【図1】
β-1,6-グルカナーゼ変異体をポリアクリルアミド電気泳動し、(A)CBB染色または(B)抗His-Tag抗体を用いてWB検出した結果である。
【図2】
β-1,6-グルカナーゼ変異体のβ-1,6-グルカン切断活性を、Pustulanの還元末端量の増加を指標に、Somogyi-nelson法で測定した結果である。
【図3】
β-1,6-グルカナーゼ変異体のβ-1,6-グルカン結合活性を、ELISA様試験を用いて測定した結果である。
【図4】
Aはβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qの温度安定性、BはそのpH安定性を評価した結果である。C、Dはバイオレイヤー干渉法によりβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321QのpH安定性を詳細に解析した結果である。
【図5】
β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qと種々のβ-1,6-グルカンとの反応性を、PustulanをコートしたELISAプレートを用いて競合的ELISA様試験により評価した結果である。
【図6】
未標識のβ-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qおよびビオチン標識化E321Qをそれぞれ用いて、可溶性PustulanをサンドイッチELISA様試験によって計測した結果である。
【図7】
PustulanをコートしたELISAプレートとビオチン化β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qを用いて、競合的ELISA様試験によりPustulanを高感度に検出した結果である。
【図8】
血清添加培地を用いてCandida albicans を24時間培養した上清中のβグルカンを、β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qを用いてサンドイッチELISA様試験あるいはリムルス試験によって検出した結果である。Aは試験の概要を示している。BはE321Qを用いたELISA様試験の結果であり、Cはリムルス試験によって検出した結果である。
【図9】
β-1,6-グルカナーゼ変異体E321QにNanoLucを融合し、不溶性担体に固定したE321QとのサンドイッチELISA様試験によって精製β1-,6-グルカンを高感度に検出した結果である。Aは発現させたE321Q-NLの遺伝子を模式的に示している。Bは精製したE321Q-NLをSDS-PAGEで分離し、CBB染色により検出した結果を示している。Cは磁気ビーズに固定したビオチン化E321Qと可溶性E321Q-NLを用いてβ-1,6-グルカンであるPustulan及びC. albicans培養上清(1000倍希釈)中多糖を検出した結果である。
【図10】
各種β-1,6-グルカナーゼ変異体を作成し、リガンドであるPustulanとの結合活性をELISA様試験およびバイオレイヤー干渉法によって比較した結果である。Aはβ-1,6-グルカナーゼの321番目のアミノ酸を各種アミノ酸に変換し、大腸菌によって発現させ、精製後にSDS-PAGEで分離し、銀染色で検出した結果である。Bは各種β-1,6-グルカナーゼ変異体のβ-1,6-グルカン(Pustulan)切断活性を、還元末端量の増加を指標にSomogyi-nelson法で測定した結果である。C、Dはバイオレイヤー干渉法により各種β-1,6-グルカナーゼ変異体のPustulan結合力を計測した結果である。EはELISA(直接法)によって各種β-1,6-グルカナーゼ変異体とPustulanの結合性を解析した結果である。
【図11】
不溶性担体に固定したSBP-1タグ融合β-1,6-グルカナーゼ変異体E321Qと、HiBiTタグ融合E321Aを用いて、サンドイッチELISA様試験によって精製β1,6-グルカン及び真菌培養上清中β-グルカンを短時間のうちに高感度に検出した結果である。Aは発現させたE321Q- SBP-1及びE321A-HiBiTの遺伝子を模式的に示している。Bは精製したE321A-HiBiT及びE321Q-SBP1をSDS-PAGEで分離し、銀染色により検出した結果を示している。Cは磁気ビーズに固定したE321Q-SBP1と可溶性E321A-HiBiTを用いてβ-1,6-グルカンであるPustulan及びC. albicans培養上清(1000倍希釈)中多糖を検出した結果である。
【図12】
血清添加培地を用いてCandida albicans を24時間培養した上清をマウスに尾静脈投与し、時間ごとの血中β-1,6-グルカン濃度をβ-1,6-グルカナーゼ変異体を用いて測定した結果である。
【図13】
6種類のβ-1,6-グルカナーゼ(EC 3.2.1.75)のアミノ酸配列の相同配列領域を対応させて示したアライメント図である。