特許 7050696 核酸を細胞に導入するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-03-31

(45)【発行日】2022-04-08

(54)【発明の名称】核酸を細胞に導入するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20220401BHJP

   C12N 15/67 20060101ALI20220401BHJP

   C12N 13/00 20060101ALI20220401BHJP

【ＦＩ】

C12N15/87 Z

C12N15/67 Z

C12N13/00

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2018558203

(86)(22)【出願日】2017-05-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-06-06

(86)【国際出願番号】 EP2017060345

(87)【国際公開番号】W WO2017191096

(87)【国際公開日】2017-11-09

【審査請求日】2020-04-27

(31)【優先権主張番号】16168589.6

(32)【優先日】2016-05-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】520493902

【氏名又は名称】ミルテニイ ビオテック ベー．ファー． ウント コー．カーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】ジューク，マリオン

(72)【発明者】

【氏名】ワイルド，ステファン

(72)【発明者】

【氏名】ボシオ，アンドレアス

【審査官】小金井 悟

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１３／００３４７５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】EMBO J.，1999年02月15日，Vol.18, No.4，pp.904-915

【文献】J. Cell. Biochem.，2013年09月，Vol.114, No.9，pp.2032-2038

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つの目的とする核酸を細胞に導入する有効性を増強するためのＳＯＣＳ１をコードする核酸の使用であって、前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸がｍＲＮＡであり、その３’末端に少なくとも１４００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、インビトロにおける使用。

【請求項2】

前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸が、３’末端に少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

少なくとも１つの目的とする核酸による細胞のインビトロにおける反復トランスフェクション方法であって、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と；同時にまたは続いて
ｂ）少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする少なくとも１つの目的とする核酸と；
を前記細胞に添加するステップを含み、少なくともステップｂ）は少なくとも１回反復され、前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸がｍＲＮＡであり、その３’末端に少なくとも１４００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの目的とする核酸が、ＤＮＡプラスミドまたはその３’末端に少なくとも１４００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有するｍＲＮＡである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記ｍＲＮＡのそれぞれが、３’末端に少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

少なくともステップｂ）が、少なくとも３回反復される、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ｍＲＮＡのそれぞれにおいて、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から５０％が、修飾核酸塩基である、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ｍＲＮＡのそれぞれが、無修飾ｍＲＮＡである、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記少なくともステップｂ）の１回の反復期間が、４時間から４８時間の間である、請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記細胞が、初代細胞である、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記細胞が、体細胞である、請求項３から９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの目的とする核酸が、リプログラミング因子をコードする、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つの目的とする核酸が、体細胞の異なる細胞種への分化転換のために使用される分化因子をコードする、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

少なくとも１つの目的とする核酸による細胞のインビトロにおけるエレクトロポレーション方法であって、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と、同時にまたは続いて
ｂ）前記少なくとも１つの目的とする核酸と
を前記細胞に添加するステップを含み、
前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸がｍＲＮＡであり、その３’末端に少なくとも１４００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、方法。

【請求項15】

前記ｍＲＮＡが、３’末端に少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションは、細胞においていわゆる自然免疫を誘発する。細胞質タンパクは、非自己核酸を認識し、シグナル伝達経路を活性化して、とりわけサイトカインの産生をもたらす結果となり、細胞のアポトーシスにつながる場合もある。誘発されるシグナル伝達経路の１つは、インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達経路である。細胞が１回トランスフェクションされる場合には、そのような影響は細胞の生存に重大ではない。しかし、細胞を数日内に反復してトランスフェクションする必要がある場合には、細胞死の激しい増加が観察される。通常、これは、トランスフェクション細胞の細胞死につながる。

【0002】

ワクシニアウイルス可溶性アルファ／ベータインターフェロンレセプター（Ｂ１８Ｒ）は、細胞表面に結合し、ＩＦＮの抗ウイルス効果から細胞を保護する（Ａｌｃａｍｉら、２０００年、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７４：１１２３０～１１２３９ページ）。細胞の反復トランスフェクション後にＢ１８Ｒタンパクを細胞培地に添加すると、細胞死が大きく低減され、トランスフェクションされた遺伝子の発現が増加する。Ｂ１８Ｒタンパクは、例えば、リプログラミング因子のｍＲＮＡによる、分化した初代細胞の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）へのリプログラミングのために毎日実施される細胞のトランスフェクション後に細胞培地に添加される（Ｗａｒｒｅｎら、２０１２年、ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＲＥＰＯＲＴＳ ２：６５７、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ００６５７）。Ｂ１８Ｒは、タンパク質として培地に添加されるため、手間を要し、製造が高価であるという欠点を有する。精製したタンパク質は、依然としてエンドトキシンなどの望ましくない成分が混入していることが多く、これは、タンパク質から分離できないか、または非常に多くの労力を用いなければ分離できない。さらに、タンパク質は入れた容器の壁に貼りつく疎水領域を有する場合が多いため、細胞培養培地などの別の環境に添加するために調製されたタンパク質は、新しい環境における実際の濃度を推定する際に問題を生じることが多い。

【0003】

Ｐｏｌｅｇａｎｏｖら（Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１５年、２６（１１）、７５１～６６ページ）は、自然免疫の活性化の望ましくない影響から細胞を救出するためのさまざまなウイルスｍＲＮＡ（ワクシニアウイルス由来のＢ１８Ｒ、Ｅ３およびＫ３のｍＲＮＡ）の組合せを報告している。リプログラミングに関連したマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と組み合わされると、結果として、これは、フィーダーフリーｉＰＳ細胞形成法になる。この方法の欠点は、リプログラミングを促進するために必要なやや複雑なｍＲＮＡ／ｍｉＲＮＡカクテルである。

【0004】

ＨｏｎｇおよびＣａｒｍｉｃｈａｅｌ（２０１３年、ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ、２８８：１６１９６～１６２０５ページ）には、減弱されたＩ型ＩＦＮに対する細胞の応答がヒト多能性幹細胞の一般的な特徴である可能性もあることおよびこれがサイトカインシグナル抑制因子１（ＳＯＣＳ１）の高い発現と関連することが示されている。

【0005】

細胞内の大半のｍＲＮＡが５０から１５０ヌクレオチドのポリ（Ａ）の長さを有することが記述されてきた（Ｊａｌｋａｎｅｎ，ＡＬら、Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２０１４年；３４：２４～３２ページ。）。

【0006】

したがって、インビトロで生成されるｍＲＮＡに関して、細胞で見られる長さと類似したポリＡテールが使用されるべきであることが一般的な想定である。非常に短いポリＡテールはより速い分解と関連する一方、１５から９８アデノシンの範囲のポリＡの長さを有するｍＲＮＡの翻訳効率は高まることが示されている（Ｐｒｅｉｓｓ，Ｔら、ＲＮＡ．１９９８年；４（１１）：１３２１～３１ページ）。一般に、インビトロで転写されるｍＲＮＡのためのポリＡテールの長さは２０から２００ヌクレオチドの範囲である。Ｐｏｌｅｇａｎｏｖらによる上記の刊行物では、すべてのｍＲＮＡが厳密に１２０ＡのポリＡテールを含んでいた。

【0007】

インビトロにおいてＲＮＡをポリアデニル化するための最も一般的な酵素であるＥ．ｃｏｌｉのポリ（Ａ）ポリメラーゼは、２０～１５０ヌクレオチドだけのポリＡテールをもたらすことが記述されている。Ｈｆｑタンパクと組み合わされた場合には、最大９００ヌクレオチドのポリＡテールをもたらすことが記述されている（Ｈａｊｎｓｄｏｒｆ Ｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０００年、１５；９７（４）：１５０１～５ページ。）。少数のポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えば、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、より長いポリ（Ａ）テールを形成することができる。

【0008】

当該技術分野において、核酸を細胞に導入することによって生じ得る、いわゆる細胞の自然免疫の望ましくない影響を低減する、目的とする核酸分子を細胞に導入するための改善されたまたは代替的な方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

驚くべきことに、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸が使用でき、（例えば、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって）ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどの前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸と共導入される、目的とするポリペプチドをコードする目的とする核酸の（例えば、細胞培養培地中の）細胞における発現に有益な影響を有することがわかった。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸が、共導入された目的とする核酸の発現に有益な影響を達成するため、反復トランスフェクションプロセスならびにエレクトロポレーションプロセスに使用できることは全く予想外であった。前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸の細胞への導入は、いわゆる細胞の自然免疫の影響を低減し、それにより、ＳＯＣＳ１をコードする核酸が共導入されていない細胞と比較して、細胞生存を改善し、および／または細胞における共導入された目的とする核酸の発現を向上させる。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどの前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸の細胞への導入は、細胞のＩ型ＩＦＮ応答を弱めるために、細胞生存を促進することによって細胞の自然免疫の影響を低減する。通常、とりわけ核酸の反復トランスフェクションは、細胞において自然免疫を誘発し、それが、その後、細胞のアポトーシスにつながる場合もある。

【0010】

したがって、例えば、細胞の反復トランスフェクションのために細胞培養培地に使用されるＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする単独の核酸が、この運命から逸脱し、トランスフェクション細胞において発現するようになるコトランスフェクションされた他の核酸を補助することができることは完全に予想外であった。また、トランスフェクション細胞におけるＳＯＣＳ１の発現は、通常、アポトーシスにつながる場合もあるＩ型ＩＦＮに対する細胞の応答を弱め、それにより細胞の自然免疫の影響を低減する。分化した初代細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミングのために毎日実施される細胞のトランスフェクション後に、（先行技術のゴールドスタンダードとして）Ｂ１８Ｒタンパクが細胞培地に添加されるが、Ｂ１８Ｒ ｍＲＮＡ単独などの他の核酸はこの有益な影響を示さなかった。今までの核酸のレベルに対して上で述べたとおり、さまざまなウイルスｍＲＮＡの組合せのみが自然免疫の活性化の望ましくない影響から細胞を救出することが示されてきた。驚くべきことに、本発明者らは、細胞に導入される１つの核酸、すなわちＳＯＣＳ１をコードする核酸、好ましくはＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡが自然免疫の活性化の影響を回避または低減するのに十分であることを明らかにした。

【0011】

反復トランスフェクションされた細胞における細胞の自然免疫の影響を低減するためのトランスフェクションプロセス内（例えば、細胞培養培地中）の薬剤としてのＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸は、Ｂ１８Ｒなどのタンパク質の上記の欠点を有さない核酸であるという利益を有する。とりわけ、ｍＲＮＡなどの核酸の生成およびその精製は、タンパク質と比較して容易である。反復トランスフェクションされた細胞における細胞の自然免疫の影響を低減するための（例えば、細胞培養培地中の）薬剤としてのＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸は、自然免疫の活性化の望ましくない影響から細胞を救出することが当該技術分野において示されてきたさまざまなウイルスｍＲＮＡの組合せ（「カクテル」）と比較した場合、１つの核酸だけであるという利益も有する。

【0012】

（例えば、トランスフェクションされる細胞を含む培地に前記核酸を添加することによって）同時にまたは続いて細胞に添加されるＳＯＣＳ１をコードする核酸および目的とするポリペプチドをコードする少なくとも１つの目的とする核酸は、ｍＲＮＡに転写された後、ポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ分子であってもよく、そのため、それらは上記の効果を発揮することができる。あるいは、ＳＯＣＳ１をコードする核酸はＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡ分子であってもよく、目的とする核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであってもよい。好ましくは、ＳＯＣＳ１をコードする核酸および目的とするポリペプチドをコードする目的とする核酸の両方がｍＲＮＡ分子であってもよい。

【0013】

さらに驚くべきことに、ｍＲＮＡ（ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡおよび目的とするポリペプチドをコードするｍＲＮＡの両方）のポリ（Ａ）テールが長い程、トランスフェクション有効性および／または目的とする核酸によってコードされる目的とするポリペプチドの発現のレベルが高いことがわかった。これは、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールが長い程、同じ細胞のより多くの反復トランスフェクションが可能であることを意味する。したがって、好ましくは、本方法において使用されるｍＲＮＡは、３’末端に少なくとも２００のアデニン、より好ましくは少なくとも１５００のアデニン、さらにより好ましくは少なくとも２０００のアデニン、最も好ましくは少なくとも４０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する。そのような長いポリ（Ａ）テールは、例えば、酵母ポリ（Ａ）ポリメラーゼによって形成され得る。

【0014】

ＳＯＣＳ１をコードする核酸が、例えば、ＳＯＣＳ１をコードする核酸および少なくとも１つの目的とする核酸の最初のコトランスフェクションによって実現されたトランスフェクション細胞に存在する（すなわち、それが、ポリペプチドに翻訳される）限り、前記細胞を前記少なくとも１つの目的とする核酸でトランスフェクションするためには同じ細胞の反復トランスフェクション（または何回かの反復トランスフェクション）で十分である。

【0015】

さらに予想外にも、本発明の方法において使用されるＳＯＣＳ１をコードする核酸および目的とする核酸の無修飾またはわずかにだけ修飾されたｍＲＮＡが、前記核ｍＲＮＡの修飾されたまたはさらに強く修飾されたバリアント（例えば、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンの１００％が修飾核酸塩基である）よりもさらにより良好であることがわかった。これは、通常、目的とする遺伝子のやや強く修飾されたｍＲＮＡがトランスフェクションに対してより安定したｍＲＮＡ分子を実現するために使用されるので、無修飾ｍＲＮＡによる自然免疫応答の活性化がさらに一層顕著であることは驚くべきことである（ＫａｒｉｋｏらＩｍｍｕｎｉｔｙ ２００５年、２３（２）、１６５～１７５ページ）。

【0016】

さらに驚くべきことに、ＳＯＣＳ１をコードする核酸が、（例えば、細胞培養培地中における）少なくとも１つの目的とする核酸を用いた細胞のエレクトロポレーション方法にも使用でき、結果として細胞の生存を改善し、および／または結果として細胞において目的とする核酸分子を発現するさらに多くの細胞を生じることがわかった。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】３日間の連日のトランスフェクション後のヒト線維芽細胞におけるＧＦＰ ｍＲＮＡ発現の強度のフローサイトメトリー測定のグラフである。

【図2】ｍＲＮＡトランスフェクションを使用したｉＰＳＣの形成に対するＢ１８ＲおよびＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの効果の比較の写真である。

【図3】ヒト新生児の包皮線維芽細胞のｉＰＳＣへのリプログラミングに対する修飾および無修飾ｍＲＮＡの効果の写真である。

【図4】線維芽細胞のｉＰＳＣへの成功したリプログラミングに対するポリＡテールの長さの影響の表である。

【図5】ＧＦＰタンパクの発現に対するポリＡテールの長さの影響のグラフである。

【図6】ｅＧＦＰプラスミドＤＮＡのＴ細胞へのエレクトロポレーション後の細胞生存力およびトランスフェクション率に対するＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの効果のグラフである（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。

【発明を実施するための形態】

【0018】

一態様において、本発明は、少なくとも１つの目的とする核酸を細胞に導入する有効性を増強するためおよび／または少なくとも１つの目的とする核酸が導入された細胞の改善された生存のためのＳＯＣＳ１をコードする核酸の使用を提供する。

【0019】

前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、ｍＲＮＡであってもよく、３’末端に少なくとも２００のアデニン、少なくとも５００のアデニン、少なくとも１０００のアデニン、少なくとも１５００のアデニン、少なくとも２０００のアデニン、少なくとも２５００のアデニン、少なくとも３０００のアデニン、少なくとも３５００のアデニン、少なくとも４０００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも５０００のアデニン、少なくとも５５００のアデニンまたは少なくとも６０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有してもよい。

【0020】

前記少なくとも１つの目的とする核酸は、ＤＮＡであってもよい。

【0021】

前記少なくとも１つの目的とする核酸は、ｍＲＮＡであってもよく、３’末端に少なくとも２００のアデニン、少なくとも５００のアデニン、少なくとも１０００のアデニン、少なくとも１５００のアデニン、少なくとも２０００のアデニン、少なくとも２５００のアデニン、少なくとも３０００のアデニン、少なくとも３５００のアデニン、少なくとも４０００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも５０００のアデニン、少なくとも５５００のアデニンまたは少なくとも６０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有してもよい。

【0022】

少なくとも１つの目的とする核酸を細胞に導入する有効性を増強するための前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸の使用は、以下の節にさらに詳細に開示されている。

【0023】

一態様において、本発明は、例えば、細胞培養培地中における少なくとも１つの目的とする核酸による細胞の反復トランスフェクション方法であって、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と；同時にまたは続いて
ｂ）少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの目的とする核酸と；
を細胞に添加するステップを含み、少なくともステップｂ）は少なくとも１回反復される、方法を提供する。

【0024】

ステップａ）も、ステップｂ）が反復されるときに、毎回反復されてもよく、あるいはステップａ）は、ステップｂ）が反復されるときに、少なくとも２回、３回、４回、５回、６回、７回または８回毎に反復されてもよい。

【0025】

本発明の一実施形態において、ステップｂ）が反復されるときに、ステップａ）も毎回反復される場合、本発明は、例えば、細胞培養培地中における少なくとも１つの目的とする核酸による細胞の反復トランスフェクション方法であって、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と；同時にまたは続いて
ｂ）少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする前記少なくとも１つの目的とする核酸と；
を細胞に（または細胞が細胞培地中にある場合は培地に）添加するステップを含み、前記ステップは、前記細胞の培養中に少なくとも１回反復される、方法を提供する。

【0026】

前記少なくとも１つの目的とする核酸および前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸はｍＲＮＡであってもよく、前記ｍＲＮＡのそれぞれは、３’末端に少なくとも２００のアデニン、少なくとも５００のアデニン、少なくとも１０００のアデニン、少なくとも１５００のアデニン、少なくとも２０００のアデニン、少なくとも２５００のアデニン、少なくとも３０００のアデニン、少なくとも３５００のアデニン、少なくとも４０００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも５０００のアデニン、少なくとも５５００のアデニンまたは少なくとも６０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有してもよい。

【0027】

前記少なくともステップｂ）は、少なくとも３回、好ましくは５回反復されてもよく、前記ポリ（Ａ）テールは少なくとも２０００のアデニンを含む。

【0028】

前記少なくともステップｂ）は、少なくとも８回反復されてもよく、前記ポリ（Ａ）テールは少なくとも４０００のアデニンを含む。

【0029】

本方法において前記核酸の両方は、ｍＲＮＡとして提供されてもよく、あるいは、ＳＯＣＳ１をコードする核酸がｍＲＮＡであってもよく、目的とするポリペプチドをコードする目的とする核酸がＤＮＡであってもよくまたは逆もまた同様である。

【0030】

本方法で使用される前記ｍＲＮＡのそれぞれにおいて、ｍＲＮＡの核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から５０％、好ましくは０％から２５％が修飾核酸塩基であってもよい。

【0031】

より好ましくは、本方法において使用される前記ｍＲＮＡは、無修飾ｍＲＮＡである。

【0032】

修飾ｍＲＮＡは、トランスフェクションＲＮＡの自然免疫を減少させることが述べられてきた。所与の用途に応じて、より高い修飾率では、トランスフェクションが反復されても細胞の生存が改善されることが想定される。しかしながら、修飾ｍＲＮＡの翻訳が減少するため、反復されるトランスフェクションを、修飾ヌクレオチドを使用するのとは別の手段によって達成することができる場合、無修飾ｍＲＮＡが好ましいことになる。

【0033】

ステップａ）およびステップｂ）または少なくともステップｂ）を反復期間は、４時間から４８時間の間、好ましくは６時間から３６時間の間、より好ましくは６時間から２４時間の間の１回の反復であってもよく、あるいは反復は毎日であってもよい。

【0034】

前記細胞は、初代細胞であってもよい。前記細胞は、分化細胞または体細胞であってもよい。前記細胞は、ｉＰＳ細胞または幹細胞であってもよい。前記細胞は、細胞株由来であってもよい。

【0035】

前記少なくとも１つの目的とする核酸は、初代細胞または分化細胞をｉＰＳＣにリプログラミングすることができる少なくとも１つのリプログラミング因子をコードしてもよい。その場合、本方法は、初代細胞または分化細胞のｉＰＳ細胞へのリプログラミングのために使用される。

【0036】

前記少なくとも１つのリプログラミング因子は、Ｏｃｔ３／４、ｃ－ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、およびＮａｎｏｇから成る群から選択されてもよい。

【0037】

前記少なくとも１つの目的とする核酸は、体細胞を異なる細胞種に分化転換（ｔｒａｎｓ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）することができる分化因子であってもよい。その場合、本方法は、体細胞の異なる細胞種への分化転換のために使用される。

【0038】

そのような分化因子に関する例は、ＭｙｏＤ、Ｇａｔａ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、およびＭｙｔ１ｌである。

【0039】

さらに、前記少なくとも１つの目的とする核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡから成る群から選択されてもよい。前記目的とする核酸は、ＤＮＡ、例えば、目的とする遺伝子をコードするプラスミドであってもよい。前記目的とする核酸は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする核酸配列であってもよい。

【0040】

前記細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞であってもよい。

【0041】

前記方法は、閉鎖系で実施されてもよい。

【0042】

閉鎖系で実施される前記方法は、自動化された方法であってもよい。

【0043】

閉鎖系に関する例は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ、ＷＯ２００９／０７２００３）である。

【0044】

さらなる態様において、本発明は、例えば、細胞培養培地中における少なくとも１つの目的とする核酸を用いた細胞のエレクトロポレーション方法であって、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と、同時にまたは続いて
ｂ）前記少なくとも１つの目的とする核酸と
を細胞に（または培地に）添加するステップを含む、方法を提供する。

【0045】

前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、ＳＯＣＳ１をコードするプラスミドであってもよい。好ましくは、前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡであってもよい。前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡであってもよく、前記ｍＲＮＡにおいて、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から５０％が修飾核酸塩基であってもよく、好ましくは、前記ｍＲＮＡにおいて、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から２５％が修飾核酸塩基であってもよく、より好ましくは前記ｍＲＮＡは、無修飾ｍＲＮＡであってもよい。

【0046】

前記目的とする核酸もｍＲＮＡである場合、前記ｍＲＮＡはｍＲＮＡであり、前記ｍＲＮＡにおいて、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から５０％が修飾核酸塩基であってもよく、好ましくは、前記ｍＲＮＡにおいて、核酸塩基ウラシルおよび／またはシトシンのうちの０％から２５％が修飾核酸塩基であってもよく、より好ましくは前記ｍＲＮＡは、無修飾ｍＲＮＡであってもよい。

【0047】

前記少なくとも１つの目的とする核酸および前記ＳＯＣＳ１をコードする核酸はｍＲＮＡであってもよく、前記ｍＲＮＡのそれぞれは、３’末端に少なくとも２００のアデニン、少なくとも５００のアデニン、少なくとも１０００のアデニン、少なくとも１５００のアデニン、少なくとも２０００のアデニン、少なくとも２５００のアデニン、少なくとも３０００のアデニン、少なくとも３５００のアデニン、少なくとも４０００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも４５００のアデニン、少なくとも５０００のアデニン、少なくとも５５００のアデニンまたは少なくとも６０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有してもよい。

【0048】

本方法において前記核酸の両方は、ｍＲＮＡとして提供されてもよく、あるいは、ＳＯＣＳ１をコードする核酸がｍＲＮＡであってもよく、目的とするポリペプチドをコードする目的とする核酸がＤＮＡであってもよくまたは逆もまた同様である。

【0049】

さらに、前記少なくとも１つの目的とする核酸は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡから成る群から選択されてもよい。前記目的とする核酸は、ＤＮＡ、例えば、目的とする遺伝子をコードするプラスミドであってもよい。前記目的とする核酸は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする核酸配列であってもよい。

【0050】

前記細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞であってもよい。

【0051】

前記方法は、閉鎖系で実施されてもよい。

【0052】

閉鎖系で実施される前記方法は、自動化された方法であってもよい。

【0053】

閉鎖系に関する例は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ、ＷＯ２００９／０７２００３）である。

【0054】

ＳＯＣＳ１核酸は、ＳＯＣＳ１タンパクと比較して類似の特性を有するＳＯＣＳ１ファミリーの別のメンバー、例えば、ＳＯＣＳ３およびＣＩＳによって置き換えられてもよく、これらもＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路の活性化を阻害する（ＬｉａｎｇらＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４年、４４：１２６５～１２７５ページ）。

【0055】

定義
別に定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0056】

「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）に対する総称である。核酸（核酸配列）は、ヌクレオチドの直鎖ポリマーである。各ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン核酸塩基（塩基）、五炭糖、およびリン酸基の３つの構成要素から成る。核酸塩基および糖から成る部分構造は、ヌクレオシドと呼ばれる。核酸の種類は、それらのヌクレオチド中の糖の構造が異なり、ＤＮＡは２’－デオキシリボースを含む一方で、ＲＮＡはリボースを含む。また、２つの核酸の種類に見られる核酸塩基も異なり、アデニン、シトシン、およびグアニンはＲＮＡおよびＤＮＡの両方に見られるが、チミンはＤＮＡで生じ、ウラシルはＲＮＡで生じる。

【0057】

アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）に加えて、ＤＮＡおよびＲＮＡは修飾された塩基も含むことが可能である。ＤＮＡにおける最も一般的な修飾塩基は、５－メチルシトシン（ｍ^５Ｃ）である。ＲＮＡには多くの修飾塩基が存在し、ヌクレオシドに含まれるものプソイドウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、イノシン（Ｉ）、および７－メチルグアノシン（ｍ^７Ｇ）が挙げられる。

【0058】

「修飾リボヌクレオシド」という用語は、標準的なグアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シチジン（Ｃ）、およびウリジン（Ｕ）ヌクレオシド以外のリボヌクレオシドを指す。そのような修飾は、例えば、哺乳動物細胞ｍＲＮＡに対する転写後修飾によって自然に生じることがある。インビトロにおいて転写されるｍＲＮＡに関して、修飾ＲＮＡを作製するために合成ヌクレオチドも使用することができる。

【0059】

修飾ヌクレオシドは、好ましくは５’－メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンである。使用することができる他のヌクレオシドは、これらに限定されるものではないが、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’－０－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、２’－０－メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－０－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－０－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－０－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’－０－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’－０－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、およびイノシン（Ｉ）である。

【0060】

ポリアデニル化は、ポリ（Ａ）テールのＲＮＡ、好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への付加である。ポリ（Ａ）テールは、複数のアデノシン一リン酸から成り、言い換えると、これは、アデニン塩基のみを有するＲＮＡの伸張部である。真核生物において、ポリアデニル化は、翻訳のために成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するプロセスの一部である。したがって、これは、遺伝子発現のより大きなプロセスの一部を形成する。通常、真核生物のｍＲＮＡは、５’キャップを含む。この５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ、またはＲＮＡ ｍ^７Ｇキャップとも呼ばれる）は、転写の開始直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「前」または５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドと５’－５’三リン酸結合を介して連結される末端７－メチルグアノシン残基から成る。この存在は、リボソームによる認識およびリボヌクレアーゼからの保護に重要である。本明細書に記載され、本発明に使用されるｍＲＮＡは、５’キャップを有する。自然に生じるキャップ構造は、最初に転写されるヌクレオチドの５’末端と三リン酸架橋により連結される７－メチルグアノシンを含み、結果としてＮが任意のヌクレオシドであるｍ^７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎのジヌクレオチドキャップが生じる。５’末端ヌクレオシドは、一般にグアノシンであり、その他のすべてのヌクレオチドに対して逆向きにあり、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。インビトロにおいて転写されるＲＮＡにキャップ構造を導入するために酵素反応を使用することに加えて、インビトロにおける転写中に既にキャップ構造を導入させるためにキャップアナログを使用することができる。

【0061】

そのようなキャップアナログは、２’または３’ＯＨ基が－ＯＣＨ_３で置換されている、いわゆるアンチリバースキャップアナログ（「ＡＲＣＡ」）であってもよい。

【0062】

「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」または「をコードしている（ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ）」という用語は、互換的に使用することができる。「コードすること」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の定義された配列などの他の巨大分子の合成のための鋳型として働くための遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の特性を指す。このように、その遺伝子と対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。「ポリペプチドをコードする核酸（配列）」は、互いの縮重バージョンであり同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。

【0063】

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞においてプロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳と定義される。

【0064】

サイトカインシグナル抑制因子１は、ヒトにおいてＳＯＣＳ１遺伝子（ＳＯＣＳ１）によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサー（ＳＯＣＳ）としても知られているＳＴＡＴ誘導ＳＴＡＴインヒビター（ＳＳＩ）ファミリーのメンバーをコードする。ＳＳＩファミリーメンバーは、サイトカインシグナル伝達のサイトカイン誘導型の負の制御因子である。この遺伝子の発現は、ＩＬ２、ＩＬ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＧＭ－ＣＳＦ、およびインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）を含むサイトカインのサブセットによって誘導され得る。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、サイトカインレセプターの下流で機能し、サイトカインシグナル伝達を減じる負のフィードバックループに関与する。

【0065】

「ＳＯＣＳ１をコードする核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、その遺伝子と対応するｍＲＮＡの転写および／または翻訳が細胞において実施される場合に完全なＳＯＣＳ１タンパクまたは機能的なそのフラグメントをコードするあらゆる核酸（配列）を指す。

【0066】

ＳＯＣＳ１ペプチドが機能的ＳＯＣＳ１完全長タンパクに代替しうることが示された（Ｈｅ，Ｃら、Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２０１５年；）。

【0067】

ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、ヒト、マウス、ラットまたはヒツジなどの哺乳動物由来の核酸配列（例えば、哺乳動物ＳＯＣＳ１をコードするｍＲＮＡ）であってもよく、好ましくは、ＳＯＣＳ１コードする核酸はＳＯＣＳ１のヒト配列（例えば、ヒトＳＯＣＳ１をコードするｍＲＮＡ）である。

【0068】

「目的とする核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、ＳＯＣＳ１をコードする核酸とともに細胞に共導入されることが意図されるあらゆる核酸、核酸配列または核酸ポリマーを指す。前記目的とする核酸は、ＤＮＡ分子、例えば、目的とする遺伝子またはｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ分子であってもよい。目的とする核酸が目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡである場合、「目的とするポリペプチドをコードする目的とする核酸」という表現も本明細書で使用される場合がある。前記ポリペプチドは、完全長タンパクであっても、または機能的なそのフラグメントであってもよい。

【0069】

「共導入すること」という用語は、本明細書で使用される場合、いくつかの核酸（ＳＯＣＳ１をコードする核酸および少なくとも１つの目的とする核酸）を細胞に導入する意図を指す。エレクトロポレーションまたはリポフェクションまたは化学的化合物によるトランスフェクションまたはウイルスによるトランスダクションなどの核酸を細胞に導入するためのいくつかの物理的または化学的または生物学的方法が当該技術分野において周知である。

【0070】

ＳＯＣＳ１をコードする核酸が存在し、それが、目的とする核酸によるさらなるトランスフェクションの間に細胞においてＳＯＣＳ１タンパクに翻訳される限り、少なくとも１回反復されるトランスフェクション（何回かのトランスフェクション）のうちの１回のトランスフェクションにおいて少なくとも１つの目的とする核酸とともに細胞にＳＯＣＳ１をコードする核酸が共導入されれば十分である。本発明の一実施形態において、核酸は、１回のトランスダクションまたはトランスフェクションのうちに導入される。本発明の別の実施形態において、ＳＯＣＳ１をコードする核酸は、少なくとも２つの核酸が、少なくとも７２ｈ、４８ｈ、３６ｈ、２４ｈ、１８ｈ、１２ｈ、６ｈ、４ｈ、２ｈまたは１ｈの同じ時間内に細胞に存在する限り、例えば、少なくとも１つの目的とする核酸の細胞への導入前または後に別に導入されてもよい。

【0071】

本明細書で開示されている方法において、いくつかの核酸を培地に添加することと関連した「同時の（同時に）」という用語は、「共導入すること」と同じ意味を有するため、いくつかの核酸の細胞培地への連続的な（ただし、１回のトランスダクションまたはトランスフェクションまたはエレクトロポレーションプロセスのうちの）添加も「同時の（同時に）」という用語に包含される。

【0072】

トランスフェクションは、核酸を細胞に計画的に導入するプロセスである。「反復トランスフェクション」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、細胞培養培地中における同じ細胞の２回以上のトランスフェクションを指す。細胞の培養中に細胞を反復してトランスフェクションするために、トランスフェクションされる核酸が細胞または細胞培地に反復して添加される必要がある。本明細書で開示されている方法において、
ａ）ＳＯＣＳ１をコードする核酸と、同時にまたは続いて
ｂ）少なくとも１つの目的とするポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸と；
を細胞または細胞培地に添加するステップであって、少なくともステップｂ）は少なくとも１回反復される、ステップを反復する期間（継続時間）は、４時間から４８時間の間、好ましくは６時間から３６時間の間、より好ましくは６時間から２４時間の間または毎日の１回の反復であってもよい。ただし、一般にトランスフェクションプロセス間で任意の継続時間（または期間）が選択されてもよい。

【0073】

いくつかの種類のトランスフェクション試薬は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ）または他のものなどが商業的に入手可能である。トランスフェクション試薬としては、ポリカチオン性化合物（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ－Ｌ－リジンまたはＤＥＡＥ－デキストランなど）、リン酸カルシウムまたは荷電した脂質およびポリマーを含有するリポソーム製剤（ＤＯＴＡＰ［Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルスルフェート］、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）などの化学的化合物およびそれらの組合せ、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）は、ポリカチオン性脂質、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、およびＤＯＰＥの３：１（ｗ／ｗ）混合物であるなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＳＯＣＳ１をコードする核酸および少なくとも１つの目的とする核酸は、上記のトランスフェクション試薬を使用することによって、または当業者に既知で、細胞をトランスフェクションするのに適した任意のトランスフェクション試薬を使用することによって細胞に送達することができる。

【0074】

トランスフェクションの効率という用語は、本明細書で使用される場合、目的とする核酸の発現レベルおよび／または全体的な細胞生存および／またはトランスフェクション率の側面を含む。

【0075】

エレクトロポレーションという用語は、細胞に電場をかけ、それにより細胞膜の完全性を壊し、核酸のような分子が細胞に入るのを可能にするプロセスのことである。細胞膜の完全性を失うことは細胞にとって致命的であり得、エレクトロポレーション条件はトランスフェクション効率と細胞生存の間でバランスがとれていなければならない。ＳＯＣＳ１核酸を細胞に導入することにより細胞生存を改善することにより、さらに高いトランスフェクション率の達成が可能になる。

【0076】

増大した効率または効率を増大させることという用語は、全体的な細胞生存が改善されるおよび／または発現レベルが増大するおよび／またはトランスフェクション率が改善されるという事実を示す。

【0077】

「細胞培養培地」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞維持に必要とされる化学的条件を提供する液体を含む。細胞（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を支援することができる化学的条件の例としては、以下に限定されるものではないが、細胞培養培地に定期的に供給される（または手作業で与えられてもよい）溶液、バッファー、血清、血清成分、栄養素、ビタミン、サイトカインおよび他の成長因子が挙げられる。細胞を培養するために使用するのに適した培地および特別な用途のための培地、例えば、初代細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング用の特別な培地が当該技術分野において知られている。

【0078】

本明細書で使用される場合、「培養すること」という用語は、細胞維持に必要とされる化学的および物理的条件（例えば、温度、ガス）、ならびに成長因子を提供することを含む。細胞を培養することは、細胞に増殖（増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ））のための条件を提供することを含む場合が多い。細胞増殖を支援することができる化学的条件の例としては、以下に限定されるものではないが、細胞増殖に適した細胞培養培地に定期的に供給される（または手作業で与えられてもよい）バッファー、血清、栄養素、ビタミン、抗生剤、サイトカインおよび他の成長因子が挙げられる。細胞の維持および／または増殖のための培地は、当該技術分野において周知である。

【0079】

対象から直接培養された細胞は、初代細胞として知られている。腫瘍由来の一部を除いて、大半の初代細胞培養物は寿命が限られている。

【0080】

体細胞は生物の体を形成するあらゆる生体細胞、すなわち、多細胞生物における、配偶子、胚細胞、生殖母細胞または未分化の幹細胞以外のあらゆる細胞である。

【0081】

「リプログラミング因子」という用語は、本明細書で使用される場合、転写を変えるよう細胞に作用し、発現時に、体細胞を異なる細胞種、または複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）もしくは多能性にリプログラミングする１つまたは複数の生物学的に活性なポリペプチドまたはそれをコードする核酸あるいは小分子を指す。

【0082】

人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても知られている）は、新生児および成体初代細胞から直接形成され得る多能性幹細胞の１タイプである。ｉＰＳＣは、一般に特定のセットの多能性関連遺伝子、または「リプログラミング因子」を所与の細胞種に導入することに由来する。リプログラミング因子の本来のセット（山中因子とも呼ばれる）は、遺伝子Ｏｃｔ４（Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、およびＫｌｆ４である。この組合せはｉＰＳＣを作製する際に最も一般的なものであるが、これらの因子のそれぞれは、関連転写因子、ｍｉＲＮＡ、小分子、またはさらには系列指定子（ｌｉｎｅａｇｅ ｓｐｅｃｉｆｉｅｒ）などの非関連遺伝子によって機能的に置換されてもよい。リプログラミング混合物はまた、リプログラミングの効率を向上させるためにさらなるリプログラミング因子によって修正されてもよい。

【0083】

分化因子は、胚性幹細胞またはｉＰＳＣなどのより多能性の細胞の、線維芽細胞、神経細胞または心筋細胞のような分化細胞などのあまり多能性でない細胞への分化を促進する転写因子であることが多い。しかし、分化因子は、分化細胞の別の細胞分化細胞種への分化（分化転換（ｔｒａｎｓ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ））を促進する転写因子である場合もある。

【0084】

「分化転換」という用語は、系列リプログラミング（ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）としても知られている。これは、中間の多能性状態または前駆細胞種を経ることなくある成熟体細胞が別の成熟体細胞に転換するプロセスである。

【0085】

「閉鎖系」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞培養物の汚染のリスクを低減する一方で新しい材料の導入などの培養プロセスを実施し、増殖、分化、活性化、遺伝子修飾および／または細胞の分離などの細胞培養ステップを実施するあらゆる閉鎖系を指す。そのような系は、ＧＭＰまたはＧＭＰ様条件（「無菌」）下で操作することを可能にし、結果として臨床的に適切な細胞組成物をもたらす。

【0086】

閉鎖系に関する例は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、ドイツ、ＷＯ２００９／０７２００３）である。

【0087】

「自動化された方法」または「自動化プロセス」という用語は、本明細書で使用される場合、装置および／またはコンピュータおよびコンピュータソフトウェアの使用により自動化され、そうでなければ操作者によって手作業で実施されるであろう、または実施できるであろうあらゆるプロセスを指す。自動化された方法（プロセス）は、実現するために必要とされる人間の介入および人間の時間が少ない。ある場合には、方法の少なくとも１つのステップが全く人間の支援または介入なしに実施される場合、方法は自動化されている。好ましくは、方法のすべてのステップが人間の支援または介入なしに実施される場合に、方法は自動化されている。

【0088】

実施形態
本発明の一実施形態において、本明細書で開示されている方法に使用される目的とする核酸は、例えば、分化した初代細胞（例えば、以下に限定されるものではないが、ヒト線維芽細胞、腎上皮細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞）のｉＰＳＣへのリプログラミングに使用される転写因子（例えば、Ｏｃｔ３／４、ｃ－ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ）をコードする核酸である。目的とする核酸は、ｍＲＮＡとして提供され、リプログラミングされる細胞をトランスフェクションするのに適したトランスフェクション試薬を使用して送達される。トランスフェクションされる目的とするｍＲＮＡに対するＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、ｍＲＮＡの反復トランスフェクションによって引き起こされる自然免疫活性化による大量の細胞死を防ぐ。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、導入されたｍＲＮＡの発現レベルを増大させることもでき、それにより初代細胞のリプログラミングの効率を高める。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、他の免疫抑制化合物の培地への添加の必要性をなくす。好ましくは、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡおよび目的とするｍＲＮＡの両方は、少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する。

【0089】

本発明の一実施形態において、本明細書に記載される実施形態に使用されるｍＲＮＡは、使用される核酸がｍＲＮＡである場合、修飾核酸塩基を有してもよい。本発明の一実施形態において、使用されるｍＲＮＡにおいて、塩基シトシン／ウラシルのうちの０％から２５％が、修飾シトシン／ウラシルであってもよい。

【0090】

本発明の一実施形態において、本明細書で開示されている方法に使用される目的とする核酸は、例えば、分化した初代細胞（例えば、以下に限定されるものではないが、ヒト線維芽細胞、腎上皮細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞）のｉＰＳＣへのリプログラミングに使用される転写因子（例えば、Ｏｃｔ３／４、ｃ－ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ）である。目的とする核酸は、例えば、エピソームプラスミド内のＤＮＡとして提供され、リプログラミングされる細胞をトランスフェクションするのに適したトランスフェクション試薬を使用して送達される。トランスフェクションプロセスの間のＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、外因的に添加されたＤＮＡによって引き起こされる自然免疫活性化による大量の細胞死を防ぐ。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、導入されたＤＮＡプラスミドの発現レベルを増大させることもでき、それにより初代細胞のリプログラミングの効率を高める。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加は、他の免疫抑制化合物の培地への添加の必要性をなくす。好ましくは、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡは、少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する。

【0091】

本発明の一実施形態において、本明細書で開示されている方法に使用される目的とする核酸は、例えば、分化した初代細胞（例えば、以下に限定されるものではないが、ヒト線維芽細胞、腎上皮細胞、内皮細胞、間葉系幹細胞）のｉＰＳＣへのリプログラミングに使用される転写因子（例えば、Ｏｃｔ３／４、ｃ－ｍｙｃ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ）である。目的とする核酸は、ｍＲＮＡとしてまたは、例えば、プラスミド内のＤＮＡとして提供されてもよく、例えば、リプログラミングされる細胞をトランスフェクションするのに適したトランスフェクション試薬を使用して送達される。トランスフェクションプロセスの間のＳＯＣＳ１をコードするＤＮＡの添加は、外因的に添加されたｍＲＮＡまたはＤＮＡによって引き起こされる自然免疫活性化による大量の細胞死を防ぐ。ＳＯＣＳ１をコードするＤＮＡの添加は、目的とする核酸を含む導入されたＤＮＡプラスミドの発現レベルを増大させることもでき、それにより、初代細胞のリプログラミングの効率を高める。ＳＯＣＳ１をコードするＤＮＡの添加は、他の免疫抑制化合物の培地への添加の必要性をなくす。好ましくは、目的とする核酸がｍＲＮＡである場合、目的とするｍＲＮＡは、少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する。

【0092】

本発明の一実施形態において、目的とする核酸は、体細胞の異なる細胞種への分化転換、例えば、ＭｙｏＤ ｍＲＮＡまたはＭｙｏＤをコードするＤＮＡによる線維芽細胞の骨格筋細胞への反復トランスフェクションに必要な１つまたは複数の転写因子である。分化転換はまた、反復トランスフェクションを使用することによって達成することができ、細胞死を誘導することまたは望ましくない細胞シグナル伝達経路を活性化することによって分化転換の試みに対抗する自然免疫経路の活性化が同時に起こる。当該技術分野において、自然免疫経路の活性化を抑制するためにＢ１８Ｒタンパクの添加が使用される。

【0093】

トランスフェクションプロセスの間のＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸の添加は、ｍＲＮＡの反復トランスフェクションによって引き起こされる自然免疫活性化による大量の細胞死を防ぐ。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡなどのＳＯＣＳ１をコードする核酸の添加は、導入されたｍＲＮＡまたはＤＮＡの発現レベルを増大させることもでき、それにより、体細胞の異なる細胞種への分化転換の効率を高める。好ましくは、ｍＲＮＡが使用される場合、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡおよび目的とするｍＲＮＡの両方は、少なくとも１５００、より好ましくは少なくとも２０００のアデニンを含むポリ（Ａ）テールを有する。

【0094】

本発明の一実施形態において、本明細書で開示されているＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加はまた、特定の転写因子例えば、Ａｓｃｌ１、Ｂｒｎ２、ＮｅｕｒｏＤ１および／またはＭｙｔ１ｌ）を前記細胞に導入することによる、その細胞の神経細胞またはその前駆細胞への分化転換のための神経転写因子を細胞（例えば、線維芽細胞）へ添加する効果を増大させるために使用することができる。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡはまた、さまざまな転写因子（例えば、ＧＡＴＡ４、Ｍｅｆ２ｃ、Ｔｂｘ５）の導入により細胞（例えば、線維芽細胞）の心筋細胞への分化転換に対して使用することができる。

【0095】

本発明の一実施形態において、目的とする核酸は、当該技術分野において既知のエレクトロポレーション手順を使用したエレクトロポレーションによって細胞に送達される。核酸を細胞に添加し、電場をかけて細胞膜を破壊して、核酸が細胞に入るのを可能にすることによって、ｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとしての前記ＳＯＣＳ核酸とともに目的とする核酸がｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして送達される。外来性の核酸に対して有効な自然免疫反応を有する細胞にはＳＯＣＳ１核酸の使用が好ましい。例えば、プラスミドＤＮＡのＴ細胞へのエレクトロポレーション後に大量の細胞死が生じることは当該技術分野において周知である。

【0096】

本発明の一実施形態において、細胞生存を高めるために、細胞に対して有毒である可能性のあるｍＲＮＡ、ｓｈＳＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはプラスミドＤＮＡの送達にＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの添加が使用される。有毒な可能性のある核酸が細胞に入る前に、ＳＯＣＳ１タンパクまたはフラグメントの翻訳およびサイトカイン分泌の抑制を可能にするために、有毒な可能性のある核酸はまた、ＳＯＣＳ１核酸に続いて利用されてもよいであろう。反復されるトランスフェクションは冗長（ｔｅｄｉｏｕｓ）であるため、同時に細胞ストレスが生じる。

【0097】

好ましい実施形態において、エレクトロポレーションは、閉鎖系で実施される。

【実施例】

【0098】

以降に、本発明が、例を参照してより詳細に具体的に記載されるが、本発明を限定する意図はない。

【実施例1】

【0099】

ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの存在下におけるＧＦＰ発現
修飾ヌクレオチド、プソイドウリジンおよび５－メチルシチジンの存在下においてＴ７ポリメラーゼ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用したインビトロにおける転写によってＳＯＣＳ１およびＢ１８Ｒ ｍＲＮＡを形成した。インビトロにおいて転写されたｍＲＮＡを、ワクシニアウイルスキャッピング酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用してキャッピングした。ポリＡテールを酵母ポリＡポリメラーゼ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して付加した。ＳＯＣＳ１およびＢ１８Ｒ ｍＲＮＡのポリＡテールは、およそ１５００のアデニン塩基を含んでいた。転写に無修飾ヌクレオチドのみを使用したことおよびポリＡテールが少なくとも３０００ヌクレオチド（ｎｔ）を含んでいたことを除いて、ＧＦＰ ｍＲＮＡを同様に形成した。ヒト新生児の包皮線維芽細胞（ＢＪ）を、漸増量のＢ１８ＲまたはＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの存在下において、供給業者の説明書に従ってＳｔｅｍＭＡＣＳ ｍＲＮＡトランスフェクションキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）を使用して、インビトロにおいて転写されたＧＦＰによりトランスフェクションした。トランスフェクションの４ｈ後に培地を変えた。対照に関しては、ＳＯＣＳ１またはＢ１８Ｒ ｍＲＮＡの添加をせず、Ｂ１８Ｒタンパク（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下または非存在下においてＧＦＰ ｍＲＮＡをトランスフェクションした。

【0100】

線維芽細胞を３日間毎日トランスフェクションした。４日目に、１つの細胞懸濁液をフローサイトメトリー分析に供し、細胞生存率（ヨウ化プロピジウムを使用して）、ＧＦＰ発現レベル（ＦＩＴＣ平均）ならびに陽性細胞％（ヨウ化プロピジウム陰性細胞に対してゲートした）を求めた。

【0101】

ＧＦＰ ｍＲＮＡ単独による毎日のトランスフェクションの結果、Ｂ１８Ｒタンパクを含んでいたが、ＧＦＰ発現レベルは低くなり、このレベルは、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの存在下においては有意に増加したが、Ｂ１８Ｒ ｍＲＮＡの存在下においては有意に増加しなかった（図１）。ＧＦＰおよびＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡでコトランスフェクションした細胞のＭＦＩは、ＧＦＰおよびＢ１８Ｒ ｍＲＮＡでコトランスフェクションした細胞と比較して高く、ＧＦＰ ｍＲＮＡでのみトランスフェクションした細胞と同等であった。このＭＦＩは、Ｂ１８Ｒタンパクの存在下であるがＧＦＰ ｍＲＮＡでのみ３回トランスフェクションした細胞のＭＦＩに近い。

【0102】

この実験は、Ｂ１８Ｒタンパクの抗ウイルス活性にもかかわらず、Ｂ１８Ｒ ｍＲＮＡが自然免疫の活性化から細胞を救出することができないことを示している。自然免疫応答の誘導は、ＧＦＰ発現レベルを低減させる。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡは、ＧＦＰ発現レベルを有意に増加させることが可能である。

【実施例2】

【0103】

ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡを使用した線維芽細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング
ヒト新生児の包皮線維芽細胞（ＢＪ）をさまざまな細胞密度で播種し、Ｏｃｔ４：Ｓｏｘ２：Ｋｌｆ４：Ｌｉｎ２８：ｃ－ｍｙｃ：Ｎａｎｏｇ：核ｅＧＦＰを含むｍＲＮＡ混合物（すべてのｍＲＮＡが２０００ｎｔ超のポリＡテールを含むものとした）を使用してトランスフェクションした。その細胞を、連続的な５日間毎日２回のトランスフェクション（６ｈ間隔）の短縮したリプログラミングプロトコールを使用してトランスフェクションした。培地をトランスフェクションの直前に交換した。ある条件では、公開されたプロトコール（２００ｎｇ／ｍｌ）で使用されるとおりＢ１８Ｒタンパクを培地に補充し、他の条件では、２０００ｎｔ超のポリＡテールを含むＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡをｍＲＮＡの混合物に添加し、同時にトランスフェクションした。形成されたｉＰＳＣを、１４日目（最初のトランスフェクションの１３日後）に多能性マーカーであるＯｃｔ３／４を使用したｉＰＳＣコロニーの細胞内染色によって特定した。形成されたｉＰＳＣの数およびサイズは、Ｂ１８Ｒタンパクの使用と比較してＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡでトランスフェクションした細胞の場合により大きかった（図２を参照）。

【実施例3】

【0104】

無修飾または２５％修飾ｍＲＮＡを使用した線維芽細胞の人工多能性幹細胞へのリプログラミング
ヒト新生児の包皮線維芽細胞を、マトリゲルコーティングプレートに播種し、２０００ｎｔ超のポリＡテールを有する修飾ｍＲＮＡ（ＲＮＡを作製するためにインビトロにおける転写に使用される７５％ウリジンおよび２５％プソイドウリジン、７５％シチジンおよび２５％５－メチルシチジン）または無修飾ｍＲＮＡのいずれかを含むｍＲＮＡ混合物でトランスフェクションした。両混合物は、ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡを含むものとした。ｉＰＳＣコロニーを、各トランスフェクションの前の培地交換を伴う５日間の毎日２回のトランスフェクションを使用した新しく開発したプロトコールを使用して形成した。最初のコロニーは、１０日目に検出でき、１４日目（最初のトランスフェクションの１３日後）に染色した。コロニーを、多能性マーカーとしてＯｃｔ３／４を使用した細胞内染色によって特定した。ｉＰＳＣ形成の効率は、無修飾ｍＲＮＡを使用するときに有意に増大する（図３を参照）。

【実施例4】

【0105】

リプログラミング効率に対するポリ（Ａ）の長さの影響
ヒト新生児の包皮線維芽細胞を、マトリゲルコーティングプレートに播種し、２５％修飾ｍＲＮＡ（ＲＮＡを作製するためにインビトロにおける転写に使用される７５％ウリジンおよび２５％プソイドウリジン、７５％シチジンおよび２５％５－メチルシチジン）および２０００ｎｔより短いまたは２０００ｎｔより長いポリ（Ａ）テールを含むｍＲＮＡ混合物でトランスフェクションした。リプログラミング因子のｍＲＮＡを含むすべての混合物にＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡを添加した。ｉＰＳＣコロニーを、各トランスフェクションの前の培地交換を伴う５日間の毎日２回のトランスフェクションを使用した新しく開発したプロトコールを使用して形成した。最初のコロニーは、１０日目に検出でき、１４日目（最初のトランスフェクションの１３日後）に染色した。コロニーを、多能性マーカーとしてＯｃｔ３／４を使用した細胞内染色によって特定した。２０００ｎｔ超のポリ（Ａ）の両方の種類のｍＲＮＡ（リプログラミング因子およびＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡ）を含む混合物のみ、トランスフェクションを１０回実施したときにｉＰＳＣコロニーを生じた（図４を参照）。

【実施例5】

【0106】

ＧＦＰ発現に対するポリ（Ａ）の長さの影響
ＨｅＬａ細胞を播種し、ＴｒａｎｓＩＴトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して短いポリ（Ａ）テール（５００ｎｔ未満）または長いポリ（Ａ）テール（５００ｎｔ超）のいずれかを含むＧＦＰ ｍＲＮＡでトランスフェクションした。細胞を２４ｈ培養し、フローサイトメトリーによる評価を使用した定量化のために回収した。長いポリ（Ａ）テールを有するＧＦＰ ｍＲＮＡのトランスフェクションは、より高いパーセンテージの形質導入細胞およびより高い平均蛍光指数（ＭＦＩ）によって示されるより高いＧＦＰ発現レベルをもたらした（図５を参照）。

【実施例6】

【0107】

ｅＧＦＰプラスミドＤＮＡのＴ細胞へのエレクトロポレーション後の細胞生存力およびトランスフェクション率に対するＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡの効果
ヒトＴ細胞を、ｐａｎ Ｔ細胞単離キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。単離したＴ細胞を４８ウェルプレート中、２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＰｒｏｌｅｕｋｉｎ Ｓ（Ｉｌ２）（ＥＤ_５０は≦０．３ｎｇ／ｍＬである^＊≧３．０×１０^６ＩＵ／ｍｇ（ＮＩＢＳＣ８６／５０４で較正した）または≧１×１０^７ＩＵ／ｍｇ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で較正した）の比活性度に相当する）ならびに５０から１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリンおよび５０から１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの最終濃度でペニシリンストレプトマイシンを補充した０．５ｍｌのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）に１．９×１０^６細胞で播種し、３７℃および５％ＣＯ_２で培養した。エレクトロポレーションの３日前に、Ｔ細胞を、１：２００（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ ＣＤ３試薬）および１：４００（ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ ＣＤ２８試薬）の推奨される力価でＭＡＣＳ（登録商標）ＧＭＰ ＴｒａｎｓＡｃｔ ＣＤ３／ＣＤ２８キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して活性化した。３７℃および５％ＣＯ_２における３日間の培養後に、Ｔ細胞を回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、再び３００×ｇで遠心分離した。細胞を、１０^７細胞／ｍｌで１００μｌのバッファーＭ（５ｍＭ ＫＣｌ；１５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；１２０ｍＭ ＮＡ_２ＨＰＯ_４／ＮａＨ_２ＰＯ_４ ｐＨ７．２；５０ｍＭマンニトール）に再懸濁した。その細胞懸濁液を、Ｓｏｃｓ１ ｍＲＮＡを含まない２μｇのｅＧＦＰコードプラスミド（対照）と混合するか、あるいはそれぞれ約１４００ヌクレオチド長または約４８００ヌクレオチド長のいずれかのポリＡテールを含む０．５μｇのＳｏｃｓ１ ｍＲＮＡと混合し、すぐにエレクトロポレーションキュベットに移した。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡは、無修飾ヌクレオチド、すなわち、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルのみを含むものとした。

【0108】

Ｔ細胞を、プログラムＴ－０２３を使用したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）においてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＰｒｏｌｅｕｋｉｎ Ｓ（Ｉｌ２）（ＥＤ_５０は≦０．３ｎｇ／ｍＬである^＊≧３．０×１０^６ＩＵ／ｍｇ（ＮＩＢＳＣ８６／５０４で較正した）または≧１×１０^７ＩＵ／ｍｇ（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）で較正した）の比活性度に相当する）ならびに５０から１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌペニシリンおよび５０から１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンの最終濃度でペニシリンストレプトマイシンを補充した０．５ｍｌのＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を入れた４８ウェルプレートにすぐに移し、３７℃および５％ＣＯ_２で２日間培養した。Ｔ細胞を回収し、３００×ｇで１０分間遠心分離した。フローサイトメトリー分析のために、細胞を４０μｌのＰＥＢ（ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水）、２０μｌのＦＣＲ－Ｂｌｏｃｋ、および５０μｌの抗体染色カクテル（ＣＤ４－ＶｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ８－ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ６９－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＡＰＣ０７）に再懸濁した。４℃で暗所において１０分間インキュベーションした後に、細胞を、３００×ｇで１０分間遠心分離し、０．５ｍｌのＰＥＢに再懸濁した。フローサイトメトリー分析の直前に、ヨウ化プロピジウムを１μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。２５μｌの細胞懸濁液を、ＭＡＣＳｑｕａｎｔフローサイトメーターにおいて分析した。

【0109】

Ｔ細胞生存率をヨウ化プロピジウム染色により求め、ｅＧＦＰ発現をＡＰＣチャネルにおける蛍光検出によって監視した。ＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡを含まないｅＧＦＰプラスミドの対照エレクトロポレーション（図６Ａ）は、結果として５８％の生細胞をもたらし、生細胞のうちの５５％がｅＧＦＰ陽性であった。ｅＧＦＰプラスミドおよび約１４００ヌクレオチドのポリＡを含むＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡのコエレクトロポレーションによって、細胞の６８％が生存可能であり、生細胞のうちの５１％がｅＧＦＰ陽性であった（図６Ｂ）。驚くべきことに、ｅＧＦＰプラスミドおよび約４８００ヌクレオチドのポリＡを含むＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡのコエレクトロポレーションによって、細胞生存率が７０％にまで増加し、生細胞のうちのｅＧＦＰ陽性細胞の割合も６１％にまで増加した（図６Ｃ）。

【0110】

明らかに、それぞれのｍＲＮＡのエレクトロポレーション後のＳＯＣＳ１発現は、プラスミドＤＮＡでエレクトロポレーションしたＴ細胞の生存を高めている。さらに、エレクトロポレーションしたＳＯＣＳ１ ｍＲＮＡに使用したより長いポリＡテールは、トランスフェクション率、すなわち、目的とする遺伝子を発現している細胞の割合を増大した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】