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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2022-04-05
(45)【発行日】2022-04-13
(54)【発明の名称】チロシナーゼ阻害剤
(51)【国際特許分類】
C12P 17/04 20060101AFI20220406BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20220406BHJP
C07D 493/04 20060101ALI20220406BHJP
A61K 8/49 20060101ALI20220406BHJP
A61K 8/9728 20170101ALI20220406BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20220406BHJP
A61K 31/343 20060101ALI20220406BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20220406BHJP
A61K 36/07 20060101ALI20220406BHJP
【ＦＩ】
C12P17/04
C12N9/02
C07D493/04 101C
A61K8/49
A61K8/9728
A61Q19/02
A61K31/343
A61P17/16
A61K36/07
【請求項の数】
5
(21)【出願番号】P 2017061552
(22)【出願日】2017-03-27
(65)【公開番号】P2018162237
(43)【公開日】2018-10-18
【審査請求日】2020-03-03
(73)【特許権者】
【識別番号】504150461
【氏名又は名称】国立大学法人鳥取大学
(74)【代理人】
【識別番号】100081422
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 光雄
(74)【代理人】
【識別番号】100084146
【氏名又は名称】山崎 宏
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(72)【発明者】
【氏名】石原 亨
(72)【発明者】
【氏名】井手 ゆり
【審査官】白井 美香保
(56)【参考文献】
【文献】Molecules，2011年，Vol.16，p.2334-2347
【文献】Molecules，2016年，Vol.21，p.1-12，doi:10.3390/molecules21101372
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，５，７－トリオール、またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項2】
請求項１記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含むチロシナーゼ阻害用組成物。
【請求項3】
化粧品である請求項２記載の組成物。
【請求項4】
医薬組成物である請求項２記載の組成物。
【請求項5】
マツオウジを培養し、請求項１記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含む菌糸体または菌糸体の培養濾液を得ることを含む、請求項１記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規化合物に関する。詳細には、本発明は、チロシナーゼ阻害活性を有する新規化合物、該化合物を含むチロシナーゼ阻害剤、および該化合物の製造方法に関する
【背景技術】
【0002】
近年の美容における主な関心事の１つに「美白」が挙げられる。メラニンは、シミやそばかすに沈着している色素である。シミやそばかすは、日焼けなどを引き金に生体内でメラニンが過剰に生成されることによって生じる。したがって、メラニンの生成を抑制することにより美白効果を得ることができる。メラニン生成の過程で重要な働きをするのがチロシナーゼである。チロシナーゼはＬ－チロシンから、Ｌ－ＤＯＰＡ、およびＬ－ＤＯＰＡからＬ－ＤＯＰＡキノンへの２段階の反応を触媒するメラニン生合成の律速酵素である。したがって、チロシナーゼの阻害剤はメラニンの生成を抑制し、肌を白く保ついわゆる美白作用を有する。
【0003】
チロシナーゼ阻害剤は、実際に様々な美白化粧品に使用されている。実用化されているチロシナーゼ阻害剤には、ヒドロキノン、コウジ酸、アルブチン、グルタチオンなどがある（非特許文献１）。しかし、これらのチロシナーゼ阻害剤の中には、水の存在下で酸化が起こり、急激な品質の低下が問題になるものもある（非特許文献１）。また、中には細胞毒性を示すものがあることも報告されている。ロドデノールを有効成分とする美白化粧品の使用によって肌に白い斑点が現れ、大きな問題となったのは記憶に新しい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【文献】谷口正之 (2013) 米タンパク質由来チロシナーゼ阻害ペプチドの精製と同定およびその美白効果. コスメとロジー研究報告21, 24-30.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上述のような背景から、効果的かつ安全なチロシナーゼ阻害剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、上述の式（Ｉ）で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物が強力なチロシナーゼ阻害活性を有することを見出し、本発明を完成させた。
【0007】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）式（Ｉ）：
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ（Ｏ）Ｒ１、（Ｏ）Ｒ２、（Ｏ）Ｒ３および（Ｏ）Ｒ４であり、ここに（Ｏ）は酸素原子が存在してもよく、存在しなくてもよいことを意味し、
Ｒ１～Ｒ４はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、
・ＯＲ５
・ＣＯＲ６、
・ＣＯＯＲ７、
・ＮＲ８Ｒ９、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
であり、
Ｒ５～Ｒ９はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
（２）Ｘ１、Ｘ３およびＸ４がそれぞれ独立してＯＨまたはＯＣ１－３アルキルであり、Ｘ２が水素、ＯＨまたはＯＣ１－３アルキルである（１）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物（ここにＣ１－３アルキルはハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよい）。
（３）１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，５，７－トリオールあるいは５－メトキシ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，７－ジオール、またはその塩もしくは溶媒和物である、（１）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
（４）（１）～（３）のいずれか記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含むチロシナーゼ阻害用組成物。
（５）化粧品である（４）記載の組成物。
（６）医薬組成物である（４）記載の組成物。
（７）きのこを培養し、（１）～（３）のいずれか記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含む培養物を得ることを含む、（１）～（３）のいずれか記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の製造方法。
（８）きのこがマツオウジである（７）記載の方法。
（１）式（Ｉ）：
【化1】
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ（Ｏ）Ｒ１、（Ｏ）Ｒ２、（Ｏ）Ｒ３および（Ｏ）Ｒ４であり、ここに（Ｏ）は酸素原子が存在してもよく、存在しなくてもよいことを意味し、
Ｒ１～Ｒ４はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、
・ＯＲ５
・ＣＯＲ６、
・ＣＯＯＲ７、
・ＮＲ８Ｒ９、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
であり、
Ｒ５～Ｒ９はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
（２）Ｘ１、Ｘ３およびＸ４がそれぞれ独立してＯＨまたはＯＣ１－３アルキルであり、Ｘ２が水素、ＯＨまたはＯＣ１－３アルキルである（１）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物（ここにＣ１－３アルキルはハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよい）。
（３）１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，５，７－トリオールあるいは５－メトキシ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，７－ジオール、またはその塩もしくは溶媒和物である、（１）記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
（４）（１）～（３）のいずれか記載の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含むチロシナーゼ阻害用組成物。
（５）化粧品である（４）記載の組成物。
（６）医薬組成物である（４）記載の組成物。
（７）きのこを培養し、（１）～（３）のいずれか記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含む培養物を得ることを含む、（１）～（３）のいずれか記載の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の製造方法。
（８）きのこがマツオウジである（７）記載の方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明は、強力なチロシナーゼ阻害活性を有する化合物を提供する。本発明の化合物は、食用キノコ中に含まれているものなので、安全性が高い。したがって、本発明の化合物を含む化粧品や医薬組成物は強力な美白効果を有し、シミやそばかすを効果的に抑制するものであり、安全性も高いものである。さらに、本発明は、きのこを培養することを特徴とする、上記化合物の製造方法も提供する。本発明の製造方法に食用きのこを用いることにより、安全に上記化合物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明は、１の態様において、式（Ｉ）：
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ（Ｏ）Ｒ１、（Ｏ）Ｒ２、（Ｏ）Ｒ３および（Ｏ）Ｒ４であり、ここに（Ｏ）は酸素原子が存在してもよく、存在しなくてもよいことを意味し、
Ｒ１～Ｒ４はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、
・ＯＲ５
・ＣＯＲ６、
・ＣＯＯＲ７、
・ＮＲ８Ｒ９、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
であり、
Ｒ５～Ｒ９はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物を提供する。
【化2】
［式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ４はそれぞれ（Ｏ）Ｒ１、（Ｏ）Ｒ２、（Ｏ）Ｒ３および（Ｏ）Ｒ４であり、ここに（Ｏ）は酸素原子が存在してもよく、存在しなくてもよいことを意味し、
Ｒ１～Ｒ４はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、
・ＯＲ５
・ＣＯＲ６、
・ＣＯＯＲ７、
・ＮＲ８Ｒ９、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
であり、
Ｒ５～Ｒ９はそれぞれ独立して、
・水素、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－６アルキル、
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルケニル、または
・ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ２－６アルキニル、
である］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物を提供する。
【0011】
式（Ｉ）の化合物はチロシナーゼ阻害活性を有する。チロシナーゼ阻害活性は、公知のチロシナーゼ活性測定系において、被験物質を添加した場合と、被験物質を添加しない場合とのチロシナーゼ活性の比較により測定してもよい。チロシナーゼ阻害活性の測定法の一例としては、緩衝溶液中のＬ－ＤＯＰＡに被験物質を添加して、あるいは被験物質を添加せずに一定時間インキュベートし、その後チロシナーゼを添加して一定時間インキュベートし、反応液の吸光度を例えば４７５ｎｍにて測定することが挙げられる。本明細書において、チロシナーゼの阻害とは、チロシナーゼ活性を低下させることおよび消失させることの両方を意味する。
【0012】
式（Ｉ）の化合物は、特に断らない限り、構造異性体、立体異性体を問わず、すべての種類の異性体、および異性体の混合物を包含する。
【0013】
好ましい式（Ｉ）の化合物の例としては、Ｘ１、Ｘ３およびＸ４がそれぞれ独立してＯＨまたはＯＣ１－３アルキルであり、Ｘ２が水素、ＯＨまたはＯＣ１－３アルキルである化合物が挙げられるが、これらに限らない。上記の好ましい化合物において、Ｃ１－３アルキルはハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよい。
【0014】
より好ましい式（Ｉ）の化合物の例としては、１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，５，７－トリオールまたは５－メトキシ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，７－ジオールが挙げられるが、これらに限らない。
【0015】
本明細書において、ハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【0016】
本明細書において、Ｃ１－６アルキルは炭素数１～６個のアルキル基を意味する。Ｃ１－６アルキルは直鎖状であってもよく、分岐状であってもよい。Ｃ１－６アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチルおよびこれらの構造異性体が挙げられる。Ｃ１－６アルキルにおけるハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２での置換位置はいずれの位置であってもよい。したがって、ハロゲンまたはＯＨにて置換されていてもよいＣ１－６アルキルは、そのすべての構造異性体および立体異性体を包含する。
【0017】
本明細書において、Ｃ１－３アルキルは炭素数１～３個のアルキル基を意味する。Ｃ１－３アルキルは直鎖状であってもよく、分岐状であってもよい。Ｃ１－３アルキルの例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルおよびこれらの構造異性体が挙げられる。Ｃ１－３アルキルにおけるＯＨまたはハロゲンでの置換位置はいずれの位置であってもよい。したがって、ハロゲン、ＯＨ、ＣＯＯＨまたはＮＨ２にて置換されていてもよいＣ１－３アルキルは、そのすべての構造異性体および立体異性体を包含する。
【0018】
本明細書において、Ｃ２－６アルケニルは、二重結合を１つ含む炭素数２～６個のアルキル基を意味する。Ｃ２－６アルケニルは直鎖状であってもよく、分岐状であってもよい。Ｃ２－６アルケニルの例としては、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルおよびこれらの構造異性体が挙げられる。Ｃ２－６アルケニルにおけるＯＨまたはハロゲンでの置換位置はいずれの位置であってもよい。したがって、ハロゲンまたはＯＨにて置換されていてもよいＣ２－６アルケニルは、そのすべての構造異性体および立体異性体を包含する。
【0019】
本明細書において、Ｃ２－６アルキニルは、三重結合を１つ含む炭素数２～６個のアルキル基を意味する。Ｃ２－６アルキニルは直鎖状であってもよく、分岐状であってもよい。Ｃ２－６アルキニルの例としては、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘプチニルおよびこれらの構造異性体が挙げられる。Ｃ２－６アルキニルにおけるＯＨまたはハロゲンでの置換位置はいずれの位置であってもよい。したがって、ハロゲンまたはＯＨにて置換されていてもよいＣ２－６アルキニルは、そのすべての構造異性体および立体異性体を包含する。
【0020】
本明細書中のその他の用語は、特に断らないかぎり、当該分野において通常使用されている意味を有するもの
とする。
とする。
【0021】
式（Ｉ）の化合物は遊離形態で存在してもよく、塩の形態で存在してもよい。式（Ｉ）の化合物の塩はチロシナーゼ阻害活性を有する。式（Ｉ）の化合物の塩は、式（Ｉ）の化合物を用いて、常法にしたがって製造することができる。
【0022】
式（Ｉ）の化合物が塩基性基を有している場合には、式（Ｉ）の化合物を酸で処理することにより、酸付加塩に変換することができる。式（Ｉ）の化合物の酸付加塩としては、例えば塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルキルスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩等のアリ－ルスルホン酸塩；フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩等の有機酸塩を挙げることができるが、これらに限定されない。
【0023】
式（Ｉ）の化合物が酸性基を有している場合には、式（Ｉ）の化合物を塩基で処理することにより、塩基付加塩に変換することができる。そのような塩基付加塩としては、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、グアニジン、トリエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン等の有機塩基による塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
式（Ｉ）の化合物がＯＨ基を有する場合には、その水素をアルカリ金属にて置換した化合物も、式（Ｉ）の塩に包含される。アルカリ金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、ストロンチウムなどが例示される。
【0025】
式（Ｉ）の化合物は遊離形態で存在してもよく、溶媒和物として存在してもよい。式（Ｉ）の化合物の溶媒和物はチロシナーゼ阻害活性を有する。式（Ｉ）の化合物の溶媒和物の典型例は水和物である。
【0026】
式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を、公知の方法を用いて化学合成することができる。あるいは式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を、きのこを培養することによって製造することもできる。したがって、本発明は、さらなる態様において、きのこを培養し、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含む培養物を得ることを含む製造方法を提供する。本発明の製造方法においてはマツオウジなどの可食性きのこあるいは食用きのこを用いることが好ましい。
【0027】
きのこの培養は公知の方法にて行うことができる。液体培地にて菌糸を培養してもよく、固体培地にて子実体を形成させてもよい。式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含む培養物としては、菌糸体、菌糸体の培養濾液、あるいは子実体が挙げられる。菌糸体、菌糸体の培養濾液、あるいは子実体を水または有機溶媒、あるいはこれらの混合物にて抽出してもよい。さらにシリカゲルクロマトグラフィー等の公知の方法を用いて、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を精製してもよい。
【0028】
式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物の製造に用いられるきのこは、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を生成するものであればいずれのきのこであってもよい。マツオウジなどの食用きのこを用いて式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を製造する場合、その製造方法はきわめて安全性の高いものとなる。
【0029】
本発明は、さらなる態様において、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物を含むチロシナーゼ阻害用組成物を提供する。本発明の組成物中の式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物としては、単離または精製されたものを用いてもよく、きのこの培養物またはその抽出物、あるいはその部分精製品を用いてもよい。
【0030】
本発明の組成物はチロシナーゼ活性を阻害するために用いられる。チロシナーゼ活性を阻害することによって様々な効果が得られる。例えば、皮膚においてシミやそばかすの生成が抑制され、美白効果が得られる。
【0031】
本発明の組成物の形状は乳液、ローション等の液体；クリーム、ペースト、ゲル等の半固体；粉末、顆粒、ブロック等の固体のいずれであってもよい。公知の担体または賦形剤を用いて、本発明の組成物を製造し、所望の形状とすることができる。本発明の組成物は所望により着色料や香料を含んでいてもよい。
【0032】
本発明の組成物を、ヒトをはじめとする動物に適用することができる。本発明の組成物の適用方法は特に限定されないが、典型的には皮膚に適用される。本発明の組成物をヒトの皮膚に適用する場合、１回あたりの式（Ｉ）の化合物の用量は特に制限されないが、例えば、１回に１ｍｇ～２００ｍｇとしてもよい。
【0033】
本発明の組成物の典型例として化粧品が挙げられる。本発明の化粧品の形態としては、ローション、乳液、スプレイ、クリーム、ゲル、ペースト、固形石けん、液体石けん、ウェットティッシュ、パックなどが例示されるが、これらに限定されない。これらの形態の化粧品の製造方法は公知である。
【0034】
本発明の組成物のさらなる典型例として医薬組成物が挙げられる。本発明の医薬組成物の投与経路は特に限定されないが、典型的には経皮投与である。経皮投与用の医薬組成物の形態としては、ローション、乳液、スプレイ、クリーム、ゲル、ペースト、軟膏、固形石けん、液体石けん、ウェットティッシュなどが例示されるが、これらに限定されない。これらの形態の医薬組成物の製造方法は公知であり、式（Ｉ）の化合物またはその塩もしくは溶媒和物および医薬上許容される担体または賦形剤を用いて、混合、撹拌、粉砕、型による成形、充填等の公知のプロセスにより行うことができる。
【0035】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例1】
【0036】
（１）きのこ抽出物のスクリーニング
鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センターから分譲された９５株のきのこを麦芽液体培地、ＬＢ培地またはＹＭ培地にて培養し、菌糸体または培養濾液を得た。また、これらのきのこの一部については子実体を形成させた。菌糸体、培養濾液、または子実体をメタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタンまたは水にて抽出し、得られた抽出物をチロシナーゼ阻害活性試験に供した。試供きのこを表１～表４に示す。
鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝資源研究センターから分譲された９５株のきのこを麦芽液体培地、ＬＢ培地またはＹＭ培地にて培養し、菌糸体または培養濾液を得た。また、これらのきのこの一部については子実体を形成させた。菌糸体、培養濾液、または子実体をメタノール、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタンまたは水にて抽出し、得られた抽出物をチロシナーゼ阻害活性試験に供した。試供きのこを表１～表４に示す。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【0037】
９６穴プレートに、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ溶液、きのこ抽出物サンプルを加え、２５℃で１５分間、インキュベートした。その後、チロシナーゼ加え２５℃で５分間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで４７５ｎｍでの吸光度を測定した。各反応液の組成を表５に示す。阻害率は以下の計算式によって求めた。
阻害率（％）＝１－｛（Ｃ吸光度－Ｄ吸光度）／（Ａ吸光度－Ｂ吸光度）×１００｝
阻害率（％）＝１－｛（Ｃ吸光度－Ｄ吸光度）／（Ａ吸光度－Ｂ吸光度）×１００｝
【表5】
【0038】
９５サンプルのきのこ抽出物のスクリーニングの結果、菌体抽出物ではＤ－ＴＵＥＸ Ｎｏ．（鳥取大学農学部附属菌類きのこ遺伝子資源研究センターにおける抽出物の番号）２３１７（マツオウジ）がチロシナーゼ活性を６０％以上阻害した。培養ろ液抽出物ではＤ－ＴＵＥＸ Ｎｏ．２１７２（マツオウジ）が６０％以上の阻害活性を示した。子実体抽出物では６０％以上の阻害活性を示したものはなかった。
【0039】
（２）マツオウジ（Ｄ－ＴＵＥＸ Ｎｏ．２１７２）からのチロシナーゼ活性阻害物質の単離および同定
（２－１）マツオウジの培養および培養ろ液の分画
マツオウジ（Ｄ－ＴＵＥＸ Ｎｏ．２１７２）のスラントから麦芽液体培地へ植菌したものを用いて大量培養を行った。麦芽液体培地５Ｌを５００ｍｌ容三角フラスコに２００ｍｌずつ分注し、オートクレーブで滅菌した後、植菌を行い、２５℃で４７日間培養した。マツオウジの培養物を吸引ろ過し、ろ液を３分の１量酢酸エチルで３回分配抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで一晩脱水した後、エバポレーターで減圧濃縮した。デシケーターで完全に乾燥し抽出物（１．１４ｇ）を得た。これをシリカゲルカラム（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、１００ｇ、ダイソー株式会社、大阪）に重層した。溶出には、アセトン－ヘキサン混合溶媒を用いた。ヘキサン中のアセトン濃度を０％から１００％まで１０％ずつ、段階的に増加させた後、メタノールで溶出した。１つのフラクションあたり１Ｌの溶媒を用いた。１２のフラクション０％（４．８ｍｇ）、１０％（９７．８ｍｇ）、２０％（１５７．５ｍｇ）、３０％（１５１．７ｍｇ）、４０％（７２．７ｍｇ）、５０％（４２．０ｍｇ）、６０％（６５．５ｍｇ）、７０％（２１．３ｍｇ）、８０％（３１．９ｍｇ）、９０％（１３．９ｍｇ）、１００％（４３．６ｍｇ）を得た。アセトン３０％画分およびアセトン４０％画分に強いチロシナーゼ阻害活性が見られた。
（２－１）マツオウジの培養および培養ろ液の分画
マツオウジ（Ｄ－ＴＵＥＸ Ｎｏ．２１７２）のスラントから麦芽液体培地へ植菌したものを用いて大量培養を行った。麦芽液体培地５Ｌを５００ｍｌ容三角フラスコに２００ｍｌずつ分注し、オートクレーブで滅菌した後、植菌を行い、２５℃で４７日間培養した。マツオウジの培養物を吸引ろ過し、ろ液を３分の１量酢酸エチルで３回分配抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで一晩脱水した後、エバポレーターで減圧濃縮した。デシケーターで完全に乾燥し抽出物（１．１４ｇ）を得た。これをシリカゲルカラム（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、１００ｇ、ダイソー株式会社、大阪）に重層した。溶出には、アセトン－ヘキサン混合溶媒を用いた。ヘキサン中のアセトン濃度を０％から１００％まで１０％ずつ、段階的に増加させた後、メタノールで溶出した。１つのフラクションあたり１Ｌの溶媒を用いた。１２のフラクション０％（４．８ｍｇ）、１０％（９７．８ｍｇ）、２０％（１５７．５ｍｇ）、３０％（１５１．７ｍｇ）、４０％（７２．７ｍｇ）、５０％（４２．０ｍｇ）、６０％（６５．５ｍｇ）、７０％（２１．３ｍｇ）、８０％（３１．９ｍｇ）、９０％（１３．９ｍｇ）、１００％（４３．６ｍｇ）を得た。アセトン３０％画分およびアセトン４０％画分に強いチロシナーゼ阻害活性が見られた。
【0040】
（２－３）チロシナーゼ阻害活性を有する化合物１の単離、同定
アセトン４０％画分（６０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、６ｇ）によって分画した。溶媒には、酢酸エチル－ヘキサン（酢酸エチル濃度４０％、５０％、６０％、７０％、１００％）を６０ｍｌずつ用いた。同一の酢酸エチル濃度の溶媒によって溶出されるフラクションを３つに分けて回収した。合計１５のフラクション、４０％－１（０．９ｍｇ）、４０％－２（０．１ｍｇ）、４０％－３（２．７ｍｇ）、５０％－１（９．１ｍｇ）、５０％－２（１２．０ｍｇ）、５０％－３（１．２ｍｇ）、６０％－１（１．８ｍｇ）、６０％－２（７．５ｍｇ）、６０％－３（０．６ｍｇ）、７０％－１（１．６ｍｇ）、７０％－２（３．０ｍｇ）、７０％－３（１．５ｍｇ）、１００％－１（４．２ｍｇ）、１００％－２（４．９ｍｇ）、１００％－３（３．８ｍｇ）を得た。これらをＴＬＣ（ＳｉＯ２アルミシート Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社、酢酸エチル－ヘキサン（１：１））で分析した。
このうち、アセトン４０％酢酸エチル５０％－１に活性が見られたため、この画分に含まれていた活性物質を化合物１とした。
アセトン４０％画分（６０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、６ｇ）によって分画した。溶媒には、酢酸エチル－ヘキサン（酢酸エチル濃度４０％、５０％、６０％、７０％、１００％）を６０ｍｌずつ用いた。同一の酢酸エチル濃度の溶媒によって溶出されるフラクションを３つに分けて回収した。合計１５のフラクション、４０％－１（０．９ｍｇ）、４０％－２（０．１ｍｇ）、４０％－３（２．７ｍｇ）、５０％－１（９．１ｍｇ）、５０％－２（１２．０ｍｇ）、５０％－３（１．２ｍｇ）、６０％－１（１．８ｍｇ）、６０％－２（７．５ｍｇ）、６０％－３（０．６ｍｇ）、７０％－１（１．６ｍｇ）、７０％－２（３．０ｍｇ）、７０％－３（１．５ｍｇ）、１００％－１（４．２ｍｇ）、１００％－２（４．９ｍｇ）、１００％－３（３．８ｍｇ）を得た。これらをＴＬＣ（ＳｉＯ２アルミシート Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社、酢酸エチル－ヘキサン（１：１））で分析した。
このうち、アセトン４０％酢酸エチル５０％－１に活性が見られたため、この画分に含まれていた活性物質を化合物１とした。
【0041】
化合物１の質量分析結果は以下のとおりであった：化合物１（９．１ｍｇ）：Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ：１６７［Ｍ－Ｈ］－；ＨＲ ＥＳＩＭＳ ｍ／ｚ：１６９．０４９５［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ８Ｈ９Ｏ４として計算値：１６９．０４９５），１９１．０３１６［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ８Ｈ８Ｏ４Ｎａとして計算値：１９１．０３１５），１６７．０３４５［Ｍ－Ｈ］－（Ｃ８Ｈ７Ｏ４として計算値：１６７．０３４４）。
【0042】
化合物１のＮＭＲスペクトルデータを表６にまとめた。
【表6】
【0043】
ＳＩ－ＭＳおよび高分解能ＭＳから、化合物１は、分子量１６８、分子式Ｃ８Ｈ８Ｏ４、不飽和度５の化合物であることがわかった。１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおいて、ケミカルシフト５．０付近に積分値が２であるシグナルが２つあることから、酸素原子に結合したメチレンが２つあると考えた。また、Ｈ－Ｈ ＣＯＳＹスペクトルでこの２つのメチレン基の間に相関が見られたことから、このふたつのメチレン基は酸素原子を介して結合していると推定した。さらに、１３Ｃ ＮＭＲよりベンゼン環の存在が推定された。分子式とベンゼン環の１３Ｃ ＮＭＲスペクトルのシグナルのケミカルシフトを考慮し、ベンゼン環には、３つの水酸基が結合していると考えた。ＨＭＢＣスペクトルで検出された相関から、４位、５位、７位に水酸基が結合している構造と決定した。以上より、化合物１を１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，５，７－トリオールと同定した。
【0044】
（２－４）チロシナーゼ阻害活性を有する化合物２の単離、同定
アセトン３０％画分（１４０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、１４ｇ）によって分画した。溶媒には、酢酸エチル－ヘキサン（酢酸エチル濃度４０％、５０％、６０％、７０％、１００％）を１４０ｍｌずつ用いた。同一の酢酸エチル濃度の溶媒によって溶出されるフラクションをさらに３つに分けた。合計１５のフラクション、４０％－１（１．７ｍｇ）、４０％－２（２９．３ｍｇ）、４０％－３（２９．３ｍｇ）、５０％－１（４２．９ｍｇ）、５０％－２（１４．３ｍｇ）、５０％－３（４．３ｍｇ）、６０％－１（３．０ｍｇ）、６０％－２（５．８ｍｇ）、６０％－３（２．４ｍｇ）、７０％－１（２．５ｍｇ）、７０％－２（２．４ｍｇ）、７０％－３（２．３ｍｇ）、１００％－１（２．３ｍｇ）、１００％－２（０．７ｍｇ）、１００％－３（１．３ｍｇ）を得た。これらをＴＬＣ（ＳｉＯ２アルミシート Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社、展開溶媒 酢酸エチル－ヘキサン（１：１））で分析した。
アセトン３０％画分（１４０ｍｇ）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、１４ｇ）によって分画した。溶媒には、酢酸エチル－ヘキサン（酢酸エチル濃度４０％、５０％、６０％、７０％、１００％）を１４０ｍｌずつ用いた。同一の酢酸エチル濃度の溶媒によって溶出されるフラクションをさらに３つに分けた。合計１５のフラクション、４０％－１（１．７ｍｇ）、４０％－２（２９．３ｍｇ）、４０％－３（２９．３ｍｇ）、５０％－１（４２．９ｍｇ）、５０％－２（１４．３ｍｇ）、５０％－３（４．３ｍｇ）、６０％－１（３．０ｍｇ）、６０％－２（５．８ｍｇ）、６０％－３（２．４ｍｇ）、７０％－１（２．５ｍｇ）、７０％－２（２．４ｍｇ）、７０％－３（２．３ｍｇ）、１００％－１（２．３ｍｇ）、１００％－２（０．７ｍｇ）、１００％－３（１．３ｍｇ）を得た。これらをＴＬＣ（ＳｉＯ２アルミシート Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、Ｍｅｒｃｋ社、展開溶媒 酢酸エチル－ヘキサン（１：１））で分析した。
【0045】
４０％－３画分（２５ｍｇ）を更にシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｄａｉｓｏｇｅｌ、２．５ｇ）によって分画した。溶媒には、メタノール－クロロホルム（メタノール濃度０％、２％、５％、１０％、１００％）を２５ｍｌずつ用いた。同一のメタノール濃度の溶媒によって溶出されるフラクションをさらに３つに分けた。１５のフラクション０％－１（１．７ｍｇ）、０％－２（０．４ｍｇ）、０％－３（１．３ｍｇ）、２％－１（１．１ｍｇ）、２％－２（３．５ｍｇ）、２％－３（３．７ｍｇ）、５％－１（９．１ｍｇ）、５％－２（０．４ｍｇ）、５％－３（１．０ｍｇ）、１０％－１（０．３ｍｇ）、１０％－２（０．４ｍｇ）、１０％－３（０ｍｇ）、１００％－１（０．６ｍｇ）、１００％－２（０．５ｍｇ）、１００％－３（０．２ｍｇ）を得た。
【0046】
メタノール２％－２のフラクションから活性化合物２を分取ＨＰＬＣによって精製した。分取ＨＰＬＣの条件を表７に示す。最終的に、分取ＨＰＬＣによって２つのピーク（保持時間４．９５分および８．２分のピーク）を分取した。このうち、保持時間８．２分のピークに活性が検出されたのでこのピークに対応する化合物を２とした。
【表7】
【0047】
化合物２の質量分析結果は以下のとおりであった：化合物２（３．５ｍｇ）Ｎｅｇａｔｉｖｅ ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ：１８１［Ｍ－Ｈ］－；ＨＲ ＥＳＩ ＭＳ ｍ／ｚ：１８３．０６２９［Ｍ＋Ｈ］＋（Ｃ９Ｈ１１Ｏ４として計算値：１８３．０６５２），２０５．０４７３［Ｍ＋Ｎａ］＋（Ｃ９Ｈ１０Ｏ４Ｎａとして計算値：２０５．０４７１），１８１．０５００［Ｍ－Ｈ］－（Ｃ９Ｈ９Ｏ４として計算値：１８１．０５０１）。
【0048】
化合物２のＮＭＲスペクトルデータを表８にまとめた。
【表8】
【0049】
化合物２について、ＥＳＩ ＭＳ、および高分解能ＭＳより分子量１８２、分子式Ｃ９Ｈ１０Ｏ４、不飽和度は５であるとわかった。１Ｈ ＮＭＲでケミカルシフト４．９９および４．９４の積分値２のシグナルがあること、１３Ｃ ＮＭＲよりベンゼン環があると考えられることから、化合物１と似た化合物であると推定した。また、１Ｈ ＮＭＲと１３Ｃ ＮＭＲから、メトキシ基（δＨ ３．８およびδＣ ５６．８）の存在が確認できた。ＨＭＢＣスペクトルにおいて、１位と３位の水素と３ａ、４、７ａ、７位の炭素との相関が見られた。しかし、１位と３位の水素とメトキシ基の付け根の炭素との相関は見られなかった。よって、メトキシ基が５位に結合している構造であると決定した。以上より、化合物２を５－メトキシ－１，３－ジヒドロイソベンゾフラン－４，７－ジオールと同定した。
【0050】
（２－５）化合物１および２によるチロシナーゼの阻害
化合物１、化合物２、アルブチンおよびヒドロキノンのＩＣ５０を求めた。マッシュルーム由来のチロシナーゼを実験に用いた。ＩＣ５０は、それぞれ１７３ｐｐｍ（１．０ｍＭ）、２６３ｐｐｍ（１．４ｍＭ）、１９６５ｐｐｍ（１７．８ｍＭ）、１９０３４ｐｐｍ（６９．９ｍＭ）であった。したがって、化合物１および２は、アルブチンやヒドロキノンより効果的な阻害剤であると言える。
化合物１、化合物２、アルブチンおよびヒドロキノンのＩＣ５０を求めた。マッシュルーム由来のチロシナーゼを実験に用いた。ＩＣ５０は、それぞれ１７３ｐｐｍ（１．０ｍＭ）、２６３ｐｐｍ（１．４ｍＭ）、１９６５ｐｐｍ（１７．８ｍＭ）、１９０３４ｐｐｍ（６９．９ｍＭ）であった。したがって、化合物１および２は、アルブチンやヒドロキノンより効果的な阻害剤であると言える。
【0051】
化合物１を用いて酵素反応を行い、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｒｋプロットを行なったところ、化合物１の阻害様式は拮抗阻害であることがわかった
【0052】
さらに、化合物１、２アルブチンおよびヒドロキノンのヒト由来チロシナーゼに対する阻害率を求めた。阻害率はそれぞれ、８９．０％、７６．６％、３５．９％、７７．５％であり（図１）、化合物１および２は、ヒト由来のチロシナーゼに対してもアルブチンやヒロドキノンと同程度、もしくは、より強い阻害活性を示すことが判明した。
【0053】
（３）化粧品配合例
（３－１）化粧水の配合例を表９に示す。
保湿剤および緩衝剤を室温にて精製水に溶解し、水相とする。化合物１または化合物２および残りの原料をエタノールに溶解し、水相と混合し、可溶化させる。その後、所望により香料、色剤を添加し、得られた溶液を濾過後、容器に充填する。
（３－１）化粧水の配合例を表９に示す。
【表9】
保湿剤および緩衝剤を室温にて精製水に溶解し、水相とする。化合物１または化合物２および残りの原料をエタノールに溶解し、水相と混合し、可溶化させる。その後、所望により香料、色剤を添加し、得られた溶液を濾過後、容器に充填する。
【0054】
（３－２）クリーム（Ｏ／Ｗ型）の配合例を表１０に示す。
保湿剤、アルカリを精製水に加え、７０℃に加熱する。油分を加熱溶解後、化合物１または化合物２、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、所望により香料を加えて予備乳化を行う。ホモミキサーにて乳化粒子を均一にした後、脱気、濾過、冷却し、容器に充填する。
【表10】
保湿剤、アルカリを精製水に加え、７０℃に加熱する。油分を加熱溶解後、化合物１または化合物２、界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、所望により香料を加えて予備乳化を行う。ホモミキサーにて乳化粒子を均一にした後、脱気、濾過、冷却し、容器に充填する。
【産業上の利用可能性】
【0055】
本発明は、化粧品、医薬品、研究用試薬などの分野において利用可能である。
【図1】