(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-28
(45)【発行日】2022-04-05
(54)【発明の名称】一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6844 20180101AFI20220329BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20220329BHJP
C12Q 1/70 20060101ALI20220329BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20220329BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6844 Z ZNA
C12Q1/6888 Z
C12Q1/70
C12N15/09 Z
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2021510480
(86)(22)【出願日】2021-02-24
(86)【国際出願番号】 JP2021006907
(87)【国際公開番号】W WO2021172370
(87)【国際公開日】2021-09-02
【審査請求日】2021-02-25
(31)【優先権主張番号】P 2020031780
(32)【優先日】2020-02-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000120456
【氏名又は名称】栄研化学株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100128381
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 義憲
(74)【代理人】
【識別番号】100126653
【弁理士】
【氏名又は名称】木元 克輔
(72)【発明者】
【氏名】山本 満智子
(72)【発明者】
【氏名】横野 航太
(72)【発明者】
【氏名】仙波 晶平
(72)【発明者】
【氏名】道行 悟
【審査官】田村 直寛
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０６２２２２９８（ＣＮ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０３０７４４４５（ＣＮ，Ａ）
【文献】CHEN, Lei et al.，A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus.，Virologica Sinica，2010年，Vol. 25, No. 1，pp. 59-64
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／６８４４
Ｃ１２Ｑ １／６８８８
Ｃ１２Ｑ １／７０
Ｃ１２Ｎ １５／０９
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃは、それぞれ領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３に相補的であり、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
【請求項2】
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスであり、標的ＲＮＡが、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
標的ＲＮＡに相補的な核酸が、３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
各前記さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスであり、標的ＲＮＡが、３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
標的ＲＮＡに相補的な核酸が、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
各前記さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
プライマーセットが、（ｖｉ）領域Ｆ１ｃと領域Ｆ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＦ、及び
（ｖｉｉ）領域Ｂ１ｃと領域Ｂ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＢ
をさらに含み、ただし、ループプライマーＦ及びループプライマーＢの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
（ｖ）の１以上のさらなるアウタープライマーの融解温度が３０～５５℃である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
プライマーセットが（ｖ）のさらなるアウタープライマーを一つ含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
逆転写ループ媒介等温増幅反応の増幅産物を検出する工程をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
一本鎖ＲＮＡウイルスを検出するためのキットであって、プライマーセットを含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃは、それぞれ領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３に相補的であり、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ウイルスは細胞に寄生する生物であり、ウイルスを単独で培養することはできないため、ウイルス感染症の診断において原因ウイルスを短時間で特定する方法としては、主に遺伝子診断が利用される。ウイルスの遺伝子診断では、検出対象であるウイルスに固有の核酸配列を核酸増幅反応により増幅して検出する。
【0003】
核酸増幅法の一種として、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））法が知られる（特許文献１）。かかる方法では、標的核酸の６つの領域（Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃ、又は、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３）に基づいて２種類のインナープライマー（ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー）と２種類のアウタープライマー（Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー）を設計し、これらのプライマーを用いて一定温度で標的核酸を増幅する。また、ＬＡＭＰ法においては、上記インナープライマーとアウタープライマーに加えて、２種類のループプライマー（ループプライマーＦ及びループプライマーＢ）を用いることにより、増幅反応の効率が向上することが知られている（特許文献２）。
【0004】
ウイルスは、ゲノムの核酸の種類によって、二本鎖ＤＮＡウイルス、一本鎖ＲＮＡウイルス等に分類される。一本鎖ＲＮＡウイルスは、遺伝子が５’末端から３’末端の方向に読み取られる＋鎖（プラス鎖）ウイルスと、遺伝子が相補鎖を介して３’末端から５’末端の方向に読み取られる－鎖（マイナス鎖）ウイルスに分けられる。ＲＮＡウイルスの核酸を増幅する場合には、増幅反応の開始時に、逆転写酵素を使用して鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する逆転写反応が必要になる。逆転写反応と組み合わせたＬＡＭＰ法は、逆転写ループ媒介等温増幅（ＲＴ－ＬＡＭＰ）法と呼ばれる（例えば、特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】国際公開第００／２８０８２号
【文献】国際公開第０２／２４９０２号
【文献】国際公開第２０１８／０４２５９８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
特許文献１～３に記載されたＬＡＭＰ法によれば、比較的高い感度でウイルスを検出することができるものの、ウイルス性疾患の中には重篤な症状をもたらす疾患が多く存在するため、それら疾患の原因となるウイルスをより確実に検出する方法が求められていた。そこで本発明は、一本鎖ＲＮＡウイルスを高感度で検出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、鋭意検討した結果、従来の６種類のプライマーに加えて特定のさらなるアウタープライマーを用いてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行うことで、一本鎖ＲＮＡウイルスをより高感度で検出することができることを見いだし、本発明を完成させた。本発明者らの新たな知見によれば、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡに相補的な核酸の３’末端側の領域にアニールするアウタープライマーを追加しても検出の感度が向上しないのに対し、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの３’末端側の領域にアニールするアウタープライマーを追加すると、検出の感度が向上する。
【0008】
本発明は、以下の［１］～［８］に関する。
［１］
試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［２］
試料中のプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備える標的ＲＮＡの塩基配列と、
３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備える、標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［３］
試料中のマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備える標的ＲＮＡの塩基配列と、
５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備える、標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［４］
プライマーセットが、
（ｖｉ）領域Ｆ１ｃと領域Ｆ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＦ、及び
（ｖｉｉ）領域Ｂ１ｃと領域Ｂ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＢ
をさらに含み、ただし、ループプライマーＦ及びループプライマーＢの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
（ｖ）の１以上のさらなるアウタープライマーの融解温度が３０～５５℃である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
プライマーセットが（ｖ）のさらなるアウタープライマーを一つ含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
逆転写ループ媒介等温増幅反応の増幅産物を検出する工程をさらに含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
一本鎖ＲＮＡウイルスを検出するためのキットであって、
プライマーセットを含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、キット。
［１］
試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［２］
試料中のプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備える標的ＲＮＡの塩基配列と、
３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備える、標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［３］
試料中のマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であって、
プライマーセットを試料に接触させて、逆転写ループ媒介等温増幅反応を行う工程を含み、
プライマーセットは、
３’末端から５’末端の方向に任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備える標的ＲＮＡの塩基配列と、
５’末端から３’末端の方向に任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備える、標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、方法。
［４］
プライマーセットが、
（ｖｉ）領域Ｆ１ｃと領域Ｆ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＦ、及び
（ｖｉｉ）領域Ｂ１ｃと領域Ｂ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有するループプライマーＢ
をさらに含み、ただし、ループプライマーＦ及びループプライマーＢの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
（ｖ）の１以上のさらなるアウタープライマーの融解温度が３０～５５℃である、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
プライマーセットが（ｖ）のさらなるアウタープライマーを一つ含む、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
逆転写ループ媒介等温増幅反応の増幅産物を検出する工程をさらに含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
一本鎖ＲＮＡウイルスを検出するためのキットであって、
プライマーセットを含み、
プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計され、
一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、
一本鎖ＲＮＡウイルスがマイナス鎖型一本鎖ＲＮＡウイルスの場合、標的ＲＮＡは、３’末端から５’末端の方向に、任意の領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３をこの順に備え、標的ＲＮＡに相補的な核酸は、５’末端から３’末端の方向に、任意の領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ３ｃをこの順に備え、
プライマーセットは、以下の（ｉ）～（ｖ）：
（ｉ）領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＦＩＰプライマー、
（ｉｉ）領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する、ＢＩＰプライマー、
（ｉｉｉ）領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＦ３プライマー、
（ｉｖ）領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する、アウタープライマーであるＢ３プライマー、及び
（ｖ）１以上のさらなるアウタープライマーであって、各さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３又は領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する、アウタープライマー
を含み、ただし、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上のさらなるアウタープライマーの塩基配列に存在し得るウラシルはチミンに置換されていてもよい、キット。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、一本鎖ＲＮＡウイルスを高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明の一形態に係る、試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法は、ＲＴ－ＬＡＭＰ法による核酸増幅を検出して、試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法であり、プライマーセットとして、従来のプライマー（すなわち、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、並びに、任意でループプライマーＦ及びループプライマーＢ）に加えて、標的ＲＮＡの３’末端側の領域にアニールする１以上のさらなるアウタープライマーを用いることを特徴とする。より具体的には、本発明の一形態に係る、試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法は、プライマーセットを試料に接触させてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行う工程を含み、プライマーセットは、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及び１以上の後述するさらなるアウタープライマーを含み、任意でループプライマーＦ及びループプライマーＢを含む。
【0012】
検出する一本鎖ＲＮＡウイルスは、プラス鎖型一本鎖ＲＮＡ（（＋）ｓｓＲＮＡ）ウイルスであっても、マイナス鎖型一本鎖ＲＮＡ（（－）ｓｓＲＮＡ）ウイルスであってもよい。（＋）ｓｓＲＮＡウイルスは特に限定されず、例えば、デングウイルス３型（ＤＥＮＶ３）等デングウイルス、風疹ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノロウイルス、チクングニアウイルス、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、コロナウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はＡ型肝炎ウイルスであってよい。（－）ｓｓＲＮＡウイルスは特に限定されず、例えば、インフルエンザウイルス、センダイウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス又は狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）であってよい。
【0013】
試料は、一本鎖ＲＮＡウイルスの感染が疑われる対象から採取された試料であってよく、例えば、喀痰、体液、糞便、又は組織であってよい。体液は、例えば、鼻汁、唾液、血液、血清、血漿、髄液、尿、精液、又は羊水であってよい。また、試料は、気管支肺胞洗浄液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、又はうがい液であってもよい。あるいは、試料は、感染実験等の実験に用いられた細胞又はその培養液であってもよい。試料は、上記試料に、分離、抽出、濃縮、精製等の前処理を行ったものであってもよい。
【0014】
標的ＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡウイルスが有する一本鎖ＲＮＡの全体又は一部であってよい。標的ＲＮＡの長さは特に限定されず、例えば、２００～３００００塩基、２００～１０００塩基、又は２００～５５０塩基であってよい。
【0015】
本明細書において、用語「ＦＩＰプライマー」、「ＢＩＰプライマー」、「Ｆ３プライマー」、「Ｂ３プライマー」、「ループプライマーＦ」及び「ループプライマーＢ」は、従来のＬＡＭＰ法におけるこれらの用語と同義であり、当業者により理解される用語である。いいかえれば、後述するさらなるアウタープライマー以外のプライマーは、当業者が公知の文献等の開示に基づいて適宜設計することができる。
【0016】
以下、図１及び図２を参照しながら、本形態に係る方法におけるプライマーセットについて説明する。プライマーセットは、一本鎖ＲＮＡウイルスの標的ＲＮＡの塩基配列と、該標的ＲＮＡに相補的な核酸の塩基配列と、に基づいて設計される。標的ＲＮＡ及び該標的ＲＮＡに相補的な核酸のうち、そのままタンパク質合成の鋳型となり得る塩基配列を有する鎖においては、プライマー設計の基となる任意の領域は、５’末端側から３’末端側の順に、領域Ｆ４、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、及びＢ４ｃと呼ばれる。一方、そのままではタンパク質合成の鋳型となり得ない塩基配列を有する鎖においては、プライマー設計の基となる任意の領域は、３’末端側から５’末端側の順に、領域Ｆ４ｃ、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ４と呼ばれる。領域Ｆ４、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、及びＢ４ｃの塩基配列は、それぞれ領域Ｆ４ｃ、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ４に相補的である。したがって、検出する一本鎖ＲＮＡウイルスが（＋）ｓｓＲＮＡウイルスの場合、図１に示すように、領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ、及びＢ４ｃは、標的ＲＮＡの５’末端から３’末端の方向にこの順で存在する任意の領域であり、領域Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、及びＢ４は、標的ＲＮＡに相補的な核酸の３’末端から５’末端の方向にこの順で存在する任意の領域である。一方、検出する一本鎖ＲＮＡウイルスが（－）ｓｓＲＮＡウイルスの場合、図２に示すように、領域Ｆ４、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃは、標的ＲＮＡに相補的な核酸の５’末端から３’末端の方向にこの順で存在する任意の領域であり、領域Ｆ４ｃ、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、及びＢ３は、標的ＲＮＡの３’末端から５’末端の方向にこの順で存在する任意の領域である。なお、図１及び２では標的ＲＮＡに相補的な核酸としてｃＤＮＡが記載されているが、標的ＲＮＡに相補的な核酸はＤＮＡに限定されず、ＲＮＡであってもよい。
【0017】
本明細書において、用語「相補的」は必ずしも完全に相補的であることを意味しない。例えば、「ある塩基配列に相補的な塩基配列」の範囲には、ある塩基配列を有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の塩基配列が含まれる。ストリンジェントな条件は、特に限定されないが、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＬ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハーツ溶液、及び１０％デキストラン硫酸であってよい。
【0018】
本明細書において、用語「同じ」は必ずしも完全に同じであることを意味しない。例えば、「ある塩基配列と同じ塩基配列」の範囲には、ある塩基配列に相補的な塩基配列に相補的な塩基配列が含まれる。
【0019】
当業者に理解されるように、インナープライマーであるＦＩＰプライマーは、領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｆ２と同じ塩基配列を３’末端に有する。ただし、領域Ｆ１ｃ又は領域Ｆ２にウラシルが存在する場合、ＦＩＰプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。領域Ｆ１ｃと同じ塩基配列と、領域Ｆ２と同じ塩基配列との間には、リンカーとなる１以上のヌクレオチドが存在しても存在しなくてもよい。リンカーとなるヌクレオチドは、１～５００塩基、１～１００塩基、又は１０～７０塩基であってよい。
【0020】
当業者に理解されるように、インナープライマーであるＢＩＰプライマーは、領域Ｂ１ｃと同じ塩基配列を５’末端に有し、領域Ｂ２と同じ塩基配列を３’末端に有する。ただし、領域Ｂ１ｃ又は領域Ｂ２にウラシルが存在する場合、ＢＩＰプライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。
【0021】
当業者に理解されるように、アウタープライマーであるＦ３プライマーは、領域Ｆ３と同じ塩基配列を有する。ただし、領域Ｆ３にウラシルが存在する場合、Ｆ３プライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。
【0022】
当業者に理解されるように、アウタープライマーであるＢ３プライマーは、領域Ｂ３と同じ塩基配列を有する。ただし、領域Ｂ３にウラシルが存在する場合、Ｂ３プライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。
【0023】
当業者に理解されるように、ループプライマーＦは、領域Ｆ１ｃと領域Ｆ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有する。ただし、領域Ｆ１ｃと領域Ｆ２ｃとの間の任意の領域にウラシルが存在する場合、ループプライマーＦにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。
【0024】
当業者に理解されるように、ループプライマーＢは、領域Ｂ１ｃと領域Ｂ２ｃとの間の任意の領域と同じ塩基配列を有する。ただし、領域Ｂ１ｃと領域Ｂ２ｃとの間の任意の領域にウラシルが存在する場合、ループプライマーＢにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。
【0025】
上述の通り、当業者は、標的ＲＮＡの増幅に適当なＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３プライマー、ループプライマーＦ、及びループプライマーＢを適宜設計できる。いいかえれば、当業者は、標的ＲＮＡにおいて、領域Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、及びＢ３ｃとして適当な領域を適宜選択することができる。各領域の長さ（塩基数）は、例えば、５塩基以上、１０塩基以上、５～２００塩基、１０～２５塩基、１０～２０塩基、又は１７～２５塩基であってよい。各領域の融解温度（Ｔｍ）は、例えば、５５～６５℃、６０～６５℃、又は５５～６０℃であってよい。本明細書におけるＴｍ値は、Ｎｅａｒｅｓｔ－Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法（反応液中のナトリウムイオン濃度：５０ｍＭ、マグネシウムイオン濃度：４ｍＭ、オリゴ核酸濃度：０．１μＭ）により算出した値である。各領域のＣＧ含量は、例えば、４０～６０％、４０～５０％、又は５０～６０％であってよい。領域Ｆ１ｃ及びＢ１ｃの５’末端から６塩基の自由エネルギー変化（ｄＧ）は、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であってよい。また、領域Ｆ２、Ｂ２、Ｆ３、及びＢ３、並びにループプライマーＦ又はＢの設計の基となる領域の３’末端から６塩基のｄＧも、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であってよい。各プライマーは、極端な二次構造を形成しない塩基配列を有することが好ましい。また、プライマーダイマーの生成を防ぐ観点から、各プライマーの３’末端は、自己の３’末端と又は他のプライマーの３’末端と相補的な塩基配列を有さないことが好ましい。
【0026】
領域Ｆ２の５’末端から領域Ｂ２ｃの３’末端までの距離は、例えば１２０～１８０塩基であってよい。領域Ｆ２と領域Ｆ３との間、及び領域Ｂ２ｃと領域Ｂ３ｃとの間の距離は、例えば、０～２０塩基であってよい。領域Ｆ２の５’末端から領域Ｆ１の５’末端までの距離、及び領域Ｂ２の５’末端から領域Ｂ１の５’末端までの距離は、例えば４０～６０塩基であってよい。領域Ｆ１から領域Ｂ１ｃの間の距離は特に限定されず、領域Ｆ１の３’末端と領域Ｂ１ｃの５’末端とは、直接結合していてもよい。
【0027】
検出する一本鎖ＲＮＡウイルスが（＋）ｓｓＲＮＡウイルスの場合、上記さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する。ただし、かかる領域にウラシルが存在する場合、上記さらなるアウタープライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。図１では、Ｂ４プライマーが上記さらなるアウタープライマーであり、Ｂ４プライマーは、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡにおける領域Ｂ３よりも５’末端側に存在する任意の領域Ｂ４と同じ塩基配列を有する。
【0028】
検出する一本鎖ＲＮＡウイルスが（－）ｓｓＲＮＡウイルスの場合、上記さらなるアウタープライマーは、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域と同じ塩基配列を有する。ただし、かかる領域にウラシルが存在する場合、上記さらなるアウタープライマーにおける対応するウラシルは、チミンに置き換えられてもよい。図２では、Ｆ４プライマーが上記さらなるアウタープライマーであり、Ｆ４プライマーは、標的ＲＮＡに相補的なｃＤＮＡにおける領域Ｆ３よりも５’末端側に存在する任意の領域Ｆ４と同じ塩基配列を有する。
【0029】
上記さらなるアウタープライマーのＴｍ値は、例えば、３０～５５℃、３３～５０℃、又は３５～４５℃であってよい。さらなるアウタープライマーの長さは特に限定されず、例えば、１０～１８塩基、１１～１６塩基、又は１２～１４塩基であってよい。さらなるアウタープライマーのＣＧ含量は、例えば、３０～７０％、３４～６５％、又は３８～５４％であってよい。さらなるアウタープライマーの３’末端から６塩基のｄＧは、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下であってよい。さらなるアウタープライマーは、極端な二次構造を形成しない塩基配列を有することが好ましい。また、プライマーダイマーの生成を防ぐ観点から、さらなるアウタープライマーの３’末端は、自己の３’末端と又は他のプライマーの３’末端と相補的な塩基配列を有さないことが好ましい。
【0030】
上記さらなるアウタープライマーの設計の基となる上記任意の領域（すなわち、図１においては領域Ｂ４であり、図２においては領域Ｆ４である。）の位置は、その領域の一部又は全部が、標的ＲＮＡに相補的な核酸において領域Ｂ３（（＋）ｓｓＲＮＡウイルスの場合）又は領域Ｆ３（（－）ｓｓＲＮＡウイルスの場合）よりも５’末端側に存在すれば特に限定されず、領域Ｂ３又は領域Ｆ３からの距離は特に限定されない。領域Ｂ３又は領域Ｆ３の５’末端からさらなるアウタープライマーの設計の基となる上記任意の領域の３’末端までの距離は、例えば、－４～５０塩基、－３～３５塩基、又は－２～２１塩基であってよい。ここで、アウタープライマーの設計の基となる上記任意の領域と領域Ｂ３又は領域Ｆ３が部分的に重なっている場合、領域Ｂ３又は領域Ｆ３の５’末端からさらなるアウタープライマーの設計の基となる上記任意の領域の３’末端までの距離は、負の値で表す。
【0031】
上記さらなるアウタープライマーは、図１ではＢ４プライマーのみであり、図２ではＦ４プライマーのみであるが、さらなるアウタープライマーの数は限定されず、プライマーセットには複数のさらなるアウタープライマーが含まれてよい。より高い検出感度を実現する観点から、プライマーセットに含まれるさらなるアウタープライマーは一つであることが好ましい。
【0032】
試料には、上記プライマーセットとともに、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）等、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行うための公知の試薬を接触させることができる。
【0033】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素であれば特に限定されず、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、又はこれらの組合せであってよい。
【0034】
逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を有する酵素であれば特に限定されず、例えば、天然の又は組み換えトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する天然の又組み換え逆転写酵素であってよい。ＭＭＬＶに由来する逆転写酵素としては、例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素、及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素、（いずれもサーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、並びにＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ（登録商標）（東洋紡株式会社製）が挙げられる。ＡＭＶに由来する逆転写酵素としては、例えばＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が挙げられる。逆転写酵素の他の具体例としては、ＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素及びＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写酵素（どちらもキアゲン社製）が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしてＢｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ等、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有する酵素を用いる場合、別途の逆転写酵素を用いなくてもよい。
【0035】
ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行うためのその他の公知の試薬としては、例えば、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液又は塩、並びにジチオトレイトール（ＤＴＴ）等の酵素又は鋳型を安定化する保護剤が挙げられる。
【0036】
試料には、上記プライマーセットとともに、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物を検出するための標識プローブ又は蛍光性インターカレーターを接触させることもできる。標識プローブは、例えば蛍光標識プローブであってよく、蛍光標識プローブは、例えば後述する蛍光消光プローブであってよい。
【0037】
プライマーセットを試料に接触させてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行う工程は、例えば、試料とプライマーセットとを含む反応液をインキュベートすることによって行うことができる。
【0038】
反応液は、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行うための上述の公知の試薬、並びに上述の標識プローブ又は蛍光性インターカレーターを含んでよい。インキュベーションの時間（すなわち、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の反応時間）は、標的ＲＮＡ及びプライマーセットによるが、通常６０分以下である。インキュベーションの温度（すなわち、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の反応温度）は、通常６５℃以下である。
【0039】
反応溶液中の各インナープライマーの濃度は、例えば０．８～２．４μＭであってよい。反応溶液中の各アウタープライマーの濃度は、例えば０．１～０．３μＭであってよい。反応溶液中の各ループプライマーの濃度は、例えば０．４～１．２μＭであってよい。ＦＩＰプライマーの濃度は、例えば、Ｆ３プライマーの濃度の８倍以上及び／又はループプライマーＦの濃度の１～４倍であってよい。ＢＩＰプライマーの濃度は、例えば、Ｂ３プライマーの濃度の８倍以上、及び／又はループプライマーＢの濃度の１～４倍であってよい。
【0040】
一実施形態において、試料中の一本鎖ＲＮＡウイルスを検出する方法は、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物を検出する工程をさらに含んでよい。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物が検出された場合、試料中に一本鎖ＲＮＡウイルスが存在すると判定することができる。増幅産物の検出は、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応終了後に行ってもよく、反応中にリアルタイムで行ってもよい。
【0041】
増幅産物を検出する方法は特に限定されず、公知の技術を利用できる。増幅産物は、例えば、標識プローブを用いることにより、蛍光性インターカレーターを用いることにより、又は反応液に対して電気泳動を行うことにより、検出することができる。あるいは、反応液中にマグネシウムイオンが含まれる場合、反応液の濁度を測定することで増幅産物を検出することもできる。マグネシウムイオンは核酸合成の副産物であるピロリン酸イオンと反応して白色のピロリン酸マグネシウムを生じる。
【0042】
標識プローブとしては、例えば蛍光消光プローブ（ＱｕｅｎｃｈｉｎｇＰｒｏｂｅ：ＱＰｒｏｂｅ（登録商標））等の蛍光標識プローブを用いることができる。蛍光消光プローブから発せられる蛍光は標的核酸とハイブリダイズしたときに消光するため、蛍光の減少を測定することで増幅産物を定量又は検出できる。蛍光消光プローブに用いることのできる蛍光標識としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、パシフィックブルー（登録商標）、及びフルオレセイン－４－イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が挙げられる。
【0043】
蛍光性インターカレーターとしては、例えば、ＳＹＴＯ（登録商標）６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等、公知の蛍光性インターカレーターを用いることができる。
【0044】
本発明の別の一形態は、上記プライマーセットを含む、一本鎖ＲＮＡウイルスを検出するためのキットである。かかるキットは、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、緩衝液、塩、保護剤等、ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行うための上記公知の試薬さらに含んでよい。また、かかるキットは、上述の標識プローブ又は蛍光性インターカレーターをさらに含んでもよい。
【実施例】
【0045】
［試験例１］（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（ＤＥＮＶ３）の検出
＜参考例１＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＦ及びループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（１００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．０４μＭ ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）。
＜参考例１＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＦ及びループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（１００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．０４μＭ ＱＰｒｏｂｅ（登録商標）。
【0046】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーＦ、ループプライマーＢ、及びＱＰｒｏｂｅとしては、それぞれ表１に示すＤＥＮＶ３＿ＦＩＰｖ４、ＤＥＮＶ３＿ＢＩＰｖ６、ＤＥＮＶ３＿Ｆ３、ＤＥＮＶ３＿Ｂ３ａ、ＤＥＮＶ３＿ＬＦ、ＤＥＮＶ３＿ＬＢｖ１、及びＤＥＮＶ３＿Ｑｐを用いた。鋳型ＲＮＡ（配列番号１）は、ＤＥＮＶ３ Ｃａｐｓｉｄ遺伝子からＲＴ－ＰＣＲにより作製したｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、該プラスミドＤＮＡからＲＮＡを転写及び精製することにより作製した。転写には、Ｓｃｒｉｐｔ Ｍａｘ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡株式会社製、コード番号：ＴＳＫ－１０１）を用い、ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、カタログ番号：Ｎｏ．７４１０４）を用いた。ＱＰｒｏｂｅの５’末端はＢＯＤＩＰＹで標識し、３’末端はリン酸化した。
【0047】
【表1】
【0048】
リアルタイム定量ＰＣＲシステムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、６３℃で６０分ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。また、Ｂ３プライマーの濃度を２～４倍上げて、同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物は、ＱＰｒｏｂｅの消光をリアルタイムで検出することにより検出した。結果を表２に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表２に併せて示す。
【0049】
【表2】
【0050】
本明細書中の表において、ＳＤは標準偏差を意味し、ＣＶは変動係数を意味し、ＮＣはネガティブコントロールを意味し、Ｎ．Ｄ．は不検出を意味する。本試験例においては、ＱＰｒｏｂｅの消光が３０分以内に検出されなかった場合を不検出と判定した。表２に示すように、Ｂ３プライマーの濃度の増加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0051】
＜実施例１＞
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＢ４プライマーを追加した以外は参考例１と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝２）。Ｂ４プライマーとしては、表３に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表４に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表４に併せて示す。
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＢ４プライマーを追加した以外は参考例１と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝２）。Ｂ４プライマーとしては、表３に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表４に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表４に併せて示す。
【0052】
【表3】
【0053】
【表4】
【0054】
表４に示すように、Ｂ４プライマーを追加することで鋳型ＲＮＡの検出感度が向上した。
【0055】
＜実施例２＞
測定回数を増やして（Ｎ＝６）実施例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。Ｂ４プライマーとしてはＢ３－ｍ２７を用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表５に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表５に併せて示す。
測定回数を増やして（Ｎ＝６）実施例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。Ｂ４プライマーとしてはＢ３－ｍ２７を用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表５に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表５に併せて示す。
【0056】
【表5】
【0057】
表５に示すように、測定回数を増やしても、Ｂ４プライマーの追加による検出感度の向上が認められた。
【0058】
＜比較例１＞
Ｂ４プライマーの代わりに表６に示すＦ４プライマーを用いて、実施例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表７に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表７に併せて示す。
Ｂ４プライマーの代わりに表６に示すＦ４プライマーを用いて、実施例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表７に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表７に併せて示す。
【0059】
【表6】
【0060】
【表7】
【0061】
表７に示すように、Ｆ４プライマーの追加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0062】
［試験例２］（－）ｓｓＲＮＡウイルス（Ｈ５Ｎ１）の検出
＜参考例２＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＦ及びループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（２００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．１μＭ ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
＜参考例２＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＦ及びループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（２００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．１μＭ ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
【0063】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーＦ、及びループプライマーＢとしては、それぞれ表８に示すＨ５Ｎ１－ＦＩＰ、Ｈ５Ｎ１－ＢＩＰ、Ｈ５Ｎ１－Ｆ３ｖ７、Ｈ５Ｎ１－Ｂ３、Ｈ５Ｎ１－ＬＦ、及びＨ５Ｎ１－ＬＢを用いた。鋳型ＲＮＡ（配列番号２７）は、Ｈ５型トリインフルエンザウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔ Ｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ８１８１３５）のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子の一部からＲＴ－ＰＣＲにより作製したｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、該プラスミドＤＮＡからＲＮＡを転写及び精製することにより作製した。転写には、Ｓｃｒｉｐｔ Ｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（東洋紡株式会社製、コード番号：ＴＳＫ－１０１）を用い、ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、カタログ番号：Ｎｏ．７４１０４）を用いた。
【0064】
【表8】
【0065】
リアルタイム定量ＰＣＲシステムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、６３℃で６０分ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。また、Ｆ３プライマーの濃度を２～４倍上げて、同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物は、インターカレーター（ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ）の蛍光をリアルタイムで検出することにより検出した。結果を表９に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表９に併せて示す。
【0066】
【表9】
【0067】
本試験例においては、インターカレーターの蛍光が３０分以内に検出されなかった場合を不検出と判定した。表９に示すように、Ｆ３プライマーの濃度の増加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0068】
＜実施例３＞
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＦ４プライマーを追加した以外は参考例２と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｆ４プライマーとしては、表１０に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表１１に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１１に併せて示す。
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＦ４プライマーを追加した以外は参考例２と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｆ４プライマーとしては、表１０に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表１１に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１１に併せて示す。
【0069】
【表10】
【0070】
【表11】
【0071】
表１１に示すように、Ｆ４プライマーを追加することで鋳型ＲＮＡの検出感度が向上した。
【0072】
＜比較例２＞
Ｆ４プライマーの代わりに表１２に示すＢ４プライマーを用いて、実施例３と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表１３に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１３に併せて示す。
Ｆ４プライマーの代わりに表１２に示すＢ４プライマーを用いて、実施例３と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表１３に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１３に併せて示す。
【0073】
【表12】
【0074】
【表13】
【0075】
表１３に示すように、Ｂ４プライマーの追加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0076】
［試験例３］（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（ＺＩＫＶ）の検出
＜参考例３＞
鋳型ＲＮＡとプライマーセットを次のように変更した以外は、試験例１の参考例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーＦ、ループプライマーＢ、及びＱＰｒｏｂｅとしては、それぞれ表１４に示すＺＩＫＶ ＦＩＰ、ＺＩＫＶ ＢＩＰ、ＺＩＫＶ Ｆ３、ＺＩＫＶ Ｂ３、ＺＩＫＶ ＬＦ、ＺＩＫＶ ＬＢ、及びＺＩＫＶ Ｑｐを用いた。鋳型ＲＮＡ（配列番号４１）は、ＺＩＫＶのＮＳ５遺伝子からＲＴ－ＰＣＲにより作製したｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、該プラスミドＤＮＡからＲＮＡを転写及び精製することにより作製した。転写には、Ｓｃｒｉｐｔ Ｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。ＱＰｒｏｂｅの３’末端はＢＯＤＩＰＹで標識した。結果を表１５に示す。
＜参考例３＞
鋳型ＲＮＡとプライマーセットを次のように変更した以外は、試験例１の参考例１と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、ループプライマーＦ、ループプライマーＢ、及びＱＰｒｏｂｅとしては、それぞれ表１４に示すＺＩＫＶ ＦＩＰ、ＺＩＫＶ ＢＩＰ、ＺＩＫＶ Ｆ３、ＺＩＫＶ Ｂ３、ＺＩＫＶ ＬＦ、ＺＩＫＶ ＬＢ、及びＺＩＫＶ Ｑｐを用いた。鋳型ＲＮＡ（配列番号４１）は、ＺＩＫＶのＮＳ５遺伝子からＲＴ－ＰＣＲにより作製したｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、該プラスミドＤＮＡからＲＮＡを転写及び精製することにより作製した。転写には、Ｓｃｒｉｐｔ Ｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。ＱＰｒｏｂｅの３’末端はＢＯＤＩＰＹで標識した。結果を表１５に示す。
【0077】
【表14】
【0078】
【表15】
【0079】
表１５に示すように、Ｂ３プライマーの濃度の増加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0080】
＜実施例４＞
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＢ４プライマーを追加した以外は参考例３と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｂ４プライマーとしては、表１６に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表１７に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１７に併せて示す。
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＢ４プライマーを追加した以外は参考例３と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｂ４プライマーとしては、表１６に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表１７に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１７に併せて示す。
【0081】
【表16】
【0082】
【表17】
【0083】
表１７に示すように、Ｂ４プライマーを追加することで鋳型ＲＮＡの検出感度が向上した。
【0084】
＜比較例３＞
Ｂ４プライマーの代わりに表１８に示すＦ４プライマーを用いて、実施例４と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表１９に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１９に併せて示す。
Ｂ４プライマーの代わりに表１８に示すＦ４プライマーを用いて、実施例４と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表１９に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１００００コピーに上げた場合の検出結果を表１９に併せて示す。
【0085】
【表18】
【0086】
【表19】
【0087】
表１９に示すように、Ｆ４プライマーの追加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0088】
［試験例４］（－）ｓｓＲＮＡウイルス（ＲＡＢＶ）の検出
＜参考例４＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（１００００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．１μＭ ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
＜参考例４＞
０．２ｍＬの試薬チューブに、次の組成を有する反応液２５μＬを調製した：
２０ｍＭ トリシン（ｐＨ８．６）、
３０ｍＭ ＫＣｌ、
８ｍＭ ＭｇＳＯ４、
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ、
０．５％ Ｔｗｅｅｎ２０、
１．６ｍＭ ＤＴＴ、
１．６μＭ ＦＩＰプライマー及びＢＩＰプライマー、
０．２μＭ Ｆ３プライマー及びＢ３プライマー、
０．８μＭ ループプライマーＢ、
ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ １．０Ｕ（２０Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ社製）、
Ｂｓｔ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２２．８Ｕ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、
ＲＮａｓｅ阻害剤（４０Ｕ／μＬ、プロメガ社製）１μＬ、
鋳型ＲＮＡ（１００００コピー）５μＬ、
ＰＰａｓｅ ２０ｍＵ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、及び
０．１μＭ ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）。
【0089】
ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、Ｂ３プライマー、及びループプライマーＢとしては、それぞれ表２０に示すＲＡＢＶ１－ＦＩＰ、ＲＡＢＶ１－ＢＩＰ、ＲＡＢＶ１－Ｆ３、ＲＡＢＶ１－Ｂ３、及びＲＡＢＶ１－ＬＢを用いた。これらのプライマーは、Bazartseren B., S. Inoue, A. Yamada, et al (2009): Rapid Detection of Rabies Virus by Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification. Jpn. J. Infect. Dis., 62, 187-191, 2009に開示されている。鋳型ＲＮＡ（配列番号５４）は、ＲＡＢＶのＮ遺伝子からＲＴ－ＰＣＲにより作製したｃＤＮＡをプラスミドに組み込み、該プラスミドＤＮＡからＲＮＡを転写及び精製することにより作製した。転写には、Ｓｃｒｉｐｔ Ｍａｘ Ｔｈｅｒｍｏ Ｔ７ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを用い、ＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを用いた。
【0090】
【表20】
【0091】
リアルタイム定量ＰＣＲシステムＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ９６を用いて、６３℃で６０分ＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。また、Ｆ３プライマーの濃度を２～４倍上げて、同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。ＲＴ－ＬＡＭＰ反応の増幅産物は、インターカレーター（ＳＹＴＯ ６３ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔａｉｎ）の蛍光をリアルタイムで検出することにより検出した。結果を表２１に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１×１０６コピーに上げた場合の検出結果を表２１に併せて示す。
【0092】
【表21】
【0093】
本試験例においては、インターカレーターの蛍光が３０分以内に検出されなかった場合を不検出と判定した。表２１に示すように、Ｆ３プライマーの濃度の増加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【0094】
＜実施例５＞
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＦ４プライマーを追加した以外は参考例４と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｆ４プライマーとしては、表２２に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表２３に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１×１０６コピーに上げた場合の検出結果を表２３に併せて示す。
反応溶液に終濃度で０．２μＭのＦ４プライマーを追加した以外は参考例４と同様にしてＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った（Ｎ＝６）。Ｆ４プライマーとしては、表２２に示すプライマーを用いた。比較のため、同様の反応をＦ４プライマーなしでも行った。結果を表２３に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１×１０６コピーに上げた場合の検出結果を表２３に併せて示す。
【0095】
【表22】
【0096】
【表23】
【0097】
表２３に示すように、Ｆ４プライマーを追加することで鋳型ＲＮＡの検出感度が向上した。
【0098】
＜比較例４＞
Ｆ４プライマーの代わりに表２４に示すＢ４プライマーを用いて、実施例５と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表２５に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１×１０６に上げた場合の検出結果を表２５に併せて示す。
Ｆ４プライマーの代わりに表２４に示すＢ４プライマーを用いて、実施例５と同様のＲＴ－ＬＡＭＰ反応を行った。比較のため、同様の反応をＢ４プライマーなしでも行った。結果を表２５に示す。また、参考までに、鋳型ＲＮＡの量を１×１０６に上げた場合の検出結果を表２５に併せて示す。
【0099】
【表24】
【0100】
【表25】
【0101】
表２５に示すように、Ｂ４プライマーの追加によっては、鋳型ＲＮＡの検出感度は向上しなかった。
【図1】
【図2】
【配列表】