
【0053】
酵母における３種の異なるＧＰＣＲの指向性進化は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて高い機能的発現をもたらす
この方法の一般的手法を図１に示す。まず、野生型ＧＰＣＲ遺伝子をエラープローンＰＣＲによってランダム化し、結果として得られるＤＮＡライブラリーを酵母の形質転換に使用する。インサートＤＮＡおよび酵母発現ベクター主鎖を、設計された相同組換え部位を介して生体内で組み立てる。次に、得られた酵母ライブラリーにおける発現を誘導し、続いて細胞を、酵母細胞壁の透過化のために最適化された緩衝液で処理する。透過化は、原形質膜中の機能的に発現された受容体に対する投与蛍光リガンドの接近、したがって結合を可能にするために必要である。飽和濃度の蛍光リガンドと共に培養した後、未結合リガンドを洗浄によって除去し、細胞をＦＡＣＳによる選択に供する。表面に変異体を機能性受容体分子最大数で発現している酵母細胞は、それに対応して最も高い蛍光を呈する。これらの細胞は、最も蛍光性であるの酵母細胞の上位０．５～１％に制限してそれらを後の増殖のために直接に増殖培地の中へと選別することによって、単離される。所望の表現型を有するＧＰＣＲ変異体を発現している細胞の強力な濃縮を達成するために、発現、蛍光リガンドとの培養、およびＦＡＣＳの反復的なサイクルを数回実施する。プラスミドＤＮＡは、分析または、さらなるランダム突然変異誘発によるさらなる多様性の導入のために、ＦＡＣＳ後に選択された細胞から単離することができ、それによって次の回の進化が開始される。
この方法の一般的手法を図１に示す。まず、野生型ＧＰＣＲ遺伝子をエラープローンＰＣＲによってランダム化し、結果として得られるＤＮＡライブラリーを酵母の形質転換に使用する。インサートＤＮＡおよび酵母発現ベクター主鎖を、設計された相同組換え部位を介して生体内で組み立てる。次に、得られた酵母ライブラリーにおける発現を誘導し、続いて細胞を、酵母細胞壁の透過化のために最適化された緩衝液で処理する。透過化は、原形質膜中の機能的に発現された受容体に対する投与蛍光リガンドの接近、したがって結合を可能にするために必要である。飽和濃度の蛍光リガンドと共に培養した後、未結合リガンドを洗浄によって除去し、細胞をＦＡＣＳによる選択に供する。表面に変異体を機能性受容体分子最大数で発現している酵母細胞は、それに対応して最も高い蛍光を呈する。これらの細胞は、最も蛍光性であるの酵母細胞の上位０．５～１％に制限してそれらを後の増殖のために直接に増殖培地の中へと選別することによって、単離される。所望の表現型を有するＧＰＣＲ変異体を発現している細胞の強力な濃縮を達成するために、発現、蛍光リガンドとの培養、およびＦＡＣＳの反復的なサイクルを数回実施する。プラスミドＤＮＡは、分析または、さらなるランダム突然変異誘発によるさらなる多様性の導入のために、ＦＡＣＳ後に選択された細胞から単離することができ、それによって次の回の進化が開始される。
【0054】
本発明者らは、３つの異なるＧＰＣＲ：（ｉ）ラットＮＴＲ１、（ｉｉ）ヒトＮＫ１Ｒおよび（ｉｉｉ）ヒトカッパ型オピオイド受容体（ＫＯＲ１）を並行して進化させることを目指した。ＮＴＲ１は、大腸菌に基づく系において容易に進化させることができることがいくつかの研究で示されており、それゆえに陽性対照と見なした。ＮＫ１Ｒも同様に、大腸菌においてより高く発現させることに向けて好結果に指向性進化に供されている（ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８：５９９－６１５）。しかしながら、相対的な改善が強力であるにも拘らず、原核生物における野生型ＮＫ１Ｒの発現レベルが非常に低いために、進化した受容体変異体は、大腸菌において進化した他の受容体に比べて依然として中程度の絶対レベルでしか発現しなかった（Ｓａｒｋａｒら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０５：１４８０８－１４８１３；ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８：５９９－６１５）。しかも、これらの進化したＮＫ１Ｒ変異体の発現レベルはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいても低く（下記参照）、機能的産生のさらなる改善が可能かもしれないことを示唆していたが、それは将来、この受容体の研究に恩恵をもたらし得る。ＫＯＲ１に関しては、この受容体を進化させる試みはこれまで行われておらず、それは、異種発現に関して挑戦に値する例の代表である。
【0055】
上に概説した手順に続いて、３つの受容体の各々に対してたった２回の進化―各回は、
エラープローンＰＣＲによる１回のランダム化とその後のＦＡＣＳによる５回の選択とから構成される―を行うだけで、機能的発現レベルを強く向上させるのに十分であった。図２は、大腸菌に基づく系において前もって進化させた野生型ＧＰＣＲであるＮＴＲ１変異体およびＮＫ１Ｒ変異体（それぞれＮＴＲ１－Ｄ０３およびＮＫ１Ｒ－Ｅ１１）、ならびに第２回目の進化の後に得られたライブラリープールすなわちＮＴＲ１ ２．５、ＮＫ１Ｒ２．５、およびＫＯＲ１ ２．５（ライブラリー命名法：ＧＰＣＲ ａ．ｂは、ａが全ランダム化の回数であり、ｂが全ＦＡＣＳ選択の回数である）の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能的発現レベルの比較を示す。機能的発現レベルは、フローサイトメトリー（ＦＣ）または放射性リガンド結合アッセイ（ＲＬＢＡ）のいずれかによって測定した。ＦＣリガンド結合実験は、インタクトな個々の細胞の表面の原形質膜中の機能性受容体を専ら測定するものであり、他方、ＲＬＢＡは、溶解した細胞の集団全体に亘って平均した機能性受容体の合計量を考量するものであり、それゆえ細胞内膜中の機能性ＧＰＣＲも検出するものである、ということに留意されたい。野生型ＧＰＣＲについては、ＦＣ実験において特異的シグナルは得られず、したがって表面の原形質膜中の活性受容体は検出されない（図２Ａ、Ｃ、Ｅ）。対照的に、ＮＴＲ１およびＫＯＲ１についてのＲＬＢＡでは、機能性受容体の低い発現レベルが測定され、少量の活性受容体が存在しているがしかし細胞内膜中に保持されている可能性が最も高いということが指し示される（図２Ｂ、Ｆ）。ＮＫ１Ｒについては、以前に報告されたこと（Ｂｕｔｚら（２００３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４：２９２－３０４）と一致して、用いたいずれかの方法では機能性受容体が検出されなかった（図２Ｃ、Ｄ）。
エラープローンＰＣＲによる１回のランダム化とその後のＦＡＣＳによる５回の選択とから構成される―を行うだけで、機能的発現レベルを強く向上させるのに十分であった。図２は、大腸菌に基づく系において前もって進化させた野生型ＧＰＣＲであるＮＴＲ１変異体およびＮＫ１Ｒ変異体（それぞれＮＴＲ１－Ｄ０３およびＮＫ１Ｒ－Ｅ１１）、ならびに第２回目の進化の後に得られたライブラリープールすなわちＮＴＲ１ ２．５、ＮＫ１Ｒ２．５、およびＫＯＲ１ ２．５（ライブラリー命名法：ＧＰＣＲ ａ．ｂは、ａが全ランダム化の回数であり、ｂが全ＦＡＣＳ選択の回数である）の、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける機能的発現レベルの比較を示す。機能的発現レベルは、フローサイトメトリー（ＦＣ）または放射性リガンド結合アッセイ（ＲＬＢＡ）のいずれかによって測定した。ＦＣリガンド結合実験は、インタクトな個々の細胞の表面の原形質膜中の機能性受容体を専ら測定するものであり、他方、ＲＬＢＡは、溶解した細胞の集団全体に亘って平均した機能性受容体の合計量を考量するものであり、それゆえ細胞内膜中の機能性ＧＰＣＲも検出するものである、ということに留意されたい。野生型ＧＰＣＲについては、ＦＣ実験において特異的シグナルは得られず、したがって表面の原形質膜中の活性受容体は検出されない（図２Ａ、Ｃ、Ｅ）。対照的に、ＮＴＲ１およびＫＯＲ１についてのＲＬＢＡでは、機能性受容体の低い発現レベルが測定され、少量の活性受容体が存在しているがしかし細胞内膜中に保持されている可能性が最も高いということが指し示される（図２Ｂ、Ｆ）。ＮＫ１Ｒについては、以前に報告されたこと（Ｂｕｔｚら（２００３）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４：２９２－３０４）と一致して、用いたいずれかの方法では機能性受容体が検出されなかった（図２Ｃ、Ｄ）。
【0056】
注目すべきことに、ＦＣおよびＲＬＢＡ分析によって示されたことであるが、選択されたライブラリーの発現レベルは、野生型受容体よりもはるかに高いだけでなく、対応する大腸菌において進化した変異体（ＮＴＲ１－Ｄ０３、ＮＫ１Ｒ－Ｅ１１）よりも高い。選択された酵母ライブラリーについては、１細胞あたりの全機能性受容体が１００，０００～１５０，０００であることがＲＬＢＡで測定され、対応する野生型ＧＰＣＲおよび大腸菌進化変異体と比べてそれぞれ２５～５０倍および５～２０倍の増加を表している（図２Ｂ、Ｄ、Ｆ）。ＦＣデータは、大腸菌からの進化変異体および選択された酵母ライブラリーのいずれについても明確な特異的シグナルを示すことによって、表面にある活性受容体を裏付けている（図２Ａ、Ｃ、Ｅ）。しかし、選択された酵母ライブラリーの特異的シグナルは、大腸菌進化変異体に比べてより高い蛍光強度に向かってシフトしており、表面にある活性受容体の増加を反映している。さらに、選択された酵母ライブラリーでは、表面に機能性受容体を少しも発現していない細胞の亜集団がより著しく小さく検出される。
【0057】
そのような２つの亜集団への分割は、酵母の単一クローンとライブラリーとの両方において試験した全てのＧＰＣＲの発現に際してＦＣ実験において再現性よく認められた。したがってこの作用は、かなりの割合の細胞において表面での機能的発現が欠如するものであるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧＰＣＲ発現に固有の特徴であるようである。例えば、大腸菌進化変異体のＦＣデータで示されているが、ＮＴＲ１－Ｄ０３の活性な表面発現は全細胞の約５０％において得られ、低発現変異体ＮＫＲ１－Ｅ１１の場合はごく少数の細胞が活性な表面発現を示す（図２Ａ、Ｃ）。なぜ単一のクローンから増殖させた集団のうちのいくつかの細胞が表面に機能性受容体を少しも産生しないのかは不明なままであるが、全ての培養は専ら選択最小培地で行われるため、これらの細胞での発現ベクターの喪失は除外できる。
【0058】
濃縮された受容体変異体の酵母における発現レベルの改善は、選択と同時に起こる宿主適応によってさらに向上する。
濃縮されたクローンを同定すべく、ＤＮＡ配列決定のために第１回目（段階１．５のライブラリー）および第２回目（段階２．５のライブラリー）の進化の後にプラスミドＤＮＡをライブラリープールから単離した。選択されたクローンについて各クローンの様々な
突然変異を描写する概要を図８に示す。興味深いことに、ＮＴＲ１およびＫＯＲ１の場合には完全長の変異体のみが選択されたが、選択されたＮＫ１Ｒ変異体は全て、推定ヘリックス８およびパルミトイル化部位の後にある狭い７アミノ酸の範囲内の位置に終止コドンを含んでおり、その結果Ｃ末端が短くなった。このことは、完全長Ｃ末端に対して対抗的な選択が強くなされ、切断がこの受容体の発現の著しい増加をもたらす、ということを指し示している。酵母では機能性の野生型ＮＫ１Ｒが検出されないため、本発明者らは代わりに、最も顕著に選択されるＣ末端切断と野生型配列とを組み合わせて、ＮＫ１Ｒ－ΔＣと呼ぶ基準変異体を構築した。これによって本発明者らは、選択された突然変異の基準を得、またＣ末端切断がＮＫ１Ｒの機能的発現の改善にどれだけ寄与するかを定量することも可能になった。
濃縮されたクローンを同定すべく、ＤＮＡ配列決定のために第１回目（段階１．５のライブラリー）および第２回目（段階２．５のライブラリー）の進化の後にプラスミドＤＮＡをライブラリープールから単離した。選択されたクローンについて各クローンの様々な
突然変異を描写する概要を図８に示す。興味深いことに、ＮＴＲ１およびＫＯＲ１の場合には完全長の変異体のみが選択されたが、選択されたＮＫ１Ｒ変異体は全て、推定ヘリックス８およびパルミトイル化部位の後にある狭い７アミノ酸の範囲内の位置に終止コドンを含んでおり、その結果Ｃ末端が短くなった。このことは、完全長Ｃ末端に対して対抗的な選択が強くなされ、切断がこの受容体の発現の著しい増加をもたらす、ということを指し示している。酵母では機能性の野生型ＮＫ１Ｒが検出されないため、本発明者らは代わりに、最も顕著に選択されるＣ末端切断と野生型配列とを組み合わせて、ＮＫ１Ｒ－ΔＣと呼ぶ基準変異体を構築した。これによって本発明者らは、選択された突然変異の基準を得、またＣ末端切断がＮＫ１Ｒの機能的発現の改善にどれだけ寄与するかを定量することも可能になった。
【0059】
再形質転換の後に個々のクローンを分析し、濃縮された全ての受容体変異体が酵母において実際に、対応する野生型受容体よりも著しく良好に発現されることを明らかにした（図３および図９）。これは、この真核生物宿主における生合成への適応がより良好である変異体が実際に得られたことを指し示す。
【0060】
選択されたＧＰＣＲライブラリーでは、表面に機能性受容体を少しも発現していない細胞がごくわずかな割合で検出されたが（図２Ａ、Ｃ、Ｅ）、個々の変異体を新鮮な宿主細胞内で再形質転換した場合にはより大きな亜集団でそのような細胞が認められた（図３Ａおよび図９Ａ、Ｂ）。さらに、再形質転換後に活性な表面発現を有する細胞では、特定のＦＣシグナルがより低い蛍光強度に向かってシフトすることによって指し示されるように、個々のＮＴＲ１変異体の１細胞あたりの受容体レベルがより低く検出された（図３Ａ）。ＦＣにおけるこれらの組み合わせ作用の観察結果と一致して、個々のＮＴＲ１変異体を発現している再形質転換株（図３Ｂ）では、選択されたＧＰＣＲライブラリー（図２Ｂ）に比べてより著しく低い平均ＲＬＢＡ読取り値が得られた。
【0061】
発明者らは、選択の過程で、選択されたライブラリーにおける膜タンパク質発現のレベルのさらなる増加につながる発現宿主の適応が起こった、という仮説を立てた。この仮説を試験するために、ＮＴＲ１－Ｙ０６と名付けられた強く選択された変異体を発現している酵母クローンを、ＮＴＲ１ ２．５ライブラリープールから直接単離した。予想通り、単離株は、ＮＴＲ１ ２．５ライブラリープールと同様の発現プロファイルでＮＴＲ１－Ｙ０６を高い機能レベルで発現する（図１０Ａ、Ｃ）。ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している再形質転換株と単離株との両方から単離された全プラスミドＤＮＡの配列決定から、差異がないことが明らかになった。それゆえ本発明者らは、ＦＡＣＳによる反復的な発現と最も良く発現するクローンの選別との実際上の手順が、ＧＰＣＲ産生の向上に向けた酵母の適応を誘導した、と結論付けた。この仮説を試験するために、ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している再形質転換された単一クローンについて、最も蛍光性である細胞の上位１．０％に制限することによってＮＴＲ１－Ｙ０６発現の最も高い細胞を単離する、後のＦＡＣＳによる５回の（配列のランダム化を伴わない）模擬選択を実施した。実際、この表現型選択の過程で、株は、活性な表面発現のない細胞の漸減と、表面発現を伴う亜集団における１細胞あたりの機能性受容体の増加とによって、より高いＮＴＲ１－Ｙ０６の発現に適応した（図１１）。最終的に、適応後にＮＴＲ１－Ｙ０６は、選択されたＮＴＲ１ ２．５プールにおいて得られた発現レベルと同じ高さの全機能レベルで発現され、１細胞あたりの平均した機能性受容体数が約１６０，０００であり、同様の発現プロファイルを有する（図１０Ｂ、Ｃ）。しかし、非発現条件下での適応株の反復的培養により、発現レベルが３０％落ち込むことによって適応作用が部分的に復帰することが認められた（図１２）。
【0062】
表現型適応は選択の主要な特徴でさえあったかもしれないのか否かを試験するために、本発明者らは、野生型ＮＴＲ１を発現している株を適応させることも試みた。しかし、ＦＡＣＳの後、選別された細胞はもはや増殖せず、反復的選択が妨げられた。この観察結果
は、改善された特性を受容体に付与するものである突然変異の選択が宿主適応の厳しい必須条件であり、配列変化が実は重要な進化事象である、ということを明白に示す。野生型ＮＴＲ１を発現している細胞において適応を誘導するのに失敗したことは、毒性のある野生型ＧＰＣＲの発現とそれに続く選択とが組み合わさって一緒に細胞の生存を制限するストレスの多い作用によって説明され得る。
は、改善された特性を受容体に付与するものである突然変異の選択が宿主適応の厳しい必須条件であり、配列変化が実は重要な進化事象である、ということを明白に示す。野生型ＮＴＲ１を発現している細胞において適応を誘導するのに失敗したことは、毒性のある野生型ＧＰＣＲの発現とそれに続く選択とが組み合わさって一緒に細胞の生存を制限するストレスの多い作用によって説明され得る。
【0063】
それゆえ、反復的選別によって誘導される適応は、本質的に細胞にとって毒性の低いものである進化したＧＰＣＲ変異体に限定されるように思われる。実際、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９およびＫＯＲ１－Ｙ０５をそれぞれ発現している株である進化したＮＫ１Ｒ変異体およびＫＯＲ１変異体の適応もまた同様に可能であった。どちらの変異体も選択中に強く濃縮され、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９またはＫＯＲ１－Ｙ０５を発現している新規形質転換細胞は、対応するライブラリープールよりも低い発現レベルを示した。各変異体について、ＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している株を適応させるために用いた手順と同一のＦＡＣＳによる５回の表現型選択を実施した。どちらの変異体についても、選択の過程で徐々に生じる、より高い発現レベルに向けた宿主適応が認められた（図１３）。ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９およびＫＯＲ１－Ｙ０５についての宿主適応作用はＮＴＲ１－Ｙ０６の場合よりも顕著ではないものの、これらの結果は、適応が受容体に特異的なものではなく、進化した受容体が発現されるならば再現性よく誘導できる、ということを示唆している。
【0064】
適応株において、機能性受容体の割合は増加するが、産生される全受容体の量がより著しく高くなりはしない。
宿主適応はＮＴＲ１－Ｙ０６の発現において最も顕著であったため、この変異体を使用して当該作用をさらに研究した。リガンド結合ＦＣ分析およびＲＬＢＡは活性受容体の検出を可能にするものの、リガンド結合活性を問わずこれらの方法はいずれも、産生された全受容体の定量化を可能としない。したがって、様々な株で産生された全受容体タンパク質をイムノブロッティングによって検出するために、受容体のＣ末端にヘマグルチニン（ＨＡ）タグを有するＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６の発現構築を作出した。
宿主適応はＮＴＲ１－Ｙ０６の発現において最も顕著であったため、この変異体を使用して当該作用をさらに研究した。リガンド結合ＦＣ分析およびＲＬＢＡは活性受容体の検出を可能にするものの、リガンド結合活性を問わずこれらの方法はいずれも、産生された全受容体の定量化を可能としない。したがって、様々な株で産生された全受容体タンパク質をイムノブロッティングによって検出するために、受容体のＣ末端にヘマグルチニン（ＨＡ）タグを有するＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６の発現構築を作出した。
【0065】
ＦＡＣＳを用いる５回の表現型選択によって、ＨＡタグ付きＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している株をより高い発現に向かって適応させた（図１４Ａ）。続いて、発現後に同数の酵母細胞を使用して、野生型ＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している様々な株（後者は未適応株および適応株）の全受容体産生を、全細胞溶解物からの定量的ウェスタンブロットにおいてＨＡタグ検出によって測定した（図４）。
【0066】
未適応株では、全受容体の量が、野生型ＮＴＲ１から、進化した変異体へと、２倍に増加する（図４）。機能的発現は、４倍に増加することがＲＬＢＡデータによって認められた（図１４Ｂ）。これは、機能性受容体と産生された全受容体との比率が、野生型受容体から進化した受容体へとごくわずかに増加することを指し示す。
【0067】
しかし、ＲＬＢＡデータに基づいて適応株を未適応株と比較すると、ＮＴＲ１－Ｙ０６の機能的発現には１０倍の増加があるものの（図１４Ｂ）、全受容体産生の増加は２倍未満である（図４）。産生された全受容体の量がほんのわずかだけ増加することから、適応株では機能性受容体の割合が著しく増加していると推定できる。
【0068】
適応は、活性受容体の表面発現を増加させ、細胞内に保持されたＧＰＣＲを専ら発現している細胞の数を減少させ、非発現細胞の亜集団を減少させる。
未適応株および適応株においてＮＴＲ１変異体の細胞局在化および機能性を評価することによって宿主適応作用をさらに説明するために、Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）融合を有するＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６構築物を共焦点顕微鏡研究およびＦＣ実験に使用した：全受容体はｍＣｈによって定量化されるが、原形質膜中で細胞表面に位置してい
る機能性受容体のみが蛍光リガンド結合からのシグナルを示すことになる。
未適応株および適応株においてＮＴＲ１変異体の細胞局在化および機能性を評価することによって宿主適応作用をさらに説明するために、Ｃ末端ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）融合を有するＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６構築物を共焦点顕微鏡研究およびＦＣ実験に使用した：全受容体はｍＣｈによって定量化されるが、原形質膜中で細胞表面に位置してい
る機能性受容体のみが蛍光リガンド結合からのシグナルを示すことになる。
【0069】
ＨＡタグ付き変異体と同じく、ｍＣｈ融合を有するＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している株をまず表現型選択によって適応させた。次に、ＮＴＲ１およびＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している未適応株ならびにＮＴＲ１－Ｙ０６を発現している適応株を蛍光リガンドに曝露して、共焦点蛍光顕微鏡検査によって共局在研究を実施した（図５）。
【0070】
リガンド結合ＦＣ実験（図６Ａ）で分かるように、原形質膜中の機能性野生型ＮＴＲ１のレベルは非常に低く、結果として顕微鏡検査ではリガンド結合シグナルは検出されない（図５）。対照的に、ｍＣｈの明確なシグナルは、いくつかの細胞において得られるが、専ら細胞内部に位置しており、それゆえ、細胞内に保持されたＮＴＲ１－ｍＣｈ融合受容体を発現している細胞を反映している。野生型ＮＴＲ１について得られた低いＲＬＢＡ読取り値（図６Ｂ）によれば、細胞内受容体の大部分は不活性であるはずである。さらに、その他多くの細胞は、非発現亜集団を表して、ｍＣｈシグナルを全く有さず検出される（図５）。注目すべきことに、これらの亜集団の両方である、細胞内に保持された受容体を専ら発現している細胞、および非発現細胞は、ＦＣによるリガンド結合実験で区別できない。そのため、ＦＣリガンド結合データにおいてこれらの２つの亜集団は共に、表面発現を少しも示していない細胞の画分を構成する。
【0071】
未適応株において発現された、進化したＮＴＲ１－Ｙ０６は、表面における検出可能なリガンド結合と、ｍＣｈシグナルとを示す（図５）。しかし、原形質膜におけるｍＣｈのシグナルは依然としていくぶん弱く、細胞内部で検出される強いｍＣｈシグナルがあり、野生型ＮＴＲ１に類似して相当量の受容体が細胞内膜に保持されていることを指し示している。さらに、リガンド結合についてもｍＣｈについても何らシグナルを有さない非発現細胞も同様に頻繁に検出される。したがって、進化した受容体の場合でも、ＦＣリガンド結合実験で検出された表面発現のない細胞の亜集団は、２種類の細胞：受容体発現を少しも有さない細胞と、発現された受容体が原形質膜に転移していない細胞とを含む。
【0072】
適応株において発現されたＮＴＲ１－Ｙ０６については状況が異なり、リガンド結合およびｍＣｈの強いシグナルが原形質膜において検出される（図５）。未だいくらかのシグナルが細胞内部に見られるものの、ｍＣｈは主として表面に局在している。しかも、著しく少ない非発現細胞が認められる。
【0073】
リガンド結合シグナルをｍＣｈシグナルと比較するＦＣ実験によるさらなる調査（図６Ａ）によって、共焦点顕微鏡研究で得られた結果が裏付けられた：発現亜集団におけるｍＣｈのシグナルは全ての変異体において検出されるが、野生型ＮＴＲ１についてはｍＣｈ蛍光強度がリガンド結合シグナル強度とよく相関していない。これは、大部分の野生型受容体が細胞表面に転移していないという事実を反映している。自家蛍光タンパク質（例えばＧＦＰまたはｍＣｈ）と融合させた野生型ＧＰＣＲの蛍光強度が、機能性受容体レベルと弱く相関するに過ぎないという知見は、以前に説明されてきた。興味深いことに、この相関は、未適応株におけるＮＴＲ１－Ｙ０６発現においてより良好であり、適応株において発現されるＮＴＲ１－Ｙ０６の場合には、産生される全受容体と機能性受容体とがよく相関している。この場合、受容体発現を専ら細胞内に有している細胞の減少を反映して、大部分の受容体が細胞表面へと輸送されている。興味深いことに、未適応株と比較して適応株では、ｍＣｈシグナルを少しも示さない亜集団（非発現細胞）もまた減少し、適応株における機能性ＧＰＣＲの産生レベルの全体的な増加にいっそうつながる。
【0074】
要約すると、ＧＰＣＲ発現のためのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの宿主適応は、産生される受容体の総量を増加させることなく活性受容体の表面発現を増加させ、そのことは、産生される活性受容体のパーセンテージがより高いことと等価である。大部分の細胞が機能
的表面発現を少しも示さない未適応細胞とは対照的に、適応細胞は細胞内に保持された受容体をほんの少ししか示さない。かなりの部分の細胞内受容体が不活性であるため、宿主適応は活性受容体の全体的な増加につながる。さらに、適応株では未適応株に比べて、受容体をまったく発現していない細胞の亜集団も減少し、より高い平均機能的産生レベルにいっそう寄与する。
的表面発現を少しも示さない未適応細胞とは対照的に、適応細胞は細胞内に保持された受容体をほんの少ししか示さない。かなりの部分の細胞内受容体が不活性であるため、宿主適応は活性受容体の全体的な増加につながる。さらに、適応株では未適応株に比べて、受容体をまったく発現していない細胞の亜集団も減少し、より高い平均機能的産生レベルにいっそう寄与する。
【0075】
３つ全てのＧＰＣＲの進化した変異体は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞において高い機能的発現レベルを示す。
究極的には本発明者の目的は、酵母だけでなく昆虫細胞においても機能的ＧＰＣＲ発現を増加させることであった。したがって、進化したＧＰＣＲであるＮＴＲ１－Ｙ０６、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９およびＫＯＲ１－Ｙ０５の機能的発現レベルをＳｆ９昆虫細胞において測定し、対応する野生型受容体と比較した。全てのＧＰＣＲについて、同一の標準発現条件（非最適化）を用いた。実際、進化した変異体の機能的発現の著しい増加が認められた。野生型ＮＴＲ１に比べてＮＴＲ１－Ｙ０６では機能的発現が５倍増加し（図７Ａ）、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９では野生型に対して４倍の増加が測定され（図７Ｂ）、ＫＯＲ１－Ｙ０５―注目すべきことにこの研究で研究した発現に関して最も挑戦的な例である―では２７倍の機能的発現の増加が検出される（図７Ｃ）。測定される１細胞あたりの平均した機能性受容体レベル（１細胞あたり４．１ｘ１０６～５．５ｘ１０６受容体）は高く、Ｓｆ９昆虫細胞において発現させた場合での大腸菌に基づく指向性進化系において発生させた第１世代さらには第２世代のＮＴＲ１突然変異体の発現レベル（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２２：４１４－４２８）を上回る。
究極的には本発明者の目的は、酵母だけでなく昆虫細胞においても機能的ＧＰＣＲ発現を増加させることであった。したがって、進化したＧＰＣＲであるＮＴＲ１－Ｙ０６、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９およびＫＯＲ１－Ｙ０５の機能的発現レベルをＳｆ９昆虫細胞において測定し、対応する野生型受容体と比較した。全てのＧＰＣＲについて、同一の標準発現条件（非最適化）を用いた。実際、進化した変異体の機能的発現の著しい増加が認められた。野生型ＮＴＲ１に比べてＮＴＲ１－Ｙ０６では機能的発現が５倍増加し（図７Ａ）、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９では野生型に対して４倍の増加が測定され（図７Ｂ）、ＫＯＲ１－Ｙ０５―注目すべきことにこの研究で研究した発現に関して最も挑戦的な例である―では２７倍の機能的発現の増加が検出される（図７Ｃ）。測定される１細胞あたりの平均した機能性受容体レベル（１細胞あたり４．１ｘ１０６～５．５ｘ１０６受容体）は高く、Ｓｆ９昆虫細胞において発現させた場合での大腸菌に基づく指向性進化系において発生させた第１世代さらには第２世代のＮＴＲ１突然変異体の発現レベル（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２２：４１４－４２８）を上回る。
【0076】
本発明者らの試験した３種のＧＰＣＲ突然変異体の全てについて得られる高い発現レベルをもってすれば、構造調査のための十分な材料を産生するのにリットル規模の発現培養物で十分である。これを試験するために、昆虫細胞発現培養物からのＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の精製を実施し、４～６ｍｇ／Ｌの純粋なタンパク質が再現性よく生じた。図１５は、サイズ排除（ＳＥＣ）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによる精製ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の分析を示す。
【0077】
非常に高い精製収率を考慮するとＮＫ１Ｒ－Ｙ０９は構造調査のための興味深く有望な候補を表す。それゆえ、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の機能性を［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合に基づくシグナル伝達アッセイによって特性評価した（図７Ｄ）。ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９は、刺激なし（基底活性）および作動薬刺激時での［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合に関していずれも野生型ＮＫ１ＲおよびＣ末端切断変異体ＮＫ１Ｒ－ΔＣに類似した活性を示し、本発明者らの手法の可能性をいっそう強調している。
【0078】
概要
機能的な形での組換えＧＰＣＲの産生は、未だに要求が厳しく困難でコスト集約的な作業であり続けている。近年決定されたＧＰＣＲ三次元構造のほとんどが、真核生物発現宿主において産生された受容体から得られ、大腸菌におけるＧＰＣＲの発現増加のためのタンパク質工学的方法の成功によって促進された、ということを考慮して本発明者らは、指向性進化手法をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入して真核生物における機能的ＧＰＣＲ産生を特異的に改善することを目指した。
機能的な形での組換えＧＰＣＲの産生は、未だに要求が厳しく困難でコスト集約的な作業であり続けている。近年決定されたＧＰＣＲ三次元構造のほとんどが、真核生物発現宿主において産生された受容体から得られ、大腸菌におけるＧＰＣＲの発現増加のためのタンパク質工学的方法の成功によって促進された、ということを考慮して本発明者らは、指向性進化手法をＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入して真核生物における機能的ＧＰＣＲ産生を特異的に改善することを目指した。
【0079】
急速な増殖、費用対効果の高い培養、および遺伝子操作の簡単さによって特徴付けられる酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、いくつかの付加的理由から、タンパク質工学および指向性進化のための理想的な真核宿主である：第１に、多様な用途において酵母表面ディスプレイは非常に強力な技術となってきた。第２に、今日では酵母を使用して多様性の高いライブラリーが簡単に得られる。第３に、酵母細胞には機能性ＧＰＣＲの産生に必要な細胞機構が備わっている、というのもＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、高等真核生物に類似したシグナル伝達経路を有する２つの異なるＧＰＣＲを内在的に発現するからである。第
４に、酵母は既に、様々ないくつかのＧＰＣＲの異種発現のために広範に使用されてきた。そして第５に、新規リガンドによって活性化される、デザイナードラッグによって独占的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）を生成させることを目指して、異種ＧＰＣＲを酵母内因性シグナル伝達経路と結合させる広く用いられているＧＰＣＲアッセイに基づき、かつてＧＰＣＲに対して指向性進化手法が成功裏に用いられた（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら（２００７）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０４：５１６３－５１６８）。
４に、酵母は既に、様々ないくつかのＧＰＣＲの異種発現のために広範に使用されてきた。そして第５に、新規リガンドによって活性化される、デザイナードラッグによって独占的に活性化されるデザイナー受容体（ＤＲＥＡＤＤ）を生成させることを目指して、異種ＧＰＣＲを酵母内因性シグナル伝達経路と結合させる広く用いられているＧＰＣＲアッセイに基づき、かつてＧＰＣＲに対して指向性進化手法が成功裏に用いられた（Ａｒｍｂｒｕｓｔｅｒら（２００７）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０４：５１６３－５１６８）。
【0080】
これまで、酵母におけるＧＰＣＲの機能的産生収率は概して低くあり続けてきた（Ｓａｒｒａｍｅｇｎａら（２００３）、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６０：１５２９－１５４６）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧＰＣＲ発現を増加させる方策には、発現条件の最適化、分子シャペロンの共発現、高発現宿主クローンのスクリーニング、遺伝子操作ＧＰＣＲ変異体のスクリーニング、または宿主遺伝子操作が含まれた。本明細書において、本発明者らは、３つの異なるＧＰＣＲを進化させることによって機能性ＧＰＣＲ発現レベルの増加したＧＰＣＲ変異体を直接得るための、本発明の一般的適用可能性を開示する。意外なことに、著しく増加した発現レベルを得るためにはたった２回の進化―２回のランダム化とその各々に続くＦＡＣＳによる選択という意味で―が必要であり、それゆえ、３つ全てのＧＰＣＲを短時間で効率的に進化させることが可能であった。大腸菌に基づく系では、大抵は４回の進化が必要であった。さらに本発明者らは、酵母宿主細胞をＧＰＣＲ産生の増加に適応させることができる、ということを開示する。これは、選択系に本来備わっている特徴であり、改良された受容体変異体の選択と同時に起こる。指向性進化が配列変化を実際もたらしたこと、そしてその改良された発現表現型が昆虫細胞に導入できるものであったこと、さらに宿主適応が、選択中に酵母において起こる付加的要因に過ぎないことは、繰り返し述べるべき重要なことである。さらに本発明者らは、野生型ＧＰＣＲを発現している細胞において宿主適応を誘導する試みが失敗したことから、進化した受容体の発現は宿主適応を誘導するための必須条件であるということを見出した。酵母の宿主適応は、ＦＡＣＳによる反復的な表現型選択によって再現性よく誘導することができる。これには通常４～５回の選別が必要であり、その作用は選択中に徐々に増加する。
【0081】
適応株は、表面発現された活性受容体の著しい増加を示して、はるかに高い割合の機能性受容体が原形質膜中にもたらされるとともに、産生される全受容体がわずかに増加する。対照的に、未適応株では、特に野生型受容体の発現の場合に、大量の受容体が細胞内区画に留まり、そのうちのかなりの量が不活性なミスフォールドタンパク質を表す。適応細胞の発現培養物における全体としてより高い平均した機能的産生の収率は、細胞内に保持された不活性受容体を発現している細胞の亜集団の減少と、非発現亜集団の減少とによって説明することができる。
【0082】
本発明者らは、産生宿主としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに限定されることを望まなかったため、得られたＧＰＣＲ変異体が他の真核生物宿主において同様に高い発現を可能にするか否かを調査した。実際、酵母において進化させたＧＰＣＲ変異体の機能的発現は、昆虫細胞においても増加した。注目すべきことに、酵母において生成させた変異体に比べて、大腸菌に基づく系において進化させた変異体は、昆虫細胞のような真核生物宿主へ移された場合に機能的発現の改善をより少なく示す（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２２：４１４－４２８）。新規な酵母進化変異体を使用して得られたＳｆ９細胞における高い発現レベルは、標準条件下でのリットル規模での発現培養物を使用する結晶学的調査に十分である。より具体的には、ＮＫ１Ｒ変異体ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の精製は、極めて大量の純粋なタンパク質をもたらした。さらに、ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９は、野生型ＮＫ１Ｒと同様のシグナル伝達活性を示して、開示の方法が、天然に意図された機能を実施できる生物学的に活性な変異体を生じさせることができることを示した
が、その結果としてこれらの変異体を使用して当該機能を好都合に研究することができる。
が、その結果としてこれらの変異体を使用して当該機能を好都合に研究することができる。
【0083】
要約すれば、本明細書において開示されるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるＧＰＣＲの指向性進化のための方法により、真核生物発現宿主における機能的発現の高いＧＰＣＲ変異体を短時間で効率的に生成させることができる。進化宿主としてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを使用することにより、酵母細胞および昆虫細胞のいずれにおいても機能的発現レベルの高いＧＰＣＲ変異体が生じ、後者の系では最大で２７倍のレベルとなった。このように、突然変異は導入可能なものであり、選択された変異体は、大腸菌において進化を実施した場合よりも、酵母細胞および昆虫細胞においてより大きな発現増加を示した。
【0084】
受容体突然変異体の有益な作用の昆虫細胞への導入可能性は、生成した突然変異体を大規模産生するための発現宿主としてＳｆ９細胞をさらに推し進める。それでもなお、誘導される宿主適応と合わさって高い発現レベルが今やＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてＧＰＣＲ進化の結果として得られる、という事実は、酵母の大規模産生宿主としての可能性を暗示する。実用的観点から、適応株において産生された全受容体に対する機能性受容体の比率が向上するという事実は、非機能性タンパク質と機能性タンパク質とを区別することができないＩＭＡＣのような精製方策にとって大きな利点である。これは、例えばＮＴＲ１の精製のために確立された切断可能リガンドカラム（Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、近刊）のようなリガンド親和性カラムが利用できない受容体の精製にとって、特別に興味深い。
【0085】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの多様性は、本発明者らの手法を受けることのできるＧＰＣＲの品目数を増やし、以前に確立された大腸菌における系では不十分であるＧＰＣＲの進化を可能にする。例えば、真核生物においてさえ非常に低い機能的発現レベルを示すＫＯＲ１のようなＧＰＣＲの場合、大腸菌における発現レベルは進化の成功に必要な閾値を下回る可能性がある。さらに、原核生物も天然酵母もコレステロール―いくつかのＧＰＣＲの活性はそれに依存している―を産生しないが、コレステロール産生Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株が遺伝子操作されてきた。原則的に、開示の方法はそのような、またはその他の任意の遺伝子操作酵母株に対して簡単に導入できるはずである。
【0086】
酵母株、ベクター、培養および発現。
全ての実験において、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）を使用した。標準的な発現は、ｐ４１５ ＧＡＬ１由来のｐＭＳ０３ｈｅｔを使用して実施した。様々な酵母発現ベクターのさらなる詳細については以下を参照されたい。ｐＭＳ０３ｈｅｔベクターを使用して形質転換したＢＹ４７４１を、ＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地（６．９ｇ／Ｌの酵母用アミノ酸不含ニトロゲンベース（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、６９０ｍｇ／Ｌのロイシン不含完全補給混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、２０ｇ／Ｌのグルコース、３５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、３５ｍＭのクエン酸）の中で３０℃で培養した。発現のために、ＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地中で３０℃で増殖させた対数増殖期の酵母細胞を遠心分離し、続いてＳＤＧ－Ｌｅｕ－培地（ＳＤＤ－Ｌｅｕ－と同一であるがグルコースの代わりに２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）の中に再び懸濁させた。ＳＤＧ－Ｌｅｕ－中への再懸濁後、初期ＯＤ６００を常に１．０に選択し、発現を２０℃で２４時間実施した。
全ての実験において、ＥＵＲＯＳＣＡＲＦから入手したＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＹ４７４１（ＭＡＴａ ｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ０ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）を使用した。標準的な発現は、ｐ４１５ ＧＡＬ１由来のｐＭＳ０３ｈｅｔを使用して実施した。様々な酵母発現ベクターのさらなる詳細については以下を参照されたい。ｐＭＳ０３ｈｅｔベクターを使用して形質転換したＢＹ４７４１を、ＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地（６．９ｇ／Ｌの酵母用アミノ酸不含ニトロゲンベース（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、６９０ｍｇ／Ｌのロイシン不含完全補給混合物（Ｆｏｒｍｅｄｉｕｍ）、２０ｇ／Ｌのグルコース、３５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、３５ｍＭのクエン酸）の中で３０℃で培養した。発現のために、ＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地中で３０℃で増殖させた対数増殖期の酵母細胞を遠心分離し、続いてＳＤＧ－Ｌｅｕ－培地（ＳＤＤ－Ｌｅｕ－と同一であるがグルコースの代わりに２０ｇ／Ｌのガラクトースを含む）の中に再び懸濁させた。ＳＤＧ－Ｌｅｕ－中への再懸濁後、初期ＯＤ６００を常に１．０に選択し、発現を２０℃で２４時間実施した。
【0087】
酵母発現ベクター
ｐＭＳ０３ｈｅｔを得るために、α接合因子プレプロ配列をｐＰＩＣＺαＡ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からｐ４１５ ＧＡＬ１の多重クローニング部位（ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ）にクローニングした。ｐＭＳ０３ｈｅｔには、高効率での形質転換、すなわちα接合因子プレプロ配列を初発とした遺伝子のインフレームクローニングのために、
効率的なベクター線状化を可能にするＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ制限部位が含まれている。Ｃ末端ＨＡタグまたはｍＣｈｅｒｒｙへの融合を有するＧＰＣＲの発現のために、ベクターｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ＨＡまたはｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ｍＣｈをそれぞれ使用した。ｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ＨＡおよびｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ｍＣｈを得るために、ＨＡタグまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列をＢａｍＨＩによってｐＭＳ０３ｈｅｔにクローニングした。
ｐＭＳ０３ｈｅｔを得るために、α接合因子プレプロ配列をｐＰＩＣＺαＡ（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からｐ４１５ ＧＡＬ１の多重クローニング部位（ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ）にクローニングした。ｐＭＳ０３ｈｅｔには、高効率での形質転換、すなわちα接合因子プレプロ配列を初発とした遺伝子のインフレームクローニングのために、
効率的なベクター線状化を可能にするＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ制限部位が含まれている。Ｃ末端ＨＡタグまたはｍＣｈｅｒｒｙへの融合を有するＧＰＣＲの発現のために、ベクターｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ＨＡまたはｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ｍＣｈをそれぞれ使用した。ｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ＨＡおよびｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ｍＣｈを得るために、ＨＡタグまたはｍＣｈｅｒｒｙをコードする配列をＢａｍＨＩによってｐＭＳ０３ｈｅｔにクローニングした。
【0088】
酵母ライブラリー構築および形質転換。
ラットＮＴＲ１（アミノ酸１～４２のＮ末端が切断されている）の野生型遺伝子は、Ｒｅｉｎｈａｒｄ Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ（アメリカ国立衛生研究所）から寄贈されたものである。ヒトＮＫ１ＲおよびヒトＫＯＲ１の野生型ｃＤＮＡは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｓ＆Ｔ ｃＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。全ての野生型ＧＰＣＲ遺伝子をｐＭＳ０３ｈｅｔ（ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ）にクローニングした。ＤＮＡライブラリーの構築は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元のプロトコルに従って使用してエラープローンＰＣＲによる第１回目の進化を行った後に野生型遺伝子または単離ＤＮＡを増幅することによって実施した。ＤＮＡライブラリーによるＢＹ４７４１の形質転換は、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）での矩形波電気穿孔によって実施した。平均して５ｘ１０７～１ｘ１０８種の多様性を有するライブラリーが得られた。ライブラリー構築および高効率形質変換のさらなる詳細については、以下を参照されたい。
ラットＮＴＲ１（アミノ酸１～４２のＮ末端が切断されている）の野生型遺伝子は、Ｒｅｉｎｈａｒｄ Ｇｒｉｓｓｈａｍｍｅｒ（アメリカ国立衛生研究所）から寄贈されたものである。ヒトＮＫ１ＲおよびヒトＫＯＲ１の野生型ｃＤＮＡは、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｓ＆Ｔ ｃＤＮＡ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｅｎｔｅｒから入手した。全ての野生型ＧＰＣＲ遺伝子をｐＭＳ０３ｈｅｔ（ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ）にクローニングした。ＤＮＡライブラリーの構築は、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＩＩランダム突然変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元のプロトコルに従って使用してエラープローンＰＣＲによる第１回目の進化を行った後に野生型遺伝子または単離ＤＮＡを増幅することによって実施した。ＤＮＡライブラリーによるＢＹ４７４１の形質転換は、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌエレクトロポレーター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）での矩形波電気穿孔によって実施した。平均して５ｘ１０７～１ｘ１０８種の多様性を有するライブラリーが得られた。ライブラリー構築および高効率形質変換のさらなる詳細については、以下を参照されたい。
【0089】
ＤＮＡライブラリー構築および高効率形質転換
第１回目の進化の後の野生型ＧＰＣＲまたは単離バージョンのＤＮＡライブラリーを、一方が２０サイクルのエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）でありもう一方が２５サイクルのｅｐＰＣＲである２回のｅｐＰＣＲを実施することによって生成させ、得られた産物をその後にプールした。ｅｐＰＣＲのために使用したプライマーは、（ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩによって消化された）線状化ｐＭＳ０３ｈｅｔに相同的な部位を、遺伝子の各末端に導入した。
第１回目の進化の後の野生型ＧＰＣＲまたは単離バージョンのＤＮＡライブラリーを、一方が２０サイクルのエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）でありもう一方が２５サイクルのｅｐＰＣＲである２回のｅｐＰＣＲを実施することによって生成させ、得られた産物をその後にプールした。ｅｐＰＣＲのために使用したプライマーは、（ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩによって消化された）線状化ｐＭＳ０３ｈｅｔに相同的な部位を、遺伝子の各末端に導入した。
【0090】
順方向プライマー：
５’－ＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＡＧＣ－３’；
逆方向プライマー：
５’－ＡＴＴＡＣＡＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣ－３’。
５’－ＣＴＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＡＧＣ－３’；
逆方向プライマー：
５’－ＡＴＴＡＣＡＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣ－３’。
【0091】
形質転換のための十分なＤＮＡ材料を得るために、得られたｅｐＰＣＲ産物を、同一のプライマーを使用する標準的なＰＣＲによってさらに増幅させた。
【0092】
矩形波電気穿孔による高効率形質転換は、先に公開された方法（Ｖａｎ ＤｅｖｅｎｔｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（２０１４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１３１：１５１－１８１）を少し改造して似たように実施した。酵母細胞を６０ｍＬのＹＰＤ中で３０℃でＯＤ６００＝１．８～２．０まで増殖させた。この細胞密度に達してすぐに５０ｍＬの培養物を遠心分離し、培地を吸引し、細胞を２５ｍＬの調整溶液（１００ｍＭの酢酸リチウム、１０ｍＭのＤＴＴ）中で３０℃で１５分間処理した。続いて、細胞をペレット化し、冷やした２５ｍＬのｄｄＨ２Ｏ中で洗浄し、再度ペレット化し、冷やしたｄｄＨ２Ｏ中に再び懸濁させて総量５００μＬにした。それ以降は細胞を常に４℃に保った。１回の形質転換のために、２５０μＬの酵母細胞を４μｇの線状化ｐＭＳ０３ｈｅｔおよび１２μｇのＰＣＲ産物と混合し、その形質転換混合物を２ｍｍの電気穿孔キュベットに移した。矩形波電気穿孔は、電圧５００Ｖおよびパルス長１５ｍｓで１パルスで実施した
。電気穿孔の後、細胞を３０℃で１時間、振盪なしで５ｍＬのＹＰＤ中で回復させた。最後に、回収した細胞をペレット化し、３０℃で２０～２４時間の選択的増殖のために５００ｍＬのＳＤＤ－Ｌｅｕ－に移し、－８０℃でグリセロールストックに保存した。高多様性ライブラリーを得るために、１ライブラリーあたり常に２つの形質転換を実施した。
。電気穿孔の後、細胞を３０℃で１時間、振盪なしで５ｍＬのＹＰＤ中で回復させた。最後に、回収した細胞をペレット化し、３０℃で２０～２４時間の選択的増殖のために５００ｍＬのＳＤＤ－Ｌｅｕ－に移し、－８０℃でグリセロールストックに保存した。高多様性ライブラリーを得るために、１ライブラリーあたり常に２つの形質転換を実施した。
【0093】
酵母細胞の透過化および蛍光リガンドの結合。
発現後、培養物を遠心分離し、培地を吸引し、室温で細胞をＴＥＬｉ緩衝液（ｐＨ９．０（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの酢酸リチウム）の中に再び懸濁させた。次に細胞を、５０ｍＭのＤＴＴで補給されたＴＥＬｉ緩衝液中で２０℃で３０分間培養し、続いて、冷やしたＴＥＬｉ緩衝液中で２回洗浄した。それ以降は細胞を常に４℃に保った。蛍光リガンド結合のために、透過化細胞をＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡｎａＳｐｅｃ）で標識したリガンド（ＮＴＲ１変異体：２５ｎＭの蛍光ニューロテンシン（８－１３）；ＮＫ１Ｒ変異体：２０ｎＭの蛍光Ｐ物質；ＫＯＲ１変異体：１０ｎＭの蛍光ダイノルフィンＡ（１－１１））と共にＴＥＬｉ緩衝液中で４℃で２時間、光に曝露することなく培養した。培養後、測定前に細胞をＴＥＬｉ緩衝液中で１回洗浄した。非特異的結合は、１０００倍過剰の非標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２５μＭのニューロテンシン（８－１３）（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＮＫ１Ｒ変異体：２０μＭのＰ物質（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＫＯＲ１変異体：１０μＭのダイノルフィンＡ（１－１１）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ））の存在下で測定した。蛍光リガンドのさらなる詳細については、以下を参照されたい。
発現後、培養物を遠心分離し、培地を吸引し、室温で細胞をＴＥＬｉ緩衝液（ｐＨ９．０（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭの酢酸リチウム）の中に再び懸濁させた。次に細胞を、５０ｍＭのＤＴＴで補給されたＴＥＬｉ緩衝液中で２０℃で３０分間培養し、続いて、冷やしたＴＥＬｉ緩衝液中で２回洗浄した。それ以降は細胞を常に４℃に保った。蛍光リガンド結合のために、透過化細胞をＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡｎａＳｐｅｃ）で標識したリガンド（ＮＴＲ１変異体：２５ｎＭの蛍光ニューロテンシン（８－１３）；ＮＫ１Ｒ変異体：２０ｎＭの蛍光Ｐ物質；ＫＯＲ１変異体：１０ｎＭの蛍光ダイノルフィンＡ（１－１１））と共にＴＥＬｉ緩衝液中で４℃で２時間、光に曝露することなく培養した。培養後、測定前に細胞をＴＥＬｉ緩衝液中で１回洗浄した。非特異的結合は、１０００倍過剰の非標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２５μＭのニューロテンシン（８－１３）（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＮＫ１Ｒ変異体：２０μＭのＰ物質（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＫＯＲ１変異体：１０μＭのダイノルフィンＡ（１－１１）（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ））の存在下で測定した。蛍光リガンドのさらなる詳細については、以下を参照されたい。
【0094】
蛍光リガンド
全ての蛍光リガンドをＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ）で標識した。ニューロテンシン（８－１３）（ＫＫＰＹＩＬ）をＮ末端アミノ基に共有結合的に標識した。Ｐ物質（ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ）をリジン－３のアミノ基に共有結合的に標識した。ダイノルフィンＡ（１－１１）（ＹＧＧＦＬＲＲＩＲＰＫ）をリジン－１１のアミノ基に共有結合的に標識した。
全ての蛍光リガンドをＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ａｎａｓｐｅｃ）で標識した。ニューロテンシン（８－１３）（ＫＫＰＹＩＬ）をＮ末端アミノ基に共有結合的に標識した。Ｐ物質（ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ）をリジン－３のアミノ基に共有結合的に標識した。ダイノルフィンＡ（１－１１）（ＹＧＧＦＬＲＲＩＲＰＫ）をリジン－１１のアミノ基に共有結合的に標識した。
【0095】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ。
測定のために、リガンド結合によって蛍光標識した細胞をＴＥＬｉ緩衝液中で保持した。フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦＡＣＳは、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ選別装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。分析測定のために、常に５０，０００イベントを記録した。ＦＡＣＳでは、最も蛍光性である０．５～１．０％の細胞３ｘ１０５～５ｘ１０５個が、その後の３０℃で２４時間の培養のためにＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地中へ選別された。全ての試料について、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。データはＦｌｏｗＪｏ ｖＸ．０．７を用いて解析した。
測定のために、リガンド結合によって蛍光標識した細胞をＴＥＬｉ緩衝液中で保持した。フローサイトメトリーは、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ細胞分析装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、ＦＡＣＳは、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩ選別装置（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。分析測定のために、常に５０，０００イベントを記録した。ＦＡＣＳでは、最も蛍光性である０．５～１．０％の細胞３ｘ１０５～５ｘ１０５個が、その後の３０℃で２４時間の培養のためにＳＤＤ－Ｌｅｕ－培地中へ選別された。全ての試料について、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。データはＦｌｏｗＪｏ ｖＸ．０．７を用いて解析した。
【0096】
放射性リガンド結合アッセイ。
全酵母細胞に対するＲＬＢＡを以下のとおりに実施した：まず、（ＯＤ６００＝１．０が１０７細胞／ｍＬに相当すると仮定して）１ｘ１０８個の細胞を、発現後に採集し、最初にｄｄＨ２Ｏ中、その後にＳＰＨ１緩衝液（１Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中、最後に１Ｍのソルビトール中で、連続的に洗浄することによって処理した。次に、細胞をＳＰＨ２緩衝液（１Ｍのソルビトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ５．８）中に再び懸濁させ、６Ｕ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ（ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加によって細胞壁消化を実施し、その後に３０℃で３０分間培養した。それ以降は細胞を４℃に保った。続いて細胞を、［３Ｈ］標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２０ｎＭの［３，１１－チロシル－３，５－３Ｈ（Ｎ）］－ニューロテンシン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；Ｎ
Ｋ１Ｒ変異体：１５ｎＭの［ロイシル－３，４，５－３Ｈ（Ｎ）］－Ｐ物質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；ＫＯＲ１変異体：１５ｎＭの［１５，１６－３Ｈ］－ジプレノルフィン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を含有するｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で２時間、４℃で培養した。非特異的結合は、１０００倍過剰の非標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２０μＭのニューロテンシン（８－１３）（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＮＫ１Ｒ変異体：１５μＭのＰ物質（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＫＯＲ１変異体：１５μＭのジプレノルフィン（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））の存在下で測定した。培養後に細胞を、真空マニホールドの備わったＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、冷やしたｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌでフィルターを４回洗浄し、Ｉｓｏｐｌａｔｅ－９６シンチレーションプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）へ移し、６５℃で２時間乾燥させ、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加した。ＲＬＢＡ測定は、１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｐｌｕｓ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で実施した。
全酵母細胞に対するＲＬＢＡを以下のとおりに実施した：まず、（ＯＤ６００＝１．０が１０７細胞／ｍＬに相当すると仮定して）１ｘ１０８個の細胞を、発現後に採集し、最初にｄｄＨ２Ｏ中、その後にＳＰＨ１緩衝液（１Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０）中、最後に１Ｍのソルビトール中で、連続的に洗浄することによって処理した。次に、細胞をＳＰＨ２緩衝液（１Ｍのソルビトール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、ｐＨ５．８）中に再び懸濁させ、６Ｕ／ｍＬのＺｙｍｏｌｙａｓｅ ２０Ｔ（ＡＭＳ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の添加によって細胞壁消化を実施し、その後に３０℃で３０分間培養した。それ以降は細胞を４℃に保った。続いて細胞を、［３Ｈ］標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２０ｎＭの［３，１１－チロシル－３，５－３Ｈ（Ｎ）］－ニューロテンシン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；Ｎ
Ｋ１Ｒ変異体：１５ｎＭの［ロイシル－３，４，５－３Ｈ（Ｎ）］－Ｐ物質（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）；ＫＯＲ１変異体：１５ｎＭの［１５，１６－３Ｈ］－ジプレノルフィン（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））を含有するｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ中で２時間、４℃で培養した。非特異的結合は、１０００倍過剰の非標識リガンド（ＮＴＲ１変異体：２０μＭのニューロテンシン（８－１３）（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＮＫ１Ｒ変異体：１５μＭのＰ物質（ＡｎａＳｐｅｃ）；ＫＯＲ１変異体：１５μＭのジプレノルフィン（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））の存在下で測定した。培養後に細胞を、真空マニホールドの備わったＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタープレート（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、冷やしたｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌでフィルターを４回洗浄し、Ｉｓｏｐｌａｔｅ－９６シンチレーションプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）へ移し、６５℃で２時間乾燥させ、Ｏｐｔｉｐｈａｓｅ Ｓｕｐｅｒｍｉｘシンチレーションカクテル（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を添加した。ＲＬＢＡ測定は、１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ Ｐｌｕｓ液体シンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で実施した。
【0097】
全Ｓｆ９細胞に対するＲＬＢＡは、先に記載したとおりに行った（Ｓｃｈｌｉｎｋｍａｎｎら（２０１２）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２２：４１４－４２８；Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １１１：Ｅ６５５－６２）。全細胞を、１５ｎＭの［３Ｈ］標識リガンドを含有する結合用緩衝液（ｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡおよび４０μｇ／ｍＬのバシトラシン）中で培養した。非特異的結合は、１５μＭの非標識リガンドの存在下で測定した。酵母細胞についてのＲＬＢＡの場合と同じリガンドを使用した。
【0098】
定量的ウェスタンブロット。
発現後、各試料について（ＯＤ６００＝１．０が１０７細胞／ｍＬに相当すると仮定して）４ｘ１０７個の細胞を遠心分離し、全細胞タンパク質を、先に公開されたプロトコル（Ｚｈａｎｇら（２０１１）、Ｙｅａｓｔ ２８：７９５－７９８）に従って抽出した。タンパク質検出は、ウサギ抗ＨＡ一次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ６９０８）およびマウス抗アクチン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２２４）、ならびにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０と結合したヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ－２１０７６）およびＩＲＤｙｅ８００と結合したロバ抗マウス二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、６１０－７３２－１２４）を使用して実施した。画像取得はＯｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、定量はＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅバージョン３．１．４（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。さらなる詳細については以下を参照されたい。
発現後、各試料について（ＯＤ６００＝１．０が１０７細胞／ｍＬに相当すると仮定して）４ｘ１０７個の細胞を遠心分離し、全細胞タンパク質を、先に公開されたプロトコル（Ｚｈａｎｇら（２０１１）、Ｙｅａｓｔ ２８：７９５－７９８）に従って抽出した。タンパク質検出は、ウサギ抗ＨＡ一次抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ６９０８）およびマウス抗アクチン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２２４）、ならびにＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０と結合したヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ－２１０７６）およびＩＲＤｙｅ８００と結合したロバ抗マウス二次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、６１０－７３２－１２４）を使用して実施した。画像取得はＯｄｙｓｓｅｙシステム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施し、定量はＩｍａｇｅ Ｓｔｕｄｉｏ Ｌｉｔｅバージョン３．１．４（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施した。さらなる詳細については以下を参照されたい。
【0099】
酵母の全細胞タンパク質抽出、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
全細胞タンパク質抽出のために、発現後の試料を遠心分離し、培地を吸引し、ペレット化させた細胞を氷上での５分間の培養のために２Ｍの酢酸リチウム５００μＬ中に再び懸濁させた。次に、細胞をペレット化し、上清を除去し、０．４ＭのＮａＯＨ１００μＬを添加し、試料を氷上で５分間培養した。培養後、試料を遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを２００μＬの還元用ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再び懸濁させた。試料を２０℃で１５分間培養し、遠心分離し、５μＬの各試料をＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニング用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に流した。ウェットブロッティングをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に行った。メンブレンのブロッキングは、ＰＢＳ中の１ｘのカゼインブロッキング用緩衝液（Ｓｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で２０分間、室温で実施した。抗体結合は、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）中の１ｘのカゼインブロッキング用緩衝液中で１時間、室温で実施し、ＰＢＳＴを全てのメンブレン洗浄ステップのために使用した。ウサギ抗ＨＡ一次抗体は１：５，０００に希釈して使用し、マウス抗アクチン一次抗体は１：１，０００に希釈して使用し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０と結合したヤギ抗ウサギ、およびＩＲＤｙｅ８００と結合したロバ抗マウス）はどちらも１：１０，０００に希釈して使用した。
全細胞タンパク質抽出のために、発現後の試料を遠心分離し、培地を吸引し、ペレット化させた細胞を氷上での５分間の培養のために２Ｍの酢酸リチウム５００μＬ中に再び懸濁させた。次に、細胞をペレット化し、上清を除去し、０．４ＭのＮａＯＨ１００μＬを添加し、試料を氷上で５分間培養した。培養後、試料を遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを２００μＬの還元用ＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳ試料用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再び懸濁させた。試料を２０℃で１５分間培養し、遠心分離し、５μＬの各試料をＮｕＰＡＧＥ ＭＥＳ ＳＤＳランニング用緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ ４－１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に流した。ウェットブロッティングをＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬメンブレン（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に行った。メンブレンのブロッキングは、ＰＢＳ中の１ｘのカゼインブロッキング用緩衝液（Ｓｉ
ｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で２０分間、室温で実施した。抗体結合は、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０）中の１ｘのカゼインブロッキング用緩衝液中で１時間、室温で実施し、ＰＢＳＴを全てのメンブレン洗浄ステップのために使用した。ウサギ抗ＨＡ一次抗体は１：５，０００に希釈して使用し、マウス抗アクチン一次抗体は１：１，０００に希釈して使用し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０と結合したヤギ抗ウサギ、およびＩＲＤｙｅ８００と結合したロバ抗マウス）はどちらも１：１０，０００に希釈して使用した。
【0100】
共焦点蛍光顕微鏡検査。
酵母細胞を透過化し、蛍光ニューロテンシンの結合を上記のとおりに実施した。洗浄後、細胞をＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩカバーグラスチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、共焦点顕微鏡検査をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。全ての試料について、倍率を６３０倍とし、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。
酵母細胞を透過化し、蛍光ニューロテンシンの結合を上記のとおりに実施した。洗浄後、細胞をＮｕｎｃ Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩカバーグラスチャンバー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に移し、共焦点顕微鏡検査をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）で実施した。全ての試料について、倍率を６３０倍とし、比較分析を可能にするために同一の取得設定を用いた。
【0101】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）ベクターおよび発現。
野生型および進化した受容体構築物を、酵母発現ベクターｐＭＳ０３ｈｅｔからのＰＣＲによって増幅させ、ＳＬＩＣによって、改変されたＭｕｌｔｉＢａｃ ｐＦＬベクターにクローニングした。ｐＦＬ＿ｍＦＬＡＧ＿Ｈｉｓ１０＿ＴＥＶ＿ＳＬＩＣと名付けられたベクターは、Ｎ末端メリチンシグナル配列に続いてＦＬＡＧタグ、デカヒスチジンタグ、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位およびＳＬＩＣクローニング部位を有する発現カセットを含んでいる。大腸菌ＤＨ１０ ＥＭＢａｃＹ細胞を、様々な受容体遺伝子を含むｐＦＬベクターで形質転換し、結果として得られたバキュロウイルスゲノムを単離した。組換えバキュロウイルスおよびバキュロウイルス感染昆虫細胞ストック（ＢＩＩＣ）の生成の詳細については以下を参照されたい。発現は、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１００倍希釈のＢＩＩＣストックを使用して密度３ｘ１０６細胞／ｍＬでＳｆ９細胞を感染させ、２７℃で４日間の培養することにより、実施した。発現後、遠心分離によって細胞を採集し、冷やしたＰＢＳで洗浄し、使用するときまで－８０℃で保存した。
野生型および進化した受容体構築物を、酵母発現ベクターｐＭＳ０３ｈｅｔからのＰＣＲによって増幅させ、ＳＬＩＣによって、改変されたＭｕｌｔｉＢａｃ ｐＦＬベクターにクローニングした。ｐＦＬ＿ｍＦＬＡＧ＿Ｈｉｓ１０＿ＴＥＶ＿ＳＬＩＣと名付けられたベクターは、Ｎ末端メリチンシグナル配列に続いてＦＬＡＧタグ、デカヒスチジンタグ、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位およびＳＬＩＣクローニング部位を有する発現カセットを含んでいる。大腸菌ＤＨ１０ ＥＭＢａｃＹ細胞を、様々な受容体遺伝子を含むｐＦＬベクターで形質転換し、結果として得られたバキュロウイルスゲノムを単離した。組換えバキュロウイルスおよびバキュロウイルス感染昆虫細胞ストック（ＢＩＩＣ）の生成の詳細については以下を参照されたい。発現は、Ｓｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、１００倍希釈のＢＩＩＣストックを使用して密度３ｘ１０６細胞／ｍＬでＳｆ９細胞を感染させ、２７℃で４日間の培養することにより、実施した。発現後、遠心分離によって細胞を採集し、冷やしたＰＢＳで洗浄し、使用するときまで－８０℃で保存した。
【0102】
組換えバキュロウイルスおよびバキュロウイルス感染昆虫細胞ストック（ＢＩＩＣ）の生成。
組換えバキュロウイルスは、８μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２ｍＬのＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で８×１０５個のＳｆ９細胞を遺伝子導入することによって生成させた。加湿インキュベーターで２７℃で４時間培養した後、遺伝子導入培地を除去し、２ｍＬの新鮮なＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭと交換した。Ｖ０ウイルスストックを、２７℃で５日間の後に採集し、Ｖ１高力価ウイルスストック（１ｍＬあたり１０８～１０９個のウイルス粒子）を生成させるために使用した。その後、Ｖ１ウイルスストックを使用してＢＩＩＣを生成させた。簡潔に述べると、密度１０６細胞／ｍＬのＳｆ９細胞を感染多重度（ＭＯＩ）５で感染させ、懸濁液中で２４時間培養し、採集し、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯとを含有するＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ中で一定分量ごとに－８０℃で凍結させた。
組換えバキュロウイルスは、８μＬのＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎ ＩＩ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２ｍＬのＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で８×１０５個のＳｆ９細胞を遺伝子導入することによって生成させた。加湿インキュベーターで２７℃で４時間培養した後、遺伝子導入培地を除去し、２ｍＬの新鮮なＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭと交換した。Ｖ０ウイルスストックを、２７℃で５日間の後に採集し、Ｖ１高力価ウイルスストック（１ｍＬあたり１０８～１０９個のウイルス粒子）を生成させるために使用した。その後、Ｖ１ウイルスストックを使用してＢＩＩＣを生成させた。簡潔に述べると、密度１０６細胞／ｍＬのＳｆ９細胞を感染多重度（ＭＯＩ）５で感染させ、懸濁液中で２４時間培養し、採集し、ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯとを含有するＳｆ－９００ＩＩ ＳＦＭ中で一定分量ごとに－８０℃で凍結させた。
【0103】
［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合アッセイ。
［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合アッセイに使用する膜は、先に記載（Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １１１：Ｅ６５５－６２）したとおりに単離した。簡潔に述べると、細胞を浸透圧衝撃の後にせん断力によって破壊した。非特異的な［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合を軽減するために、膜を尿素含有緩衝液中で洗浄した。単離した膜を一定分量ごとに凍結させて－８０℃で保存した。尿素洗浄済の膜
上の受容体レベルを、上記の放射性リガンド結合アッセイによって測定した。
［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合アッセイに使用する膜は、先に記載（Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １１１：Ｅ６５５－６２）したとおりに単離した。簡潔に述べると、細胞を浸透圧衝撃の後にせん断力によって破壊した。非特異的な［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合を軽減するために、膜を尿素含有緩衝液中で洗浄した。単離した膜を一定分量ごとに凍結させて－８０℃で保存した。尿素洗浄済の膜
上の受容体レベルを、上記の放射性リガンド結合アッセイによって測定した。
【0104】
［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合アッセイを、先に記載（Ｅｇｌｏｆｆら（２０１４）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １１１：Ｅ６５５－６２）したとおりに実施した。簡潔に述べると、アッセイ用緩衝液（ｐＨ７．４（４℃で）の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．３％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、２μＭのＧＤＰ、４ｎＭの［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ））中、１ｎＭの、尿素洗浄済の膜中のＧＰＣＲと、１００ｎＭのＧタンパク質（Ｇαｉ１β１γ１、（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎら（２０１１）、Ｎａｔｕｒｅ ４７７：５４９－５５５）に従って精製）を、２５℃で２０分間、２００μＭのＰ物質（ＡｎａＳｐｅｃ）の存在下または非存在下で保温した。緩衝液、ＧＰＣＲおよびＧタンパク質のみから生じるバックグラウンド計数を考慮し、差し引いた。したがって、与えられた計数は、作動薬の存在下および非存在下でのＧタンパク質に対するＧＰＣＲ誘導［３５Ｓ］－ＧＴＰγＳ結合を表す。
【0105】
ＮＫ１Ｒ変異体ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９の精製
全てのステップは４℃で行った。凍結したＳｆ９細胞を解凍し、低張緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠（Ｒｏｃｈｅ）、１μＭのＰ物質）中で１時間膨潤させた。その後、細胞膜を、ホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー）によって破壊し、１３０，０００ｒｃｆで遠心分離によって採集した。単離した膜を、ホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー）と低張緩衝液中での遠心分離との反復によって広範に２回洗浄し、その後にこの手順を、高張緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠、１μＭのＰ物質）を使用して３回繰り返した。精製した膜を溶解用緩衝液（ｐＨ７．４の３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠、１μＭのＰ物質、２ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ））中に再び懸濁させ、４５分間撹拌した。その後、１．５％（ｗ／ｖ）のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ、Ａｎａｔｒａｃｅ）および０．３％（ｗ／ｖ）のヘミこはく酸コレステリル（ＣＨＳ、Ｓｉｇｍａ）に膜を溶かした。３時間の撹拌後、溶けなかった材料を遠心分離（１３０，０００ｒｃｆ、４０分間、４℃）によって除去した。上清を、終濃度で８００ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのイミダゾールを含有するように調節し、その後、１．５ｍＬのＴＡＬＯＮ
Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に一晩保温した。タンパク質結合樹脂を重力流カラム内に移し、その後、各々１０カラムボリューム（ＣＶ）の、洗浄１緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、８００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．３％／０．０６％のＤＤＭ／ＣＨＳ）と、洗浄２緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ、１０ｍＭのＡＴＰ）と、洗浄３緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ）とで洗浄した。ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９を４ＣＶの溶出用緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ）中で溶出させた。精製した受容体を、分子量カットオフ１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で０．５ｍＬまで濃縮した。ＳＥＣ緩衝液（ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％／０．０１％のＤＤＭ／ＣＨＳ、０．１μＭのＰ物質）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／
３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡｅｋｔａ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。
全てのステップは４℃で行った。凍結したＳｆ９細胞を解凍し、低張緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠（Ｒｏｃｈｅ）、１μＭのＰ物質）中で１時間膨潤させた。その後、細胞膜を、ホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー）によって破壊し、１３０，０００ｒｃｆで遠心分離によって採集した。単離した膜を、ホモジナイゼーション（Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー）と低張緩衝液中での遠心分離との反復によって広範に２回洗浄し、その後にこの手順を、高張緩衝液（ｐＨ７．４の１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠、１μＭのＰ物質）を使用して３回繰り返した。精製した膜を溶解用緩衝液（ｐＨ７．４の３０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、ｃＯｍｐｌｅｔｅ ＵＬＴＲＡ ＥＤＴＡ不含錠、１μＭのＰ物質、２ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ））中に再び懸濁させ、４５分間撹拌した。その後、１．５％（ｗ／ｖ）のｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（ＤＤＭ、Ａｎａｔｒａｃｅ）および０．３％（ｗ／ｖ）のヘミこはく酸コレステリル（ＣＨＳ、Ｓｉｇｍａ）に膜を溶かした。３時間の撹拌後、溶けなかった材料を遠心分離（１３０，０００ｒｃｆ、４０分間、４℃）によって除去した。上清を、終濃度で８００ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのイミダゾールを含有するように調節し、その後、１．５ｍＬのＴＡＬＯＮ
Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と共に一晩保温した。タンパク質結合樹脂を重力流カラム内に移し、その後、各々１０カラムボリューム（ＣＶ）の、洗浄１緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、８００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．３％／０．０６％のＤＤＭ／ＣＨＳ）と、洗浄２緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、４００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４０ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ、１０ｍＭのＡＴＰ）と、洗浄３緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ）とで洗浄した。ＮＫ１Ｒ－Ｙ０９を４ＣＶの溶出用緩衝液（ｐＨ７．４の２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのイミダゾール、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．５μＭのＰ物質、０．２％／０．０４％のＤＤＭ／ＣＨＳ）中で溶出させた。精製した受容体を、分子量カットオフ１００ｋＤａのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で０．５ｍＬまで濃縮した。ＳＥＣ緩衝液（ｐＨ７．４の２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％／０．０１％のＤＤＭ／ＣＨＳ、０．１μＭのＰ物質）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／
３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を備えたＡｅｋｔａ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施した。
【0106】
実施例２：酵母におけるＧＰＣＲの指向性進化
大腸菌における発現レベルの向上に向けたＧＰＣＲの指向性進化は、以前に確立されている（Ｓａｒｋａｒら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０５：１４８０８－１４８１３；ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８：５９９－６１５）。本発明は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける指向性進化のための類似の方法を開示する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいていくつかのＧＰＣＲをこの方法で進化させており、酵母および昆虫細胞における高い機能的発現につながり、大腸菌に基づく系において進化させた変異体から得られ発現レベルを凌駕した。通常は、高度に発現された変異体を得るのにたった２回の進化を必要とした。
大腸菌における発現レベルの向上に向けたＧＰＣＲの指向性進化は、以前に確立されている（Ｓａｒｋａｒら（２００８）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ 米国 １０５：１４８０８－１４８１３；ＤｏｄｅｖｓｋｉおよびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（２０１１）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０８：５９９－６１５）。本発明は、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける指向性進化のための類似の方法を開示する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいていくつかのＧＰＣＲをこの方法で進化させており、酵母および昆虫細胞における高い機能的発現につながり、大腸菌に基づく系において進化させた変異体から得られ発現レベルを凌駕した。通常は、高度に発現された変異体を得るのにたった２回の進化を必要とした。
【0107】
興味深いことに、使用した酵母菌株を、ＧＰＣＲ産生の増加に向けて適応させることもできる。これは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による反復的な選別による進化の間に自動的に誘導され、選択の過程で徐々に生じる。したがって、選択されたライブラリーについて得られる発現レベルは、宿主適応と合わさったＧＰＣＲ進化の結果である。個々のＧＰＣＲ変異体を新規形質転換酵母細胞において発現させる場合、平均発現レベルは選択されたライブラリーの場合よりも低くなる、というのも、これらの細胞は適応していないからである。しかしながら、反復的なＦＡＣＳ選択を単に行うことにより、いかなる進化した変異体に対しても適応を誘導することができる。
【0108】
ＧＰＣＲ発現構築物
異なるいくつかのＧＰＣＲ発現構築物が入手可能である。全てのベクターはｐ４１５ ＧＡＬ１に由来するものである。ベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ロイシンに対して栄養要求性である株の選択的増殖のための機能性ＬＥＵ２遺伝子を提供しながら低コピープラスミドとして維持され、また、形質転換後に酵母から簡単に再単離されることができる。それらは、シャトルベクターであるために、大腸菌において高コピーベクターとして増えることができ、それに対応して全てのクローニングステップが行われる。
異なるいくつかのＧＰＣＲ発現構築物が入手可能である。全てのベクターはｐ４１５ ＧＡＬ１に由来するものである。ベクターは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、ロイシンに対して栄養要求性である株の選択的増殖のための機能性ＬＥＵ２遺伝子を提供しながら低コピープラスミドとして維持され、また、形質転換後に酵母から簡単に再単離されることができる。それらは、シャトルベクターであるために、大腸菌において高コピーベクターとして増えることができ、それに対応して全てのクローニングステップが行われる。
【0109】
各ベクターは、ＧＰＣＲ遺伝子の挿入のためにクローニング部位に先行するα接合因子プレプロ配列をコードする。クローニングは、ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を介して行われて、対象遺伝子のインフレーム挿入を可能にする。発現は、誘導性ＧＡＬ１プロモーターの制御下にある。様々なベクターはクローニング部位の後の配列が異なっている。進化のために使用する標準ベクターｐＭＳ０３ｈｅｔは、クローニング部位の後にタグまたはタンパク質を少しもコードしておらず、そのためｐＭＳ０３ｈｅｔではいかなる融合も有さないＧＰＣＲが産生される。他のベクターは、Ｃ末端切断可能なデカヒスチジンタグ（ｐＭＳ０３ｈｅｔ＿３ＣＨｉｓ１０）、ＨＡタグ（ｐＭＳ０３ｈｅｔ ＨＡ）、ｍＣｈｅｒｒｙへの融合（ｐＭＳ０３ｈｅｔ＿ｍＣｈ）、またはＡｖｉＴａｇ（商標）（ｐＭＳ０３ｈｅｔ＿Ａｖｉ）を含んだ構築物をコードする。
【0110】
リガンド結合のための酵母細胞の透過化
この節では、リガンド結合実験のための酵母細胞の透過化について説明する。ＴＥＬｉ緩衝液およびＤＴＴによる調節によって細胞壁が透過化され、細胞膜中のＧＰＣＲへのリガンドの拡散が可能になる。この透過化方法の利点は、細胞が生きたまま保たれ、かつスフェロプラストほど脆弱ではない点である。したがって、この手順は、分析のためのフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ、ならびにリガンド結合を検出するその他のいかなる用
途（例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査、ＲＬＢＡ）にも使用することができる。
この節では、リガンド結合実験のための酵母細胞の透過化について説明する。ＴＥＬｉ緩衝液およびＤＴＴによる調節によって細胞壁が透過化され、細胞膜中のＧＰＣＲへのリガンドの拡散が可能になる。この透過化方法の利点は、細胞が生きたまま保たれ、かつスフェロプラストほど脆弱ではない点である。したがって、この手順は、分析のためのフローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ、ならびにリガンド結合を検出するその他のいかなる用
途（例えば、共焦点蛍光顕微鏡検査、ＲＬＢＡ）にも使用することができる。
【0111】
プロトコル：
・発現後に細胞を遠心分離（５，０００ｒｃｆ、１０分間、室温）によって採集し、上清を吸引する。
・細胞を室温で１ｍＬのＴＥＬｉ緩衝液中に再び懸濁させ、遠心分離し（４，０００ｒｃｆ、３分間、室温）、上清を吸引する。
・細胞を室温で９００μＬのＴＥＬｉ緩衝液中に再び懸濁させ、新しく調製されフィルター滅菌された（１００ｍＭの酢酸リチウム溶液中に溶かした）０．５ＭのＤＴＴを１００μＬ添加する。これにより、５０ｍＭのＤＴＴの終濃度が得られる。
・細胞をサーモミキサー内で７００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で３０分間培養する。
・細胞を遠心分離し（４，０００ｒｃｆ、３分間、４℃）、上清を吸引する。
・これより細胞は常に氷上に保たれなければならない。
・冷やした１ｍＬのＴＥＬｉ緩衝液中に細胞を再び懸濁させ、遠心分離（４，０００ｒｃｆ、３分間、４℃）し、上清を吸引する。
・冷やしたＴＥＬｉ緩衝液中に細胞を再び懸濁させる（体積は実験上の必要性に応じて選択する）。
・発現後に細胞を遠心分離（５，０００ｒｃｆ、１０分間、室温）によって採集し、上清を吸引する。
・細胞を室温で１ｍＬのＴＥＬｉ緩衝液中に再び懸濁させ、遠心分離し（４，０００ｒｃｆ、３分間、室温）、上清を吸引する。
・細胞を室温で９００μＬのＴＥＬｉ緩衝液中に再び懸濁させ、新しく調製されフィルター滅菌された（１００ｍＭの酢酸リチウム溶液中に溶かした）０．５ＭのＤＴＴを１００μＬ添加する。これにより、５０ｍＭのＤＴＴの終濃度が得られる。
・細胞をサーモミキサー内で７００ｒｐｍで振盪しながら２０℃で３０分間培養する。
・細胞を遠心分離し（４，０００ｒｃｆ、３分間、４℃）、上清を吸引する。
・これより細胞は常に氷上に保たれなければならない。
・冷やした１ｍＬのＴＥＬｉ緩衝液中に細胞を再び懸濁させ、遠心分離（４，０００ｒｃｆ、３分間、４℃）し、上清を吸引する。
・冷やしたＴＥＬｉ緩衝液中に細胞を再び懸濁させる（体積は実験上の必要性に応じて選択する）。
【0112】
フローサイトメトリーによるＧＰＣＲ発現の測定
細胞表面における機能的ＧＰＣＲ発現の検出は、原則的に、フローサイトメトリーで測定する蛍光リガンド結合によって実施することができる。蛍光リガンドと共に培養すると、原形質膜中に位置する機能的に発現されたＧＰＣＲのみがリガンドに結合することになる。未結合リガンドを洗浄によって除去した後、蛍光強度を測定することによってリガンド結合を検出する。ところが酵母細胞壁は、保護障壁として働いて、ペプチドリガンドのようなより大きな分子を通過させない。そのため、蛍光リガンドと共に培養する前に酵母細胞を透過化させる必要がある。機能的発現レベルの分析的定量化に次いで、蛍光リガンド結合をＦＡＣＳによる選択のためにも用いる。高発現表現型を有する変異体を発現している細胞は、対応してより高い蛍光強度を呈することになる。最も蛍光性である細胞を選別することにより、高度に発現しているＧＰＣＲ変異体を単離することができる。
細胞表面における機能的ＧＰＣＲ発現の検出は、原則的に、フローサイトメトリーで測定する蛍光リガンド結合によって実施することができる。蛍光リガンドと共に培養すると、原形質膜中に位置する機能的に発現されたＧＰＣＲのみがリガンドに結合することになる。未結合リガンドを洗浄によって除去した後、蛍光強度を測定することによってリガンド結合を検出する。ところが酵母細胞壁は、保護障壁として働いて、ペプチドリガンドのようなより大きな分子を通過させない。そのため、蛍光リガンドと共に培養する前に酵母細胞を透過化させる必要がある。機能的発現レベルの分析的定量化に次いで、蛍光リガンド結合をＦＡＣＳによる選択のためにも用いる。高発現表現型を有する変異体を発現している細胞は、対応してより高い蛍光強度を呈することになる。最も蛍光性である細胞を選別することにより、高度に発現しているＧＰＣＲ変異体を単離することができる。
【0113】
蛍光リガンドと共に培養することによって全シグナルの測定が可能になるが、非特異的シグナルを決定することも同様に重要である。これは、競合結合実験において蛍光リガンドを過剰の非標識リガンドと共に保温することによって行うことができる。そのような測定において得られた非特異的シグナルはバックグラウンドを表す。通常、酵母におけるＧＰＣＲ発現は、細胞の２つの亜集団をもたらす。一部の細胞は活性ＧＰＣＲの表面発現を示すが、他方で、活性な表面発現が認められない亜集団も認められる。典型的には、この非発現細胞の割合は適応株において減少する。
【0114】
ＦＡＣＳによる選択のワークフロー
選択のワークフローの概要を図１に示す。ＧＰＣＲの指向性進化のために、選択はライブラリーの生成から始める。ＧＰＣＲ遺伝子に対するエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）を用いるランダム突然変異誘発によって、新規なＤＮＡライブラリーが作出される。ＤＮＡライブラリーは、高効率形質転換に適したインサートを生成する特別なプライマーを使用するＰＣＲ（ａｍｐＰＣＲ）によって増幅されなければならない。ひとたび酵母ライブラリーが所望の効率で形質転換によって作出されれば、ＦＡＣＳによる選択を実施することができる。典型的にはＦＡＣＳを５回実施する。ひとたびＦＡＣＳによる選択が完了すれば、選択されたクローンのＤＮＡが単離される。このステップでは、選択されたクローンを分析することができる。所望により、選択されたクローンからｅｐＰＣＲおよびその後のＦＡＣＳによる選択によって新しいライブラリーを作出することによって、別の指
向性進化を実施することができる。事前のＧＰＣＲの指向性進化では、高度に増加した発現レベルを得るために２回の進化―２回のランダム化とその各々に続くＦＡＣＳによる５回の選択という意味で―が必要であった。
選択のワークフローの概要を図１に示す。ＧＰＣＲの指向性進化のために、選択はライブラリーの生成から始める。ＧＰＣＲ遺伝子に対するエラープローンＰＣＲ（ｅｐＰＣＲ）を用いるランダム突然変異誘発によって、新規なＤＮＡライブラリーが作出される。ＤＮＡライブラリーは、高効率形質転換に適したインサートを生成する特別なプライマーを使用するＰＣＲ（ａｍｐＰＣＲ）によって増幅されなければならない。ひとたび酵母ライブラリーが所望の効率で形質転換によって作出されれば、ＦＡＣＳによる選択を実施することができる。典型的にはＦＡＣＳを５回実施する。ひとたびＦＡＣＳによる選択が完了すれば、選択されたクローンのＤＮＡが単離される。このステップでは、選択されたクローンを分析することができる。所望により、選択されたクローンからｅｐＰＣＲおよびその後のＦＡＣＳによる選択によって新しいライブラリーを作出することによって、別の指
向性進化を実施することができる。事前のＧＰＣＲの指向性進化では、高度に増加した発現レベルを得るために２回の進化―２回のランダム化とその各々に続くＦＡＣＳによる５回の選択という意味で―が必要であった。
【0115】
進化したＧＰＣＲ変異体を発現している株の適応のためのワークフローはほぼ同一である。唯一の違いは、ライブラリーを作製する必要がないことである。株の適応は、ＦＡＣＳによる５回の選択に供せられる選択されたＧＰＣＲ変異体を発現している単一のクローンから始める。選択後、適応株のグリセロールストックを調製することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】