特許 7049262 結合組織成長因子を標的とするＲＮＡ複合体を用いた特発性肺胞線維症の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-29

(45)【発行日】2022-04-06

(54)【発明の名称】結合組織成長因子を標的とするＲＮＡ複合体を用いた特発性肺胞線維症の治療

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220330BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20220330BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220330BHJP

   A61K 9/72 20060101ALI20220330BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 120Z

A61K31/713 ZNA

A61P43/00 111

A61P11/00

A61K45/00

A61K48/00

A61K9/72

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2018553128

(86)(22)【出願日】2017-04-10

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-05-30

(86)【国際出願番号】 IB2017000470

(87)【国際公開番号】W WO2017178883

(87)【国際公開日】2017-10-19

【審査請求日】2020-04-10

(31)【優先権主張番号】62/320,944

(32)【優先日】2016-04-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】518028055

【氏名又は名称】オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】リー，ドン，キ

(72)【発明者】

【氏名】ホン，スン，ウー

(72)【発明者】

【氏名】リー，テ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】リー，セ－ロ－オーム

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジ，ヒュン

(72)【発明者】

【氏名】ナ，ユ，ラン

(72)【発明者】

【氏名】キム，ヨン－ドン

【審査官】池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１５－５１８７２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２０１３－０９４０７１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖、及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有するセンス鎖を含むＲＮＡ複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の５'末端及び前記センス鎖の３'末端が平滑末端を形成する複合体を形成し、
前記センス鎖が配列番号２９のヌクレオチド配列からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号３０のヌクレオチド配列からなる、前記ＲＮＡ複合体。

【請求項2】

前記ＲＮＡ複合体が、細胞によるＣＴＧＦ発現を阻害することができ、かつ前記細胞は上皮細胞、肺胞細胞、Ａ５４９細胞、ＨａＣａＴ細胞、又はＨｓ６８細胞であってよい、請求項１に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項3】

前記ＲＮＡ複合体が化学修飾を含む、請求項１に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項4】

前記化学修飾が、２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合又は疎水性部分である、請求項３に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項5】

前記ＲＮＡ複合体が疎水性部分を含み、前記疎水性部分はコレステロール部分であってもよく、前記コレステロール部分は、前記センス鎖の３'末端に結合していてもよい、請求項４に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項6】

前記ＲＮＡ複合体が２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含み、
前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖上に位置し、及び／又は
前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記アンチセンス鎖の３'末端に位置し、及び／又は
前記アンチセンス鎖の前記３'末端領域が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含み、及び／又は
前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖上；及び前記アンチセンス鎖の前記３'末端に位置し、及び／又は
前記センス鎖が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含み、前記アンチセンス鎖の３'末端領域が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、
請求項３～５のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項7】

前記ＲＮＡ複合体が少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、請求項６に記載のＲＮＡ複合体であって、
前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも５％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも１０％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも１５％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも２０％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも５％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも１０％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも１５％がホスホロチオエート結合であってもよい、又は
前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも２０％がホスホロチオエート結合であってもよい、
請求項６に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項8】

前記修飾ＲＮＡ複合体は、

【化1】

のヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を有し、ここで前記ヌクレオチド配列中のｍは２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを表し、アスタリスク（＊）はホスホロチオエート結合を表す、請求項３に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項9】

前記修飾ＲＮＡ複合体は、

【化2】

のヌクレオチド配列を有するセンス鎖を有し、ここで前記ヌクレオチド配列中のｍは２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを表し、アスタリスク（＊）はホスホロチオエート結合を表し、ｃｈｏｌはコレステロールトリエチレングリコールを表す、請求項３に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項10】

前記ＲＮＡ複合体が、送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過することができる、請求項８又は９に記載のＲＮＡ複合体。

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に記載のＲＮＡ複合体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項12】

特発性肺線維症の治療用の、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

前記ＲＮＡ複合体を、特発性肺線維症の治療用の第２の薬剤とともに使用し、その第２の薬剤が増殖因子阻害剤であってもよい、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

細胞によるＣＴＧＦ発現を阻害するための、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記ＲＮＡ複合体が気道に投与される、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記ＲＮＡ複合体が非経口的、静脈内、又は吸入により投与される、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１１日出願の米国仮特許出願第６２／３２０，９４４号の優先権の利益を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

背景技術
特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺組織の重篤かつ進行性の瘢痕（線維症）を特徴とする。多くの人々は診断後約３～５年しか生きられず、死亡は主に呼吸不全によるものである。米国及び欧州連合の患者約７万人がＩＰＦに苦しんでいる。肺移植以外の有効な治癒は存在せず、１％未満の患者が肺移植の対象となる。したがって、効果的に患者の肺線維症を阻害し、または低減することができる新規で臨床的に有効なＩＰＦ治療薬の重要な必要性が、依然として残っている。

【0003】

ＩＰＦの病因にはいくつかの増殖因子が関与している。これらの増殖因子のうち結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、複数の細胞型の筋線維芽細胞への形質転換に関与しているようであり、重要な抗線維化及び再生促進修復因子を損なう。ＣＴＧＦレベルは、ＩＰＦ患者の血漿、経気管支生検標本及び気管支肺胞洗浄液中で上昇する。

【0004】

したがって、ＣＴＧＦを標的とした特発性肺線維症の治療のための新規かつ改善された治療薬が必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

発明の概要
特定の態様では、本明細書は、ＣＴＧＦを標的とし、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の治療及び／または予防に有用であるＲＮＡ複合体を提供する。特定の態様では、本明細書は、そのようなＲＮＡ複合体を含む医薬組成物、及びそのようなＲＮＡ複合体及び医薬組成物を使用する方法を提供する。

【0006】

特定の態様では、本明細書は、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖及びアンチセンス鎖に対する配列相補性を有するセンス鎖を含むＲＮＡ複合体を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、細胞（例えば、肺胞細胞、上皮細胞、Ｈｓ６８、ＨａＣａＴ、またはＡ５４９細胞）におけるＣＴＧＦ発現を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、非対称短鎖干渉ＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、細胞膜透過非対称短鎖干渉ＲＮＡ（ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、表１、表２、表３、または表６に列挙されるＲＮＡ複合体である。

【0007】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡ複合体は化学修飾を含み、この修飾は、送達ビヒクルの非存在下での細胞膜の透過を促進する。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡ複合体は、疎水性部分を含む。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、疎水特性を有する任意の化学構造であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、疎水性部分は、脂質、親油性ペプチド及び／または親油性タンパク質である。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、コレステロール、トコフェロールまたは１０個以上の炭素原子を有する長鎖脂肪酸（例えば、ステアリン酸またはパルミチン酸）などの脂質である。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、表２、表３、または表６に列挙される修飾ＲＮＡ複合体である。特定の実施形態では、ＲＮＡ複合体は細胞毒性ではない。

【0008】

特定の態様では、本明細書は、記載のＲＮＡ複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口、静脈内、または経口送達用に製剤化する。他の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化する。

【0009】

特定の態様では、本明細書は、細胞（例えば、肺胞細胞、上皮細胞、Ｈｓ６８、ＨａＣａＴ、またはＡ５４９細胞）におけるＣＴＧＦ発現を阻害する方法であって、この細胞を本明細書に記載のＲＮＡ複合体と接触させることを含む、方法を提供する。

【0010】

特定の態様では、本明細書は、ヒト対象におけるＣＴＧＦ遺伝子発現を阻害する方法であって、本明細書で提供するＲＮＡ複合体または医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を記載する。特定の態様では、本明細書は、ＩＰＦのヒト対象を治療する方法であって、本明細書に記載のＲＮＡ複合体または医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明は以下の態様も提供する。
［１］ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に対する配列相補性を有する、少なくとも１９ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのアンチセンス鎖、及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する、１５～１７ｎｔの長さのセンス鎖を含むＲＮＡ複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の５'末端及び前記センス鎖の３'末端が平滑末端を形成する複合体を形成する、前記ＲＮＡ複合体。
［２］前記アンチセンス鎖が１９～２１ｎｔの長さである、上記［１］のＲＮＡ複合体。
［３］前記アンチセンス鎖が１９ｎｔの長さである、上記［１］に記載のＲＮＡ複合体。
［４］前記アンチセンス鎖が２０ｎｔの長さである、上記［１］に記載のＲＮＡ複合体。
［５］前記アンチセンス鎖が２１ｎｔの長さである、上記［１］に記載のＲＮＡ複合体。
［６］前記アンチセンス鎖が少なくとも２４ｎｔの長さである、上記［１］に記載のＲＮＡ複合体。
［７］前記センス鎖が１５ｎｔの長さである、上記［１］から［６］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［８］前記センス鎖が１６ｎｔの長さである、上記［１］から［６］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［９］前記センス鎖が１７ｎｔの長さである、上記［１］から［６］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［１０］前記センス鎖が、表１、表２及び表３に列挙されるセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記［１］から［９］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［１１］前記アンチセンス鎖が、表１、表２及び表３に列挙されるアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記［１］から［９］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［１２］ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に対する配列相補性を有する、少なくとも２１ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのアンチセンス鎖、及び前記アンチセンス鎖に対する配列相補性を有する、１６ｎｔの長さのセンス鎖を含むＲＮＡ複合体であって、前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の５'末端及び前記センス鎖の３'末端が平滑末端を形成する複合体を形成する、前記ＲＮＡ複合体。
［１３］前記アンチセンス鎖が２１～３１ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１４］前記アンチセンス鎖が２１ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１５］前記アンチセンス鎖が２３ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１６］前記アンチセンス鎖が２５ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１７］前記アンチセンス鎖が２７ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１８］前記アンチセンス鎖が２９ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［１９］前記アンチセンス鎖が３１ｎｔの長さである、上記［１２］に記載のＲＮＡ複合体。
［２０］前記センス鎖が１６ｎｔの長さである、上記［１２］から［１９］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［２１］前記センス鎖が、表６に列挙されるセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記［１２］から［２０］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［２２］前記アンチセンス鎖が、表６に列挙されるアンチセンス鎖配列から選択される配列を有する、上記［１２］から［２０］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［２３］前記ＲＮＡ複合体が、細胞におけるＣＴＧＦ発現を阻害することができる、上記［１］から［２２］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［２４］前記細胞が上皮細胞である、上記［２３］に記載のＲＮＡ複合体。
［２５］前記細胞が肺胞細胞である、上記［２３］に記載のＲＮＡ複合体。
［２６］前記細胞がＡ５４９細胞である、上記［２３］に記載のＲＮＡ複合体。
［２７］前記細胞がＨａＣａＴ細胞である、上記［２３］に記載のＲＮＡ複合体。
［２８］前記細胞がＨｓ６８細胞である、上記［２３］に記載のＲＮＡ複合体。
［２９］前記ＲＮＡ複合体が化学修飾を含む、上記［１］から［２８］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［３０］前記化学修飾が、２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合又は疎水性部分である、上記［２９］に記載のＲＮＡ複合体。
［３１］前記ＲＮＡ複合体が疎水性部分を含む、上記［３０］に記載のＲＮＡ複合体。
［３２］前記疎水性部分がコレステロール部分である、上記［３１］に記載のＲＮＡ複合体。
［３３］前記コレステロール部分が、前記センス鎖の３'末端に結合している、上記［３２］に記載のＲＮＡ複合体。
［３４］前記ＲＮＡ複合体が２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、上記［２９］から［３０］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［３５］前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖上に位置する、上記［３４］に記載のＲＮＡ複合体。
［３６］前記センス鎖が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、上記［３５］に記載のＲＮＡ複合体。
［３７］前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記アンチセンス鎖の３'末端に位置する、上記［３４］に記載のＲＮＡ複合体。
［３８］前記アンチセンス鎖の前記３'末端領域が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、上記［３７］に記載のＲＮＡ複合体。
［３９］前記２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドが前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖の前記３'末端に位置する、上記［３４］に記載のＲＮＡ複合体。
［４０］前記センス鎖が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含み、前記アンチセンス鎖の３'末端領域が複数の２'－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む、上記［３９］に記載のＲＮＡ複合体。
［４１］前記ＲＮＡ複合体がホスホロチオエート結合を含む、上記［２９］から［４０］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［４２］前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも５％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］に記載のＲＮＡ複合体。
［４３］前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中の前記リボヌクレオチド間の結合の少なくとも１０％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］に記載のＲＮＡ複合体。
［４４］前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中の前記リボヌクレオチド間の結合の少なくとも１５％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］に記載のＲＮＡ複合体。
［４５］前記ＲＮＡ複合体の前記センス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも２０％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］に記載のＲＮＡ複合体。
［４６］前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中のリボヌクレオチド間の結合の少なくとも５％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］から［４５］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［４７］前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中の前記リボヌクレオチド間の結合の少なくとも１０％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］から［４５］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［４８］前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中の前記リボヌクレオチド間の結合の少なくとも１５％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］から［４５］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［４９］前記ＲＮＡ複合体の前記アンチセンス鎖中の前記リボヌクレオチド間の結合の少なくとも２０％がホスホロチオエート結合である、上記［４１］から［４５］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［５０］前記ＲＮＡ複合体が、表２、表３、又は表６に列挙される修飾ＲＮＡ複合体である、上記［４９］に記載のＲＮＡ複合体。
［５１］前記ＲＮＡ複合体が、送達ビヒクルの非存在下で細胞の細胞膜を透過することができる、上記［４１］から［５０］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［５２］前記ＲＮＡ複合体が、細胞毒性ではない、上記［１］から［５１］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体。
［５３］上記［１］から［５２］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体と前記細胞を接触させることを含む、細胞においてＣＴＧＦ発現を阻害する方法。
［５４］前記細胞がＡ５４９、Ｈｓ６８、ＨａＣａＴ、上皮細胞又は肺胞細胞である、上記［５３］に記載の方法。
［５５］前記細胞が、ヒト対象の気道に存在する、上記［５３］に記載の方法。
［５６］対象における特発性肺線維症を治療する方法であって、上記［１］から［５２］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体を前記対象に投与することを含む、前記方法。
［５７］前記ＲＮＡ複合体を前記対象の気道に投与することを含む、上記［５６］に記載の方法。
［５８］前記ＲＮＡ複合体を静脈内投与する、上記［５６］に記載の方法。
［５９］前記ＲＮＡ複合体を非経口的に投与する、上記［５６］に記載の方法。
［６０］前記ＲＮＡ複合体を吸入により投与する、上記［５６］又は［５７］に記載の方法。
［６１］上記［１］から［５２］のいずれかに記載のＲＮＡ複合体及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［６２］前記医薬組成物が、吸入による投与のために製剤化される、上記［６１］に記載の医薬組成物。
［６３］前記医薬組成物が、吸入器を使用する投与のために製剤化される、上記［６１］に記載の医薬組成物。
［６４］上記［６１］から［６３］のいずれかに記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象における特発性肺線維症の治療方法。
［６５］前記医薬組成物を、前記対象の気道に投与することを含む、上記［６４］に記載の方法。
［６６］前記医薬組成物が吸入器中にある、上記［６５］に記載の方法。
［６７］前記医薬組成物を、非経口的に又は静脈内に投与することを含む、上記［６４］に記載の方法。
［６８］前記医薬組成物を、経口投与することを含む、上記［６４］に記載の方法。
［６９］前記対象が、前記医薬組成物を自己投与する、上記［６４］から［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０］特発性肺線維症の前記治療のための第２の薬剤を投与することをさらに含む、上記［６４］から［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１］前記第２の薬剤が増殖因子阻害剤である、上記［７０］に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＣＴＧＦを標的とする１００の例示的なａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図2】ＣＴＧＦを標的とする１８の例示的なａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図3】ＣＴＧＦを標的とする１３の例示的なａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図4】ＣＴＧＦを標的とする１８の例示的なａｓｉＲＮＡの血清ヌクレアーゼ安定性を示す。

【図5】ＣＴＧＦを標的とする１８の例示的な裸のａｓｉＲＮＡ及び修飾ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図6】例示的なＣＴＧＦ標的化細胞透過ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ－ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ）の遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図7】例示的なｃｐ－ａｓｉＲＮＡによるＣＴＧＦタンパク質発現の阻害を示す。

【図8】ラット皮膚における例示的なｃｐ－ａｓｉＲＮＡによるＣＴＧＦタンパク質発現の阻害を示す。

【図9】ブレオマイシン処理マウス（ＢＬＭ処理マウス）におけるＣＴＧＦを標的とするｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の遺伝子サイレンシング効力を示す。

【図10】ＢＬＭ処理マウスにおけるｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３による線維症関連遺伝子発現の阻害を示す。

【図11】ＢＬＭ処理マウスにおけるｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３による線維症関連タンパク質産生の阻害を示す。

【図12A】Ａ５４９細胞におけるＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を示す。

【図12B】ＨａＣａＴ細胞におけるＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの追加の遺伝子サイレンシング活性を示す。

【図12C】Ｈｓ６８細胞におけるＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を示す。

【図13】ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

概要
特定の態様では、本明細書は、ＣＴＧＦを阻害し、したがってＩＰＦの治療に有用な非対称ＲＮＡ複合体（例えば、ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ－ａｓｉＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、化学修飾され、トランスフェクションビヒクルを必要とせずに細胞を浸透することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、表１、表２、表３、または表６に列挙されるＲＮＡ複合体である。特定の態様では、本明細書は、そのようなＲＮＡ複合体を含む医薬組成物、及びそのようなＲＮＡ複合体及び医薬組成物を使用する方法を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ－ｓｉＲＮＡである。本明細書で使用するとき、ａｓｉＲＮＡという用語は、１９～２１ｎｔのアンチセンス鎖及び１３～１７ｎｔのセンス鎖を有する２本鎖非対称短鎖干渉ＲＮＡ分子を意味する。ａｓｉＲＮＡについてのさらなる情報は、米国特許出願公開第２０１２／０２３８０１７号及びＣｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ． １７：７２５－７３２ （２００９）に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0014】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、リポソーム、カチオン性ポリマー、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗体及び／またはアプタマーなどの送達ビヒクルを使用して、細胞に送達される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、細胞におけるＣＴＧＦ阻害を媒介するためにそのような送達ビヒクルの使用を必要としないように、化学修飾される。そのようなＲＮＡ複合体は、本明細書では細胞膜透過ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ）と称する。

【0015】

定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用する特定の用語をここに収集する。

【0016】

冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、その冠詞の文法的対象の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「ある要素」は、１つの要素または複数の要素を意味する。

【0017】

本明細書で使用するとき、「投与する」という用語は、医薬品または組成物を対象に提供することを意味し、医療従事者による投与及び自己投与を含むが、これらに限定されない。

【0018】

本明細書で使用するとき、「干渉核酸」及び「阻害核酸」という用語は、互換的に使用する。干渉核酸は、一般に、それぞれが塩基対形成部分を有し、塩基対形成部分が、ワトソン・クリック型塩基対形成により核酸（典型的にはＲＮＡ）中の標的配列にハイブリダイズして、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成する、サブユニット間結合によって連結した、環状サブユニット配列を含む。干渉ＲＮＡ分子には、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子、ａｓｉＲＮＡ分子、ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ分子、一本鎖ｓｉＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されない。そのような干渉核酸は、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害するか、または天然のプレｍＲＮＡスプライシングプロセシングを阻害するか、または標的ｍＲＮＡの分解を誘導するように設計することができ、この干渉核酸がハイブリダイズする標的配列を「ターゲットにする」または「標的化する」と言ってもよい。干渉核酸は、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、２’－Ｏ－メチルオリゴヌクレオチド及びＲＮＡ干渉剤（ｓｉＲＮＡ剤）を含み得る。ＲＮＡｉ分子は、一般に、標的分子とヘテロ二本鎖を形成することによって作用し、標的分子は選択的に分解または「ノックダウン」され、それにより標的ＲＮＡを不活性化する。いくつかの条件下では、干渉ＲＮＡ分子は、転写物翻訳を抑制することによって、及び／または転写物の転写を阻害することによって、標的転写物を不活性化することもできる。干渉核酸は、より一般的には、上記の方法で標的の核酸を標的化する場合、タンパク質などの生物学的に関連する標的を「標的化」すると言われる。

【0019】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、互換的に使用する。ポリヌクレオチド及び核酸とは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体のいずれであっても、任意の組み合わせ及び任意の長さの、ポリマー形態のヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である、すなわち、遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、連鎖解析から定義される遺伝子座（ｌｏｃｉ 複数）（ｌｏｃｕｓ 単数）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーである。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド構造の修飾は、存在する場合には、ポリマーアセンブリの前または後に付与し得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに修飾してもよい。本明細書で提供する全ての核酸配列において、Ｕ核酸塩基はＴ核酸塩基と互換性がある。

【0020】

本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒カプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する。

【0021】

Ｔｍが実質的に４５℃よりも高く、または少なくとも５０℃もしくは少なくとも６０℃～８０℃以上である生理学的条件下で、オリゴヌクレオチドが標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。そのようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応する。所与のイオン強度及びｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。ここでもまた、そのようなハイブリダイゼーションは、標的配列に対するアンチセンスオリゴマーの「おおよその」または「実質的な」相補性ならびに完全な相補性により生じ得る。

【0022】

本明細書中で使用するとき、「対象」という用語は、治療または療法のために選択されたヒトまたは非ヒト動物を意味する。

【0023】

本明細書中で使用する「治療有効量」及び「有効量」という語句は、任意の医学的治療に適用可能な妥当な利益／リスク比で、対象における少なくとも細胞亜集団における所望の治療効果をもたらすのに有効な薬剤の量を意味する。

【0024】

対象における疾患を「治療する」または疾患を有する対象を「治療する」とは、疾患の少なくとも１つの症状を軽減させるか、またはその悪化を防ぐために、対象に医薬的治療、例えば薬物の投与を施すことを意味する。

【0025】

本明細書中で使用するとき、障害または状態を「予防する」治療薬は、疾患または状態の発症前に統計的試料に投与する場合、非治療対照試料と比較して、治療試料における障害または状態の発生を低減するか、または非治療対照試料と比較して、障害または状態の１種または複数の症状の発症を遅らせるかまたは重篤度を低減する化合物を意味する。

【0026】

ＲＮＡ複合体
特定の態様では、本明細書は、それぞれ、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡを標的とし、細胞におけるＣＴＧＦ発現を阻害するＲＮＡ複合体を提供する。ヒトＣＴＧＦ ｃＤＮＡの核酸配列を以下に示す。
ヒトＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列。（ＮＭ＿００１９０１．２）
ホモサピエンス結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、ｍＲＮＡ

【0027】

【0028】

特定の態様では、本明細書は、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列（例えば、ヒトＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列）に対する配列相補性を有するアンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖に対する配列相補性を有するセンス鎖を含むＲＮＡ複合体を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、細胞（例えば、肺胞細胞、上皮細胞、Ｈｓ６８、ＨａＣａＴ、またはＡ５４９細胞）におけるＣＴＧＦ発現を阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、非対称短鎖干渉ＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、表１、表２、表３、または表６に列挙されるＲＮＡ複合体である。本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、ＲＮＡ塩基、非ＲＮＡ塩基、またはＲＮＡ塩基と非ＲＮＡ塩基との混合物を含有することができる。例えば、本明細書で提供する特定のＲＮＡ複合体は、主にＲＮＡ塩基から構成され得るが、ＤＮＡ塩基または天然に存在しないヌクレオチドも含む。

【0029】

いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は少なくとも１９ヌクレオチド（ｎｔ）の長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１９～２１ｎｔの長さ（すなわち、１９、２０または２１ｎｔの長さ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は少なくとも２１ヌクレオチド（ｎｔ）の長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、２１～３１ｎｔの長さ（すなわち、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１ｎｔの長さ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３１ｎｔは、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に相補的である。完璧な相補性は必須ではない。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖はＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に完全に相補的である。

【0030】

いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも２４ｎｔの長さ（例えば、少なくとも２５ｎｔの長さ、少なくとも２６ｎｔの長さ、少なくとも２７ｎｔの長さ、少なくとも２８ｎｔの長さ、少なくとも２９ｎｔの長さ、少なくとも３０ｎｔの長さ、または少なくとも３１ｎｔの長さ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、１２４ｎｔ以下の長さ（例えば、１００ｎｔ以下の長さ、９０ｎｔ以下の長さ、８０ｎｔ以下の長さ、７０ｎｔ以下の長さ、６０ｎｔ以下の長さ、５０ｎｔ以下の長さ、または４０ｎｔ以下の長さ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２１ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２３ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２５ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２７ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は２９ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は３１ｎｔの長さである。いくつかの実施形態では、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または ３１ｎｔのアンチセンス鎖は、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に相補的である。完璧な相補性は必須ではない。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖はＣＴＧＦ ｍＲＮＡ配列に完全に相補的である。

【0031】

いくつかの実施形態では、センス鎖は、１５～１７ｎｔの長さ（すなわち、１５ｎｔの長さ、１６ｎｔの長さまたは１７ｎｔの長さ）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも１６ｎｔ、少なくとも１７ｎｔのセンス鎖は、アンチセンス鎖の配列に相補的である。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の配列に完全に相補的である。いくつかの実施形態では、センス鎖は１６ｎｔの長さである。

【0032】

いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が平滑末端を形成する複合体を形成する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端がセンス鎖の３’末端にオーバーハングする（例えば、１、２、３、４または５ｎｔで）複合体を形成する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、センス鎖の５’末端がアンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングする（例えば、１、２、３、４または５ｎｔで）複合体を形成する。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖及び／またはセンス鎖は、表１、表２、表３または表６に列挙される配列から選択されるセンス鎖配列及び／またはアンチセンス鎖配列を有する。

【0034】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供するＲＮＡ複合体は化学修飾を含み、この修飾は、送達ビヒクルの非存在下での細胞膜の透過を促進する。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド、ホスホロチオエート結合または疎水性部分である。いくつかの実施形態では、化学修飾は疎水性部分である。いくつかの実施形態では、疎水性部分は、コレステロール部分である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、表２、表３、または表６に列挙される修飾ＲＮＡ複合体である。特定の実施形態では、ＲＮＡ複合体は細胞毒性ではない。

【0035】

本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、種々のオリゴヌクレオチド化学を使用することができる。オリゴヌクレオチド化学の例としては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノ化学、上記のいずれかの組み合わせを含む例が挙げられるが、これらに限定されない。一般に、ＰＮＡ化学は、２’－Ｏ－Ｍｅオリゴヌクレオチドと比較して比較的高い標的結合強度のために、より短い標的配列を利用することができる。多くの場合、ホスホロチオエート及び２’－Ｏ－Ｍｅ修飾化学を組み合わせて、ホスホロチオエート骨格を有する２’－Ｏ－Ｍｅ修飾オリゴヌクレオチドを生成する。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ／２０１３／１１２０５３及びＷＯ／２００９／００８７２５を参照のこと、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0036】

ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、その骨格がピリミジンまたはプリン塩基が結合しているＮ－（２－アミノエチル）グリシン単位からなるデオキシリボース骨格と、構造的に同形であるＤＮＡの類似体である。天然ピリミジン及びプリン塩基を含むＰＮＡは、ワトソン－クリック塩基対形成規則に従い相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識の点でＤＮＡを模倣する。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって形成され、これにより、アンチセンス用途に非常に好適なものになっている（下記の構造を参照）。この骨格は荷電しておらず、結果としてＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖が通常より高い熱安定性を示す。ＰＮＡは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼによって認識されない。

【0037】

天然構造に対する根本的な構造変化にもかかわらず、ＰＮＡはヘリックス形態でＤＮＡまたはＲＮＡに配列特異的に結合することができる。ＰＮＡの特徴としては、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対する高い結合親和性、一塩基ミスマッチによって生じる不安定化効果、ヌクレアーゼ及びプロテアーゼに対する耐性、塩濃度とは無関係のＤＮＡまたはＲＮＡとのハイブリダイゼーション及びホモプリンＤＮＡとの三重鎖形成が挙げられる。

【0038】

ＰＡＮＡＧＥＮＥ．ＴＭ．は、独自のＢｔｓ ＰＮＡモノマー（Ｂｔｓ；ベンゾチアゾール－２－スルホニル基）及び独自のオリゴマー化プロセスを開発した。Ｂｔｓ ＰＮＡモノマーを使用するＰＮＡオリゴマー化は、脱保護、カップリング及びキャッピングの反復サイクルからなる。ＰＮＡは、当該分野で公知の任意の技術を用いて合成的に製造することができる。例えば、米国特許第６，９６９，７６６号、第７，２１１，６６８号、第７，０２２，８５１号、第７，１２５，９９４号、第７，１４５，００６号及び第７，１７９，８９６号を参照のこと。また、ＰＮＡの調製のための、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１、及び第５，７１９，２６２号も参照のこと。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５４：１４９７－１５００， １９９１に見出すことができる。上記のそれぞれは、参照によりその全体が組み込まれる。

【0039】

干渉核酸はまた、「ロックド核酸」サブユニット（ＬＮＡ）を含み得る。「ＬＮＡ」は架橋核酸（ＢＮＡ）と呼ばれる修飾クラスのメンバーである。ＢＮＡは、Ｃ３－エンド（ノーザン）糖パッカーのリボース環の配座をロックする共有結合を特徴とする。ＬＮＡでは、架橋は、２’－Ｏ位と４’－Ｃ位間のメチレンからなる。ＬＮＡは、骨格の事前組織化（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）及び塩基スタッキングを強化して、ハイブリダイゼーション及び熱安定性を高める。

【0040】

ＬＮＡの構造は、例えば、Ｗｅｎｇｅｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ （１９９８） ４５５、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （１９９８） ５４：３６０７， 及び Ａｃｃｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９９） ３２：３０１）、Ｏｂｉｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ （１９９７） ３８：８７３５、（１９９８） ３９：５４０１、及びＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （２００８） １６：９２３０に見出すことができる。本明細書で提供する化合物は、１つまたは複数のＬＮＡを組み込んでもよい。場合によっては、化合物は完全にＬＮＡからなっていてもよい。個々のＬＮＡヌクレオシドサブユニットの合成方法及びオリゴヌクレオチドへそれらを組み込む方法は、例えば、米国特許第７，５７２，５８２号、第７，５６９，５７５号、第７，０８４，１２５号、第７，０６０，８０９号、第７，０５３，２０７号、第７，０３４，１３３号、第６，７９４，４９９号、及び第６，６７０，４６１号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。典型的なサブユニット間リンカーには、ホスホジエステル及びホスホロチオエート部分が含まれ、あるいは、リン非含有リンカーを使用してもよい。一実施形態は、各ＬＮＡサブユニットがＤＮＡサブユニットによって分離されるＬＮＡ含有化合物である。特定の化合物は、サブユニット間リンカーがホスホロチオエートである、交互になっているＬＮＡサブユニット及びＤＮＡサブユニットからなる。

【0041】

特定の実施形態では、ＲＮＡ複合体は、コレステロール部分に連結している。いくつかの実施形態では、コレステロール部分はセンス鎖の３’末端に結合している。いくつかの実施形態では、コレステロール部分はアンチセンス鎖の３’末端に結合している。いくつかの実施形態では、コレステロール部分はセンス鎖の５’末端に結合している。いくつかの実施形態では、コレステロール部分はアンチセンス鎖の５’末端に結合している。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドは、リボース分子の２’－ＯＨ残基にメチル基を有する。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡはＲＮＡと同じ（または同様の）挙動を示すが、ヌクレアーゼ分解から保護される。さらなる安定化のために、２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡをホスホチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）と組み合わせることもできる。２’－Ｏ－Ｍｅ－ＲＮＡ（ホスホジエステルまたはホスホチオエート）は、当技術分野のルーチン技術に従って合成することができる（例えば、Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３２：２００８－１６， ２００４、を参照のこと、これは参照により本明細書に組み込まれる）。

【0043】

いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、センス鎖上に位置する。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、センス鎖上の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、センス鎖は、複数の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（例えば、２、３、４、５または６個の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド）を含む。いくつかの実施形態では、２’－Ｏ－メチルヌクレオシドは、アンチセンス鎖上の３’末端に位置する。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端領域は、複数の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド（例えば、３’末端の６ヌクレオシド内に、２、３、４、５または６個の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシド）を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端領域の両方は、複数の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、非修飾ヌクレオシドと交互になっている２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は非修飾ヌクレオシドと交互になっている２、３、４、５、６、７または８個の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、非修飾ヌクレオシドと交互になっている２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は非修飾ヌクレオシドと交互になっている２、３、４、５、６、７または８個の２’－Ｏ－メチル化ヌクレオシドの連続配列を含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は、ホスホロチオエート結合を含む。「ホスホロチオエート」（またはＳ－オリゴ）は、非架橋酸素の１つが硫黄で置換された、正常ＤＮＡの変異体である。ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’方向及び３’から５’方向ＤＮＡ ＰＯＬ１エキソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１及びＰ１、ＲＮアーゼ、血清ヌクレアーゼならびにヘビ毒ホスホジエステラーゼを含むエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの作用を低下させる。ホスホロチオエートは、２つの主な経路、すなわち、ハイドロゲンホスホネート上の二硫化炭素中の元素状硫黄の溶液の作用によって、またはテトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）もしくは３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン１，１－ジオキシド（ＢＤＴＤ）により、亜リン酸トリエステルを硫化する方法によって、製造する（例えば、Ｉｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５５， ４６９３－４６９９， １９９０を参照のこと）。後者の方法は、ほとんどの有機溶媒中の元素状硫黄の不溶性及び二硫化炭素の毒性の問題を回避する。ＴＥＴＤ及びＢＤＴＤ法はまた、より高純度のホスホロチオエートをもたらす。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体のセンス鎖のリボヌクレオチド間結合の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体のセンス鎖のリボヌクレオチド間結合のすべてが、ホスホロチオエート結合である。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖のリボヌクレオチド間結合の少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖のリボヌクレオチド間結合のすべてが、ホスホロチオエート結合である。

【0047】

本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、細胞と接触させるか、または生物（例えば、ヒト）に投与してもよい。あるいは、ＲＮＡ複合体をコードする構築物及び／またはベクターを、細胞または生物と接触させるか、または細胞または生物に導入してもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターを使用する。

【0048】

本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって調製することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、化学合成またはインビトロ転写によって調製する。

【0049】

特定の態様では、本明細書は、本明細書に開示されるＲＮＡ複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、医薬組成物は、肺への送達用に（例えば、吸入器として）製剤化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口または非経口送達用に製剤化する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ＩＰＦの治療のための第２の薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の薬剤は増殖因子阻害剤である。増殖因子阻害剤の例としては、ニンテダニブ、ピルフェニドン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オシメラルビブ、ネシツムマブ、及びバンデタニブが挙げられる。いくつかの実施形態では、第２の薬剤はステロイドである。ステロイドの例としては、ヒドロコルチゾン、フルチカゾン、ブデソニド（ｍｕｄｅｓｏｎｉｄｅ）、モメタゾン、ベクロメタゾン、シクレソニド、フルニソリドコルチゾン及びプレドニゾンが挙げられる。２つ以上の増殖因子阻害剤及び／またはステロイドを医薬組成物に取り込み得る。

【0050】

特定の実施形態では、医薬組成物は、トランスフェクションビヒクルを含まない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、送達ビヒクル（例えば、リポソーム、カチオン性ポリマー、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗体及び／またはアプタマー）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の複数（例えば２つ以上）のＲＮＡ複合体の組み合わせを含む。

【0051】

これらの製剤または組成物を調製する方法としては、本明細書に記載のＲＮＡ複合体を、担体及び任意に１つまたは複数の補助成分と会合させる工程が挙げられる。
一般に、製剤は、本明細書に記載の薬剤を、液体担体と均一かつ緊密に会合させることによって調製する。

【0052】

治療方法
特定の態様では、本明細書は、細胞におけるＣＴＧＦ発現を阻害する方法であって、この細胞を本明細書に記載のＲＮＡ複合体と接触させることを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体は修飾ＲＮＡ複合体であり、トランスフェクションビヒクルの非存在下で細胞をＲＮＡ複合体と接触させる。いくつかの実施形態では、送達ビヒクル（例えば、リポソーム、カチオン性ポリマー、細胞膜透過ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗体及び／またはアプタマー）の存在下で、細胞をＲＮＡ複合体と接触させる。いくつかの実施形態では、細胞はヒト対象の気道に存在する。いくつかの実施形態では、対象はＩＰＦを有する。いくつかの実施形態では、対象は女性である。いくつかの実施形態では、対象は男性である。

【0053】

特定の態様では、本明細書は、ＩＰＦのヒト対象を治療する方法であって、本明細書に記載のＲＮＡ複合体または医薬組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。
特定の実施形態では、ＲＮＡ複合体または医薬組成物は、対象の気道に投与する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ複合体または医薬組成物は、対象によって自己投与する。

【0054】

本発明の方法において、本明細書に記載のＲＮＡ複合体は、例えば送達ビヒクルなしの核酸（例えば、ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの場合）として、送達試薬との組み合わせで、及び／または本明細書中に記載のＲＮＡ複合体を発現する配列を含む核酸として提供することができる。いくつかの実施形態では、当該分野で公知の任意の核酸送達方法を、本明細書に記載の方法で使用することができる。好適な送達試薬としては、例えば、Ｍｉｒｕｓ Ｔｒａｎｓｉｔ ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例えば、ポリリシン）、アテロコラーゲン、ナノプレックス及びリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子の送達ビヒクルとしてのアテロコラーゲンの使用は、Ｍｉｎａｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２（１３）：ｅ１０９ （２００４）、Ｈａｎａｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．， １０８２：９－１７ （２００６）、及び Ｋａｗａｔａ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．， ７（９）：２９０４－１２ （２００８）に記載されており、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に組み込まれる。例示的な干渉核酸送達システムは、米国特許第８，２８３，４６１号、第８，３１３，７７２号、第８，５０１，９３０号、第８，４２６，５５４号、第８，２６８，７９８号及び第８，３２４，３６６号において提供されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0055】

本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、リポソームを用いて、本明細書に記載のＲＮＡ複合体を対象に送達する。本明細書に記載の方法での使用に好適なリポソームは、一般に中性または負に荷電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールを含む、標準的な小胞形成脂質から形成することができる。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームサイズ及び血流中のリポソームの半減期などの因子を考慮することによって導かれる。リポソームを調製するための種々の方法が知られており、例えば、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ． （１９８０）， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｅｎｇ． ９：４６７，及び米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号及び同第５，０１９，３６９号に記載されているが、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0056】

本方法で使用するためのリポソームは、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを回避するように修飾することもできる。そのような修飾リポソームは、表面上にオプソニン化阻害部分を有するか、またはリポソーム構造に組み込まれている。

【0057】

本明細書に記載のリポソームの調製に使用するためのオプソニン化阻害部分は、典型的には、リポソーム膜に結合した大きな親水性ポリマーである。本明細書中で使用するとき、オプソニン化阻害部分は、例えばリポソーム膜自体への脂溶性アンカーのインターカレーションによって、または膜脂質の活性基に直接結合することによって、それが膜に化学的にまたは物理的に付着している場合、リポソーム膜に「結合して」いる。これらのオプソニン化阻害親水性ポリマーは、ＭＭＳ及びＲＥＳによるリポソームの取り込みを有意に減少させる保護表面層を形成する。例えば、これは米国特許第４，９２０，０１６号に記載され、その全体の開示が参照により本明細書に組み込まれる。

【0058】

いくつかの実施形態では、リポソームを修飾するのに好適なオプソニン化阻害部分は、約５００～約４０，０００ダルトンまたは約２，０００～約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーとしては、例えばメトキシＰＥＧまたはＰＰＧ、及びＰＥＧまたはＰＰＧステアレートなどの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）誘導体、ポリアクリルアミドまたはポリＮ－ビニルピロリドン、直鎖状、分枝状またはデンドリマー状のポリアミドアミン、ポリアクリル酸、カルボキシル基またはアミノ基が化学的に結合しているポリビニルアルコール及びポリキシリトールなどのポリアルコール、ならびにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドなどの合成ポリマーが挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、またはメトキシＰＰＧのコポリマー、またはその誘導体もまた好適である。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミンまたはポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであり得る。オプソニン化阻害ポリマーはまた、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギナンなどのアミノ酸またはカルボン酸を含む天然多糖、アミノ化多糖またはオリゴ糖（直鎖状または分枝状）、または、例えば、カルボン酸誘導体と反応してカルボキシル基結合を得る、カルボキシル化多糖またはオリゴ糖であり得る。いくつかの実施形態では、オプソニン化阻害部分は、ＰＥＧ、ＰＰＧ、またはその誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、「ＰＥＧ化リポソーム」と呼ばれることがある。

【0059】

本明細書に開示される医薬組成物は、任意の好適な投与経路、吸入によって、経口的及び非経口的に投与してもよい。特定の実施形態では、医薬組成物は、全身的に（例えば、経口または非経口投与によって）送達される。特定の他の実施形態では、医薬組成物は、肺への吸入により局所的に送達される。

【0060】

医薬組成物中のＲＮＡ複合体の実際の用量レベルは、特定の患者、組成及び投与方法について、患者に有毒でなく所望の治療応答を達成するのに有効な量のＲＮＡ複合体を得るように、変えてよい。

【0061】

選択される用量レベルは、使用される特定の薬剤の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度または代謝速度、治療期間、使用される特定の化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／または物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び以前の病歴を含む種々の要因、及び医学分野においてよく知られている同様の要因に依存する。

【0062】

当業者である医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師または獣医師であれば、所望の治療効果を達成するために必要なレベルよりも低いレベルで、医薬組成物に用いられている薬剤の用量を処方及び／または投与し、所望の効果が達成されるまで徐々に用量を増加させることができる。

【0063】

一般的に本明細書に記載のＲＮＡ複合体の好適な１日用量は、治療効果を生じるのに有効な最低用量であるＲＮＡ複合体の量である。そのような有効用量は、一般に上記の因子に依存する。

【実施例】

【0064】

例示
実施例１：ＣＴＧＦ特異的非対称低分子干渉ＲＮＡのスクリーニング
結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）を阻害する非対称低分子干渉ＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）を同定するために、１００のａｓｉＲＮＡを合成し、スクリーニングした。例示的なａｓｉＲＮＡの核酸配列を、表１に示す。

【0065】

【表1】

【0066】

表１に列挙したａｓｉＲＮＡを、１×二本鎖ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｉｎｃ．，Ｋｏｒｅａ）中、９５℃で２分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した２．５×１０^４個のＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、２４ウェルプレートに播種した。Ａ５４９細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って、０．３ｎＭのａｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

【0067】

トランスフェクションの２４時間後、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによってＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを測定した。Ｉｓｏｌ－ＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（５ＰＲＩＭＥ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、製造者の指示に従ってｃＤＮＡ合成に使用した。合成したｃＤＮＡを希釈し、次いでＳｔｅｐＯｎｅ ＲＴ－ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。１００のａｓｉＲＮＡのそれぞれによるＣＴＧＦ阻害のレベルを図１に示す。

【0068】

実施例２：ＣＴＧＦ標的化ａｓｉＲＮＡを用いたＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現の阻害
１８のａｓｉＲＮＡ配列、ａｓｉＣＴＧＦ ４、９、１６、２５、３０、３２、３３、３４、３９、４０、４８、４９、８１、９２、９３、９６、９７及び９９を、ＣＴＧＦ発現を阻害する能力について試験した。

【0069】

選択したａｓｉＲＮＡを、１× 二本鎖ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｉｎｃ．， Ｋｏｒｅａ）中、９５℃で２分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、２．５×１０^４個のＡ５４９（ＡＴＣＣ）細胞を、２４ウェルプレートに播種した。Ａ５４９細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って、０．３または０．１ｎＭのａｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

【0070】

トランスフェクトした細胞のＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを、トランスフェクションの２４時間後にＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した。具体的には、Ｉｓｏｌ－ＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（５ＰＲＩＭＥ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、ｃＤＮＡ合成に使用した。合成したｃＤＮＡを希釈し、次いでＳｔｅｐＯｎｅ ＲＴ－ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。ＣＴＧＦ遺伝子の増幅は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを内部対照として増幅した。下のプライマー配列を使用した：

【0071】

ヒトＧＡＰＤＨ－フォワード：５’－ＧＡＧ ＴＣＡ ＡＣＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＴＣＧＴ－３’
ヒトＧＡＰＤＨ－リバース：５’－ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＣＣ ＧＴＴ ＣＴＣ ＡＧ－３’
ヒトＣＴＧＦ－フォワード：５’－ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＴ ＣＴＴ ＣＴＧ ＴＧＡ ＣＴ－３’
ヒトＣＴＧＦ－リバース：５’－ＡＣＧ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＴＧＣ ＡＧ－３’

【0072】

１８の例示的なａｓｉＲＮＡのＣＴＧＦ阻害のレベルを図２に示す。図２に示すように、４、９、１６、３０、３３、３４、４８、４９、８１、９２、９３、９６及び９７のａｓｉＲＮＡは、ＣＴＧＦ発現を阻害した。

【0073】

実施例３：ＣＴＧＦ標的化ａｓｉＲＮＡを用いたＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現の阻害
１３のａｓｉＲＮＡ配列、ａｓｉＣＴＧＦ４、９、１６、３０、３３、３４、４８、４９、８１、９２、９３、９６及び９７を、トランスフェクションによるＣＴＧＦ発現を阻害する能力について試験した。

【0074】

ａｓｉＲＮＡを、１×二本鎖ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ）中、９５℃で５分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｍｍ細胞培養皿中の、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。トランスフェクションの１日前に、２．５×１０^４個のＡ５４９細胞を、２４ウェルプレートに播種した。Ａ５４９細胞を、０．１、０．０３及び０．００１ｎＭのａｓｉＲＮＡ濃度でａｓｉＲＮＡによりトランスフェクトした。ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ （ＴａＫａＲａ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡ合成に使用した。ＣＴＧＦ遺伝子の増幅は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ）を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。１３のａｓｉＲＮＡのＣＴＧＦ阻害のレベルを図３に示す。

【0075】

実施例４：ＣＴＧＦ標的化ａｓｉＲＮＡを用いた血清ヌクレアーゼ安定性
実施例１から選択したａｓｉＲＮＡ（０．１ｎｍｏｌｅ）を、５０μＬの１０％ウシ胎仔血清溶液中でインキュベートした。指示された時点で、各試料７マイクロリットルを採取し、直ちに－７０℃で凍結させた。次いで、各試料のアリコート３μＬを、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ透過照明によって視覚化した。血清ヌクレアーゼに対するａｓｉＣＴＧＦの安定性を図４に示す。

【0076】

実施例５：スクリーニングのためのａｓｉＲＮＡの初期化学修飾
２’－Ｏ－メチルＲＮＡの化学修飾を、実施例１から選択したａｓｉＲＮＡに適用し、修飾ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効力を、裸のａｓｉＲＮＡの効率とともにＡ５４９細胞で試験した。修飾ａｓｉＲＮＡ（表２）を、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ阻害Ａ５４９細胞についてスクリーニングし、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。

【0077】

【表2】

【0078】

表２に列挙した２’－Ｏ－メチルＲＮＡ修飾ａｓｉＲＮＡを、１×二本鎖ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｂｉｏｎｅｅｒ Ｉｎｃ．、Ｋｏｒｅａ）中、９５℃で２分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。スクリーニングのために、１００ｍｍ細胞培養皿中の、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した２．５×１０^４個のＡ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、２４ウェルプレートに播種した。Ａ５４９細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の指示に従って、０．１ｎＭの修飾及び裸のａｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。

【0079】

トランスフェクトした細胞のＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを、トランスフェクションの２４時間後にＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した。Ｉｓｏｌ－ＲＮＡ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（５ＰＲＩＭＥ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡ合成に使用した。合成したｃＤＮＡを希釈し、次いで、ＳｔｅｐＯｎｅ リアルタイム－ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、定量的ＲＴ－ＰＣＲを行った。裸のａｓｉＲＮＡまたは２’－Ｏ－メチルＲＮＡ修飾ａｓｉＲＮＡのａｓｉＲＮＡのＣＴＧＦ阻害のレベルを図５に示す。

【0080】

実施例６：自己送達のためのａｓｉＲＮＡ化学修飾
選択したａｓｉＲＮＡに化学修飾を適用し、修飾ａｓｉＲＮＡの細胞送達を他の送達試薬の非存在下で試験した。以下に記載するように、特定の修飾は、エンドサイトーシス及びａｓｉＲＮＡの安定性を改善した。そのような細胞膜透過ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ）は、送達試薬の非存在下で細胞に送達することができる。

【0081】

４つのポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡ（表３）を、Ａ５４９細胞におけるＣＴＧＦ ｍＲＮＡ阻害についてスクリーニングした。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、送達試薬なしでＡ５４９細胞とともに３μＭでインキュベートした。リアルタイムＰＣＲによってＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを測定した。

【0082】

【表3】

【0083】

Ａ５４９細胞を、１００ｍｍ細胞培養皿中の、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。表３に列挙したポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中、９５℃で５分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ処理の１日前に、２．５×１０^４個の細胞を、２４ウェルプレートに播種した。処理前に、Ａ５４９細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、次いで、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液中で、ポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡの存在下で２４時間培養した。各時点で、ａｓｉＲＮＡ含有ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地を、血清含有培地と交換した。ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現のレベルは、ａｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。

【0084】

実施例７：ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを用いたＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現の阻害
ｃｐ－ａｓｉＲＮＡによるＣＴＧＦ ｍＲＮＡの阻害を試験した。各ポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、送達試薬なしでＡ５４９細胞とともに３μＭでインキュベートした。リアルタイムＰＣＲによってＣＴＧＦ ｍＲＮＡレベルを測定した。

【0085】

ＣＴＧＦ細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｍｍ細胞培養皿中の、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中、９５℃で５分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。トランスフェクションの１日前に、２．５×１０^４個のＡ５４９細胞を、２４ウェルプレートに播種した。処理直前に、Ａ５４９細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、次いで、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液中で、ポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡの存在下で２４時間培養した。その時点で、ａｓｉＲＮＡ含有ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地を、血清含有培地と交換した。ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現のレベルは、ａｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にリアルタイムＰＣＲを用いて測定した。ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ （ＴａＫａＲａ）を用いて全ＲＮＡを抽出し、次いで抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡ合成に使用した。ＣＴＧＦ遺伝子の増幅は、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ）を用いて検出した。ＧＡＰＤＨを内部対照として増幅した。

【0086】

４つのポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡのそれぞれによるＣＴＧＦ ｍＲＮＡ阻害のレベルを図６に示す。全てのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦインキュベート細胞株において、４５％のＣＴＧＦタンパク質阻害が観察され、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３はｍＲＮＡの阻害レベルにおいて最も高い有効性を有していた。

【0087】

実施例８：ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを用いたＣＴＧＦタンパク質発現の阻害
ｃｐ－ａｓｉＲＮＡによるＣＴＧＦタンパク質の阻害を試験するために、各ポテンシャルｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、送達試薬なしでＡ５４９細胞とともに３μＭでインキュベートした。Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）を、１００ｍｍ細胞培養皿中の、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。

【0088】

ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中、９５℃で５分間、３７℃で１時間インキュベートした。適切な鎖アニーリングをゲル電気泳動により確認した。

【0089】

トランスフェクションの１日前に、９×１０^４個のＡ５４９細胞を、６ウェルプレートに播種した。処理直前に、Ａ５４９細胞をダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、次いで、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ緩衝液中で、ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの存在下で２４時間培養した。その時点で、ａｓｉＲＮＡ含有ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地を、血清含有培地と交換した。

【0090】

ＣＴＧＦタンパク質発現のレベルは、ａｓｉＲＮＡ処理の４８時間後にウエスタンブロットを用いて測定した。要約すると、処理済みＣＴＧＦ細胞を、ＳＤＳ溶解緩衝液（１％ＳＤＳ、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．８））で溶解した。全タンパク質抽出物２０μｇを、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに充填し、１２０Ｖで電気泳動させた。電気泳動後、タンパク質を、３００ｍＡで１時間、メタノール（Ｍｅｒｃｋ）で既に活性化したＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に移した。膜を室温で１時間、３％ＢＳＡ（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ）でブロックし、次いで、抗ＣＴＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）及び抗γチューブリン抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を含む３％ＢＳＡ中で、４℃で一晩インキュベートした。次いで膜を１ｘＴＢＳＴで１０分間３回洗浄し、室温で１時間、１ｘＴＢＳＴ中でＨＲＰコンジュゲート二次抗体と共に１時間インキュベートした。膜を１×ＴＢＳＴで１０分間洗浄し、１×ＥＣＬで１分間処理した。次いで、ＣＴＧＦ及びγ－チューブリンバンドを、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ装置（Ｂｉｏ－ｒａｄ）を用いて画像化した。
ウエスタンブロットアッセイの結果を図７に示す。

【0091】

実施例９：動物モデルにおけるｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦによるＣＴＧＦの阻害
ＣＴＧＦ発現の阻害についてのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の有効性を、動物モデルで評価した。Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ （Ｋｏｒｅａ）から、ＳＤラット（雄型、６～８週齢）を購入した。ラットの皮膚に０．４、０．７または１ｍｇの濃度のｃｐ－ａｓｉＲＮＡを注射し、７２時間後に注射部位から皮膚生検試料を採取し、ｑＲＴ－ＰＣＲ分析にかけ、ＣＴＧＦのタンパク質レベルを評価した。

【0092】

ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ処理の７２時間後、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を用いて全タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイキットを用いて測定した。等量のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動で分離した。電気泳動後、タンパク質を、メタノール（Ｍｅｒｃｋ）で既に１時間活性化したＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ－ｒａｄ）に移した。膜を室温で１時間、５％スキムミルクでブロックし、次いで特異的抗体（抗ＣＴＧＦ抗体：Ｎｏｖｕｓ及びＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ、抗β－アクチン抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、抗ＧＡＰＤＨ抗体：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む５％スキムミルク中で、４℃で一晩インキュベートした。膜を、１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むトリス緩衝生理食塩水で洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含む５％スキムミルク中で、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、膜をＥＣＬ基質（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。次いで、標的タンパク質バンドを、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ装置（Ｂｉｏ－ｒａｄ社）を用いて画像化した。

【0093】

図８に示すように、０．４ｍｇ／注射のｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３は、ＣＴＧＦタンパク質レベルの８０％超の減少をもたらした。

【0094】

実施例１０：ブレオマイシン誘発肺線維症動物モデルにおけるＣＴＧＦの発現に対するｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の効果
ＣＴＧＦ発現の阻害についてのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の有効性を、ブレオマイシン誘発（ＢＬＭ）肺線維症動物モデルで評価した。

【0095】

７週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ（Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。マウスを、Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０の腹腔内投与により麻酔にかけた。
ブレオマイシン硫酸（Ｅｎｚｏ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）を１Ｘ生理食塩水に溶解し、体重１ｋｇあたり２ｍｇの単回用量として気管内投与した。対照動物には生理食塩水のみを投与した。

【0096】

７日後、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３を、０．６×生理食塩水中、９５℃で５分間、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３をブレオマイシン処置マウス（ＢＬＭ処置マウス）に気管内投与した。３０匹のマウスを無作為に６群に分けた、すなわち、０．６×生理食塩水を投与した陰性対照マウス（ｎ＝４）、ブレオマイシンを投与したＢＬＭマウス（ｎ＝５）、ブレオマイシン及び６．２ｍｇ／ｋｇのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３を投与した６．２ｍｐｋマウス（ｎ＝５）、ブレオマイシン及び３．１ｍｇ／ｋｇのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３を投与した３．１ｍｐｋマウス（ｎ＝６）、ブレオマイシン及び１．５ｍｇ／ｋｇのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３を投与した１．５ｍｐｋマウス（ｎ＝５）、及びブレオマイシン及び０．７５ｍｇ／ｋｇのｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３を投与した０．７５ｍｐｋマウス（ｎ＝５）、である。

【0097】

ブレオマイシン投与の１４日後、マウスを犠死させ、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡのレベルを定量的ＲＴ－ＰＣＲを用いて測定した。右肺をリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）に使用して、ｍＲＮＡレベルを測定した。

【0098】

ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、肺組織から全ＲＮＡを抽出し、抽出した５００ｎｇのＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造者の指示に従って、ｃＤＮＡ合成に使用した。使用したプライマー及びプローブ配列を表４に示す。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ＣＴＧＦ用にｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ， Ｊａｐａｎ）を、または１８Ｓ用にＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ， Ｊａｐａｎ）を、製造者の指示に従って用いて実施した。ハウスキーピング遺伝子１８Ｓを内部対照として使用し、遺伝子特異的ｍＲＮＡ発現を１８Ｓ発現に対して正規化した。

【0099】

【表4】

【0100】

図９に示すように、ＣＴＧＦ発現のＢＬＭ誘発アップレギュレーションは、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３の単回気管内投与によって有意に阻害された。ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３の単回気管内投与は、ＢＬＭ処置群と比較して、ＢＬＭ処置マウスにおけるＣＴＧＦ ｍＲＮＡを＞６０％減少させた。

【0101】

実施例１１：ブレオマイシン誘発肺線維症動物モデルにおける線維症関連遺伝子発現に対するｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の効果
線維症関連遺伝子発現に対するｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の効果を、ブレオマイシン誘発肺線維症動物モデルにおいて評価した。

【0102】

ブレオマイシン投与の７日後に、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３を気管内投与した（２ｍｇ／ｋｇ体重）。ブレオマイシン投与の１４日後に、リアルタイムＰＣＲを用いて線維症関連遺伝子の発現レベルを測定した。

【0103】

製造業者のプロトコールに従って、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ（ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、肺組織から全ＲＮＡを抽出した。使用したプライマー配列を表５に示す。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲは、ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ （ＴａＫａＲａ，Ｊａｐａｎ）を、またはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標） Ｐｒｏｂｅ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ （ＴＯＹＯＢＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて実施し、反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳｔｅｐＯｎｅ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて実施した。ハウスキーピング遺伝子１８Ｓを内部対照として使用し、遺伝子特異的ｍＲＮＡ発現を１８Ｓ発現に対して正規化した。

【0104】

【表5】

【0105】

図１０に示すように、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン発現のＢＬＭ誘発アップレギュレーションは、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ ９３の投与によって有意に阻害された。

【0106】

実施例１２：ブレオマイシン誘発肺線維症動物モデルにおけるフィブロネクチンタンパク質の産生に対するｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の効果
フィブロネクチンタンパク質レベルに対するｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の効果を、ブレオマイシン誘発肺線維症動物モデルにおいて評価した。

【0107】

ブレオマイシン投与（２ｍｇ／ｋｇ体重）の７日後に、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３（６．２～０．７５ｍｇ／ｋｇ体重）を気管内投与した。ブレオマイシン投与の１４日後、マウスを犠死させ、評価した。線維性肺組織におけるフィブロネクチンの発現を、ウエスタンブロット分析を用いて測定した。

【0108】

試料を、５００μＬの哺乳動物タンパク質抽出緩衝液（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中でホモジナイズして、フィブロネクチン及びγチューブリンを検出した。タンパク質濃度は ブラッドフォードアッセイを用いて測定した。全タンパク質抽出物２０μｇを、１０％ゲルＳＤＳ－ＰＡＧＥにより電気泳動させ、メタノール（Ｍｅｒｃｋ）で既に３００ｍＡで１時間活性化したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）に移した。膜を室温で１時間、５％スキムミルクでブロックし、次いでマウス抗フィブロネクチン抗体（Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）または抗γチューブリン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を含む５％ＢＳＡ（Ｂｉｏｗｏｒｄ）で、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギＩｇＧ二次抗体及びＣｈｅｍｉｄｏｃ機器（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて検出した。

【0109】

図１１に示すように、フィブロネクチンタンパク質の発現のＢＬＭ誘発アップレギュレーションは、ｃｐ－ａｓｉＣＴＧＦ９３の投与によって有意に阻害された。

【0110】

実施例１３：異なるアンチセンス鎖を有するｃｐ－ａｓｉＲＮＡによる標的遺伝子ノックダウンの効果
異なるアンチセンス鎖長を有する、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、効力について試験した。ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの配列及び化学修飾は、以下の表６に見出すことができる。

【0111】

【表6】

【0112】

種々のアンチセンス鎖長を有する、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を、図１２Ａに見出すことができる。Ａ５４９細胞を、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、Ａ５４９細胞をｃｐ－ａｓｉＲＮＡとインキュベートした。全ＲＮＡを細胞溶解物から抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により分析した。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの強力な標的遺伝子サイレンシングが観察された。ＮＴは非処理の対照を示す。

【0113】

ＨａＣａＴ細胞における、異なるアンチセンス鎖長を有するＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を、図１２Ｂに見出すことができる。ＨａＣａＴ細胞を、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＨａＣａＴ細胞を、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡでインキュベートした。全ＲＮＡを細胞溶解物から抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により分析した。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの強力な標的遺伝子サイレンシングが観察された。ＮＴは非処理の対照を示す。Ｈｓ６８細胞における、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を、図１２Ｃに見出すことができる。Ｈｓ６８細胞を、上記のＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを用いてトランスフェクト／インキュベートした。全ＲＮＡを細胞溶解物から抽出し、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）により処理した。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの強力な標的遺伝子サイレンシングが観察された。

【0114】

実施例１４：皮内注射によるインビボ標的遺伝子ノックダウンの効果
異なるアンチセンス鎖長を有する、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、効力について試験した。ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの配列及び化学は、表６に示す。

【0115】

異なるアンチセンス鎖長を有する、ＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの標的遺伝子サイレンシング活性を、ラットの皮膚で試験した（表６）。０．６Ｘ生理食塩水中の０．５ｍｇのＣＴＧＦ標的化ｃｐ－ａｓｉＲＮＡを、ラットの皮膚に注射した（皮内注射）。図１３は、ｃｐ－ａｓｉＲＮＡ投与後の標的ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを示す。ｃｐ－ａｓｉＲＮＡの強力な標的遺伝子サイレンシングが観察された。さらに、より長いアンチセンス鎖を有するｃｐ－ａｓｉＲＮＡは、最大の標的遺伝子ノックダウンを示した。ＮＴは非処理の対照を示す。０．６Ｘ生理食塩水は、試薬のみの対照を表す。これらの結果は、インビボでのｃｐ－ａｓｉＲＮＡ処置による標的遺伝子ノックダウンを示す。

【0116】

参照による組み込み
本明細書に記載された全ての刊行物、特許及び特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれるように、具体的かつ個々に示される場合と同様に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。抵触する場合には、本明細書一切の定義を含めて、本出願が優先する。

【0117】

均等物
当業者は、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載された発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、または確認できるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【配列表】

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