(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-03-31
(45)【発行日】2022-04-08
(54)【発明の名称】ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/32 20060101AFI20220401BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20220401BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20220401BHJP
C12P 17/18 20060101ALI20220401BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/32
G01N33/48 M
G01N33/68
C12P17/18 D
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2019503937
(86)(22)【出願日】2017-07-27
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2019-09-12
(86)【国際出願番号】 EP2017068985
(87)【国際公開番号】W WO2018019927
(87)【国際公開日】2018-02-01
【審査請求日】2020-07-27
(31)【優先権主張番号】1657324
(32)【優先日】2016-07-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(73)【特許権者】
【識別番号】518443845
【氏名又は名称】アドヴァンスト・バイオデザイン
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】セイラン、イズマル
(72)【発明者】
【氏名】マルタン、ギヨーム
(72)【発明者】
【氏名】カーシュ、ジェラルド
(72)【発明者】
【氏名】ペレズ－アレア、ミレイディズ
(72)【発明者】
【氏名】フールネ、ギュイ
【審査官】西垣 歩美
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０６４３９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５０６８５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１１－１８４３０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５２３４７６（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０３６９７３８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Jacek Wierzchowski，Anal Biochem，1997年，245(1)，69-78
【文献】Hossein Eshghi，Dyes and Pigments，2011年，89 ，120－126
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００
Ｃ１２Ｑ １／００－３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはプロピオネート、レチノエート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
【化1】
を含む、ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質。
【請求項2】
Ａ－ＯＨは、７－ヒドロキシクマリン、トーキョーグリーンファミリーの発蛍光団、特に２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン（Ｔｏｋｙｏ Ｇｒｅｅｎ）、レゾルフィンおよびフルオレセインから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の特異的基質。
【請求項3】
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ１であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、プロピオネート、レチノエートまたはヘキサノエートを形成するために選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の特異的基質。
【請求項4】
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ３であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、オクタノエート、４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートまたはベンゾエートを形成するために選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の特異的基質。
【請求項5】
前記ＡＬＤＨアイソザイムは細胞集団で検出されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の特異的基質。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む組成物。
【請求項7】
請求項１～５のいずれか１項に記載の特異的基質を含む診断用組成物。
【請求項8】
請求項１～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む、細胞集団中の少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを定量するための組成物。
【請求項9】
請求項１～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む、少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムの発現に従って細胞集団の全部または一部を選別するための組成物。
【請求項10】
ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを伴う疾患の診断のための請求項７に記載の診断用組成物。
【請求項11】
前記疾患が、癌、精子運動障害、虚血、頭部外傷または膵炎の中から選択される、請求項１０に記載の診断用組成物。
【請求項12】
対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するための、請求項７に記載のマーカーの診断用組成物。
【請求項13】
請求項１から５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む、健常な幹細胞を癌幹細胞と区別するための組成物。
【請求項14】
幹細胞を固形癌および／または血液悪性腫瘍と区別するための請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
請求項１から５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む、癌の異なる段階または幹細胞の分化の異なる段階を特徴付けるための組成物。
【請求項16】
請求項１～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含む、細胞集団において少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を識別する方法に使用するための組成物であって、前記方法が、
（ａ）前記細胞集団を前記少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）前記細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が前記少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の前記細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む、組成物。
【請求項17】
請求項１～５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの特異的基質を含むＡＬＤＨアイソザイムを定量化するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質、少なくとも１つのそのような基質を含む組成物、そのような基質を含む診断マーカー、ならびにそれらに関連する使用および方法に関する。
【背景技術】
【0002】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）は、アルデヒドの酸化（脱水素化）を触媒する一群の酵素である。今日までに、ＡＬＤＨをコードする１９個の遺伝子がヒトゲノムにおいて識別されている。これらの遺伝子は、外因的および内因的に生成されたアルデヒドの解毒を含む多種多様な生物学的過程に関与している。ＡＬＤＨは、サイトゾル、ミトコンドリア、小胞体、および核を含むすべての細胞内領域に見られ、それらの多くは複数のコンパートメントに見られる。ほとんどのＡＬＤＨは広い組織分布を持ち、異なる基質特異性を示す。
【0003】
一般的に解毒酵素と考えられている、ＡＬＤＨは、アルデヒド誘発性細胞傷害に対して保護することが示されている。ＡＬＤＨはまた、胚形成および発生などの生理学的機能および過程において中心的な役割を果たす。
【0004】
特に、ＡＬＤＨ１アイソザイムは、レチノイン酸シグナル伝達を媒介することによって胚形成および発生において中心的な役割を果たす。それはまたメチオナールの解毒にも関与し、一方で、ＡＬＤＨ３は、４－ヒドロキシノナールのそれに関与し、ここで、両化合物は内因性のアポプトジェニックアルデヒドである。ＡＬＤＨ１およびＡＬＤＨ３はまた、眼球組織における損傷を誘発するＵＶ照射に対する細胞防御メカニズムにも関連する。ＡＬＤＨ２アイソザイムは、主にアルコール代謝の第二段階におけるアセトアルデヒドの解毒に関連するミトコンドリアイソザイムである。
【0005】
２０年以上前に、いくつかのＡＬＤＨアイソザイムがこれらの細胞の重要な要素として識別されてきたので、ＡＬＤＨは、正常および癌幹細胞の普遍的なマーカーとしてのそれらの潜在的な使用について研究された。例えば、ＡＬＤＨ１は、造血幹細胞が多いことが示されており、それらを単離するために使用され得る。
【0006】
それらの高いＡＬＤＨ活性を介して幹細胞を識別および単離するために使用される一般的な方法は、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）試験（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の使用である。このＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）試験は、ＡＬＤＨの多くのアイソザイムによって代謝され得る蛍光基質を使用する。
【0007】
この試験では、ＡＬＤＨの基質：ＢＯＤＩＰＹ－アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）は、細胞内に蓄積し、緑色の発光によってそれらの蛍光を増加させるＡＬＤＨの存在下でＢＯＤＩＰＹ－アミノ酢酸に変換される。
【0008】
しかし、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲ（商標）はＡＬＤＨの異なるアイソザイムを区別しない。
【0009】
活発な研究にもかかわらず、幹細胞または腫瘍学のような異なる領域におけるＡＬＤＨの異なるアイソザイムの役割は謎のままである。細胞表現型の制御および発生中、組織の恒常性または修復、ならびに発癌の過程におけるさまざまなアイソザイムの代謝を理解することは、組織生物学において重要な展望を開く可能性がある。
【0010】
したがって、ＡＬＤＨの異なるアイソザイムに特異的な新しい基質を識別する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0011】
これに関連して、本発明の発明者らは、その新たな特異的基質を開発することによって、ＡＬＤＨの異なるアイソザイムを識別するためのツールを発見した。
【0012】
したがって、本発明の目的は、以下の化合物を含むＡＬＤＨアイソザイムのための特異的基質である。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
（式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される。）。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
【化1】
【0013】
したがって、以下の化合物を含むＡＬＤＨアイソザイムについての特異的基質が記載される。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
（式中、
・同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択され、および、
・Ａ－ＯＨは蛍光トレーサーである。）。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
【化2】
・同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択され、および、
・Ａ－ＯＨは蛍光トレーサーである。）。
【0014】
したがって、Ａは、後者が、遊離の場合には蛍光トレーサーであるＡ－ＯＨのエステル化形態である。
【0015】
本発明はまた、細胞集団中のＡＬＤＨアイソザイムを定量化するための本発明による特異的基質の使用に関する。
【0016】
本発明はまた、健常な幹細胞を癌幹細胞から区別するための本発明による特異的基質の使用に関する。
【0017】
本発明はまた、癌の異なる段階または幹細胞分化の異なる段階を特徴付けるための本発明による特異的基質の使用に関する。
【0018】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質を含む組成物に関する。
【0019】
本発明はまた、本発明による特異的基質を含む診断マーカーに関する。
【0020】
本発明はまた、ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを伴う疾患の診断のための本発明によるマーカーの使用に関する。特に、マーカーは、対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するために使用される。
【0021】
本発明はまた、細胞集団において少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を区別する方法に関し、該方法は、
（ａ）細胞集団を本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む。
（ａ）細胞集団を本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む。
【0022】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質を含むＡＬＤＨアイソザイムを定量化するためのキットに関する。
【0023】
上記のように、本発明は、以下の化合物を含むＡＬＤＨアイソザイムのための特異的基質に関する。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
（式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される。）。
（ａ）式（Ｉ）の化合物：対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
【化3】
【0024】
式（ＩＩ）の化合物はまた、以下の式を有するように記載され得る。Ｒ－ＣＯＯ－Ａ－ＯＯＣ－Ｒ’（式中、蛍光トレーサーは、式ＨＯ－Ａ－ＯＨであり、フルオレセインである。）。
【0025】
「ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質」とは、本発明の文脈において、蛍光分子（Ａ－ＯＨ）を放出することを可能にする化学反応を生じさせ、それにより特定のＡＬＤＨアイソザイムを確実に識別することを可能にするために、例えばＡＬＤＨ１またはＡＬＤＨ３などの特定のＡＬＤＨアイソザイムと特異的に相互作用する化学分子を意味する。したがって、本発明の文脈において、特異的基質は、ＡＬＤＨアイソザイムによって切断されて、蛍光トレーサーＡ－ＯＨの放出を可能にするであろう。
【0026】
本発明による特異的基質は、対応酸ＲＣＯＯＨまたはＲ’ＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる。
【0027】
例えば、酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨがプロピオン酸であるＲおよび／またはＲ’の場合、対応エステルはプロピオネートであり、その酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨがヘキサン酸であるＲおよび／またはＲ’の場合、エステルはヘキサノエートに対応し、酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨがレチノイン酸であるＲおよび／またはＲ’の場合、対応エステルはレチノエートであり、Ｒおよび／またはＲ’がその酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨが安息香酸である場合、対応エステルはベンゾエートであり、酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨが４－ジエチルアミノ安息香酸であるＲおよびＲ’の場合、対応エステルは４－ジエチルアミノベンゾエートであり、酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨが４－ヒドロキシ－２－ノネン酸であるＲおよびＲ’の場合、対応エステルは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートであり、酸ＲＣＯＯＨおよび／またはＲ’ＣＯＯＨが４－アミノブタン酸であるＲおよび／またはＲ’の場合、対応エステルは４－アミノブチレートである。
【0028】
並行して、例えば、Ｒおよび／またはＲ’がヘプチルである場合、対応エステルはオクタノエートであり、Ｒおよび／またはＲ’がエチルである場合、対応エステルはプロピオネートであり、Ｒおよび／またはＲ’がフェニルである場合、対応エステルはベンゾエートであり、Ｒおよび／またはＲ’が３－アミノプロピルである場合、対応エステルは４－アミノブチレートなどである。
【0029】
ヒドロキシル化形態のＡ（つまり、Ａ－ＯＨ）として定義される「Ａ」は、蛍光トレーサーである。Ａ－ＯＨは、特異的基質とエステルを形成して、式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａおよび（ＩＩ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ－ＯＯＣ－Ｒ’を形成し、エステル官能基の切断後、酸ＲＣＯＯＨ、および／またはＲ’ＣＯＯＨならびに蛍光トレーサーＡ－ＯＨの放出につながる。
【0030】
以下の表１は、蛍光トレーサーに結合した、本発明による置換基ＲおよびＲ’の構造を示す。表はまた、ＡＬＤＨアイソザイムに対する各基質の特異性も示す。
【表1】
【0031】
「蛍光トレーサー」とは、蛍光によって識別され得る化合物を意味する。特に、本発明による蛍光トレーサーは、蛍光色素または蛍光色素分子、すなわち励起後に蛍光を発することができる化学物質である。
【0032】
本発明の文脈では、蛍光色素分子はＡＬＤＨアイソザイムの作用下で放出されるであろう。
【0033】
フルオロフォアは当業者に周知である。（例えば、Ｍａｎａｆｉ （２０００） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６０： ２０５－２１８を参照）。
【0034】
本発明による種々の蛍光トレーサーを下記の表２に示す。
【表2】
【0035】
特に、本発明の文脈において、Ａ－ＯＨは、７－ヒドロキシクマリン、トーキョーグリーンファミリーの蛍光色素分子、特に２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン、レゾルフィンおよびフルオレセインから選択される。これらのトレーサーは、すべて当業者に知られており、市販されているかまたは当業者に周知の方法により合成され得る。
【0036】
特に、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンはまた、６－ヒドロキシ－９－（４－メトキシ－２－メチルフェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－オン、２－Ｍｅ－４－ＯＭｅトーキョーグリーンまたは２－Ｍｅ－４－ＯＭｅＴＧという名前でもある。
【0037】
したがって、本発明による特異的基質としては、以下の分子から作ることができる：レゾルフィンレチノエート、レゾルフィンプロピオネート、レゾルフィンオクタノエート、レゾルフィンベンゾエート、レゾルフィン４－アミノブチレート、レゾルフィンヘキサノエート、レゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエートまたはレゾルフィン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、７－ヒドロキシクマリンレチノエート、７－ヒドロキシクマリンプロピオネート、７－ヒドロキシクマリンオクタノエート、７－ヒドロキシクマリンベンゾエート、４－ヒドロキシクマリン４－アミノブチレート、７－ヒドロキシクマリンヘキサノエート、７－ヒドロキシクマリン４－ジエチルアミノベンゾエートまたは７－ヒドロキシクマリン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンレチノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンプロピオネート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンオクタノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンベンゾエート、４－アミノブチレート２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン、２－メチル－４－メトキシヘキサノエートトーキョーグリーン、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－ジエチルアミノベンゾエートまたは２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンまたは４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、フルオレセインジ－レチノエート、フルオレセインジ－プロピオネート、フルオレセインジ－オクタノエート、フルオレセインジ－ベンゾエート、フルオレセインジ－４－アミノブチレート、フルオレセインジ－ヘキサノエート、フルオレセインジ－４－ジエチルアミノベンゾエートまたはフルオレセインジ－４－ヒドロキシ－２－ノネノエート。
【0038】
前述のように、「ＡＬＤＨ」は「アルデヒドデヒドロゲナーゼ」に使用され、構成的および誘導形態で存在する一群のデヒドロゲナーゼ様酵素を表す。
【0039】
ヒトにおいて、１９個のＡＬＤＨが識別されており、その中には多くの遺伝子が含まれている。それらはサブグループに分けられる：ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＡＬＤＨ１Ｂ１、ＡＬＤＨ１Ｌ１およびＡＬＤＨ１Ｌ２を含むＡＬＤＨ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ３Ａ１、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＡＬＤＨ３Ｂ１およびＡＬＤＨ３Ｂ２を含むＡＬＤＨ３、ＡＬＤＨ４、ＡＬＤＨ５、ＡＬＤＨ６、ＡＬＤＨ７、ＡＬＤＨ８、ＡＬＤＨ９、ＡＬＤＨ１６、ならびにＡＬＤＨ１８。
【0040】
特に、本発明による特異的基質は、ＡＬＤＨ１またはＡＬＤＨ３についての特異的基質である。
【0041】
本発明の一実施形態によれば、ＡＬＤＨアイソザイムが、ＡＬＤＨ１である場合、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、ヘキサノエートまたはプロピオネートを形成するために選択される。
【0042】
特に、ＡＬＤＨアイソザイムが、ＡＬＤＨ１である場合、本発明による特異的基質は、レゾルフィンレチノエート、レゾルフィンヘキサノエート、レゾルフィンプロピオネート、７－ヒドロキシクマリンレチノエート、７－ヒドロキシクマリンヘキサノエート、７－ヒドロキシクマリンプロピオネート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンレチノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンヘキサノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンプロピオネート、フルオレセインジ－レチノエート、フルオレセインジプロピオネート、フルオレセインジ－ヘキサノエートの中から選択される。
【0043】
本発明の別の実施形態によれば、ＡＬＤＨアイソザイムが、ＡＬＤＨ３である場合、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、オクタノエート、４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートまたはベンゾエートを得るために選択される。
【0044】
特に、ＡＬＤＨアイソザイムがＡＬＤＨ３である場合、本発明による特異的基質は、レゾルフィンオクタノエート、レゾルフィン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、レゾルフィンベンゾエート、レゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエート、７－ヒドロキシクマリンオクタノエート、７－ヒドロキシクマリン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、７－ヒドロキシクマリンベンゾエート、７－ヒドロキシクマリン４－ジエチルアミノベンゾエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンオクタノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンベンゾエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンヘキサノエート、フルオレセインジ－オクタノエート、フルオレセインジ－４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、フルオレセインジ－ベンゾエートおよびフルオレセインジ－４－ジエチルアミノベンゾエートの中から選択される。
【0045】
本発明の別の実施形態によれば、ＡＬＤＨアイソザイムが、ＡＬＤＨ９である場合、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、４－アミノブチレートを得るために選択される。
【0046】
特に、ＡＬＤＨアイソザイムがＡＬＤＨ９である場合、本発明による特異的基質は、レゾルフィン４－アミノブチレート、７－ヒドロキシクマリン４－アミノブチレートおよび２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－アミノブチレート、フルオレセインジ－４－アミノブチレートの中から選択される。
【0047】
これらの態様のうちの１つによれば、本発明はまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質を含む組成物に関する。
【0048】
したがって、本発明による組成物は、本発明による１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９個またはそれ以上の特異的基質を含む。
【0049】
したがって、この組成物は、ＡＬＤＨのいくつかのアイソザイムを検出しそして直接識別することを可能にする。例えば、組成物は、ＡＤＬＨ１の特異的基質とＡＬＤＨ３についての特異的基質、またはＡＬＤＨ１およびＡＬＤＨ９についての特異的基質、またはＡＬＤＨ３およびＡＬＤＨ９についての特異的基質、またはＡＬＤＨ１、ＡＬＤＨ３およびＡＬＤＨ９についての特異的基質を含む。
【0050】
したがって、本発明による組成物としては、例えば、以下の１つ以上の特異的基質を含む：レゾルフィンレチノエート、レゾルフィンプロピオネート、レゾルフィンオクタノエート、レゾルフィンベンゾエート、レゾルフィン４－アミノブチレート、レゾルフィンヘキサノエートまたはレゾルフィン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、レゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエート、７－ヒドロキシクマリンレチノエート、７－ヒドロキシクマリンプロピオネート、７－ヒドロキシクマリンオクタノエート、７－ヒドロキシクマリンベンゾエート、７－ヒドロキシクマリン４－アミノブチレート、７－ヒドロキシクマリンヘキサノエートまたは７－ヒドロキシクマリン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、７－ヒドロキシクマリン４－ジエチルアミノベンゾエート、２－メチル－４－メトキシトーキョーグリーン、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンプロピオネート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンオクタノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンベンゾエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－アミノブチレート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーンヘキサノエートまたは２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン４－ジエチルアミノベンゾエート、フルオレセインジ－レチノエート、フルオレセインジプロピオネート、フルオレセインジ－オクタノエート、フルオレセインジ－ベンゾエート、フルオレセインジ－４－アミノブチレート、フルオレセインジ－ヘキサノエートまたはフルオレセインジ－４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、フルオレセインジ－４－ジエチルアミノベンゾエート。
【0051】
特に、本発明による特異的基質は、ＡＤＬＨアイソザイムが細胞集団内で検出されることを特徴とする。
【0052】
「細胞集団」とは、同じ起源または異なる起源の、それらの特徴（遺伝子配列、発現レベル、分化状態）が同一のまたは異なる一組の細胞を意味する。特に、細胞集団は、少なくとも２個の細胞、例えば１０、１００、１０００または１００００００個の細胞を含む。
【0053】
したがって、本発明の一実施形態によれば、特異的基質は、蛍光プレート技術、フローサイトメトリー技術および／または免疫蛍光技術の使用によってｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで検出される。
【0054】
本発明による特異的基質は、異なるＡＬＤＨアイソザイムを識別するのに有用である。それらは、特に、異なるＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞（例えば、ある種の幹細胞）を識別すること、および、混合した集団の中のそれらの細胞をＡＬＤＨアイソザイムを発現していないもの、または同じＡＬＤＨアイソザイムでないものから区別することを可能にする。本発明による基質はまた、ＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を、それをより少ない程度で発現する細胞よりも高い程度で区別することを可能にし得る。
【0055】
したがって、本発明は、細胞集団中の少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを定量化するための本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用に関する。
【0056】
したがって、本発明はまた、ＡＬＤＨアイソザイムを過剰発現している細胞集団の一部を単離および／または選択するための本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用に関する。
【0057】
したがって、本発明はまた、少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムの発現に従って細胞集団の全部または一部を選別するための本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用に関する。
【0058】
「少なくとも１つの」ＡＬＤＨアイソザイムは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８または１９個のＡＬＤＨアイソザイムとして定義される。１９個のアイソザイムは上記に記載されている。
【0059】
本発明による「少なくとも１つの」特異的基質は、前述と同じ意味を有する。
【0060】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用を含む、細胞集団中の少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを定量化するための方法に関する。
【0061】
定量化は、蛍光プレート技術を用いて実施することができる。ＡＬＤＨの異なるアイソザイムの識別および／または定量化は、異なる細胞型を区別および／または識別することを可能にする。
【0062】
したがって、本発明はまた、健常な幹細胞を癌幹細胞から区別するための本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用に関する。
【0063】
それはまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用を含む、健常な幹細胞を癌幹細胞から区別する方法に関する。
【0064】
この方法および使用はまた、例えば蛍光を有する細胞を単離する工程を含むことによってこれらの細胞を単離することを可能にする。
【0065】
例えば、「癌幹細胞」は、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、頭頸部、肝臓、肺、膵臓、前立腺、卵巣の癌の幹細胞、白血病の幹細胞を意味する。
【0066】
特に、本発明による特異的基質は、幹細胞を固形癌および／または血液悪性腫瘍から区別するために使用される。
【0067】
例えば、「固形癌」は乳癌、肺癌または前立腺癌を意味する。
【0068】
「血液悪性腫瘍」とは、例えば白血病、リンパ腫または骨髄腫を意味する。
【0069】
特に、目的の幹細胞は、癌性または健常な造血細胞である。異なるＡＬＤＨアイソザイムの識別および／または定量化はまた、疾患または細胞分化の異なる段階を特徴付けることを可能にする。
【0070】
したがって、本発明はまた、癌の異なる段階または幹細胞分化の異なる段階を特徴付けるための本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用に関する。
【0071】
それはまた、本発明による少なくとも１つの特異的基質の使用を含む、癌のさまざまな段階または幹細胞分化の異なる段階を特徴付けるための方法に関する。
【0072】
「幹細胞の分化の異なる段階」とは、当業者に周知の段階、特に以下の段階を意味する：未分化細胞、低分化細胞、中分化細胞、および高分化細胞。
【0073】
「癌の異なる段階」とは、当業者に周知の段階、特に以下の段階を意味する：腫瘍または未分化癌、腫瘍または低分化癌、腫瘍または中分化癌、腫瘍または高分化癌。
【0074】
本発明による特異的基質は、異なるＡＬＤＨアイソザイムの識別および／または定量化を可能にすることにより診断マーカーとして有用である。
【0075】
それゆえ、本発明はまた、本発明による特異的基質を含む診断マーカーに関する。
【0076】
「診断マーカー」とは、当業者によってこれらの用語に一般に帰される意味、すなわち診断を確認または無効にすることを可能にする特徴的な要素を意味する。
【0077】
本発明の一実施形態によれば、本発明による診断マーカーは本発明による特異的基質である。
【0078】
したがって、本発明はまた、ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを伴う疾患の診断のための本発明によるマーカーの使用に関する。
【0079】
それはまた、本発明によるマーカーの使用を含む、ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを含む疾患を診断するための方法に関する。
【0080】
ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを含む疾患は、いわゆる正常発現、すなわち健常な対象において観察される発現に関して、アイソザイムが患者において過剰発現または過少発現されることを意味する疾患である。
【0081】
「過剰発現された」または「過剰発現」とは、健常な対象の発現率よりも大きい、病気の対象における発現率を意味する。
【0082】
「過少発現された」または「過少発現」とは、健常な対象の発現率よりも低い、患者における発現率を意味する。
【0083】
そのような疾患は、癌、精子運動障害、虚血、頭部外傷または膵炎から選択され得る。
【0084】
「癌」とは、例えば、白血病、乳癌または肺癌を意味する。
【0085】
「精子運動障害」は、精子が女性の子宮頸管、子宮管および卵管を移動して通過することができる割合に影響を及ぼす障害を意味する。
【0086】
本発明はまた、対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するための本発明によるマーカーの使用に関する。
【0087】
それはまた、本発明によるマーカーの使用を含む、対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するための方法に関する。
【0088】
本発明の文脈において、「対象」は、哺乳動物、動物またはヒトなどの温血動物、特にヒトを指す。対象は、健常な対象、または本発明の範囲内の記載される１つ以上の疾患および／もしくは状態に罹患しているか、またはそれらに罹患する可能性を有する対象であり得る。
【0089】
「ＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法」とは、その直接的または間接的な標的が１つのＡＬＤＨアイソザイム、例えばＡＬＤＨ１、ＡＬＤＨ３、ＡＬＤＨ９またはいくつかのＡＬＤＨアイソザイムである療法を意味する。
【0090】
「癌幹細胞に対する療法」とは、その標的が癌幹細胞であり、その特徴のうちの１つが高レベルのＡＬＤＨである療法を意味する。
【0091】
これらの態様のうちの１つによれば、本発明はまた、細胞集団において少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を区別する方法に関し、該方法は、
（ａ）細胞集団を本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が前記少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の前記細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む。
（ａ）細胞集団を本発明による少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が前記少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の前記細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む。
【0092】
「接触させる」とは、特に、本発明による少なくとも１つの特異的基質の、数分、例えば３０分から数時間、例えば４時間以上の範囲の規定された時間の細胞集団とのインキュベーションを意味する。
【0093】
「細胞集団」は上記で定義した通りである。「少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイム」および「１つの本発明による少なくとも特異的基質」は上記で定義した通りである。
【0094】
蛍光の測定は、当業者に知られている任意の方法によって実施することができる。例として、蛍光光度計、フローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡の使用を挙げることができる。
【0095】
「集団が特異的基質と接触させられる前の細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光」とは、研究対象の細胞集団の蛍光が、本発明による特異的基質と接触させられた前のこの同じ細胞集団の蛍光よりも大きいことを意味する。
【0096】
少なくとも２つの異なるＡＬＤＨアイソザイムについての少なくとも２つの特異的基質を細胞集団と接触させる場合、方法は、細胞の少なくとも２つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を区別することを含む追加の工程ｄ）も含み得る。
【0097】
この区別は、例えば、検出されたアイソザイムに応じて異なる蛍光色を観察することによって行うことができる。
【0098】
例えば、細胞集団をレゾルフィンレチノエートおよび７－ヒドロキシクマリンオクタノエートと接触させることを含む場合、増加した赤色蛍光を有する細胞は増加したＡＬＤＨ１を発現するとして識別される一方、増加した青色蛍光を有する細胞はＡＬＤＨ３を発現するとして識別される。
【0099】
これらの態様のうちの１つによれば、本発明はまた、特にＡＬＤＨアイソザイムを定量化するための、より詳細には細胞集団中のＡＬＤＨアイソザイムを定量化するための、本発明による少なくとも１つの特異的基質を含む、本発明の文脈において言及されるさまざまな使用のためのキットに関する。
【0100】
キットはまた、対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するために、健常幹細胞を癌幹細胞から区別するために、例えば、幹細胞を固形癌および／または血液悪性腫瘍と区別するために、あるいは癌のさまざまな段階または幹細胞分化のさまざまな段階を特徴付けるために、ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを含む疾患を診断するためのキットであり得、ここで、疾患は、例えば、癌、精子運動障害、虚血、頭部外傷または膵炎から選択される。
【0101】
本発明によるキットは、例えば、ＡＬＤＨアイソザイムの量を決定するためのキットの使用説明書も含み得、特に細胞集団において、ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを含む疾患の診断について、対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定し、健常な癌幹細胞を区別し、または癌のさまざまな段階もしくは幹細胞分化のさまざまな段階を特徴付ける。
【0102】
本発明によるキットに含まれるさまざまな化合物は、固体の形態（例えば凍結乾燥）または液体形態で提供されてもよい。
【0103】
本発明のキットは、各化合物に対して異なる容器（例えば、アンプル、試験管、バイアルまたはボトル）を任意に含み得る。各化合物は通常その容器に等分されるかまたは濃縮形態で提供される。本発明の文脈において記載された方法の特定の工程を実施するための他の適切な容器もまた提供され得る。
【0104】
本発明は、以下の図および実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２およびＡＬＤＨ３Ａ１上のレゾルフィンプロピオネートのＫｍおよびＶｍａｘを決定するためのミカエリス－メンテンプロット。
【図2】ＲＮＡを妨害するＡＬＤＨ１Ａ１で処理した後のレゾルフィンプロピオネートによるＡＬＤＨ１活性の試験。
【図3】ＡＬＤＨ１および３の阻害剤で処理した後のレゾルフィンプロピオネートによるＡＬＤＨ１活性の試験。
【図4】レゾルフィンプロピオネートによるフローサイトメトリーにより検出されたＡＬＤＨ１活性。
【図5】レチノイン酸処理後のレゾルフィンレチノエートとフルオレセインジ－レチノエートによるＡＬＤＨ１活性とレゾルフィンベンゾエートとフルオレセインジベンゾエートによるＡＬＤＨ３の試験。
【図6】ジスルフィラム（Ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ）（ＤＳＦ）処理後のレゾルフィンレチノエートとフルオレセインジ－レチノエートによるＡＬＤＨ１活性とレゾルフィンベンゾエートとフルオレセインジベンゾエートによるＡＬＤＨ３の試験。
【発明を実施するための形態】
【0106】
（実施例）
１．本発明による特異的基質の調製
操作条件
ＣａＨ２上で不活性雰囲気下でジクロロメタンを蒸留したことを除いて、市販の試薬および溶媒（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍなど）を精製せずに使用した。反応は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌシリカゲルＡＬＵＧＲＡＭ ＳＩＬ Ｇ ／ ＵＶ ２５４（厚さ０．２ｍｍ）で被覆されたアルミニウムシート上の薄層クロマトグラフィーによってモニターし、プレートの観察は２５４および３１２ｎｍの紫外線ランプ下で行った。
１．本発明による特異的基質の調製
操作条件
ＣａＨ２上で不活性雰囲気下でジクロロメタンを蒸留したことを除いて、市販の試薬および溶媒（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍなど）を精製せずに使用した。反応は、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌシリカゲルＡＬＵＧＲＡＭ ＳＩＬ Ｇ ／ ＵＶ ２５４（厚さ０．２ｍｍ）で被覆されたアルミニウムシート上の薄層クロマトグラフィーによってモニターし、プレートの観察は２５４および３１２ｎｍの紫外線ランプ下で行った。
【0107】
カラムクロマトグラフィーは、大気圧下でＭａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌシリカゲル６０Ｍ（４０～６３μｍ）で行った。
【0108】
融点はＴｏｔｔｏｌｉＢｕｃｈｉＳＭＰ－２０装置を用いて測定され、補正されなかった。
【0109】
１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＡＬＳ３００またはＤＲＸ３００ ３００ＭＨｚ装置を用いて記録した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｃｋｅｒ ＤＲＸ３００ ７５ＭＨｚ装置で得られた。化学シフトδは百万分の一（ｐｐｍ）の重量部で表され、溶媒の残留ピークを内部基準とした。結合定数ＪはＨｚで表される。
【0110】
質量スペクトルは、エレクトロスプレー源（ＥＳＩ）を備えたハイブリッド飛行時間型質量分析計（ＭｉｃｒｏＴＯＦＱ－ＩＩ、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ブレーメン）でポジティブモードで記録した。
【0111】
スプレーガス流は０．４バールでありそして毛管電圧は３５００ボルトであった。溶液を１％ギ酸を含む溶媒混合物（メタノール／ジクロロメタン／水４５／４０／１５）中で１０μｌ／分で灌流した。アッセイの質量範囲は５０～１０００ｍ－ｚであり、較正はギ酸ナトリウムを用いて実施した。
【0112】
本発明による特異的基質の構造例
【表3】
【0113】
レゾルフィンエステル
レゾルフィンプロピオネートおよびベンゾエート
化合物は、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、２当量）の存在下、ジクロロメタン（０．０５Ｍ）中の対応酸塩化物（２当量）を用いてレゾルフィン（ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ）から調製した。
レゾルフィンプロピオネートおよびベンゾエート
化合物は、ＤＩＰＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン、２当量）の存在下、ジクロロメタン（０．０５Ｍ）中の対応酸塩化物（２当量）を用いてレゾルフィン（ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ）から調製した。
【0114】
プロピオネートについては、２０ｍＬの無水ＤＣＭ中のレゾルフィンナトリウム塩（２３５．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の懸濁液に室温でＤＩＰＥＡ（２当量）が加えられ、次に０℃で塩化プロピオニル（２当量）を滴下した。０℃で５分後、反応媒体を室温にし、そして一夜撹拌する。次いで、３０ｍＬの水を加え、３×３０ｍＬのＤＣＭで抽出した。合わせた有機相を３０ｍｌのＮａＨＣＯ３飽和溶液、次いで３０ｍｌのＮａＣｌ飽和溶液で洗浄した。溶媒をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させた後、残渣をＥｔＯＨに溶解した。超音波処理を行い、得られた固体を焼結し、ＥｔＯＨで洗浄した（２回）。真空乾燥後、２１８ｍｇ（８１％）のオレンジ色の固体が得られた。
【0115】
Ｍｐ １７６－１７７°Ｃ （ＥｔＯＨ） （Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ １９６５， ３７， １２０－１２３：１７７°Ｃ）； １ＨＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．１５ （ｔ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ２７０．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋．
重量：２６９．２ｇ．ｍｏｌ－１．
式：Ｃ１５Ｈ１１ＮＯ４
重量：２６９．２ｇ．ｍｏｌ－１．
式：Ｃ１５Ｈ１１ＮＯ４
【化4】
【0116】
ベンゾエートついては、その手順はプロピオネートのそれと同一である。塩化ベンゾイルを使用した（スケール：１．０ｍｍｏｌ）。単離した固体（１６６ｍｇ）をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／９９）で精製して、１５６ｍｇ（４９％）の純粋なベンゾエートを得た。
【0117】
Ｍｐ ＞ ２１０°Ｃ （Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ ｅｔ ａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ １９６５， ３７， １２０－１２３： ２０３°Ｃ）； １ＨＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．２１ － ８．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ７．９５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８４ － ７．７５ （ｍ， １Ｈ）， ７．６２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １１．７， １０．５， ８．１ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．４４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３３ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ３１８．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋ ．
重量：３１７．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１９Ｈ１１ＮＯ４
重量：３１７．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１９Ｈ１１ＮＯ４
【化5】
【0118】
レゾルフィンヘキサノエートおよびオクタノエート
対応酸塩化物を使用して、上記の２つのエステルと同じ方法で化合物を調製し単離した。得られたそれぞれの収率は６５％および８１％である。
対応酸塩化物を使用して、上記の２つのエステルと同じ方法で化合物を調製し単離した。得られたそれぞれの収率は６５％および８１％である。
【0119】
ヘキサノエートについては、その手順はプロピオネートのそれと同一である。塩化ヘキサノイル（スケール：１．０ｍｍｏｌ）を使用した。得られた化合物をＥｔＯＨ中で沈殿させ、続いてＥｔＯＨで２回洗浄することにより単離した、収率６５％。
【0120】
Ｍｐ １３０－１３２°Ｃ； １ＨＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７５ － １．５７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４３ － １．２５ （ｍ， ４Ｈ）， ０．９０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ３１２．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋．
重量：３１１．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１８Ｈ１７ＮＯ４
重量：３１１．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１８Ｈ１７ＮＯ４
【化6】
【0121】
オクタノエートについては、その手順はプロピオネートのそれと同一である。塩化オクタノイル（スケール：１．０ｍｍｏｌ）を使用した。得られた化合物をＥｔＯＨ中で沈殿させ、続いてＥｔＯＨで２回洗浄することにより単離した、収率８１％。
【0122】
Ｍｐ １２７－１２９°Ｃ； １ＨＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．８９ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．５７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３９ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２３ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７２ － １．５７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４４ － １．１９ （ｍ， ８Ｈ）， ０．８７ （ｔ， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， ３Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ３４０．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋．
重量：３３９．４ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４
重量：３３９．４ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４
【化7】
【0123】
レゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエート
レゾルフィンのナトリウム塩（２３５．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４－ジエチルアミノ安息香酸（１．１当量）、ＥＤＣＩ（１．１当量）および４－ＤＭＡＰ（０．１当量）をアルゴン下に置いた。２５ｍｌのＤＣＭを添加し、そして反応媒体を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／９９～２．５／８７．５）により精製し、２番目のカラム（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／９９）によって除去される、ごくわずかな不純物（可視ＵＶ）を有する生成物２０７ｍｇ（５３％）を得る。Ｍｐ ２０６－２０８°Ｃ；１Ｈ ＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ３８９．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋．
重量：３８８．４ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ４
レゾルフィンのナトリウム塩（２３５．２ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、４－ジエチルアミノ安息香酸（１．１当量）、ＥＤＣＩ（１．１当量）および４－ＤＭＡＰ（０．１当量）をアルゴン下に置いた。２５ｍｌのＤＣＭを添加し、そして反応媒体を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／９９～２．５／８７．５）により精製し、２番目のカラム（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／９９）によって除去される、ごくわずかな不純物（可視ＵＶ）を有する生成物２０７ｍｇ（５３％）を得る。Ｍｐ ２０６－２０８°Ｃ；１Ｈ ＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ７．９２ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ７．５９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．３５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８５ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．７９ （ｄ， Ｊ ＝ ９．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．１４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ， ６Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ３８９．１ ［Ｍ＋Ｈ］＋．
重量：３８８．４ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２３Ｈ２０Ｎ２Ｏ４
【化8】
【0124】
（すべて）レゾルフィンのトランスレチノエート
市販のレチノイン酸を使用して、前述のエステルと同じ方法で化合物を調製した（収率４０％）。得られた粗生成物（橙赤色固体）をＭｅＯＨで洗浄し、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／９９）によって精製した。さらにＥｔＯＨ、次いでＭｅＯＨで洗浄して１００ｍｇ（４０％）の純粋な生成物を得た。Ｍｐ １５０－１６０ （分解）； １ＨＲＭＮ（３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．８２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２５ － ７．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ６．８９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４６ － ６．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．２６ － ６．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．００ （ｓ， １Ｈ）， ２．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．１０－２．００ （ｍ， ５Ｈ）， １．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．７０ － １．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５４ － １．４６ （ｍ， ２Ｈ）， １．０６ （ｓ， ６Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ４９６．２ ［Ｍ＋Ｈ＋］．
重量：４９５．６ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３２Ｈ３３ＮＯ４
市販のレチノイン酸を使用して、前述のエステルと同じ方法で化合物を調製した（収率４０％）。得られた粗生成物（橙赤色固体）をＭｅＯＨで洗浄し、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／９９）によって精製した。さらにＥｔＯＨ、次いでＭｅＯＨで洗浄して１００ｍｇ（４０％）の純粋な生成物を得た。Ｍｐ １５０－１６０ （分解）； １ＨＲＭＮ（３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．８２ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２５ － ７．１０ （ｍ， ３Ｈ）， ６．８９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．８， ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４６ － ６．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ６．２６ － ６．１４ （ｍ， ２Ｈ）， ６．００ （ｓ， １Ｈ）， ２．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．９ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．１０－２．００ （ｍ， ５Ｈ）， １．７５ （ｄ， Ｊ ＝ ０．６ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．７０ － １．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．５４ － １．４６ （ｍ， ２Ｈ）， １．０６ （ｓ， ６Ｈ）； ＥＳＩ－ＭＳ ｍ／ｚ ４９６．２ ［Ｍ＋Ｈ＋］．
重量：４９５．６ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３２Ｈ３３ＮＯ４
【化9】
【0125】
トーキョー－グリーンエステル
２－Ｍｅ－４－ＭｅＯトーキョー－グリーン（ＣＡＳ Ｎｏ．６４３７５５－８４－４：６－ヒドロキシ－９－（４－メトキシ－２－メチルフェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－オン）を２段階で合成し：「Ｊ． Ｂｉｏｌ． ＣｈｅｍＶｏｌ． ２６４， Ｎｏ． １４． Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｙ １５， ＰＰ． ８１７１－８１７８， １９８９」の文献に記載の手順に従って行われた市販の３．６－ジヒドロキシキサンタ－９－オンのビスシリル化は、３．６－ビス（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）キサントンを導く。２－ブロモ－３－メトキシトルエンからのマグネシウムによる処理とそれに続く酸加水分解からなる、文献「Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． ２０１４， ２０， ４４７－４５５」に記載の手順により行われた第２工程により、２－Ｍｅ－４－ＭｅＯトーキョーグリーンを得る。
２－Ｍｅ－４－ＭｅＯトーキョー－グリーン（ＣＡＳ Ｎｏ．６４３７５５－８４－４：６－ヒドロキシ－９－（４－メトキシ－２－メチルフェニル）－３Ｈ－キサンテン－３－オン）を２段階で合成し：「Ｊ． Ｂｉｏｌ． ＣｈｅｍＶｏｌ． ２６４， Ｎｏ． １４． Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ｍａｙ １５， ＰＰ． ８１７１－８１７８， １９８９」の文献に記載の手順に従って行われた市販の３．６－ジヒドロキシキサンタ－９－オンのビスシリル化は、３．６－ビス（ｔ－ブチルジメチルシリルオキシ）キサントンを導く。２－ブロモ－３－メトキシトルエンからのマグネシウムによる処理とそれに続く酸加水分解からなる、文献「Ｃｈｅｍ． Ｅｕｒ． Ｊ． ２０１４， ２０， ４４７－４５５」に記載の手順により行われた第２工程により、２－Ｍｅ－４－ＭｅＯトーキョーグリーンを得る。
【化10】
【0126】
２－Ｍｅ－４－ＭｅＯトーキョー－グリーンのヘキサノエートおよびオクタノエート
化合物は対応酸塩化物を用いて慣用的に調製された。
化合物は対応酸塩化物を用いて慣用的に調製された。
【0127】
ヘキサノエートについては、０．１５ｍｍｏｌの２－Ｍｅ－４－ＭｅＯ－ＴＧから、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／９９～１０／９０）による精製を行った、収率：４０％（非結晶化樹脂）。
【0128】
１ＨＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， Ｍｅ０Ｄ） ｅｔ ７．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１６ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０４ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．９９ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６１ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．７， １．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４４ （ｄ， Ｊ ＝ １．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０４ （ｓ， ３Ｈ）， １．８１ － １．６７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３３ （ｍ， ４Ｈ）， １．００ － ０．８９ （ｍ， ３Ｈ）．
【0129】
１３ＣＲＭＮ（１０１ ＭＨｚ， ＣＤＣＩ３） ｅｔ １８６．２３， １７１．６４， １６０．６３， １５８．８５， １５４．５４， １５３．２９， １４８．８７， １３８．０７， １３１．００， １３０．８８， １３０．５８， １２９．３８， １２４．２９， １２０．８４， １１８．８５， １１８．５６， １１６．２４， １１１．８０， １１０．３８， １０６．１８， ７７．１６， ５５．５１， ３４．４７， ３１．３２， ２４．６０， ２２．４２， ２０．１９， １４．０５；
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ４３１．１
重量：４３０．５ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２７Ｈ２６Ｏ５
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ４３１．１
重量：４３０．５ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２７Ｈ２６Ｏ５
【化11】
【0130】
オクタノエートについては、０．１９ｍｍｏｌのＴＧから、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ：１／９９～１０／９０）による精製を行った、収率：２０％（非結晶化樹脂）
【0131】
１Ｈ ＲＭＮ （３００ ＭＨｚ， Ｍｅ０Ｄ） ｅｔ ７．４６ （ｓ， １Ｈ）， ７．２５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１７ （ｄ， １ ＝ ８．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．１２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．８， １．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｃｉｄ， １ ＝ ８．４， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６２ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．７， １．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４５ （ｓ， １Ｈ）， ３．９０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６４ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．０５ （ｓ， ３Ｈ）， １．８１ － １．６７ （ｍ， ２Ｈ）， １．４９ － １．２６ （ｍ， ９Ｈ）， ０．９６ － ０．８７ （ｍ．３Ｈ）．
【0132】
１３ＣＲＭＮ（１０１ ＭＨｚ， ＣＤＣＩ３） ｅｔ １８６．２０， １７１．６６， １６０．６１， １５８．７８， １５４．４９， １３０．９２， １３０．５９， １２９．３４， １２４．３３， １２０．８９， １１８．８６， １０６．２３， ７７．１６， ５５．５１， ３４．５１， ３１．７６， ２９．１４， ２９．０２， ２４．９２， ２２．７３， ２０．１９， １４．２１．
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ ＋ Ｈ］＋： ４５９．２
重量：４８５ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２９Ｈ３０Ｏ５
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ ＋ Ｈ］＋： ４５９．２
重量：４８５ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ２９Ｈ３０Ｏ５
【化12】
【0133】
フルオレセインジエステル
同一の調製は上記の通りであり、３．０当量の対応酸塩化物および３当量の塩基を用いる。。ヘキサノエートおよびオクタノエートは既に記載されている ［ｌｉｔｔ． Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ； Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６］。
同一の調製は上記の通りであり、３．０当量の対応酸塩化物および３当量の塩基を用いる。。ヘキサノエートおよびオクタノエートは既に記載されている ［ｌｉｔｔ． Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ； Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６］。
【0134】
フルオレセインジ－ヘキサノエート
［７３６４－９０－１］スケール０．８ｍｍｏｌ、シリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：９０／１０）による精製。白色固体， 収率： ９８％。Ｍｐ １０３－１０５°Ｃ （ペンタン洗浄）（１００°Ｃ， Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ， Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６）；
［７３６４－９０－１］スケール０．８ｍｍｏｌ、シリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：９０／１０）による精製。白色固体， 収率： ９８％。Ｍｐ １０３－１０５°Ｃ （ペンタン洗浄）（１００°Ｃ， Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ， Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６）；
【0135】
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．０９ － ８．０３ （ｍ， １Ｈ）， ７．８３ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．４， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．４， １．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４４ － ７．３８ （ｍ， １Ｈ）， ７．２８ （ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６０ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．７１ － １．５８ （ｍ， ４Ｈ）， １．４０ － １．２５ （ｍ， ８Ｈ）， ０．９５ － ０．８１ （ｍ， ６Ｈ） ；
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ５２９．２
重量：５２８．９ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３２Ｈ３２Ｏ７
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ５２９．２
重量：５２８．９ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３２Ｈ３２Ｏ７
【化13】
【0136】
フルオレセインジオクタノエート
［１９７２２－８６－２］スケール０．８ｍｍｏｌ、シリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：９０／１０～８０／２０）による精製。白色固体、９２％．Ｍｐ ５０－５２°．（ｌｉｔ ４９°Ｃ， Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ， Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６）．
［１９７２２－８６－２］スケール０．８ｍｍｏｌ、シリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：９０／１０～８０／２０）による精製。白色固体、９２％．Ｍｐ ５０－５２°．（ｌｉｔ ４９°Ｃ， Ｇｅ， Ｆｅｎｇ－Ｙａｎ， Ｄｙｅｓ ａｎｄ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ ２００７， ７２ （３）， ３２２－３２６）．
【0137】
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．０９ － ８．０４ （ｍ， １Ｈ）， ７．８３ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．４， １．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．３， １．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ２．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．７０ － １．５７ （ｍ， ４Ｈ）， １．４１ － １．２０ （ｍ， １６Ｈ）， ０．９２ － ０．８１ （ｍ， ６Ｈ） ；
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ５８５．３．
重量：５８４．７ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３６Ｈ４０Ｏ７
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ５８５．３．
重量：５８４．７ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ３６Ｈ４０Ｏ７
【化14】
【0138】
フルオレセインジ－レチノエート：
化合物は、２．１当量のレチノイン酸、２．１当量のＥＤＣＩ、０．１当量の４－ＤＭＡＰから調製した。スケール：０．５ｍｍｏｌシリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：８０／２０）による精製。黄色固体、収率４５％。Ｍ．ｐ．１４５－１５０°Ｃ（ｄｅｃ）；
化合物は、２．１当量のレチノイン酸、２．１当量のＥＤＣＩ、０．１当量の４－ＤＭＡＰから調製した。スケール：０．５ｍｍｏｌシリカゲル上クロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：８０／２０）による精製。黄色固体、収率４５％。Ｍ．ｐ．１４５－１５０°Ｃ（ｄｅｃ）；
【0139】
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８９ － ７．７３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４２ （ｄ， Ｊ ＝ ７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １５．０， １１．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．９８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．８８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．５４ （ｄ， Ｊ ＝ １５．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ６．３９ － ６．１５ （ｍ， ６Ｈ）， ６．１１ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３８ （ｓ， ６Ｈ）， ２．０７ － １．９５ （ｍ， １０Ｈ）， １．７０ （ｓ， ６Ｈ）， １．６３ － １．５１ （ｍ， ４Ｈ）， １．５０ － １．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．０３ （ｓ， １２Ｈ）．
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ８９７．３
重量：８７９．１ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ６０Ｈ６４Ｏ７
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ８９７．３
重量：８７９．１ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ６０Ｈ６４Ｏ７
【化15】
【0140】
７－ヒドロキシクマリンのエステル
これらのエステルは、ＤＩＰＥＡの存在下で７－ヒドロキシクマリンおよび酸塩化物から上記と同じ方法で調製した。
これらのエステルは、ＤＩＰＥＡの存在下で７－ヒドロキシクマリンおよび酸塩化物から上記と同じ方法で調製した。
【0141】
７－ヒドロキシクマリンオクタノエート：
スケール２ｍｍｏｌ、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：７０／３０）による精製：収率９２％。Ｍｐ ５８－５９°Ｃ；
スケール２ｍｍｏｌ、シリカゲル上のクロマトグラフィー（ＰＥ／ＥｔＯＡｃ：７０／３０）による精製：収率９２％。Ｍｐ ５８－５９°Ｃ；
【0142】
１Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．７７ （ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２６ （ｄ， Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．１５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．４， ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．４８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．６１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６５ （ｓ， ２Ｈ）， １．４２ － １．２１ （ｍ， ８Ｈ）， ０．９３ － ０．８１ （ｍ， ３Ｈ）；
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ２８９．１
重量：２８８．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１７Ｈ２０Ｏ４
ＥＳＩ－ＭＳ： ［Ｍ＋Ｈ］＋： ２８９．１
重量：２８８．３ｇ．ｍｏｌ－１
式：Ｃ１７Ｈ２０Ｏ４
【化16】
【0143】
２．本発明による特異的基質の活性
材料および方法
細胞株
ＮＣＩ－Ｈ５２２およびＡ５４９肺癌細胞ならびに白血病株を使用した。細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｒｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）から入手した。
材料および方法
細胞株
ＮＣＩ－Ｈ５２２およびＡ５４９肺癌細胞ならびに白血病株を使用した。細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ）およびＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｒｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ）から入手した。
【0144】
精製された異なるアイソザイムＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２およびＡＬＤＨ３Ａ１を用いたレゾルフィンプロピオネートのＫｍおよびＶｍａｘの決定
５０μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．００；０．２Ｍ ＫＣｌ；２ｍＭ ＮＡＤＰ ＋；２ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０および７０μＭおよび０μＭの範囲のレゾルフィンプロピオネートを製造した。２．５ｍＵ／ウェルＡＬＤＨ１Ａ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｔｅｍｓ、５８６９－ＤＨ）、ＡＬＤＨ２（ａｂｃａｍ、ａｂ８７４１５）およびＡＬＤＨ３Ａ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｔｅｍｓ、６７０５－ＤＨ）の５０μＬの組換え酵素溶液を加えた。インキュベーションを＋３７℃で３０分間行い、次いで蛍光読み取りを行った（Ｅｍ：５９０ｎｍ、Ｅｘ：５３０ｎｍ）。次いで、データを放出されたレゾルフィン（ｎＭ．ｍｉｎ－１μｇ－１）に変換し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を用いてミカエリス－メンテンの式を用いてＫｍおよびＶｍａｘを計算した。
５０μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．００；０．２Ｍ ＫＣｌ；２ｍＭ ＮＡＤＰ ＋；２ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０および７０μＭおよび０μＭの範囲のレゾルフィンプロピオネートを製造した。２．５ｍＵ／ウェルＡＬＤＨ１Ａ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｔｅｍｓ、５８６９－ＤＨ）、ＡＬＤＨ２（ａｂｃａｍ、ａｂ８７４１５）およびＡＬＤＨ３Ａ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｔｅｍｓ、６７０５－ＤＨ）の５０μＬの組換え酵素溶液を加えた。インキュベーションを＋３７℃で３０分間行い、次いで蛍光読み取りを行った（Ｅｍ：５９０ｎｍ、Ｅｘ：５３０ｎｍ）。次いで、データを放出されたレゾルフィン（ｎＭ．ｍｉｎ－１μｇ－１）に変換し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０を用いてミカエリス－メンテンの式を用いてＫｍおよびＶｍａｘを計算した。
【0145】
ＡＤＬＨ１および３の特異的阻害剤による細胞の処理
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、およびそれぞれ８μＭの濃度でジメチルアンパルチオールエステル（ＤＩＭＡＴＥ）、特異的阻害剤ＡＬＤＨ１および３、モルホリノアンパルチオールエステル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｍｐａｌ ｔｈｉｏｌｅｓｔｅｒ）（ＭＡＴＥ）、ＡＬＤＨ３の特異的阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。６時間インキュベートした後、異なるＡＬＤＨの基質を、それぞれＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンプロピオネート、ＡＬＤＨ３についてはレゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエートを最終濃度１０μＭになるように添加し、次いで＋３７℃で１時間インキュベートした。次いでプレートをＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光プレートリーダー（ｅｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００）を用いて読み取った。データは、同数の細胞によって生成された相対蛍光単位で表した。
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、およびそれぞれ８μＭの濃度でジメチルアンパルチオールエステル（ＤＩＭＡＴＥ）、特異的阻害剤ＡＬＤＨ１および３、モルホリノアンパルチオールエステル（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ａｍｐａｌ ｔｈｉｏｌｅｓｔｅｒ）（ＭＡＴＥ）、ＡＬＤＨ３の特異的阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。６時間インキュベートした後、異なるＡＬＤＨの基質を、それぞれＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンプロピオネート、ＡＬＤＨ３についてはレゾルフィン４－ジエチルアミノベンゾエートを最終濃度１０μＭになるように添加し、次いで＋３７℃で１時間インキュベートした。次いでプレートをＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光プレートリーダー（ｅｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００）を用いて読み取った。データは、同数の細胞によって生成された相対蛍光単位で表した。
【0146】
ジスルフィラム（ＤＳＦ）による細胞の処理
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および２５０ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度でジスルフィラム（ＤＳＦ）、ＡＬＤＨ活性の阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。次いで細胞を１時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるＡＬＤＨの基質、ＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエート、ならびにＡＬＤＨ３についてはフルオレセインベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートを最終濃度５μＭまで添加し、次いで＋３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（レゾルフィンについてはＥｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００ｎｍ、フルオレセインについてはｅｘ＝４８５ｎｍ、ｅｍ＝５３５ｎｍ）を用いてプレートを読み取った。データは相対蛍光単位で表した。
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および２５０ｎＭおよび１０００ｎＭの濃度でジスルフィラム（ＤＳＦ）、ＡＬＤＨ活性の阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。次いで細胞を１時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるＡＬＤＨの基質、ＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエート、ならびにＡＬＤＨ３についてはフルオレセインベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートを最終濃度５μＭまで添加し、次いで＋３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（レゾルフィンについてはＥｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００ｎｍ、フルオレセインについてはｅｘ＝４８５ｎｍ、ｅｍ＝５３５ｎｍ）を用いてプレートを読み取った。データは相対蛍光単位で表した。
【0147】
レチノイン酸による細胞の処理
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および１μＭおよび１０μＭの濃度でレチノイン酸、知られたＡＬＤＨ活性の阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。次いで細胞を７２時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるＡＬＤＨの基質、ＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエート、ならびにＡＬＤＨ３についてはフルオレセインベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートを最終濃度５μＭまで添加し、次いで＋３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（レゾルフィンについてはＥｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００ｎｍ、フルオレセインについてはＥｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３５ｎｍ）を用いてプレートを読み取った。データは相対蛍光単位で表した。
９６ウェルプレートにおいて、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および１μＭおよび１０μＭの濃度でレチノイン酸、知られたＡＬＤＨ活性の阻害剤を添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中に５０，０００細胞／ウェルの濃度で、ＨＬ－６０細胞を接種した。次いで細胞を７２時間インキュベートした。インキュベーション後、異なるＡＬＤＨの基質、ＡＬＤＨ１についてはレゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエート、ならびにＡＬＤＨ３についてはフルオレセインベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートを最終濃度５μＭまで添加し、次いで＋３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）蛍光プレートリーダー、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（レゾルフィンについてはＥｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００ｎｍ、フルオレセインについてはＥｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５３５ｎｍ）を用いてプレートを読み取った。データは相対蛍光単位で表した。
【0148】
干渉ＲＮＡ ＡＬＤＨ１Ａ１による細胞の処理
Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、３７℃で一晩、６０ｍｍペトリ皿において、ＮＣＩ－Ｈ５２２細胞を、４０～５０％の集合に相当する、２５０，０００細胞／プレートの濃度で播種した。翌日、培地をＦＣＳを含まない同じ培地と交換した。次いで、トランスフェクション溶液を、ＦＣＳを含まない５００μＬの培地中で１００ｎＭに希釈することによって調製し、これに、３μＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した、ＦＣＳを含まない５００μＬの培地を加えた。次いで溶液を室温で３０分間インキュベートし、次いで細胞溶液に滴下した。混合物を５％ＣＯ２インキュベーター中で＋３７℃で８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地をＦＣＳを添加した培地に変え、細胞を４８時間培養液に置いた。タンパク質の阻害はウエスタンブロットによって確認された。次いでＡＬＤＨ１Ａ１の比活性を蛍光によりアッセイした。
Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）中、３７℃で一晩、６０ｍｍペトリ皿において、ＮＣＩ－Ｈ５２２細胞を、４０～５０％の集合に相当する、２５０，０００細胞／プレートの濃度で播種した。翌日、培地をＦＣＳを含まない同じ培地と交換した。次いで、トランスフェクション溶液を、ＦＣＳを含まない５００μＬの培地中で１００ｎＭに希釈することによって調製し、これに、３μＬのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した、ＦＣＳを含まない５００μＬの培地を加えた。次いで溶液を室温で３０分間インキュベートし、次いで細胞溶液に滴下した。混合物を５％ＣＯ２インキュベーター中で＋３７℃で８時間インキュベートした。インキュベーション後、培地をＦＣＳを添加した培地に変え、細胞を４８時間培養液に置いた。タンパク質の阻害はウエスタンブロットによって確認された。次いでＡＬＤＨ１Ａ１の比活性を蛍光によりアッセイした。
【0149】
レゾルフィンプロピオネートによるＡＬＤＨ１活性の測定
Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０μＭレゾルフィンプロピオネートを添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む１００μｌの９６ウェルプレート中に１×１０４細胞／ウェルの濃度で細胞を接種した。次に細胞を１時間インキュベートし、次にプレートをＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光プレートリーダー（ｅｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００）を用いて読み取った。データは、同数の細胞によって生成された相対蛍光単位で表した。
Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０μＭレゾルフィンプロピオネートを添加した１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む１００μｌの９６ウェルプレート中に１×１０４細胞／ウェルの濃度で細胞を接種した。次に細胞を１時間インキュベートし、次にプレートをＡｐｐｌｉｓｋａｎ蛍光プレートリーダー（ｅｘ＝５６０ｎｍ、Ｅｍ＝６００）を用いて読み取った。データは、同数の細胞によって生成された相対蛍光単位で表した。
【0150】
蛍光顕微鏡によるレゾルフィンプロピオネートとＡＬＤＨ１Ａ１の二重局在
予めエタノールで洗浄してからウェルに入れた顕微鏡用ガラス付き２４ウェルプレートに、ＮＣＩ－Ｈ５２２細胞を５０，０００細胞／ウェルの細胞濃度で添加し、次いでＬ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０％ウシ胎児血清中で、５％ＣＯ２雰囲気下、＋３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地をＤＩＭＡＴＥ（５μＭ）または処理ビヒクルのいずれかと交換し、そして６時間インキュベートした。細胞を、１０μＭのレゾルフィンプロピオネートを添加した培養培地で３０分間インキュベートし、次いで冷ＰＢＳで洗浄し、次いでパラホルムアルデヒドで３７℃で１５分間固定した。細胞を透過処理し、ＰＢＳ；３％ウシアルブミン；０．３％トリトンで１時間飽和させた。ＰＢＳで２つの工程の間に洗浄しつつ、抗ＡＬＤＨ１Ａ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＡＢ５８６９）と共に＋３７℃で１時間インキュベートした後、フルオレセインに結合した抗マウス抗体を用いて暗所で室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、顕微鏡用ガラスにＤＡＰＩを添加した脱色防止支持体を取り付けた。次いで細胞を顕微鏡下で観察した。
予めエタノールで洗浄してからウェルに入れた顕微鏡用ガラス付き２４ウェルプレートに、ＮＣＩ－Ｈ５２２細胞を５０，０００細胞／ウェルの細胞濃度で添加し、次いでＬ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地、および１０％ウシ胎児血清中で、５％ＣＯ２雰囲気下、＋３７℃で一晩インキュベートした。翌日、培地をＤＩＭＡＴＥ（５μＭ）または処理ビヒクルのいずれかと交換し、そして６時間インキュベートした。細胞を、１０μＭのレゾルフィンプロピオネートを添加した培養培地で３０分間インキュベートし、次いで冷ＰＢＳで洗浄し、次いでパラホルムアルデヒドで３７℃で１５分間固定した。細胞を透過処理し、ＰＢＳ；３％ウシアルブミン；０．３％トリトンで１時間飽和させた。ＰＢＳで２つの工程の間に洗浄しつつ、抗ＡＬＤＨ１Ａ１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＡＢ５８６９）と共に＋３７℃で１時間インキュベートした後、フルオレセインに結合した抗マウス抗体を用いて暗所で室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、顕微鏡用ガラスにＤＡＰＩを添加した脱色防止支持体を取り付けた。次いで細胞を顕微鏡下で観察した。
【0151】
フローサイトメトリーによる陽性ＡＬＤＨ１細胞の識別
６０ｍｍペトリ皿中で、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で、５％ＣＯ２雰囲気下、＋３７℃で一晩、５００，０００個の細胞をインキュベートした。陰性対照のために、細胞を、１５μＭのジメチルアンパルチオールエステル（Ｄａｔｉｍｅ）、ＡＬＤＨ１および３の特異的阻害剤を添加した培地中に溶解し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。トリプシン処理後、細胞を添加ＲＰＭＩ培地に溶解し、そして８００ｇで５分間遠心分離した。次いで細胞ペレットを１０μＭのレゾルフィンプロピオネートを含有する新鮮な添加培地に溶解し、次いでポリカーボネートチューブ中で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション後、次いで細胞を遠心分離し、次いで冷ＰＢＳ×１で洗浄し、そして最後に２００ｍＬの冷ＰＢＳ×１に溶解した。次に溶液をフローサイトメトリー（Ｅｘ ５９０ｎｍ／Ｅｍ ５６０ｎｍまたは赤色レーザー）によって分析した。
６０ｍｍペトリ皿中で、Ｌ－グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよび１０％ウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で、５％ＣＯ２雰囲気下、＋３７℃で一晩、５００，０００個の細胞をインキュベートした。陰性対照のために、細胞を、１５μＭのジメチルアンパルチオールエステル（Ｄａｔｉｍｅ）、ＡＬＤＨ１および３の特異的阻害剤を添加した培地中に溶解し、次いで３７℃、５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。トリプシン処理後、細胞を添加ＲＰＭＩ培地に溶解し、そして８００ｇで５分間遠心分離した。次いで細胞ペレットを１０μＭのレゾルフィンプロピオネートを含有する新鮮な添加培地に溶解し、次いでポリカーボネートチューブ中で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。インキュベーション後、次いで細胞を遠心分離し、次いで冷ＰＢＳ×１で洗浄し、そして最後に２００ｍＬの冷ＰＢＳ×１に溶解した。次に溶液をフローサイトメトリー（Ｅｘ ５９０ｎｍ／Ｅｍ ５６０ｎｍまたは赤色レーザー）によって分析した。
【0152】
【0153】
ＲＮＡ干渉ＡＬＤＨ１Ａ１で処理した後のレゾルフィンプロピオネートによるＡＬＤＨ１活性のアッセイの結果を図２に示し、これは、有意な（Ｐ＜０．０５）シグナルレゾルフィンプロピオネートの減少を誘発する１００ｎＭのｓｉＲＮＡでＡＬＤＨ１Ａ１の完全な阻害が観察されることを示す。
【0154】
ＡＬＤＨ１および３の阻害剤で処理した後のレゾルフィンプロピオネートによるＡＬＤＨ１活性の試験の結果を図３に示し、ＡＬＤＨ３の特異的阻害剤であるＭＡＴＥとは異なり、ＤＩＭＡＴＥ（ＡＬＤＨ１および３の阻害剤）で処理した後の蛍光の有意な阻害（Ｐ ＜０．００１）を示す。
【0155】
さらに、レゾルフィンプロピオネートの、赤色に蛍光を発する分子であるレゾルフィンへの変換は、蛍光顕微鏡により検出された。反応はＡＬＤＨ１の阻害剤であるＤＩＭＡＴＥによって阻害され、基質の特異性を示す（結果は示さず）。さらに、レゾルフィンプロピオネートの蛍光シグナルはＡＬＤＨ１Ａ１と共局在化することができることは、酵素との比活性を示唆している（結果は示さず）。
【0156】
図４は、レゾルフィンプロピオネートによるフローサイトメトリーにより検出されたＡＬＤＨ１活性を示す。未処理の状態は、陽性ＡＬＤＨ１生細胞（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）の存在を実証する。
【0157】
ＡＬＤＨ１の阻害剤であるＤＩＭＡＴＥの存在下では、処理により、生細胞について陽性のＡＬＤＨ１細胞阻害ならびに生存率の低下が観察される。
【0158】
レチノイン酸処理後のレゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエートによるＡＬＤＨ１活性、ならびにレゾルフィンベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートによるＡＬＤＨ３活性の試験の結果を図５に示し、これは、レゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエートについてのＡＬＤＨ１、ならびにレゾルフィンおよびフルオレセインジ－ベンゾエートのベンゾエートについてのＡＬＤＨ３の有意な（Ｐ＜０．００１）または（Ｐ＜０．０１）レベルの活性阻害を示す。
【0159】
２５０ｎＭおよび１０００ｎＭの両方の濃度でのＤＳＦの存在下で、レゾルフィンレチノエートおよびフルオレセインジ－レチノエートについてのＡＬＤＨ１活性ならびにレゾルフィンベンゾエートおよびフルオレセインジ－ベンゾエートについてのＡＬＤＨ３の有意な（Ｐ＜０．００１）阻害が図６に示される。
【0160】
３．基質の使用の応用
材料および方法
患者
骨髄（Ｍｏ）と血液（Ｓｇ）は啓発されたコード（ｅｎｌｉｇｈｔｅｎｅｄ ｃｈｏｒｄ）を持つ３３人の患者から得られた。評価は、赤血球または骨髄の溶解後に全血で実施した。
材料および方法
患者
骨髄（Ｍｏ）と血液（Ｓｇ）は啓発されたコード（ｅｎｌｉｇｈｔｅｎｅｄ ｃｈｏｒｄ）を持つ３３人の患者から得られた。評価は、赤血球または骨髄の溶解後に全血で実施した。
【0161】
芽細胞の単離ならびにＡＬＤＨ１およびＡＬＤＨ３活性の評価
芽細胞の単離は、表５に示す後者の表現型（ＣＤ３４＋、ＣＤ１１７＋またはＣＤ４５弱）に従ってＮａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））によって実施した。
芽細胞の単離は、表５に示す後者の表現型（ＣＤ３４＋、ＣＤ１１７＋またはＣＤ４５弱）に従ってＮａｖｉｏｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標））によって実施した。
【0162】
赤血球溶解後の血中総量または骨髄抽出液中、３７℃で３０分間、試薬：５μｍｏｌ．Ｌ－１のレゾルフィンレチノエートまたはレゾルフィンオクタノエート、および０．８μｍｏｌ．Ｌ－１のフルオレセインジ－レチノエートまたはフルオレセインジオクタノエートをインキュベートすることにより、ＡＬＤＨ１およびＡＬＤＨ３活性を評価した。観察された蛍光をサイトメトリーによって分析し、芽細胞の各ＡＬＤＨアイソフォームの相対活性に対応中央蛍光強度（ＭＦＩ）の値を得ることを可能にする。
【0163】
結果
結果を以下の表５に示す。
結果を以下の表５に示す。
【表5】
【0164】
（付記）
（付記１）
（ａ）対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
（式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、
を含む、ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質。
（付記１）
（ａ）対応酸ＲＣＯＯＨから誘導されたアシル化剤との蛍光トレーサーＡ－ＯＨのエステル化から生じる式（Ｉ）Ｒ－ＣＯＯ－Ａ（Ｉ）の化合物（式中、Ｒはレチノエート、プロピオネート、オクタノエート、ベンゾエート、４－アミノブチレート、ヘキサノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートもしくは４－ヒドロキシ－２－ノネノエートを形成するために選択される）、または、
（ｂ）式（ＩＩ）の化合物
【化17】
を含む、ＡＬＤＨアイソザイムの特異的基質。
【0165】
（付記２）
Ａ－ＯＨは、７－ヒドロキシクマリン、トーキョーグリーンファミリーの発蛍光団、特に２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン（Ｔｏｋｙｏ Ｇｒｅｅｎ）、レゾルフィンおよびフルオレセインから選択されることを特徴とする、付記１に記載の特異的基質。
Ａ－ＯＨは、７－ヒドロキシクマリン、トーキョーグリーンファミリーの発蛍光団、特に２－メチル－４－メトキシ－トーキョーグリーン（Ｔｏｋｙｏ Ｇｒｅｅｎ）、レゾルフィンおよびフルオレセインから選択されることを特徴とする、付記１に記載の特異的基質。
【0166】
（付記３）
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ１であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、ヘキサノエートまたはプロピオネートを形成するために選択されることを特徴とする、付記１または２に記載の特異的基質。
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ１であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、レチノエート、ヘキサノエートまたはプロピオネートを形成するために選択されることを特徴とする、付記１または２に記載の特異的基質。
【0167】
（付記４）
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ３であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、オクタノエート、４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートまたはベンゾエートを形成するために選択されることを特徴とする、付記１または２に記載の特異的基質。
前記ＡＬＤＨアイソザイムは、ＡＬＤＨ３であり、式中、同一のまたは異なるＲおよびＲ’は、オクタノエート、４－ヒドロキシ－２－ノネノエート、４－ジエチルアミノベンゾエートまたはベンゾエートを形成するために選択されることを特徴とする、付記１または２に記載の特異的基質。
【0168】
（付記５）
前記ＡＬＤＨアイソザイムは細胞集団で検出されることを特徴とする、付記１～４のいずれか１つに記載の特異的基質。
前記ＡＬＤＨアイソザイムは細胞集団で検出されることを特徴とする、付記１～４のいずれか１つに記載の特異的基質。
【0169】
（付記６）
付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質を含む組成物。
付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質を含む組成物。
【0170】
（付記７）
付記１～５のいずれか１つに記載の特異的基質を含む診断マーカー。
付記１～５のいずれか１つに記載の特異的基質を含む診断マーカー。
【0171】
（付記８）
細胞集団中の少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを定量するための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
細胞集団中の少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを定量するための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
【0172】
（付記９）
少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムの発現に従って細胞集団の全部または一部を選別するための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムの発現に従って細胞集団の全部または一部を選別するための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
【0173】
（付記１０）
ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを伴う疾患の診断のための付記７に記載のマーカーの使用。
ＡＬＤＨアイソザイムのデレギュレーションを伴う疾患の診断のための付記７に記載のマーカーの使用。
【0174】
（付記１１）
前記疾患が、癌、精子運動障害、虚血、頭部外傷または膵炎の中から選択される、付記１０に記載の使用。
前記疾患が、癌、精子運動障害、虚血、頭部外傷または膵炎の中から選択される、付記１０に記載の使用。
【0175】
（付記１２）
対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するための、付記７に記載のマーカーの使用。
対象がＡＬＤＨアイソザイムの活性を阻害する療法および／または癌幹細胞に対する療法に応答することができるかどうかを決定するための、付記７に記載のマーカーの使用。
【0176】
（付記１３）
健常な幹細胞を癌幹細胞と区別するための、付記１から５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
健常な幹細胞を癌幹細胞と区別するための、付記１から５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
【0177】
（付記１４）
幹細胞を固形癌および／または血液悪性腫瘍と区別するための付記１３に記載の使用。
幹細胞を固形癌および／または血液悪性腫瘍と区別するための付記１３に記載の使用。
【0178】
（付記１５）
癌の異なる段階または幹細胞の分化の異なる段階を特徴付けるための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
癌の異なる段階または幹細胞の分化の異なる段階を特徴付けるための、付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質の使用。
【0179】
（付記１６）
細胞集団において少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を識別する方法であって、
（ａ）前記細胞集団を付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）前記細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が前記少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の前記細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む、方法。
細胞集団において少なくとも１つのＡＬＤＨアイソザイムを発現している細胞を識別する方法であって、
（ａ）前記細胞集団を付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質と接触させること、
（ｂ）前記細胞集団の蛍光を測定すること、および、
（ｃ）この集団が前記少なくとも１つの特異的基質と接触させられる前の前記細胞集団の蛍光と比較して増加した蛍光を有する細胞を識別すること、
を含む、方法。
【0180】
（付記１７）
付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質を含むＡＬＤＨアイソザイムを定量化するためのキット。
付記１～５のいずれか１つに記載の少なくとも１つの特異的基質を含むＡＬＤＨアイソザイムを定量化するためのキット。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】