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▶ グリピー ホールディングス ピーティーワイ リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-04
(45)【発行日】2022-04-12
(54)【発明の名称】グリピカンエピトープおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20220405BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20220405BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20220405BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20220405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/30
C07K14/705
G01N33/574 B
【請求項の数】
9
(21)【出願番号】P 2020093553
(22)【出願日】2020-05-28
(62)【分割の表示】P 2017537906の分割
【原出願日】2015-01-16
(65)【公開番号】P2020141702
(43)【公開日】2020-09-10
【審査請求日】2020-06-29
(73)【特許権者】
【識別番号】520068032
【氏名又は名称】グリピー ホールディングス ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】特許業務法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キャンベル，ダグラス
(72)【発明者】
【氏名】ジャスティニアノ フエンマヨール，イレネ
(72)【発明者】
【氏名】ノコン，アライン
(72)【発明者】
【氏名】スーン，ジュリー
(72)【発明者】
【氏名】トルオング，コーク
(72)【発明者】
【氏名】ウォルシュ，ブラッドリー
(72)【発明者】
【氏名】ウィスムエラー，サンドラ
【審査官】佐久 敬
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０４８１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第９９／０３７７６４（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミノ酸配列ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）によって定められるＧＰＣ－１可動性ループの一部分の中に位置するグリピカン１（ＧＰＣ－１）のエピトープに、特異的に結合する抗体であって、前記エピトープまたはエピトープセグメントが：
（ｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）；
（ｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）、ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）からなる、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）のフラグメント；
（ｉｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体であって、
Ｖ（ｖａｌ）が他の任意のアミノ酸で置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている３位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＹ（ｔｙｒ）、Ａ（ａｌａ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｖ（ｖａｌ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｌ（ｌｅｕ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＡ（ａｌａ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｙ（ｔｙｒ）、Ｆ（ｐｈｅ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている８位；または
Ｅ（ｇｌｕ）がＱ（ｇｌｎ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている１０位
のうちのいずれか１つの位置に置換を含む、前記ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体；
（ｉｖ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体であって、
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）で置換されている１位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＮ（ａｓｎ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｓ（ｓｅｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｃ（ｃｙｓ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｚ（ｇｌｘ）、Ｇ（ｇｌｙ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｐ（ｐｒｏ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｗ（ｔｒｐ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている７位；または
Ｅ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている９位
のうちのいずれか１つの位置に置換を含む、前記ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体；または
（ｖ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体であって、
Ｋ（ｌｙｓ）がＷ（ｔｒｐ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｌ（ｌｙｓ）、Ｙ（ｔｙｒ）またはＦ（ｐｈｅ）のいずれか１つで置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）、Ｐ（ｐｒｏ）またはＤ（ａｓｐ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＲ（ａｒｇ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＮ（ａｓｎ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＤ（ａｓｐ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｎ（ａｓｎ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）またはＡ（ａｌａ）のいずれか１つで置換されている８位；または
Ｐ（ｐｒｏ）がＭ（ｍｅｔ）、Ａ（ａｌａ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている９位
のうちのいずれか１つの位置にのみ置換を含む、前記ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体
からなるものである、前記抗体。
【請求項2】
前記抗体が単離された抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項5】
前記エピトープまたはエピトープセグメントが、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
前記エピトープまたはエピトープセグメントが、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）、ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）からなる、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）のフラグメントからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
前記エピトープまたはエピトープセグメントが：（ｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体であって、
Ｖ（ｖａｌ）が他の任意のアミノ酸で置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている３位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＹ（ｔｙｒ）、Ａ（ａｌａ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｖ（ｖａｌ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｌ（ｌｅｕ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＡ（ａｌａ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｙ（ｔｙｒ）、Ｆ（ｐｈｅ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている８位；または
Ｅ（ｇｌｕ）がＱ（ｇｌｎ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている１０位
のうちのいずれか１つの位置に置換を含む、前記ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体；
（ｉｉ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体であって、
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）で置換されている１位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＮ（ａｓｎ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｓ（ｓｅｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｃ（ｃｙｓ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｚ（ｇｌｘ）、Ｇ（ｇｌｙ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｐ（ｐｒｏ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｗ（ｔｒｐ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている７位；または
Ｅ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている９位
のうちのいずれか１つの位置に置換を含む、前記ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体；または
（ｉｉｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体であって、
Ｋ（ｌｙｓ）がＷ（ｔｒｐ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｌ（ｌｙｓ）、Ｙ（ｔｙｒ）またはＦ（ｐｈｅ）のいずれか１つで置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）、Ｐ（ｐｒｏ）またはＤ（ａｓｐ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＲ（ａｒｇ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＮ（ａｓｎ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＤ（ａｓｐ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｎ（ａｓｎ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）またはＡ（ａｌａ）のいずれか１つで置換されている８位；または
Ｐ（ｐｒｏ）がＭ（ｍｅｔ）、Ａ（ａｌａ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている９位
のうちのいずれか１つの位置にのみ置換を含む、前記ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）またはＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体
からなる、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
【請求項9】
対象の前立腺癌を検出する方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体を使用して、前記対象から採取された生体試料中のグリピカン１（ＧＰＣ－１）のエピトープを検出することと、前記試料中に検出された前記エピトープの量に基づいて、前記対象に前立腺癌があるか、前立腺癌が発症する可能性が高いことを判定することとを含み、前記対象から採取された生体試料中のエピトープの量が対照試料中のエピトープの量よりも多いことが検出された場合、それは対象に前立腺癌があること、または対象に前立腺癌が発症する可能性が高いことを示す、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、全般的には免疫学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明はグリピカン－１（ＧＰＣ－１）のエピトープおよびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
前立腺癌は、人種を問わず男性で最も頻発する癌であり、白人、黒人、アメリカインディアン／アラスカ先住民およびヒスパニック系の男性では、死亡率が肺癌に次いで第２位を占めている。米国では、２０１１年に前立腺癌と診断された男性は２０９，２９２人であり、そのうち２７，９７０人が前立腺癌で死亡している（Ｕ．Ｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，「Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：１９９９－２０１１ Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ Ｒｅｐｏｒｔ」，Ａｔｌａｎｔａ（ＧＡ）：米国保健社会福祉省、米国疾病対策予防センターおよび米国国立癌研究所；２０１４）。
【0003】
前立腺癌の診断が早期であれば、多くの患者で外科手術および／または放射線療法による治療が奏効する。しかし、多くの進行癌の患者のほか前立腺癌患者全体の相当な割合の患者は、局所治療を実施しても、いずれは転移癌に進展する。
【0004】
このため、前立腺癌を特にその初期段階で診断する簡便で信頼性も精度も高い検査方法が必要とされている。
【0005】
グリピカン－１（ＧＰＣ－１）は、細胞表面ヘパラン硫酸プロテオグリカンの１つであり、グリコシルホスファチジルイノシトールを介して細胞膜に結合したコアタンパク質を有する。ＧＰＣ－１は大きなグリピカンファミリーのメンバーである。ＧＰＣ－１は一部の形態の癌（例えば、膵癌、乳癌）で過剰発現することが報告されているが、発現にはほかの癌と有意な差はみられない。本発明者らは最近、ＧＰＣ－１が前立腺癌細胞によって過剰に発現され、前立腺癌を診断する手段として用いることが可能であることを明らかにした（Ｗａｌｓｈら，「Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」と題する米国特許仮出願第６１／９２８／７７６号（未公開）；Ｗａｌｓｈら，国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２０１４／０００９９９号，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ 抗ＧＰＣ－１ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｔｈｅｒｅｏｆ」（未公開））。
【0006】
本発明者らが明らかにしたＧＰＣ－１レベルと前立腺癌との間の関係を考えれば、診断アッセイおよび／または予後検査を受けている患者のＧＰＣ－１レベルを検出し定量化するのに有利なＧＰＣ－１内のエピトープを同定することが必要とされる。
【発明の概要】
【0007】
本発明者らは、ＧＰＣ－１タンパク質内の一連のエピトープが、特に限定されないが抗体を含めた結合実体によって標的化するのに好ましいことを明らかにした。
【0008】
したがって、本発明は、少なくとも以下に挙げる実施形態に関する：
【0009】
実施形態１：
アミノ酸配列ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）によって定められるＧＰＣ－１可動性ループの一部分の中に位置する、抗グリピカン１（ＧＰＣ－１）抗体のエピトープ。
アミノ酸配列ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）によって定められるＧＰＣ－１可動性ループの一部分の中に位置する、抗グリピカン１（ＧＰＣ－１）抗体のエピトープ。
【0010】
実施形態２：
（ｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）；あるいは
（ｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）の変異体であって、
２位、３位、７位、８位、９位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置；または
１位、２位、３位、４位、６位、８位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置；または
１位、２位、３位、４位、５位、８位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置
にのみ置換アミノ酸残基を含む変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
（ｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）；あるいは
（ｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）の変異体であって、
２位、３位、７位、８位、９位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置；または
１位、２位、３位、４位、６位、８位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置；または
１位、２位、３位、４位、５位、８位、１０位および／もしくは１１位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置
にのみ置換アミノ酸残基を含む変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
【0011】
実施形態３：
（ｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）；または
（ｉｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の１位、３位、４位、８位および９位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号６の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
（ｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）；または
（ｉｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の１位、３位、４位、８位および９位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号６の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
【0012】
実施形態４：
配列番号６の８位および９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態３に記載の変異体。
配列番号６の８位および９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態３に記載の変異体。
【0013】
実施形態５：
（ｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）；または
（ｉｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）の１位、３位、４位、８位、９位および１０位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号５の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
（ｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）；または
（ｉｉ）ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）の１位、３位、４位、８位、９位および１０位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号５の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１に記載のエピトープ。
【0014】
実施形態６：
配列番号６の８位、９位および１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態５に記載の変異体。
配列番号６の８位、９位および１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態５に記載の変異体。
【0015】
実施形態７：
１０位のＥ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている、実施形態５または実施形態６に記載の変異体。
１０位のＥ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている、実施形態５または実施形態６に記載の変異体。
【0016】
実施形態８：
Ｋ（ｌｙｓ）がＷ（ｔｒｐ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｌ（ｌｙｓ）、Ｙ（ｔｙｒ）またはＦ（ｐｈｅ）のいずれか１つで置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）、Ｐ（ｐｒｏ）またはＤ（ａｓｐ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＲ（ａｒｇ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＮ（ａｓｎ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＤ（ａｓｐ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｎ（ａｓｎ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）またはＡ（ａｌａ）のいずれか１つで置換されている８位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＭ（ｍｅｔ）、Ａ（ａｌａ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている９位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換を含む、実施形態３～７のいずれか１つに記載の変異体。
Ｋ（ｌｙｓ）がＷ（ｔｒｐ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｌ（ｌｙｓ）、Ｙ（ｔｙｒ）またはＦ（ｐｈｅ）のいずれか１つで置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）、Ｐ（ｐｒｏ）またはＤ（ａｓｐ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＲ（ａｒｇ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＮ（ａｓｎ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＤ（ａｓｐ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｎ（ａｓｎ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）またはＡ（ａｌａ）のいずれか１つで置換されている８位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＭ（ｍｅｔ）、Ａ（ａｌａ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｒ（ａｒｇ）、Ｑ（ｇｌｎ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている９位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換を含む、実施形態３～７のいずれか１つに記載の変異体。
【0017】
実施形態９：
アミノ酸配列ＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0018】
実施形態１０：
アミノ酸配列ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号７）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号７）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0019】
実施形態１１：
（ｉ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）；または
（ｉｉ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の１位、２位、３位、５位、７位および９位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号４の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１または実施形態２に記載のエピトープ。
（ｉ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）；または
（ｉｉ）ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の１位、２位、３位、５位、７位および９位のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号４の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１または実施形態２に記載のエピトープ。
【0020】
実施形態１２：
配列番号４の２位、７位および９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態１１に記載の変異体。
配列番号４の２位、７位および９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態１１に記載の変異体。
【0021】
実施形態１３：
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）で置換されている１位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＮ（ａｓｎ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｓ（ｓｅｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｃ（ｃｙｓ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｚ（ｇｌｘ）、Ｇ（ｇｌｙ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｐ（ｐｒｏ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｗ（ｔｒｐ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている７位；
Ｅ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている９位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置に置換を含む、実施形態１１または実施形態１２に記載の変異体。
Ｎ（ａｓｎ）がＨ（ｈｉｓ）で置換されている１位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＮ（ａｓｎ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｓ（ｓｅｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている３位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）で置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）がＡ（ａｌａ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｃ（ｃｙｓ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｚ（ｇｌｘ）、Ｇ（ｇｌｙ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｋ（ｌｙｓ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｐ（ｐｒｏ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｗ（ｔｒｐ）またはＹ（ｔｙｒ）のいずれか１つで置換されている７位；
Ｅ（ｇｌｕ）が他の任意のアミノ酸で置換されている９位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置に置換を含む、実施形態１１または実施形態１２に記載の変異体。
【0022】
実施形態１４：
アミノ酸配列ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ（配列番号９）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ（配列番号９）を含む第二のセグメントを含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0023】
実施形態１５：
（ｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）；または
（ｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の１位、２位、３位、４位、５位、８位および１０のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号３の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１または実施形
態２に記載のエピトープ。
（ｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）；または
（ｉｉ）ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の１位、２位、３位、４位、５位、８位および１０のうちのいずれか１つもしくは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、配列番号３の変異体
から選択されるアミノ酸配列を含む第一のセグメントを含む、実施形態１または実施形
態２に記載のエピトープ。
【0024】
実施形態１６：
配列番号３の１位、２位、３位および８位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態１５に記載の変異体。
配列番号３の１位、２位、３位および８位のうちのいずれか１つまたは複数の位置にのみ置換アミノ酸残基を含む、実施形態１５に記載の変異体。
【0025】
実施形態１７：
Ｖ（ｖａｌ）が他の任意のアミノ酸で置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている３位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＹ（ｔｙｒ）、Ａ（ａｌａ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｖ（ｖａｌ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｌ（ｌｅｕ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＡ（ａｌａ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｙ（ｔｙｒ）、Ｆ（ｐｈｅ）またはＭ（ｍｅｔ）のいずれか１つで置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている８位；
Ｅ（ｇｌｕ）がＱ（ｇｌｎ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている１０位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置に置換を含む、実施形態１５または実施形態１６に記載の変異体。
Ｖ（ｖａｌ）が他の任意のアミノ酸で置換されている１位；
Ｎ（ａｓｎ）が他の任意のアミノ酸で置換されている２位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている３位；
Ｑ（ｇｌｎ）がＹ（ｔｙｒ）、Ａ（ａｌａ）、Ｅ（ｇｌｕ）、Ｖ（ｖａｌ）、Ｍ（ｍｅｔ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｌ（ｌｅｕ）、Ｉ（ｉｌｅ）、Ｔ（ｔｈｒ）またはＲ（ａｒｇ）のいずれか１つで置換されている４位；
Ｇ（ｇｌｙ）がＡ（ａｌａ）、Ｓ（ｓｅｒ）、Ｔ（ｔｈｒ）、Ｈ（ｈｉｓ）、Ｗ（ｔｒｐ）、Ｙ（ｔｙｒ）、Ｆ（ｐｈｅ）またはＭ（ｍｅｔ）のいずれか１つで置換されている５位；
Ｐ（ｐｒｏ）が他の任意のアミノ酸で置換されている８位；
Ｅ（ｇｌｕ）がＱ（ｇｌｎ）、Ｄ（ａｓｐ）、Ｆ（ｐｈｅ）、Ｈ（ｈｉｓ）またはＭ（ｍｅｔ）で置換されている１０位
のうちのいずれか１つまたは複数の位置に置換を含む、実施形態１５または実施形態１６に記載の変異体。
【0026】
実施形態１８：
アミノ酸配列ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）または
アミノ酸配列ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）
を含む第二のセグメントを含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）または
アミノ酸配列ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）
を含む第二のセグメントを含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0027】
実施形態１９：
アミノ酸配列ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）を含む第二のセグメントと、アミノ酸配列ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）を含む第三のセグメントとを含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）を含む第二のセグメントと、アミノ酸配列ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）を含む第三のセグメントとを含む、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0028】
実施形態２０：
アミノ酸配列ＣＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＣＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＣ（配列番号１２）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のエピトープ。
アミノ酸配列ＣＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＣＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＣ（配列番号１２）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0029】
実施形態２１：
直鎖状エピトープである、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のエピトープ。
直鎖状エピトープである、実施形態１～２０のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0030】
実施形態２２：
エピトープの第二のセグメントと第三のセグメントが不連続である、実施形態１９に記載のエピトープ。
エピトープの第二のセグメントと第三のセグメントが不連続である、実施形態１９に記載のエピトープ。
【0031】
実施形態２３：
エピトープの第一のセグメントと第二のセグメントが不連続である、実施形態９、１０、１４、１８または２２のいずれか１つに記載のエピトープ。
エピトープの第一のセグメントと第二のセグメントが不連続である、実施形態９、１０、１４、１８または２２のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0032】
実施形態２４：
ＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）、ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ（配列番号９）、ＰＲＥＲＰＰ（配
列番号１０）、ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）、ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ（配列番号１３）およびＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号７）のいずれか１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む、抗グリピカン１（ＧＰＣ－１）抗体のエピトープ。
ＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）、ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ（配列番号９）、ＰＲＥＲＰＰ（配
列番号１０）、ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）、ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ（配列番号１３）およびＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号７）のいずれか１つまたは複数から選択されるアミノ酸配列を含む、抗グリピカン１（ＧＰＣ－１）抗体のエピトープ。
【0033】
実施形態２５：
単離ポリペプチドまたは合成ポリペプチドである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のエピトープ。
単離ポリペプチドまたは合成ポリペプチドである、実施形態１～２４のいずれか１つに記載のエピトープ。
【0034】
実施形態２６：
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
前記異なるエピトープがそれぞれ、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープであるか；
前記エピトープがそれぞれ、表１に記載のエピトープであるか；
前記エピトープの組合せが、表３に記載されるいずれか１つまたは複数の組合せである、
エピトープの取合せ。
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
前記異なるエピトープがそれぞれ、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープであるか；
前記エピトープがそれぞれ、表１に記載のエピトープであるか；
前記エピトープの組合せが、表３に記載されるいずれか１つまたは複数の組合せである、
エピトープの取合せ。
【0035】
実施形態２７：
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の第一のエピトープと、
実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の第二のエピトープと
を含む、
エピトープの取合せ。
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の第一のエピトープと、
実施形態１１～１４のいずれか１つに記載の第二のエピトープと
を含む、
エピトープの取合せ。
【0036】
実施形態２８：
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の第一のエピトープと、
実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の第二のエピトープと
を含む、
エピトープの取合せ。
２つ以上の異なるエピトープの組合せを含み、
実施形態１～１０のいずれか１つに記載の第一のエピトープと、
実施形態１５～１９のいずれか１つに記載の第二のエピトープと
を含む、
エピトープの取合せ。
【0037】
実施形態２９：
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープまたは実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せと、薬学的に許容される担体または補形剤とを含む、組成物。
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープまたは実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せと、薬学的に許容される担体または補形剤とを含む、組成物。
【0038】
実施形態３０：
１つまたは複数の可溶性支持体または不溶性支持体に結合した実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープまたは実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せを含む、集成体。
１つまたは複数の可溶性支持体または不溶性支持体に結合した実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープまたは実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せを含む、集成体。
【0039】
実施形態３１：
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の構成要素である、実施形態３０に記載の集成体。
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の構成要素である、実施形態３０に記載の集成体。
【0040】
実施形態３２：
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープをコードする核酸。
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープをコードする核酸。
【0041】
実施形態３３：
実施形態３２に記載の核酸を含むベクター。
実施形態３２に記載の核酸を含むベクター。
【0042】
実施形態３４：
実施形態３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
実施形態３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【0043】
実施形態３５：
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な単離された結合実体であって、抗体ではない結合実体。
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な単離された結合実体であって、抗体ではない結合実体。
【0044】
実施形態３６：
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な単離された結合実体であって、抗体であり、ただし、抗体がＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）ではない、結合実体。
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な単離された結合実体であって、抗体であり、ただし、抗体がＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）ではない、結合実体。
【0045】
実施形態３７：
対象の前立腺癌を検出する方法であって、対象から生体試料を採取することと、試料中に実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープの存在を検出することと、試料中に検出されたエピトープの量に基づいて、対象に前立腺癌があるか、前立腺癌が発症する可能性が高いことを判定することとを含む、方法。
生体試料は体液試料であり得る。
生体試料は組織試料であり得る。
対象の前立腺癌を検出する方法であって、対象から生体試料を採取することと、試料中に実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープの存在を検出することと、試料中に検出されたエピトープの量に基づいて、対象に前立腺癌があるか、前立腺癌が発症する可能性が高いことを判定することとを含む、方法。
生体試料は体液試料であり得る。
生体試料は組織試料であり得る。
【0046】
実施形態３８：
試料中にエピトープの存在を検出することが、試料と、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な結合実体とを接触させることを含む、実施形態３７に記載の方法。
試料中にエピトープの存在を検出することが、試料と、実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープと特異的に結合することが可能な結合実体とを接触させることを含む、実施形態３７に記載の方法。
【0047】
実施形態３９：
結合実体が抗体の集団である、実施形態３８に記載の方法。
結合実体が抗体の集団である、実施形態３８に記載の方法。
【0048】
実施形態４０：
抗体の集団が、ＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）のいずれか１つまたは複数のものを含む、実施形態３９に記載の方法。
抗体の集団が、ＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）のいずれか１つまたは複数のものを含む、実施形態３９に記載の方法。
【0049】
実施形態４１：
抗体の集団が、ＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）のいずれも含まない、実施形態３９に記載の方法。
抗体の集団が、ＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）、ウサギ抗ＧＰＣ－１ポリクローナル抗体（ａｂ１３７６０４、ａｂｃａｍ社）、マウス抗グリピカンモノクローナル抗体２６００クローン４Ｄ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）またはヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）のいずれも含まない、実施形態３９に記載の方法。
【0050】
実施形態４２：
生体試料中に存在するエピトープの量と対照試料中に存在するエピトープの量とを比較することを含み、体液試料中のエピトープの量が対照試料の同じ測定値よりも多いことが検出された場合、それは対象に前立腺癌があること、または対象に前立腺癌が発症する可能性が高いことを示す、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載の方法。
生体試料中に存在するエピトープの量と対照試料中に存在するエピトープの量とを比較することを含み、体液試料中のエピトープの量が対照試料の同じ測定値よりも多いことが検出された場合、それは対象に前立腺癌があること、または対象に前立腺癌が発症する可能性が高いことを示す、実施形態３７～４１のいずれか１つに記載の方法。
【0051】
実施形態４３：
試料中に検出されたエピトープの量が、対照試料中に検出されたエピトープの量よりも５０％超多い、実施形態４２に記載の方法。
試料中に検出されたエピトープの量が、対照試料中に検出されたエピトープの量よりも５０％超多い、実施形態４２に記載の方法。
【0052】
実施形態４４：
エピトープの存在を検出することが、試料と、Ｃｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａにアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されているＭＩＬ３８抗体の集団とを接触させることを含む、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の方法。
エピトープの存在を検出することが、試料と、Ｃｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａにアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されているＭＩＬ３８抗体の集団とを接触させることを含む、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の方法。
【0053】
実施形態４５：
エピトープの存在を検出することが、試料と、配列番号２０の４８位～５８位によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号２０の７４位～８０位によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および／または配列番号２０の１１３位～１２１によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体を含まない抗体の集団とを接触させることを含む、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の方法。
エピトープの存在を検出することが、試料と、配列番号２０の４８位～５８位によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号２０の７４位～８０位によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；および／または配列番号２０の１１３位～１２１によって定められるアミノ酸配列を含むかこれよりなる相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む軽鎖可変領域を含む抗体を含まない抗体の集団とを接触させることを含む、実施形態３７～４３のいずれか１つに記載の方法。
【0054】
実施形態４６：
生体試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを求めることと、検出されたレベルと対照試料のものとを比較することとをさらに含む、実施形態３７～４５のいずれか１つに記載の方法。
生体試料中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを求めることと、検出されたレベルと対照試料のものとを比較することとをさらに含む、実施形態３７～４５のいずれか１つに記載の方法。
【0055】
実施形態４７：
生体試料が体液試料である、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。
生体試料が体液試料である、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0056】
実施形態４８：
生体試料が組織試料である、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。
生体試料が組織試料である、実施形態３７～４６のいずれか１つに記載の方法。
【0057】
実施形態４９：
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープを含む、融合タンパク質。
実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープを含む、融合タンパク質。
【0058】
実施形態５０：
ＧＰＣ－１の検出方法の陽性対照要素としての実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープ、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せまたは実施形態４８に記載の融合タンパク質の使用。
ＧＰＣ－１の検出方法の陽性対照要素としての実施形態１～２５のいずれか１つに記載のエピトープ、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のエピトープの取合せまたは実施形態４８に記載の融合タンパク質の使用。
【0059】
実施形態５１：
方法が、実施形態３７～４８のいずれか１つに記載の前立腺癌の検出方法である、実施形態５０に記載の使用。
方法が、実施形態３７～４８のいずれか１つに記載の前立腺癌の検出方法である、実施形態５０に記載の使用。
【0060】
検出方法または検出アッセイに使用する陽性対照要素は、直接的または間接的に陽性／肯定的シグナルを発生し、それにより、その方法またはアッセイが正しく機能し得ることが少なくとも部分的にまたは全面的に確認され得る。
【0061】
これより、単なる例として添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）として存在する鎖Ｂのレンダリング画像である。
【図2】ＭＩＬ３８－ＡＭ４抗体スクリーニングの未処理データの箱ひげ図のグラフである。箱の下端および上端は、データの第一四分位数および第三四分位数である。箱の中央付近のバンドは第二四分位数（中央値）である。ひげは四分位範囲の１．５倍の位置にあり、データセット内の統計的外れ値を示す（Ｍｃｇｉｌｌら，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ，３２：１２－１６，１９７８）。
【図3】全５つのアレイ（実施例１のセット１～５）を１μｇ／ｍｌ（上のトレース）または１０μｇ／ｍｌ（下のトレース）のＭＩＬ３８－ＡＭ４とインキュベートして記録した強度に対するペプチド番号のプロットである。
【図4】配列ＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＹＳ（配列番号２１）を濃色の球で表し、残基Ｋ３４７、Ｖ３４８、Ｇ３６２およびＫ３６３を淡色の球で表したＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）の鎖Ｂのレンダリング画像である。Ｘ線回折ではＶ３４８とＧ３６２とを接続するループは解像されない。
【図5】ポリクローナルおよびモノクローナルの抗ＧＰＣ－１抗体ならびにＭＩＬ３８－ＡＭ３抗体のスクリーニングの未処理データの箱ひげ図のグラフである。箱の下端および上端は、データの第一四分位数および第三四分位数である。箱の中央付近のバンドは第二四分位数（中央値）である。ひげは四分位範囲の１．５倍の位置にあり、データセット内の統計的外れ値を示す（Ｍｃｇｉｌｌら，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ，３２：１２－１６，１９７８）。
【図6】ＭＩＬ３８－ＡＭ４のマッピングに使用したアレイで３種類の市販の抗グリピカン１調製物を試験して記録した強度に対するペプチド番号のプロットを比較のために示したものである。
【図7】Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）の鎖Ｂのレンダリング画像である。図７Ａは、配列ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）を淡色の球で表し、残基Ｋ３４７、Ｖ３４８、Ｇ３６２およびＫ３６３を濃色の球で表した鎖Ｂのレンダリング画像である。Ｘ線回折ではＶ３４８とＧ３６２とを接続するループは解像されない。これらのエピトープはウサギ抗ＧＰＣ－１によって認識される。追加のエピトープＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）は座標ファイルでは解像されない。図７Ｂは、配列ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ（配列番号１３）を陰影のある球で表した鎖Ｂのレンダリング画像である。このエピトープはマウス抗ＧＰＣ－１によって認識される。
【図8】抗体スクリーニングの未処理データの箱ひげ図のグラフである。箱の下端および上端は、データの第一四分位数および第三四分位数である。箱の中央付近のバンドは第二四分位数（中央値）である。ひげは四分位範囲の１．５倍の位置にあり、データセット内の統計的外れ値を示す（Ｍｃｇｉｌｌら，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎ，３２：１２－１６，１９７８）。
【図9】セット３の置換解析でプローブしたウサギポリクローナルＡｂ１３７６０４をレタープロットで表した図である。中央の水平方向のバーは、ベース配列で記録した平均強度を表す。変異の位置に対応するカラムに個々の変異が示されており、記録した強度に対応する高さに記号がプロットされている。
【図10】セット２（実施例３）の置換解析でプローブしたヤギポリクローナル抗ＧＰＣ－１をレタープロットで表した図である。
【図11】セット３（実施例３）の置換解析でプローブしたＭＩＬ３８－ＡＭ４をレタープロットで表した図である。
【図12】セット１のペプチド（実施例３）でＭＩＬ３８－ＡＭ４をプローブして得たデータをヒートマップで表した図である。シグナル強度は黒色（ベースライン）から白色（平均）を経て灰色（最大）に至る；「Ｘ」＝ｘ軸であり；ｘ軸のカラムＸ１～Ｘ３３に示されるペプチド配列は以下の通りである：Ｘ－１ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５３であり；Ｘ－２ペプチドは配列番号１の残基３４８～３５７であり；Ｘ－３ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６１であり；Ｘ－４ペプチドは配列番号１の残基３５６～３６５であり；Ｘ－５ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５４であり；Ｘ－６ペプチドは配列番号１の残基３４８～３５８であり；Ｘ－７ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６２であり；Ｘ－８ペプチドは配列番号１の残基３５６～３６６であり；Ｘ－９ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５５であり；Ｘ－１０ペプチドは配列番号１の残基３４８～３５９であり；Ｘ－１１ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６３であり；Ｘ－１２ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５６であり；Ｘ－１３ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６０であり；Ｘ－１４ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６４であり；Ｘ－１５ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５７であり；Ｘ－１６ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６１であり；Ｘ－１７ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６５であり；Ｘ－１８ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５８であり；Ｘ－１９ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６２であり；Ｘ－２０ペプチドは配列番号１の残基３５２～３６６であり；Ｘ－２１ペプチドは配列番号１の残基３４４～３５９であり；Ｘ－２２ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６３であり；Ｘ－２３ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６０であり；Ｘ－２４ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６４であり；Ｘ－２５ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６１であり；Ｘ－２６ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６５であり；Ｘ－２７ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６２であり；Ｘ－２８ペプチドは配列番号１の残基３４８～３６６であり；Ｘ－２９ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６３であり；Ｘ－３０ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６４であり；Ｘ－３１ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６５であり；Ｘ－３２ペプチドは配列番号１の残基３４４～３６６であり；Ｘ－３３ペプチドはスクランブル／ランダム配列である；「Ｙ」＝ｙ軸であり；ｙ軸のカラムＹ１～Ｙ１９に示されるペプチド配列は以下の通りである：Ｙ－１ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４０であり；Ｙ－２ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４４であり；Ｙ－３ペプチドは配列番号１の残基１３９～１４８であり；Ｙ－４ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４１であり；Ｙ－５ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４５であり；Ｙ－６ペプチドは配列番号１の残基１３９～１４９であり；Ｙ－７ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４２であり；Ｙ－８ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４６であり；Ｙ－９ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４３であり；Ｙ－１０ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４７であり；Ｙ－１１ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４４であり；Ｙ－１２ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４８であり；Ｙ－１３ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４５であり；Ｙ－１４ペプチドは配列番号１の残基１３５～１４９であり；Ｙ－１５ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４６であり；Ｙ－１６ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４７であり；Ｙ－１７ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４８であり；Ｙ－１８ペプチドは配列番号１の残基１３１～１４９であり；Ｙ－１９ペプチドはスクランブル／ランダム配列である。
【図13】セット１のペプチドで得られた全結果の散布図マトリックスである。
【図14】ＭＩＬ３８抗体と抗ＧＰＣ－１抗体には二次元ゲルウエスタンブロットでの反応性に重複が見られることを示す二次元電気泳動およびウエスタンブロット法の結果である。
【図15】ＤＵ－１４５前立腺癌またはＣ３（ＭＩＬ３８陰性）の細胞膜タンパク質抽出物にＭＩＬ３８抗体または抗ＧＰＣ－１抗体を用いて実施した免疫沈降のウエスタンブロットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0063】
定義
本願で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」は複数の抗体も包含する。
本願で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（抗体）」は複数の抗体も包含する。
【0064】
本明細書で使用される「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」を意味する。単語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」の変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などは、それに対応して様々な意味を有する。したがって、例えば、抗体Ａを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」試料は、抗体Ａのみからなるものであっても、１つまたは複数の追加の成分（例えば、抗体Ｂ）を含むものであってもよい。
【0065】
本明細書で使用される「複数（ｍｕｌｔｉｐｌｅおよびｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」という用語は、２以上であることを意味する。ある特定の態様または実施形態では、複数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１またはそれ以上のほか、そこで導き出され得る任意の整数およびそこで導き出され得る任意の範囲を意味し得る。
【0066】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、１つまたは複数の結合実体、例えばタンパク質、リガンド、抗体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体などと相互作用する（例えば、結合する）抗原の特定の部分（１つまたは複数）を指す。
【0067】
本明細書で使用される「抗体（１つまたは複数）」という用語は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＹ、一本鎖全抗体を含めた全抗体ならびにその抗原結合フラグメントを包含する。抗原結合抗体フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）およびＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメントが挙げられる。抗体は、任意の動物起源またはしかるべき産生宿主に由来するものであり得る。一本鎖抗体を含めた抗原結合抗体フラグメントは、可変領域（１つまたは複数）を単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインのうちの全部もしくは一部のものとともに含み得る。このほか、可変領域（１つまたは複数）とヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインとの任意の組合せが含まれる。抗体は、生体分子と特異的に結合するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、ヒト化抗体およびヒトモノクローナル抗体およびヒトポリクローナル抗体であり得る。抗体は、二特異性抗体、ａｖｉｂｏｄｙ、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体、ＶＨＨドメイン、ヒト抗体、完全ヒト化抗体、部分ヒト化抗体、アンチカリン、アドネクチンまたはａｆｆｉｂｏｄｙであり得る。
【0068】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一の抗原性エピトープを認識する抗体であって、同じ抗原性エピトープと特異的に結合し、少量存在し得る天然の変異（１つまたは複数）を除いて同一である実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す。
【0069】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体および非ヒト抗体（例え
ば、マウス抗体）に由来する配列を含む諸形態の抗体を指す。例えば、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列に由来するものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを実質的にすべて含み得る。任意選択で、ヒト化抗体はほかにも、通常はヒト免疫グロブリンのものであり得る免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含み得る。
ば、マウス抗体）に由来する配列を含む諸形態の抗体を指す。例えば、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列に由来するものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを実質的にすべて含み得る。任意選択で、ヒト化抗体はほかにも、通常はヒト免疫グロブリンのものであり得る免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含み得る。
【0070】
本明細書で使用される「キメラ抗体」という用語は、所望の生物活性を示す抗体であって、軽鎖および／または重鎖の一部分が、所与の種または特定の種に由来する抗体の対応する配列と同一または相同であり、残りの鎖（１つまたは複数）が、別の種に由来する抗体の対応する配列と同一または相同である抗体を指す。例えば、キメラ抗体は、第一の種に由来する可変領域を含み、第二の種に由来する定常領域を含み得る。キメラ抗体は、例えば、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから遺伝子工学によって構築することができる。
【0071】
本明細書で使用される「ハイブリドーマ」という用語は、不死細胞（例えば、多発性骨髄腫細胞）と抗体産生細胞（例えば、Ｂリンパ球）との融合によって作製され、単一の結合特異性を有するモノクローナル抗体を産生することが可能な細胞を指す。
【0072】
本明細書で抗体、抗体変異体、抗体誘導体、抗原結合フラグメントなどに関して使用される「特異的に結合する」という用語は、それが他の非標的分子よりも優先的に所与の標的分子と結合することが可能であることを指す。例えば、抗体、抗体変異体、抗体誘導体または抗原結合フラグメント（「分子Ａ」）が所与の標的分子（「分子Ｂ」）と特異的に結合することが可能である場合、分子Ａは、分子Ｂと他のいくつかの潜在的な別の結合パートナーとを区別する能力を有する。したがって、分子Ａを潜在的な結合パートナーとして接触する可能性が等しい様々な分子に曝露すると、分子Ａは分子Ｂと選択的に結合し、他の別の潜在的結合パートナーは実質的に分子Ａと未結合のままとなる。一般に、分子Ａは他の潜在的結合パートナーの少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは１００倍超の頻度で分子Ｂと優先的に結合する。分子Ａは、分子Ｂ以外の分子とも微弱であるが検出可能なレベルで結合することが可能であり得る。これはバックグランド結合として一般に知られているものであり、例えば、しかるべき対照を用いることによって、分子Ｂに特異的な結合と容易に区別することができる。
【0073】
本明細書で使用される「対象」という用語は、ウシ，ウマ，ヒツジ，霊長類，鳥類およびげっ歯類を含めた経済、社会または研究に重要な任意の動物を包含する。したがって、「対象」は哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物などであり得る。
【0074】
本明細書で生体分子（例えば、抗体）に関して使用される「単離」という用語は、天然状態で付随する成分の少なくとも一部を含まない生体分子のことである。
【0075】
本明細書で使用される「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語はそれぞれ、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸からなるポリマーを指し、互換的に使用される。本発明の目的には、「ポリペプチド」は完全長タンパク質を構成するものであっても、完全長タンパク質の一部分を構成するものであってもよく、「ペプチド」と「ポリペプチド」の意味に意図的な差はない。
【0076】
本明細書で使用される「保存的」アミノ酸置換は、あるアミノ酸配列の所与のアミノ酸残基を大きさおよび／または化学的特性がこれとほぼ同じ別の異なるアミノ酸残基に置き換えることを指す。保存的アミノ酸置換の非限定的な例としては、Ａ（Ａｌａ）からＳ（Ｓｅｒ）への置換；Ｒ（ａｒｇ）からＫ（ｌｙｓ）への置換；Ｎ（ａｓｎ）からＱ（ｇｌ
ｎ）またはＨ（ｈｉｓ）への置換；Ｄ（ａｓｐ）からＥ（ｇｌｕ）への置換；Ｑ（ｇｌｎ）からＮ（ａｓｎ）への置換；Ｃ（ｃｙｓ）からＳ（ｓｅｒ）への置換；Ｅ（ｇｌｕ）からＤ（ａｓｐ）への置換；Ｇ（ｇｌｙ）からＰ（ｐｒｏ）への置換が挙げられる。
ｎ）またはＨ（ｈｉｓ）への置換；Ｄ（ａｓｐ）からＥ（ｇｌｕ）への置換；Ｑ（ｇｌｎ）からＮ（ａｓｎ）への置換；Ｃ（ｃｙｓ）からＳ（ｓｅｒ）への置換；Ｅ（ｇｌｕ）からＤ（ａｓｐ）への置換；Ｇ（ｇｌｙ）からＰ（ｐｒｏ）への置換が挙げられる。
【0077】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド塩基、リボヌクレオチド塩基、既知の類似体もしくは天然のヌクレオチドまたはその混合物の一本鎖ポリマーまたは二本鎖ポリマーを指す。
【0078】
本明細書で使用される「結合実体」という用語は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープまたはその模倣体と特異的に結合することが可能な任意の分子を包含する。結合実体の非限定的な例としては、例えば抗体などのポリペプチドが挙げられる。
【0079】
本明細書で使用される「キット」という用語は、材料を送達するための任意の送達システムを指す。このような送達システムとしては、反応試薬（例えば、しかるべき容器に入った標識、参照試料、補助物質など）および／または補助材料（例えば、緩衝液、アッセイを実施する際の取扱説明書など）を保管したり、ある場所から別の場所に輸送または送達したりすることを可能にするシステムが挙げられる。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または補助材料の入った箱などの収容器を１つまたは複数含み得る。
【0080】
本明細書で検出方法または検出アッセイと関連して使用される「陽性対照要素」という用語は、その方法またはアッセイに用いると、直接的または間接的に陽性／肯定的シグナルを発生し、それにより、その方法またはアッセイが正しく機能し得ることが少なくとも部分的にまたは全面的に確認され得る要素を指す。
【0081】
本明細書である範囲の数値に関して「～の間」という用語を使用する場合、その範囲の両端の数値が含まれることが理解されよう。例えば、長さ１０残基～２０残基の間のポリペプチドには、長さ１０残基のポリペプチドおよび長さ２０残基のポリペプチドが含まれる。
【0082】
本明細書に先行技術に関する資料またはその資料から導かれるかそれに基づく記述が記載されていても、その資料またはそこから導かれる記述が関連技術分野の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。本明細書で参照する資料はいずれも、特に明記されない限り、説明を目的としてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0083】
（詳細な説明）
本発明者らは、抗体などの結合実体を用いてＧＰＣ－１レベルを検出および定量化するのに有利なグリピカン－１（ＧＰＣ－１）内の特異的エピトープを同定した。これらのエピトープおよびその組合せは多く目的に有用であるが、前立腺癌の診断アッセイでＧＰＣ－１レベルを定量化するための標的となり得る。
本発明者らは、抗体などの結合実体を用いてＧＰＣ－１レベルを検出および定量化するのに有利なグリピカン－１（ＧＰＣ－１）内の特異的エピトープを同定した。これらのエピトープおよびその組合せは多く目的に有用であるが、前立腺癌の診断アッセイでＧＰＣ－１レベルを定量化するための標的となり得る。
【0084】
したがって、本発明は、ＧＰＣ－１エピトープおよびその構成要素；前記エピトープおよび／またはエピトープ構成要素の組合せ；エピトープ、構成要素および／または組合せを特異的に標的とすることが可能な結合実体；エピトープ、構成要素および／または組合せを含む組成物、キットをはじめとする実体；エピトープ、構成要素および／または組合せを特異的に標的とすることが可能な結合実体を作製する方法；ならびにエピトープ、構成要素および／または組合せの検出を必要とする前立腺癌の診断方法に関する。
【0085】
グリピカン－１（ＧＰＣ－１）
本発明は、特異的結合実体（例えば、抗体）の標的となるグリピカン－１ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＧＰＣ－１）内の一連のエピトープから生じる。
本発明は、特異的結合実体（例えば、抗体）の標的となるグリピカン－１ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＧＰＣ－１）内の一連のエピトープから生じる。
【0086】
エピトープは、哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、霊長類またはげっ歯類などのＧＰＣ－１タンパク質中に存在するものであり得る。したがって、エピトープは、哺乳動物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物などのＧＰＣ－１タンパク質（例えば、イヌのＧＰＣ－１タンパク質）中に存在するものであり得る。
【0087】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、エピトープは、非哺乳動物のＧＰＣ－１タンパク質、例えば鳥類のＧＰＣ－１タンパク質などの中に存在するものであり得る。
【0088】
エピトープは、ヒトＧＰＣ－１タンパク質（例えば、ＮＣＢＩ参照配列アクセッション番号ＮＰ＿００２０７２．２、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ５１２７９．１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ９８１３２．１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＡＷ７１１８４．１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３５０５２．２および／または配列番号１４のいずれか１つに記載の配列によって定められるもの）中に存在するものであり得る。
【0089】
エピトープはほかにも、ＧＰＣ－１変異体（例えば、ＧＰＣ－１のアイソフォーム、スプライスバリアントまたはアロタイプ）中に存在するものであり得ることが理解されよう。エピトープは、細胞表面結合型および／または分泌型のＧＰＣ－１中に存在するものであり得る。
【0090】
エピトープ
－グリピカン－１エピトープ
本発明は、ＧＰＣ－１エピトープおよびその構成要素を提供するほか、前記エピトープおよび／またはエピトープ構成要素の組合せも含む。
－グリピカン－１エピトープ
本発明は、ＧＰＣ－１エピトープおよびその構成要素を提供するほか、前記エピトープおよび／またはエピトープ構成要素の組合せも含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、本発明によるＧＰＣ－１エピトープは、下の表１に記載するエピトープのうちのいずれか１つまたは複数のものを含むかこれよりなるものであり得る。
【0092】
【表1】
【0093】
ある特定の実施形態では、本発明のエピトープは複数のセグメントを含むかこれよりなるものである。これらのエピトープは、直鎖状であっても不連続であってもよい。複数のセグメントを含むエピトープの非限定的な例を下の表２に記載する。
【0094】
【表2】
【表2-1】
【表2-2】
【0095】
他の実施形態では、本発明は、複数の別個のエピトープを含むかこれよりなる異なるエピトープの組合せを提供する。これらの別個のエピトープは、直鎖状であっても不連続であってもよい。複数の異なるエピトープを含むエピトープの組合せの非限定的な例を下の表３に記載する。
【0096】
【表3】
【表3-1】
【表3-2】
【0097】
本発明によるエピトープの組合せは、ガンマ－セミノプロテインまたはカリクレイン－３（ＫＬＫ３）としても知られる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を含み得る。したがって、本発明によるエピトープの組合せは、表１または表２に記載されるエピトープのうちのいずれか１つをＰＳＡと組み合わせて含むか、表３に記載されるエピトープの組合せのうちのいずれか１つをさらにＰＳＡと組み合わせて含み得る。
【0098】
－変異体
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープの変異体を提供する。
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープの変異体を提供する。
【0099】
変異体は、当業者に公知の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換（１つまたは複数）を含み得る。
【0100】
いくつかの実施形態では、本発明のエピトープの変異体は、特定の領域にわたって、または明記されない場合は配列全体にわたって、特定のパーセントのアミノ酸残基が同じで
ある（「配列同一性」のパーセント）。したがって、本明細書に開示されるＧＰＣ－１エピトープの「変異体」は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープの配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
ある（「配列同一性」のパーセント）。したがって、本明細書に開示されるＧＰＣ－１エピトープの「変異体」は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープの配列と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【0101】
変異体は、その変異体の起源であるＧＰＣ－１エピトープ配列と比較して同じ生物活性、実質的に同じ生物活性または変化した生物活性を保持し得る。
【0102】
変異体は、異なる科、属または種に由来し、その変異体の起源であるＧＰＣ－１エピトープ配列と同じまたは実質的に同じ生物学的機能または生物活性を有する相同なＧＰＣ－１エピトープ（例えば、ほかの種の哺乳動物に由来するもの）であり得る。
【0103】
配列同一性の差は、アミノ酸置換（例えば、保存的置換および／または非保存的置換）、挿入および／または欠失によって生じ得る。保存的アミノ酸置換は、当業者に周知のように、ポリペプチド鎖内のあるアミノ酸を特性がほぼ同じ別のアミノ酸に置換する、または置き換えることを指す。例えば、電荷を持つアミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）を同じく電荷を持つアミノ酸であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）で置換することは、保存的アミノ酸置換であるといえる。
【0104】
２配列間の配列同一性のパーセントは、当業者に公知の方法を用いて容易に求め得る。例えば、最適に整列させた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって２配列間の配列同一性のパーセントを求め得る。配列の比較ウィンドウ内の部分は、例えば、２つの配列を最適に整列させるため欠失も付加も含まない参照配列（例えば、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープ配列）と比較したとき、欠失または付加（すなわち、ギャップ）を含み得る。次いで、両配列で核酸塩基またはアミノ酸残基が一致する位置の数を求めてマッチする位置を算出し、そのマッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセントを求めることによって、配列同一性のパーセントを算出し得る。
【0105】
配列同一性のレベルは、配列解析ソフトウェア（例えば、５３７０５、ウィスコンシン州、マディソン、ユニバーシティアベニュー１７１０、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター、遺伝学コンピュータグループのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ）を用いて測定し得る。このソフトウェアは、様々な置換、欠失をはじめとする改変に相同性の程度を割り当てることによって、類似した配列をマッチさせるものである。２配列間の配列同一性の程度を測定するのに適したコンピュータソフトウェアの例としてはほかにも、特に限定されないが、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（カリフォルニア州、マウンテンビューのＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社から入手可能）のＣＬＵＳＴＡＬ；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）のほか、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ、スクラントンロード９６８５のＡｃｃｅｌｒｙｓ社から入手可能）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが挙げられる。
【0106】
上の表１～３に記載したものを含めた上記の実施形態に関連して、言及される変異体の適切で非限定的な例を下の表４に記載する。
【0107】
【表4】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【0108】
したがって、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）の変異体は、２位にＶ（ｖａｌ）、５位にＱ（ｇｌｎ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および７位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、１位にＫ（ｌｙｓ）、３位にＮ（ａｓｎ）および／または４位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、８位にＧ（ｇｌｙ）、９位にＰ（ｐｒｏ）および／または１０位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号１の１位、３位、４位、８位、９位、１０位、１１位および／または１２位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0109】
あるいは、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）の変異体は、６位にＧ（ｇｌｙ）、８位にＧ（ｇｌｙ）および１０位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、３位にＮ（ａｓｎ）、５位にＱ（ｇｌｎ）および／または７位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号１の１位、２位、３位、４位、５位、７位、９位、１１位および／または１２位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0110】
あるいは、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号１）の変異体は、７位にＰ（ｐｒｏ）、８位にＧ（ｇｌｙ）および１０位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、５位にＱ（ｇｌｎ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および／または１１位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個または９個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号１の１位、２位、３位、４位、５位、６位、９位、１１位および／または１２位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0111】
ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）の変異体は、１位にＶ（ｖａｌ）、４位にＱ（ｇｌｎ）、５位にＧ（ｇｌｙ）および６位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、２位にＮ（ａｓｎ）および／または３位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加
えて、またはこれに代えて、この変異体は、７位にＧ（ｇｌｙ）、８位にＰ（ｐｒｏ）および／または９位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号２の２位、３位、７位、８位、９位、１０位および／または１１位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
えて、またはこれに代えて、この変異体は、７位にＧ（ｇｌｙ）、８位にＰ（ｐｒｏ）および／または９位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号２の２位、３位、７位、８位、９位、１０位および／または１１位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0112】
あるいは、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）の変異体は、５位にＧ（ｇｌｙ）、７位にＧ（ｇｌｙ）および９位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、２位にＮ（ａｓｎ）、４位にＱ（ｇｌｎ）および／または６位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号２の１位、２位、３位、４位、６位、８位、１０位および／または１１位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0113】
あるいは、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ（配列番号２）の変異体は、６位にＰ（ｐｒｏ）、７位にＧ（ｇｌｙ）および９位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、４位にＱ（ｇｌｎ）、５位にＧ（ｇｌｙ）および／または１０位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号２の１位、２位、３位、４位、５位、８位、１０位および／または１１位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0114】
ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体は、１位にＶ（ｖａｌ）、４位にＱ（ｇｌｎ）、５位にＧ（ｇｌｙ）および６位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、２位にＮ（ａｓｎ）および／または３位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、７位にＧ（ｇｌｙ）、８位にＰ（ｐｒｏ）および／または９位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号３の２位、３位、７位、８位、９位および／または１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0115】
あるいは、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体は、５位にＧ（ｇｌｙ）、７位にＧ（ｇｌｙ）および９位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、２位にＮ（ａｓｎ）、４位にＱ（ｇｌｎ）および／または６位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号３の１位、２位、３位、４位、６位、８位および／または１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0116】
あるいは、ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号３）の変異体は、６位にＰ（ｐｒｏ）、７位にＧ（ｇｌｙ）および９位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、４位にＱ（ｇｌｎ）、５位にＧ（ｇｌｙ）および／または１０位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号３の１位、２位、３位、４位、５位、８位および／または１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0117】
ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体は、３位にＱ（ｇｌｎ）、４位にＧ（ｇｌｙ）および５位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。変異体は、１位にＮ（ａｓｎ）および／また
は２位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、６位にＧ（ｇｌｙ）、７位にＰ（ｐｒｏ）および／または８位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号４の１位、２位、６位、７位、８位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
は２位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、６位にＧ（ｇｌｙ）、７位にＰ（ｐｒｏ）および／または８位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号４の１位、２位、６位、７位、８位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0118】
あるいは、ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体は、４位にＧ（ｇｌｙ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および８位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、１位にＮ（ａｓｎ）、３位にＱ（ｇｌｎ）および／または５位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号４の１位、２位、３位、５位、７位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0119】
あるいは、ＮＰＱＧＰＧＰＥＥ（配列番号４）の変異体は、５位にＰ（ｐｒｏ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および８位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、３位にＱ（ｇｌｎ）、４位にＧ（ｇｌｙ）および／または９位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号４の１位、２位、３位、４位、７位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0120】
ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）の変異体は、２位にＶ（ｖａｌ）、５位にＱ（ｇｌｎ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および７位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、１位にＫ（ｌｙｓ）、３位にＮ（ａｓｎ）および／または４位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、８位にＧ（ｇｌｙ）、９位にＰ（ｐｒｏ）および／または１０位にＥ（ｇｌｕ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個または６個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号５の１位、３位、４位、８位、９位および／または１０位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0121】
あるいは、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）の変異体は、６位にＧ（ｇｌｙ）、８位にＧ（ｇｌｙ）および１０位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、３位にＮ（ａｓｎ）、５位にＱ（ｇｌｎ）および／または７位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号５の１位、２位、３位、４位、５位、７位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0122】
あるいは、ＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥ（配列番号５）の変異体は、７位にＰ（ｐｒｏ）、８位にＧ（ｇｌｙ）および１０位にＥ（ｇｌｕ）を含み得る。この変異体は、５位にＱ（ｇｌｎ）および／または６位にＧ（ｇｌｙ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号５の１位、２位、３位、４位、５位、６位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0123】
ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体は、２位にＶ（ｖａｌ）、５位にＱ（ｇｌ
ｎ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および７位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、１位にＫ（ｌｙｓ）、３位にＮ（ａｓｎ）および／または４位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、８位にＧ（ｇｌｙ）および／または９位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個または５個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号６の１位、３位、４位、８位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
ｎ）、６位にＧ（ｇｌｙ）および７位にＰ（ｐｒｏ）を含み得る。この変異体は、１位にＫ（ｌｙｓ）、３位にＮ（ａｓｎ）および／または４位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、８位にＧ（ｇｌｙ）および／または９位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個または５個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号６の１位、３位、４位、８位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0124】
ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体は、６位にＧ（ｇｌｙ）および８位にＧ（ｇｌｙ）を含み得る。この変異体は、３位にＮ（ａｓｎ）、５位にＱ（ｇｌｎ）および／または７位にＰ（ｐｒｏ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号６の１位、２位、３位、４位、５位、７位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。
【0125】
ＫＶＮＰＱＧＰＧＰ（配列番号６）の変異体は、７位にＰ（ｐｒｏ）および８位にＧ（ｇｌｙ）を含み得る。この変異体は、５位にＱ（ｇｌｎ）および／または６位にＧ（ｇｌｙ）をさらに含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、この変異体は、置換残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個含み得る。置換アミノ酸残基（１つまたは複数）は、配列番号６の１位、２位、３位、４位、５位、６位および／または９位のうちのいずれか１つまたは複数の位置に存在し得る。配列番号７～１３で表される本発明のエピトープのうちのいずれか１つの変異体は、そのエピトープ配列の１つまたは複数の任意の位置にアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、当業者に公知の保存的アミノ酸置換であっても非保存的アミノ酸置換であってもよい。変異体は、保存的置換（１つまたは複数）のみ、非保存的置換（１つまたは複数）のみまたは保存的置換（１つまたは複数）と非保存的置換（１つまたは複数）の組み合わせを含み得る。
【0126】
－フラグメント
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープおよび変異体のフラグメントを提供する。
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープおよび変異体のフラグメントを提供する。
【0127】
いくつかの実施形態では、本発明のエピトープのフラグメントは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個のアミノ酸を含むかこれよりなるものであり得る。したがって、本発明によるエピトープのフラグメントは、例えば、長さ５～１０アミノ酸、５～１５アミノ酸、５～２０アミノ酸、１０～２０アミノ酸、１０～１５アミノ酸、７～１５アミノ酸、７～１３アミノ酸、８～１２アミノ酸、８～１０アミノ酸、１１～１９アミノ酸、１２～１８アミノ酸または１３～１７アミノ酸を含むか、これよりなるものであり得る。本明細書に開示される完全長ＧＰＣ－１エピトープのフラグメントは一般に、完全長ＧＰＣ－１エピトープと同等であるか、場合によってはこれより改善された免疫学的特性を有し得る。
【0128】
上の表１～４に記載されるものを含めた上記の実施形態に関連して、言及されるフラグメントの適切で非限定的な例を表５に記載する。
【0129】
【表5】
【表5-1】
【0130】
－融合ポリペプチド
本発明の特定の実施形態は、融合ポリペプチド形態のＧＰＣ－１エピトープを提供する。例えば、表１から選択される２つ以上の完全長エピトープ、表２から選択される２つ以上のエピトープセグメント、表３から選択される２つ以上の完全長エピトープの組合せまたは表１の完全長エピトープと表２から選択されるいずれか１つもしくは複数のエピトープとの組合せを連結して融合ポリペプチドを形成し得る。
本発明の特定の実施形態は、融合ポリペプチド形態のＧＰＣ－１エピトープを提供する。例えば、表１から選択される２つ以上の完全長エピトープ、表２から選択される２つ以上のエピトープセグメント、表３から選択される２つ以上の完全長エピトープの組合せまたは表１の完全長エピトープと表２から選択されるいずれか１つもしくは複数のエピトープとの組合せを連結して融合ポリペプチドを形成し得る。
【0131】
融合ポリペプチドは、例えば化学的コンジュゲーションを含めた当業者に公知の標準的な技術を用いて調製することができる。このほか、融合ポリペプチドを発現系で組換えポリペプチドとして発現させてもよい。例えば、融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素をコードするＤＮＡ配列を別個に組み立て、しかるべき発現ベクター内にライゲートし得る。あるポリペプチド構成要素をコードするＤＮＡ配列の３’末端を、配列のリーディングフレームがインフレームになるように、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第二のポリペプチド構成要素をコードするＤＮＡ配列の５’末端にライゲートすることができる。これにより、両ポリペプチド構成要素の生物活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳が可能になる。
【0132】
リンカー配列を用いて、融合タンパク質の第一のポリペプチド構成要素と第二のポリペ
プチド構成要素を、各ポリペプチド構成要素が確実にしかるべき二次構造および／または三次構造にフォールドされるのに十分な距離を空けて分離させ得る。適切なリンカーの非限定的な例としては、当業者に公知のペプチド／ポリペプチド、アルキル鎖をはじめとする便利なスペーサー分子が挙げられる。柔軟な伸長立体配座をとることが可能であること、融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素（１つまたは複数）内の機能的エピトープ（１つまたは複数）と相互作用し得る二次構造をとることが不可能であること、ならびに／あるいは融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素（１つまたは複数）内の機能的エピトープ（１つまたは複数）と反応し得る疎水性残基および／または荷電残基がないことを含めた諸因子に応じて、適切なペプチドリンカー配列を選択し得る。
プチド構成要素を、各ポリペプチド構成要素が確実にしかるべき二次構造および／または三次構造にフォールドされるのに十分な距離を空けて分離させ得る。適切なリンカーの非限定的な例としては、当業者に公知のペプチド／ポリペプチド、アルキル鎖をはじめとする便利なスペーサー分子が挙げられる。柔軟な伸長立体配座をとることが可能であること、融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素（１つまたは複数）内の機能的エピトープ（１つまたは複数）と相互作用し得る二次構造をとることが不可能であること、ならびに／あるいは融合ポリペプチドのポリペプチド構成要素（１つまたは複数）内の機能的エピトープ（１つまたは複数）と反応し得る疎水性残基および／または荷電残基がないことを含めた諸因子に応じて、適切なペプチドリンカー配列を選択し得る。
【0133】
単なる非限定的な例を挙げれば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基および／またはＳｅｒ残基を含み得る。上記のものに加えて、またはこれに代えてほかにも、ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性付近のアミノ酸をペプチドリンカー配列に用いてもよい。リンカーとして有用に使用し得るアミノ酸配列のさらなる例としては、米国特許第４，９３５，２３３号；米国特許第４，７５１，１８０号；Ｍｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８２５８－８２６２，１９８６；およびＭａｒａｔｅａら，Ｇｅｎｅ ４０：３９－４６，１９８５に開示されているものが挙げられる。リンカー配列は一般に、長さが１～約５０アミノ酸のものであり得る。したがって、リンカー配列は、長さが５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、１０～５０アミノ酸、１０～４０アミノ酸、１０～３０アミノ酸、２０～３０アミノ酸、１～５アミノ酸または５～１０アミノ酸であり得る。本発明による融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドの第一のポリペプチド構成要素と第二のポリペプチド構成要素が、機能ドメインを分離し立体障害を防ぐのに使用し得る必須ではないＮ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列を必要としないこともある。
【0134】
－ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明はほかにも、本発明のＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明はほかにも、本発明のＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【0135】
このポリヌクレオチドをベクターにクローン化し得る。ベクターは、例えば、ＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープセグメント（１つまたは複数）および／または融合タンパク質をコードするＤＮＡ、ＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含み得る。ベクターは、プラスミドベクター、ウイルスベクターまたは外来配列の挿入、外来配列の細胞内への導入および導入配列の発現に適合した他の任意の適切な媒体であり得る。通常、ベクターは発現ベクターであり、発現制御配列およびプロセシング配列、例えばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナルおよび転写終止配列を含み得る。
【0136】
本発明はこのほか、上記のベクターによって形質転換させた宿主細胞を企図する。例えば、本発明のポリヌクレオチドをベクターにクローン化し、それを細菌宿主細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に形質転換し得る。
【0137】
ベクターの構築および宿主細胞内へのベクターの形質転換の方法は一般に、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ ＹｏｒｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
【0138】
－作製
本発明のＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法論に従って製造することができる。
本発明のＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質は、当業者に周知の標準的な方法論に従って製造することができる。
【0139】
エピトープ、セグメントおよび融合タンパク質は、様々なよく知られた合成技術および／または組換え技術のいずれかを用いも調製し得る。ポリペプチドは、例えば、当業者に周知の方法論を用いる合成手段によって作製し得る。１つの非限定的な例では、アミノ酸を順次付加してアミノ酸鎖を伸長させる市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相合成法）を用い得る（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２１４６，１９６３）。本明細書に開示されるエピトープ、セグメントおよび融合タンパク質を自動的に合成する装置が市販されており（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社／Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ部門（フォスターシティ、カリフォルニア州）、製造業者の取扱説明書に従って使用し得る。
【0140】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、当業者が利用可能な他の任意の方法によってエピトープ、セグメントおよび融合タンパク質を作製してもよい。例えば組換え手段を用いてもよく、このような手段では、選択したエピトープ（１つまたは複数）、セグメント（１つまたは複数）および／または融合タンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸を、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを用いて発現ベクターに挿入し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｊａｎ．１５，２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８７９６９５７６５；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ（１９８９））。選択したエピトープ（１つまたは複数）、セグメント（１つまたは複数）および／または融合タンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸を含む適切な発現ベクターの構築では、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を用いる。
【0141】
ライゲートした核酸配列は、エピトープ（１つまたは複数）、セグメント（１つまたは複数）および／または 融合タンパク質（１つまたは複数）の発現を促進する適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントと作動可能に連結することができる。タンパク質の発現に関与する調節エレメントは、ポリペプチドのコード領域の５’側に位置し得る。翻訳を終了させる停止コドンおよび転写終止シグナルは、エピトープ（１つまたは複数）、セグメント（１つまたは複数）および／または融合タンパク質（１つまたは複数）をコードする核酸配列の３’側に存在し得る。目的とするポリペプチド（１つまたは複数）を作動可能に連結された調節エレメントとともにコードする核酸を構築した後、得られた発現カセットを宿主細胞内に導入し、コードされているポリペプチド（１つまたは複数）を発現させることができる。
【0142】
本発明では、ＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質は「単離」されたものであり得る。「単離」ポリペプチドとは、その元の環境から取り出されたポリペプチドのことである。例えば、本明細書で言及される天然のタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系で共存する物質の一部または全部から分離されていれば、単離されたも
のであると見なす。本明細書で言及される単離ポリペプチドは、精製されたものであってもよい。例えば、単離ポリペプチドは、純度が少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％であり得る。
のであると見なす。本明細書で言及される単離ポリペプチドは、精製されたものであってもよい。例えば、単離ポリペプチドは、純度が少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％であり得る。
【0143】
本発明によるポリヌクレオチドおよび核酸は一般に、当該技術分野で公知のものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ．ら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；およびＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２），２８０－２８１記載されている。ポリヌクレオチドは、例えば化学合成技術、例えばホスホジエステル法およびホスホトリエステル方法（例えば、Ｎａｒａｎｇ Ｓ．Ａ．ら（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ，Ｅ．Ｌ．（１９７９）ら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；および米国特許第４３５６２７０号を参照されたい）、ジエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ Ｓ．Ｌら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９－１８６２を参照されたい）によって調製し得る。修飾した固相支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する方法が米国特許第４４５８０６６号に記載されている。
【0144】
－支持体
本発明によるエピトープおよび融合ポリペプチドを支持体に付着させてもよい。支持体は、例えば、エピトープを保持し、反応混合物の大部分においてそれを自由に移動させない不溶性材料または基質であり得る。エピトープおよび融合ポリペプチドを固定化または局在化させるのに適した支持体は当業者に周知である。支持体は、マイクロアッセイに使用するのに好都合なビーズ、個別のウェルを有するプラスチック製およびガラス製のプレートをはじめとする反応条件に適合性のある材料を含めた様々な形態の多種多様な基質、ポリマーなどから選択することができる。特定の好ましい実施形態では、支持体は、プラスチック製材料、プラスチック製のビーズもしくはウエハなど、または特定のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を実施するプラスチック製のウェルもしくはチューブであり得る。
本発明によるエピトープおよび融合ポリペプチドを支持体に付着させてもよい。支持体は、例えば、エピトープを保持し、反応混合物の大部分においてそれを自由に移動させない不溶性材料または基質であり得る。エピトープおよび融合ポリペプチドを固定化または局在化させるのに適した支持体は当業者に周知である。支持体は、マイクロアッセイに使用するのに好都合なビーズ、個別のウェルを有するプラスチック製およびガラス製のプレートをはじめとする反応条件に適合性のある材料を含めた様々な形態の多種多様な基質、ポリマーなどから選択することができる。特定の好ましい実施形態では、支持体は、プラスチック製材料、プラスチック製のビーズもしくはウエハなど、または特定のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を実施するプラスチック製のウェルもしくはチューブであり得る。
【0145】
結合実体
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープと特異的に結合することが可能な結合実体を提供する。
本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープと特異的に結合することが可能な結合実体を提供する。
【0146】
結合実体は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープと特異的に結合することが可能な任意の分子であり得る。結合実体の非限定的な例としては、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、分子インプリント、レクチンおよび捕捉化合物が挙げられる。結合実体は、本発明のＧＰＣ－１エピトープまたはＧＰＣ－１の別の異なる領域と結合することができるほか、エピトープと別の異なる結合実体、例えば本明細書に開示される抗体などとの間の結合相互作用を修飾することもできる薬剤であり得る。
【0147】
本発明のＧＰＣ－１エピトープと特異的に結合することが可能な抗体などの結合実体は、所与の標的エピトープ、エピトープセグメントの組合せまたはエピトープの組合せと他の非標的分子よりも優先的に結合することができる。例えば、結合実体（「分子Ａ」）が、所与の標的ＧＰＣ－１エピトープ（「分子Ｂ」）と特異的に結合することが可能である場合、分子Ａは、分子Ｂと他のいくつかの潜在的な別の結合パートナーとを区別する能力を有する。したがって、分子Ａを潜在的な結合パートナーとして接触する可能性が等しい様々な分子に曝露すると、分子Ａは分子Ｂと選択的に結合し、他の別の潜在的結合パートナーは実質的に分子Ａと未結合のままとなる。一般に、分子Ａは他の潜在的結合パートナ
ーの少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは１００倍超の頻度で分子Ｂと優先的に結合する。分子Ａは、分子Ｂ以外の分子とも微弱であるが検出可能なレベルで結合することが可能であり得る。これはバックグランド結合として一般に知られているものであり、例えば、しかるべき対照を用いることによって、分子Ｂに特異的な結合と容易に区別することができる。
ーの少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、より好ましくは１００倍、最も好ましくは１００倍超の頻度で分子Ｂと優先的に結合する。分子Ａは、分子Ｂ以外の分子とも微弱であるが検出可能なレベルで結合することが可能であり得る。これはバックグランド結合として一般に知られているものであり、例えば、しかるべき対照を用いることによって、分子Ｂに特異的な結合と容易に区別することができる。
【0148】
本明細書に提供される特異的ＧＰＣ－１エピトープがわかれば、当業者は発明のための努力をせずに結合実体を作製することができる。例えば、公知の技術を用いて、本発明のＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）と特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製物を調製することができる。
【0149】
標的ＧＰＣ－１エピトープに対するモノクローナル抗体の調製には、培養連続細胞株に抗体分子を産生させる任意の技術を用い得る。一般的な方法論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），（１９８８），「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。具体的な方法論としては、最初にＫｏｈｌｅｒ（１９７５）が開発したハイブリドーマ技術（「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）のほか、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，（１９８３），「Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４：７２－７９）およびヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，（１９８５），「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｐｐ．７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。融合以外の技術、例えば発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バーウイルスによるトランスフェクションによって、不死性の抗体産生細胞系を作製することができる（例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，（１９８０），「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，（１９８１），「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ－Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０），「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」，ｐｐ．７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。融合以外の技術、例えば発癌性ＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換またはエプスタイン・バーウイルスによるトランスフェクションによって、不死性の抗体産生細胞系を作製することができる（例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，（１９８０），「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，（１９８１），「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ－Ｈｏｌｌａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ；Ｋｅｎｎｅｔｔら（１９８０），「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【0150】
簡潔に述べれば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する手段では、骨髄腫をはじめとする自己永続化細胞系と、その認識因子結合部分、認識因子またはその複製開始点特異的ＤＮＡ結合部分で過免疫化した哺乳動物の脾臓から採取したリンパ球とを融合することができる。本発明のＧＰＣ－１エピトープと特異的に結合することが可能なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、提示されたエピトープ（１つまたは複数）に対して免疫反応を示す能力によって特定される。
【0151】
本発明の実施に有用なモノクローナル抗体は、しかるべき抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含む、モノクローナルハイブリドーマの培養を開始することによって作製することができる。この培養物をハイブリドーマが培地中に抗体分子を分泌するのに十分な条件下で、そのような分泌に十分な期間にわたって維持する。次いで、抗体含有培地を収集する。次いで、よく知られた技術によって抗体分子をさらに単離することができる。
【0152】
同じように、ポリクローナル抗体の作製に用い得る当該技術分野で公知の様々な方法が
存在する。所与のＧＰＣ－１エピトープの組合せに対するポリクローナル抗体の作製には、エピトープの注射によって、特に限定されないが、ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含めた様々な宿主動物を感作させることができる。さらに、標的分子と免疫原性担体（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））とをコンジュゲートすることができる。このほか、特に限定されないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン（ｒｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）などの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのヒトに有用であると考えられるアジュバントを含めた様々なアジュバントを用いて免疫応答を増大させ得る。
存在する。所与のＧＰＣ－１エピトープの組合せに対するポリクローナル抗体の作製には、エピトープの注射によって、特に限定されないが、ウサギ、ニワトリ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどを含めた様々な宿主動物を感作させることができる。さらに、標的分子と免疫原性担体（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））とをコンジュゲートすることができる。このほか、特に限定されないが、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチン（ｒｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）などの界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのヒトに有用であると考えられるアジュバントを含めた様々なアジュバントを用いて免疫応答を増大させ得る。
【0153】
所望の抗体のスクリーニングは、当該技術分野で公知の様々な技術によって実施することができる。抗体の免疫特異的結合を調べるのに適したアッセイとしては、特に限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫測定法）、サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイなどが挙げられる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，（１９９４），「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。抗体結合は、一次抗体上の検出可能な標識によって検出し得る。あるいは、適宜標識した二次抗体または試薬との結合によって抗体を検出してもよい。イムノアッセイで結合を検出する様々な方法が当該技術分野で公知であり、本発明の範囲内に含まれる。
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第１巻，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。抗体結合は、一次抗体上の検出可能な標識によって検出し得る。あるいは、適宜標識した二次抗体または試薬との結合によって抗体を検出してもよい。イムノアッセイで結合を検出する様々な方法が当該技術分野で公知であり、本発明の範囲内に含まれる。
【0154】
目的とする特異的ＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）に対する抗体（またはそのフラグメント）は、そのエピトープ（１つまたは複数）に対して結合親和性を示す。好ましくは、抗体（またはそのフラグメント）の結合親和性または結合活性は約１０５Ｍ－１超、より好ましくは約１０６Ｍ－１超、さらにより好ましくは約１０７Ｍ－１超、最も好ましくは約１０８Ｍ－１超である。
【0155】
適切な量の本発明による抗体を得るという観点から言えば、無血清培地によるバッチ発酵を用いて抗体（１つまたは複数）を製造し得る。発酵後、クロマトグラフィーおよびウイルス不活性化／除去の段階を組み込んだ多段階からなる方法により抗体を精製し得る。例えば、最初にプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより抗体を分離し、次いで、溶媒／界面活性剤で処理して、脂質エンベロープ型ウイルスを不活性化し得る。さらなる精製、通常は陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて、残ったタンパク質、溶媒／界面活性剤および核酸を除去し得る。精製した抗体をゲルろ過カラムを用いてさらに精製し、０．９％生理食塩水で製剤化する。次いで、製剤化したバルク調製物を滅菌およびウイルスろ過し、小分けし得る。
【0156】
本発明の１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープと結合することが可能な抗体の非限定的な例としては、
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ２１４５、オーストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販さ
れている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００｜抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ２１４５、オーストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販さ
れている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００｜抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
【0157】
組成物およびキット
本発明による組成物およびキットは以下のものを含み得る：
－本明細書（例えば、表１）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープ、その変異体またはフラグメント；
－本明細書（例えば、表２）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープセグメント、その変異体またはフラグメント；
－本明細書（例えば、表３）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープの組合せ；
－本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープのセグメント（１つまたは複数）および／またはその変異体もしくはフラグメントを含む１つまたは複数の融合タンパク質（上記の「融合ポリペプチド」と題するサブセクションを参照されたい）；ならびに／あるいは
－本明細書に記載される１つまたは複数の結合実体（上記の「結合実体」と題するサブセクションを参照されたい）。
本発明による組成物およびキットは以下のものを含み得る：
－本明細書（例えば、表１）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープ、その変異体またはフラグメント；
－本明細書（例えば、表２）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープセグメント、その変異体またはフラグメント；
－本明細書（例えば、表３）に記載される１つまたは複数のＧＰＣ－１エピトープの組合せ；
－本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープのセグメント（１つまたは複数）および／またはその変異体もしくはフラグメントを含む１つまたは複数の融合タンパク質（上記の「融合ポリペプチド」と題するサブセクションを参照されたい）；ならびに／あるいは
－本明細書に記載される１つまたは複数の結合実体（上記の「結合実体」と題するサブセクションを参照されたい）。
【0158】
組成物は、許容される担体、補助剤および／または希釈剤をさらに含み得る。担体、希釈剤および補助剤は、組成物の他の成分と適合性がある観点から「許容される」ものであり得、かつ／または一般に、その任意の被投与者に無害である点で「薬学的に許容される」ものであり得る。適切な担体、希釈剤および補助剤は当業者に周知である（例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編），Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，第１７版（１９８５）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、組成物を診断目的または研究目的で使用し得る。
【0159】
キットは、小分けにしたキットでもひとまとめにしたキットでもよい。「小分けにしたキット」は、２つ以上の別個の容器を含み、各容器にキットの構成要素全体のサブ部分が収納された送達システムを指す。２つ以上の別個の容器を含み、各容器にキットの構成要素全体のサブ部分が収納された送達システムはいずれも、小分けにしたキットという用語の意味の範囲内に含まれる。「ひとまとめにしたキット」は、キットの全構成要素が単一の容器（例えば、所望の各構成要素が収められている単一の箱）に収納されている送達システムを指す。いくつかの実施形態では、キットを診断目的または研究目的で使用し得る。
【0160】
診断方法
本発明のＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質は、診断方法に用いることができる。具体的には、本発明者らは、グリピカン－１が新規な前立腺癌のマーカーとなることを発見した（Ｗａｌｓｈらの「Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」と題する米国特許仮出願第６１／９２８／７７６号（未公開））。
本発明のＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープのセグメントならびにＧＰＣ－１エピトープおよび／またはそのセグメントを含む融合タンパク質は、診断方法に用いることができる。具体的には、本発明者らは、グリピカン－１が新規な前立腺癌のマーカーとなることを発見した（Ｗａｌｓｈらの「Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ
Ｃａｎｃｅｒ Ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」と題する米国特許仮出願第６１／９２８／７７６号（未公開））。
【0161】
したがって、本発明は、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに／あるいはエピトープ／エピトープセグメントの変異体およびフラグメントの検出に基づいて、対象の前立腺癌を診断する、予後を予測する、あるいは対象に前立腺癌が発症する可能性を予測する方法を提供する。上記のものに加えて、またはこれに代えて、ＧＰＣ－１エピトープの変異体およびフラグメントならびに／あるいはＧＰＣ－１エピトープフラグメントを診断方法で検出し得る。
【0162】
上記の方法は一般に、被験対象由来の生体試料中のＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）および／またはＧＰＣ－１エピトープセグメントのレベルを求めることを含む。この方法を実施する際に、上記のものに加えて、またはこれに代えて、ＧＰＣ－１エピトープの変異体（１つまたは複数）およびフラグメントならびに／あるいはそのセグメントのレベルを求めてもよい。ＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに変異体およびフラグメントの非限定的な例としては、「エピトープ」と題するセクションで言及されるもの（特に、表１～３ならびにそれに関連する変異体およびフラグメントの説明を参照されたい）が挙げられる。
【0163】
この方法は、生体試料中のガンマ－セミノプロテインまたはカリクレイン－３（ＫＬＫ３）としても知られる前立腺特異抗原（ＰＳＡ）のレベルを求めることのほか、任意選択で、検出されたＰＳＡのレベルを対照のものと比較することをさらに含み得る。
【0164】
いくつかの実施形態では、対象の生体試料中に検出されたＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに／あるいはエピトープ／エピトープセグメントの変異体およびフラグメントのレベルと、対照試料中に存在することが明らかになったレベルとを比較し得る。対照試料中のレベルは、対象の生体試料中に存在するレベルを求める前、求めるとき、または求めた後に求め得る。非限定的な例を挙げれば、ある個体由来の同等の生体試料中に存在するレベルまたは個体集団由来の生体試料中に存在する平均レベルに基づいて、対照試料中に存在するレベルを求め得る。個体（１つまたは複数）は、癌ではないことが既にわかっている個体および／または前立腺癌ではないことが既にわかっている個体であり得る。一般に、対象の生体試料中のレベルが対照のものよりも高いことが検出されれば、その対象は前立腺癌を有するか、前立腺癌を発症する可能性が高いことを示すものと考えられる。例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または少なくとも６０％高いことが、対象が前立腺癌を有するか、前立腺癌を発症する可能性が高いことの指標となり得る。あるいは、対象の生体試料中のレベルが対照のものと同等かそれ以下のレベルであることが検出されれば、その対象は前立腺癌を有さないか、前立腺癌を発症する可能性が高くないことを示すものと考えられる。
【0165】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに／あるいはエピトープ／エピトープセグメントの変異体およびフラグメントを本発明の診断方法に陽性対照として使用する。例えば、これらを所与のアッセイに使用して、実施したそのアッセイでＧＰＣ－１エピトープ（１つまたは複数）、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに／あるいは変異体およびフラグメントを検出することが可能であることを確認する。
【0166】
いくつかの実施形態では、本発明の診断方法に本発明の融合タンパク質（１つまたは複数）を用いる。「融合タンパク質」と題するサブセクションには、適切な融合タンパク質の非限定的な例が記載されている。融合タンパク質（１つまたは複数）は、検出方法に陽性対照として使用し得る。
【0167】
生体試料は組織試料（例えば、前立腺組織の生検試料）または体液試料であり得る。
【0168】
体液試料は、血液、血清、血漿または尿試料であり得る。
【0169】
本発明で検出され得る前立腺癌の非限定的な例としては、前立腺上皮内新生物、腺癌、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫が挙げられる。
【0170】
特定の検出方法に限定されるわけではないが、単なる非限定的な例を挙げれば、ＧＰＣ－１エピトープ、ＧＰＣ－１エピトープセグメントならびに変異体およびフラグメントの検出は、特に限定されないが、ウエスタンブロット解析、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、バイオフィルム試験またはａｆｆｉｎｉｔｙ ｒｉｎｇ ｔｅｓｔ（例えば、米国特許出願公開第２０１３／０１６，７３６号を参照されたい）を含めた当業者に公知の標準的なアッセイによるものであり得る。これらのアッセイに本発明による結合実体を使用し得る。
【0171】
いくつかの実施形態では、結合実体は抗体である。他の実施形態では、待つ実体は抗体ではない。
【0172】
いくつかの実施形態では、抗体は以下のうちのいずれか１つまたは複数のものから選択される：
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ ２１４５、オーストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ ２１４５、オーストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
【0173】
いくつかの実施形態では、抗体は以下のうちのいずれか１つまたは複数のものからは選択されない：
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ２１４５、オー
ストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
（ｉ）２０１４年８月２２日、ブダペスト条約の条項に従ってＣｅｌｌｂａｎｋ Ａｕｓｔｒａｌｉａ（ホークスベリーロード２１４、ウェストミード、ＮＳＷ２１４５、オー
ストラリア）にアクセッション番号ＣＢＡ２０１４００２６で寄託されたＭＩＬ３８抗体；
（ｉｉ）抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体（ａｂ１３７６０４）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なウサギポリクローナル抗体（ＩｇＧ）であり、ａｂｃａｍ（登録商標）社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｇｌｙｐｉｃａｎ－１－ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｂ１３７６０４．ｈｔｍｌを参照されたい）；
（ｉｉｉ）ＭＡＢ２６００抗グリピカン－１抗体、クローン４Ｄ１：ヒトおよびラットのＧＰＣ－１に特異的なマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧｋ）であり、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社から市販されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ／ＡＵ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／，ＭＭ＿ＮＦ－ＭＡＢ２６００？ｃｉｄ＝ＢＩ－ＸＸ－ＢＲＣ－Ａ－ＢＩＯＣ－抗Ｂ０３３－１３０８を参照されたい）；
（ｉｖ）ヤギ抗グリピカン１抗体（ＡＡ２４－５３０）：ヒトＧＰＣ－１に特異的なヤギポリクローナル抗体であり、ＬｉｆｅＳｐａｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社から市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｓｂｉｏ．ｃｏｍ／ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ／抗ｇｐｃ１－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｇｌｙｐｉｃａｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａａ２４－５３０－ｉｃｃ－ｗｂ－ｗｅｓｔｅｒｎ－ｆｌｏｗ－ｌｓ－ｃ３３０７６０／３４１１０４を参照されたい）。
【0174】
いくつかの実施形態では、結合実体は、ＭＩＬ３８抗体（ＣＢＡ２０１４００２６）を含み、ＴＱＮＡＲＡ（配列番号８）、ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ（配列番号９）、ＰＲＥＲＰＰ（配列番号１０）、ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ（配列番号１１）、ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ（配列番号１３）およびＴＱＮＡＲＡＦＲＤ（配列番号７）のうちのいずれか１つまたは複数のものから選択されるアミノ酸配列を含むエピトープと結合することが可能な抗グリピカン１（ＧＰＣ－１）抗体を含まない抗体集団である。
【0175】
当業者には、広く記載される本発明の趣旨も範囲も逸脱することなく、具体的な実施形態の形で開示される本発明に多数の変形および／または修正を施し得ることが理解されよう。したがって、本発明の諸実施形態は、あらゆる点で例示的なものであって、限定的なものではないと見なされるべきである。
【実施例】
【0176】
これより、具体的な実施例を参照しながら本発明を説明するが、これらは決して限定的なものとして解釈されるべきではない。
【0177】
実施例１：マウス抗ヒトグリピカン１（ＭＩＬ３８－ＡＭ４）が結合するグリピカン－１エピトープの同定および特徴付け
１．１．材料および方法
様々な立体配座拘束を有する参照配列をカバーした実験的セットを作製し、ペプチドアレイで抗体をプローブした。
１．１．材料および方法
様々な立体配座拘束を有する参照配列をカバーした実験的セットを作製し、ペプチドアレイで抗体をプローブした。
【0178】
－抗体
下の表６に記載する通りにマウス抗ヒトグリピカン１モノクローナル抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４を準備した。
下の表６に記載する通りにマウス抗ヒトグリピカン１モノクローナル抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４を準備した。
【0179】
【表6】
【0180】
－ペプチド
構造化ペプチドのライブラリーを作製する土台として以下のヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列を用いた。
構造化ペプチドのライブラリーを作製する土台として以下のヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列を用いた。
【表7】
【0181】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）として存在する鎖Ｂのレンダリング画像を図１Ａに示す。
【0182】
－ペプチドを足場に化学結合させる（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）技術
用いたＣＬＩＰＳ技術の一般的原理を以下に説明する。
用いたＣＬＩＰＳ技術の一般的原理を以下に説明する。
【0183】
ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドの構造を定められた三次元構造に固定化するものである。これにより、最も複雑な結合部位の機能でさえ模倣することができる。ＣＬＩＰＳ技術は現在、ペプチドライブラリーを単一、二重または三重のループ構造ならびにシート様およびヘリックス様のフォールドにするのに日常的に用いられている。
【0184】
ＣＬＩＰＳ足場のブロモ基とシステインのチオール側鎖との間でＣＬＩＰＳ反応が起こる。この反応は、穏やかな条件下では速度が速く特異的なものである。この化学反応を用いて、天然のタンパク質配列を単一のＴ２ループ、Ｔ３二重ループ、Ｔ２ループとＴ３ループのコンジュゲート、安定化したベータシートおよび安定化したアルファヘリックスを
含めた様々な構造を有するＣＬＩＰＳ構築物に変換する（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００７；２０：２８３－２９）。
含めた様々な構造を有するＣＬＩＰＳ構築物に変換する（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００７；２０：２８３－２９）。
【0185】
ＣＬＩＰＳライブラリースクリーニングは、コンビナトリアルな基質設計を用いて標的タンパク質を最大１０，０００の重複ペプチド構築物からなるライブラリーに変換することから始まる。固体担体上で直鎖状ペプチドの基質が合成され、次いで、これが空間的に定められるＣＬＩＰＳ構築物の形になる。不連続エピトープの両方の部分が正しい立体配座になっている構築物は高い親和性で抗体と結合して、検出および定量化される。エピトープが不完全な構築物はこれより低い親和性で抗体と結合するのに対し、エピトープが含まれていない構築物は全く結合しない。親和性に関する情報を反復スクリーニングに用いて、エピトープの配列および立体配座の詳細を明らかにする。
【0186】
不連続な立体構造エピトープが含まれている標的タンパク質を基質ライブラリーに変換する。特許製品のｍｉｎｉｃａｒｄ上でコンビナトリアルペプチドを合成し、空間的に定義されたＣＬＩＰＳ構築物に化学的に変換する。抗体の結合を定量化する。
【0187】
－ペプチド合成
標的分子の不連続エピトープを再構築するため、構造化ペプチドのライブラリーを合成した。この合成はペプチドを足場に化学結合させる（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて実施した。ＣＬＩＰＳ技術によって、単一のループ、二重ループ、三重ループ、シート様フォールド、ヘリックス様フォールドおよびその組合せの構造化ペプチドを作製することができた。ＣＬＩＰＳ鋳型をシステイン残基と結合させた。ペプチド内の複数のシステインの側鎖を１つまたは２つのＣＬＩＰＳ鋳型と結合させた。例えば、Ｔ２のＣＬＩＰＳ鋳型１，３－ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶かした。この溶液をペプチドアレイ上に加えた。ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイ（４５５３μｌウェルを備えたウェルプレート）の固相結合ペプチドに存在する２つのシステインの側鎖と結合した。ペプチドアレイを溶液で完全に覆って、溶液中で３０～６０分間、穏やかに振盪した。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１パーセントのＳＤＳ／０．１パーセントのベータ－メルカプトエタノールを含有する破壊緩衝液中、７０℃で３０分間超音波処理した後、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理した。システインが３つであること以外は同じ方法で、ペプチドを担持するＴ３のＣＬＩＰＳを作製した。
標的分子の不連続エピトープを再構築するため、構造化ペプチドのライブラリーを合成した。この合成はペプチドを足場に化学結合させる（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて実施した。ＣＬＩＰＳ技術によって、単一のループ、二重ループ、三重ループ、シート様フォールド、ヘリックス様フォールドおよびその組合せの構造化ペプチドを作製することができた。ＣＬＩＰＳ鋳型をシステイン残基と結合させた。ペプチド内の複数のシステインの側鎖を１つまたは２つのＣＬＩＰＳ鋳型と結合させた。例えば、Ｔ２のＣＬＩＰＳ鋳型１，３－ビス（ブロモメチル）ベンゼンの０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．９）／アセトニトリル（１：１（ｖ／ｖ））に溶かした。この溶液をペプチドアレイ上に加えた。ＣＬＩＰＳ鋳型は、ペプチドアレイ（４５５３μｌウェルを備えたウェルプレート）の固相結合ペプチドに存在する２つのシステインの側鎖と結合した。ペプチドアレイを溶液で完全に覆って、溶液中で３０～６０分間、穏やかに振盪した。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ２Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中１パーセントのＳＤＳ／０．１パーセントのベータ－メルカプトエタノールを含有する破壊緩衝液中、７０℃で３０分間超音波処理した後、Ｈ２Ｏ中でさらに４５分間超音波処理した。システインが３つであること以外は同じ方法で、ペプチドを担持するＴ３のＣＬＩＰＳを作製した。
【0188】
以下の設計に従って直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを化学合成した：
【表8】
【表8-1】
【0189】
－ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体と各合成ペプチドとの結合をＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液とインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを１／１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ社、カタログ番号２０１０－０５）と２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンゾチアゾリンスルホナート（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３パーセントＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムで発色を定量化した。
抗体と各合成ペプチドとの結合をＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液とインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを１／１０００希釈の抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ社、カタログ番号２０１０－０５）と２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンゾチアゾリンスルホナート（ＡＢＴＳ）および２μｌ／ｍｌの３パーセントＨ２Ｏ２を加えた。１時間後、発色を測定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよび画像処理システムで発色を定量化した。
【0190】
－データ処理
ＣＣＤカメラで得られた値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーとほぼ同じ０～３０００ｍＡＵの範囲であった。この結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保管した。時折、気泡が含まれ偽陽性の値を示すウェルがみられた。カードを手作業で調べ、気泡による値はいずれもスコアを０とした。
ＣＣＤカメラで得られた値は、標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダーとほぼ同じ０～３０００ｍＡＵの範囲であった。この結果を定量化し、Ｐｅｐｌａｂデータベースに保管した。時折、気泡が含まれ偽陽性の値を示すウェルがみられた。カードを手作業で調べ、気泡による値はいずれもスコアを０とした。
【0191】
－合成の品質管理
合成ペプチドの品質を確認するため、陽性対照ペプチドと陰性対照ペプチドの組を別個に並行して合成した。これを抗体５７．９でスクリーニングした（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，６４：３３０４－３３０９を参照されたい）。
合成ペプチドの品質を確認するため、陽性対照ペプチドと陰性対照ペプチドの組を別個に並行して合成した。これを抗体５７．９でスクリーニングした（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０，６４：３３０４－３３０９を参照されたい）。
【0192】
－スクリーニングの詳細
表７に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。
表７に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。
【0193】
【表9】
【0194】
１．２．結果
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図２にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られた。このデータからエピトープを同定することができた。
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図２にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られた。このデータからエピトープを同定することができた。
【0195】
アレイを通常のストリンジェンシー条件下、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌの希釈のＭＩＬ３８－ＡＭ４とインキュベートした。濃度依存性の反応が観察された（図３Ａおよび３Ｂ）。１０μｇ／ｍｌでは飽和は観察されず、いずれのペプチドも完全なエピトープではないことがわかった。一次構造内で隣接していない２つの反応のクラスターを同定した。２つの共通の核は１３５ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ１４３（配列番号７）および３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）であり、後者の区間の方が前者のものよりも明らかに優勢であることがわかった。
【0196】
区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）から得られた三次元（３Ｄ）モデル（図４）でも公開されている別のｐｄｂ座標ファイル（４ＡＣＲ、４ＢＷＥ）でも解像されず、この区間が可動性のものであると考えられた。３Ｄモデルで解像されるＶ３４８およびＧ３６２の位置から明らかなように、区間１３５ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ１４３（配列番号７）はこの欠けているループに隣接している。
【0197】
このアレイで観察されるＭＩＬ３８－ＡＭ４とペプチドとの結合と同じように、抗体が求める条件を部分的に満たす不完全な模倣体と結合するのはよくみられることである。本発明者らは、可動性ループ３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）が寄与する主要部分と、ヘリックス１３５ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ１４３（配列番号７）（の残基）が寄与する副次的部分とからなる不連続エピトープなるものを仮定する。
【0198】
１．３．まとめおよび考察
この試験は、マウス抗ヒトグリピカン１（ＭＩＬ３８－ＡＭ４）のエピトープをマッピングすることを目的としたものである。様々な立体配座拘束を有する参照配列をカバーした実験的セットを作製し、ペプチドアレイで抗体をプローブした。有意な結合から、可動性ループ３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）が寄与する主要部分と、ヘリックス１３５ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ１４３（配列番号７）（の残基）が寄与する副次的部分とからなる不連続エピトープの存在がうかがえた。
この試験は、マウス抗ヒトグリピカン１（ＭＩＬ３８－ＡＭ４）のエピトープをマッピングすることを目的としたものである。様々な立体配座拘束を有する参照配列をカバーした実験的セットを作製し、ペプチドアレイで抗体をプローブした。有意な結合から、可動性ループ３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）が寄与する主要部分と、ヘリックス１３５ＴＱＮＡＲＡＦＲＤ１４３（配列番号７）（の残基）が寄与する副次的部分とからなる不連続エピトープの存在がうかがえた。
【0199】
実施例２：その他の抗グリピカン－１抗体が結合した別のグリピカン－１エピトープの同定および特徴付け
２．１．材料および方法
下の表８に、この試験に使用した抗体に関する情報を記載する。記載する抗体のうち最初の３つは市販のものである。
２．１．材料および方法
下の表８に、この試験に使用した抗体に関する情報を記載する。記載する抗体のうち最初の３つは市販のものである。
【0200】
【表10】
【0201】
－ペプチド
配列番号１４によって定められるヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列を土台に用いて構造化ペプチドのライブラリーを作製した。
配列番号１４によって定められるヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列を土台に用いて構造化ペプチドのライブラリーを作製した。
【0202】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ識別番号（ＰＢＤ ＩＤ）４ＡＤ７（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｄｂｓｕｍ／４ＡＤ７）として存在する鎖Ｂのレンダリング画像を図１Ａに示す。
【0203】
－ペプチドを足場に化学結合させる（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）技術
この実験に用いたＣＬＩＰＳ技術の一般的原理については上の実施例１に記載されている。
この実験に用いたＣＬＩＰＳ技術の一般的原理については上の実施例１に記載されている。
【0204】
－ペプチド合成
実施例１で言及した方法を用いてペプチド合成を実施した。実施例１に示した設計（セット１～５）に従って化学合成直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを合成した。
実施例１で言及した方法を用いてペプチド合成を実施した。実施例１に示した設計（セット１～５）に従って化学合成直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを合成した。
【0205】
－ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体と各合成ペプチドとの結合を、実施例１に記載した通りにＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。
抗体と各合成ペプチドとの結合を、実施例１に記載した通りにＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。
【0206】
－データ処理および合成の品質管理
データ処理および合成の品質管理を実施例１の通りに実施した。
データ処理および合成の品質管理を実施例１の通りに実施した。
【0207】
－スクリーニングの詳細
表９に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。このほか、結合のストリンジェンシーを低下させるのにＰ／Ｔｗ（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）を用いた。
表９に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。このほか、結合のストリンジェンシーを低下させるのにＰ／Ｔｗ（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）を用いた。
【0208】
【表11】
【0209】
２．２結果
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図５にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られる。このデータから、モノクローナル血清およびポリクローナル血清のエピトープは同定することができたが、ＭＩＬ３８－ＡＭ３のものは同定することができなかった。
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図５にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られる。このデータから、モノクローナル血清およびポリクローナル血清のエピトープは同定することができたが、ＭＩＬ３８－ＡＭ３のものは同定することができなかった。
【0210】
－ＭＩＬ３８－ＡＭ３
高濃度（１０μｇ／ｍｌ）かつ低ストリンジェンシー（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で試験しても、ＭＩＬ３８－ＡＭ３を検出することはできなかった。同試料には異なる二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＮＸＡ９３１）も試みたが、同じく結果は得られなかった。
高濃度（１０μｇ／ｍｌ）かつ低ストリンジェンシー（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ）で試験しても、ＭＩＬ３８－ＡＭ３を検出することはできなかった。同試料には異なる二次抗体（ヒツジ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＮＸＡ９３１）も試みたが、同じく結果は得られなかった。
【0211】
確認のため、ＭＩＬ３８－ＡＭ３をプレート上にコートする直接ＥＬＩＳＡを試みた。ウサギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いても抗体を検出することはできなかった。
【0212】
－ウサギ抗グリピカン１／ＧＰＣ１抗体ａｂ１３７６０４
図６の対応するパネルからわかるように、ウサギ抗ＧＰＣ１では主要なシグナルが３つ見られる。これらのシグナルは、区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）、３６６ＰＲＥＲＰＰ３７１（配列番号１０）および４７８ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ４８７（配列番号１１）に対応する。
図６の対応するパネルからわかるように、ウサギ抗ＧＰＣ１では主要なシグナルが３つ見られる。これらのシグナルは、区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）、３６６ＰＲＥＲＰＰ３７１（配列番号１０）および４７８ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ４８７（配列番号１１）に対応する。
【0213】
－マウスｍＡｂ２６００（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）
マウス抗体２６００は、共通の核２４２ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ２５２（配列番号１３）を有する全ペプチドの１つの明確なピークを認識する。このことは、図６の対応するパネルからわかる。
マウス抗体２６００は、共通の核２４２ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ２５２（配列番号１３）を有する全ペプチドの１つの明確なピークを認識する。このことは、図６の対応するパネルからわかる。
【0214】
－ヤギ抗ＧＰＣ－１（ＧＰＣ１）
図６の対応するパネルからわかるように、ヤギ抗ＧＰＣ－１では主要なシグナルが２つ見られる。これらのシグナルは、区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）および４０８ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ４１４（配列番号９）に対応する。
図６の対応するパネルからわかるように、ヤギ抗ＧＰＣ－１では主要なシグナルが２つ見られる。これらのシグナルは、区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）および４０８ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ４１４（配列番号９）に対応する。
【0215】
２．３まとめおよび考察
この試験は、同じアレイで市販の抗グリピカン１抗体３種類および追加のｍＡｂ（ＭＩＬ３８－ＡＭ３）の特性を明らかにすることを目的としたものである。実施例１に記載した通りに既存のペプチドアレイで抗体をプローブした。市販の抗ＧＰＣ－１抗体はいずれも、上記のアレイを用いてマッピングすることができた。抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ３は、エピトープの不連続な性状または試料の劣化により、いずれのアレイでもシグナルを生じなかったことから、マッピングが無効であることがわかった。
この試験は、同じアレイで市販の抗グリピカン１抗体３種類および追加のｍＡｂ（ＭＩＬ３８－ＡＭ３）の特性を明らかにすることを目的としたものである。実施例１に記載した通りに既存のペプチドアレイで抗体をプローブした。市販の抗ＧＰＣ－１抗体はいずれも、上記のアレイを用いてマッピングすることができた。抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ３は、エピトープの不連続な性状または試料の劣化により、いずれのアレイでもシグナルを生じなかったことから、マッピングが無効であることがわかった。
【0216】
ウサギ抗ＧＰＣ－１は、グリピカン１の少なくとも３つの区間、すなわち３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）、３６６ＰＲＥＲＰＰ３７１（配列番号１０）および４７８ＱＤＡＳＤＤＧＳＧＳ４８７（配列番号１１）を認識する。そのうち２つの区間は、図７Ａに図示されるように、座標ファイル４ＡＤ７．ｐｂｄで解像される。これはポリクローナル抗体の調製物であるため、このエピトープが直鎖状であるのか、複雑なエピトープの一部であるのかを評価することはできない。
【0217】
マウス抗グリピカンｍａｂ２６００は、アレイの全ペプチドセットの区間２４２ＬＧＰＥＣＳＲＡＶＭＫ２５２（配列番号１３）を認識する。座標ファイル４ＡＤ７．ｐｄｂでのエピトープの位置を図７Ｂに示す。
【0218】
ヤギ抗グリピカン１は、グリピカン１の少なくとも２つの区間、すなわち３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）および４０８ＡＬＳＴＡＳＤＤＲ４１４（配列番号９）を認識する。これはポリクローナル抗体の調製物であるため、このエピトープが直鎖状であるのか、複雑なエピトープの一部であるのかを評価することはできない。いずれの区間も、入手可能な座標ファイルでは解像されない。
【0219】
ウサギおよびヤギのポリクローナル調製物はともにグリピカン１の区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）を認識し、この区間はＭａｂ ＭＩＬ３８－ＡＭ４の（不連続であると思われる）結合部位の一部を形成するものでもある。両ポリクローナル調製物はグリピカン１のほかのエピトープも認識するが、これらのエピトープが１つの
不連続エピトープを形成するのか、試料のポリクローナル性が現れたものであるのかを評価することはできない。いずれのｐＡｂも、ＭＩＬ３８－ＡＭ４結合に寄与すると考えられる区間１３５ＴＱＮＡＲＡ１４０は認識しない。
不連続エピトープを形成するのか、試料のポリクローナル性が現れたものであるのかを評価することはできない。いずれのｐＡｂも、ＭＩＬ３８－ＡＭ４結合に寄与すると考えられる区間１３５ＴＱＮＡＲＡ１４０は認識しない。
【0220】
マウスＭａｂ２６００は、これまでに試験した他の抗ＧＰＣ－１抗体のいずれも共通しないエピトープを認識する。
【0221】
実施例３：その他の抗グリピカン－１抗体が結合した別のグリピカン－１エピトープの同定および特徴付け
３．１．材料および方法
下の表１０に、この試験に使用した抗体に関する情報を記載する。上の実施例１および／または実施例２に記載した前の実験にそれぞれ使用した３種類の抗グリピカン１抗体を用いた。
３．１．材料および方法
下の表１０に、この試験に使用した抗体に関する情報を記載する。上の実施例１および／または実施例２に記載した前の実験にそれぞれ使用した３種類の抗グリピカン１抗体を用いた。
【0222】
【表12】
【0223】
－ペプチド
この試験で土台としたヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列は配列番号１４で定められるものである。以下の残基の配列を用いた：
ＧＰＣ１＿残基番号３４４－３６６ ＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＫＬＡＰ（配列番号１５）
ＧＰＣ１＿残基番号１３１－１４９ ＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＹＳＥＬＲ（配列番号１６）
この試験で土台としたヒトグリピカン－１（ＧＰＣ－１）配列は配列番号１４で定められるものである。以下の残基の配列を用いた：
ＧＰＣ１＿残基番号３４４－３６６ ＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＫＬＡＰ（配列番号１５）
ＧＰＣ１＿残基番号１３１－１４９ ＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＹＳＥＬＲ（配列番号１６）
【0224】
－ペプチド合成
実施例１で言及した方法を用いてペプチド合成を実施した。以下に示す設計に従って化学合成直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを合成した：
実施例１で言及した方法を用いてペプチド合成を実施した。以下に示す設計に従って化学合成直鎖状ペプチドおよびＣＬＩＰＳペプチドを合成した：
【0225】
【表13】
【0226】
－ＥＬＩＳＡスクリーニング
抗体と各合成ペプチドとの結合を、実施例１に記載した通りにＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。
抗体と各合成ペプチドとの結合を、実施例１に記載した通りにＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡで試験した。
【0227】
－データ処理および合成の品質管理
データ処理および合成の品質管理を実施例１の通りに実施した。
データ処理および合成の品質管理を実施例１の通りに実施した。
【0228】
－ヒートマップ解析
用いたヒートマップ方法論に関する簡潔な概要を以下に記載する。
用いたヒートマップ方法論に関する簡潔な概要を以下に記載する。
【0229】
ヒートマップとは、二次元マップ内で変数がとる数値を色で表したデータのグラフ表示の１つである。二次元ループＣＬＩＰＳペプチドでは、第一のループおよび第二のループの独立した配列から、そのような二次元マップを導くことができる。例えば、所与の一連の１６個のＣＬＩＰＳペプチドの配列は、ループ１内の４つの固有のサブ配列とループ２内の４つの固有のサブ配列を効率的に並べ替えたものである。したがって、ＥＬＩＳＡで
観察されたデータを４×４のマトリックスにプロットすることができ、この場合、Ｘ座標はそれぞれ第一のループの配列に対応し、Ｙ座標はそれぞれ第二のループの配列に対応する。
観察されたデータを４×４のマトリックスにプロットすることができ、この場合、Ｘ座標はそれぞれ第一のループの配列に対応し、Ｙ座標はそれぞれ第二のループの配列に対応する。
【0230】
さらに可視化しやすくするため、ＥＬＩＳＡの数値を連続的な陰影勾配に置き換えることができる。この場合、極めて低い数値は明るい色で表され、極めて高い値は濃い色で表され、平均値は黒色で表される。この勾配マップをデータマトリックスに適用すると、陰影の付いたヒートマップが得られる。
【0231】
－スクリーニングの詳細
表１１に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。
表１１に抗体結合条件をまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液および前準備（ＳＱ）については、数値は競合タンパク質（ウマ血清とオボアルブミンの組合せ）の相対量を表す。
【0232】
【表14】
【0233】
３．２．結果
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図８にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られる。
－主な実験結果およびシグナル／ノイズ比の決定
スクリーニングによって得られた未処理のＥＬＩＳＡの結果のデータセット全体の概要を図８にグラフで示す。この図では、箱ひげ図が各データセットを示し、各データセット内での平均ＥＬＩＳＡシグナル、分布および外れ値を表す。実験条件（抗体量、ブロッキング強度など）に応じて様々なＥＬＩＳＡデータの分布が得られる。
【0234】
－ウサギポリクローナルＡｂ１３７６０４
実施例２では、ウサギポリクローナルＡｂ１３７６０４由来の一部のＩｇＧと結合するのに区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）があれば十分であることがわかった。この試験では、３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ３５７（配列番号３）が含まれる構築物のいずれも同じように、この試料由来の１／２５００希釈のＩｇＧと結合した。セット１のマトリックスでは、特定の構築物にシグナルの増強は見られない。
実施例２では、ウサギポリクローナルＡｂ１３７６０４由来の一部のＩｇＧと結合するのに区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）があれば十分であることがわかった。この試験では、３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ３５７（配列番号３）が含まれる構築物のいずれも同じように、この試料由来の１／２５００希釈のＩｇＧと結合した。セット１のマトリックスでは、特定の構築物にシグナルの増強は見られない。
【0235】
図９の置換解析から、残基Ｐ３５３、Ｇ３５４およびＥ３５６が不可欠であることがわかる。Ｑ３５１、Ｇ３５２およびＥ３５７の位置で可能な置換は限られている。
【0236】
－ヤギポリクローナル抗ＧＰＣ－１
実施例２ではほかにも、ヤギポリクローナル抗ＧＰＣ－１由来の一部のＩｇＧと結合するのに区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）があれば十分であった。この抗体は、ウサギポリクローナル抗体と同じループを認識するが、認識するときの微細な特異性がわずかに異なる。図１０の文字プロットでは、最も重要な残基がＧ３５２、Ｇ
３５４およびＥ３５６であるとともに、Ｎ３４９、Ｑ３５１およびＰ３５３の位置で可能な置換は限られていることがわかる。セット１のマトリックスではシグナルの増強が見られる。この抗体の主要なマッピングに残基１４０～１４９付近の区間は示されなかったが、この区間を含む別の構築物は、このポリクローンの一部のＩｇＧを結合させるのに優れたベイトとなる。
実施例２ではほかにも、ヤギポリクローナル抗ＧＰＣ－１由来の一部のＩｇＧと結合するのに区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）があれば十分であった。この抗体は、ウサギポリクローナル抗体と同じループを認識するが、認識するときの微細な特異性がわずかに異なる。図１０の文字プロットでは、最も重要な残基がＧ３５２、Ｇ
３５４およびＥ３５６であるとともに、Ｎ３４９、Ｑ３５１およびＰ３５３の位置で可能な置換は限られていることがわかる。セット１のマトリックスではシグナルの増強が見られる。この抗体の主要なマッピングに残基１４０～１４９付近の区間は示されなかったが、この区間を含む別の構築物は、このポリクローンの一部のＩｇＧを結合させるのに優れたベイトとなる。
【0237】
－抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４
実施例１および２では、ＭＩＬ３８－ＡＭ４がグリピカンの区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）のほか区間１３５ＴＱＮＡＲＡ１４０（配列番号８）とも結合することが確認され、このことは不連続エピトープの存在を示すものと考えられた。
実施例１および２では、ＭＩＬ３８－ＡＭ４がグリピカンの区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫ３５８（配列番号２）のほか区間１３５ＴＱＮＡＲＡ１４０（配列番号８）とも結合することが確認され、このことは不連続エピトープの存在を示すものと考えられた。
【0238】
この主要な区間を含むループ状の構築物により、結合に最も重要な残基が正確に特定される。図１０から、残基Ｖ３４８、Ｑ３５１、Ｇ３５２およびＰ３５３は置換が許容されず、Ｋ３４７、Ｎ３４９およびＰ３５０は必要度が相当高く、Ｇ３５４、Ｐ３５５およびＥ３５６はその程度が低いことがわかる。
【0239】
セット１の主要なループマトリックスに１３５～１４３の範囲の残基を付加することによる、ＭＩＬ３８－ＡＭ４による模倣物の認識の最適化。
【0240】
これらのシリーズでも同じく、Ｖ３４８およびその付近の残基が必要であること明らかになった。マトリックスセットにはほかにも結合がみられ、最終的にＴ３拘束ＣＧＥＬＹＴＱＮＡＲＡＦＲＤＬＣＧＮＰＫＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥＫＲＲＲＧＣ（配列番号１２）に最適なシグナルとなった（図１２）。
【0241】
－類似性および非類似性
図１３の散布図からわかるように、抗体には、類似した構築物に結合するものとそうでないものとがある。しかし、多くの構築物は、もっぱら調製物のうちの１つに認識される（軸に沿った点または右下端および左上端）。
図１３の散布図からわかるように、抗体には、類似した構築物に結合するものとそうでないものとがある。しかし、多くの構築物は、もっぱら調製物のうちの１つに認識される（軸に沿った点または右下端および左上端）。
【0242】
－結論
実施例１および２を補足する形で、抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４の立体構造エピトープの特性を明らかにした。ポリクローナル抗体であるＡＢ１３７６０４（ウサギ）および抗ＧＰＣ－１ ２４－５３０（ヤギ）が類似したエピトープを認識することがわかった。この２つを同じアレイで比較対照した。
実施例１および２を補足する形で、抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４の立体構造エピトープの特性を明らかにした。ポリクローナル抗体であるＡＢ１３７６０４（ウサギ）および抗ＧＰＣ－１ ２４－５３０（ヤギ）が類似したエピトープを認識することがわかった。この２つを同じアレイで比較対照した。
【0243】
実施例１で得られＭＩＬ３８－ＡＭ４に対する不連続エピトープを示す２つのリードを用いて、ループの長さが異なるマトリックスアレイを作製した。さらに、個々のリード配列について全置換解析を実施した。いずれのアレイも上記の３種類の抗体でプローブした。
【0244】
グリピカン１の認識に関しては、この試験で検討した抗体はいずれも、残基３４７～３５８の可動性ループのみからなるか、主としてこのループからなるエピトープと結合する。しかし、微細な特異性は異なっており、このことがその機能的特性に影響を及ぼし、ひいてはｉｎ ｖｉｖｏの選択性または識別試験での適用性にも影響を及ぼし得る。
【0245】
ウサギポリクローナルＡｂ１３７６０４（にみられる一部のＩｇＧ種）のエピトープは直鎖状の区間３４８ＶＮＰＱＧＰＧＰＥＥ３５７（配列番号３）である。立体構造エピトープを認識する抗体の存在を示すものはない。
【0246】
ヤギポリクローナル抗ＧＰＣ－１（にみられる一部のＩｇＧ種）も同じ可動性ループを
認識する。構造化模倣物に対してある程度の選好性はあるが、大きなものではない。この調製物中の抗体がすべて同じようにして可動性ループを認識するわけではないとも考えられる。モノクローナル抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４は主としてグリピカン１の残基３４７～３５５のループと結合するが、そのペプチドに１３５～１４３の範囲の残基を付加することがこの抗体に有効であるのは明らかである。作製した模倣物は未だ最適なものであるとはいえず、このことは、ウサギＡｂ１３７６０４で記録されるものと同程度のシグナル強度を得るのに１０００倍の濃度の抗体が必要であるという事実に反映されており、さらには、結合基質に必要なことがほかにもあることを示している。
認識する。構造化模倣物に対してある程度の選好性はあるが、大きなものではない。この調製物中の抗体がすべて同じようにして可動性ループを認識するわけではないとも考えられる。モノクローナル抗体ＭＩＬ３８－ＡＭ４は主としてグリピカン１の残基３４７～３５５のループと結合するが、そのペプチドに１３５～１４３の範囲の残基を付加することがこの抗体に有効であるのは明らかである。作製した模倣物は未だ最適なものであるとはいえず、このことは、ウサギＡｂ１３７６０４で記録されるものと同程度のシグナル強度を得るのに１０００倍の濃度の抗体が必要であるという事実に反映されており、さらには、結合基質に必要なことがほかにもあることを示している。
【0247】
このことは、定量的方法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）によって明らかにすることができる標的タンパク質に対する親和性に影響を及ぼすことはない。実際、鋭敏な選択性が、副作用を引き起こさずにｉｎ ｖｉｖｏで使用可能な抗体の品質を保証するわけではない。
【0248】
【表15】
【0249】
上に記載した結果に基づき、解析したエピトープ配列で許容される置換のまとめを下の表１３に示す。
【0250】
【表16】
【0251】
実施例４．ＭＩＬ３８抗体と抗グリピカン－１（抗ＧＰＣ－１）抗体には二次元ウエスタンブロットでの反応性に重複が見られる。
ウサギ抗ＧＰＣ－１抗体ａｂ１３７６０４は、分子量約６０ｋＤａ（ＭＩＬ３８によって検出された分子量と同じ）でグリピカン－１のコアタンパク質との反応性を示した。ＭＩＬ３８がグリピカン－１を認識することを裏付けるため、前立腺癌ＤＵ－１４５のＭＰＥＫ抽出物を２次元電気泳動およびウエスタンブロット法に供した。
ウサギ抗ＧＰＣ－１抗体ａｂ１３７６０４は、分子量約６０ｋＤａ（ＭＩＬ３８によって検出された分子量と同じ）でグリピカン－１のコアタンパク質との反応性を示した。ＭＩＬ３８がグリピカン－１を認識することを裏付けるため、前立腺癌ＤＵ－１４５のＭＰＥＫ抽出物を２次元電気泳動およびウエスタンブロット法に供した。
【0252】
ＤＵ－１４５前立腺癌細胞の膜タンパク質抽出物（ＭＰＥＫ）を二次元ゲル（ｐＩ勾配が水平方向、分子質量が垂直方向）上で分離した。ＭＩＬ３８抗体および市販のｒＧＰＣ－１ウサギポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットには、６０Ｋｄのタンパク質を示す反応性の重複が見られる（図１４の丸で囲った部分）。レーンＤ（図１４）は、対照であるＤＵ－１４５抽出物の一次元分離である。レーンＭ（図１４）は、対照である分子サイズマーカーの一次元分離レーンである。
【0253】
図１４からわかるように、ＭＩＬ３８抗体と抗ＧＰＣ－１抗体は、分子量が６０ｋＤａで等電点の範囲が５～７のタンパク質を検出する反応性に重複が見られた。
【0254】
実施例５．抗ＧＰＣ－１の免疫沈降物にＭＩＬ３８が検出され、その逆も同様である。
ＭＩＬ３８抗体またはウサギ抗ＧＰＣ－１抗体を用いて、ＤＵ－１４５またはＣ３（ＭＩＬ３８陰性）のＭＰＥＫ抽出物由来のそれぞれの抗原を免疫沈降させた。免疫沈降物（ＩＰ）をＭＩＬ３８抗体または抗ＧＰＣ－１抗体とウエスタンブロットに供した（図１５）。
ＭＩＬ３８抗体またはウサギ抗ＧＰＣ－１抗体を用いて、ＤＵ－１４５またはＣ３（ＭＩＬ３８陰性）のＭＰＥＫ抽出物由来のそれぞれの抗原を免疫沈降させた。免疫沈降物（ＩＰ）をＭＩＬ３８抗体または抗ＧＰＣ－１抗体とウエスタンブロットに供した（図１５）。
【0255】
抗ＧＰＣ－１とブロットしたＭＩＬ３８のＩＰに６０ｋＤａのＧＰＣ－１反応性のバンドが検出され、ＭＩＬ３８とブロットした抗ＧＰＣ－１のＩＰに６０ｋＤａのＭＩＬ３８反応性のバンドが検出された。二次抗体のみの対照では反応性が検出されなかった。さらに、ＭＩＬ３８抗体との免疫沈降によってＭＩＬ３８抗原および抗ＧＰＣ－１抗原ともにほぼ完全に枯渇し、ＭＩＬ３８抗原がグリピカン－１であることが強く示唆された。
【0256】
ＭＩＬ３８抗体およびウサギ抗ＧＰＣ－１抗体を用いて、ＤＵ－１４５前立腺癌またはＣ３（ＭＩＬ３８陰性）の細胞膜タンパク質抽出物由来のそれぞれの抗原を免疫沈降させた。ＭＩＬ３８抗体または抗ＧＰＣ－１抗体で検出された免疫沈降のウエスタンブロットを示す。図１５Ａは、ＭＩＬ３８免疫沈降物（左）のＧＰＣ１検出およびＧＰＣ１免疫沈降物（右）のＭＩＬ３８検出を示している。図１５Ｂは、対照であるＭＩＬ３８免疫沈降物のＭＩＬ３８検出を示している。各レーンは、対照のＭａｇｉｃ Ｍａｒｋ－市販のタンパク質マーカー；ＤＵ１４５ ＭＰＥＫ－前立腺癌膜タンパク質抽出物（免疫沈降しなかった）；ＤＵ１４５ ＦＴ－免疫沈降で得られた前立腺癌のフロースルー；ＤＵ１４５
ＩＰ－抗体を用いた免疫沈降物；Ｃ３ ＭＰＥＫ－（ＭＩＬ３８陰性）対照膜タンパク質抽出物（免疫沈降しなかった）；Ｃ３ ＦＴ－免疫沈降で得られたフロースルー；Ｃ３
ＩＰ溶出物－抗体を用いた（ＭＩＬ３８陰性）免疫沈降物である。ＭＩＬ３８は、ｒＧＰＣ１抗体による免疫沈降物を検出することができ、その逆も同様である。ＭＩＬ３８はほかにも、ＤＵ１４５ ＭＰＥＫを含めた全対照およびＭＩＬ３８によって得られたＩＰと結合することができる。
ＩＰ－抗体を用いた免疫沈降物；Ｃ３ ＭＰＥＫ－（ＭＩＬ３８陰性）対照膜タンパク質抽出物（免疫沈降しなかった）；Ｃ３ ＦＴ－免疫沈降で得られたフロースルー；Ｃ３
ＩＰ溶出物－抗体を用いた（ＭＩＬ３８陰性）免疫沈降物である。ＭＩＬ３８は、ｒＧＰＣ１抗体による免疫沈降物を検出することができ、その逆も同様である。ＭＩＬ３８はほかにも、ＤＵ１４５ ＭＰＥＫを含めた全対照およびＭＩＬ３８によって得られたＩＰと結合することができる。
【0257】
実施例６．前立腺癌患者の前立腺癌血漿試料および膜抽出物に含まれるＭＩＬ３８によってＧＰＣ－１を検出することができる。
正常患者１例（０４２）および前立腺癌患者１例（０４６）の血漿試料をＭＩＬ３８抗体と免疫沈降させ、ＩＰ試料をＭＩＬ３８抗体および抗ＧＰＣ－１抗体とウエスタンブロットに供した（図１６Ａ）。
正常患者１例（０４２）および前立腺癌患者１例（０４６）の血漿試料をＭＩＬ３８抗体と免疫沈降させ、ＩＰ試料をＭＩＬ３８抗体および抗ＧＰＣ－１抗体とウエスタンブロットに供した（図１６Ａ）。
【0258】
両抗体とも、両血漿試料の約７０ｋＤａの特異的バンドを検出した。ＭＩＬ３８抗体、抗ＧＰＣ－１抗体ともに、正常患者の血漿よりも前立腺癌患者の血漿の方がシグナルが著明に高く（バンドが濃く）、前立腺癌患者ではこの可溶型のグリピカン－１が増大する可能性が示唆された。
【0259】
正常な前立腺および前立腺癌の膜タンパク質抽出物にＭＩＬ３８抗原を検出することが
できるかどうかを明らかにするため、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ社から試料をそれぞれ１例入手した。ＭＩＬ３８抗体を用いて等量のタンパク質にウエスタンブロットを実施した（図１６Ｂ）。正常な前立腺の試料よりも前立腺癌抽出物の方がＭＩＬ３８抗原の発現がはるかに高いことがわかった。
できるかどうかを明らかにするため、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏ社から試料をそれぞれ１例入手した。ＭＩＬ３８抗体を用いて等量のタンパク質にウエスタンブロットを実施した（図１６Ｂ）。正常な前立腺の試料よりも前立腺癌抽出物の方がＭＩＬ３８抗原の発現がはるかに高いことがわかった。
【0260】
実施例７．患者尿中のＭＩＬ３８抗原の検出。
ＭＩＬ３８は前立腺癌患者の尿中の細胞を検出することができる。この検出方法の感度および特異性を試験するため、年齢の一致した尿試料１２５例を入手した。尿から細胞を沈降させ、ＭＩＬ３８を用いた直接免疫蛍光アッセイにより分析した。健常対照計４７例、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）計３７および生検で確定された前立腺癌計４１例を分析した。
ＭＩＬ３８は前立腺癌患者の尿中の細胞を検出することができる。この検出方法の感度および特異性を試験するため、年齢の一致した尿試料１２５例を入手した。尿から細胞を沈降させ、ＭＩＬ３８を用いた直接免疫蛍光アッセイにより分析した。健常対照計４７例、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）計３７および生検で確定された前立腺癌計４１例を分析した。
【0261】
ＭＩＬ３８を用いた免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）による試験では、コホート内での前立腺癌識別の感度が７１％、特異性が７３％であることがわかった。この試験では、ＢＰＨ患者に対する前立腺癌識別の感度が７１％、特異性が７６％であることがわかった（表１４）。
【0262】
【表17】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】