特許 7053783 肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2022-04-04

(45)【発行日】2022-04-12

(54)【発明の名称】肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20220405BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20220405BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20220405BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALN20220405BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

C12Q1/6883 Z ZNA

【請求項の数】 5

(21)【出願番号】P 2020501172

(86)(22)【出願日】2018-08-20

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-09-17

(86)【国際出願番号】 KR2018009548

(87)【国際公開番号】W WO2019039817

(87)【国際公開日】2019-02-28

【審査請求日】2020-01-15

(31)【優先権主張番号】10-2017-0105714

(32)【優先日】2017-08-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】504314133

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】100107515

【弁理士】

【氏名又は名称】廣田 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100107733

【弁理士】

【氏名又は名称】流 良広

(74)【代理人】

【識別番号】100115347

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 奈緒子

(72)【発明者】

【氏名】ウォン・キム

【審査官】草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５１５３３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００７／０２３７７１３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１２／０４９８７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２００３／０２３２３８５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１５－５３２２７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】LEE, E.S外５名，Growth Differentiation Factor 15 Predicts Chronic Liver Disease Severity，Gut Liver，2017年03月，Vol.11,No.2，Page.276-282，Published online 2016 Oct 13. doi: 10.5009/gnl16049

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

Ｃ１２Ｑ １／６８８３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；以下、ＧＤＦ１５）タンパク質をコードする核酸配列の発現又はＧＤＦ１５タンパク質の活性を測定する剤を含み、
前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる、
非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化の予測又は診断用組成物。

【請求項2】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、検体から分離された生物学的試料に由来し、
前記生物学的試料は、血液又は生検組織から得られる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記剤は、ＧＤＦ１５タンパク質又はその断片に特異的に結合可能な抗体である、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

次の段階を含む、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化の予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法：
肝細胞を成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質及び候補物質で処理する処理段階；及び
前記ＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する候補物質を選別する分析段階；
前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

【請求項5】

次の段階を含む、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化の予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法：
成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ １５）タンパク質発現細胞を候補物質で処理する処理段階；及び
前記細胞においてＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する候補物質を選別する分析段階；
前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなる。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法に関し、より詳細には、非アルコール脂肪肝における肝線維化を予測又は診断するためのマーカー及びこれを用いた予測又は診断方法に関する。

【背景技術】

【0002】

成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）は、哺乳類組織に広範囲に分布し、炎症、癌及び心血管疾患において多角的な役割を担うものと知られている。最近では、血清ＧＤＦ１５数値が肝硬化及び慢性Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎ウイルスの感染に関連した肝細胞癌腫疾患患者において増加することが報告された。肝臓疾患におけるＧＤＦ１５の力学的役割は明らかでないが、ＧＤＦ１５は成長因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｅｔａ １；ＴＧＦ－β１）の発現を刺激するだけでなく、肝線維化／発癌経路において重要な役割を担うＳＭＡＤ信号システムを直接に活性化させることが明らかになった。

【0003】

最近では、筋減少症が非アルコール脂肪肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）及び非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の独立した危険因子であることが報告された。ＧＤＦ１５発現は筋肉消耗条件で増加するので、血清ＧＤＦ１５数値は筋肉量を調節してＮＡＦＬＤの組織学的重症度に影響を与え得ることが予想された。

【0004】

したがって、知られた代謝性危険因子とは独立に、ＧＤＦ１５が、生検によって検証されたＮＡＦＬＤ患者達においてＮＡＳＨ発病の危険及び進行性線維化（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の増加を招くかどうか、肝細胞が高濃度のＧＤＦ１５に露出されることが肝線維化に影響を与えるかどうかを調べることにより、ＮＡＦＬＤの発病及び進行においてＧＤＦ１５の病原性役割を確立する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明者等は非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化を予測又は診断するためのマーカー及びこれを用いた予測又は診断方法を開発しようと鋭意研究・努力した。

【0006】

その結果、成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質の数値と肝線維化との間に正の相関関係があることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

したがって、本発明の目的は、成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；以下、「ＧＤＦ１５」という。）タンパク質をコードする核酸配列の発現又はＧＤＦ１５タンパク質の活性を測定する剤を含む肝疾患予測又は診断用組成物を提供することにある。

【0008】

本発明の他の目的は、試料からＧＤＦ１５タンパク質をコードする核酸配列の発現程度又はＧＤＦ１５タンパク質の濃度を測定する測定段階を含む肝疾患予測又は診断方法を提供することにある。

【0009】

本発明のさらに他の目的は、次の段階を含む、肝疾患予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法を提供することにある：
被検試料をＧＤＦ１５タンパク質で処理する段階；及び
前記ＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する被検試料を選別する段階。

【0010】

本発明のさらに他の目的は、次の段階を含む、肝疾患予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法を提供することにある：
被検試料をＧＤＦ１５タンパク質発現細胞で処理する段階；及び
前記細胞においてＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する被検試料を選別する段階。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法に関し、より詳細には、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化を予測又は診断するためのマーカーを含む。以下、本発明をより詳細に説明する。

【0012】

本発明の一態様は、成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；以下、「ＧＤＦ１５」という）タンパク質をコードする核酸配列の発現又はＧＤＦ１５タンパク質の活性を測定する剤を含む肝疾患予測又は診断用組成物である。

【0013】

前記肝疾患は、肝線維化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変又は肝癌でよく、例えば、肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0014】

前記肝線維化は、非アルコール脂肪肝疾患における肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0015】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。

【0016】

前記剤は、ＧＤＦ１５タンパク質又はその断片に特異的に結合可能な抗体であり得るが、これに限定されるものではない。

【0017】

前記剤は、前記ＧＤＦ１５タンパク質又はその断片に特異的に結合可能な抗体に特異的に結合する検出体をさらに含むことができる。

【0018】

前記検出体は、発色酵素、蛍光物質、放射性同位元素又はコロイドなどで標識した接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）；又は前記ＧＤＦ１５タンパク質又はその断片に特異的に結合可能な抗体に特異的に結合できる２次抗体であり得るが、これに限定されるものではない。

【0019】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、検体から分離された生物学的試料から由来したものであり得る。

【0020】

前記生物学的試料は、血液又は生検組織から得られるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0021】

本発明の他の態様は、試料から成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質をコードする核酸配列の発現程度又はＧＤＦ１５タンパク質の濃度を測定する測定段階を含む肝疾患予測又は診断方法である。

【0022】

前記肝疾患は、肝線維化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変又は肝癌でよく、例えば、肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0023】

前記肝線維化は、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0024】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。

【0025】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、検体から分離された生物学的試料から由来したものであり得る。

【0026】

前記生物学的試料は、血液又は生検組織から得られるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0027】

前記測定段階は、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、電気化学法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ）、蛍光法（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）、発光法（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｙ）、粒子計数法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）、肉眼測定法（ｖｉｓｕａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）、閃光計数法（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）及び組織免疫染色法からなる群から選ばれるいずれか一方法を用いて行うことができ、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて行うことができるが、これに限定されるものではない。

【0028】

前記測定段階は、ＧＤＦ１５タンパク質の濃度が１．５２ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを測定することを含むことができる。

【0029】

本発明の一実施例において、血清ＧＤＦ１５数値の測定値を４個の群（ｑｕａｒｔｉｌｅｓ；Ｑ）に分類した。ＧＤＦ１５の数値が最高である群はＱ４であり、これは、ＧＤＦ１５タンパク質の濃度が１．５２ｎｇ／ｍＬ以上であることを意味し、この場合、重症線維化の有病率は４１．７％であった。

【0030】

したがって、ＧＤＦ１５数値がＱ４に該当する場合、進行性線維化と関連していると見なすことができるので、ＧＤＦ１５タンパク質の濃度が１．５２ｎｇ／ｍＬ以上であるか否かを測定する方法を用いて、ＧＤＦ１５を非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化を予測又は診断するためのマーカーとして活用することができる。

【0031】

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む、肝疾患予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法である：
被検試料を成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質で処理する処理段階；及び
前記ＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する被検試料を選別する分析段階。

【0032】

前記肝疾患は、肝線維化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変又は肝癌でよく、例えば、肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0033】

前記肝線維化は、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0034】

前記被検試料は、血液又は生検組織から得られるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0035】

前記分析段階は、ＧＤＦ１５タンパク質の活性を測定するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫蛍光法、酵素免疫分析法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析及びタンパク質チップからなる群から選ばれる方法を用いて行うことができるが、これに限定されない。

【0036】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。

【0037】

本発明のさらに他の態様は、次の段階を含む、肝疾患予防、治療又は改善候補物質スクリーニング方法である：
被検試料を成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質発現細胞で処理する処理段階；及び
前記細胞においてＧＤＦ１５タンパク質の活性を抑制する被検試料を選別する分析段階。

【0038】

前記肝疾患は、肝線維化、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変又は肝癌でよく、例えば、肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0039】

前記肝線維化は、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化であり得るが、これに限定されるものではない。

【0040】

前記被検試料は、血液又は生検組織から得られるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0041】

前記分析段階は、ＧＤＦ１５タンパク質の発現を測定するために、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、酵素－免疫化学検出法（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）及び免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）からなる群から選ばれる方法を用いて行うことができるが、これに限定されない。

【0042】

前記ＧＤＦ１５タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むものでよく、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるものであり得る。

【発明の効果】

【0043】

本発明は、肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法に関し、前記組成物を用いて、非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）における肝線維化と正の相関関係を持つ成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）タンパク質の数値を確認することができるので、これを、ＮＡＦＬＤにおける肝線維化の予測及び診断に効果的に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1a】非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）の組織学的重症度によって成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）数値が有意に増加することを示すグラフである。

【図1b】脂肪症等級による平均ＧＤＦ１５数値を示すグラフである。

【図1c】風船変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）等級による平均ＧＤＦ１５数値を示すグラフである。

【図1d】肝小葉炎症等級による平均ＧＤＦ１５数値を示すグラフである。

【図1e】線維化段階による平均ＧＤＦ１５数値を示すグラフである。

【図1f】線維化段階を重症度によって区分して平均ＧＤＦ１５数値を示すグラフである。

【図2a】線維化段階Ｆ０に該当する肝組織をマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色して示す写真である。

【図2b】線維化段階Ｆ０に該当する肝組織を抗－ＧＤＦ１５抗体で染色して示す写真である。

【図2c】線維化段階Ｆ１に該当する肝組織をマッソントリクローム染色して示す写真である。

【図2d】線維化段階Ｆ１に該当する肝組織を抗－ＧＤＦ１５抗体で染色して示す写真である。

【図2e】線維化段階Ｆ２に該当する肝組織をマッソントリクローム染色して示す写真である。

【図2f】線維化段階Ｆ２に該当する肝組織を抗－ＧＤＦ１５抗体で染色して示す写真である。

【図2g】線維化段階Ｆ３に該当する肝組織をマッソントリクローム染色して示す写真である。

【図2h】線維化段階Ｆ３に該当する肝組織を抗－ＧＤＦ１５抗体で染色して示す写真である。

【図3a】ＧＤＦ１５数値と肝硬直程度との相関関係を示すグラフである。

【図3b】血清ＧＤＦ１５数値と糖尿病状態によって確認された進行性線維化（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を示すグラフである。

【図4a】ヒト肝星状細胞（Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ；ＨＳＣｓ）であるＬＸ－２細胞の抽出物に組換えヒトＧＤＦ１５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＧＤＦ１５；ｒｈＧＤＦ１５）処理後に時間の経過に従って示すα－平滑筋アクチン（α－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ；α－ＳＭＡ）の免疫ブロッティング写真である。

【図4b】ＬＸ－２細胞にｒｈＧＤＦ１５処理後に時間の経過に従って示すα－ＳＭＡの免疫蛍光写真である。

【図4c】ＬＸ－２細胞にｒｈＧＤＦ１５処理後に時間の経過に従って示すα－ＳＭＡの免疫ブロッティング写真である。

【図4d】肝細胞の抽出物にｒｈＧＤＦ１５処理後に時間の経過に従って示すα－ＳＭＡの免疫ブロッティング写真である。

【図5a】肝細胞、ＨＳＣｓ細胞及びクッパー細胞にパルミチン酸を処理して３時間経過後にＧＤＦ１５ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。

【図5b】肝細胞、ＨＳＣｓ細胞及びクッパー細胞にパルミチン酸を処理して６時間経過後にＧＤＦ１５ｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0045】

成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；以下、ＧＤＦ１５）タンパク質をコードする核酸配列の発現又はＧＤＦ１５タンパク質の活性を測定する剤を含む肝疾患予測又は診断用組成物に関する。

【実施例】

【0046】

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【0047】

実験例１：対象者の選定
対象者は、肝脂肪症の放射線学的記録があるか否かを基準に選抜した。
対象者の適格性基準は次の通りである：
（ｉ）１８歳以上；
（ｉｉ）超音波スキャニング（肝／腎臓エコー発生及び後方減衰増加）において明るいエコーが生成される肝；及び
（ｉｉｉ）６ケ月以内に基準値を超えたアラニントランスアミナーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＡＬＴ）数値の原因不明の上昇。
次の除外基準が適用された：
（ｉ）Ｂ型肝炎又はＣ型肝炎ウイルス感染；
（ｉｉ）自己免疫性肝炎；
（ｉｉｉ）薬物による肝損傷又は脂肪症；
（ｉｖ）ウィルソン病又は血色素沈着症；
（ｖ）過度な飲酒（男性＞３０ｇ／ｄａｙ、女性＞２０ｇ／ｄａｙ）；及び
（ｖｉ）悪性腫瘍診断。
実験群には非アルコール脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ Ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）又は線維化が疑われる肝生検患者が含まれた。
また、対照群は、肝組織の肝生検及び供与者肝移植のための事前評価から収集された血清又は放射線結果に基づいて、肝脂肪症の徴候はないが、肝腺腫又は局所結節過形成と疑われる固形肝癌の確認のために収集された血清を含むように設定された。

【0048】

実験例２：測定方法
身体質量指数（Ｂｏｄｙ ｍａｓｓ ｉｎｄｅｘ，ＢＭＩ、≧２５ｋｇ／ｍ^２）は、世界保健機構アジア－太平洋基準に基づいて肥満を判断する基準として用いた。代謝症候群は、改正された国家コレステロール教育プログラム成人治療パネルＩＩＩ基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ ｃｒｉｔｅｒｉａ）によって定義された。インスリン抵抗性は、１２時間（一晩）中に迅速に生検を行った静脈血サンプルに対してインスリン抵抗性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＨＯＭＡ－ＩＲ）の恒常性モデル評価を用いて評価した。筋減少症（Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）は、四肢骨格筋（ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｒ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ；ＡＳＭ）の質量を体重で割った値で評価した（ＡＳＭ／ｗｅｉｇｈｔ，ＡＳＭ％）。骨格筋量欠乏（Ｌｏｗ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ；ＬＳＭＭ）は、米国国立保健院筋減少症プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｐｒｏｊｅｃｔ）指針に従って骨格筋質量（ＡＳＭ）をＢＭＩで割った値（ＡＳＭ／ＢＭＩ）で定義した。成長分化因子１５（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １５；ＧＤＦ１５）数値は、商業的に利用可能な酵素免疫吸着分析キット（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｋｉｔ；ＥＬＩＳＡ；Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて測定した。前記ＧＤＦ１５のアミノ酸配列情報は、下記表１の通りである。

【0049】

【表1】

【0050】

肝硬直の測定のために、進行性線維化（Ａｄｖａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を予測するための一時的弾力性検査（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ；ＴＥ）を行った。線維化指数（ＮＡＦＬＤ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｃｏｒｅ；ＮＦＳ）、線維化－４（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ－４；Ｆｉｂ４）基準及びアスパラギン酸アミノ転移酵素（ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）、血小板比指数（ＡＳＴ ｔｏ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｒａｔｉｏ Ｉｎｄｅｘ；ＡＰＲＩ）を計算し、ＧＤＦ１５に対するそれらの指数を進行性線維化の予測及び診断の観点から比較した。

【0051】

実験例３：肝組織学的評価
非アルコール脂肪肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）は、５％以上の巨大水疱性脂肪症の存在の有無によって診断された。ＮＡＳＨは、巨大細胞で構成された組織学的肝損傷の全パターンに基づいて診断された。このような基準によって線維化が確認された。進行性線維化は、Ｆ３以上の段階に該当するものに限って診断された。

【0052】

実験例４：ＧＤＦ１５存在下における肝細胞培養
ＧＤＦ１５ １００ｎｇ／ｍＬ及びＴＧＦ－β １０ｎｇ／ｍＬの存在下で培養されたＬＸ－２細胞（ヒト肝星状細胞；Ｈｕｍａｎ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｓｔｅｌｌａｔｅ Ｃｅｌｌ，ＫＡＩＳＴ）及びマウスの肝から直接分離した１次肝細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｃｅｌｌｓ）当たりに３×１０^５ｃｅｌｌｓ／６ウェル（ｗｅｌｌ）に組換えヒトＧＤＦ１５（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＧＤＦ１５；ｒｈＧＤＦ１５；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；９５７－ＧＤ－０２５）を１００ｎｇ／ｍＬ添加した。アルファ平滑筋アクチン（Ａｌｐｈａ－ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ；α－ＳＭＡ）及びコラーゲン１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ １）のような線維化マーカーの数値は、免疫ブロッティング、免疫組織化学染色及び免疫蛍光染色で確認した。

【0053】

実験例５：パルミチン酸処理によるＧＤＦ１５ｍＲＮＡの発現量変化確認
１次肝細胞を分離して、肝細胞、ＨＳＣｓ（ＬＸ－２）、クッパー（Ｋｕｐｆｆｅｒ）細胞及び肝血管内皮細胞（ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；ＬＳＥＣｓ）に分化させた。クッパー細胞は肝に存在する大食細胞であり、炎症の開始に必須の役割を担うものと知られている。

【0054】

クッパー細胞とＬＳＥＣｓとを区分するために、ＭｉｎｉＭＡＣＳ^ＴＭ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を用いて自己－活性化細胞選別（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を行った。ＬＳＥＣｓの純度は、抗－ＰＥ抗体（純度９０％以上）を用いた蛍光－活性化細胞分類方法によって評価された。１次細胞を１．５ｍＬの無血清（ｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ）培地で４時間培養し、５（ｗ／ｗ）％牛血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ対照群）、２００μＭパルミチン酸／５（ｗ／ｗ）％ＢＳＡ溶液及び５００μＭパルミチン酸／５（ｗ／ｗ）％ＢＳＡ溶液をそれぞれ処理した。３時間及び６時間の経過後、細胞を収集してさらに分析した。逆転写重合酵素連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ－ＰＣＲ）及び実時間ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行ってパルミチン酸処理後のＧＤＦ１５ｍＲＮＡの発現を評価した。

【0055】

実験例６：統計分析
グループ間の差異は、独立ｔ検定、マンホイットニーＵ（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ）検定、分散分析（ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ；ＡＮＯＶＡ）又は連続変数に対するクラスカルウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定及び範疇型変数に対するカイ二乗（ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ）検定を用いて評価された。スピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の相関分析は、ＧＤＦ１５数値と組織学的媒介変数との関係を評価するために行われた。

【0056】

年齢、性別、インスリン抵抗性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＨＯＭＡ－ＩＲ）を補正した一般の線形モデルを用いてＮＡＳＨ又は進行性線維化状態によるＧＤＦ１５数値を比較した。ＮＡＳＨ又は線維化の独立した予測因子を調べるために、共変量（ｃｏｖａｒｉａｔｅｓ）が調整されたバイナリロジスティック回帰モデル（ｂｉｎａｒｙ ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）を生成した。有意性は、Ｐ＜０．０５と定義された。全ての統計分析は、ＩＢＭ ＳＰＳＳ統計バージョン２０．０（ＩＢＭ Ｉｎｃ．，Ａｒｍｏｎｋ，ＮＹ）を用いて行われた。

【0057】

結果例１：ＮＡＦＬＤの組織学的スペクトルによる臨床的特徴
表２－１～２－３に示すように、１５０名のＮＡＦＬＤ患者と４０名の対照群を調べた。ＮＡＦＬＤ患者達を、生検によって、非アルコール脂肪肝（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ；ＮＡＦＬ）７２名（男性６５．３％）とＮＡＳＨ７８名（男性４４．９％）とに区分した。

【0058】

【表2-1】

【0059】

【表2-2】

【0060】

【表2-3】

【0061】

前記表２－１～２－３から確認できるように、ＮＡＦＬＤの重症度とＢＭＩ、腰回り、関連条件（糖尿病、高血圧及び黄斑症）、アラニントランスアミナーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＡＬＴ）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ；ＡＳＴ）数値、インスリン抵抗性（ＨＯＭＡ－ＩＲ）との線形相関関係を発見した（^１ＢＭＩ≧２５ｋｇ／ｍ^２、^２米国国立保健院筋減少症プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｐｒｏｊｅｃｔ）指針による男性＜０．７８９及び女性＜０．５１２以上のＡＳＭ／ＢＭＩ、^３連続変数のための独立ｔ検定又はマンホイットニー分析検定；範疇型変数に対するカイ二乗検定）。

【0062】

表３－１～３－２から確認できるように、ＮＡＦＬＤ患者（ｎ＝１５０）のうち、進行性線維化患者は、年齢が高く、女性の方が多く、進行性線維化が確認されなかったＮＡＦＬＤ患者に比べて有意に低い血清アルブミン数値及び血小板数値を示した。

【0063】

【表3-1】

【0064】

【表3-2】

【0065】

進行性線維化は、糖尿病と高血圧、高いインスリン抵抗性、低いＡＳＭ／ＢＭＩ（Ｐ：０．００３，０．００１，＜０．００１，０．００８）の条件と有意の相関関係を示したが、腰回りやＢＭＩとは有意の相関関係を示さなかった（^１ＢＭＩ≧２５ｋｇ／ｍ^２、^２米国国立保健院筋減少症プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｐｒｏｊｅｃｔ）指針による男性＜０．７８９及び女性＜０．５１２以上のＡＳＭ／ＢＭＩ、^３連続変数に対するＡＮＯＶＡ又はクラスカルウォリス検定；範疇型変数に対するカイ二乗検定）。

【0066】

結果例２：ＧＤＦ１５数値と進行性線維化との関係
前記表２－１～２－３によれば、ＧＤＦ１５数値は、ＮＡＦＬＤの組織学的重症度によって有意に増加した。図１ａから確認できるように、ＮＡＳＨ患者は、対照群（Ｎｏ ＮＡＦＬＤ）又はＮＡＦＬ患者に比べて有意に高いＧＤＦ１５数値を示した。一方、図１ｂから確認できるように、ＧＤＦ１５数値と脂肪症等級との連関性はなかった（Ｐ＝０．２０２）。図１ｃ及び図１ｄから確認できるように、血清ＧＤＦ１５数値は風船変性（ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ρ，０．２００；Ｐ＝０．００６）及び肝小葉炎症の重症度（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ρ，０．２７１；Ｐ＜０．００１）によって有意に増加した。図１ｅから確認できるように、線維化程度は、血清ＧＤＦ１５数値と有意の相関関係があった（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ρ，０．３３７；Ｐ＜０．００１）。図１ｆから確認できるように、進行性線維化に該当する対象者であるＦ３及びＦ４は、そうでない対象者であるＦ０～Ｆ２に比べて有意に高いＧＤＦ１５数値を示した（Ｐ＜０．００１）。

【0067】

結果的に、血清ＧＤＦ１５数値とＮＡＦＬＤの組織学的な重症度との間に階段式連関性があることが確認でき、また、肝小葉炎症、風船変性及び線維化の重症度と正の相関関係があることが確認できる。

【0068】

図２から確認できるように、免疫組織化学的分析によって確認したところによれば、図２ｈのように表示される進行性線維化を示す対象者の肝におけるＧＤＦ１５発現程度は、図２ｂ、図２ｄ及び図２ｆのように表示され、進行性線維化が確認されなかった対象者の場合に比べて顕著に高く現れた。

【0069】

ＧＤＦ１５数値が進行性線維化（≧Ｆ３）と独立に関連しているため、ＧＤＦ１５数値と、線維化の重症度を肝硬直度で示したＴＥ数値との間に相関関係が成立するかを調べた。

【0070】

図３ａから確認できるように、ＧＤＦ１５数値と肝硬直度との間に有意な正の相関関係があることを発見した（Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ρ，０．５２５；Ｐ＜０．００１）。

【0071】

次に、ＧＤＦ１５数値を４個の群（ｑｕａｒｔｉｌｅｓ；Ｑ）に分類した；Ｑ１とＱ４はそれぞれ、最低群と最高群である。重症線維化の有病率はそれぞれ、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３及びＱ４において２．２％、８．２％、８．５％及び４１．７％であった（Ｐ＜０．００１）。ＧＤＦ１５が最も高い群（Ｑ４；ＧＤＦ１５数値≧１．５２ｎｇ／ｍＬ）は、進行性線維化と関連があった（ｕｎａｄｊｕｓｔｅｄ ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ［ＯＲ］，１０．５６；９５％ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌ［ＣＩ］，４．３５－２５．６０；Ｐ＜０．００１）。

【0072】

結果例３：ＮＡＦＬＤにおいて線維化の決定的因子としてのＧＤＦ１５の確認
その後、ＧＤＦ１５数値によって線維化進行の危険を予測することがＮＡＦＬＤ患者に限って可能であるかを調べた。

【0073】

表４のように、多変数モデル１は、年齢、性別及び体質量指数を調整し、多変数モデル２は、モデル１に含まれた要因の他にも喫煙、高血圧及び糖尿病を、多変数モデル３は、モデル２に含まれた要因の他にもＡＳＴ、血小板及びアルブミンを、多変数モデル４は、モデル３に含まれた要因の他にもＨＯＭＡ－ＩＲを、多変数モデル５は、モデル４に含まれた要因の他にもＬＳＭＭを、変数として追加して調整した。

【0074】

【表4】

【0075】

Ｑ４のＧＤＦ１５数値は、年齢、性別、ＢＭＩ、喫煙状態によって調整された多変数モデル（Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｍｏｄｅｌ）分析において有意味な状態を維持する進行性線維化、高血圧、糖尿病、ＡＳＴ数値、血小板数値、アルブミン数値を示した。インスリン抵抗性及びＬＳＭＭに対する追加調整は、ＧＤＦ１５数値と進行性線維化との連関性において統計的有意性を示した。対照的に、Ｑ４のＧＤＦ１５数値は、ＮＡＦＬＤ対象者においてＮＡＳＨ発病の危険とは連関性がなかった。しかし、ＧＤＦ１５は、ＬＳＭＭ及びインスリン抵抗性に対する調整後にもＮＡＦＬＤの進行性線維化に独立した決定因子として機能することが確認できる。

【0076】

結果例４：糖尿病の有無と進行性線維化有病率との相関関係
ＧＤＦ１５が糖尿病の有無に関係なく進行性線維化に決定的な影響を及ぼし得るかを調べた。

【0077】

図３ｂから確認できるように、ＧＤＦ１５数値を４個の群に分けて層化分析した結果は、進行性線維化の重症度に対する更なる差異を示した。特に、糖尿病を持つ対象者のうち、進行性線維化の有病率は、Ｑ４のＧＤＦ１５数値に該当する場合に５４．２％だったが、Ｑ１～Ｑ３のＧＤＦ１５数値に該当する場合には１２．１％に過ぎなかった。特に、ＧＤＦ１５数値がＱ４に該当する場合、非糖尿病患者においても、重症線維化に該当する有病率は３１．３％であり、これは、Ｑ１～Ｑ３に該当するＧＤＦ１５数値を有する非糖尿病患者の危険度に比べて線維化進行危険度が６倍以上も高いことを示す（ＯＲ，６．７２，９５％ ＣＩ，１．５０－３０．１３）。糖尿病の有無に関係なく、ＧＤＦ１５数値に関連した進行性線維化の有病率は、ＮＡＦＬＤ群において２９．８％（１７／５７）、１０．８％（１０／９３）だった（Ｐ＝０．００３、カイ二乗検定）。

【0078】

結果例５：ＧＤＦ１５処理によるＬＸ－２細胞における線維化の誘導
図４ａから確認できるように、ｒｈＧＤＦ１５処理によってＬＸ－２細胞においてα－ＳＭＡ及びコラーゲン１（Ｃｏｌｌａｇｅｎ １）のような既存線維化マーカーの発現は増加し、細胞死滅には影響を与えなかった。

【0079】

図４ｂから確認できるように、免疫ブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）と同様に、免疫蛍光（ｉｍｍｕｎｏｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）染色法によって確認した結果、ＧＤＦ１５を１２時間処理した場合、白色矢印で表される部分のように、α－ＳＭＡが高い発現量を示した。図４ｃから確認できるように、ＧＤＦ１５がヒト肝細胞においてＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３のリン酸化を増加させることによって線維化を誘導するということを検証した。図４ｄから確認できるように、ＧＤＦ１５の処理は、１次肝細胞においてＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３のリン酸化を上向き調節することによって線維化を誘導した。

【0080】

ＧＤＦ１５処理後、１２時間以内にα－ＳＭＡ数値は増加し、ＳＭＡＤリン酸化は３時間以内で非常に早く誘導された。ＧＤＦ１５処理後に肝細胞活性化及び線維化に重要な役割を担うものと知られたＳＭＡＤ２とＳＭＡＤ３のリン酸化が増加することによって、ＧＤＦ１５がヒト肝細胞を活性化させ、線維化を誘導するということを発見した。肝細胞に対するＧＤＦ１５の急性刺激効果は１２時間後に顕著に減少し、これは、ＧＤＦ１５が肝損傷又は炎症に対する初期反応に関与し得るということを示唆する。

【0081】

結果例６：パルミチン酸処理によるＧＤＦ１５ｍＲＮＡの発現増加
ＧＤＦ１５がＬＳＭＭに関係なく進行性線維化に決定的な影響を及ぼし得るかどうかを調べた。筋減少現象を誘導するものと知られたパルミチン酸を肝細胞に時間及び容量依存的に処理した後、ＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現を評価した。

【0082】

図５ａから確認できるように、パルミチン酸処理３時間後に肝細胞では変化がなく、ＨＳＣｓでは、パルミチン酸２００μＭを処理した場合、ＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現レベルがやや上昇したが、有意ではなかった。しかし、クッパー細胞ではパルミチン酸５００μＭを処理した場合、ＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現レベルの約２倍と有意に増加した（Ｐ＝０．００４）。

【0083】

図５ｂから確認できるように、パルミチン酸処理６時間経過後、肝細胞とＨＳＣｓにおけるＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現数値では有意の変化がなかった。クッパー細胞におけるＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現量は、パルミチン酸２００μＭを処理した場合に２．５倍増加し（Ｐ＝０．００９）、パルミチン酸を５００μＭ処理した場合に１．５倍増加した（Ｐ＝０．０３２）。

【0084】

結果的に、パルミチン酸を処理する場合、クッパー細胞においてＧＤＦ１５ｍＲＮＡ発現量が増加することを確認し、これは、ＧＤＦ１５の発現量と筋肉量との間に逆の相関関係があることを意味する。

【産業上の利用可能性】

【0085】

本発明は、肝疾患予測又は診断用組成物及びこれを用いた肝疾患予測又は診断方法に関し、より詳細には、非アルコール脂肪肝における肝線維化を予測又は診断するためのマーカー及びこれを用いた予測又は診断方法に関する。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図2a】

【図2b】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図5a】

【図5b】

【配列表】

0007053783000001.app