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技術分野

癌特異的トランス－スプライシングリボザイム及びその用途

発明が解決しようとする課題[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、前記のような問題を解決するためのものであって、安全性及び発現効率に優れた癌特異的トランス－スプライシングリボザイムの癌治療用途を提供することにその目的がある。

課題を解決するための手段[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＭＶ）プローモーター；及び（ｉｉ）癌特異的遺伝子を標的にするトランス－スプライシングリボザイム、前記リボザイムの３'エクソンに連結された目的遺伝子を含む、リボザイム－目的遺伝子発現カセットを含み、前記発現カセットは、リボザイム－目的遺伝子発現カセットの５'末端にスプライシング供与体／スプライシング受容体配列（ｓｐｌｉｃｉ・・・　続きを知財ポータルサイト IP Force にログインして見る

発明の効果[発明の詳細な説明]から抜粋

本発明によるトランス－スプライシングリボザイムは、正常組織には作用せず癌組織で特異的に発現されるので、安全性が高く、転写後レベルで発現効率に優れるので、癌の治療において有用に用いられ得る。具体的に、本発明の組換えベクターは、ＣＭＶプローモーター、ＳＤ／ＳＡ及びＷＰＲＥ配列を保有することで、リボザイムの発現効率が高く、ｍｉＲ－１２２Ｔを保有してｍｉＲ－１２２により活性が調節できるので、安全性に優れる。したがって、ＨＣＶが原因である肝癌のうち、ｍｉＲ－１２２の発現が正常組織より癌組織で高く現われる一部肝癌を除けば、全ての肝癌の治療において効果的に用いられ得、ｍｉＲ－１２２を実質的に発現しない他の癌の治療にも効果的に用いられ得る。

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この特許公報に記載されている図面[図面の簡単な説明]から抜粋

【図1】 図１は、本発明のＣＭＶプローモーターに基づいたｈＴＥＲＴ標的トランス－スプライシングリボザイム及び目的遺伝子発現カセットの構成を示した模式図である。
【図2】 図２は、ｍｉＲ－１２２を発現しないＨｅｐ３Ｂ細胞株（ａ）及びｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ－７．５細胞株（ｂ）で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図3】 図３は、ｍｉＲ－１２２を発現しない細胞株（ａ：Ｈｅｐ３Ｂ、ｂ：ＳＮＵ３９８、ｃ：ＳＮＵ４４９）で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図4】 図４は、ｍｉＲ－１２２を発現する細胞株（ａ：Ｈｕｈ－７、ｂ：Ｈｕｈ－７．５）で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図5】 図５は、ｍｉＲ－１２２を発現するか又は発現しない多様な肝癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図6】 図６は、ソラフェニブに対して感受性があるか又は感受性のない肝癌患者由来の細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図7】 図７は、動物の肝癌モデルでＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔを発現するアデノウイルスの注入用量による腫瘍重量（ａ）、腫瘍組織（ｂ）及び肝酵素（ＧＯＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｏｘａｌｏａｃｅｔｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、ＧＰＴ：ｇｌｕｔａｍｉｃ ｐｙｒｕｖｉｃ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）数値（ｃ）を確認した結果である。
【図8】 図８は、 ｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ－７細胞株で形質導入された組換えベクターのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ－１２２）を示したグラフである。
【図9】 図９は、ｍｉＲ－１２２を発現するＨｕｈ－７．５細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによるＲＮＡ発現量（ａ：Ｅ４、ｂ：リボザイム、ｃ：ｍｉＲ－１２２）を示したグラフである。
【図10】 図１０は、ｍｉＲ－１２２テトラサイクリン－オンシステムを有するＨｅｐ３Ｂ安定化細胞株クローン（＃７－１４、７－４及び７－２）で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩ及びテトラサイクリン濃度による細胞生存率、ｍｉＲ－１２２発現量及びリボザイム発現量を示したグラフである。
【図11】 図１１は、肝癌患者の正常肝組織と肝癌組織でｍｉＲ－１２２の発現量を比較したグラフである（ａ：全体患者群、ｂ：ＨＢＶ連関患者群、ｃ：ＨＣＶ連関患者群、ｄ：アルコール連関患者群、ｅ：ＨＢＶ及びＨＣＶ連関患者群を除いた慢性肝炎連関患者群、ｆ：その他病因患者群）。
【図12】 図１２は、患者の肝癌細胞に由来した肝癌細胞株でｈＴＥＲＴのｍＲＮＡ（ａ）及びタンパク質レベル（ｂ）、ｍｉＲ－１２２レベル（ｃ）を分析した結果である。
【図13】 図１３は、大膓癌細胞株、膠芽腫細胞株、黒色腫細胞株、子宮頸部癌細胞株、肺癌細胞株、骨肉種細胞株及び乳房癌細胞株で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図14】 図１４は、胆管癌細胞株（ａ：ＳＮＵ４７８、ｂ：ＳＮＵ８６９）で形質導入されたＥＣＲＴ－１２２ＴアデノウイルスのＭＯＩによる細胞生存率を示したグラフである。
【図15】 図１５は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＬＮ２２９細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズ（ａ）及び腫瘍重量（ｂ）を確認したグラフである。
【図16】 図１６は、ヌードマウスに膠芽腫細胞であるＵ８７ＭＧ細胞株を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを投与して腫瘍サイズを確認したグラフである。
【図17】 図１７は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを静脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図18】 図１８は、ラットにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、主要組織で組換えベクターの分布程度を示したグラフである。
【図19】 図１９は、ラットにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、各臓器でゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離してＨＳＶｔｋ ＤＮＡを定量した結果を示したグラフである。
【図20】 図２０は、ラットにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを肝動脈注射で注入した後、肝で分離したＲＮＡからリボザイム発現レベルを確認した結果を示したグラフである。
【図21】 図２１は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し た後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図22】 図２２は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し た後、マウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図23】 図２３は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図24】 図２４は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。
【図25】 図２５は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後にマウスの体重（ａ）、飼料消費量（ｂ）及び肝重量（ｃ）を測定した結果を示したグラフである。
【図26】 図２６は、正常ＩＣＲマウスに他の用量のＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入し、ＧＣＶを処理した後の肝の組織病理学的検査結果を示す。
【図27】 図２７は、マウスにＨｅｐ３Ｂ細胞を注入して肝癌形成を誘導した後、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図28】 図２８は、マウス異種移植皮下モデルにＳＮＵ３９８細胞を注入して腫瘍形成を誘導した後、ＣＲＴ－１２２Ｔ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを投与して抗癌効能を比較した結果を示す。
【図29】 図２９は、正常ＩＣＲマウスにＥＣＲＴ又はＥＣＲＴ－１２２Ｔアデノウイルスを注入した後、ＡＳＴ及びＡＬＴレベルを測定した結果を示したグラフである。

代表図 図1本件の代表的な図

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