特許 7051683 結節性硬化症の処置のためのアンチセンスオリゴマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-01

(45)【発行日】2022-04-11

(54)【発明の名称】結節性硬化症の処置のためのアンチセンスオリゴマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20220404BHJP

   C12N 15/33 20060101ALI20220404BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20220404BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20220404BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20220404BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20220404BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 ZNA

C12N15/33

A61K48/00

A61K31/7105

A61P35/00

A61P25/00

【請求項の数】 14

(21)【出願番号】P 2018529258

(86)(22)【出願日】2016-12-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2019-01-10

(86)【国際出願番号】 US2016066705

(87)【国際公開番号】W WO2017106375

(87)【国際公開日】2017-06-22

【審査請求日】2019-12-13

(31)【優先権主張番号】62/267,212

(32)【優先日】2015-12-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504278156

【氏名又は名称】コールド スプリング ハーバー ラボラトリー

(73)【特許権者】

【識別番号】518195690

【氏名又は名称】ストーク セラピューティクス，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】100140109

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 新次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】アズナレズ，イザベル

(72)【発明者】

【氏名】ナッシュ，ヒュー エム．

(72)【発明者】

【氏名】クライナー，エイドリアン

【審査官】古閑 一実

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１２／０２５２８７７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】CANCER RES.，2002年，Vol.62，p.1503-1509

【文献】Biochimica et Biophysica Acta，2000年，Vol.1502，p.495-507

【文献】Genomics，1995年，Vol.27，p.475-480

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ツベリンをコードする保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）であって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２３、２５～２７、２５０～２５２、２５４～２５６、３９５～４０１、４６０～４６２、４６４～４６７から選択される配列を含み、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は保持されたイントロンを含み、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞においてＡＳＯがＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合することにより、保持されたイントロンはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で、ツベリンをコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させ、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は保持されたイントロン内にある、前記ＡＳＯ。

【請求項2】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分が、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６の領域内にある、請求項１に記載のＡＳＯ。

【請求項3】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～８から選択される配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性を備えた配列を含む、請求項１又は２に記載のＡＳＯ。

【請求項4】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７～５１０５から選択される配列内にある、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項5】

ＡＳＯが、１８～５０の核酸塩基から成る、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項6】

ＡＳＯが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２３、２５～２７、２５０～２５２、２５４～２５６、３９５～４０１、４６０～４６２、４６４～４６７から選択される配列から成る、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項7】

ツベリンが、同等の野生型タンパク質と比較して：
ｉ） 機能が低下した形態；又は
ｉｉ） 十分に機能的な形態、
で生成される、請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項8】

ＡＳＯが、ホスホロチオエート結合若しくはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾；又は修飾された糖部若しくは糖アナログを含み、ホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル部分、２’－フルオロ部分、又は２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含んでいてもよい、請求項１～７のいずれか１項に記載のＡＳＯ。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＳＯを含むポリヌクレオチドを連結させたウイルスベクター。

【請求項10】

被験体においてツベリンタンパク質の量又は機能の不足を特徴とする疾患又は疾病を処置するための医薬組成物であって、請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＳＯ又は請求項９に記載のウイルスベクターを含む、前記医薬組成物。

【請求項11】

疾患又は疾病が結節性硬化症である、請求項１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

ツベリンの量の不足は、ツベリンのハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的なツベリンをコードする第１の対立遺伝子、及びツベリンが生成されない第２の対立遺伝子又は非機能的なツベリンをコードする第２の対立遺伝子を有し、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する、請求項１０又は１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

被験体は、第１の変異対立遺伝子及び第２の変異対立遺伝子を有し、ツベリンは、
ａ． 第１の変異対立遺伝子から：
ｉ． 野生型対立遺伝子からの生成と比較して減少したレベルで生成される；
ｉｉ． 同等の野生型ツベリンと比較して機能が低下した形態で生成される；又は
ｉｉｉ． 生成されない、及び
ｂ． 第２の変異対立遺伝子から：
ｉ． 野生型対立遺伝子からの生成と比較して減少したレベル生成される；
ｉｉ． 同等の野生型ツベリンと比較して機能が低下した形態で生成される；又は
ｉｉｉ． 生成されない、
ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子ａ．ｉｉｉ．を有する場合、第２の変異対立遺伝子はｂ．ｉ．又はｂ．ｉｉ．であり、被験体が第２の変異対立遺伝子ｂ．ｉｉｉ．を有する場合、第１の変異対立遺伝子はａ．ｉ．又はａ．ｉｉ．であり、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ａ．ｉ．若しくはａ．ｉｉ．である第１の変異対立遺伝子又はｂ．ｉ．若しくはｂ．ｉｉ．である第２の変異対立遺伝子から転写される、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射による投与用である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１５年１２月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２６７，２１２号の利益を主張し、該仮出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

＜配列表＞
本出願は配列表を包含しており、これは、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が引用により本明細書に組み込まれる。２０１６年１２月１２日に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、４７９９１－７０６＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔのファイル名であり、１，６６３，７０８バイトのサイズである。前述のファイルは２０１６年１２月１２日に作成され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

結節性硬化症（ＴＳＣ）は、複数の臓器系における良性腫瘍の成長を特徴とする障害である（Ａｕ，Ｋ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，１９：６９９－７０９）。中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍は、罹患率と死亡率、続いて腎疾患の主因である。患者は、皮膚、肺、腎臓、および心臓の異常と同様に、発作、知的障害、および発育上の遅延を含み得る脳の異常に苦しむことがある。障害は米国で２５，０００人から４０，０００人もの個体、および世界でも約１００万人～２００万人で発症しており、６，０００人の新生児に１人のの評価された罹患率と推定される。

【0004】

ＴＳＣは、２つの遺伝子ＴＳＣ１およびＴＳＣ２上で生じる遺伝性の欠損またはデノボの突然変異によって引き起こされる、常染色体優性遺伝パターンを備えた遺伝病である。遺伝子の１つだけが罹患すればＴＳＣが存在する。染色体９上のＴＳＣ１遺伝子は、ハマルチンと呼ばれるタンパク質を産生する。１９９３年に発見されたＴＳＣ２遺伝子は、染色体１６上にあり、タンパク質ツベリンを産生する。科学者らは、これらのタンパク質がｍＴＯＲと呼ばれる支配的な進化上で保存されたキナーゼの活性化を阻害することにより、成長抑制因子として複合体中で作用すると信じている。ｍＴＯＲの調節の喪失がハマルチンまたはツベリンのいずれかを欠く細胞で生じ、これにより、ＴＳＣ脳病変で見られるような異常な分化と発達、および拡大した細胞の生成が引き起こされる。

【発明の概要】

【0005】

本発明は、結節性硬化症を処置するための組成物および方法を提供し、組成物は、ＴＳＣ２の保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）のイントロンスプライス部位での構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を含む。本発明はさらに、必要としている被験体、例えば、ＴＳＣ２タンパク質の産生の増加から恩恵を得ることができる被験体の細胞において、成熟ＴＳＣ２ ｍＲＮＡおよび順にＴＳＣ２タンパク質の産生を増加させるための組成物および方法を提供する。上記方法は、結果としてツベリンタンパク質産生の不足につながる、ミスセンス、スプライシング、フレームシフトおよびナンセンスの変異を含む、ＴＳＣ２遺伝子内の変異に加えて、全遺伝子欠失によっても引き起こされる結節性硬化症を有する被験体を処置するために使用されてもよい。

【0006】

本明細書には、特定の実施形態において、被験体の細胞により標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることによって必要としている被験体の結節性硬化症を処置する方法が開示され、ここで、該細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここでＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、該方法は、被験体の細胞を、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書にはまた、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有している細胞によって、ツベリンである標的タンパク質の発現を増加させる方法が開示され、該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はツベリンタンパク質をコードし、該方法は、細胞を、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ツベリンタンパク質の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、標的タンパク質はツベリンである。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、細胞は、ツベリンタンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか又は被験体に由来する。いくつかの実施形態では、標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が産生されない第２の対立遺伝子、または非機能的な標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する。いくつかの実施形態において、被験体は、標的タンパク質の量または機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、ここで、被験体は、（ａ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第１の変異対立遺伝子と、（ｂ）（ｉ）標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、（ｉｉ）標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、（ｉｉｉ）標的タンパク質が生成されない、第２の変異対立遺伝子とを有し、ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子ａ．ｉｉｉ．を有するとき、第２の変異対立遺伝子はｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子ｂ．ｉｉｉ．を有するとき、第１の変異対立遺伝子はａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．である第１の変異対立遺伝子、および／または、ｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．である第２の変異対立遺伝子から転写される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される。いくつかの実施形態において、標的タンパク質は、同等な野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、＋６から＋５００、＋６から＋４９５、または＋６から＋１００の領域；または、（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、－１６から－５００、－１６から－４００、または－１６から－１００の領域。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡまたは標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、または野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞において生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞において生成された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７－５１０５から選択される配列内にある。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡを
コードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態において、細胞は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、および、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する。いくつかの実施形態において、２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は結節性硬化症である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＴＳＣ２遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、当該方法はＴＳＣ２タンパク質発現を評価する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはツベリンＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分へ結合し、ここで、標的部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、および５７から選択された配列内にある。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体はヒト以外の動物である。いくつかの実施形態において、被験体は胎児、胚、あるいは子供である。いくつかの実施形態では、細胞はエクスビボである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、被験体の皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される。いくつかの実施形態において、５’スプライス部位に隣接するエクソンの－３ｅ～－１ｅと、保持されたイントロンの＋１～＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンの－１５～－１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である。

【0007】

本明細書には、特定の実施形態において、上記の方法に使用されるアンチセンスオリゴマーが開示される。

【0008】

ある実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含むアンチセンスオリゴマーが本明細書で開示される。

【0009】

本明細書には、特定の実施形態において、上記のアンチセンスオリゴマーおよび賦形剤を含む医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書にはまた、皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射により医薬組成物を投与することによって、必要としている被験体を処置する方法が記載される。

【0010】

本明細書には、特定の実施形態において、不足しているタンパク質または不足している機能的ＲＮＡに関係する被験体の結節性硬化症を処置するために細胞によって標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物が開示され、ここで、不足しているタンパク質または機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的スプライシングを増強し、ここで、標的タンパク質は：（ａ）不足しているタンパク質；あるいは（ｂ）被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、ここで、機能的ＲＮＡは：（ａ）不足しているＲＮＡ；または（ｂ）被験体において不足している機能的ＲＮＡを機能的に増強または交換する、補償する機能的ＲＮＡであり、ここでＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体において標的タンパク質または機能的ＲＮＡの産生または活性を増加させる。いくつかの実施形態において、本明細書にはまた、被験体においてツベリンタンパク質に関係する疾病を処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物が開示され、該方法は、被験体の細胞によってツベリンタンパク質の発現を増加させる工程であって、細胞が保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はツベリンタンパク質をコードし、該方法は細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ツベリンタンパク質の発現を増加させる、工程を含む。いくつかの実施形態では、疾病は疾患または障害である。いくつかの実施形態において、疾患または障害は結節性硬化症である。いくつかの実施形態において、標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＴＳＣ２遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、以下の内部の保持されたイントロンにある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００の領域；（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－１００の領域。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約５００、４００、３００、２００、または１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、以下の内部にある：（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域；あるいは（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域。いくつかの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質または機能的ＲＮＡの量を増加させない。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡまたは機能的タンパク質の量を増加させない。いくつかの実施形態において、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、または野生型のｍＲＮＡ前駆体からの部分的なスプライシングによって生成された。いくつかの実施形態において、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは律速イントロンである。いくつかの実施形態において、前記保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む。いくつかの実施形態において、それぞれの糖部は修飾された糖部である。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ツベリン ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、ここで標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７－５１０５から選択される配列内にある。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む。

【0011】

本明細書には、特定の実施形態において、上記のアンチセンスオリゴマーおよび賦形剤を含む医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態において、本明細書にはまた、皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射により医薬組成物を投与することによって、必要としている被験体を処置する方法が記載される。

【0012】

ある実施形態において、医薬組成物が本明細書に開示され、該組成物は、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー、および薬学的に許容可能な賦形剤を含み、ここで不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物は保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーは、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。いくつかの実施形態では、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。いくつかの実施形態において、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある。いくつかの実施形態では、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２－８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合またはホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基を含む。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である。いくつかの実施形態では、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７－５１０５から選択される配列内にある。いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される。

【0013】

ある実施形態では、ツベリンタンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法が本明細書で開示され、該方法は：（ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物が、ツベリンタンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、（ｃ）ツベリンタンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するために不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、および（ｄ）十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物からツベリンタンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む。いくつかの実施形態において、保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である。いくつかの実施形態では、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。

【0014】

本明細書には、特定の実施形態において、ツベリンタンパク質の量または活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法が開示され、該方法は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。

【0015】

＜引用による組み込み＞
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に指示される程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ 被験体の細胞により標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現を増加させることによって被験体の結節性硬化症を処置する方法であって、
ここで、前記細胞は、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードし、
前記方法は、
被験体の細胞を、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの発現を増加させる、方法。
［項目２］ 保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有している細胞によって、ツベリンである標的タンパク質の発現を増加させる方法であって、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はツベリンタンパク質をコードし、
前記方法は、
細胞を、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる工程を含み、それによって、保持されたイントロンは、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から構成的にスプライシングされ、それにより、細胞内で、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ツベリンタンパク質の発現を増加させる、方法。
［項目３］ 標的タンパク質はツベリンである、項目１に記載の方法。
［項目４］ 標的タンパク質又は機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足している標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡを機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質あるいは補償機能的ＲＮＡである、項目１に記載の方法。
［項目５］ 細胞は、ツベリンタンパク質の量又は活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体内にあるか又は被験体に由来する、項目２に記載の方法。
［項目６］ 標的タンパク質の量の不足は、標的タンパク質のハプロ不全によって引き起こされ、ここで、被験体は、機能的な標的タンパク質をコードする第１の対立遺伝子、標的タンパク質が生成されない第２の対立遺伝子、又は非機能的な標的タンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合する、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
［項目７］ 被験体は、標的タンパク質の量又は機能の不足に起因する障害により引き起こされた疾病を抱えており、
ここで、被験体は、
ａ．
ｉ．標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
ｉｉ．標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
ｉｉｉ．標的タンパク質が生成されない、
第１の変異対立遺伝子と、
ｂ．
ｉ．標的タンパク質が野生型対立遺伝子からの生成と比較して、減少したレベルで生成され、
ｉｉ．標的タンパク質が同等の野性型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、あるいは、
ｉｉｉ．標的タンパク質が生成されない、
第２の変異対立遺伝子とを有し、
ここで、被験体が第１の変異対立遺伝子ａ．ｉｉｉ．を有するとき、第２の変異対立遺伝子はｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．であり、ここで、被験体が第２の変異対立遺伝子ｂ．ｉｉｉ．を有するとき、第１の変異対立遺伝子はａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．であり、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ａ．ｉ．あるいはａ．ｉｉ．である第１の変異対立遺伝子、及び／又は、ｂ．ｉ．あるいはｂ．ｉｉ．である第２の変異対立遺伝子から転写される、項目１～５のいずれか１つに記載の方法。
［項目８］ 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、機能が低下した形態で生成される、項目７に記載の方法。
［項目９］ 標的タンパク質は、同等の野性型タンパク質と比較して、十分に機能的な形態で生成される、項目７に記載の方法。
［項目１０］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにある、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
［項目１１］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
［項目１２］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して、＋６から＋５００、＋６から＋４９５、又は＋６から＋１００の領域、又は、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して、－１６から－５００、－１６から－４００、又は－１６から－１００の領域、
の内部の保持されたイントロンにある、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
［項目１３］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域、あるいは、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域、
の内部にある、項目１～９のいずれか１つに記載の方法。
［項目１４］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、項目１～１３のいずれか１つに記載の方法。
［項目１５］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、項目１～１４のいずれか１つに記載の方法。
［項目１６］ アンチセンスオリゴマーは、機能的ＲＮＡ又は標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの量を増加させない、項目１～１５のいずれか１つに記載の方法。
［項目１７］ アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの量を増加させない、項目１～１５のいずれか１つに記載の方法。
［項目１８］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシング、又は野生型のｍＲＮＡ前駆体の部分的なスプライシングによって生成された、項目１～１７のいずれか１つに記載の方法。
［項目１９］ 標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、項目１～１８のいずれか１つに記載の方法。
［項目２０］ 生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、請求項１～１９のいずれか１つに記載の方法。
［項目２１］ アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞において生成された標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量は、対照細胞において生成された標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡの総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する、項目１～２０のいずれか１つに記載の方法。
［項目２２］ アンチセンスオリゴマーと接触させた細胞によって生成された標的タンパク質の総量は、対照細胞によって生成された標的タンパク質の総量と比較して、約１．１～約１０倍、約１．５～約１０倍、約２～約１０倍、約３～約１０倍、約４～約１０倍、約１．１～約５倍、約１．１～約６倍、約１．１～約７倍、約１．１～約８倍、約１．１～約９倍、約２～約５倍、約２～約６倍、約２～約７倍、約２～約８倍、約２～約９倍、約３～約６倍、約３～約７倍、約３～約８倍、約３～約９倍、約４～約７倍、約４～約８倍、約４～約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、あるいは少なくとも約１０倍増加する、項目１～２１のいずれか１つに記載の方法。
［項目２３］ アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合又はホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、項目１～２２のいずれか１つに記載の方法。
［項目２４］ アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目１～２３のいずれか１つに記載の方法。
［項目２５］ アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、項目１～２４のいずれか１つに記載の方法。
［項目２６］ それぞれの糖部は修飾された糖部である、項目２５に記載の方法。
［項目２７］ アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる、項目１～２６のいずれか１つに記載の方法。
［項目２８］ アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、項目１～２７のいずれか１つに記載の方法。
［項目２９］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７～５１０５から選択される配列内にある、項目１～２８のいずれか１つに記載の方法。
［項目３０］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～２９のいずれか１つに記載の方法。
［項目３１］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む、項目１～２９のいずれか１つに記載の方法。
［項目３２］ 細胞は、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、及び、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で最も豊富な保持されたイントロンに結合する、項目１～３１のいずれか１つに記載の方法。
［項目３３］ 最も豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、項目３２に記載の方法。
［項目３４］ 細胞は、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団を含み、ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含み、及び、ここで、アンチセンスオリゴマーは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団で２番目に豊富な保持されたイントロンに結合する、項目１～３１のいずれか１つに記載の方法。
［項目３５］ ２番目に豊富な保持されたイントロンに対するアンチセンスオリゴマーの結合は、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡを生成するＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団からの２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、請求項３４に記載の方法。
［項目３６］ 疾病は疾患又は障害である、項目５～３５のいずれか１つに記載の方法。
［項目３７］ 疾患又は障害は結節性硬化症である、項目３６に記載の方法。
［項目３８］ 標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＴＳＣ２遺伝子によってコードされる、請求項３７に記載の方法。
［項目３９］ 前記方法はＴＳＣ２タンパク質発現を評価する工程をさらに含む、項目１～３８のいずれか１つに記載の方法。
［項目４０］ アンチセンスオリゴマーはツベリンＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分へ結合し、ここで、標的部分はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、及び５７から選択された配列内にある、項目１～３９のいずれか１つに記載の方法。
［項目４１］ 被験体はヒトである、項目１～４０のいずれか１つに記載の方法。
［項目４２］ 被験体はヒト以外の動物である、項目１～４０のいずれか１つに記載の方法。
［項目４３］ 被験体は胎児、胚、あるいは子供である、項目１～４１のいずれか１つに記載の方法。
［項目４４］ 細胞はエクスビボである、項目１～４２のいずれか１つに記載の方法。
［項目４５］ アンチセンスオリゴマーは、被験体の皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射によって投与される、項目１～４２のいずれか１つに記載の方法。
［項目４６］ ５’スプライス部位に隣接するエクソンの－３ｅ～－１ｅと、保持されたイントロンの＋１～＋６にある９つのヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、項目１～４５のいずれか１つに記載の方法。
［項目４７］ 保持されたイントロンの－１５～－１と３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅにある１６のヌクレオチドは、対応する野性型配列と同一である、項目１～４６のいずれか１つに記載の方法。
［項目４８］ 項目１～３９のいずれか１つの方法に使用されるアンチセンスオリゴマー。
［項目４９］ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含むアンチセンスオリゴマー。
［項目５０］ 項目４８又は４９のアンチセンスオリゴマーと賦形剤を含む医薬組成物。
［項目５１］ 皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により、項目５０に記載の医薬組成物を投与することによって、被験体を処置する方法。
［項目５２］ 不足しているタンパク質又は不足している機能的ＲＮＡに関係する被験体の結節性硬化症を処置するために細胞によって標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの発現を増加させる方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
ここで、不足しているタンパク質又は機能的ＲＮＡは、被験体において量あるいは活性が不足しており、ここで、アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の構成的スプライシングを増強し、
ここで、標的タンパク質は、
（ａ）不足しているタンパク質、あるいは、
（ｂ）被験体において不足しているタンパク質を機能的に増大させるか、これに取って代わる、補償タンパク質であり、
ここで、機能的ＲＮＡは、
（ａ）不足しているＲＮＡ、あるいは、
（ｂ）被験体において不足している機能的ＲＮＡを機能的に増強又は交換する、補償する機能的ＲＮＡであり、
ここで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接しているエクソン、及び３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含み、保持されたイントロンは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からスプライシングされ、それによって、被験体において標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの生成又は活性を増加させる、組成物。
［項目５３］ 被験体においてツベリンタンパク質に関係する疾病を処置する方法に使用するためのアンチセンスオリゴマーを含む組成物であって、
該方法は、被験体の細胞によってツベリンタンパク質の発現を増加させる工程であって、細胞が保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン、及び保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンを含む、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を有し、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体がツベリンタンパク質をコードする、工程と、細胞をアンチセンスオリゴマーと接触させる工程であって、それによって、保持されたイントロンは、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物から構成的にスプライシングされ、それにより、被験体の細胞内で、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させ、ツベリンタンパク質の発現を増加させる、工程を含む、組成物。
［項目５４］ 疾病は疾患又は障害である、項目５３に記載の組成物。
［項目５５］ 疾患又は障害は結節性硬化症である、項目５４に記載の組成物。
［項目５６］ 標的タンパク質とＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体はＴＳＣ２遺伝子によってコードされる、請求項５５に記載の組成物。
［項目５７］ アンチセンスオリゴマーは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６までの領域内の保持されたイントロンにあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、項目５２～５６のいずれか１つに記載の組成物。
［項目５８］ アンチセンスオリゴマーはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とし、これは、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋６から＋１００の領域、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－１６から－１００の領域、の内部の保持されたイントロンにある、項目５２～５７のいずれか１つに記載の組成物。
［項目５９］ アンチセンスオリゴマーは、少なくとも１つの保持されたイントロンの５’スプライス部位の約５００、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド下流から、少なくとも１つの保持されたイントロンの３’スプライス部位の約１００、２００、３００、４００、又は５００ヌクレオチド上流までの領域内にあるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の一部を標的とする、項目５２～５６のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６０］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、
（ａ）保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域、あるいは、
（ｂ）保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソン中の＋２ｅ～－４ｅの領域、
の内部にある、項目５２～５６のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６１］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、項目５２～６０のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６２］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、項目５２～６１のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６３］ アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングを調節することにより標的タンパク質又は機能的ＲＮＡの量を増加させない、項目５２～６２のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６４］ アンチセンスオリゴマーは、標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする遺伝子の突然変異に起因する異常なスプライシングを調節することにより、機能的ＲＮＡ又は機能的タンパク質の量を増加させない、項目５２～６２のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６５］ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のｍＲＮＡ前駆体、又は野生型のｍＲＮＡ前駆体からの部分的なスプライシングによって生成された、項目５２～６４のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６６］ 標的タンパク質又は機能的ＲＮＡをコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡ、あるいは野生型の成熟ｍＲＮＡである、項目５２～６５のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６７］ 生成された標的タンパク質は全長のタンパク質あるいは野生型のタンパク質である、項目５２～６６のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６８］ 保持されたイントロンは律速イントロンである、項目５２～６７のいずれか１つに記載の組成物。
［項目６９］ 前記保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で最も豊富な保持されたイントロンである、項目５２～６８のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７０］ 保持されたイントロンは前記ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体で２番目に豊富な保持されたイントロンである、項目５２～６８のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７１］ アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合又はホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、項目５２～７０のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７２］ 前記アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目５２～７１のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７３］ アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目５２～７２のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７４］ アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、項目５２～７３のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７５］ それぞれの糖部は修飾された糖部である、項目７４に記載の組成物。
［項目７６］ アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基からなる、項目５２～７５のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７７］ アンチセンスオリゴマーは、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、項目５２～７６のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７８］ アンチセンスオリゴマーは、ツベリン ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、ここで標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７～５１０５から選択される配列内にある、項目５２～７７のいずれか１つに記載の組成物。
［項目７９］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項５２～７８のいずれか１つに記載の組成物。
［項目８０］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む、項目５２～７８のいずれか１つに記載の組成物。
［項目８１］ 項目５２～８０の組成物のいずれかのアンチセンスオリゴマー及び賦形剤を含む医薬組成物。
［項目８２］ 皮膚への局所投与、肺への肺送達、くも膜下腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、又は静脈内注射により、項目８１に記載の医薬組成物を投与することによって被験体を処置する方法。
［項目８３］ 不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物の標的配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマーであって、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物が保持されたイントロンを含み、アンチセンスオリゴマーが不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物からの保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する、アンチセンスオリゴマーと、
薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、
医薬組成物。
［項目８４］ 不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、項目８３に記載の医薬組成物。
［項目８５］ ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対して＋５００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対して－５００までの領域内の保持されたイントロンにある、項目８３又は８４に記載の医薬組成物。
［項目８６］ ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する遺伝子配列によってコードされる、項目８３～８５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目８７］ ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２～８のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を備えた配列を含む、項目８３～８６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目８８］ アンチセンスオリゴマーは、ホスホロチオエート結合又はホスホロジアミデート結合を含む骨格修飾を含む、項目８３～８７のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目８９］ アンチセンスオリゴマーはアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目８３～８８のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９０］ アンチセンスオリゴマーはホスホロジアミデートモルホリノ、ロックド核酸、ペプチド核酸、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、あるいは２’－Ｏ－メトキシエチル部分を含む、項目８３～８９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９１］ アンチセンスオリゴマーは少なくとも１つの修飾された糖部を含む、項目８３～９０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９２］ アンチセンスオリゴマーは、８～５０の核酸塩基、８～４０の核酸塩基、８～３５の核酸塩基、８～３０の核酸塩基、８～２５の核酸塩基、８～２０の核酸塩基、８～１５の核酸塩基、９～５０の核酸塩基、９～４０の核酸塩基、９～３５の核酸塩基、９～３０の核酸塩基、９～２５の核酸塩基、９～２０の核酸塩基、９～１５の核酸塩基、１０～５０の核酸塩基、１０～４０の核酸塩基、１０～３５の核酸塩基、１０～３０の核酸塩基、１０～２５の核酸塩基、１０～２０の核酸塩基、１０～１５の核酸塩基、１１～５０の核酸塩基、１１～４０の核酸塩基、１１～３５の核酸塩基、１１～３０の核酸塩基、１１～２５の核酸塩基、１１～２０の核酸塩基、１１～１５の核酸塩基、１２～５０の核酸塩基、１２～４０の核酸塩基、１２～３５の核酸塩基、１２～３０の核酸塩基、１２～２５の核酸塩基、１２～２０の核酸塩基、あるいは１２～１５の核酸塩基を含む、項目８３～９１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９３］ アンチセンスオリゴマーは、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、あるいは１００％相補的である、項目８３～９２のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９４］ ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７～５１０５から選択される配列内にある、項目８３～９３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９５］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％の配列同一性であるヌクレオチド配列を含む、請求項８３～９４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９６］ アンチセンスオリゴマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６から選択されたヌクレオチド配列を含む、項目８３～９４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９７］ 医薬組成物は、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、あるいは静脈内注射のために製剤される、項目８３～９５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
［項目９８］ ツベリンタンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するべく、保持されたイントロンの除去を促すために不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物の処理を誘発する方法であって、
前記方法は、
（ａ）被験体の標的細胞へアンチセンスオリゴマーを接触させる工程と、
（ｂ）アンチセンスオリゴマーを不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物にハイブリダイズする工程であって、不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物が、ツベリンタンパク質の機能形態をコードすることができ、少なくとも１つの保持されたイントロンを含む、工程と、
（ｃ）ツベリンタンパク質の機能的な形態をコードする十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物を生成するために不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡ転写産物から少なくとも１つの保持されたイントロンを除去する工程と、
（ｄ）十分に処理されたＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物からツベリンタンパク質の機能形態を翻訳する工程を含む、方法。
［項目９９］ 保持されたイントロンは保持されたイントロン全体である、項目９８に記載の方法。
［項目１００］ 不足しているＴＳＣ２ ｍＲＮＡの転写産物は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物である、項目９８又は９９に記載の方法。
［項目１０１］ ツベリンタンパク質の量又は活性の不足によって引き起こされた疾病を有する被験体を処置する方法であって、
前記方法は、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９～５０９６のいずれか１つに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0016】

本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の諸原則が利用される例示的な実施形態について説明する以下の詳細な記載と、添付の図面を参照することで、本発明の特徴および利点についてのよりよい理解が得られるであろう。

【図1】典型的な保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の概略図を示す。５’スプライス部位コンセンサス配列は、－３ｅから－１ｅおよび＋１から＋６（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。３’スプライス部位コンセンサス配列は、－１５から－１および＋１ｅ（「ｅ」と標識された数字はエクソンであり、標識されていない数字はイントロンである）まで下線を引かれた文字（文字はヌクレオチドである；大文字：エクソン部分、および小文字：イントロン部分）で示されている。ＡＳＯスクリ－ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位（左の矢印）に対するヌクレオチド＋６から、保持されたイントロンの３’スプライス部位（右の矢印）に対するヌクレオチド－１６までを含む。実施形態では、ＡＳＯスクリ－ニングのためのイントロン標的領域は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋６から＋１００、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に対するヌクレオチド－１６から－１００を含む。エクソン標的部位は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅ、および保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅのヌクレオチドを含む。「ｎ」または「Ｎ」はヌクレオチドを表し、「ｙ」はピリミジンを表す。図示された配列は、哺乳動物のスプライス部位に対するコンセンサス配列を表し、個々のイントロンおよびエクソンは、すべての位置でコンセンサス配列に一致する必要はなない。

【図2A】核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）方法の概略図を例示する。図２Ａは、核と細胞質区画に分割された細胞を示す。核では、エクソン（長方形）およびイントロン（接続線）からなる標的遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ｍＲＮＡを生成するためにスプライシングを受け、このｍＲＮＡは細胞質に輸送され、標的タンパク質へと翻訳される。この標的遺伝子については、イントロン１のスプライシングは非効率的であり、保持されたイントロン含有（ＲＩＣ）ｍＲＮＡ前駆体は、主として核内に蓄積し、細胞質に輸送された場合は劣化し、標的タンパク質の産生にはつながらない。

【図2B】核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）方法の概略図を例示する。図２Ｂは、核と細胞質区画に分割された同様の細胞の例を示す。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）での処置は、イントロン１のスプライシングを促進し、かつｍＲＮＡの増加をもたらし、これは順に、高レベルの標的タンパク質に翻訳される。

【図3】イントロン４をもつＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持を詳細に示す。ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を用いた、ＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持事象の特定は、ＵＣＳＣゲノムブラウザで視覚化され示される。上のパネルは、ＨＣＮ（ヒトの皮質ニューロン）において発現され、且つ細胞質（上）または核分画（下）のいずれかにおいて局在化されたＴＳＣ２転写産物に対応する読み取り密度を示す。このパネルの底部には、ＴＳＣ２遺伝子のグラフ表現が、スケールに合わせて示される。読み取り密度は、ピークとして示される。最も高い読み取り密度は、エクソン（ブラックボックス）に相当し、一方、いずれの細胞分画においてもイントロンの大半（矢印頭部を有する線）について読取は観察されない。細胞質分画と比較してより高い読み取り密度は、核分画のイントロン４、２５／２６、および３１／３２（矢印により示される）で検出され、これはイントロン４、２５／２６、および３１／３２のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前躯体の転写産物は、核に保持され、細胞質には輸送されない。ＨＣＮ中のイントロン４の読み取り密度は、下のパネルで詳細に示される。

【図4】ＴＳＣ２遺伝子ＩＶＳ ４ ＡＳＯウォーク（ｗａｌｋ）を示す。２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、５’スプライス部位のすぐ下流、または３’スプライス部位の上流の配列を標的とするＴＳＣ２ ＩＶＳ ４に対して行われたＡＳＯウォークが図示される。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドの位置を変えることにより、これらの領域をカバーするように設計された。ＴＳＣ２エクソン－イントロン構造はスケールに合わせて示される。

【図5】イントロン２５と２６をもつＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持を詳細に示す。ＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持は、本明細書中の実施例において述べられているように、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって特定され、ＵＣＳＣゲノムブラウザ中で視覚化された。ＨＣＮ中のイントロン２５と２６の読み取り密度は、下のパネルで詳細に示される。イントロン２５と２６は、代替的にスプライシングされたエクソンであるエクソン２６に隣接している。これは、ＴＳＣ２転写産物及びＲＮＡｓｅｑデータのグラフ表現において証明され、従ってエクソン２６を表す長方形が幾つかの転写産物中に存在する一方で他の転写産物中には存在せず、細胞質分画中のエクソン２６に対応する読み取り密度は、ＴＳＣ２中の構成的にスプライシングされたエクソンよりも著しく低い。イントロン２６についての読み取り密度は、生物情報学的な分析によって計算されるとおり５１％のイントロン保持を示す下のパネルで詳細に示される。

【図6】ＴＳＣ２遺伝子ＩＶＳ ２５及び２６のＡＳＯウォークを示す。２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、イントロン２５の５’スプライス部位のすぐ下流、またはイントロン２６の３’スプライス部位の上流の配列を標的とするＴＳＣ２ ＩＶＳ ２５と２６に対して行われたＡＳＯウォークのグラフ表現が示される。代替的なエクソン２６に隣接しているスプライス部位のイントロン領域は、エクソン２６の包含レベルに影響を及ぼすのを回避するために標的とされない。ＡＳＯは、一度に５つのヌクレオチドの位置を変えることにより、これらの領域をカバーするように設計された。ＴＳＣ２エクソン－イントロン構造はスケールに合わせて示される。

【図7】イントロン３１と３２を持つＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持を詳細に示す。ＴＳＣ２遺伝子中のイントロン保持は、本明細書中の実施例において述べられているように、ＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）によって特定され、ＵＣＳＣゲノムブラウザ中で視覚化された。イントロン３１と３２の読み取り密度は、下のパネルで詳細に示される。イントロン３１と３２は、代替的にスプライシングされたエクソンであるエクソン３２に隣接している。これは、ＴＳＣ２転写産物及びＲＮＡｓｅｑデータの図式表示において証明され、従ってエクソン３２を表す長方形が幾つかの転写産物中に存在する一方で他の転写産物中には存在せず、細胞質分画中のエクソン３２に対応する読み取り密度は、ＴＳＣ２中の構成的にスプライシングされたエクソンよりも著しく低い。イントロン３１についての読み取り密度は、生物情報学的な分析によって計算されるとおり４３％のイントロン保持を示す下のパネルで詳細に示される。

【図8】ＴＳＣ２遺伝子ＩＶＳ ３１及び３２のＡＳＯウォークを示す。２’－ＯＭｅ ＡＳＯ、ＰＳ骨格を使用して、イントロン３１の５’スプライス部位のすぐ下流、またはイントロン３２の３’スプライス部位の上流の配列を標的とするＴＳＣ２ ＩＶＳ ３１と３２に対して行われたＡＳＯウォークのグラフ表現が示される。代替的なエクソン３２に隣接しているスプライス部位のイントロン領域は、エクソン３２の包含レベルに影響を及ぼすのを回避するために標的とされない。ＡＳＯは、ＴＳＣ２－ＩＶＳ３２－３３およびＴＳＣ２－ＩＶＳ３２－５１を例外として、一度に５つのヌクレオチドの位置を変えることにより、これらの領域をカバーするように設計された。ＴＳＣ２エクソン－イントロン構造はスケールに合わせて示される。

【図9】ＮＭ＿０００５４８に対応するＴＳＣ２イントロン４のＲｅＳｅｑ遺伝子の模式図を表す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図10】偽処理した細胞上で８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置したＡＲＰＥ－１９細胞にイントロン４が無いＴＳＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルにおける平均（ｎ＝３）の倍率変化を示す、典型的なグラフを表す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【図11】ＮＭ＿０００５４８に対応するＴＳＣ２イントロン２５のＲｅＳｅｑ遺伝子の模式図を表す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図12】偽処理した細胞上で８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置したＡＲＰＥ－１９細胞にイントロン２５が無いＴＳＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルにおける平均（ｎ＝３）の倍率変化を示す、典型的なグラフを表す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【図13】ＮＭ＿０００５４８に対応するＴＳＣ２イントロン２６のＲｅＳｅｑ遺伝子の模式図を表す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図14】ＮＭ＿０００５４８に対応するＴＳＣ２イントロン３１のＲｅＳｅｑ遺伝子の模式図を表す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【図15】偽処理した細胞上で８０ｎＭの示されたＡＳＯで２４時間処置したＡＲＰＥ－１９細胞にイントロン３１が無いＴＳＣ２ ｍＲＮＡの発現レベルにおける平均（ｎ＝３）の倍率変化を示す、典型的なグラフを表す。データはＲＰＬ３２発現に正規化される。

【図16】ＮＭ＿０００５４８に対応するＴＳＣ２イントロン３２のＲｅＳｅｑ遺伝子の模式図を表す。円で囲んだイントロンのイントロン保持率（ＰＩＲ）が示される。

【発明を実施するための形態】

【0017】

２つ以上のイントロンを有するタンパク質コード遺伝子の一次転写産物中の個々のイントロンは、異なる効率性をもつ一次転写産物からスプライシングされる。ほとんどの場合、完全にスプライシングされたｍＲＮＡだけが、続く細胞質での翻訳のために核膜孔を通じて輸送される。スプライシングされていない、または部分的にスプライシングされた転写産物は、核内で検出可能である。完全にスプライシングされていない転写産物の核内蓄積は、タンパク質に翻訳され得る細胞質中での潜在的に有害なｍＲＮＡの蓄積を防止するメカニズムであると一般的に考えられる。いくつかの遺伝子については、最も効率性の低いイントロンのスプライシングは、細胞質中での翻訳に先立つ、遺伝子発現における律速的な転写後の工程である。

【0018】

本発明は、完全にスプライシングされた成熟ｍＲＮＡの安定した状態の産生を増加させる、およびそれ故、翻訳されたタンパク質レベルを増加させるために、遺伝子発現の核段階に対して律速的である１つ以上の保持されたＴＳＣ２イントロンのスプライシングをアップレギュレートするための組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、核に蓄積する保持されたイントロン含有ＴＳＣ２ ｍＲＮＡ前駆体のイントロンスプライス部位において構成的スプライシングを促進するアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）を活用する。したがって、実施形態では、ＴＳＣ２不足に起因する疾病を処置するために、本発明の方法を用いて、ＴＳＣ２タンパク質を増加させる。

【0019】

他の実施形態では、本発明の方法は、必要とする被験体の疾病を処置するために、ＴＳＣ２生成を増加させるために使用される。実施形態では、被験体は、ＴＳＣ２が野性型に対して必ずしも不足していないが、それにも関わらずＴＳＣ２の増加が疾患を緩和する疾病を有している。実施形態では、疾病はＴＳＣ２ハプロ不全によって引き起こされる。実施形態では、疾病は、常染色体優性障害である。実施形態では、疾病は、常染色体劣性障害である。

【0020】

＜結節性硬化症＞
結節性硬化症は、多臓器系における腫瘍増殖を特徴とする疾患である（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。腫瘍は通常良性であるが、時に悪性である。結節性硬化症の症例のおよそ９０％は皮質結節を表し；顔面線維性血管腫及び腎臓の血管筋脂肪腫が症例の８０％より多くに生じる。加えて、症例のおよそ８０％は上衣下結節を表し、症例のおよそ５０％は心臓の横紋筋腫を表し、症例の５１％～およそ８８％は爪／爪下線維腫を表す。中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍は、腎疾患が後続する罹患率と死亡率の主因である（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。

【0021】

結節性硬化症は、常染色体優性遺伝パターン及び高い突然変異率を備えた遺伝病である（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。染色体領域９ｑ３４．３と１６ｐ１３．３への結節性硬化症の結合は、ＴＳＣ１及びＴＳＣ２遺伝子それぞれの特定に繋がった。結節性硬化症の症例の６９％より多くはＴＳＣ２のハプロ不全から結果として生じ、患者のおよそ３分の２の疾患はデノボの突然変異又は欠失から結果として生じる（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。重篤な疾患は他の対立遺伝子の「第２のヒット（ｈｉｔ）」の減少を必要とすると考えられる。結節性硬化症の有病率は、アメリカ合衆国において１年につき５，８００の生児出生、或いはおよそ３００の出生のうち１つほどであり、１年につき２００の症例がＴＳＣ２の突然変異の結果から生じる。疾病は例えば、参照により本明細書に組み込まれるＯＭＩＭ ＃６１３２５４（Ｏｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９６６－２０１５）により説明されている。

【0022】

ＴＳＣ２遺伝子はツベリンと称されるタンパク質をコードする。ＴＳＣ２遺伝子は、うち２つが代替的にスプライシングされる４１のエクソンを含有し、染色体１６上でおよそ４０ｋｂに及ぶ（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。ツベリンは、ＴＳＣ１遺伝子産物であるハマルチンとの複合体を形成する２００ｋＤａのタンパク質である。ツベリン－ハマルチンの複合体は、様々なシグナルカスケードを介した、細胞の増殖、輸送、細胞の大きさ、細胞接着、及び移動の調節の役割を果たす。例えば、ツベリン－ハマルチンの複合体は、翻訳を調節するフォスファチジルイノシトール－３－キナーゼ及びタンパク質Ｂ経路（ＰＩ３Ｋ／ＰＫＢ）において機能する。具体的に、ツベリン－ハマルチンの複合値は、ｍＴＯＲキナーゼ活性を抑えることにより細胞増殖と翻訳を抑え、その結果、ｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）１の抑制及び真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４Ｅ－ＢＰ１）の活性化をもたらす。更に、ツベリンのＧＡＰドメインは、脳において豊富なＲａｓホモログである小さなＧタンパク質Ｒｈｅｂに結合したグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を加水分解して、故にｍＴＯＲ活性化を防ぐ。

【0023】

加えて、ツベリンとハマルチンは、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）及びＥ－カドヘリン－ベータ－カテニン経路を介して細胞増殖と細胞接着をそれぞれ調節する。染色体１６ｐ１３の部分のヘテロ接合性の損失の特定により最初に発見されると、多数の突然変異はＴＳＣ２について説明された（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。突然変異は、フレームシフト及びタンパク質短縮化、ナンセンス変異、スプライシングに影響を及ぼす突然変異、インフレーム変異、欠失、挿入、重複、及び大きな欠失と転位を含む。短縮化されたタンパク質生成物をもたらすＴＳＣ２の突然変異は、ツベリン－ハマルチン複合体を形成することができず、故に細胞増殖の調節の損失が結果として生じる。多数のシグナル伝達経路の主要調節因子としてのツベリン－ハマルチンの複合体の役割は、発作、知的障害、及び発達遅延などの神経学的及び神経反応性の異常を含む、多臓器系に関与する結節性硬化症を患う患者間での臨床所見の幅広いスペクトルと一致している（Ａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２００４，１９，６９９－７０９）。

【0024】

＜保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）＞
実施形態では、本明細書の方法は、細胞の核内で、ＴＳＣ２遺伝子から転写され且つツベリンタンパク質をコードする、保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）の存在を活用する。成熟し、完全にスプライシングされたＴＳＣ２ ｍＲＮＡを産出するための、特定のＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の種のスプライシングは、保持されたイントロンのスプライシングアウトを刺激するＡＳＯを用いて誘導される。結果としてもたらされる成熟ＴＳＣ２ ｍＲＮＡは、細胞質に輸送されて翻訳され、それによって患者の細胞中のツベリンタンパク質の量を増加させ、結節性硬化症の症状を緩和する。この方法は以下で更に説明される、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）として知られる。

【0025】

＜ＴＳＣ２核の転写産物＞
本明細書の実施例に記載されるように、ＴＳＣ２遺伝子はイントロン保持事象について分析され、イントロン４、２５、２６、３１、および３２の保持が観察された。ＵＣＳＣゲノムブラウザによって視覚化されたＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）は、ＨＣＮ（ヒト皮質ニューロン）細胞に発現したＴＳＣ２転写産物を示し、細胞質または核分画のいずれかに局在した。どちらの分画においても、読み取りは大多数のイントロンについて観察されなかった。しかし、細胞質分画と比較してより高い読み取り密度が、核分画のイントロン４、２５、２６、３１、および３２において検出され、これはイントロン４、２５、２６、３１、および３２のスプライシング効率が低く、結果としてイントロン保持をもたらすことを示している。保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、主として核に蓄積し、ツベリンタンパク質へと翻訳されない。ＡＳＴのイントロン２６についての読み取り密度は、生物情報学的な分析によって計算されるとおり５１％のイントロン保持を示す下のパネルで詳細に示される。イントロン２６のイントロン保持率（ＰＩＲ）の値は、平均化した４つの値（８７、８３、２０および１２）により得られた。それぞれの値は、４つの異なるアルゴリズムのうち１つを使用し、腎上皮細胞において判定された、ＡＳＴのイントロン３１についての読み取り密度は、４３％のイントロン保持を示す下のパネルで詳細に示される。イントロン３１のイントロン保持率（ＰＩＲ）の値は、平均化した４つの値（７８、７１、１６および８）により得られた。それぞれの値は、４つの異なるアルゴリズムのうちの１つを使用し、腎上皮細胞において判定された。イントロン４および３２はマッピングされなかった。イントロン保持事象を特定するための、ＥＮＣＯＤＥデータの分析（例えば、Ｔｉｌｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，「Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｓｈｏｗｓ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｔｏ ｂｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｃｏ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｂｕｔ ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ ｌｎｃＲＮＡｓ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２（９）：１６１６－２５に記載）は、イントロン２５、２６、又は３１を保持されたものとして特定せず、イントロン４と３２をマッピングしなかった。

【0026】

表１は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の領域を標的化することによってツベリンタンパク質の生成を増加させるのに有用な、配列ＩＤごとのＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的配列、および、配列ＩＤごとのＡＳＯの、非限定的なリストを提供する。実施形態では、これらの目的に有用な他のＡＳＯは、例えば、本明細書に記載の方法を用いて特定される。

【0027】

【表1】

【0028】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＴＳＣ２ゲノム配列から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ゲノム配列からのＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、３、２４、２９、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、４、２５、２６、３１、３２、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、４、２５、３０、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、４、２５、２６、３１、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２２、２７、２８、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、４、２５、３０、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、３、２４、２９、またはその組み合わせで保持されたイントロンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。

【0029】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４、保持されたイントロン３、保持されたイントロン２９、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５、保持されたイントロン２６、保持されたイントロン４、保持されたイントロン３１、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５、保持されたイントロン４、保持されたイントロン３０、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５、保持されたイントロン２６、保持されたイントロン４、保持されたイントロン３１、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７、保持されたイントロン２８、保持されたイントロン２２、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５、保持されたイントロン４、保持されたイントロン３０、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４、保持されたイントロン３、保持されたイントロン２９、またはそれらの組み合わせを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に係るＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の配列を標的とする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０９７－５１０５を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９－５０９６のいずれか１つに係る配列を有する。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２４またはエクソン２５を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から約２～約７５或いは約４～約７４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２～約１５０或いは約２～約１４７のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２５配列を標的とする。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のイントロン２４を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６～約４９７のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６～約４９６のヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２４配列を標的とする。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン３またはエクソン４を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４～約９４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２～約１２７のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン４配列を標的とする。

【0033】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のイントロン３を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６～約４３５のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６～約４３２のヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３配列を標的とする。

【0034】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２９またはエクソン３０を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４～約１８４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２～約１０２のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３０配列を標的とする。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のイントロン２９を標的とし、ここで、イントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２９におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６～約４９２のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６～約５００或いは約３６～約５００のヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２９配列を標的とする。

【0036】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン３２またはエクソン３３を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約４９ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３３配列を標的とする。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３２を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６～約５００または約３６～約５００ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３２配列を標的とする。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２５またはエクソン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１１２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２５を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９８ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２６またはエクソン２７を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１１１ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２７配列を標的とする。

【0041】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約５００ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９６ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２６配列を標的とする。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン４またはエクソン５を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約９４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１２７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。

【0043】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン４を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４３５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４３２ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。

【0044】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン３１またはエクソン３２を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約５２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３２配列を標的とする。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３１を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿０００５４８におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約３３１ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約３３３ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３１配列を標的とする。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２５またはエクソン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２５を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９９ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン４またはエクソン５を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に一致する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約９４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１２７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。

【0049】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン４を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４３５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４３２ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。

【0050】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン３０またはエクソン３１を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に一致する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３１配列を標的とする。

【0051】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３０を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１０７７１８３におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９２ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約５００または約３６から約５００ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３０配列を標的とする。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２５またはエクソン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１１２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２５を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９８ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２６またはエクソン２７を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１１１ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２７配列を標的とする。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約５００ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２６を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９６ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２６配列を標的とする。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４またはエクソン５を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約９４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１２７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン４を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４３５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４３２ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。

【0058】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン３１またはエクソン３２を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３２配列を標的とする。

【0059】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３１を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１１１４３８２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９２ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３１を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約５００または約３６から約５００ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３１配列を標的とする。

【0060】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２７またはエクソン２８を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約５２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２８配列を標的とする。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２７を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約３３１ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２７配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２７を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約３３３ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２７配列を標的とする。

【0062】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２８またはエクソン２９を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約４９ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２９配列を標的とする。

【0063】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２８を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２８配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２８を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約５００または約３６から約５００ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２８配列を標的とする。

【0064】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２２またはエクソン２３を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２３配列を標的とする。

【0065】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２２を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３１におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２２配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２２を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９９ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２２配列を標的とする。

【0066】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン２５またはエクソン２６を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４２ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２６配列を標的とする。

【0067】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２５を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２５を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９９ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２５配列を標的とする。

【0068】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のエクソン４またはエクソン５を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約９４ヌクレオチド上流（または５’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１２７ヌクレオチド下流（または３’）のエクソン５配列を標的とする。

【0069】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体中のイントロン４を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に相当する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４３５ヌクレオチド下流（または３’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４３２ヌクレオチド上流（または５’）のイントロン４配列を標的とする。

【0070】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン３０またはエクソン３１を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３１配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３１配列を標的とする。

【0071】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３０を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８３２におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９２のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３０を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約５００、あるいは約３６から約５００のヌクレオチド上流（または５’）の、イントロン３０配列を標的とする。

【0072】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２４またはエクソン２５を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約７４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン２５配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１４７のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン２５配列を標的とする。

【0073】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２４を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９７のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２４を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９６のヌクレオチド上流（または５’）のイントロン２４配列を標的とする。

【0074】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン３またはエクソン４を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約６９のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン４配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１２７のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン４配列を標的とする。

【0075】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン３を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９９のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン３配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン３を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約４９７のヌクレオチド上流（または５’）のイントロン３配列を標的とする。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体のエクソン２９またはエクソン３０を標的とし、ここでイントロンの番号付けは、ＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から上流（または５’）のエクソン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約４から約１８４のヌクレオチド上流（または５’）のエクソン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から下流（または３’）のエクソン３０配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約２から約１０２のヌクレオチド下流（または３’）のエクソン３０配列を標的とする。

【0077】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣｍＲＮＡ前駆体中のイントロン２９を標的とし、ここでイントロンの番号付けはＮＭ＿００１３１８８２７におけるｍＲＮＡ配列に対応する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から下流（または３’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の５’スプライス部位から、約６から約４９２のヌクレオチド下流（または３’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から上流（または５’）のイントロン２９配列を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロン２９を含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の３’スプライス部位から、約１６から約５００、あるいは約３６から約５００のヌクレオチド上流（または５’）の、イントロン２９配列を標的とする。

【0078】

イントロン保持の程度は、パーセントイントロン保持（ＰＩＲ）、すなわち所与のイントロンが保持される転写産物のパーセンテージとして表すことができる。手短に言えば、エクソン－イントロン連結の読み取りとエクソン－エクソン連結の読み取りの平均の合計に対して、エクソン－イントロン連結にマッピングする平均読み取り数のパーセンテージとして、ＰＩＲを算出することができる。

【0079】

＜ツベリンタンパク質発現＞
結節性硬化症の症例の６９％以上はＴＳＣ２のハプロ不全に起因し、また、およそ３分の２の患者の疾患は、デノボの突然変異または欠失に起因する（Ａｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，１９：６９９－７０９）。

【0080】

実施形態では、本明細書に記載の方法が、機能的ツベリンタンパク質の産生を増加させるために使用される。本明細書において使用される用語「機能的」は、結節性硬化症の１つ以上の症状を除去するのに必要なツベリンタンパク質の活性または機能の量を指す。実施形態では、該方法は、部分的機能的ツベリンタンパク質の産生を増加させるために使用される。本明細書において使用される用語「部分的機能的」は、疾患または疾病の１つ以上の症状を除去または予防するのに必要な活性または機能の量未満の、ツベリンタンパク質の活性または機能の量を指す。いくつかの実施形態では、部分的機能的タンパク質またはＲＮＡは、完全な機能的タンパク質またはＲＮＡに比して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％少ない活性を持つだろう。

【0081】

実施形態では、該方法は、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞によって、ツベリンタンパク質の発現を増加させる方法であり、該被験体は、ツベリンタンパク質活性の量の不足に起因する結節性硬化症を有し、および該ツベリンタンパク質量の不足は、ツベリンタンパク質のハプロ不全に起因する。そのような実施形態では、被験体は、機能的ツベリンタンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、ツベリンタンパク質が産生されない第２の対立遺伝子とを有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ツベリンタンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、非機能的ツベリンタンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。別のそのような実施形態では、被験体は、機能的ツベリンタンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的機能的ツベリンタンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有する。これらの実施形態のいずれの場合でも、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ツベリンタンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、機能的ツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡレベルの増加と、被験体の細胞中のツベリンタンパク質発現の増加をもたらす。

【0082】

実施形態では、被験体は、機能的ツベリンタンパク質をコードする第１の対立遺伝子と、部分的機能的ツベリンタンパク質をコードする第２の対立遺伝子を有し、アンチセンスオリゴマーは、第１の対立遺伝子（機能的ツベリンタンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分、あるいは第２の対立遺伝子（部分的機能的ツベリンタンパク質をコードする）から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合し、それによって、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡレベルの増加と、被験体の細胞中の機能的あるいは部分的機能的ツベリンタンパク質発現の増加をもたらす。

【0083】

関連する実施形態では、該方法は、タンパク質あるいは機能的ＲＮＡの発現を増加させるためにＡＳＯを用いる方法である。実施形態では、ＡＳＯは、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する被験体の細胞中のツベリンタンパク質発現を増加させるために使用され、該被験体は、ツベリンタンパク質の量または機能の不足、例えば結節性硬化症を有する。

【0084】

実施形態では、疾患または疾病の原因となる、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、本明細書に記載されるＡＳＯによって標的化される。いくつかの実施形態では、疾患の原因ではない、タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、ＡＳＯによって標的化される。例えば、特定の経路における第１のタンパク質の突然変異または欠失がもたらす疾患は、第２のタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を標的とし、それによって第２のタンパク質産生が増加することで、改善しうる。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質の活性は、第１のタンパク質の突然変異または不足（それは疾患または疾病の原因である）を補うことができる。

【0085】

実施形態では、被験体は、
ａ．第１の変異対立遺伝子であって、
ｉ）ツベリンタンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
ｉｉ）ツベリンタンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して機能が低下した形態で生成され、または
ｉｉｉ）ツベリンタンパク質あるいは機能的ＲＮＡが産生されない、第１の変異対立遺伝子；
および
ｂ．第２の変異対立遺伝子であって、
ｉ）ツベリンタンパク質が、野生型対立遺伝子からの産生と比較して、減少したレベルで産生され、
ｉｉ）ツベリンタンパク質が、同等の野生型タンパク質と比較して機能が低下した形態で産生され、または
ｉｉｉ）ツベリンタンパク質が産生されない、第２の変異対立遺伝子を有し、ここで、
ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、第１の対立遺伝子および／または第２の対立遺伝子から転写される。これらの実施形態では、ＡＳＯは、第１の対立遺伝子または第２の対立遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に結合することで、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルの増加を引き起こし、被験体の細胞中の標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現の増加をもたらす。これらの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングの結果として生じる、発現レベルの増加を有する標的タンパク質あるいは機能的ＲＮＡは、同等の野性型タンパク質と比較して機能性の低い形態（部分的機能的）、あるいは同等の野性型タンパク質と比較して完全な機能性を有する（完全機能的）、のいずれかで有り得る。

【0086】

実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルは、例えば、アンチセンスオリゴマーで処置されない、あるいはＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分と結合しないアンチセンスオリゴマーで処置された、対照細胞内で産生されたＴＳＣ２をコードするｍＲＮＡの量と比較した場合、１．１倍から１０倍に増加する。

【0087】

実施形態では、ツベリンタンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ＡＳＯが標的とされる保持されたイントロンの選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、ツベリンタンパク質の量あるいは活性の不足に起因する疾病は、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体内の保持されたイントロンの、選択的スプライシングあるいは異常スプライシングに起因する疾病ではない。実施形態では、選択的スプライシングあるいは異常スプライシングが、遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体に生じうる。しかしながら、本発明の組成物および方法は、この選択的スプライシングあるいは異常スプライシングを予防しないし、修正しない。

【0088】

実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から部分的機能的ツベリンタンパク質を発現し、その部分的機能性ツベリンタンパク質は、フレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子から非機能的ツベリンタンパク質を発現し、その非機能的ツベリンタンパク質は、１つの対立遺伝子中のフレームシフト変異、ナンセンス変異、ミスセンス変異、あるいは部分的な遺伝子欠失に起因する。実施形態では、本発明の方法を使用して処置された被験体は、１つの対立遺伝子にＴＳＣ２全遺伝子欠失を有する。

【0089】

実施形態では、被験体は、Ｒ６１１Ｑ／ＷおよびＲ９０５Ｗから選択されたＴＳＣ２ミスセンス変異を有する。実施形態では、被験体は、エクソン３８に少なくとも６つのアミノ酸のＴＳＣ２欠失突然変異を有する。実施形態では、被験体は、トリプトファンまたはグルタミンのためのアルギニン６１１のＴＳＣ２置換突然変異を有する。実施形態では、当技術分野において既知の、および、例えば先に参照された（Ａｕ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．，２００４，１９：６９９－７０９）等の文献に記載された、任意のＴＳＣ２突然変異を有する被験体が、本発明の方法および組成物を使用して処置される。

【0090】

＜ツベリンタンパク質発現を増加させるためのＴＡＮＧＯの使用＞
前述したように、実施形態では、核内遺伝子出力の標的とされた増強（ＴＡＮＧＯ）は、ツベリンタンパク質の発現を増加させるために、本発明の方法において使用される。これらの実施形態では、ツベリンタンパク質をコードする保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体（ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）は、細胞の核内にある。ツベリンタンパク質をコードする、保持されたイントロン、５’スプライス部位に隣接するエクソン、および３’スプライス部位に隣接するエクソンを含むＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を有する細胞を、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に対して相補的なアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）と接触させる。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分へのＡＳＯのハイブリダイゼーションは、保持されたイントロンのスプライス部位（５’スプライス部位あるいは３’スプライス部位）のスプライシングを増強し、その後の標的タンパク質産生を増加させる。

【0091】

用語「ｍＲＮＡ前駆体」および「ｍＲＮＡ前駆体の転写産物」は、交換可能に使用され、少なくとも１つのイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体種を指すこともある。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含む。実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップおよびポリＡ末端の両方を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は、５’－７－メチルグアノシンキャップ、および／またはポリＡ末端を含まない。タンパク質に翻訳されない場合（あるいは核から細胞質へと輸送された場合）、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物は非生産的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子である。

【0092】

本明細書において使用されるように、「保持されたイントロン含有ｍＲＮＡ前駆体」（「ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」）は、少なくとも１つの保持されたイントロンを含むｍＲＮＡ前駆体の転写産物である。ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、保持されたイントロン、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接するエクソン、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接するエクソンを含み、標的タンパク質をコードする。「標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体」は、完全にスプライシングされた場合に、標的タンパク質をコードすると解される。「保持されたイントロン」は、同じ遺伝子によってコードされた、隣接するイントロン等の１つ以上の他のイントロンが、同じｍＲＮＡ前駆体の転写産物からスプライシングアウトされた場合に、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物に存在するイントロンである。いくつかの実施形態では、保持されたイントロンは、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において最も豊富なイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞内の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も豊富なイントロンであり、当該ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団は２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の集団において最も豊富なイントロンに標的とされたアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされた、または結合する保持されたイントロンを含む集団内の、２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。実施形態では、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡは、それによって産生される。「成熟ｍＲＮＡ」および「完全にスプライシングされたｍＲＮＡ」の用語は、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡ（例えば、核から細胞質へと輸送され、標的タンパク質に翻訳されたｍＲＮＡ）、あるいは完全に処理された機能的ＲＮＡを記載するように、本明細書において交換可能に使用される。用語「生産的ｍＲＮＡ」もまた、標的タンパク質をコードする完全に処理されたｍＲＮＡについて記載するように使用することができる。実施形態では、標的領域は、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団に最も豊富な保持されたイントロンにある。実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において最も豊富な保持されたイントロンは、イントロン４、２５、２６、３１、３２、２５および２６、または３１および３２である。実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に最も豊富な保持されたイントロンは、イントロン２６である。実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に最も豊富な保持されたイントロンは、イントロン３１である。いくつかの実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において最も豊富な保持されたイントロンは、イントロン２６であり、またツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において２番目に豊富な保持されたイントロンは、イントロン３１である。

【0093】

実施形態では、保持されたイントロンは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、あるいは少なくとも約５０％の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。実施形態では、保持されたイントロンはすなわち、約５％～約１００％、約５％～約９５％、約５％～約９０％、約５％～約８５％、約５％～約８０％、約５％～約７５％、約５％～約７０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約６５％、約５％～約６０％、約５％～約５５％、約５％～約５０％、約５％～約４５％、約５％～約４０％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約１０％～約１００％、約１０％～約９５％、約１０％～約９０％、約１０％～約８５％、約１０％～約８０％、約１０％～約７５％、約１０％～約７０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約６５％、約１０％～約６０％、約１０％～約５５％、約１０％～約５０％、約１０％～約４５％、約１０％～約４０％、約１０％～約３５％、約１０％～約３０％、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１５％～約１００％、約１５％～約９５％、約１５％～約９０％、約１５％～約８５％、約１５％～約８０％、約１５％～約７５％、約１５％～約７０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約６５％、約１５％～約６０％、約１５％～約５５％、約１５％～約５０％、約１５％～約４５％、約１５％～約４０％、約１５％～約３５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２５％、約２０％～約１００％、約２０％～約９５％、約２０％～約９０％、約２０％～約８５％、約２０％～約８０％、約２０％～約７５％、約２０％～約７０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約６５％、約２０％～約６０％、約２０％～約５５％、約２０％～約５０％、約２０％～約４５％、約２０％～約４０％、約２０％～約３５％、約２０％～約３０％、約２５％～約１００％、約２５％～約９５％、約２５％～約９０％、約２５％～約８５％、約２５％～約８０％、約２５％～約７５％、約２５％～約７０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約６５％、約２５％～約６０％、約２５％～約５５％、約２５％～約５０％、約２５％～約４５％、約２５％～約４０％、あるいは約２５％～約３５％の保定の保持率に基づき、保持されたイントロンとして特定されたイントロンである。

【0094】

本明細書において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変化形は、列挙された特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、定義された核酸塩基配列）を含むが、他のいかなる特徴をも除外しないことを示すと解されるべきである。したがって、本明細書において使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は包含的で、追加の列挙されていない特徴（例えば、アンチセンスオリゴマーの場合、追加の列挙されていない核酸塩基の存在）を除外しない。

【0095】

本明細書において提供される組成物および方法のいずれかの実施形態において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」または「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」と置換可能である。「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という句は、特定された特徴（例えば核酸塩基配列）と共に、請求される本発明の性質または機能に実質的に影響しない特徴も必要とするために本明細書で使用される。本明細書で使用される用語「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」は、列挙された特徴（例えば核酸塩基配列）単独の存在を示すために使用される（その結果、特定された核酸塩基配列から成るアンチセンスオリゴマーの場合には、追加の列挙されていない核酸塩基の存在は除外される）。

【0096】

実施形態では、標的領域は、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に２番目に豊富なイントロンである保持されたイントロンにある。例えば、２番目に豊富な保持されたイントロンは、最も豊富な保持されたイントロンよりもむしろ標的とされ得る。その要因は、２番目に豊富な保持されたイントロンのヌクレオチド配列の独自性、特定のヌクレオチド配列を標的とするＡＳＯ設計の容易さ、および／またはＡＳＯによりイントロンを標的とすることから生じるタンパク質産生量の増加である。実施形態では、保持されたイントロンは、細胞内の標的タンパク質をコードする遺伝子から転写されたＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団において２番目に豊富なイントロンであり、そのＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団は、２つ以上の保持されたイントロンを含む。実施形態では、標的タンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体集団における２番目に豊富なイントロンを標的とするアンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオリゴマーが標的とされた、または結合する保持されたイントロンを含む集団において、２つ以上の保持されたイントロンのスプライシングアウトを誘発する。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた（成熟）ＲＮＡが産生される。実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に２番目に多く保持されたイントロンは、イントロン４、２５、２６、３１、３２、２５および２６、または３１および３２である。いくつかの実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体に２番目に豊富に保持されたイントロンは、イントロン３１である。

【0097】

実施形態では、ＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の保持されていないイントロン内にある標的領域に相補的である。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は：保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋１００の領域；または保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－１００の領域内にある。実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されていないイントロンの５’スプライス部位に対する＋１００から、保持されていないイントロンの３’スプライス部位に対する－１００の領域内にある。領域または配列の場所を特定するために使用されるように、「内（ｗｉｔｈｉｎ）」は、列挙される位置で残基を含むように理解される。例えば、＋６から＋１００の領域は、＋６および＋１００の位置に残基を含む。それによって、実施形態では、標的タンパク質をコードする完全にスプライシングされた（成熟）ＲＮＡが産生される。

【0098】

実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の保持されたイントロンは、非効率的にスプライシングされたイントロンである。本明細書で使用されるように、「非効率的にスプライシングされた」は、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のスプライス部位でのスプライシングの頻度と比較して、保持されたイントロンに隣接するスプライス部位（５’スプライス部位または３’スプライス部位）でのスプライシングの頻度が比較的低いことを指し得る。用語「非効率的にスプライシングされた」はまた、スプライス部位でのスプライシングの相対速度または動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を指し得る。この「非効率的にスプライシングされた」イントロンは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体における別のイントロンと比較して、より遅い速度でスプライシングあるいは除去され得る。

【0099】

実施形態では、５’スプライス部位に隣接するエクソンの－３ｅから－１ｅ、および保持されたイントロンの＋１から＋６の９－ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。実施形態では、保持されたイントロンの－１５から－１および３’スプライス部位に隣接するエクソンの＋１ｅの１６ヌクレオチド配列は、対応する野生型配列と同一である。本明細書に使用されるように、「野生型配列」は、生体および科学の情報のＮＣＢＩリポジトリに寄託された公開された参照ゲノムにおけるＴＳＣ２遺伝子に対するヌクレオチド配列を指す。本明細書に使用されるように、「野生型配列」は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ７２４９で見つけられるＴＳＣ２遺伝子に対する標準配列を指す。さらに本明細書で使用されるように、「ｅ」で示されたヌクレオチド位置は、ヌクレオチドがエクソン（例えば、５’スプライス部位に隣接するエクソン、または３’スプライス部位に隣接するエクソン）の配列中に存在することを示す。

【0100】

該方法では、細胞を、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ前駆体の一部に相補的であるＡＳＯと接触させ、結果としてＴＳＣ２の発現が増加する。本明細書で使用されるように、細胞に「接触させる」または投与することは、ＡＳＯと細胞が相互作用するように、ＡＳＯを細胞に即座に近接させる方法を指す。ＡＳＯと接触させられる細胞は、ＡＳＯを細胞へと取り込む又は輸送する。該方法は、疾病または疾患に関係する又は疾病または疾患に関連する細胞を、本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯを細胞型に対して標的とする、ＡＳＯと疾病または疾患に関係する又は疾病または疾患に関連する細胞との間の接触を増強する、またはＡＳＯの取り込みを増強するために、さらに修飾され得るかまたは別の分子に結合され得る（例えば、共有結合される）。

【0101】

本明細書で使用されるように、用語「タンパク質産生を増加させる」または「標的タンパク質の発現を増加させる」は、細胞中のｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の量を増加させることを意味する。「標的タンパク質」は、発現／産生の増加が望まれるタンパク質で有り得る。

【0102】

実施形態では、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的部位に相補的であるＡＳＯに、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体を発現する細胞を接触させることにより、ｍＲＮＡ前駆体によってコードされたツベリンタンパク質（例えば標的タンパク質）の量の測定可能な増加をもたらす。タンパク質の産生を測定または検出する方法は、当業者に明白となり、あらゆる既知の方法、例えば、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡを含む。

【0103】

実施形態では、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡの転写産物の標的部位に相補的であるＡＳＯに、細胞を接触させることにより、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％の産生されたツベリンタンパク質の量の増加をもたらす。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞によって産生されたツベリンタンパク質の総量は、対照の化合物により生産された標的タンパク質の量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、 約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、 約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも４倍、 少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加される。対照化合物は、例えば、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に相補的でないオリゴヌクレオチドでもよい。

【0104】

いくつかの実施形態では、細胞を、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に相補的であるＡＳＯと接触させることで、標的タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡを含むＴＳＣ２をコードするｍＲＮＡ量の増加がもたらされる。いくつかの実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの量は、ＡＳＯの欠如／処置の欠如下における細胞によって産生されたタンパク質の量と比較して、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、または１０００％増加する。実施形態では、アンチセンスオリゴマーが接触させられた細胞内で産生される、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡの総量は、未処理の細胞、例えば未処理の細胞または対照の化合物により処理された細胞内で産生された成熟ＲＮＡの量と比較して、約１．１倍から約１０倍、約１．５倍から約１０倍、約２倍から約１０倍、約３倍から約１０倍、約４倍から約１０倍、約１．１倍から約５倍、約１．１倍から約６倍、約１．１倍から約７倍、 約１．１倍から約８倍、約１．１倍から約９倍、約２倍から約５倍、約２倍から約６倍、約２倍から約７倍、約２倍から約８倍、約２倍から約９倍、約３倍から約６倍、約３倍から約７倍、約３倍から約８倍、約３倍から約９倍、約４倍から約７倍、 約４倍から約８倍、約４倍から約９倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加する。対照化合物は、例えば、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部位に相補的でないオリゴヌクレオチドでもよい。

【0105】

＜ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシング＞
本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、ツベリンタンパク質の量または活性の不足がもたらす結節性硬化症を有する被験体において、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルを増加させることによって、細胞内のツベリンタンパク質の発現を増加させるのに有用である。特に、本明細書に記載されるような方法および組成物は、ツベリンタンパク質をコードするＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の転写産物からの保持されたイントロンの構成的スプライシングを誘発し、それによって、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはツベリンタンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡのレベルが増加し、ツベリンタンパク質の発現が増加する。

【0106】

ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去する。この保持されたイントロンは、野生型スプライス配列を有する。構成的スプライシングは、本明細書で使用されるように、遺伝子または対立遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有する遺伝子または対立遺伝子から転写された、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンのスプライシングを包含しない。例えば、本明細書で提供される方法およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して誘発された、保持されたイントロンの構成的スプライシングは、ｍＲＮＡ前駆体における異常スプライシングを修正しない、あるいはｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングに影響せず、結果的に標的タンパク質または機能的ＲＮＡの発現が増加する。

【0107】

実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去する。このＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、野生型の遺伝子または対立遺伝子、あるいは多形性の遺伝子または対立遺伝子から転写され、完全に機能的な標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。前記遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。

【0108】

いくつかの実施形態では、ＴＳＣ２タンパク質をコードするＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体からの保持されたイントロンの構成的スプライシングは、ツベリンタンパク質をコードするＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から、保持されたイントロンを正しく除去する。前記ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、野生型対立遺伝子からの産生と比較して減少したレベルで標的遺伝子あるいは機能的ＲＮＡを産生する遺伝子または対立遺伝子から転写される。そして、前記遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的にスプライシングされた保持されたイントロンの正しい除去は、同等の野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較した場合に機能的である、標的タンパク質または機能的ＲＮＡの産生をもたらす。

【0109】

他の実施形態では、構成的スプライシングは、保持されたイントロンをＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体から正しく除去する。このＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、同等の野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較して、機能の低下した形態で産生された標的タンパク質または機能的ＲＮＡをコードする遺伝子または対立遺伝子から転写される。そして、前記遺伝子または対立遺伝子は、保持されたイントロンの選択的スプライシングまたは異常スプライシングを引き起こす突然変異を有さない。これらの実施形態では、構成的にスプライシングされた保持されたイントロンの正しい除去は、部分的に機能的な標的タンパク質、または同等の野生型タンパク質または機能的ＲＮＡと比較した場合に、部分的に機能的である機能的ＲＮＡの産生をもたらす。

【0110】

構成的スプライシングによる保持されたイントロンの「正しい除去」は、エクソンのいかなる部分も除去することなく、全イントロンを除去することを指す。

【0111】

実施形態では、本明細書に記載されるような、あるいは本明細書に記載される方法に使用されるアンチセンスオリゴマーは、ＴＳＣ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングまたは異常スプライシングを調節することによって、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの量、またはツベリンタンパク質量を増加させない。選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、ＲＮＡ種の配列および長さを解析する任意の既知の方法を使用して、例えば、ＲＴ－ＰＣＲによって、および本明細書および文献中で別記される方法を使用して測定することができる。実施形態では、選択的スプライシングまたは異常スプライシングの調節は、少なくとも１０％または１．１倍でスプライシングされた、対象となる種の量の増加または減少に基づいて判定される。実施形態では、調節は、本発明の方法においてツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡの増加の判定に関連して本明細書に記載されるように、少なくとも１０％から１００％または１．１倍から１０倍のレベルでの増加または減少に基づいて判定される。

【0112】

実施形態では、該方法は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、野生型ＴＳＣ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、該方法は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、全長の野生型ＴＳＣ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された方法である。実施形態では、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体は、全長のＴＳＣ２ ｍＲＮＡ前駆体の部分的スプライシングによって産生された。これらの実施形態では、全長のＴＳＣ２ ｍＲＮＡ前駆体は、野生型スプライス部位配列を有する保持されたイントロンのスプライシングと比較して、保持されたイントロンの正しいスプライシングを損なわない保持されたイントロンのスプライス部位に多型性を有し得る。

【0113】

実施形態では、ツベリンタンパク質をコードするｍＲＮＡは、全長の成熟ｍＲＮＡまたは野生型成熟ｍＲＮＡである。これらの実施形態では、全長の成熟ｍＲＮＡは、野生型成熟ｍＲＮＡによってコードされたツベリンタンパク質の活性と比較して、成熟ｍＲＮＡによってコードされた標的タンパク質または機能的ＲＮＡの活性に影響しない多型性を有し得る。

【0114】

＜アンチセンスオリゴマー＞
本開示の一態様は、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的とされた部分に結合することによってスプライシングを増強するアンチセンスオリゴマーを含む組成物である。本明細書で使用されるように、用語「ＡＳＯ」および「アンチセンスオリゴマー」は、交換可能に使用され、ワトソン・クリック塩基対またはゆらぎ塩基対（Ｇ－Ｕ）によって標的核酸（例えば、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）配列にハイブリダイズする、核酸塩基を含む、ポリヌクレオチドなどのオリゴマーを指す。ＡＳＯは、標的配列に相補的な又はほぼ相補的（例えば、標的配列に結合し、スプライス部位でスプライシングを増強させるのに十分な相補性）である正確な配列を有し得る。ＡＳＯは、標的核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的とされた部分）に結合し（ハイブリダイズし）、生理学的条件下でハイブリダイズされたままであるように設計されている。典型的に、ＡＳＯは、意図した（標的とされた）核酸配列以外の部位にハイブリダイズする場合、標的核酸でない限られた数の配列に（標的核酸以外の少数の部位に）ハイブリダイズする。ＡＳＯの設計は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の標的とされた部分の核酸配列、或いはゲノムまたは細胞のｍＲＮＡ前駆体またはトランスクリプトームにおける他の場所での十分に類似した核酸配列の発生を考慮に入れることができ、その結果、ＡＳＯが他の部位に結合し「オフターゲット」効果を引き起こす可能性は限定される。例えば、発明の名称「Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ｎｏｎｓｅｎｓｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍＲＮＡ Ｄｅｃａｙ」のＷＯ２０１５／０３５０９１として公開されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５４１５１におけるものなどの、当業者に既知のアンチセンスオリゴマーは、本明細書に記載される方法を実施するために使用され得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、標的核酸またはＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的とされた部分に「特異的にハイブリダイズする」または「特異的である」。典型的に、そのようなハイブリダイゼーションは、３７℃より実質的に高い融解温度（Ｔｍ）で、好ましくは少なくとも５０℃で、および典型的に６０℃からおよそ９０℃の間で生じる。そのようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、厳しいハイブリダイゼーション条件に対応している。与えられたイオン強度およびｐＨで、Ｔｍは、標的配列の５０％が相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。

【0116】

オリゴヌクレオチドなどのオリゴマーは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチド間の逆平行構成で生じるときに、互いに「相補的」である。二本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの鎖の１つと第２のポリヌクレオチドの鎖の１つとの間に生じる場合に、別のポリヌクレオチドに「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に容認された塩基対合則に従って、互いに水素結合を形成すると予期される対向する鎖における塩基の割合（例えばパーセンテージ）の点から数量化できる。アンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の配列は、ハイブリダイズするその標的核酸の配列に１００％相補的である必要はない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的とされる標的核酸配列内の標的部位に対する、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列相補性を含むことができる。例えば、オリゴマー化合物の２０の核酸塩基のうちの１８が標的部位に相補的であり、それ故、特異的にハイブリダイズするＡＳＯは９０パーセントの相補性を表わす。この例において、残りの相補的でない核酸塩基は、ともにクラスター化され得るか、または相補的な核酸塩基と分散され（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）、互いに又は相補的な核酸塩基に隣接している必要はない。ＡＳＯの標的核酸の領域とのパーセント相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム（基礎的なローカルアライメント検索ツール）および当該技術分野で既知のＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５， ４０３－４１０； Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， １９９７， ７， ６４９－６５６）を慣例的に使用して判定され得る。

【0117】

ＡＳＯは、標的配列におけるすべての核酸塩基にハイブリダイズする必要はなく、それがハイブリダイズする核酸塩基は、隣接しているか又は隣接していないかもしれない。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物の１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズし得、その結果、介在する又は隣接するセグメントは、ハイブリダイゼーション事象に関係しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造が形成され得る）。特定の実施形態では、ＡＳＯは、標的ｍＲＮＡ前駆体の転写産物において隣接していない核酸塩基にハイブリダイズする。例えば、ＡＳＯは、ＡＳＯがハイブリダイズしない１つ以上の核酸塩基によって分離される、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物における核酸塩基にハイブリダイズすることができる。

【0118】

本明細書に記載されるＡＳＯは、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に存在する核酸塩基に相補的である核酸塩基を含む。用語「ＡＳＯ」は、オリゴヌクレオチド、および標的ｍＲＮＡ上の相補的な核酸塩基にハイブリダイズすることができる核酸塩基を含むが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの糖部を含まない、他のオリゴマー分子を具体化する。ＡＳＯは、自然発生のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、修飾されたヌクレオチド、またはそれらの２つ又は３つの任意の組み合わせを含み得る。用語「自然発生のヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖類及び／又は修飾された骨格を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯのヌクレオチドのすべてが、修飾されたヌクレオチドである。本明細書に記載される方法および組成物と適合性のあるＡＳＯの化学修飾およびＡＳＯの成分は、当業者に明白であり、例えば、米国特許第８，２５８，１０９号 Ｂ２、米国特許第５，６５６，６１２号、米国特許公開番号２０１２／０１９０７２８、およびＤｉａｓ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００２，３４７－３５５で見られ得、それら全体が引用によって本明細書に組み込まれる。

【0119】

ＡＳＯの核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルなどの自然発生の未修飾の核酸塩基、または標的ｍＲＮＡ前駆体上に存在する核酸塩基との水素結合が可能であるように未修飾の核酸塩基に十分に類似している合成または修飾された核酸塩基であり得る。修飾された核酸塩基の例としては、限定されないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、および５－ヒドロキシメチルシトシンが挙げられる。

【0120】

本明細書に記載されるＡＳＯはまた、オリゴマーの成分に結合する骨格構造を含む。用語「骨格構造」および「オリゴマー結合」は、交換可能に使用され、ＡＳＯの単量体間の結合を指し得る。自然発生のオリゴヌクレオチドでは、骨格は、オリゴマーの糖部を結合する３’－５’ホスホジエステル結合を含む。本明細書に記載されるＡＳＯの骨格構造またはオリゴマー結合は、（限定されないが）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｎｉｌａｄａｔｅ）、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）などを含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：９０８１（１９８６）； Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７（１９８４），Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８），Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ６：５３９ １９９１；Ｚｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ｐｐ．８７－１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１））；Ｓｔｅｃ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３（１９９０）を参照。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの骨格構造は、亜リン酸を含有していないが、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはカルバミン酸塩、アミド、および直鎖および環式の炭化水素基を含む連結基において、ペプチド結合を含有している。いくつかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、骨格修飾は、ホスホラミデート結合である。

【0121】

実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、ランダムである。実施形態では、ＡＳＯ骨格のリンヌクレオチド間の結合の各々での立体化学は、制御され、ランダムではない。例えば、引用によって本明細書に組み込まれた米国特許出願公報第２０１４／０１９４６１０号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」は、核酸オリゴマーにおいて各リン原子でキラリティーの掌性（ｈａｎｄｅｄｎｅｓｓ）を独立して選択する方法について記載している。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、ランダムでないリンヌクレオチド間の結合を有するＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、純粋なジアステレオマーＡＳＯを含む。実施形態では、本発明の方法に使用される組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％から約１００％、約９１％から約１００％、約９２％から約１００％、約９３％から約１００％、約９４％から約１００％、約９５％から約１００％、約９６％から約１００％、約９７％から約１００％、約９８％から約１００％、または約９９％から約１００％のジアステレオマー純度を有するＡＳＯを含む。

【0122】

実施形態では、ＡＳＯは、そのリンヌクレオチド間の結合でＲｐおよびＳｐの構成のランダムでない混合物を有している。例えば、良好な活性とヌクレアーゼの安定性のバランスを達成するために、ＲｐとＳｐの混合がアンチセンスオリゴヌクレオチドに求められることが示唆されてきた（Ｗａｎ， ｅｔ ａｌ．，２０１４「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｈｉｒａｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４２（２２）：１３４５６－１３４６８、これは引用によって本明細書に組み込まれる）。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、または少なくとも約９５％のＲｐと、残りのｓｐ、或いは、約１００％のＲｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＲｐ、約１５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約１００％のＲｐ、約２５％から約１００％のＲｐ、約３０％から約１００％のＲｐ、約３５％から約１００％のＲｐ、約４０％から約１００％のＲｐ、約４５％から約１００％のＲｐ、約５０％から約１００％のＲｐ、約５５％から約１００％のＲｐ、約６０％から約１００％のＲｐ、約６５％から約１００％のＲｐ、約７０％から約１００％のＲｐ、約７５％から約１００％のＲｐ、約８０％から約１００％のＲｐ、約８５％から約１００％のＲｐ、約９０％約１００％のＲｐ、または約９５％から約１００％のＲｐ、約２０％から約８０％のＲｐ、約２５％から約７５％のＲｐ、約３０％から約７０％のＲｐ、約４０％から約６０％のＲｐ、または約４５％から約５５％のＲｐと、残りのＳｐを含む。

【0123】

実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約５～１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、または少なくとも約９５％のＳｐと、残りのＲｐ、あるいは約１００％のＳｐを含む。実施形態では、限定されないが、本明細書で表１に明記されるＡＳＯのいずれかを含む、本発明の方法に使用されるＡＳＯは、約１０％から約１００％のＳｐ、約１５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約１００％のＳｐ、約２５％から約１００％のＳｐ、約３０％から約１００％のＳｐ、約３５％から約１００％のＳｐ、約４０％から約１００％のＳｐ、約４５％から約１００％のＳｐ、約５０％から約１００％のＳｐ、約５５％から約１００％のＳｐ、約６０％から約１００％のＳｐ、約６５％から約１００％のＳｐ、約７０％から約１００％のＳｐ、約７５％から約１００％のＳｐ、約８０％から約１００％のＳｐ、約８５％から約１００％のＳｐ、約９０％から約１００％のＳｐ、または約９５％から約１００％のＳｐ、約２０％から約８０％のＳｐ、約２５％から約７５％のＳｐ、約３０％から約７０％のＳｐ、約４０％から約６０％のＳｐ、または約４５％から約５５％のＳｐと、残りのＲｐを含む。

【0124】

本明細書に記載されるＡＳＯのいずれかは、自然発生のヌクレオチド中に存在するような、リボースまたはデオキシリボースを含む糖部、あるいはモルホリン環を含む、修飾された糖部または糖アナログを含有し得る。修飾された糖部の限定しない例は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノエチル、２’Ｆ；Ｎ３’－＞Ｐ５’ホスホラミデート、２’ジメチルアミノオキシエトキシ、２’ジメチルアミノエトキシエトキシ、２’－グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｄｉｕｍ）、２’－Ｏ－グアニジニウムエチル、カルバミン酸塩修飾した糖、および二環式修飾した糖などの、２’置換基が挙げられる。いくつかの実施形態では、糖部修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’Ｆ、および２’ＭＯＥから選択される。いくつかの実施形態では、糖部修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）におけるような追加の架橋結合である。いくつかの実施形態では、糖アナログは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）などのモルホリン環を含有している。いくつかの実施形態では、糖部は、リボフラノシルまたは２’デオキシリボフラノシルの修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、２’４’－抑制（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）２’Ｏ－メチルオキシエチル（ｃＭＯＥ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、ｃＥｔ ２’４’－抑制２’－ＯエチルＢＮＡ修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、エチレン核酸（ＥＮＡ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、糖部は、ＭＣＥ修飾を含む。修飾は当該技術分野で既知であり、文献、例えば、Ｊａｒｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，「Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖｉｅｗ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２４（１）：３７－４７に記載され、これは、この目的のための引用によって本明細書に組み込まれる。

【0125】

いくつかの例では、ＡＳＯの各単量体は同じ方法で修飾され、例えば、ＡＳＯの骨格の各結合はホスホロチオエート結合を含み、または各リボース糖部は２’Ｏ－メチル修飾を含む。ＡＳＯの単量体成分の各々の上に存在する、そのような修飾は、「均一な修飾」と呼ばれる。いくつかの例では、異なる修飾の組み合わせが望まれ得、例えば、ＡＳＯは、ホスホロジアミデート結合とモルホリン環を含む糖部（モルホリノ）との組み合わせを含み得る。ＡＳＯへの異なる修飾の組み合わせは、「混合修飾」または「混合化学作用」と呼ばれる。

【0126】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の糖部修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の骨格修飾および１つ以上の糖部修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２’ＭＯＥ修飾およびホスホロチオエート骨格を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。本明細書に記載されるＡＳＯのいずれか又はＡＳＯの成分（例えば、核酸塩基、糖部、骨格）は、ＡＳＯの望ましい特性または活性を達成するために或いはＡＳＯの望ましくない特性または活性を減少させるために修飾されてもよい。例えば、ＡＳＯまたはＡＳＯの１つ以上の成分は、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物上の標的配列への結合親和性を増強する；非標的配列への結合を減少させる；細胞のヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ Ｈ）による分解を減少させる；細胞及び／又は細胞の核へのＡＳＯの取り込みを改善する；ＡＳＯの薬物動態（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）または薬力（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ）を変更する；およびＡＳＯの半減期を調節するために修飾され得る。

【0127】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドで構成される。そのようなヌクレオチドで構成されたＡＳＯは、特に、本明細書で開示される方法によく適しており、そのような修飾を有しているオリゴマーは、ヌクレアーゼ分解に対する著しく増強された耐性および増加したバイオアベイラビリティを有すると示されており、これによって、例えば、本明細書に記載されるいくつかの実施形態における経口送達に適するようになる。例えば、Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９０－７；Ｇｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ．２００１；２９６（３）：８９８－９０４を参照。

【0128】

ＡＳＯを合成する方法は当業者に既知である。代替的に又は加えて、ＡＳＯは商用源から得てもよい。

【0129】

他に明記されない限り、一本鎖核酸（例えば、ｍＲＮＡ前駆体の転写産物、オリゴヌクレオチド、ＡＳＯなど）配列の左端は、５’末端であり、一本鎖または二本鎖の核酸配列の左方向は５’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列（一本鎖または二本鎖）の右端または右方向は、３’末端または３’方向である。一般に、核酸中の基準点に対する５’にある領域または配列は「上流」として言及され、核酸中の基準点に対する３’にある領域または配列は「下流」として言及される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向または５’末端は、開始コドン（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｒ ｓｔａｒｔ ｃｏｄｏｎ）が位置する場所であり、一方で、３’末端または３’方向は、終止コドンが位置する場所である。いくつかの態様では、核酸中の基準点の上流にあるヌクレオチドは、負の数によって指定され、基準点の下流にあるヌクレオチドは、正の数によって指定され得る。例えば、基準点（例えば、ｍＲＮＡ中のエクソン－エクソン連結）は「ゼロ」部位として指定され得、基準点に直接隣接し且つその上流にあるヌクレオチドは、「マイナス１」、例えば「－１」と指定され、一方で、基準点に直接隣接し且つその下流にあるヌクレオチドは、「プラス１」、例えば「＋１」と指定される。

【0130】

他の実施形態では、ＡＳＯは、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの５’スプライス部位の下流（３’の方向）であるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分（例えば５’スプライス部位に対して、正の数で示された方向）に対して相補的である（及び、標的部分に結合する）（図１）。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋５００、＋６から＋４００、＋６から＋３００、＋６から＋２００、または＋６から＋１００の領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’スプライス部位に対して、＋１から＋５までのヌクレオチド（５’スプライス部位の下流に位置付けられた最初の５つのヌクレオチド）に対して相補的ではない。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋５０のヌクレオチドの領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的であり得る。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋６から＋９０、＋６から＋８０、＋６から＋７０、＋６から＋６０、＋６から＋５０、＋６から＋４０、＋６から＋３０、または＋６から＋２０の領域内にある標的部分に相補的である。

【0131】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体において保持されたイントロンの３’スプライス部位の上流にある（５’の方向）ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的領域（例えば、負の数で指定された方向）に対して相補的である（図１）。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－５００、－１６から－４００、－１６から－３００、－１６から－２００、－１６から－１００の領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、３’スプライス部位に対して、－１から－１５までのヌクレオチド（３’スプライス部位の上流に位置付けられた最初の１５のヌクレオチド）には相補的ではない。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－５０の領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。いくつかの態様では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１６から－９０、－１６から－８０、－１６から－７０、－１６から－６０、－１６から－５０、－１６から－４０、または－１６から－３０の領域内にある、標的部分に相補的である。

【0132】

実施形態において、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分は、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する＋１００から、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する－１００までの領域内に存在する。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソン内（上流）にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である（図１）。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅの領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する－１ｅから－３ｅのヌクレオチドに相補的ではない。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位に対する－４ｅから－１００ｅ、－４ｅから－９０ｅ、－４ｅから－８０ｅ、－４ｅから－７０ｅ、－４ｅから－６０ｅ、－４ｅから－５０ｅ、－４ｅから－４０ｅ、－４ｅから－３０ｅ、または－４ｅから－２０ｅの領域内にある、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソン内（下流）にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である（図１）。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に隣接しているエクソンにおける＋２ｅから－４ｅの領域内にあるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１ｅに相補的ではない。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、保持されたイントロンの３’スプライス部位に対する＋２ｅから＋１００ｅ、＋２ｅから＋９０ｅ、＋２ｅから＋８０ｅ、＋２ｅから＋７０ｅ、＋２ｅから＋６０ｅ、＋２ｅから＋５０ｅ、＋２ｅから＋４０ｅ、＋２ｅから＋３０ｅ、または＋２ｅから＋２０ｅの領域内にある、ＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の標的部分に相補的である。ＡＳＯは、スプライシングの特異的結合および効果的な増強作用に適する任意の長さでもよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは８から５０の核酸塩基から成る。例えば、ＡＳＯは、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４５または５０の核酸塩基であってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは５０よりも多い核酸塩基から成る。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、８から５０の核酸塩基、８から４０の核酸塩基、８から３５の核酸塩基、８から３０の核酸塩基、８から２５の核酸塩基、８から２０の核酸塩基、８から１５の核酸塩基、９から５０の核酸塩基、９から４０の核酸塩基、９から３５の核酸塩基、９から３０の核酸塩基、９から２５の核酸塩基、９から２０の核酸塩基、９から１５の核酸塩基、１０から５０の核酸塩基、１０から４０の核酸塩基、１０から３５の核酸塩基、１０から３０の核酸塩基、１０から２５の核酸塩基、１０から２０の核酸塩基、１０から１５の核酸塩基、１１から５０の核酸塩基、１１から４０の核酸塩基、１１から３５の核酸塩基、１１から３０の核酸塩基、１１から２５の核酸塩基、１１から２０の核酸塩基、１１から１５の核酸塩基、１２から５０の核酸塩基、１２から４０の核酸塩基、１２から３５核酸塩基、１２から３０核酸塩基、１２から２５の核酸塩基、１２から２０の核酸塩基、１２から１５の核酸塩基、１３から５０の核酸塩基、１３から４０の核酸塩基、１３から３５の核酸塩基、１３から３０の核酸塩基、１３から２５の核酸塩基、１３から２０の核酸塩基、１４から５０の核酸塩基、１４から４０の核酸塩基、１４から３５の核酸塩基、１４から３０の核酸塩基、１４から２５の核酸塩基、１４から２０の核酸塩基、１５から５０の核酸塩基、１５から４０の核酸塩基、１５から３５の核酸塩基、１５から３０の核酸塩基、１５から２５の核酸塩基、１５から２０の核酸塩基、２０から５０の核酸塩基、２０から４０の核酸塩基、２０から３５の核酸塩基、２０から３０の核酸塩基、２０から２５の核酸塩基、２５から５０の核酸塩基、２５から４０の核酸塩基、２５から３５の核酸塩基、または２５から３０の核酸塩基の長さである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが３０のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２９のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２８のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２７のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２６のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２５のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２４のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２３のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２２のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが２０のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１９のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１８のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１７のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１６のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１５のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１４のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１３のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１２のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１１のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは長さが１０のヌクレオチドである。

【0135】

幾つかの実施形態では、異なる化学作用を有するがＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の同じ標的部分に相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。幾つかの実施形態では、ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体の異なる標的部分に対して相補的である２つ以上のＡＳＯが使用される。

【0136】

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的とする部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分は、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分のような脂質部分、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシルの残留物、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｕｌＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース－６－リン酸塩）、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分で抱合される。抱合体は、例えばリンカーを使用して、当技術分野において理解され、文献中に記載されるように、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの１つ以上に連結され得る。リンカーは、二価または三価の分枝したリンカーを含むことができる。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチド抱合体を調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。

【0137】

幾つかの実施形態では、ＡＳＯによって標的とされる核酸は、真核細胞などの細胞において発現されたＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体である。幾つかの実施形態では、用語「細胞」は、細胞の集団を指し得る。幾つかの実施形態では、細胞は被験体内に存在する。幾つかの実施形態では、細胞は被験体から分離されている。幾つかの実施形態では、細胞はエクスビボにある。幾つかの実施形態では、細胞は、疾病または疾患関連の細胞または細胞株である。幾つかの実施形態では、細胞はインビトロに（例えば、細胞培養液中に）ある。

【0138】

＜医薬組成物＞
記載された組成物のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む及び記載された方法のいずれかにおいて使用するための医薬組成物または製剤は、製薬産業において周知の及び公開された文献に記載された従来の技術に従って調製され得る。実施形態では、被験体を処置するための医薬組成物または製剤は、上記されるような有効量のアンチセンスオリゴマー、あるいはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、またはエステル、および薬学的に許容可能な希釈剤を含む。医薬製剤のアンチセンスオリゴマーはさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体を含み得る。

【0139】

薬学的に許容可能な塩は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などがない、ヒトおよび下等動物の組織と接触させる使用に適しており、合理的なベネフィット・リスク比に相応している（例えば、Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１－１９（１９７７）を参照し、これは、この目的のための参照によって本明細書に組み込まれる）。その塩は、化合物の最終的な分離および精製中に、または別に遊離塩基の官能基を適切な有機酸と反応させることによって、インサイチュで調製され得る。薬学的に許容可能で無毒な酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸か、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸か、またはイオン交換などの他の文書で立証された方法を用いることによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容可能な塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属の塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどを含む。さらに薬学的に許容可能な塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された、無毒なアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンのカチオンを含む。

【0140】

実施形態では、組成物は、限定されないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、坐剤、および浣腸剤などの多くの考えられ得る剤形のいずれかへと製剤される。実施形態では、組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体状の懸濁液として製剤される。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、及び／又はデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる特定の物質をさらに含み得る。その懸濁液はまた、安定化剤も含み得る。実施形態では、本発明の医薬製剤または組成物は、限定されないが、溶液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、発泡体またはリポソーム含有製剤（例えば、カチオンリポソームまたは非カチオンリポソーム）を含む。

【0141】

本発明の医薬組成物または製剤は、必要に応じた及び当業者に周知の又は公開された文献に記載された、１つ以上の浸透促進剤、担体、賦形剤、または他の活性または不活性の成分を含み得る。実施形態では、リポソームは、立体的に安定したリポソーム、例えば、１つ以上の特定の脂質を含むリポソームも含む。これらの特定の脂質によって、結果として、リポソームの循環寿命は高められる。実施形態では、立体的に安定したリポソームは、１つ以上の糖脂質を含むか、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの１つ以上の親油性ポリマーを用いて誘導体化される。実施形態では、界面活性剤は、医薬製剤または組成物中に含まれる。薬物製品、製剤およびエマルジョンにおける界面活性剤の使用は、当技術分野においてよく知られている。実施形態では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な送達を達成する、例えば、細胞膜にわたる拡散を助ける及び／又は脂溶性薬物の浸透性を増強するために、浸透促進剤を利用する。実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、または非キレート性の非界面活性剤である。

【0142】

実施形態では、医薬製剤は、複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、別の薬物または治療剤と組み合わせて投与される。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られている方法によって、血液脳関門を介する主題のアンチセンスオリゴヌクレオチドの浸透を促進することができる１つ以上の薬剤とともに投与される。例えば、筋組織における運動ニューロンへのアデノウイルスベクターの投与による薬剤の送達は、米国特許第６，６３２，４２７号「Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ－ｖｅｃｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。脳、例えば、線条体、視床、海馬、または黒質への直接のベクターの送達は、例えば、米国特許第６，７５６，５２３号「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｆｏｒｅｉｇｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ ｉｎ ｂｒａｉｎ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。

【0143】

実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、望ましい薬学的特性または薬力学的特性を提供する薬剤と連結または抱合される。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、血液脳関門にわたる浸透または輸送を促進するために、当技術分野において知られている物質、例えばトランスフェリン受容体に対する抗体に結合される。実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、アンチセンス組成物をより効果的にするために、または血液脳関門にわたる輸送を増加させるために、ウイルスベクターに連結される。実施形態では、浸透性の血液脳関門の破壊は、糖、例えば、メソ－エリトリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（－）フルクトース、Ｄ（－）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（－）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（－）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（－）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（－）フコース、Ｄ（－）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、およびＬ（－）リキソース、あるいはアミノ酸、例えば、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン、バリン、およびタウリンの注入によって助けられる。血液脳関門の浸透を増強するための方法および物質は、例えば、米国特許第４，８６６，０４２号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、米国特許第６，２９４，５２０号「Ｍａｔｅｒｉａｌ ｆｏｒ ｐａｓｓａｇｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」、および米国特許第６，９３６，５８９号「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」に記載され、これら各々は引用によって本明細書に組み込まれる。

【0144】

実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つ以上の部分または抱合体、例えば、オリゴヌクレオチドの活性または細胞取り込みを増強する標的とする部分または他の抱合体に化学的に連結される。そのような部分は、限定されないが、例えば、コレステロール部分、コレステリル部分のような脂質部分、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシルの残留物、ポリアミン鎖もしくはポリエチレングリコール鎖、あるいはアダマンタン酢酸を含む。親油性部分を含むオリゴヌクレオチドおよび調製方法は、公開された文献に記載されている。他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定されないが、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－Ａｃ－グルコサミン（ＧｕｌＮＡｃ）、またはマンノース（例えば、マンノース－６－リン酸塩）、脂質、またはポリ炭化水素化合物を含む部分で抱合される。抱合体は、例えばリンカーを使用して、当技術分野において理解され、文献中に記載されるように、糖、塩基またはリン酸基上の幾つかの位置のいずれかでアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチドの１つ以上に連結され得る。リンカーは、二価または三価の分岐したリンカーを含むことができる。実施形態では、抱合体は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの３’末端に結合される。オリゴヌクレオチドを調製する方法は、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」に記載され、これは引用によって本明細書に組み込まれる。

【0145】

＜被験体の処置＞
本明細書で提供される組成物のいずれかが、個体に投与され得る。「個体」は、「被験体」または「患者」と互換的に使用されてもよい。個体は哺乳動物でもよく、例えばヒト、あるいはヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ロバ、ヤギ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、またはヒツジなどの動物であってもよい。実施形態では、個体はヒトである。実施形態では、個体は、胎児、胚、または小児である。他の実施形態では、個体は、植物などの別の真核生物であってもよい。幾つかの実施形態では、本明細書で提供される化合物は、細胞にエクスビボで投与される。

【0146】

幾つかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、疾患または障害を処置する方法として個体に投与される。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される疾患のいずれかなどの遺伝子疾患を有している。幾つかの実施形態では、個体は、本明細書に記載される疾患のいずれかなどの疾患を有しているリスクがある。幾つかの実施形態では、個体は、タンパク質の量の不足またはタンパク質の活性の不足によって引き起こされた疾患または障害を有するリスクが増加している。個体が、タンパク質の量の不足またはタンパク質の活性の不足によって引き起こされる疾患または障害を有するリスクが増加している場合、該方法は、防止的または予防的な処置を含む。例えば、個体は、疾患の家族歴のために、そのような疾病または障害を有するリスクが増加している場合がある。典型的には、そのような疾患または障害を有するリスクが増加している個体は、予防的処置から（例えば、疾患または障害の発症または進行を予防するか又は遅らせることによる）恩恵を受ける。

【0147】

本発明のＡＳＯの投与に適切な経路は、ＡＳＯの送達が望まれる細胞型に応じて変わり得る。複数の組織および臓器が、結節硬化症による影響を受け、脳、腎臓、皮膚、肺および心臓は、最も著しく影響を受ける組織である。本発明のＡＳＯは、局所的に患者の皮膚に投与されるか、または肺送達によって肺に投与され得る。本発明のＡＳＯは、例えば、髄腔内注射、脳室内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって、患者に非経口で投与されてもよい。実施形態では、脳、腎臓、皮膚、肺または心臓への送達が行われる。実施形態では、胎児は、例えば、ＡＳＯ組成物を胎児に対して直接的または間接的に（例えば母親を介して）投与することによって子宮内で処置される。

【0148】

＜スプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する方法＞
本発明の範囲内にはまた、特に標的イントロンにおけるＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを増強する追加のＡＳＯを特定する（判定する）方法がある。ｍＲＮＡ前駆体の標的領域内で様々なヌクレオチドを特異的にハイブリダイズするＡＳＯは、標的イントロンのスプライシングの速度及び／又は程度を改善するＡＳＯを特定する（判定する）ためにスクリーニングされてもよい。幾つかの実施形態では、ＡＳＯは、スプライシング抑制因子／サイレンサーの結合部位をブロックまたは妨害し得る。イントロンの標的領域にハイブリダイズされたときに望ましい効果（例えば、スプライシング、タンパク質または機能的なＲＮＡ産生の増強）を結果としてもたらすＡＳＯを特定する（判定する）ために、当該技術分野における既知の方法が使用されてもよい。これらの方法はまた、保持されたイントロンに隣接するエクソンにおいて、または保持されていないイントロンにおいて標的領域に結合することによって保持されたイントロンのスプライシングを増強するＡＳＯの特定のためにも使用することができる。使用され得る方法の一例が以下に提供される。

【0149】

ＡＳＯ「ウォーク（ｗａｌｋ）」と呼ばれる、１ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的部位にハイブリダイズするように設計されているＡＳＯを使用して実行され得る。例えば、ＡＳＯウォークに使用されるＡＳＯは、保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００のヌクレオチド上流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの上流に位置するエクソンの配列の一部）から、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位のおよそ１００のヌクレオチド下流まで、及び／又は保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００のヌクレオチド上流から、標的とされた／保持されたイントロンの３’スプライス部位のおよそ１００のヌクレオチド下流（例えば、標的とされた／保持されたイントロンの下流に位置するエクソンの配列の一部）まで、５つのヌクレオチドごとに敷き詰められ（ｔｉｌｅｄ）得る。例えば、１５のヌクレオチドの長さの第１のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋６から＋２０まで特異的にハイブリダイズするように設計され得る。第２のＡＳＯは、標的とされた／保持されたイントロンの５’スプライス部位に対するヌクレオチド＋１１から＋２５まで特異的にハイブリダイズするように設計されている。ＡＳＯは、ｍＲＮＡ前駆体の標的領域に及ぶように設計されている。実施形態では、ＡＳＯは、より密に、例えば、１、２、３、または４つのヌクレオチドごとに敷き詰められ得る。さらに、ＡＳＯは、５’スプライス部位の１００のヌクレオチド下流から３’スプライス部位の１００のヌクレオチド上流まで敷き詰められ得る。

【0150】

１つ以上のＡＳＯ、または１つの対照ＡＳＯ（標的部位にハイブリダイズするとは予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）は、例えばトランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体（例えば、本明細書で別記されるＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体）を発現する疾患関連の細胞株へと送達される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照のＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ－ＰＣＲ産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の比率、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質または機能的ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが望ましい効果（例えば、タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価する及び／又は定量するための当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

【0151】

ＡＳＯ「ミクロウォーク（ｍｉｃｒｏ－ｗａｌｋ）」と呼ばれる第２ラウンドのスクリーニングは、ｍＲＮＡ前駆体の標的部位にハイブリダイズするように設計されたＡＳＯを使用して実行され得る。ＡＳＯミクロウォークに使用されるＡＳＯは、ＡＳＯでハイブリダイズされたときに結果的にスプライシングを増強させるｍＲＮＡ前駆体のヌクレオチド酸配列をさらに改良する（ｒｅｆｉｎｅ）ために、１つのヌクレオチドごとに敷き詰められる。

【0152】

標的イントロンのスプライシングを促進するＡＳＯによって定義された領域は、１－ｎｔステップ（１－ｎｔ ｓｔｅｐｓ）で間隔を置かれたＡＳＯの他に、典型的に１８－２５ｎｔである、より長いＡＳＯを含む、ＡＳＯ「ミクロウォーク」によって、より詳細に調査される。

【0153】

上にＡＳＯウォークに関して記載されたように、ＡＳＯミクロウォークは、１つ以上のＡＳＯ、または対照ＡＳＯ（標的部位にハイブリダイズすると予期されていない配列である、スクランブル配列を有するＡＳＯ）を、例えば、トランスフェクションによって、標的ｍＲＮＡ前駆体を発現する疾患関連の細胞株へと送達することにより実行される。ＡＳＯの各々のスプライシングを誘発する効果は、本明細書で記載されるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、スプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用する逆転写酵素（ＲＴ）－ＰＣＲによって評価され得る（「イントロン保持事象の特定」を参照）。対照のＡＳＯ処理された細胞と比較して、ＡＳＯ処理された細胞におけるスプライスジャンクションに及ぶプライマーを使用して生成されたＲＴ－ＰＣＲ産物が減少または欠如することは、標的イントロンのスプライシングが増強されたことを示している。幾つかの実施形態では、スプライシング効率、スプライシングされていないｍＲＮＡ前駆体に対するスプライシングされたｍＲＮＡ前駆体の比率、スプライシングの速度、またはスプライシングの程度は、本明細書に記載されるＡＳＯを使用して改善され得る。標的ｍＲＮＡ前駆体によってコードされるタンパク質または機能ＲＮＡの量も、各ＡＳＯが望ましい効果（例えば、タンパク質産生の増強）を達成したかどうかを判定するために評価され得る。ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡検査法、およびＥＬＩＳＡなどの、タンパク質産生を評価する及び／又は定量するための当該技術分野で既知の方法も使用することができる。

【0154】

ｍＲＮＡ前駆体の領域にハイブリダイズされたときに、結果的にスプライシングを増強させ、タンパク質産生を増加させるＡＳＯは、動物モデル、例えば、全長ヒト遺伝子がノックインされたトランスジェニックマウスモデルまたは疾患のヒト化マウスモデルを使用して、インビボで試験され得る。ＡＳＯの投与に適した経路は、ＡＳＯの送達が望まれる疾患及び／又は細胞型に応じて変化し得る。ＡＳＯは、例えば、皮膚に対する局所適用、肺に対する肺送達、髄腔内注射、脳室内注射、腹膜腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、または静脈内注射によって投与され得る。投与後に、モデル動物の細胞、組織、及び／又は臓器は、当該技術分野に既知の方法および本明細書に記載される方法によって、例えば、スプライシング（効率、速度、程度）およびタンパク質産生を評価することによって、ＡＳＯ処置の効果を判定するために評価され得る。動物モデルはまた、疾患または疾患重症度の表現型または行動的徴候であり得る。

【0155】

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、記載されているが、このような実施形態がほんの一例として提供されることは当業者に明白となる。多くの変更、変化および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想到される。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代案が、本発明の実施において利用され得ることを理解されたい。以下の請求項は本発明の範囲を定義するものであり、これらの請求項の範囲内の方法および構造並びにそれらの同等物がそれによって包含されるものであることが意図される。

【実施例】

【0156】

本発明は、以下の実施例によってより具体的に例示される。しかしながら、本発明がいかなる方法でもこれらの実施例によって限定されないことが理解されるべきである。

【0157】

実施例１：次世代配列決定を用いたＲＮＡｓｅｑによるＴＳＣ２転写産物のイントロン保持事象の特定
イントロン保持事象を特定するべくＴＳＣ２遺伝子によって産生された転写産物のスナップショットを明らかにするために、次世代配列決定を使用して、トランスクリプトーム全体のショットガン配列決定を実行した。この目的のために、ＨＣＮ（ヒト皮質ニューロン）、腎上皮細胞、気管支上皮細胞、およびＴＨＬＥ－３（ヒト肝上皮）細胞の核および細胞質の分画からのｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを単離し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＴｒｕＳｅｑ Ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡライブラリー Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーを、ペアエンド配列決定（ｐａｉｒ－ｅｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）し、結果として、１００のヌクレオチドの読み取り値をヒトゲノムにマッピングした（２００９年２月、ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９アセンブリ）。ＴＳＣ２に関する配列決定の結果を、図３に示す。簡潔に言うと、図３は、（ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｇｒｏｕｐ （Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， １１５６ Ｈｉｇｈ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ ９５０６４）によって操作され、例えばＲｏｓｅｎｂｌｏｏｍ， ｅｔ ａｌ．，２０１５，「Ｔｈｅ ＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｒｏｗｓｅｒ ｄａｔａｂａｓｅ：２０１５ ｕｐｄａｔｅ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３， Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，ｄｏｉ： １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｕ１１７７に記載された）ＵＣＳＣのゲノムブラウザを使用して視覚化されたマッピングされた読み取り値を示し、読み取り値の適用範囲および数はピーク信号によって推論され得る。ピークの高さは、特定の領域における読み取り値の密度によって与えられた発現のレベルを示している。ＴＳＣ２の概略図（縮尺通りに描かれている）は、ピークがＴＳＣ２エクソン領域およびイントロン領域に適合されるように、（読み取り信号の下の）ＵＣＳＣゲノムブラウザによって提供される。この表示に基づいて、（図３の下の図におけるイントロン４に関して、図５の下の図におけるイントロン２５および２６に関して、および図７の下の図におけるイントロン３１および３２に関して示されるように）ＨＣＮの核分画において高い読取密度を有するが、これらの細胞の細胞質分画においては非常に低い読み取り値しか有さないか読み取り値を有さない、５つのイントロン（矢印により示された４、２５、２６、３１、および３２）を特定した。このことは、これらのイントロンが保持されること、およびイントロン－４、イントロン－２５、イントロン－２６、イントロン－３１、およびイントロン－３２を含有する転写産物が、細胞核中に残存することを示しており、これらの保持されたＴＳＣ２ ＲＩＣ ｍＲＮＡ前駆体が、細胞質へと輸送されないため非生産的であることを示唆している。

【0158】

実施例２：ＴＳＣ２のイントロン４を標的とするＡＳＯ－ウォークの設計
ＡＳＯウォークを、本明細書に記載される方法を使用して、イントロン４を標的とするよう設計した（図４；表２）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶイントロン４の５’スプライス部位のすぐ下流の領域およびヌクレオチド－１６から－６８に及ぶイントロン４の３’スプライス部位のすぐ上流の領域を、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格を用いて標的とし、１８－ｍｅｒ ＡＳＯを、５－ヌクレオチド間隔でシフトした。

【0159】

実施例３：ＴＳＣ２のイントロン２５および２６を標的とするＡＳＯ－ウォークの設計
ＡＳＯウォークを、本明細書に記載される方法を使用して、イントロン２５および２６を標的とするよう設計した（図６；表２）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶイントロン２５の５’スプライス部位のすぐ下流の領域およびヌクレオチド－１６から－６８に及ぶイントロン２６の３’スプライス部位のすぐ上流の領域を、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格を用いて標的とし、１８－ｍｅｒ ＡＳＯを、５－ヌクレオチド間隔でシフトした。代替的なエクソン２６に隣接しているスプライス部位のイントロン領域は、エクソン２６の包含レベルに影響を与えることを回避するために、標的とされない。

【0160】

実施例４：ＴＳＣ２のイントロン３１および３２を標的とするＡＳＯ－ウォークの設計
ＡＳＯウォークを、本明細書に記載される方法を使用して、イントロン３１および３２を標的とするよう設計した（図８；表２）。ヌクレオチド＋６から＋５８に及ぶイントロン３１の５’スプライス部位のすぐ下流の領域およびヌクレオチド－１８から－６８に及ぶイントロン３２の３’スプライス部位のすぐ上流の領域を、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ、ＰＳ骨格を用いて標的とし、１８－ｍｅｒ ＡＳＯを、５－ヌクレオチド間隔でシフトした（２つのＡＳＯ、ＴＳＣ２－ＩＶＳ３２－３３およびＴＳＣ２－ＩＶＳ３２－５１を例外とする）。代替的なエクソン３２に隣接しているスプライス部位のイントロン領域は、エクソン３２の包含レベルに影響を与えることを回避するために、標的とされない。

【0161】

実施例５：ＴＳＣ２イントロン４、２５、２６、３１または３２のＡＳＯ標的を介するスプライシング効率の改善は、転写産物レベルを増大させる
ＡＳＯを使用して、ＴＳＣ２発現の増加が、ＴＳＣ２イントロン４、２５、２６、３１または３２のスプライシング効率を改善することによって達成され得るかどうかを判断するために、ＲＴ－ＰＣＲ産物を、放射性のＲＴ－ＰＣＲおよびＲＴ－ｑＰＣＲを使用して評価した。ヒト網膜上皮細胞株である、ＡＲＰＥ－１９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）， ＵＳＡ）、またはヒト肝細胞癌細胞株である、Ｈｕｈ－７（ＮＩＢＩＯＨＮ、日本）、あるいはヒト神経芽腫細胞株である、ＳＫ－Ｎ－ＡＳ（ＡＴＣＣ）を、疑似トランスフェクトしたか、または図１０、図１２、図１５および表１－２に記載される標的ＡＳＯでトランスフェクトした。細胞を、供給業者の仕様書に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭａｘトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてトランスフェクトした。簡潔に述べると、ＡＳＯを、９６ウェル組織培養プレートに蒔き、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中に希釈したＲＮＡｉＭａｘと組み合わせた。細胞を、トリプシンを用いて剥離し、完全培地中で再懸濁し、約２５，０００個の細胞をＡＳＯトランスフェクション混合物に加えた。トランスフェクション実験を、三通りのプレート複製において実行した。最終的なＡＳＯ濃度は８０ｎＭであった。供給業者の仕様書に従って、培地をトランスフェクションの６時間後に交換し、細胞を、ＤＮＡｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を補足したＣｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ ＲＴ試薬を用いて２４時間で採取した。供給業者の仕様書に従って、ｃＤＮＡを、Ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－Ｃｔ ＲＴ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で生成した。対象のイントロンでスプライシングの量を定量化するために、表１－２に列挙される、対応するエクソン－エクソン連結（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に及ぶプローブとともにＴａｑｍａｎアッセイを使用して、定量的ＰＣＲを実行した。Ｔａｑｍａｎアッセイを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）上で、供給業者の仕様書に従って実行した。標的遺伝子アッセイ値を、ＲＰＬ３２（ｄｅｌｔａＣｔ）およびプレート適合偽トランスフェクションサンプル（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）に対して正規化し、擬似定量（２＾－（ｄｅｌｔａ－ｄｅｌｔａ Ｃｔ）にわたる倍数変化をもたらす。３つのプレート複製のモック（ｍｏｃｋ）にわたる平均倍数変化をプロットした（図１０、図１２および図１５）。図１０、図１２および図１５では、幾つかのＡＳＯは、標的遺伝子発現を増大させると特定され、これは、それぞれの標的イントロンでのスプライシングの増加を示唆している。

【0162】

【表2-1】

【0163】

【表2-2】

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【配列表】

0007051683000001.app